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Entwicklung eines rekombinanten Ganzzellsystems-Klonierung, Coexpression und Mutagenese der Phenylalanin-Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 und des malic enzymes aus E.coli K12 Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität vorgelegt von Shukrallah Na’amnieh aus Düsseldorf Jülich 2002 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 1998 bis März 2002 am Institut für Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf im Forschungszentrum Jülich unter der Leitung von Herrn Priv. Doz.- Dr. W. Hummel durchgeführt. Die Arbeit wurde von Degussa AG und Minerva Stiftung der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften gefördert. Gedruckt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Referent: Priv.- Doz. Dr. W. Hummel Korreferent: Prof. Dr. Cornelis P. Hollenberg Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ................................................................................................................................................. 1 1.1 BEDEUTUNG VON ENZYMEN ................................................................................................................... 1 1.2 ENZYME IN DER INDUSTRIE .................................................................................................................... 2 1.3 DIE PHENYLALANIN DEHYDROGENASE AUS RHODOCOCCUS SP. M4 ....................................................... 4 1.3.1 Malic enzyme aus E. coli K12............................................................................................................... 8 1.3.2 L-Phenylalanin-Synthese unter Coenzymregeneration ........................................................................... 8 1.3.3 Expression rekombinanter Proteine ....................................................................................................... 9 1.4 PROTEIN-DESIGN .................................................................................................................................. 11 1.4.1 Gezielte Mutagenese........................................................................................................................... 11 1.4.2 Zufallsmutagenese.............................................................................................................................. 13 1.5 HOCHZELLDICHTE-FERMENTATION (HZD) ......................................................................................... 14 2 Problemstellung und Zielsetzung........................................................................................................... 15 3 Material.................................................................................................................................................. 17 4 Methoden................................................................................................................................................ 20 4.1 MOLEKULARBIOLOGIE ......................................................................................................................... 20 4.1.1 Isolierung der genomischen DNA ....................................................................................................... 20 4.1.2 Auftrennung von DNA-Fragmenten über Elektrophorese .................................................................... 21 4.1.3 Ethanolfällung.................................................................................................................................... 21 4.1.4 Polymerase Ketten Reaktion [PCR] .................................................................................................... 22 4.1.5 Berechnen der Schmelztemperatur der Primer ..................................................................................... 23 4.1.6 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen ........................................................................... 23 4.1.7 Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA................................................................................. 24 4.1.8 Ligation.............................................................................................................................................. 24 4.1.9 Herstellung kompetenter Bakterienzellen ............................................................................................ 25 4.1.10 Transformation................................................................................................................................. 26 4.1.11 Schnellisolierung von Plasmid-DNA aus E.coli (modifiziert nach Birnboim und Doly) ...................... 26 4.1.12 Plasmidisolierung [Biorad] ............................................................................................................... 27 4.1.13 Plasmidisolierung [Qiagen]............................................................................................................... 27 4.1.14 Restriktion........................................................................................................................................ 28 4.1.15 Sequenzierung.................................................................................................................................. 28 4.1.16 Gezielte Mutagenese......................................................................................................................... 28 4.1.17 Zufallsmutagenese ............................................................................................................................ 29 4.1.18 Sättigungsmutagenese....................................................................................................................... 31 4.2 BIOCHEMISCHE METHODEN ................................................................................................................. 32 4.2.1 Zellaufschluß und Rohextraktgewinnung ............................................................................................ 32 4.2.2 Aktivitätstest für die Phenylalanin Dehydrogenase .............................................................................. 33 4.2.3 Screening und Aktivitätstest in Titerplatten......................................................................................... 34 4.2.4 Aktivitätstest für das NAD-abhängige malic enzyme........................................................................... 35 4.2.5 Gekoppelte enzymatische Synthese..................................................................................................... 35 4.2.6 Bestimmung des L-Phenylalanin mittels HPLC ................................................................................... 35 4.2.7 Bestimmung der Acetatkonzentration.................................................................................................. 36 4.2.8 Ganzzell Biotransformation ................................................................................................................ 36 4.2.9 Proteinaufreinigung ............................................................................................................................ 36 4.2.10 Proteinbestimmung nach Bradford .................................................................................................... 37 4.2.11 Entsalzen von Proteinlösungen.......................................................................................................... 37 4.2.12 Konzentrierung von Proteinlösungen................................................................................................. 37 4.2.13 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).......................................................................... 38 4.2.14 Färbung............................................................................................................................................ 39 4.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN ........................................................................................................ 40 4.3.1 Verwendete Organismen..................................................................................................................... 40 4.3.2 Anzuchtbedingungen und Medien....................................................................................................... 40 4.3.3 Plattenkulturen ................................................................................................................................... 41 4.3.4 Schüttelkolbenkulturen ....................................................................................................................... 41 4.3.5 Konservieren von mikrobiologischen Stämmen................................................................................... 41 4.3.6 Fermentation der rekombinanten PheDH in Hochdichte Medium (HZD) ............................................. 41 4.3.7 Bestimmung der optischen Dichte....................................................................................................... 44 5 Ergebnisse .............................................................................................................................................. 45 5.1 KLONIERUNG DER PHENYLALANIN DEHYDROGENASE (PHEDH).......................................................... 45 5.1.1 Präparation genomischer DNA............................................................................................................ 45 5.1.2 Klonierung des PheDH-Gens mittels PCR........................................................................................... 46 5.1.3 Klonierung des PheDH Gens in den pUC-18....................................................................................... 47 5.1.4 Sequenzierung des phedh-Gens........................................................................................................... 49 5.1.5 Expression des recPheDH-Gens in E.coli ........................................................................................... 50 5.1.5.1 Klonierung der PheDH im Expressionsvektor PET16b ..................................................................... 50 5.1.5.2 Expression der PheDH im PET-System............................................................................................ 52 5.1.5.3 Klonierung des PheDH-Gens in pkk223-3........................................................................................ 53 5.1.5.4 Expression der recPheDH im pKK223-3 .......................................................................................... 56 5.1.6 Optimierung der Induktionsparameter................................................................................................. 57 5.1.7 Reinigung der recPheDH aus E. coli JM105........................................................................................ 60 5.1.8 Substratspektrum und KM-Werte......................................................................................................... 62 5.1.9 Temperaturstabilität............................................................................................................................ 63 5.1.10 Temperaturoptimum ......................................................................................................................... 64 5.1.11 pH-Optimum .................................................................................................................................... 64 5.2 HOCHZELLDICHTE FERMENTATION (HZD).......................................................................................... 66 5.2.1 Zuführung von Nährstoffen, Nebenproduktbildung und Wachstum...................................................... 66 5.2.2 Bestimmung des Induktionszeitpunkts ................................................................................................ 68 5.3 KLONIERUNG DES MALIC ENZYMES ...................................................................................................... 70 5.3.1 Präparation genomischer DNA............................................................................................................ 70 5.3.2 Genisolierung und Klonierung des malic enzymes im recPhe-pKK-223-3............................................ 70 5.4 KONSTRUKTION EINES EXPRESSIONSVEKTORS MIT HETEROLOGER EXPRESSION................................. 75 5.4.1 Coexpression der PheDH und des malic enzymes................................................................................ 77 5.4.2 Optimierung der Aktivität................................................................................................................... 78 5.4.3 Km-Wertbestimmung ......................................................................................................................... 81 5.4.4 Gekoppelte L-Phenylalanin Synthese unter Regeneration des Coenzyms NADH ................................. 81 5.5 GANZZELLUMSETZUNG ........................................................................................................................ 85 5.6 GEZIELTE MUTAGENESE ...................................................................................................................... 87 5.6.1 Mutation des Lysin 66 ........................................................................................................................ 88 5.6.2 Sequenzierung der K66I ..................................................................................................................... 94 5.6.3 Expression der PheDH-Mutante K66I ................................................................................................. 94 5.6.4 Herstellung weiterer Muteine.............................................................................................................. 96 5.6.5 Mutation von Lysin 66 zu Arginin und Lysin 78 zu Isoleucin .............................................................. 97 5.6.6 PCR der K66R- Mutanten und deren Klonierung................................................................................. 98 5.6.7 Aktivitätsnachweis des PheDH-Muteins K66R und K78I .................................................................... 99 5.7 ZUFALLSMUTAGENESE ....................................................................................................................... 101 5.8 ENTWICKLUNG EINES FARBTESTES ALS SCREENINGSMETHODE ......................................................... 102 5.8.1 K66R –Muteine................................................................................................................................ 104 5.8.2 Biochemische Charakterisierung des K66R-8-Muteins ...................................................................... 107 5.8.3 Synthese von Phenyllactat mit dem Mutein K66R-8.......................................................................... 109 5.8.4 Austausch K66I................................................................................................................................ 112 6 Diskussion............................................................................................................................................. 114 7 Zusammenfassung................................................................................................................................ 127 8 Literaturverzeichnis............................................................................................................................. 131 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Industriell genutzte Enzyme, ihr Ursprungsorganismus, aus dem sie isoliert werden und mögliche Verwendungszwecke................................................................................................................................. 2 Tabelle 2: PCR-Zyklen ................................................................................................................................... 46 Tabelle 3: PCR Protokoll zur Amplifizierung des PheDH-Gens. Variiert wurde die Konzentration der TemplateDNA....................................................................................................................................................... 46 Tabelle 4: Ligationsansatz zur Klonierung der PheDH im pUC18-Vektor ........................................................ 