195 kB - Johannes Gutenberg

Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Institut für Mikrobiologie und Weinforschung
FI-Übung: Identifizierung, Wachstum und Regulation (WS 2004/05)
Sebastian Lux
Datum: 19.1.2005
6. Induktion der
Galactosidase von Escherichia coli
1. Theoretische Grundlagen
Befinden sich Glucose und Lactose in einer Lösung, so verbraucht E. coli zuerst
sämtliche Glucose, bevor er auf Lactosestoffwechsel umschaltet. Verantwortlich
für diesen Regelungsmechanismus ist das lac-Operon, welches einer positiven
und einer negativen Kontrolle unterliegt. Das lac-Operon besteht aus einem
Promotor, welcher Bindungsstelle für das Regulatorprotein CAP („Catabolite
Activator Protein“) ist, einem Operator, welcher Bindungsstelle für einen
Repressor
ist,
sowie
den
drei
Strukturgenen
Strukturgene codieren für die Enzyme
lacZ,
lacY
und
lacA.
Die
Galactosidase, welche Lactose in
Galactose und Glucose spaltet, Permease, welche für den Transport von Lactose
in die Zelle verantwortlich ist, sowie für eine Transacetylase.
Abb. 1: lac-Operon
Als Induktor fungiert das Lactose-Isomer Allolactose. Diese hemmt den lacRepressor, welcher bei Abwesenheit von Lactose an den Operator gebunden ist
und so die Transkription verhindert. Indem Allolactose an den Repressor bindet,
verändert sich dessen Konfirmation und er kann nicht mehr an den Operator
binden, wodurch die Transkription ermöglicht wird.
Allerdings bedarf es zusätzlich noch einer positiven Kontrolle. Erst wenn das
Regulatorprotein CAP am Promotor bindet, startet die Transkription endgültig.
CAP benötigt den Signalstoff cAMP, welcher bei Glucosemangel als Hungersignal
gebildet wird. Regulierend für die cAMP-Bildung ist das Phosphotransferasesystem. Ist Glucose vorhanden, so wird diese über Enzym III phosphoryliert, bei
Abwesenheit von Glucose induziert die phosphorylierte Form von EIII die
Synthese von CAMP durch die Adenylatcyclase.
Abb. 2: Phosphotransferasesystem
Somit konkurriert Glucose erfolgreich mit Lactose um den Platz als verwendetes
Substrat. Dieses als „Katabolit-Repression“ bezeichnete Phänomen ist insofern
plausibel, da Glucose für E. coli energetisch günstiger ist. Lactose muss erst
gespalten werden und Galactose erst umgewandelt werden, bevor sie dem
Hexoseabbau zugeführt wird. Auch andere Kohlenhydrate wie z.B. Mannit werden
gegenüber Lactose bevorzugt.
Ist die bevorzugte Energiequelle verbraucht, steigt E. coli auf das nächstgünstigere Substrat um. Bei diesem Wechsel der Energiequelle kommt es zu
einem kurzzeitigen Wachstumsstillstand, bevor die neue Energiequelle verwertet
wird. Dieses Phänomen wird als Diauxie bezeichnet.
2. Material und Methode
Vom E. coli-Stamm AN387 werden Vorkulturen auf Lactose, Glucose sowie
Lactose+Glucose
gezüchtet.
Diese
werden
am
Versuchstag
in
sterile
Reagenzgläser mit M9-Medium und der entsprechenden C-Quelle überführt und
für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Um die
Bestimmung
durchführen zu können, wird mit Chloroform und Sodiumdodecylsulfat die
Permeabilität der Zellmembranen erhöht.
Nachgewiesen wird die
und ONP
Galactosidase mit Hilfe von ONPG, welches in Galactose
Nitrophenol) gespalten wird.
Der
Gehalt kann photometrisch bestimmt werden und gibt
letztendlich
Aufschluss
über
die
Aktivität
(in
Miller-Units)
abhängig von den drei Substraten. Von jeder Kultur werden drei Messungen
durchgeführt, plus jeweils eine Leermessung nur mit Medium.
Gestartet wird die Reaktion durch Zugabe von ONPG, gestoppt wird sie durch
Zugabe
von
Natriumcarbonat,
wodurch
der
pH-Wert
steigt
und
die
Galactosidase ihre Funktion verliert. Nachdem die Proben zentrifugiert wurden
(um die aufgelösten Zellreste zu entfernen) werden die photometrischen
Messungen durchgeführt.
Für die Berechnung der Miller-Units müssen neben den Extinktionen auch die
optische
Dichte
der
jeweiligen
Kultur
sowie
die
Inkubationszeit
Versuchsansatzes und das Probevolumen mit einbezogen werden.
Für Details siehe Skript.
des
3. Ergebnisse
Tabelle 1: Messwerte
Glucose
Lactose
Lac + Glc
0,48
0,25
0,55
0,06
0,50
0,26
0,58
0,06
0,49
0,255
0,565
0,06
0,43
0,195
0,505
0
0,057
0,339
0,097
2
0,055
0,384
0,088
3
0,059
0,369
0,092
E420 MW
0,057
0,364
0,092
E420 BW
0,057
0,055
0,058
0
0,309
0,034
30
5
22
0
1585
15
OD578
MW
OD
(MW-BW)
E420
E
1
(MW-BW)
t [min]
Miller-Units
BW
Beispielrechnung anhand der Lactosewerte:
1000 * E(MW-BW)
Aktivität [Miller-Units] = _____________________________
Zeit [min] * VProbe [ml] * OD (MW-BW)
1000 * 0,309
= ___________________ = 1584,62 à 1585
5 min * 0,2 ml * 0,195
4. Diskussion
Der Versuch liefert recht deutliche Ergebnisse. Die
Aktivität bei
Glucose als Substrat ist erwartungsgemäß gleich null. Glucose wird mit Hilfe des
Phosphotransferasesystems phosphoryliert, wodurch die cAMP-Konzentration
erniedrigt wird. Infolgedessen bindet der cAMP-CAP-Komplex nicht am Promotor
und es findet keine Transkription statt. Zudem bleibt der lac-Repressor bei
Abwesenheit von Lactose an den Operator gebunden, was ebenfalls die
Galactosidase-Transkription verhindert.
Im reinen Lactose-Medium beträgt die Aktivität von
Galactosidase 1585 Miller-
Units. Glucose wird nicht phosphoryliert, da nicht vorhanden, somit wird
vermehrt cAMP gebildet, welches zusammen mit CAP an den Promotor bindet.
Desweiteren induziert Allolactose die Transkription von
sie an den lac-Repressor bindet und ihn so inaktiviert.
Galactosidase, indem
Etwa um den Faktor 100 geringer ist die
Aktivität, wenn sowohl
Lactose als auch Glucose im Medium vorliegen. Zwar wird der lac-Repressor
durch Allolactose inaktiviert, doch da Glucose gleichzeitig die Bildung von cAMP
hemmt, werden die Strukturgene des lac-Operons nicht transkribiert. Somit
entscheidet die positive Kontrolle des lac-Operons darüber, ob eine Transkription
stattfindet oder nicht.
Womöglich würde man zu einem späteren Zeitpunkt eine höhere Enzymaktivität
messen können, da die Bakterien sich evtl. zum Zeitpunkt der Messung noch in
der Wachstumsstillstandphase beim Wechsel zwischen den beiden Substraten
befinden.
Literatur:
MADIGAN, MICHAEL T. et. al (2001): Brock. Mikrobiologie, Heidelberg.
SCHLEGEL, HANS G. (1992): Allgemeine Mikrobiologie. Stuttgart.