48 Tabelle 5: Expressionsresultate der rekombinanten E.coli Stämme. Die Aktivitäten wurden im Rohextrakt „30 %iger Aufschluss“ gemessen................................................................................................................... 57 Tabelle 6: Zusammenfassung der Reinigung der recPheDH aus E.coli-Rohextrakt........................................... 61 Tabelle 7: Untersuchte Substrate der Rec-PheDH. ........................................................................................... 62 Tabelle 8: Kinetische Parameter für die Rec-PheDH........................................................................................ 62 Tabelle 9: PCR Protokoll zur Amplifizierung des malic enzymes aus dem rekombinanten pUC18-Plasmid. Variiert wurden die Konzentrationen der Template-DNA......................................................................... 76 Tabelle 10: Aktivitätsbestimmung der exprimierten Enzyme in einem 10 L Fermenter mit LB-Medium als batchFermentation........................................................................................................................................... 78 Tabelle 11: Aktivitätsvergleich in Abhängigkeit des Aufschlusspuffers ........................................................... 79 Tabelle 12: Proteinbestimmung beider exprimierten Enzymen, PheDH und malic enzyme, nach Variation der Aufschlusszeit. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30Sekunden abgekühlt. ........................................................................................................................... 81 Tabelle 13: Aufreinigung des rekombinanten malic enzymes........................................................................... 81 Tabelle 14: Vergleich der PheDH- bzw. der malic enzyme-Aktivität in verschiedenen Reaktionspuffern. Die Aktivitäten sind in Prozent vom Optimalen zu sehen................................................................................ 84 Tabelle 15: Möglichkeiten zur Substratumsetzung nach einer Mutagenese. Durch den Austausch des Lysins in Isoleucin (neutrale Aminosäure) könnte die Methylgruppe des Ketons akzeptiert werden und somit das Keton zum Amin umsetzen. Es wird eine direkte Hydrierung der Ketosäure zur Hydroxysäure bei einer Mutagense des Lysin 66 in Arginin erwartet. ........................................................................................... 88 Tabelle 16: Zusammenfassung der hergestellten Mutanten und deren neue Eigenschaften . (O) getestet aber keine Aktivität, ( -) nicht getestet. Die Restaktivität bezieht sich auf der rec-PheDH. ....................................... 100 Tabelle 17: Km-Werte des Muteins K66R-8. Untersucht wurde Phenylpyruvat sowohl bei einer reduktiven Aminierung als auch bei einer Reduktion ohne Ammoniumionen........................................................... 108 Tabelle 18: Vergleich der Reaktionsmechanismen verschiedener Muteine. Die 3 Mutationen wurden einzeln rückgängig mutiert. Die drei Mutationen sind als Kombination für die neue Eigenschaft der PheDH verantwortlich. Die Substitution der einzelnen Mutationen in die ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der LDH-Aktivität. ............................................................................................................ 111 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Reaktionsschema der Phenylalanin Dehydrogenase. ..................................................................... 4 Abbildung 2: Reaktionsmechanismus zur Aminierung von Ketosäuren und die dabei beteiligten Aminosäuren in der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase. .................................................................................. 5 Abbildung 3: Dreidimensionale Struktur der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4. Dargestellt ist das Enzym mit dem Substrat Phenylpyruvat ohne Coenzym und Inhibitor. Die Pfeile zeigen auf die Aminosäure Lysin 66, die im aktiven Zentrum beteiligt ist, sowie auf das Substrat im Substratkanal. Die tiefe Spalte ist ein typischer Substratkanal für Aminosäure Dehydrogenasen. ................ 6 Abbildung 4: Die beteiligten Aminosäuren im aktiven Zentrum der PheDH. Die Aminosäure Lysin 66 ist die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Phenylpyruvat ............................................................................... 7 Abbildung 5: Schema zur Synthese von L-Phenylalanin unter Regeneration des Coenzyms NADH mittels Formiat Dehydrogenase............................................................................................................................. 9 Abbildung 6: Protein-Design Zyklus zur gezielten Mutagenese eines Enzyms.................................................. 12 Abbildung 7: Prinzip der gezielten Mutagenese mittels überlappender Fragmente............................................ 29 Abbildung 8: Vorgehensweise der Zufallsmutagenese ..................................................................................... 31 Abbildung 9: Schema zum Screeningsvorgang ................................................................................................ 34 Abbildung 10: genomische DNA aus Rhodococcus sp. M4 nach Elektrophorese im 0.5 %igem Agarosegel ..... 45 Abbildung 11: Ergebnis der PCR Reaktionen, die Abbildung zeigt ein Fragment mit einer Größe von etwa 1100 bp, als Marker wurde die Gibco KB-Leiter verwendet. Von den PCR-Ansätze wurden 7 µl auf ein 0.8 % Agarosegel aufgetragen, 1-3 entsprechen den Ansätze in Tabelle 2 .......................................................... 47 Abbildung 12: Vektorkarte des pUC18 -PheDH .............................................................................................. 48 Abbildung 13: DNA-Sequenz der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 mit zwei Stopcodons. ............................................................................................................................................................... 49 Abbildung 14: Fließschema zur Klonierung des recPheDH-Gens in die Expressionsvektoren PET11a oder PET 16b ......................................................................................................................................................... 51 Abbildung 15: Agarose-Gel zur Überprüfung der Restriktion der recpET-16b-und 11a-Vektoren. Bei einer Größe von etwa 1100bp tritt eine Bande des geschnittenen Inserts auf Bahn 2 pET-16b und Bahn 5 pET-11a. Als Marker wurde eine KB-Leiter (Gibco) verwendet Bahn 1. Der Ansätze wurden mit NdeI/BamHI behandelt ............................................................................................................................................................... 51 Abbildung 16: SDS-Gel zur Überprüfung der Expression. Bei einer Größe von etwa 39 kDa tritt eine Bande auf. Bahn 1: Rohextrakt aus dem rec-pET16b in E. coli BL21 das Rohextrakt wurde nicht abzentrifugiert. Bahn 2: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET16b in E. coli BL21. Bahn 3: Rohextrakt aus dem rec-pET11a in E. coli BL21. Bahn 4: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET11a in E. coli BL21. 5: Marker........................................................................................................................... 52 Abbildung 17: Vektorkarte des pKK-223-3recPheDH. Das PheDH-Gen wurde an der SmaI-Schnittstelle im Expressionsvektor pKK-223-3 mit einem Abstand zur Ribosomenbindungsstelle von 14bp ligiert............ 54 Abbildung 18: rec-pKK223-3-PheDH verdaut mit EcoRI. 1: KB-Marker, 2-6 recPhe-pKK223-3 verdaut mit EcoRI (verschiedene Konzentrationen). Nach einer Restriktionsanalyse taucht eine Bande mit der erwarteten Größe von ca. 800bp auf......................................................................................................... 56 Abbildung 19: Variation der IPTG-Konzentration bei der Induktion von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen zwischen 0 und 3 mM induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen............................................................................... 58 Abbildung 20: Wachstumsverhalten für E. coli nach der Induktion .................................................................. 59 Abbildung 21: Variation des Induktionszeitpunktes in Expressionskulturen von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit 1 mM IPTG induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen. .............................................................................................................. 60 Abbildung 22: SDS-PAGE (12.5 %, Silberfärbung) zur Überprüfung der Reinheit der recPheDH nach DEAESepharose FF –Chromatographiegel. 1 Marker, 2+3 recPheDH nach DEAE-Sepharose FF, 4 Rohextrakt aus E. coli ..................................................................................................................................................... 61 Abbildung 23: Temperaturstabilität der rec-PheDH im Vergleich zur WT-PheDH im Rohextrakt..................... 63 Abbildung 24: Temperaturoptimum der recPheDH im Vergleich zur WT-PheDH, Enzym-präparate aus dem Rohextrakt JM105. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 270 U/mg, und im WT-PheDH 24 U/mg. ....... 64 Abbildung 25: pH-Optimum der rec-PheDH für die reduktive Aminierung. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 190 U/mg, und im WT-PheDH 16 U/mg. Die Messung wurde bei 30°C durchgeführt. .......... 65 Abbildung 26: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK-223-3-PheDH] bei linearer Erhöhung der Glucosezufuhr in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C. Die Acetatbildung wurde mittels HPLC bestimmt................................................................................................................. 66 Abbildung 27: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK223-3-PheDH] in HZDMedium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C und exponentieller Erhöhung der Glucosezufuhr ....................... 67 Abbildung 28: Entwicklung der PheDH-Volumenaktivität in Abhängigkeit vom Induktionszeitpunkt während der Zufütterungsphase ............................................................................................................................. 68 Abbildung 29: 0.8 %iges Agarosegel zum Nachweis der Konzentrationszunahme an rec-pKK-223-3 bei Induktion 1h nach Beginn der Glucose-Zuführung während der Fermentation.......................................... 69 Abbildungsverzeichnis Abbildung 30: Zu- und Abnahme der Plasmidkopienzahl bei Induktion 5 h nach Beginn der Glucosezuführung69 Abbildung 31: Neue PCR-Strategie zur Amplifikation des malic enzymes. Es wurde ein Einzelstrang amplifiziert, der als Template für eine zweite PCR dient .......................................................................... 71 Abbildung 32: DNA-Sequenz des malic enzymes aus E. coli K12 ................................................................... 72 Abbildung 33: Proteinsequenz des malic enzymes aus E. coli K12 abgeleitet von der DNA-Sequenz ............... 73 Abbildung 34: Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener malic enzymes. NADP- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (Parkhill et al., 2001), Mdh Pasteurella multocida (May et al., 2001), NADBrucella melitensis (DelVecchio et al., 2002), NADP-E.coli (Blattner et al., 1997). ................................. 75 Abbildung 35: Konstruktion des Plasmids für eine heterologe Expression zur L-Phe Synthese mittels Ganzzellumsetzung ................................................................................................................................. 75 Abbildung 36: PCR-Ausbeute des malic enzyme-Gens bei verschiedenen Konzentrationen an Template-DNA (rec-pUC18)............................................................................................................................................ 76 Abbildung 37: Vektorkarte des rec-pKK-223-3 PheDH-Malic. Malic enzyme wurde 3’zur PheDH an der Pst1und HindIII-Schnittstelle mit eigener Ribosomenbindungsstelle kloniert. ................................................. 77 Abbildung 38: Stabilitätsbestimmung der PheDH bzw. des malic enzymes nach verschiedenen Aufschlusszeiten mittels Ultraschalls. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30 Sekunden abgekühlt. ............................................................................................................................... 80 Abbildung 39: pH-Optimum von malic enzyme und der PheDH. Die Aktivität beider Enzymen nimmt bei Zunahme des pH-Wertes zu. Die Messungen wurden mit partiell gereinigtem Enzym durchgeführt. Für die Phenylalanin Dehydrogenase wurde die reduktive Aminierung gemessen................................................. 82 Abbildung 40: Temperaturoptimum. Die Messungen wurden bei pH 8,5 und in 0,1M Hepes-Puffer durchgeführt. ............................................................................................................................................................... 83 Abbildung 41: HPLC-Analytik zur Nachweis von in situ Regenerationsystems gildeten L-Phenylalanin .......... 84 Abbildung 42: Bildungskinetik für L-Phe. Die Bildung von L-Phe wurde in situ durchgeführt. ........................ 85 Abbildung 43: Produktnachweis nach einer 5 stündigen Umsetzung mit ganzen rekombinanten E. coli Zellen . 86 Abbildung 44: Ganzzellumsetzung zur Produktion von L-Phe. Die Bestimmung von L-Phe erfolgte mittels HPLC ..................................................................................................................................................... 86 Abbildung 45: Reaktionsmechanismus der reduktiven Aminierung von Phenylalanin mittels PheDH ............... 87 Abbildung 46: Schema zur Mutagenese mittels PCR nach der Methode der „overlapping extension“, ausgetauscht wurde das Lysin66 gegen Isoleucin ..................................................................................... 89 Abbildung 47: Klonierungsstrategie zur Einführung der Mutation PheDHK66I. Im ersten Schritt wurden zwei Fragmente amplifiziert, die die gleiche Mutation tragen; beim zweiten Schritt hybridisierten sie zum ganzen Gen. Somit konnte das amplifizierte Gen in den Expressionsvektor ligiert werden.................................... 90 Abbildung 48: Agarosegelanalyse der PCR zur K66I- Mutagenese. Spur 1: kb-Leiter; Spur 2 unspezifische Amplifikation der Teilfragmente; Spur 3 und 4 sind gewünschte Amplifikate nach einer Optimierung der PCR- Bedingungen mit einer Größe von ca. 200 bp bzw. 900 bp.............................................................. 93 Abbildung 49: Sauberes PCR-Produkt nach der Fusion der beiden Fragmente (Abbildung 48; Bahn 3+4) mit einer Größe von 1.1 kb ............................................................................................................................ 93 Abbildung 50: Gensequenz des K66I- Muteins................................................................................................ 94 Abbildung 51: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin66 durch den Austausch in Isoleucin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin66 und der Carboxylgruppe des Substrates in der PheDH, (B) Mutein K66I, Lysin wurde gegen Isoleucin ausgetauscht, das keine Wasserstoffbindung zur Carboxylgruppe des Substrates bildet. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. ................................................................. 95 Abbildung 52: Reaktionsmechanismus der reduktive Aminierung von Phenylaceton....................................... 95 Abbildung 53: Klonierungsstrategie der PheDH-Mutanten am Beispiel der PheDH-K66R. Das ganze rekombinante Plasmid wird mittels Mutagenese-Primer amplifiziert und in E.coli-Zellen transformiert ... 98 Abbildung 54: Reaktionsmechanismus zur Umsetzung der Ketosäure Phenylpyruvat zur Hydroxysäure Phenyllactat. ........................................................................................................................................... 99 Abbildung 55: Reaktionsschema zum Verlauf des Farbtests........................................................................... 103 Abbildung 56: Farbtest auf Agarplatten mit ganzen Zellen. Die gelben Zellen enthalten PheDH-Aktivität...... 103 Abbildung 57: Bestimmung der Aktivität der K66R-Muteine. Gezeigt werden einige Muteine mit den restlichen Aktivitäten im Vergleich zur Wt-PheDH. Bei zwei Muteinen (Mutein 2 und 8) konnte der natürliche Reaktionsmechanismus verändert und somit neue Eigenschaften erzielt werden..................................... 104 Abbildung 58: Aminosäurensequenz des Mutein K66R-8 im Vergleich zur PheDH-AS-Sequenz. 3 Mutationen K66R, T208A, E225D sind in diesem Mutein für die neue Aktivität verantwortlich................................ 105 Abbildung 59: Dreidimensionale Struktur des K66R-8-Mutein. Gezeigt sind die durch die Mutagenese ausgetauschten Aminosäuren. Die Mutationen K66R, T208A und E225D sind hervorgehoben. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. .......................................................................................... 106 Abbildung 60: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin66 durch den Austausch in Arginin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin66 und der Carboxylgruppe des Substrates, (B) Arginin wird anders orientiert und geht keine Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe des Substrates ein. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. .......................................................................................... 107 Abbildungsverzeichnis Abbildung 61: Reaktionsschema des K66R-8-Mutein.................................................................................... 107 Abbildung 62: pH-Optimum des Muteins K66R-8 im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Der Aktivitätstest (Reduktion des Phenlpyruvat ohne Ammoniumionen) wurde bei verschiedenen pH-Werten zwischen pH 5 und pH 10 gemessen ............................................................................................................................. 108 Abbildung 63: Temperaturoptimum des K66R-8-Muteins im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Die Ansätze enthielten Tris/HCl Puffer (100 mM pH 8.0 + Phenylpyruvat und NADH) wurden auf den jeweiligen Meßtemperaturen (25-50°C) in der Küvette temperiert und gemessen .................................................... 109 Abbildung 64a: GC-Chromatogramm des Syntheseansatzes der K66R-8 nach zweistündiger Inkubation. Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM HEPES-Puffer, 100 mM Formiat, 2 mM NAD+, 2 mM MgCl2, 20 U K66R-8 und 30 U Formiat Dehydrogenase........................................................................ 110 Abbildung 65: Einfluss der Mutationen K66R, T208A und E225D, auf die Enantioselektivität der Reduktion von Phenylpyruvat (30 mM) in Abhängigkeit von der Zeit..................................................................... 111 Abbildung 66 Produktnachweis nach einer 9 stündigen Umsetzung mit dem Mutein K66I. Zur Regenerierung des Coenzyms NADH wurden 40 U Formiat Dehydrogenase eingesetzt. Die reduktive Aminierung erfolgte mit (NH4)2SO4 und 30 mM Phenylpyruvat als Substrat. (L-Phe = 23 min; der Peak bei 29 min ist nicht identifiziert). ......................................................................................................................................... 113 Abbildung 67: Alignment der Aminosäurensequenzen der Wt-PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Brunhuber et al., 1994) mit der LDH aus Bifidobacterium longum (Iwata et al., 1994) und der Mutante K66R-8. Rot: Identische Aminosäuren; grün: ähnliche Aminosäuren; Durch Fettdruck hervorgehoben: Mutationen; blaue Pfeile: wichtige Reste zur Bildung der Rossmann fold. .......................................................................... 125 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ALF Automated Laser Fluorescent Sequencer Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosintriphosphat BSA Bovine serum albumine C-Quelle Kohlenstoffquelle CTAB N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium Bromid C-Terminus Carboxy-Terminus Da Dalton DEAE Diethylaminoethyl dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FDH Formiatdehydrogenase FF Fast Flow h Stunde IB-L-C N-Iobutyryl-L-Cystein IEF Isoelektrische Fokussierung IEP Isoelektrischer Punkt IPTG Isopropylthiogalactosid kb Kilobasen kDa Kilodalton Kpi Kaliumphosphatpuffer Km Michaelis-Menten Konstante L Liter LB Luria Bertani min Minute M molar Abbildungsverzeichnis mM Millimolar MOPS 3-N-Morpholino-propansulfonsäure NAD Nicotinamidadenindinukleotid (oxidierte Form) NADH Nicotinamidadenindinucleotid (reduzierte Form) N-Terminus Amino-Terminus OD optische Dichte OPA o-Phtaldialdehyd PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR Polymerase chain reaction PEG Polyethylenglycol PheDH Phenylalanin Dehydrogenase Rec-PheDH rekombinante wt-PheDH SDS Natriumlaurylsulfat TBE Tris-Borsäure-EDTA Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TEA Triethanolamin TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin Tris N-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U Unit (Enzymeinheit) Upm Umdrehung pro Minute UV Ultraviolett Vmax maximale Reaktionsgeschwindigkeit v/v Volumenanteil pro Volumenanteil w/v Gewichtsanteil pro Volumenanteil w/w Gewichtsanteil pro Gewichtsanteil WT Wildtyp Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Bedeutung von Enzymen In den meisten Publikationen über die Biokatalyse findet man die Aussage, dass die chemische Industrie durch die Biokatalyse inhärent bessere Verfahren zu erwarten hat. Dabei sollte allerdings nicht übersehen werden, dass seit 200 Jahren verschiedenste Verbindungen von Arzneimitteln bis zu Haushaltsreinigern ohne Biokatalysatoren effizient hergestellt werden. Daher besteht kein Grund zu der Annahme, dass die Chemie in den nächsten Jahrhunderten nicht ebenso erfolgreich sein wird. Die großen Vorteile chemischer Verfahren sind Einfachheit, Geschwindigkeit (gesteigert durch den Einsatz von Hitze und Druck) und niedrige Kosten, warum also sollten Biokatalysatoren interessant sein? Die genannten Vorteile der chemischen Verfahren kommen manchmal nicht zum Tragen, wenn für das gewünschte Produkt regio- oder stereospezifische Reaktionen erforderlich sind, wenn Edukte oder das Produkt instabil sind oder wenn Verunreinigungen durch Nebenreaktionen ein ernsthaftes Problem sind. Biokatalysatoren sind attraktiv, weil zu ihren Eigenschaften Chemo-, Regio- und Stereoselektivität, eine beeindruckende Katalyseeffizienz und die Fähigkeit zur Reaktion in wässrigen Medien gehören. So besitzen Enzyme eine hohe Chemo- und Regioselektivität, die Voraussetzungen für die Steuerung der komplexen Vorgänge in einer Zelle sind. Enzyme beschleunigen Reaktionen um Faktoren von wenigstens einer Million. Ohne sie würden die meisten Reaktionen in biologischen Systemen nicht in wahrnehmbarem Umfang ablaufen. Eine erhebliche Bedeutung hat die Biotechnologie in der Qualitätsverbesserung von Nahrungsmitteln in Bezug auf Struktur und Geschmack (Uhlig, 1991) sowie in der Herstellung von Aminosäuren erlangt. Aufgrund der hohen Spezifität und Selektivität werden Enzyme in zunehmendem Maße in die klassische Organische Chemie integriert. Für Pharmaka und Agrochemikalien sind enantiomerenreine Wirkstoffe zunehmend gefordert, um unerwünschte Nebenwirkungen auszuschließen, wie im bekanntesten Fall beim Contergan, bei dem das (R)-Enantiomer beruhigend, das (S)-Enantiomer aber teratogen wirkt (Faber, 1997). Die Synthese von enantiomerenreinen Verbindungen ist daher von besonderem Interesse. Dass Enzyme nicht immer bei industriellen Prozessen zum Einsatz kommen, liegt hauptsächlich daran, dass Enzyme unter harten industriellen Bedingungen eingesetzt werden sollten, die zu deren Denaturierung führen. Dazu gehören vor allem hohe Temperaturen und die Anwesenheit organischer Lösungsmittel. Dennoch haben biotechnologische Verfahren es ermöglicht, einige klassische chemische Prozesse zu ersetzen. Einleitung 2 1.2 Enzyme in der Industrie Wegen der strengen Umweltauflagen für die chemische Industrie suchen die Groß-Industrien, aber auch mittelständige Betriebe nach umweltfreundlichen Methoden. Dadurch entwickeln sich biotechnologische Verfahren rasch und es werden immer mehr Enzyme in der Industrie eingesetzt. Die Pharmaindustrie hat enorme Aufwendungen in die Herstellung enantiomerenreiner Wirkstoffe gesteckt, um pharmakologisch wirksame Substanzen in der geforderten Reinheit zu erhalten. Mittlerweile wird die Forderung nach enantiomerenreinen Wirkstoffen auch für die Entwicklung neuer Agrochemikalien intensiv geprüft (Ernst&Young, 1998). Zu erwarten ist, dass dieses Qualitätskriterium eingehalten werden muss, sobald der Stand der Technik dies zulässt. Industriell genutzte Enzyme sind z.B. die bei der Fruchtsaftklärung verwendeten Pektinasen oder die als enzymatische Wirkstoffkomponenten in Waschmitteln und in der Textilverarbeitung zum Einsatz kommenden Lipasen, Proteasen, und Cellulasen (Tabelle 1) (Jaag, 1968). Tabelle 1: Industriell genutzte Enzyme, ihr Ursprungsorganismus, aus dem sie isoliert werden und mögliche Verwendungszwecke Enzym Isoliert aus Nutzung bei ? -Amylase Bacillus subtilis, Aspergillus niger Stärkeprodukte, Textilverarbeitung, Aspergillus oryzae Brotherstellung, Fruchtsäfte, Sirup, Gemüsesäfte Bromelain Cellulasen Glucose-Isomerase Ananas comosus Fruchtsaftklärung, Ananas bracteatus Fleischzartmacher Aspergillus niger Glucoseherstellung, Trichoderma reesei Papierverarbeitung Streptomyces spec Herstellung von Zuckersirup Bacillus coagulans Glucose-Oxidase Aspergillus niger Antioxidans Auch in der organischen Synthese gewinnen Enzyme zunehmend an Bedeutung (Zaks, 2001). Innerhalb der industriell genutzten Biokatalysatoren kommt den Dehydrogenasen dabei in den letzten Jahren, trotz des erforderlichen Zusatzes von Coenzymen, eine stärkere Bedeutung zu. Einleitung 3 (Carrea et al., 1996). Da Coenzyme kostenintensiv sind, wenn sie in äquimolaren Mengen in der enzymatischen Synthese im industriellen Maßstab eingesetzt werden, wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt, die Coenzyme in situ zu regenerieren (Kometani et al., 1994; Leonida et al., 1998). Dabei stellen enzymatische Verfahren die effizienteste Methode zur Coenzymregenerierung dar. So stellen Dehydrogenasen ideale Biokatalysatoren für asymmetrische Synthesen chiraler, enantiomerenreiner Substanzen aus prochiralen Vorstufen dar (Hummel & Kula, 1989). Einsatzgebiete sind derzeit vor allem die Produktion von Pharmazeutika, Feinchemikalien und Lebensmittelzusatzstoffen (Drauz et al., 1994). Kommerziell gehandelte Enzyme wie zum Beispiel Alkohol Dehydrogenasen, Phenylalanin Dehydrogenase (Hummel, 1997), D- oder LLactat Dehydrogenasen oder D-Hydroxyisocapronsäure Dehydrogenasen (Lerch et al., 1989), wurden für die Präparation von optisch aktiven Substanzen mit Erfolg eingesetzt (Hanson et al., 2000). Am Beispiel der Synthese von enantiomerenreinen Aminosäuren durch die enzymatische reduktive Aminierung prochiraler ? -Ketosäuren werden Aminosäure Dehydrogenasen wie die Leucin Dehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus sp. (Bommarius & Drauz, 1994; Bommarius et al., 1995; Wichmann et al., 1981) und die Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) aus Rhodococcus sp. M4 mit Erfolg eingesetzt (Hummel et al., 1987). Eine Vielzahl neuer aliphatischen und aromatischen ? -Aminosäurederivate, kann aufgrund der breiten Substratspektren der LeuDH und der PheDH mit hoher Enantioselektivität hergestellt werden (Krix et al., 1997). Erfolgreich wurde die NAD-abhängige Leucin Dehydrogenase aus Bacillus sp. für die Synthese optisch aktiver Aminosäuren mit ungewöhnlichen Resten wie (S)-tert.-Leucin eingesetzt (Bommarius et al., 1995). Das meist breite Substratspektrum dieser für die chemische Synthese einsetzbaren Enzyme wirkt sich vorteilhaft aus, da meistens die Enzyme für mehr als ein Substrat verwendbar sein sollten. Das bei Dehydrogenasen notwendige Coenzym beeinträchtigt die Synthese nicht, da NAD+ über einen längeren Zeitraum stabil (Janssen et al., 1987; Oppenheimer & Kaplan, 1974; Wong & Whitesides, 1981) und durch die Regenerierung mit Formiat kostengünstig einsetzbar ist. Einleitung 4 1.3 Die Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 Die Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) aus Rhodococcus sp. M4 katalysiert die oxidative Desaminierung von L-Phenylalanin zum Phenylpyruvat und Ammonium, dabei wird das Coenzym NAD+ zum NADH reduziert (Abbildung 1) (Hummel et al., 1987). O C COOH CH 2 H 2N + Phe DH + NH 4 + NADH Phenylpyruvat H C COOH CH 2 + NAD + + H 2 0 L-Phenylalanin Abbildung 1: Reaktionsschema der Phenylalanin Dehydrogenase. Das Enzym benötigt NAD+ als natürliches Coenzym und wurde bei einigen gram-positiven, aeroben Bakterien gefunden. Anfänglich wurde die PheDH in Brevibacterium sp (Hummel et al., 1984) und später in anderen Bakterienstämmen wie Bacillus, Sporosarcina (Asano et al., 1987), Nocardia (de Boer et al., 1989), Thermoactinomyces (Ohshima et al., 1991), und Rhodococcus (Hummel et al., 1987) gefunden. Die Phenylalanin Dehydrogenase gehört zu einer großen Aminosäure-Dehydrogenasen-Familie, zu der die Glutamat Dehydrogenase, Alanin Dehydrogenase, Leucin Dehydrogenase, und die selten vorkommende LysinDehydrogenase gehören. Die PheDH kann für die Synthese von optisch aktivem LHomophenylalanin, einem Baustein vom Angiotensin, für die Behandlung von Bluthochdruck (Hypertension) und Herzfehlern (Abrams et al., 1984; Ondetti & Cushman, 1981) und ebenfalls für die Herstellung von Allysin als Vasopeptidase Inhibitor (Hanson et al., 2000) sowie zur industriellen Synthese von L-Phenylalanin als Komponente von Aspartam (Wichmann et al., 1981) verwendet werden. Ebenso kann das Enzym für den Nachweis der Phenylketonurie (Centerwall & Centerwall, 2000) mittels eines Biosensors eingesetzt werden (Wendel et al., 1991; Wendel et al., 1990). Die Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 ist im Gegensatz zu den octameren Phenylalanin Dehydrogenasen aus Bacillus sphaericus (Okazaki et al., 1988) und Sporosarcina urea (Asano et al., 1987) ein Tetramer von 39.5 kDa pro Monomer (Brunhuber et al., 1994). Die Phenylalanin Dehydrogenase aus Thermoactinomyces liegt als Hexamer vor (Takada et al., 1991). In Abbildung 2 ist der Reaktionsmechanismus der Phenylalanin Dehydrogenase dargestellt (Brunhuber et al., 2000). Die reduktive Aminierung des Phenyl- Einleitung 5 pyruvats erfolgt über die Bildung von Iminophenylpyruvat, das in einem weiteren Schritt zu L-Phenylalanin reduziert wird. Abbildung 2: Reaktionsmechanismus zur Aminierung von Ketosäuren und die dabei beteiligten Aminosäuren in der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase. Einleitung 6 Die Kristallisation und Aufklärung der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 wurde durch Vanhooke et al (Vanhooke et al., 1999) ermöglicht. Basierend auf den Daten der dreidimensionalen Struktur konnte die PheDH mittels 3D-Programm (Swiss PDB Viewer) modelliert werden (Abbildung 3). Hervorgehoben sind die Aminosäure Lysin an Position 66 im aktiven Zentrum, die Lage des Substrates Phenylpyruvat und das Coenzym NAD+. NAD+ Phenylpyruvat Lysin 66 Abbildung 3: Dreidimensionale Struktur der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4. Dargestellt ist das Enzym mit dem Substrat Phenylpyruvat ohne Coenzym und Inhibitor. Die Pfeile zeigen auf die Aminosäure Lysin 66, die im aktiven Zentrum beteiligt ist, sowie auf das Substrat im Substratkanal. Die tiefe Spalte ist ein typischer Substratkanal für Aminosäure Dehydrogenasen. Einleitung 7 Zur Veranschaulichung sind die beteiligten Aminosäuren im aktiven Zentrums mit den Wasserstoffbindungen zum Substrat und Coenzym (NAD) in Abbildung 4 dargestellt. Lysin 78 NAD+ Phenylpyruvat Lysin 66 Abbildung 4: Die beteiligten Aminosäuren im aktiven Zentrum der PheDH. Die Aminosäure Lysin 66 ist die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Phenylpyruvat Einleitung 8 1.3.1 Malic enzyme aus E. coli K12 Das NAD abhängige malic enzyme ist in der Natur weit verbreitet und katalysiert die oxidative Decarboxylierung von L-Malat. Dieses Enzym gehört zur Klasse der Oxidoreduktasen und kann für die kolorimetrische Bestimmung von Malat und ebenfalls für die NADH-Regenerierung im Enzymreaktor eingesetzt werden (Nakamura et al., 1986). Das malic enzyme wurde sehr umfangreich in verschiedenen Organismen, in Bakterien (Sulfolobus solfataricus (Iwakura et al., 1978), Clostridium thermocellum (Lamed & Zeikus, 1981), Bacillus subtilis (Diesterhaft & Freese, 1973), Pseudomonas fluorescens (Knichel & Radler, 1982), in Pflanzen Zea mays, Solanum tuberosum (Hausler et al., 1987; Willeford & Wedding, 1987), und ebenfalls in höheren Organismen, Rattenleber (Bagchi et al., 1987; Magnuson et al., 1986; Winberry et al., 1983) untersucht. Das in dieser Arbeit klonierte NAD abhängige E. coli K12 malic enzyme zeigt Ähnlichkeit im Molekulargewicht (50 kDa) zum malic enzyme aus Bacillus stearothermophilus (Kobayashi et al., 1989) aber einen Unterschied zum NADP-abhängigen malic enzyme aus E. coli (62 kDa) (Nakamura et al., 1986). 1.3.2 L-Phenylalanin-Synthese unter Coenzymregeneration Verschiedene Wege führen zur Produktion der Aminosäure L-Phenylalanin. Man kann dies durch chemische Synthesen, Extraktion von Protein-Hydrolysaten, fermentative oder enzymatische Methoden erreichen. Eine direkte Fermentation zur Produktion von LPhenylalanin ist mit Corynebacterium glutamicum (Nakayama et al., 1978) oder Bacillus subtilis (McEvoy & Joyce, 1974) beschrieben. Dennoch konnten mittels der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 in einem Enzym-Membran-Reaktor 456 g L-1·d-1 L- Phenylalanin erzielt werden (Hummel et al., 1987). Die Synthese des L- Phenylalanins wurde durch die PheDH unter Regeneration des Coenzyms NADH mit der Formiat Dehydrogenase (FDH) katalysiert. Phenylpyruvat wird in diesem System durch reduktive Aminierung mit Hilfe von PheDH in L-Phenylalanin umgewandelt. Gleichzeitig sorgt die FDH für die Regenerierung des NADH durch Formiat (Abbildung 5) (Hummel et al., 1987). Für die Regenerierung des NADH im industriellen Maßstab wird bis dato die NAD-abhängige Formiat Dehydrogenase eingesetzt (Kula & Wandrey, 1987; Shaked & Whitesides, 1980). Das Verfahren konnte großtechnisch angewandt werden (Kragl et al., 1992). Einleitung 9 R egeneration des Coenzymes NAD H NAD + Formiat L-Phenylalanin + H 2 O PheDH FDH NADH CO 2 Phenylpyruvat + N H 4 + Abbildung 5: Schema zur Synthese von L-Phenylalanin unter Regeneration des Coenzyms NADH mittels Formiat Dehydrogenase. 1.3.3 Expression rekombinanter Proteine Die Möglichkeit, Proteine, die normalerweise entweder gar nicht oder nur in extrem geringen Mengen verfügbar waren, in großen Mengen herzustellen, beeindruckte Wissenschaftler, Ärzte und Geschäftsleute gleichermaßen. Im Jahre 1976 hielt die Gentechnik Einzug in die Biotechnologie. Erstmals wandte man die Verfahren der DNA-Klonierung, Oligonucleotidsynthese und Genexpression in einem einzelnen Experiment an, bei dem man ein menschliches Protein durch die Expression einer rekombinierten DNA gewann. Es handelte sich um den aus 14 Aminosäuren bestehenden Peptidneurotransmitter Somatostatin (Itakura et al., 1977). Das Gen des entsprechenden Proteins wurde in einem Plasmid kloniert und in E. coli exprimiert. Wenig später gelang die Expression des menschlichen Insulins (Nossal, 1980), das zur Behandlung des Diabetes dient und zum ersten kommerziell genutzten Produkt der Gentechnik wurde. Solche Meisterleistungen beruhten auf Erfolgen in allen Bereichen der Molekularbiologie, unter anderem der Oligonucleotidsynthese, der Isolierung der DNA-spaltenden und verknüpfenden Enzyme, der Charakterisierung bakterieller Plasmide und der Erforschung der Genexpression. Eine Vielfalt an Expressionsplasmiden ist kommerziell erhältlich. Die Minimal-Ausstattung solcher Plasmide besteht aus einem Promotor, einer Ribosomenbindungsstelle, dem Origin of Replication, und einem Selektionsmarker. Dennoch führt der Abbau oder die chemische Modifizierung des Antibiotikums durch das Produkt des Resistenzgens oder den Wirtsstamm oft zur Reduktion der Plasmidkopienzahl in der Zelle und begünstigen die Entstehung heterogener Organismenpopulationen (Bentley et al., 1993). Einleitung 10 Für die Verbesserung solcher Systeme wurden spezielle DNA-Sequenzen bezüglich Plasmidstabilität, mRNA-Stabilität, effizienter Translationsinitiation, und rechtszeitiger Transkriptionstermination entwickelt (Balbas & Bolivar, 1990). Beispiele solcher Sequenzen bilden Repressorgene, Terminatoren, Antiterminatoren, Sekretionsgene und Reportgene (Stader, 1995). Die Stabilität des Fremdgens oder Plasmids (Segregationsstabilität), wird durch hohe Kopienzahl, par-Sequenzen und Selektionsmarker gefördert (Balbas & Bolivar, 1990). Durch die Einführung einer par-Sequenz kann die Segregationsstabilität eines Expressionsvektors erhöht werden (Zurita et al., 1984). Einfluß üben außerdem die Transkriptionsaktivität des Fremdgens und die genetischen Eigenschaften des Wirtsorganismus (Stader, 1995) sowie die Zusammensetzung des Kulturmediums aus (Mason & Bailey, 1989). Die Klonierung des Gens der cDNA eines Proteins ist nur der erste von vielen Schritten, um gentechnisch ein Protein für medizinische oder industrielle Anwendungen herzustellen. Der nächste Schritt besteht darin, das Gen in eine Wirtszelle einzuschleusen und es darin zu exprimieren. Die bekanntesten Expressionssysteme sind die Bakterien E.coli und Bacillus subtilis, die Hefe, sowie kultivierte Insekten- und Säugetierzellen. Welches System geeignet ist, hängt von den Projektzielen und den Eigenschaften des zu produzierenden Proteins ab. Bakterienzellen sind einfache Systeme mit kurzer Generationszeit, hoher Ausbeute und niedrigen Kosten. Die Zellen, insbesondere von B. subtilis, lassen sich induzieren und schleusen das Produkt in das Kulturmedium aus, was die Reinigung des Proteins außerordentlich vereinfacht. Allerdings haben prokaryotische Zellen auch einige Nachteile. Manche Proteine werden zwar extrem stark exprimiert (sie können mehr als 20 % der Masse aller Bakterienproteine ausmachen), aber oft falten sie sich nicht korrekt, und bilden dann unlösliche Einschlusskörper (inclusion bodies) (Hibino et al., 1994). Diese Proteine kann man zwar durch Extraktion gewinnen, sie sind allerdings in aller Regel biologisch inaktiv. Kleine Proteine lassen sich unter Umständen in ihre aktive Form überführen (Babbitt et al., 1990; Huang et al., 1993), bei großen Produkten ist das jedoch normalerweise nicht möglich. Ein zweites Problem ist, dass Fremdproteine für Bakterien manchmal toxisch sind wie z.B. Aminosäure-Oxidasen, sodass Kulturen, die das Protein herstellen, nicht in hoher Dichte wachsen können. Diese Schwierigkeit lässt sich oft durch einen induzierbaren Promotor umgehen. Wenn die Kultur dicht gewachsen ist, schaltet man den Promotor an, der daraufhin mit der Transkription des Gens für das toxische Fremdprotein beginnt. Einleitung 11 Drittens fehlen den Bakterien jene Enzyme, die Proteine in Eukaryotenzellen nach der Translation modifizieren, indem sie ihnen beispielsweise Phosphatgruppen oder Zuckerreste anhängen. Derartige chemische Modifikationen sind häufig notwendig, damit die Proteine Aktivität zeigen. Eine Möglichkeit zur posttranslationalen Modifikation besteht darin, die modifizierenden eukaryotischen Enzyme zu reinigen und mit ihnen bakteriell exprimierte Proteine nachträglich abzuwandeln. 1.4 Protein-Design 1.4.1 Gezielte Mutagenese Die Nutzung von Mikroorganismen und der daraus gewonnenen Enzyme erhalten neue Aspekte durch die Gentechnik, mit denen sowohl neue Produkte herstellbar werden, als auch erhebliche Verbesserungen in Ausbeute und Qualität bei konventionellen Produkten zu erwarten sind. Mittels NMR-Techniken und Röntgenstrukturanalyse wurde die Ermittlung der dreidimensionalen Struktur eines Proteins ermöglicht, und durch den Einsatz von Computertechnik gezielt Veränderungen vorgenommen. Über die gezielte Verknüpfung dieser Strukturaufklärung mittels Computertechnik mit den neuen Kenntnissen der Biochemie und der Molekularbiologie können wirtschaftlich interessante Enzyme untersucht und modifiziert werden. So wurden Enzymvarianten hergestellt, die sich durch überlegene Eigenschaften, wie z.B. höhere Aktivität, bessere Stabilität, erweitertes Substratspektrum oder Coenzymspezifität auszeichnen (Galkin et al., 1997; Slusarczyk et al., 2000). Einige veränderte Enzyme können so technisch interessante Chemikalien bis zu 10000x besser umsetzen, als die natürliche Form des Enzyms (Wilkinson et al., 1984). Statt tausender von Proteinen auf mögliche Wirksamkeit zu testen, versucht man mit Hilfe des Protein-Designs eine neue maßgeschneiderte Struktur am Computer zu entwerfen. Diese neumodifizierten Enzyme werden dann mit molekularbiologischen Methoden hergestellt und hinsichtlich Struktur und neuer Eigenschaften untersucht. Für den Einsatz eines erfolgreichen rationalen Designs müssen vorab tiefgehende Informationen über Struktur und Reaktionsmechanismus vorliegen. Abbildung 6 zeigt den Zyklus, wie er normalerweise durchgeführt wird. Einleitung 12 m o le k u la r e s M o d e ll R a u m s tr u k tu r RKSA NMR K r is t a llis a t io n P r o t e in is o lie r u n g E ig e n s c h a f te n P r o t e in E x p r e s s io n M o d if ik a t io n P r im ä r s tr u k tu r K lo n ie r u n g W ild t y p D N A -S y n th e s e G enbank D N A - Is o la tio n Abbildung 6: Protein-Design Zyklus zur gezielten Mutagenese eines Enzyms (RKSA = Röntgenstrukturanalyse) Die Überlegung, dass durch die Senkung der Entfaltungsentropie mittels ausgewählter Aminosäurensubstitutionen die Konformation des T4-Lysozyms stabilisiert werden kann, haben Mathews et al. (Matthews et al., 1987) durch die Erzeugung einer Doppelmutante nachgewiesen und somit die Thermostabilität dieses Proteins erhöht. In einer folgenden Arbeit wurde durch die Einführung von zwei Disulfidbrücken an definierten Stellen im Lysozym, das heißt Austausch von vier Aminosäuren, die strukturell günstig für eine Ausbildung lagen, die Thermostabilität von 41°C auf 58°C erhöht, wobei das neu entstandene Enzym die volle Aktivität besaß (Matsumura et al., 1989). Vacca et al. (Vacca et al., 1995) konnten durch den Austausch von Tryptophan 140 gegen Histidin mittels gezielter Mutagenese die Reaktions- bzw. Substratspezifität der Aspartataminotransferase verändern. Dadurch kann Alanin siebenmal schneller als durch das Wildtypenzym racemisieren, während die Aktivität des Muteins gegenüber Alanin sechsfach abnahm. Die benötigte exakte Aufklärung der Struktur eines Enzyms ist ein Nachteil der gezielten Mutagenese, da sich die Strukturen bekannter Proteine nicht auf andere mit ähnlichen Sequenzmotiven übertragen lassen. Einleitung 13 1.4.2 Zufallsmutagenese Die Methode der „Zufallsmutagense“ (random mutagenesis), bei der ein großer Pool an Veränderungen in ein Enzym eingeführt wird, ist eine gute Alternative zum rationalen Protein-Design. Um das Screening der durch die Zufallsmutagenese hergestellten Enzymvarianten- Bibliothek ermöglichen zu können, sind geeignete und effektive Selektionsmechanismen notwendig. Mit geeigneten Methoden können die gewünschten Eigenschaften detektiert werden. Es wird eine Art künstlicher Evolution herbeigeführt (Arnold & Moore, 1997), bei der man den Selektionsdruck zur Verbesserung der Eigenschaften zu Hilfe nimmt (Bornscheuer et al., 1998; Bornscheuer et al., 1999). Diese Methode wurde zur Erhöhung der Temperaturstabilität (Bryan et al., 1986) bzw. der pH-Stabilität (Cunningham & Wells, 1987) von Enzymen oder zur Erhöhung der Resistenz (Oliphant & Struhl, 1989) erfolgreich angewandt. Durch den Austausch von Asparagin 218 gegen Serin konnte die Thermostabilität der Serin-Protease Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens im Vergleich zum Wildtyp um das vierfache gesteigert werden (Bryan et al., 1986). Hier erfolgte die Mutagenese durch Zugabe von Natriumbisulfit, das zur Desaminierung von Cytosin zu Uracil führte. Das Screening nach diesem Mutein erfolgte über ein geeignetes Subtilisinsubstrat und einen pH-Indikator auf Agarplatten, so dass beim Abbau des Substrates eine pH-Senkung stattfand und sich somit die Farbe des Indikators änderte. Zhou et al. verwendeten für die Erhöhung der Thermostabilität des Subtilisins die Polymerase- Ketten- Reaktion (PCR) (Zhou et al., 1996), konnten damit allerdings die gleichen Punktmutationen wie Bryan et al. nachweisen. In einer anschließenden gezielten Mutagenese wurde eine weitere Aminosäure substituiert und somit eine Doppelmutante erzeugt, die sowohl thermostabil als auch oxidationsresistent ist. Arnold et al. bewirkte eine Verbesserung der Thermostabilität der Bacillus subtilis-Protease – Subtilisin E und erhielten somit eine ähnliche Thermostabilität wie bei der Thermoactinomyces vulgaris- Thermitase (Zhao & Arnold, 1999). Mit der „error-prone“ Methode konnte ebenfalls die Aktivität vom Subtilisin E auf das 16 fache erhöht werden (You & Arnold, 1996). Die gerichtete Evolution als erfolgreiches Konzept zeigen die folgenden Beispiele: p-NB-Esterase: 3 Mutationen / höhere Aktivität in org. Lösungsmittel (Moore et al., 1997) Subtilisin E: 8 Mutationen / 1000 x höhere Halbwertszeit bei 65°C (Zhao et al., 1998) Einleitung 14 Die Zufallsmutagenese hat folgende Vorteile: 1. keine Strukturinformation nötig 2. schnellerer Optimierungsprozeß 3. mehrere unspezifische Mutationen/Generationen sind möglich 1.5 Hochzelldichte-Fermentation (HZD) Um die durch kontinuierliche Zuführung ein oder mehrerer Nährstoffe während der Fermentation auftretende Katabolit-Repression und Anreicherung toxischer Substanzen vermeiden zu können, erfolgt die Kultivierung rekombinanter Mikroorganismen in der Regel mittels der fed-batch-Technologie. Die HZD-Fermentation dient zur Verbesserung der Produktivität mikrobieller Systeme, der Reduktion von Produktions- Investitionskosten und Kulturvolumina (Knorre et al., 1991). Ebenso können Sauerstoffverbrauch und die Wärmeentwicklung durch die Limitierung der Wachstumsrate kontrolliert werden (Riesenberg, 1991). Dennoch führen die Substratlimitation und -inhibition, Limitierung der Sauerstoffversorgung und Wärmetransfer, CO2 –Konzentration sowie die Bildung metabolischer Nebenprodukte zu Problemen bei der HZD-Fermentation (Riesenberg et al., 1991). Metabolische Nebenprodukte: Die Bildung von Nebenprodukten hängt von der Zusammensetzung des Mediums, dem Wirtsstamm und der spezifischen Wachstumsrate ab (Pan et al., 1987). Unvollständig oxidierte Nebenprodukte wie Acetat, Lactat, Pyruvat, Ethanol und Isobutyrat werden von E. coli Kulturen, deren Dichte über 40 g Biomasse pro Liter Medium beträgt, akkumuliert (Landwall & Holme, 1977; Paalme et al., 1990). Dieser Effekt ist durch die Bildung von Salzen im Medium zu beobachten (Jensen & Carlsen, 1990). Nach Lee et al. führt insbesondere das Nebenprodukt Acetat zur Inhibition des Wachstums, infolgedessen wird die Produktion des heterologen Proteins vermindert (Lee, 1996). CO2-Konzentration: Verminderte Wachstumsrate sowie die Bildung metabolischer Nebenprodukte können bei CO2-Partialdrücke oberhalb 0,3 atm beobachtet werden (Pan et al., 1987). Einleitung Sauerstofftransfer: 15 Da das Wachstum rekombinanter E.coli-Zellen unter aeroben Bedingungen erfolgt, sollte der Sauerstoff-Partialdruck nicht unter 10 % sinken. Dennoch wächst das Problem der Sauerstoff-Transferrate bei großen Fermentervolumina aufgrund der Löslichkeit von Sauerstoff in Wasser, die auf maximal 200 mmol O2 pro Liter limitiert ist (Riesenberg, 1991). Substratinhibition: Die Inhibierung des Wachstums wird durch Substratkonzentrationen oberhalb bestimmter Grenzwerte verursacht. Hefeextrakt oder Pepton, die komplexe Verbindungen darstellen, sind nur in geringer Konzentration löslich (Riesenberg & Guthke, 1999). Fermenter-Durchmischung: Bei mangelhafter Durchmischung großer Fermenter sind Zellen, die sich nahe der Nährstoff-Injektionsstelle befinden, erhöhten Nährstoffkonzentration ausgesetzt, während an anderen Stellen Nährstoffmangel herrschen kann. Sowohl der Mangel als auch der Überschuss bewirken eine Verringerung der Zellausbeute (Neubauer et al., 1995) 2 Problemstellung und Zielsetzung Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, sowohl die NAD-abhängige Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) aus Rhodococcus sp. M4 als auch das malic enzyme aus E.coli K12 zu klonieren. Die Klonierung dieser zwei Enzyme im gleichen Plasmid sollte die Grundlage für die reduktive Aminierung von ? -Ketosäuren und gleichzeitig die Regeneration des Coenzyms mittels Ganzzell-Biotransformation ermöglichen. Ein weiteres Ziel war die Erweiterung des Substratspektrums der PheDH durch Mutagenese. Der Faktor, der die Effektivität der NADH-Regeneration im Produktionsprozeß herabsetzt, ist die schwache Aktivität und die mangelnde Stabilität des üblicherweise verwendeten Regenerationsenzym Formiat-Dehydrogenase (FDH). Die erforderliche Nachdosierung des Coenzyms während des Prozesses erhöht die Produktionskosten signifikant. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahren zu erhöhen, wird in dieser Arbeit das malic enzyme aus E. coli K12 als eine Alternative zur FDH für die Regeneration kloniert und überprüft. Die Klonierung des zweiten Enzyms – die rec-PheDH - soll eine Grundlage für die Mutagenese schaffen. Die Erweiterung des Substratspektrum der PheDH, wird mittels gezielter Mutagenese bzw. Zufallsmutagenese durchgeführt. Die Sequenz der PheDH wird mit bekannten Aminosäurensequenzen verglichen und die Bindungsstellen sowie die Einleitung 16 Interaktionen zwischen den Aminosäurenresten im aktiven Zentrum der PheDH zum Substrat bestimmt. Mit Hilfe der Kristalllisationsdaten der PheDH wird die PheDH modelliert und ein Proteindesign durchgeführt. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war, Einblicke in den Reaktionsmechanismus der PheDH und Aufschluss über die Struktur–Funktionsbeziehungen dieses Enzyms zu gewinnen. Hierbei sollte das aktive Zentrum der PheDH mit dem der Lactatdehydrogenase verglichen und eventuelle Mutagenese durchgeführt werden. Für die Erweiterung des Substratspektrums werden Mutationen in der PheDH mit Hilfe verschiedener Methoden eingeführt, um somit die Konstruktion einer neuen AminDehydrogenase für die Herstellung von aromatischen Aminen aus aromatischen Ketonen zu erreichen. Material 17 3 Material Geräte Analytik-Apparaturen Gaschromatograph Shimadzu HBLC-System Gynkotek (Germering) GC-9A Shimadzu (Düsseldorf) NMR-ARX500 Bruker Robocycler Stratagene Bildverarbeitung Eagle Eye II, Videosystem Stratagene (Heidelberg) Fraktionssammler Frac 100 (Pharmacia) Disintegration Schwingkugelmühle (Retsch) Disintegrator S IMA Ultraschallgerät Branson Dialyse und Ultrafiltration Ultrafiltrationskammer 8050, 8010 Amicon Fermentation 20 L-Bioreaktor Biostat Braun Contifuge 300 MD Heraeus Christ Elektrophorese Gel elektrophorese GNA 100 Pharmacia (Freiburg) Gelelektrophorese Horizon 11.14 Life Technologies (Eggenstein) Prep Cell Biorad Küvetten Mikroküvetten (50 µl), Quarzglas Hellma (Müllheim/Baden) Halbmikroküvetten (1 ml), optisches Glas Hellma (Müllheim/Baden) Fluoreszenzhalbmikroküvetten(1 ml), Quarzglas Hellma (Müllheim/Baden) Photometer UV/Vis-Spektralphotometer 16 A Shimadzu (Duisburg) UV/Vis-Spektralphotometer DU 650 Beckmann (Düsseldorf) Fluoreszenzphotometer LS 50 B Perkin Elmer (Düsseldorf Material 18 Zentrifugen Eppendorf-Zentrifuge 5415 C Eppendorf (Hamburg) Kühlzentrifuge Sorvall RC-5B Du Pont Instruments (Bad Homburg) Vacuumzentrifuge (Univapo 150 H) +Kühlfalle (Unicryo MC1L) Chemikalien Alle nicht aufgeführten Chemikalien für Lösungen und Puffer waren mindestens von analytischer Qualität (p.a.) und wurden in der Regel von Fluka, Sigma, Roth oder Merck bezogen. Nährmedienbestandteile waren von Merck oder Difco, die Coenzyme von Bts. Enzyme für die Molekularbiologie wurden von NEB, Pharmacia, Biozym, Stratagene oder Roche bezogen. Die Chemikalien für molekularbiologische Untersuchungen waren von höchster Qualität. Die genannten Chemikalien wurden in „ultra pure“ Qualität eingesetzt. Acetonitril Applied biosystems (Weiterstadt) EDTA Pharmacia (Freiburg) Acrylamid Biorad (München) Bis-Acrylamid Biorad (München) APS Biorad (München) Nucleotide/Nucleinsäuren dATP, dGTP, dTTP, dCTP DNA-Molekulargewichtsmarker: A. DNA-Marker IV [Boehringer] B. DNA-Marker VI [Boehringer] C. DNA-Marker VII [Boehringer] D. DNA-Leiter [Gibco] Pharmacia (Freiburg) Material 19 Enzyme BamHI, NcoI StuI, EcoRI, HindIII,pStI, NdeI, SmaI Biolabs RNaseA Roth (Karlsruhe) Taq-DNA-Polymerase (10 U/µl) Finnzyme Ligase Roche Alkalische Phosphatase Promega (Heidelberg) Mikroorganismen E. coli BL21 [hsdS gal (? cIts857 ind1Sam7 nin5 lacUV5)] E. coli DH5? [supE44 ? lacU169 ? 80lacZ? M15) hsdR17 recA1 gyrA96 thi1relA1] E. coli HB101 [supE44 hsdS20 (rB- mB-) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20xyl-5mtl-1] E. coli JM105 [subE endA sbcB15 hsdR4 rpsL(strr) thi ? (lac-proAB) F(traD36proAB+ lacIq lac? ZM15)] E. coli JM109 [recA1 sup E44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi ? (lac-proAB F’(traD36proAB+ lacIq lacZ? M15)] E. coli XL1-Blue [supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA1 lac- F’[proAB+ lacIq lacZ? M15 Tn10(tetr)] Vektoren pKK223-3 [4,584kb, ColE1-Replicon, Ptac, Ampr] pTRC99a [4,176 kb, ColE1-Replicon, Ptrc, lacIq, AmpR] pUC18 [2,686 kb, ColE1-Replicon, lacZ’, lacI, AmpR] pET-16b [5,711 kb, His.Tag, T7, Amp] Kits für die Molekularbiolgie Sure clone Kit Pharmacia Plasmid Präparation Qiagen DNA Extraktion Qiagen Auto Read Sequencing Kit Pharmacia Rapid DNA Ligation Kit Roche Methoden 20 4 Methoden 4.1 Molekularbiologie 4.1.1 Isolierung der genomischen DNA Sowohl die genomische DNA von Rhodococcus sp. M4 für die Isolierung der Phenylalanin Dehydrogenase als auch die des E. coli K12 für malic enzyme, wurden nach van Soolingen et al. isoliert (van Soolingen et al., 1991). Dafür wurden Kulturen mit einer einzelnen Kolonie angeimpft und bei 30°C und 120 rpm bis zu einer optischen Dichte OD600 ca. 0.7 wachsen gelassen. Die Kultur wurde für 30 min bei 80°C erhitzt und dann abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml TE-Puffer resuspendiert. Nach dem Resuspendieren wurden die Zellen mit 0.5 ml Lysozym (10 mg/ml) behandelt, und für 30 min bei 37°C inkubiert. 1.5 ml 10 %iges SDS und 120 µl Protease K (10 mg/ml) wurden zugefügt und für 10 min bei 65°C inkubiert. Durch diese Behandlung konnten die Proteine denaturiert und ausgefällt werden. Um die restlichen Proteine und Lipide zu fällen, wurde die Lösung mit 1 ml 5 M NaCl und 1.5 ml N-Cetyl-N,N,N-trimethylammonium Bromid/NaCl, (4.1 g NaCl, 10 g Ncetyl-N,N,N-trimethylammonium Bromid in 100 ml H2O), versetzt. Der ganze Ansatz wurde gut vermischt und für 20 min bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde durch ein äquivalentes Volumen von CHCl3 / Isoamyl Alkohol (24:1) nach Zentrifugation extrahiert. Der Vorgang wurde zweimal durchgeführt, um die DNA vollständig zu isolieren. Die DNA aus der wässrigen Phase konnte durch 0.6 Vol. Isopropanol bei -20°C für 30 min gefällt werden. Danach wurde sie abzentrifugiert und das erhaltene DNA-Pellet mit 2 ml 70%igem kalten Ethanol gewaschen. Da Ethanol spätere Reaktionen inhibieren könnte, wurde die DNA durch Zentrifugation im Vakuum (vacuum speed univapo) getrocknet. Zum Nachweis der Reinheit der DNA können zwei Methoden eingesetzt werden: 1. Absorption bei 260 und 280 nm 2. durch Gelelektrophorese ( 0.5 % Agarose) Methoden 21 4.1.2 Auftrennung von DNA-Fragmenten über Elektrophorese Die Agarose wurde durch Aufkochen in der gewünschten Konzentration (0,8-1.2 %) in 1xTBE-Puffer gelöst und nach dem Abkühlen auf ca. 60°C mit 1/20000 Volumen an Ethidiumbromid (10 mg/ml) versetzt und in horizontale Kammern gegossen. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 1/6 Volumen Probenpuffer gemischt. Die Elektrophorese erfolgte in einer mit 1xTBE-Puffer gefüllten Kammer. Die Ethidiumbromidfluoreszenz wurde im UV-Durchlicht (312 nm) mit dem Videosystem „Eagle Eye II“ (Stratagene) aufgezeichnet. 6X Probenpuffer: 30 % Glycerin, 0,25 % Bromphenolblau TBE-Puffer: 90 mM Tris-HCL, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH8,2 Als Größenstandard für die DNA- Gelelektrophorese wurde die kB-Leiter der Fa. Gibco benutzt. 10X TBE-Puffer: Tris 121.12 g Borsäure EDTA 51.32 g 3.72 g Probenvorbereitung: Die zu trennende DNA-Lösung wurde mit einfach DNA-Probenpuffer [Endkonzentration] pH 8.0 versetzt. DNA-Probenpuffer [6fach]: 6xTBE; 50 % (v/v) Glycerin; 0.25 % (w/v) Bromphenolblau 4.1.3 Ethanolfällung Zur Konzentrierung und Reinigung von DNA-Lösungen wurden diese mit 2 Vol. Ethanol und 1/10 Vol. 3 M Natriumacetat, pH 4.8 versetzt, 30 min. bei –20°C inkubiert und 20 min. bei 4°C und 13000 rpm abzentrifugiert. Die sedimentierte DNA wurde zweimal mit 70 % Ethanol (v/v) gewaschen, in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in Aq. bidest oder TE-Puffer, pH8.0 (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA) resuspendiert. Methoden 22 4.1.4 Polymerase Ketten Reaktion [PCR] Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) bietet die Möglichkeit, gezielt spezifische DNAFragmente zu amplifizieren. Durch entsprechende Geräte [Robocycler, Stratagene] ist die Reaktion komplett automatisiert. Durch Zugabe von genomischer DNA oder Plasmiden zusammen mit für ein DNA-Stück spezifischen Primern wird dieses DNA-Stück durch die Taq-Polymerase [Thermus aquaticus] amplifiziert. Da die Taq-Polymerase die hohen Denaturierungstemperaturen von 94°C übersteht und diese Temperatur für die Aufspaltung der doppelsträngigen DNA benötigt wird, ist es möglich, über viele Zyklen eine Amplifikation zu erreichen. Innerhalb jedes Zyklus erhöht sich exponentiell die Zahl des Template, da jedes neu gebildete Template Ausgangsmaterial für das nächste wird. Ein Zyklus besteht aus einem Denaturierungsschritt [94°C], einem Annealingschritt, in dem die Primer an das Template binden [Temperaturvariabel] und einem Amplifizierungsschritt [72°C], bei dem die Polymerase aktiv ist. Der Reaktionsansatz aus: 10 mM Tris pH 8.3 50 mM KCl 1.5 mM MgCl2 jeweils 200 µM dATP, dCTP, dTTP, dGTP 20-40 pmol jedes Oligonucleotid-Primers 2.5 U Taq-Polymerase pro 100 µl Ansatz 10 ng Plasmid-DNA als PCR-Template Die PCR Amplifikation wurde auf einem automatischen DNA-Thermal-Cycler (Robocycler, Fa. Stratagene) nach folgendem Programm durchgeführt. ??5 min Denaturierung bei 94°C (zu Anfang des Programms 1x) ??1.2 min Annealingsschritt, in dem die Primer an das Template binden ??1.5 min Extension (Verlängerung der Primer durch die Taq-Polymerase) bei 72°C [Temperaturvariabel]. ??1 min Denaturierung bei 95°C ??Zyklisches Wiederholen der letzten drei Schritte (25-30x) ??5 min Extension (nach Abschluß der PCR, um eine vollständige Verlängerung eventuell vorher abgebrochener DNA-Produkte zu gewährleisten) Methoden 23 4.1.5 Berechnen der Schmelztemperatur der Primer Die Schmelztemperatur Tm der Primer wurde nach Thein und Wallace (Thein & Wallace, 1988) abgeschätzt: Schmelztemperatur Tm[°C] = 2x(Basenzahl A+T)+3x(Basenzahl G+C) Diese Bezeichnung gilt für Primerlängen ? 24 bp. Für Primerlängen ? 14 bp gilt [MWG-Biotech]: Schmelztemperatur Tm [°C] = 69.3°C + 0.41 x (GC-Gehalt [%]) – 650 / Primerlänge Annealingtemperatur Ta [°C] = Tm + 3°C 4.1.6 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen Die aus dem Gel ausgeschnittenen DNA-Banden können auch über spezielle Membransäulen aus dem Gel eluiert werden. Das dreifache Volumen des Gelstückgewichts an Puffer QX1 [keine Herstellangaben] wird hinzugegeben, und die Probe unter einmaligem Schütteln 10min bei 50°C inkubiert. Die Lösung wird auf eine Qiaquick-Zentrifugationssäule gegeben und 60sec bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Filtrat wird verworfen und die Säule durch erneute Zentrifugation mit 0.75 ml Puffer PE gewaschen und durch nochmalige Zentrifugation Reste des Puffers von der Membran der Säule entfernt. Abweichend von den Herstellerangaben wurde jedoch zur Elution 50 µl H2O (pH 8.0) verwendet. Die eluierte DNA wurde über Einengen in der Vakuumzentrifuge auf die gewünschte Konzentration gebracht und weiterverarbeitet. Eine zweite Methode zur Isolierung der DNA- Fragmente erfolgte ebenso nach einem Qiagen Kit, mit dem man die komplette PCR-Lösung mit fünffachem Puffer PB [keine Herstellungsangaben] verdünnt und in eine Qiaquick Säule pipettiert. Die Säule wird zusammen mit einem Auffanggefäß 60 sec bei 13000 rpm zentrifugiert. Die DNA kann nun mit 0.75 ml PE-Puffer [Ethanol] gewaschen. Dabei werden durch nochmalige Zentrifugation (60 sec., 13000 rpm) sämtliche Reste des PE entfernt. Anschließend wird die DNA mit 50µl 1mM Tris bzw. H2O pH 8.0 [1min, 13000 rpm] von der Säule eluiert und über Vakuumzentrifugation auf das gewünschte Volumen zur Weiterverarbeitung eingeengt. Methoden 24 4.1.7 Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA Linearisierte Plasmide, deren Religationsrate aufgrund des Vorliegens komplementärer Enden besonders groß war, wurden unter Verwendung Alkalischer Phosphatase an ihren 5’-Termini dephosphoryliert. Dazu wurden 40µl des Restriktionsansatzes mit 1U alkalischer Phosphatase aus Shrimps (Shrimp Alkaline Phosphotase, SAP, Boehringer Mannheim) versetzt, mit dem zugehörigen, Zn2+-haltigen Reaktionspuffer und Aq. bidest. auf ein Endvolumen von 50µl gebracht und 30 min. bei 37°C inkubiert. Eine weitere Unit des Enzyms wurde nach Ablauf dieser Periode zugefügt und die Inkubation um zusätzliche 30 min. verlängert. Das Enzym wurde mit einem Vol. Phenol-Isoamylalkohol-Chloroform (25:24:1; v/v/v) aus dem Ansatz extrahiert und die dephosphorylierte Vektor-DNA durch Ethanolfällung gereinigt. 4.1.8 Ligation Die Ligation der geschnittenen und isolierten Gene erfolgte sowohl mit Hilfe der T4-DNALigase der Firma Roche als auch mit dem „sure clone kit“ der Fa. Pharmacia. Je nach Schnittenden wurde für Ligationen mit überhängenden Enden (sticky-ends) ein molares Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:3 bzw. glatten Enden (blunt-end) von 1:5 gewählt. Nach vorschriftmäßiger Reaktion mit Klenowenzym und Phosphonucleotidkinase (zur Auffüllung und Phosphorylierung der PCR-Enden) wurden die Fragmente von den Proteinen mittels Agarosegel aufgereinigt. Genfragment 1-16 µl [50-200 ng] Klenow-Fragment 1 µl 10 x Puffer 2 µl Polynucleotidkinase 1 µl Der Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert, dann ein äquivalentes Volumen an PhenolChloroform zugegeben, intensiv vermischt [Vortex] und zur Phasentrennung bei 13000 rpm 2min abzentrifugiert. Die obere Phase wurde abgenommen und auf ein Agarosegel aufgetragen. Das Genfragment wurde aus dem Gel isoliert. Anschließend wurde eine Ligation der glatten Enden durchgeführt. Ligation nach „sure clone kit Pharmacia“ Genfragment 50-200 ng pUC18 Vektor 50 ng 2 x Ligationspuffer 10 ng DTT 1 µl Methoden 25 T4-Ligase H 2O 1 µl ad 20 µl Das Reaktionsgemisch wurde für 4 h bei 16°C inkubiert und dann kompetente E.coli Zellen [verschiedene Stämme] mit dem ligierten Plasmid transformiert. Ligation nach “rapid ligation kit Roche” Genfragment 6 µl (200 ng) Plasmid (geschnitten) 2 µl (50 ng) Dilution Puffer (keine Herstellerangaben) 2 µl Ligation Puffer (keine Herstellerangaben) 10 µl T4-Ligase 1 µl Das Reaktionsgemisch wurde für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann kompetente E. coli Zellen [verschiedene Stämme] mit dem ligierten Plasmid transformiert. 4.1.9 Herstellung kompetenter Bakterienzellen Die Herstellung kompetenter E. coli XL1 Blue und JM 105 sowie HB101 erfolgte nach der Methode von Hanahan (Hanahan, 1983). Die Lagerung erfolgte bei –80°C. Aus dem konservierten E. coli Stamm, wurden 5 ml LB-Medium 5 % angeimpt und über Nacht wachsen gelassen. 200 µl davon werden in 300 ml LB-Medium überimpft, das dann bis zu einer OD550 0.5 bei 37°C inkubiert wird. Die Kultur wird dann in eine SS34Zentrifugenbecher überführt, 15 min auf Eis gekühlt und dann bei 4°C abzentrifugiert. ( 5000 rpm, 10 min. ). Die Zellen werden mit einer Lösung von 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM KaliumAcetat pH 5.8, 10 mM CaCl2, 15 % (v/v) Glycerin resuspendiert und erneut für 1h auf Eis gestellt. Anschließend werden die Zellen nochmals abzentrifugiert und in einer Lösung von 10 mM MOPS pH 7.0, 10 mM RbCl, 15 mM CaCl2, 15 % (v/v) Glycerin aufgenommen und 15 min auf Eis inkubiert. Diese Zellsuspension wird dann in Aliquots von 100 µl schockgefroren (flüssiger Stickstoff) und bei -80°C aufbewahrt. Methoden 26 4.1.10 Transformation Die Standardtransformation wurde nach dem Protokoll von Hanahan (Hanahan, 1983) durchgeführt. Hierzu wurden 100-200 µl kompetenter E. coli –Zellen auf Eis aufgetaut und 40 ng DNA aus dem Ligationsansatz zugegeben. Die Plasmidzellsuspension wurde 30 min auf Eis gekühlt und anschließend für 90 sec auf 42°C erwärmt und sofort wieder auf Eis gekühlt. Nach Zugabe von 300 µl LB - Medium wurden die Zellen zur Regeneration etwa 45 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 200 µl dieser Kultur auf einer Antibiotikahaltigen LBPlatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. 4.1.11 Schnellisolierung von Plasmid-DNA aus E.coli (modifiziert nach Birnboim und Doly) Für die Schnellisolierung von Plasmiden werden die Zellen einem osomotischen Schock ausgesetzt und die Proteine danach ausgefällt, wobei die Zellen mit osmotischen Lösungen behandelt werden, die zum Platzen der Zellen führen (Birnboim & Doly, 1979). 1.5ml einer Übernachtkultur werden abzentrifugiert und mit 100µl Lsg. A + 100 µg/ml RNase sowie 200 µl Lsg. B versetzt (für 5 ml ÜN-Kultur werden alle Mengen bis zur IsopropanolFällung vervierfacht). Der Ansatz wird dann 5 min auf Eis gelegt, gefolgt von 150 µl Lsg. C. Nach der Zugabe von Lsg. C wird der Ansatz wieder auf Eis für 15 min inkubiert und anschließend für 10 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand (400µl) wird mit 260µl Isopropanol versetzt und bei -20°C für 30min absetzen gelassen. Danach wird der Ansatz für 5 min bei 13000 rpm abzentrifugiert und 2x mit 70%igem kaltem Ethanol gewaschen. Über der Speedvacuumzentrifuge werden die Plasmide getrocknet und in 50 µl TE-Puffer resuspendiert und bei -20°C aufbewahrt. Lsg. A: Lsg. B: Lsg. C: 50 mM Glucose 10 mM EDTA 2.5 mM Tris pH 8.0 0.2 M NaOH 1 % SDS 3 M NaAC pH 8.0 (mit HCl titriert) Methoden 27 4.1.12 Plasmidisolierung [Biorad] Für die saubere Plasmidreinigung wurde das Quantum Prep? (Plasmid Miniprep kit [Biorad]) verwendet. Die bindende Matrix ist ein Silicon dioxid exoskeleton aus Diatome. Für die Reinigung der Plasmide wurden 2 ml transformierte Zellen bei 13000 rpm für 30 sec. abzentrifugiert und den Überstand entfernt. Dazu wurden 200µl Cell-Resuspension zupipettiert und gut resuspendiert (Vortex). Auf die Zellsuspension wurden 250 µl Cell-Lysis-Solution zugegeben und gut vermischt. Nach der Behandlung mit der Lyse-Lösung wurden 250 µl „Neutralization Solution“ zugegeben und vorsichtig vermischt (nicht vortexen). Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (5 min bei 13000 rpm). Die wäßrige Phase wurde entfernt und mit 200 µl Matrix-Suspension vermischt. Die Lösung wurde dann in einen Spin-Filter angebracht und bei 13000 rpm für 5’abzentrifugiert. Der Bodensatz wurde entfernt und der Ansatz (im Spin-Filter) wurde mit 500µl „WashSolution“ durch Zentrifugation gewaschen. Der Waschvorgang wurde 2x wiederholt. Der Bodensatz wurde wieder entfernt und die Plasmid-DNA mit 56°C heißem deionisiertem H2O durch Zentrifugation für 30 sek. eluiert. Die Plasmid-DNA wurde bei -20°C aufbewahrt. 4.1.13 Plasmidisolierung [Qiagen] Um die Plasmide aus den Bakterienzellen zu isolieren, wurde der Plasmid-Präparations-Kit der Fa. Qiagen verwendet. Dieser beruht auf dem Prinzip der alkalischen Lyse in Verbindung mit einer Anionenaustauschchromatographie. Zur Vermeidung der Kopräzipitation störender Salze wurde die anschließende Isopropanol- Fällung bei Raumtemperatur durchgeführt und auch das 2 malige Ethanolwaschen (70 %) erfolgte bei Raumtemperatur. Nach der Trocknung in der Speed-Vac wurde das erhaltene Pellet in 10 µl 1 mM Tris, pH 8.0 aufgenommen. Die genaue Konzentration wurde mittels Restriktion eines 1µl Aliquots gelelektrophoretisch bestimmt. Methoden 28 4.1.14 Restriktion Analytische Restriktionen erfolgten in einem Volumen von 30 µl, präparative in einem Volumen von 50µl. Die für die einzelnen Restriktionsenzyme nötigen Puffer-Konzentrationen folgten den Herstellerempfehlungen. Die DNA-Menge für den präparativen Verdau lag in einem Bereich von 3-4 µg/Ansatz. Die Vektoren wurden noch zusätzlich 1h mit 5 Units alkalischer Phosphatase bei 37°C inkubiert, um die 5’-Phosphatgruppe zu entfernen und so die Religation des Vektors zu verhindern. 4.1.15 Sequenzierung Die DNA- Sequenzierung erfolgte per Auftrag durch die Firma SequiServe, Vaterstetten, oder mittels eines Automated Laser Fluoreszenz- (A.L.F.) Sequenzierautomaten (Fa. Phasrmacia ) in einem 6 %igen Polyacrylamidgel. Die Sequenzreaktion nach Sanger et al. (Sanger et al., 1977) mittels T7- DNA-Polymerase wurde gemäß Herstellerangaben durchgeführt [AutoRead TM Sequencing Kit, Fa. Pharmacia]. Pro Sequenzierung wurden 7 µg hochreine Plasmid-DNA benötigt. Sie erfolgten mit den im Kit enthaltenen vektorspezifischen Primern (pUC universal und reversal). Die Daten der Sequenz wurden mit dem Programm DNAsis ausgewertet. 4.1.16 Gezielte Mutagenese Die gezielte Mutagenese erfolgte nach dem Prinzip der überlappenden PCR (Ho et al., 1989). Hierbei werden Primer verwendet, die zwei DNA- Fragmente mit überlappenden Enden erzeugen. In einer zweiten PCR hybridisieren diese Fragmente. Das überlappende 3’-Ende jeden Stranges dient als Primer für die Synthese des Gegenstranges. Werden nun in die Oligonucleotiden Mutationen eingeführt, finden sich diese auch 100 % im Produkt wieder. In einer zweiten PCR hybridisieren diese Fragmente, das überlappende 3’-Ende jeden Stranges dient als Primer für die Synthese des Gegenstranges. Das resultierende Fusionsprodukt wurde durch weitere PCR mit den „äußeren“ Primern, die den gesamten Bereich einschließen, amplifiziert. Vorteil dieser Methode ist, dass weder auf das Vorhandensein einer Restriktionsschnittstelle geachtet werden muss, noch das gesamte Plasmid amplifiziert wird. Das Prinzip der PCRMutagenese ist in Abbildung 7 dargestellt. Methoden 5' 29 P1 5' P2 * Templat-DNA K66 * P1' PCR mit den Primern P1+P1' 5' 5' P2' PCR mit den Primern P2+P2' 5' 1.Produkt * * 2.Produkt 5' PCR mit den Primern P1+P2' und Produkt 1+2 als Templat 5' * 5' Abbildung 7: Prinzip der gezielten Mutagenese mittels überlappender Fragmente. 4.1.17 Zufallsmutagenese Für die Herstellung verbesserter Enzymvarianten existieren zwei Strategien: 1. Asexuelle Evolution (Kuchner & Arnold, 1997), dabei wird durch zufällige Mutagenese, die möglichst auf das für das gewünschte Protein codierende Ausgangsgen beschränkt wird, eine Enzymbibliothek hergestellt und anschließend auf verbesserte Eigenschaften durchmustert. Die in der ersten Generation gefundenen besten Enzyme können in folgenden Mutationsrunden optimiert werden. Dies setzt jedoch eine weitere Verbesserung der Varianten der ersten Generation durch Einführung neuer und Deletion sich als negativ erweisender Mutationen voraus. 2. Die sexuelle Evolution hingegen geht von einem Pool homologer Ausgangsgene aus. Diese können aus einer asexuellen Evolution hervorgegangen oder nah verwandten natürlichen Sequenzen sowie Enzymvarianten abgeleitet sein, die durch rationales Design hergestellt wurden. Das Prinzip dieses DNA shuffling oder gene shuffling (Stemmer, 1994) basiert auf einem partiellen DNAseI-Verdau und einer nachfolgenden Rekombination der Bruchstücke durch eine Polymerasekettenreaktion Methoden 30 (PCR). Nachteilig sind die nicht immer gegebenen Verfügbarkeiten homologer Gene, die Kontrolle des DNAse-Verdaus zur Herstellung von Bruchstücken optimaler Größe und Probleme mit der Ligationseffizienz bei der PCR (Bornscheuer et al., 1998). Die wohl wichtigste Methode zur asexuellen Evolution ist die Fehlerhafte Polymerasekettenreaktion (error-prone PCR) (Rice et al., 1992). Durch Einstellung nicht-optimaler Reaktionsbedingungen in der PCR kann die Fehlerhäufigkeit der Polymerase gesteigert werden ??Die Einflußgrößen in der „error prone PCR“ sind: ??Fehlerrate der Taq- Polymerase ??Konzentration der Taq-Polymerase ??molare Verhältnisse der Desoxynukleotide ??Konzentration der Ziel- DNA (Template) ??PCR- Zyklenzahl ??c [MgCl2] ??c [MnCl2] Methoden 31 Die Vorgehensweise der asexuellen Evolution ist in beschrieben. Zielgen Erzeugen von Diversität durch Zufallsmutagenese Screnning der „random library“ Gene selektierter Klone Gene selektierter Klone Neue Varianten durch in vitro Rekombination Screening der „library Abbildung 8: Vorgehensweise der Zufallsmutagenese 4.1.18 Sättigungsmutagenese Der ausgewählte Aminosäurerest wird gegen mögliche andere Aminosäuren ausgetauscht, dafür werden die Mutageneseprimer so synthetisiert, dass theoretisch alle Triplettkombination möglich sind (Derbyshire et al., 1986). PCR-Protokoll: 10 mM Tris pH 8.3 50 mM KCl 1.5 mM MgCl2 jeweils 200 µM dATP, dCTP, dTTP, dGTP Methoden 32 20-40 pmol jedes Mutagenese-Primers 2.5 U Polymerase-pfu – Stratagene pro 100 µl Ansatz 20 ng Plasmid-DNA als PCR-Template Die PCR-Amplifikation wurde auf einen automatischen DNA-Thermal-Cycler (Robocycler, Fa Stratagene) nach folgendem Programm durchgeführt. ??3 min Denaturierung bei 94°C (zu Anfang des Programms 1x) ??1 min Annealingsschritt, in dem die Primer an das Template binden. ??Extension bei 72°C (Zeit hängt von der Größe des Plasmids ab. 1 min/ kb) ??1 min Denaturierung bei 95°C ??Zyklisches Wiederholen der letzten drei Schritte (25x) ??6 min Extension (nach Abschluß der PCR) 4.2 Biochemische Methoden 4.2.1 Zellaufschluß und Rohextraktgewinnung Da das Protein in kleinen Mengen für den qualitativen Nachweis gebraucht wurde, wurden die Zellen durch eine Schwingkugelmühle aufgeschlossen [Retsch]. Dafür wurde ein Verhältnis von Zellen zum Aufschlußpuffer [ 0.1 M Kpi pH 7.0, 1 mM MgCl2 , 10 Tropfen Ucolup/L) von 1:3 eingesetzt, und 1,2g Glasperlen (0.3 ? ) pro 600 µl dieser Lösung zugegeben. Die Eppendorfgefäße wurden in die Schwingkugelmühlenzylinder gestellt und dann die Zellen in der Schwingkugelmühle für 10 min. disintegriert. Anschließend wurden die Proben 5 min. auf Eis abgekühlt und danach 3 min. bei 13000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert. Der Aufschluß wurde ein zweites Mal wiederholt, indem die Aufschlußpuffer auf die Eppendorfgefäße verteilt und die restlichen, nicht aufgeschlossenen Zellen durch die Schwingkugelmühle disintegriert worden sind. Um die große Zahl an Mutanten schnell und effektiv zu überprüfen, wurden die Kolonien in kleinem Maßstab (1,2 ml) angezüchtet und mit der unten geschilderten Methode aufgeschlossen. Die Transformanten der Zufallsmutagenese wurden einzeln mit Zahnstochern abgepickt und in 150 µl LB-amp angeimpft. Das Wachstum der Vorkultur erfolgte über Nacht. 50 µl aus dieser Vorkultur wurden in 1,2 ml LB-amp als Hauptkultur angeimpft und nach einem Methoden 33 Wachstum von etwa 5 h (OD600 0,7) wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG induziert, um die Expression zu starten. Die Zellen werden nach dem folgenden Protokoll geerntet: ??1,2 ml Kultur abzentrifugieren ??600 µl Überstand wegwerfen und den Rest resuspendieren ??50 µl Lysis-Puffer dazu und noch mal resuspendieren ??30-45’bei 37°C schütteln ??Aus dem Ansatz der lysierten Zellen werden 50µl zur photometrischen Messung benötigt Lysis-Puffer: 0,2 % Triton X-100 10 ml 20 mM EDTA 40 ml 200 mM Kpi-Puffer 50 ml pH 7.0 4.2.2 Aktivitätstest für die Phenylalanin Dehydrogenase Die Bestimmung der enzymatischen rekombinanten PheDH erfolgte mittels photometrischer Tests anhand der Extinktionsabnahme bei 340 nm. Dies basiert auf dem Verbrauch von NADH im Zuge der Umsetzung der Ketosäure Phenylpyruvat (Hummel et al., 1987) Phenylpyruvat + NADH + NH4+ L-Phe + NAD+ + H2O Die Extinktsionsabnahme bei 340nm wurde über 1min verfolgt. Die Berechnung der Aktivität als U/ml (U entsprecht 1 µmol Substratumsatz/min) erfolgte über das Lambert-Beersche Gesetz. Der Aktivitätstest wurde bei 30°C und bei pH 8.5 durchgeführt Der Testansatz setzte sich wie folgt zusammen: Tris/HCl 0.1 M (NH4)2SO4 0,15 M Phenylpyruvat 3 NADH 0.3 mM mM Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl Enzym gestartet. Methoden 34 4.2.3 Screening und Aktivitätstest in Titerplatten Die Aktivitätbestimmung der hergestellten Muteine in Bezug auf Phenylaceton bzw Phenylpyruvat wurde photometrisch in Titerplatten durchgeführt. Dafür wurden Mutanten durch eine schnelle Methode isoliert (4.2.1) und auf Aktivität überprüft. Vorkultur im 150µl-Maßstab Hauptkultur und Expression im 1 ml- Maßstab Zellernte und Permeabilisierung Bestimmung der Aktivität Selektion aktiver Mutanten Abbildung 9: Schema zum Screeningsvorgang Reaktionsansatz: 120 µl Substratansatz 50 µl Rohextrakt Messung bei 340 nm Substratansatz: 100 mM (NH4)2SO4 100 mM (Tris-Puffer) pH-Wert 8.5 3 mM 0,3 mM Phenylpyruvat bzw. Phenylaceton NADH Für die Reaktion wurden 120 µl davon verwendet und mit 50 µl Rohextrakt gestartet. Methoden 35 4.2.4 Aktivitätstest für das NAD-abhängige malic enzyme HEPES pH 7.5 0.1 M L-Malat 2 NAD+ 0.5 mM Enzym (Rohextrakt) mM 10 µl 4.2.5 Gekoppelte enzymatische Synthese Das Reaktionsmedium für die kontinuierliche Produktion des L-Phenylalanin wurde folgendermaßen zusamenpipettiert: 0,1 M (NH4)2SO4 0,1 M Hepes (pH 8.0) 30 mM Phenylpyruvat 60 mM Malat 2 mM MgCl2 1,5 g/l BSA 2 mM NAD+ Das gesamte Volumen des Reaktionsmediums beträgt 10 ml und wurde mit 50 U PheDH und 70 U malic enzyme gestartet. Die L-Phenylalaninkonzentration wurde zu unterschiedlichen Reaktionszeiten mittels HPLC bestimmt. 4.2.6 Bestimmung des L-Phenylalanin mittels HPLC Die Derivatisierung der Proben für die HPLC-Analytik wurde wie folgt durchgeführt: OPA-Derivatisierungsansatz: 140 µl Na-Borat-Puffer + 40 µl Probe bzw. Standard + 20 µl OPA/IBLC-Reagenz. Die Mischung wurde sofort kräftig gerührt. OPA/IBLC oder IBDC: 260 mM IBLC oder IBDC + 170 mM OPA werden in Na-BoratPuffer ( 0,1 M, pH 10,5) gelöst. Na-Borat-Puffer: 0,1 M Na2B4O7 ·10 H20 in Wasser gelöst und mit NaOH auf pH 10,5 eingestellt. Methoden 36 4.2.7 Bestimmung der Acetatkonzentration Die Bestimmung der Acetatkonzentration in Fermenterlösungen erfolgte über HPLC auf einer Aminex HPX 87 H Säule (Biorad) mit einem Fluß von 0,5 ml/min unter Verwendung von 0,2N Schwefelsäure als Laufmittel. Das Injektionsvolumen betrug 100 µl und die Temperatur 40°C, die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 215nm. Die absoluten Acetatkonzentrationen der Proben, aus denen die Biomasse durch Zentrifugation abgetrennt worden war, wurden anhand einer Eichung mittels Acetatlösung ermittelt. 4.2.8 Ganzzell Biotransformation In 200 ml Reaktionsansatz wurden 1 g rekombinante Zellen für die Produktion von L-Phenylalanin verwendet. Reaktionsansatz für L-Phenylalanin-Synthese: 0,1 M (NH4)2SO4 0,1 M HEPES-Puffer pH8.5 0,1 M Malat 2 mM MgCl2 2 mM NAD+ 40 mM Phenylpyruvat Die Synthese erfolgte bei 30°C unter langsamen Rühren. Für kleinere Ansätze wurden die Zellmengen entsprechend abgewogen. 4.2.9 Proteinaufreinigung Das durch den Aufschluß erhaltene Rohextrakt wurde auf eine DEAE-Sepharose-FF Säule (Volumen 7.1 ml, Fluß 1 ml/min.) aufgetragen. Die Säule wurde vorher mit 5 fachem Säulenvolumen eines 0.1 M Kpi-Puffers (8.94 g K2HPO 4 + 0.21 g KH2PO4) gespült. Anschließend wurde die Konzentration von NaCl über einen linearen Gradienten bis auf 100 % zum Eluieren erhöht. Dadurch wurden die Proteine aufgrund ihrer unterschiedlichen anionischen Bindungsstärke bei verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen eluiert und in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen wurden anhand des Aktivitätstests auf PheDH-Aktivität überprüft. Diejenigen mit der höchsten Aktivität wurden vereinigt, und für weitere Untersuchungen aufbewahrt. Methoden 37 4.2.10 Proteinbestimmung nach Bradford Der Proteingehalt wurde photometrisch nach Bradford (Bradford, 1976) bestimmt. Diese Methode beruht auf der Farbverschiebung des Farbstoffes im Gegenwart von Proteinen. Es bildet sich ein blau gefärbter Komplex, der bei 595 nm detektiert werden kann. Die Proteinbestimmung nach Bradford ist sehr empfindlich und für geringe Proteinmengen geeignet. Das in der Reaktion eingesetzte Bradfordreagenz wurde selbst hergestellt: 100 mg Coomassie Brillant Blue G-250 wurden mit 50 ml Ethanol versetzt und über Nacht gerührt. Danach erfolgte die Zugabe von 100 ml 85 %iger Phosphorsäure, und anschließend wurde die Lösung auf 1 L mit Wasser aufgefüllt. Die fertige Lösung wurde einige Zeit gerührt, anschließend filtriert und unter Lichtabschluß aufbewahrt. Testansatz: 900 µl Bradfordreagenz 100 µl Proteinlösung Die Proben wurden 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 595 nm gemessen. 4.2.11 Entsalzen von Proteinlösungen Die Entsalzung von Proteinen erfolgte entweder über Gelfiltration oder Ultrafiltration. Hierbei wurden 2.5 ml der Proteinlösung auf eine vorher mit dem gewünschten Puffer äquilibrierte PD10 Sephadex G 25 Säule [Pharmacia] aufgetragen. Die Proteine wurden anschließend durch Elution der PD10 mit 3.5 ml des gewünschten Puffers wiedergewonnen und damit umgepuffert. 4.2.12 Konzentrierung von Proteinlösungen Die Enzympräparate wurden, je nach Bedarf, mittels Ultrafiltration aufkonzentriert. Es wurden entweder YM20-Membranen in Rührzellen [Fa. Amicon] oder Zentrifugationsröhrchen [Fa. Centricon] verwendet. Methoden 38 4.2.13 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gehört zu den in der biochemischen Analytik meistverwendeten Elektrophoresemethoden. Sie verwendet als Träger polymerisiertes und quervernetztes Acrylamid, dessen Porengröße in einem weiten Bereich variierbar ist. Diese Methode liefert scharf getrennte Banden und dient bei entsprechender Eichung zur Bestimmung der molaren Masse bzw. des stoke’schen Radius von nichtglobulären Makromolekülen. Die Geldichte, auch Gelkonzentration genannt, wird durch die Größen T und C bestimmt. T ist gleich dem Prozentanteil an Acrylamid und Methylen-bis-Acrylamid am Gesamtvolumen, C ist der prozentuale Anteil von N,N,-Methylen-bis-acrylamid (dem quervernetzenden Agens). Die Gele wurden nach Laemmli (Laemmli, 1970) gegossen. Verwendete Stammlösungen: Trennpuffer 1.5 M Tris/HCl pH 8.8 Sammelgelpuffer 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 SDS 10 % (w/v) Glycerin 85 % (w/v) APS 10 % (w/v) Sammelgelzusammensetzung: Sammelgelpuffer 0.125 M Acrylamid 5% SDS 0.10 % (w/v) APS 0.02 % (w/v) TEMED 0.25 % (w/v) Elektrophoresepuffer pH 8.0 Tris 0.025 M Glycerin 0.192 M SDS 0.1 % (w/v) Methoden 39 Probenpuffer: Glycerin 10 % (v/v) SDS 2 % (w/v) Tris/HCl pH 6.8 0.063 M Bromphenolblau 0.1 % (w/v) ? -Mercaptoethanol 10 % (v/v) Um eine Denaturierung zu erreichen, wurden die Proben mit 20 µl Probenpuffer versetzt und 4 min bei 95°C aufgekocht. Anschließend wurden die Proben auf Eis abgekühlt. 4.2.14 Färbung Silberfärbung von Proteinen (Blum et al., 1987): Das Gel wurde in eine Fixierlösung überführt und unter ständigem Schütteln (3x30 min.) fixiert. Nach der Fixierung wurde das Gel 10 min mit 20 % (v/v) Ethanol inkubiert und direkt 10 min mit Millipore Wasser gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Gel silbergefärbt. Um das Gel zu färben und sichtbar zu machen, wurde es für 1min in der Sensitivierungslösung (0.02 % (w/v) Natriumthiosulfat x H2O) geschüttelt, dann kurz mit Wasser gespült und anschließend 20-30 min in der Färbelösung [2 % (v/v) AgNO3 , 750 µl/L (v/v) 37 % HCHO] inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurde das Gel wieder kurz mit Wasser gespült und dann entwickelt [6 %(w/v) Na2CO3, 500 µl/l (v/v) 37 % HCHO, 0.0005 % (w/v) Natriumsulfat x H2O]. Die Fixierreaktion wurde abgestoppt, sobald die Banden sichtbar waren. Fixierlösung 40 %(v/v) Ethanol, vergällt (Methylethylketon) 10 %(v/v) Essigsäure konz. Coomassie Färbung: Färbelösung 0.1 % Coomassie blue R-250 (w/v) 40 % Ethanol, vergällt [Methylethylketon] (v/v) 10 % Essigsäure (v/v) Entfärber 40 % Ethanol, vergällt [Methylethylketon] (v/v) 10 % Essigsäure (v/v) Methoden 40 Nach erfolgter Elektrophorese wurde das Gel für 20 min in der Färbelösung inkubiert und anschließend die Banden mit Hilfe des Entfärbers [mehrmals wechseln] unter Schütteln sichtbar gemacht. Um einen klaren Hintergrund zu erzielen, konnte das Gel nach Einsatz des Entfärbers über Nacht in 0.5 M NaCl oder Wasser inkubiert werden. 4.3 Mikrobiologische Methoden 4.3.1 Verwendete Organismen In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem Stamm Rhodococcus sp. M4, sowie mit E.coli XL1-blue, E.coli k12, HB101, JM105, SG13009, UT5600 und BL21 gearbeitet. 4.3.2 Anzuchtbedingungen und Medien Rhodococcus sp. M4 Für den Rhodococcus sp. M4 wurde das M4-Medium (Hummel et al., 1987) nach folgender Zusammensetzung verwendet: KH2PO4 4g L-Phenylalanin 10 g Hefeextrakt 1g HVK 2 ml Thiamin/HCl (nach dem Autoklavieren) 200 µg add 1L H2O Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7.5 mit NaOH eingestellt. Als Vorkultur wurden 200ml dieses Mediums mit einer einzelnen Kolonie des Rhodococcus sp. M4 angeimpft. Die Zellen wurden für 48h bis zur stationären Phase unter aeroben Bedingungen (Kolben mit Schikanen) bei 120 rpm und 30°C kultiviert. Davon wurde die Hauptkultur 5 %ig angeimpft und unter gleichen Bedingungen kultiviert. E. coli Für den E. coli wurde das LB-Medium (Luria-Bertani) nach folgender Zusammensetzung verwendet: Bacto-Trypton 1% Bacto-Yeast Extrakt 0.5 % NaCl 0.5 % pH 7.5 Methoden 41 Für feste Nährböden wurde 1.5 % Bactoagar (Difco) zugesetzt. Der Selektionsdruck wurde durch Zugabe von Ampicillin (100 µg/ml) nach dem Autoklavieren eingestellt. Die Anzucht von E. coli erfolgte bei 37°C als Schüttelkultur in den entsprechenden Medien. Vorkulturen wurden in Reagenzgläsern, größere Kulturen in Schüttelkolben mit Schikanen inkubiert. 4.3.3 Plattenkulturen Die Inkubation fester Medien erfolgte aerob bei 37°C, bis Einzelkolonien erkennbar waren. Bewachsene Platten wurden bis zu vier Wochen bei 4°C gelagert. 4.3.4 Schüttelkolbenkulturen Flüssigmedien wurden mit Einzelkolonien, Glycerin-Stocks oder 0,1-10 Vol.-% anderer Flüssigkulturen beimpft und auf einem Rundschüttelgerät mit einer Frequenz von 110-160 rpm bei geeigneter Temperatur inkubiert. 4.3.5 Konservieren von mikrobiologischen Stämmen Von allen Stämmen wurden 1 ml einer stationären Kultur mit 5 % DMSO [steril] versetzt und in entsprechenden, sterilen Kryoröhrchen (Nunc) bei -80°C konserviert. 4.3.6 Fermentation der rekombinanten PheDH in Hochdichte Medium (HZD) 5 L bzw. 20 L HZD-Medium wurden mit 1 % exponentiell wachsender HZDamp Flüssigkultur beimpft und bei 37°C inkubiert. Rührerdrehzahl und Sauerstoffeintrag wurden so angepasst, dass ein Sauerstoffpartialdruck von 20 % nicht unterschritten wurde. Die maximalen Werte betrugen 800 rpm Rührerdrehzahl und 5 L·min-1 Lufteintrag. Bei Bedarf wurde ein Überdruck von bis zu 1 bar angelegt. Die Einstellung des pH-Werts auf 7.0 erfolgte unter Verwendung von 25 %igem Ammoniakwasser und 1 N Phosphorsäure. Sobald die vorgelegte C-Quelle erschöpft war, wurde Feedlösung computergesteuert zugesetzt. Die Induktion der Expression erfolgte innerhalb der Feedphase durch IPTG. War der Sauerstoffpartialdruck irreversibel unter 20 % gesunken, wurde die Fermentation abgebrochen. Methoden 42 Batch-Medium-Zusammensetzung Nr. Lösung Substanz Endkonz. (g/l) 1 HZD-Grundlsg. pH= 6,9 V End Konz.- (ml) Faktor V Stamm (ml) m (g) NH4Cl 0,2 10000 10 1000 2 (NH4)2SO4 2 10000 10 1000 20 KH2PO4 13 10000 10 1000 130 K2HPO4 10 10000 10 1000 100 NaH2PO4-H 2O 6 10000 10 1000 60 2 Glucose-Lsg. Glucose-1H2O 6 10000 80 125 60 3 MgSO4-Lsg. MgSO4-7H2O 1 10000 200 50 10 4 Hefeextrakt-Lsg. Hefeextrakt 3 10000 100 100 30 5 Na2-EDTA-Lsg. Na2-EDTA 0,0084 10000 5000 2 0,084 6 Vitamin-Lsg. 428 DSM Riboflavin(Vit. B2) 0,0005 10000 200 50 0,005 Thiamin-HCl(Vit.B1) 0,05 10000 200 50 0,5 Nicotinsäure 0,0025 10000 200 50 0,025 PyridoxinHCl(VitB6) 0,0025 10000 200 50 0,025 Ca-Panthotenat 0,0025 10000 200 50 0,025 lösen, dann die anderen bei Biotin 0,000005 10000 200 50 0,00005 pH=12 lösen Folsäure 0,00001 10000 200 50 0,0001 Cyanocobalamin(B12 0,00005 10000 200 50 0,0005 CaCl2-2H2O 0,04 10000 250 40 0,4 ZnSO4-7H2O 0,002 10000 250 40 0,02 CuCl2-2H2O 0,001 10000 250 40 0,01 Spurenelemente-Lsg. MnSO4-1H2O 0,01 10000 250 40 0,1 In 5 N HCl CoCl2-6H2O 0,007 10000 250 40 0,07 H3BO3 0,0005 10000 250 40 0,005 AlCl3-6H2O 0,01 10000 250 40 0,1 Na2MoO4-2H 2O 0,002 10000 250 40 0,02 FeSO4-7H2O 0,04 10000 250 40 0,4 pH=7 erst Folsäure bei pH=7 7 8 Thiamin-Lsg. Thiamin-HCl(Vit.B1) 0,1 10000 2000 5 1 9 Ampicillin-Lsg. Ampicillin 0,1 10000 2000 5 1 10 IPTG-Lsg. IPTG 0,119145 10000 1000 10 (Endkonz.=0,5 mM 1,191 Methoden 43 Fed-Batch-Medium- Zusammensetzung Nr. Lösung Substanz Endkonz. V End Konz. V Stamm m (g/l) (ml) faktor (ml) (g) 4000 10 400 1 HZD-Grundlsg. Stammlsg von Batch 2 Glucoselsg. Glucose 600 4000 1,28 3124 2400 3 MgSO4-Lsg. Stammlsg von Batch 12 4000 16,6666 240 48 4 Hefeextrakt-Lsg. Stammlsg von Batch 18 4000 16,6666 240 72 5 Vitaminlsg428DSM Stammlsg von Batch 4000 200 20 6 Spurenelemente-Lsg. Stammlsg von Batch 4000 250 16 7 Thiamin-Lsg. Thiamin-HCl (Vit.B1 4000 40 4 1 Batch-Medium: Im Fermenter HZD-Grundlsg. 1000 ml Glucose-Lsg. 125 ml MgSO4-Lsg. 50 ml Hefeextrakt-Lsg. 100 ml Na2-EDTA-Lsg. 1 ml Vitamin-Lsg. 428 (DSM) 50 ml Spurenelemente-Lsg. 40 ml Thiamin-Lsg. 5..ml Ampicillin-Lsg. 5 ml IPTG-Lsg. 10 ml Antischaum 4 ml Inokulum 100 ml ad Aqua dest 8510 ml Gesamt 10000 Fed-Batch-Medium: Im Fermenter HZD-Grundlsg. 400 ml Glucose-Lsg. 3044 ml MgSO4-Lsg. 240 ml Hefeextrakt-Lsg. 240 ml Vitamin-Lsg. 428 (DSM) 20 ml Methoden 44 Spuremelemente-Lsg. 16 ml Thiamin-Lsg. 40 ml Gesamt 4000 ml Die rekombinaten Zellen wurden bei einer OD600 von 60 mit 1 mM IPTG induziert. Unter Sauerstoff- sowie pH-Regulation sind die Zellen bis zu einer OD600 von 170 gewachsen. 4.3.7 Bestimmung der optischen Dichte Mikrobielle Zellen, die in einen Lichtstrahl gebracht werden, bewirken einen Intensitätsverlust, der unter Berücksichtigung des Lambert-Beer’schen Gesetzes beschrieben werden kann (Bergter, 1983): E=? .c.d. Bei konstanten Extinktionskoeffizienten (? ) und konstanter Küvettenschichtdicke (d) besteht für definierte Bereiche eine direkte proportionale Beziehung zwischen Extinktion und Zellkonzentration (c) (Bursch et al., 1970). Innerhalb einer Population wachsende Zellen kann über spektrophotometrische Messung der Extinktion im Wellenlängenbereich von 550 nm bis 610 nm die zeitabhängige Zunahme der Zellkonzentration bestimmt werden. Dies erleichtert die Reproduzierbarkeit wachstumsabhängiger Versuchsergebnisse, erfordert jedoch konstante Versuchsbedingungen, da der jeweilige Extinktionskoeffizient von Größe, Form, Brechungsindex und Wachstumsbedingungen der untersuchten Spezies abhängig ist. Aussagen über absolute Zellkonzentrationen sind unter mikroskopischer Bestimmung der Zellzahl erstellt worden. Bei jeder OD 600 wurden die Zellsuspensionen durch Zugabe vom Medium soweit verdünnt, dass die Extinktion unterhalb von 0,5 lag. Darüber besteht keine lineare Beziehung mehr zwischen Extinktion und Konzentration. Ergebnisse 45 5 Ergebnisse 5.1 Klonierung der Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) 5.1.1 Präparation genomischer DNA Das phedh-Gen aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987) wurde mittels PCR mit genomischer DNA als Templat amplifiziert. Die genomische DNA wurde nach der Methode von van Soolingen (van Soolingen et al., 1991) aus dem Stamm Rhodococcus sp. M4 isoliert. Diese Methode beinhaltet die enzymatische Vorbehandlung der Zellwand mit Lysozym und die Fällung der Proteine mit CTAB und Proteinase K als Denaturierungsmittel. Die Zugabe von CHCl3/Isoamylalkohol (23:1) führt zur Abtrennung der genomischen DNA. Das DNA-Pellet wurde mit kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen und in TE-Puffer bei 4°C aufbewahrt. (bei –20°C Lagerung würde die DNA beim Auftauen durch die Scherkräfte gespalten). Die Reinheit sowie die Ausbeute der DNA wurde durch ein 0.5 %iges Agarose Gel mit Ethidiumbromid überprüft. Aus Abbildung 10 geht hervor, dass die nach dieser Methode präparierte genomische DNA hochmolekular und intakt war. 9 kb 5 kb genom. DNA 1µl = 70 ng Abbildung 10: genomische DNA aus Rhodococcus sp. M4 nach Elektrophorese im 0.5 %igem Agarosegel. Ergebnisse 46 5.1.2 Klonierung des PheDH-Gens mittels PCR Die benötigten Primer für die 5’- und 3’-Enden des zu klonierenden phedh-Gens wurden aus der veröffentlichten DNA-Sequenz (Brunhuber et al., 1994) abgeleitet. 5’Primer (5’Phe-for) 5’ATG AGT ATC GAC AGC GCA CTG AAC 3’Primer (5’Phe-rev) 5’CTA CTA GGC AGT CGC TGT CGT TGT An den 3’Primer wurden hinter die letzte Aminosäure des C-Terminus 2 Stopcodons angefügt, um eine effiziente Termination der Transkription zu gewährleisten. Für die PCR wurde eine Verdünnungsreihe des DNA-Templates durchgeführt, um die optimale Ausgangskonzentration zu bestimmen. Dafür wurden zwei Versuchsreihen angesetzt. Die PCR-Ansätze wurden 7 min bei 94°C denaturiert, anschließend wurden 30 Zyklen wie aus Tabelle 2 ersichtlich durchgeführt. Die verwendeten Ansatzgrößen sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 2: PCR-Zyklen Zyklusschritt Zeit [min] Temperatur [°C] Annealing 2 65 Polymerisation 1.5 72 Denaturierung der Stränge 2 94 Tabelle 3: PCR Protokoll zur Amplifizierung des PheDH-Gens. Variiert wurde die Konzentration der Template-DNA. Template DNA 5’-ende 3’-ende dNTP Puffer Taq-Polymerase DMSO H2O 100 ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 3 81µl 70 ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 3 81µl 30 ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 3 81µl Durch die Verwendung der obengenanten Primer (5’Phe-for und 5’Phe-rev), die aus der Nterminalen bzw. C-terminalen Sequenz abgeleitet wurden, konnte ein spezifisches 1.1 kbFragment bei einer Annealing-Temperatur von 65°C amplifiziert werden (Abbildung 11). Um eventuelle Fehler, die bei Verwendung der Taq-Polymerase auftreten können zu minimieren, Ergebnisse 47 wurde zur Klonierung des PheDH-Gens in der PCR eine DNA-Polymerase mit ‚proof reading’-Funktion (high fidelity®- Polymerase) (Roche), Fehlerrate 1.3*10-6 verwendet. 1.6 kb 1.0 kb 1 2 3 Abbildung 11: Ergebnis der PCR Reaktionen, die Abbildung zeigt ein Fragment mit einer Größe von etwa 1100 bp, als Marker wurde die Gibco KB-Leiter verwendet. Von den PCR-Ansätze wurden 7 µl auf ein 0.8 % Agarosegel aufgetragen, 1-3 entsprechen den Ansätze in Tabelle 2. 5.1.3 Klonierung des PheDH Gens in den pUC-18 Das phedh- Gen wurde in die „multiple cloning site“ des pUC18-Vektors über glatte Enden an der SmaI- Restriktionsschnittstelle (CCCGGG) kloniert. Das Verhältnis zwischen Vektor und Insert lag bei 1:3. Für eine erfolgreiche Ligation wurden 200 ng DNA eingesetzt. Der Vektor wurde an der SmaI -Schnittstelle geschnitten und um eine Religation des linearen Plasmids zu verhindern, wurden die 5'-Phosphatgruppen abgespalten. Die Dephosphorylierung wurde durch alkalische Phosphatase (SAP, Shrimp Alkaline Phosphatase) durchgeführt, und in die Ligation eingesetzt (Abbildung 12). Ergebnisse 48 ori Abbildung 12: Vektorkarte des pUC18 -PheDH Der Vektor enthält folgende Strukturelemente: ??ein regulierbares Promotor/Operator Element bestehend aus dem tac-Promotor und einer lac Operon Sequenz lac Z’, die das Gen für die ß-Galactosidase komplementiert ??ein Gen für die ß-Lactamase, die dem plasmidenthaltenden Stamm Ampicillinresistenz gewährt ??eine multiple cloning site, die das Einklonieren von Fremd-DNA [hier PheDH] erlaubt ??den Replikationsursprung ori Tabelle 4: Ligationsansatz zur Klonierung der PheDH im pUC18-Vektor Genfragment 50-200 ng 10 µl pUC18-Vektor 50 ng 2X Ligationspuffer 10 µl DTT 1 µl T4-Ligase 1 µl H2 O ad 20 Das PCR-Fragment wurde 5’-phosphoryliert und der 3’ Überhang mittels Klenow-Fragment ergänzt, so dass glatte Enden entstanden. Nach Reinigung der DNA aus dem Enzymansatz Ergebnisse 49 wurde eine Ligation durchgeführt und in kompetente E. coli XL1 Blue Zellen transformiert. Nach Ausplattierung auf einer LBamp Agarplatte wurden ca. 150 Kolonien erhalten. 5.1.4 Sequenzierung des phedh-Gens Von den durch die Transformation erhaltenen Kolonien wurden exemplarisch 20 Kolonien ausgewählt und über Nacht in 5ml LBamp Medium inkubiert. Aus der hochgewachsenen Kultur wurde eine Schnellisolierung der Plasmid-DNA durchgeführt. Mit der isolierten Plasmid-DNA wurde eine Restriktionsanalyse mit SacI und BamHI durchgeführt, die auf einem 0.8 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurde. Die Sequenz der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 ist in Abbildung 13 dargestellt. ATGAGTATCGACAGCGCACTGAACTGGGACGGGGAAATGACGGTCACCCGATTCGACCG GGAGACTGGTGCCCATTTCGTCATTCGACTCGATTCGACCCAACTCGGACCGGCGGCCG GAGGCACCAGAGCCGCACAGTACTCACAGCTGGCGGACGCCCTCACCGACGCCGGCAAA TTGGCGGGGGCGATGACGTTGAAGATGGCAGTGAGCAACCTTCCGATGGGCGGGGGCAA ATCCGTCATTGCGCTTCCTGCGCCGCGTCATTCGATCGATCCGAGCACGTGGGCACGCA TCCTCCGAATCCACGCCGAGAACATCGACAAGTTGTCCGGCAACTACTGGACCGGACCG GACGTCAACACCAATTCGGCAGACATGGATACTCTGAACGACACCACCGAGTTCGTGTT CGGACGGTCGCTCGAACGCGGCGGCGCGGGTTCGAGCGCGTTCACCACCGCCGTTGGCG TGTTCGAGGCGATGAAGGCGACCGTCGCGCACCGTGGGCTGGGCTCACTCGACGGTTTG ACGGTCCTGGTCCAAGGACTGGGGGCAGTCGGAGGATCATTGGCATCCCTGGCCGCCGA AGCGGGTGCGCAACTCCTGGTGGCAGACACCGACACCGAGCGAGTAGCGCACGCTGTTG CGTTGGGCCACACAGCGGTTGCCCTCGAGGACGTTCTGTCCACCCCGTGTGATGTCTTC GCACCCTGCGCAATGGGCGGCGTCATCACCACCGAGGTGGCGCGAACACTCGACTGTTC CGTCGTGGCCGGTGCCGCCAACAACGTCATCGCCGACGAGGCCGCCTCGGACATCCTGC ACGCACGCGGAATTCTGTACGCTCCCGACTTCGTGGCCAACGCCGGCGGTGCCATCCAC CTCGTAGGCCGGGAGGTTCTCGGTTGGTCCGAGTCGGTTGTCCACGAACGAGCAGTTGC CATAGGCGACACCCTGAATCAGGTCTTCGAGATCTCCGACAACGACGGCGTCACCCCGG ACGAGGCCGCCCGCACTCTCGCTGGACGGCGCGCCCGCGAGGCCTCGACAACGACAGCG ACTGCCTAGTAA Abbildung 13: DNA-Sequenz der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 mit zwei Stopcodons. Ergebnisse 50 5.1.5 Expression des recPheDH-Gens in E.coli 5.1.5.1 Klonierung der PheDH im Expressionsvektor PET16b Zur Klonierung des recPheDH-Gens in einen Expressionsvektor wurden durch entsprechendes Primerdesign Restriktionsschnittstellen an beiden Enden des Gens eingeführt. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine Klonierung des Gens in der gewünschten Orientierung downstream des Promotors. Außerdem kann durch die Wahl der Restriktionsschnittstelle am 5’-Ende des Gens der Abstand des Startcodons ATG zum Promotor und damit auch zur Ribosomenbindungsstelle auf dem Plasmid beeinflusst Expressionsvektoren pET11a und pET16b tragen eine werden. Die verwendeten Nde1 Restriktionstelle vor dem Startcodon des lacZ-Gens. Daher wurde an das 5’-Ende des recPheDH-Gens eine Nde1Restriktionsschnittstelle eingefügt. An das 3’-Ende des Gens wurde eine BamHI-Restriktionsschnittstelle hinter dem Stopcodon angehängt. Der pET16b-Vektor enthält neben einem starken Promotor einen His-Tag upstream der MCS. Durch die Klonierung der PheDH über die Schnittstellen NdeI/BamHI wird der His-Tag am 3’-Ende des Gens angefügt, sodass die exprimierte PheDH einen His-Tag am N-Terminus besitzt. Dafür wurden folgende Primer für eine PCR konstruiert: 5’-For NdeI-Schnittstelle CGGCATATGAGTATCGACAGCGCACTG 5’-Rev BamHI-Schnittstelle GCGGATCCCTACTAGGCAGTCGCTGTC Mit den konstruierten Primern wurde das Insert aus dem rec-pUC18 amplifiziert und in die Expressionsvektoren pET-16b und pET-11a an der NdeI/BamHI ligiert. Die Strategie zur Expression der PheDH ist in Abbildung 14 dargestellt. Ergebnisse 51 PCR zur Einführung der Restriktionsschnittstellen Nde1 und BamH1 an das 5’und 3’-Enden des PheDH-Gens „Blunt-end“-Klonierung in den Klonierungsvektor pUC18 zur Amplifizierung des recPheDH-Gens Restriktion der recPheDH mit Nde1 und BamH1 aus pUC18 Ligation des recPheDH-Nde1/BamH1-Fragments in den Expressionsvektor pET16b-Nde1/BamH1 und pET11a-Nde1/BamH1 Transformation in E.coli Xl1Blue, BL21 Überprüfung der Expression in einer 100 ml-Kultur Abbildung 14: Fließschema zur Klonierung des recPheDH-Gens in die Expressionsvektoren PET11a oder PET 16b Nach der Vermehrung der rekombinanten Vektoren (pET-16b und pET-11a) im BL21-Stamm wurde eine Schnellisolierung des Plasmids durchgeführt und dieses mit NdeI/BamHI zum Nachweis des PheDH-Gens verdaut. Das Ergebnis ist in Abbildung 15 dargestellt. 1 2 3 4 5 6 1: KB-Leiter 2: rec-pET16b-Plasmide mit einem Insert von ca. 1.1 kb verdaut mit NdeI/BamHI 3+4+5 rec-pET11a verdaut mit NdeI und BamHI 6: PET16b verdaut nur mit NdeI 1.6 kb 1.0 kb PheDH-Gen 1068 bp Abbildung 15: Agarose-Gel zur Überprüfung der Restriktion der recpET-16b-und 11a-Vektoren. Bei einer Größe von etwa 1100 bp tritt eine Bande des geschnittenen Inserts auf Bahn 2 pET-16b und Bahn 5 pET-11a. Als Marker wurde eine KB-Leiter (Gibco) verwendet Bahn 1. Der Ansätze wurden mit NdeI/BamHI behandelt. Ergebnisse 52 5.1.5.2 Expression der PheDH im PET-System Die Induktion der rekombinanten Stämme erfolgte bei einer OD600 sowohl mit 0.5 als auch 1.5 mM IPTG bei 37°C. Das SDS-Gel (Abbildung 16) zeigte eine breite Bande bei 39 kDa, die der PheDH entspricht. Es wurde aber keine Enzymaktivität nachgewiesen. Eine Analyse des exprimierten Proteins auf einem SDS-Gel (12.5 %ig) zeigte die Bildung von Einschlusskörpern (inclusion bodies). 97.400 Da 66.200 Da 39.200 Da 26.600 Da 14.400 Da 1 2 3 4 5 Abbildung 16: SDS-Gel zur Überprüfung der Expression. Bei einer Größe von etwa 39 kDa tritt eine Bande auf. Bahn 1: Rohextrakt aus dem rec-pET16b in E. coli BL21 das Rohextrakt wurde nicht abzentrifugiert. Bahn 2: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET16b in E. coli BL21. Bahn 3: Rohextrakt aus dem rec-pET11a in E. coli BL21. Bahn 4: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET11a in E. coli BL21. 5: Marker Um die Bildung von inclusion bodies zu minimieren, wurde das PheDH-Gen in weitere Plasmide ohne His-Tag (pTRC99a, pBtac, pKK223-3) kloniert. Auch die Klonierung in diese Vektoren führte zu inclusion bodies. Die Induktion der rekombinanten Zellen durch niedrigere IPTG-Konzentrationen bzw. die Anzucht bei erniedrigten Temperaturen (bis 25°C) konnte dieses Problem nicht lösen. Ein weiterer Ansatzpunkt war die Manipulation auf genetischer Ebene. Inclusion bodies könnten durch eine schwächere Transkription bzw. Translation verhindert oder zumindest minimiert werden. Diesem Gedanken folgend wurde die PheDH einerseits in einen anderen Expressionsvektor mit schwächerem Promotor Ergebnisse 53 umkloniert. Andererseits wurde der Abstand zwischen dem Startcodon und der Ribosomenbindungsstelle variiert. 5.1.5.3 Klonierung des PheDH-Gens in pkk223-3 Die optimale Expression eines Enzyms erreicht man normalerweise, wenn das Startcodon des dazugehörigen Gens zwischen 7 und 9 bp von der Ribosomenbindungsstelle entfernt ist (Esipov et al., 1999; Tedin et al., 1997). Diese Klonierungsstrategie wurde für die PheDH in dieser Arbeit auch mit mehreren Vektoren, pTRC99A, pET16b, pET11a und pBtac, durchgeführt. Die Klonierungen führten in allen Fällen zu einer starken Expression des Proteins, das aber, wie oben dargestellt, in unlöslicher Form (inclusion bodies) vorlag. Unlösliche Proteine können durch eine zu schnelle Expression gebildet werden, die den Proteinen nicht genügend Zeit und Raum zur Faltung lässt. Für die Vermeidung der Bildung von unlöslichen Proteinen wurden physikalische bzw. biochemische Methoden (Temperatur, Induktion, Schüttelgeschwindigkeit) (Shin et al., 1997; Xu et al., 1994; Yang et al., 1997) während des Wachstums variiert. Dafür wurden die rekombinanten Zellen bei 25°C bzw. 30°C inkubiert sowie eine Inkubation bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 80 rpm, die eindeutig niedriger liegt als üblicherweise mit 140 rpm, durchgeführt. Durch diese Parameter konnte das Wachstum negativ beeinflusst werden, das aber nicht zur Vermeidung der „inclusion bodies“ führte. Eine Induktion mit verschiedenen IPTG- Konzentrationen (0,1mM1,5 mM) erzielte ebenso keine positiven Ergebnisse. Wie bereits oben angedeutet kann durch entsprechende Manipulation auf genetischer Ebene eine schwächere Transkription bzw. Translation erreicht werden, was zu einer langsameren und schwächeren Expression führt. Diesen bleibt dann genug Zeit und Raum zur Faltung und man erhält zwar weniger, dafür aber aktives Enzym. Um dies zu erreichen, erfolgte die Klonierung an der SmaI-Schnittstelle im Expressionsvektor pKK223-3 mit einer „nicht optimalen“ Entfernung von 14 bp des Startcodons zur Ribosomenbindungsstelle. Dadurch ist die Translation schwächer mit dem bereits oben erklärten Effekt. Zusätzlich dazu besitzt das verwendete Plasmid pKK223-3 einen schwächeren Promotor als beispielsweise die oben verwendeten pET Systeme, was zu einer weiteren Abschwächung der Expression führt. In Abbildung 17 ist die Vektorkarte dargestellt. Ergebnisse 54 Abbildung 17: Vektorkarte des pKK-223-3recPheDH. Das PheDH-Gen wurde an der SmaI-Schnittstelle im Expressionsvektor pKK-223-3 mit einem Abstand zur Ribosomenbindungsstelle von 14bp ligiert. Der Vektor enthält folgende Strukturelemente: ??ein regulierbares Promotor/Operator Element bestehend aus dem tac-Promotor. Dadurch kann die Expression über IPTG, das den Repressor des lac-Operons inaktiviert, induziert werden ??abwärts der Klonierungsstelle den rrnB Transkriptionsterminator, der das Ende der Transkription signalisiert ??eine „multiple cloning site“ für die Insertion von Fremd-DNA [hier rec-PheDH], dadurch wird das lacZ-Gen inaktiviert und eine blau-weiß-Selektion rekombinanter Klone ermöglicht ??den Replikationsursprung [Ori] und das Gen für die ? -Lactamase, die die Ampicillinresistenz bereitstellt ??die lacZ Ribosomenbindungsstelle Ergebnisse 55 Um die Klonierung des PheDH-Gens an einer „nicht optimalen“ Entfernung des Startcodons zur ribosomalen Bindungsstelle durchführen zu können, wurde das recPheDH-Gen in die „multiple cloning site“ des pKK223-3 Expressionsvektors über glatte Schnittstellen an der SmaI Restriktionsschnittstelle [CCCGGG] ligiert. Dabei wurde zunächst der Vektor mit dem Restriktionsenzym SmaI geschnitten und anschließend mit einer alkalischen Phosphatase inkubiert, um eine 5’-Dephosphorylierung zu erreichen. Das amplifizierte recPheDH-Gen wurde mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und mittels Agarosegelsauftrennung gereinigt. Die benötigten Primer für die 5’- und 3’-Enden sind: 5’Primer (5’Phe-for) 5’ATG AGT ATC GAC AGC GCA CTG AAC 3’Primer (5’Phe-rev) 5’CTA CTA GGC AGT CGC TGT CGT TGT An den 3’-Primer wurden hinter die letzte Aminosäure des C-Terminus 2 Stopcodons angefügt, um eine effiziente Termination der Translation zu gewährleisten. Die Vektor-DNA konnte über Phenol/Chloroform Fällungen wiedergewonnen werden und wurde für die Ligation mit dem aufgereinigten recPheDH-Gens eingesetzt. Für die anschließende Transformation wurden kompetente E. coli HB101 bzw. JM-105 Zellen hergestellt (Hanahan, 1983) und verwendet. Einige der Transformanden wurden über Nacht in 5 ml LBamp inkubiert, und aus der hochgewachsenen Kultur Plasmid-DNA isoliert. Mit den durch Schnellisolierung gewonnenen Plasmiden wurde eine Restriktionsanalyse mit EcoRI durchgeführt. 5 µL des Ansatzes wurden auf einem Agarosegel (0,8 %) elektrophoretisch aufgetrennt (Abbildung 18). In der „multiple cloning site“ des pKK223-3-Vektor befindet sich vor der SmaI-Schnittstelle, über die die PheDH kloniert wurde, eine EcoRI-Schnittstelle. Da sich im Gen an Position 821 ebenfalls eine EcoRI-Schnittstelle befindet, führt ein Verdau mit EcoRI zu einem Fragment von etwa 830 bp. Ergebnisse 56 1 2 3 4 5 6 3 kb PKK-223-3 1 kb Fragment aus dem PheDH-Gen ca.800 bp Abbildung 18: rec-pKK223-3-PheDH verdaut mit EcoRI. 1: KB-Marker, 2-6 recPhe-pKK223-3 verdaut mit EcoRI (verschiedene Konzentrationen). Nach einer Restriktionsanalyse taucht eine Bande mit der erwarteten Größe von ca. 800bp auf. 5.1.5.4 Expression der recPheDH im pKK223-3 Das beschriebene Expressionssystem wurde zunächst in weitere E. coli Stämme (Tabelle 5) transformiert und hinsichtlich ihrer Expressionsrate sowie der nachweisbaren spezifischen Aktivität im zellfreien Rohextrakt untersucht. Das Ergebnis der Expressionsuntersuchung ist in Tabelle 5 dargestellt. Es wurden zwei weitere Stämme ausgewählt [JM105 und UT5600] und in 100 ml Kulturen [+amp] kultiviert. Beim Erreichen einer OD600 von 0.5 wurden sie mit 1 mM IPTG induziert. Nach 7 h wurde die Expression abgebrochen und die Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen. Aus den Daten wird ersichtlich, dass in allen untersuchten Stämmen eine Expression der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 nachzuweisen war. Die höchsten spezifischen Aktivitäten im zellfreien Rohextrakt konnten mit dem E. coli JM105 erzielt werden. Infolgedessen wurde dieser Stamm für alle weiteren Untersuchungen und für die Klonierung und Expression der Mutanten verwendet. Ergebnisse 57 Tabelle 5: Expressionsresultate der rekombinanten E.coli Stämme. Die Aktivitäten wurden im Rohextrakt „30 %iger Aufschluss“ gemessen. Aktivität U/ml Spez.Aktiv U/mg Rohextrakt im Rohextrakt Rhod.sp. M4 100 U/ml 7 UT5600 420U/ml 46 HB101 550 U/ml 61 JM105 2000 U/ml 250 5.1.6 Optimierung der Induktionsparameter Zur Optimierung der Expression der recPheDH in E. coli wurden neben der Auswahl eines geeigneten Vektor-Wirt-Systems die Induktionsparameter variiert, um eine effiziente Proteinexpression zu erzielen. Einerseits wurde die Induktorkonzentration zwischen 0 und 3 mM IPTG (? -D-Isopropylthiogalaktosid) bei einem konstanten Induktionszeitpunkt (OD600= 0.6) variiert (Abbildung 19). Die Untersuchung führte zu dem Ergebnis, dass mit einer IPTG-Konzentration zwischen 0.7mM und 1.2 mM eine optimale Expression zu erzielen war. In der Kontrollexpression ohne IPTG-Induktion konnte nur geringe PheDH-Aktivität (35 U/ml) im Rohextrakt nachgewiesen werden. Folglich unterdrückte der lac I-Repressor die Expression des PheDH-Gens im nichtinduzierten Zustand fast vollständig. Dies ist von Vorteil, da die Expression des Fremdproteins eine Belastung des Zellstoffwechsels bedeutet und zu einer erheblich geringeren Zellausbeute führt. Ergebnisse 58 Spezifische Aktivität (U/mg) 300 250 200 150 100 50 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 IPTG-Konzentration (mM) Abbildung 19: Variation der IPTG-Konzentration bei der Induktion von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen zwischen 0 und 3 mM induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen. Darüberhinaus wurde der Zeitpunkt der Induktion nach Inokulation variiert, wobei alle Kulturen mit 1 mM IPTG induziert worden sind. Die Zellen wurden 24 h nach Inokulation geerntet und die spezifischen Aktivitäten in den zellfreien Rohextrakten bestimmt. Die Ergebnisse der Induktionsuntersuchungen sind in Abbildung 20 und Abbildung 21 dargestellt. Es zeigt sich, dass der Zeitpunkt der Induktion einen großen Einfluss auf das Wachstum der Zellen hat. Ergebnisse 59 4 OD600 ohne IPTG OD600 mit IPTG OD 600 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Zeit nach der Inokulation (h) Abbildung 20: Wachstumsverhalten für E. coli nach der Induktion Bei der Betrachtung des Verlaufs der OD600nm im untersuchten Zeitraum fällt auf, dass in der Kultur, die zum Zeitpunkt der Inokulation mit 1 mM IPTG induziert worden ist, nur eine geringe Zunahme der OD600nm zu betrachten war (Abbildung 20). Hingegen zeigt die Kontrollkultur ohne IPTG eine deutliche Zunahme der Zelldichte. Eine Variation des Induktionszeitpunktes für die Erzielung der maximalen Induktion wurde durchgeführt (Abbildung 21). Aus Abbildung 21 ist zu entnehmen, dass die maximale Induktion des pKK223-3-PheDH im E. coli JM105 3 ½ h von der Inokulation erzielt werden konnte. Dieser Zeitpunkt entspricht einer OD600 von 0,5-0,55, d.h. die Zellen befanden sich während der IPTG- Zugabe am Anfang der logarithmischen Wachstumsphase. Ergebnisse 60 250 Spezifische Aktivität (U/mg) Spezifische Aktivität 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Induktionszeitpunkt (h) Abbildung 21: Variation des Induktionszeitpunktes in Expressionskulturen von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit 1 mM IPTG induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen. 5.1.7 Reinigung der recPheDH aus E. coli JM105 Die Reinigung der recPheDH aus E. coli-Rohextrakten erfolgte in Anlehnung an das Reinigungsprotokoll der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987). Zunächst wurden die Bakterienzellen durch Disintegration mit Glasperlen aufgeschlossen. Im Anschluß daran erfolgte ein zusätzlicher Reinigungsschritt zu den Literaturangaben durch eine Hitzedenaturierung der Begleitproteine in Gegenwart von 5 % (w/v) L-Phenylalanin und Entfernung des L-Phenylalanin mittels Gelfiltrationschromatographie. Die nach dieser Methode präparierte recPheDH-Fraktion konnte über Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose FF bis zur Homogenität gereinigt werden. Abbildung 22 (Bahn 1+2) zeigt die Auftrennung der gereinigten recPheDH in einem SDS-Polyacrylamidgel nach Silberfärbung. Ergebnisse 61 97.4 kDa 1 66.2 kDa 2+3 recPheDH nach DEAE-Sepharose FF 4 Marker E. coli Rohextrakt mit recPheDH 39.2 kDa 20.0 kDa 1 2 3 4 Abbildung 22: SDS-PAGE (12.5 %, Silberfärbung) zur Überprüfung der Reinheit der recPheDH nach DEAE-Sepharose FF–Chromatographiegel. 1 Marker, 2+3 recPheDH nach DEAE-Sepharose FF, 4 Rohextrakt aus E.coli. Mit dem vorliegenden Reinigungsprotokoll (Tabelle 6) konnte die recPheDH bis zur Homogenität gereinigt werden. Im Gegensatz zur Reinigung der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987) und PheDH aus Rhodococcus maris K-18 (Misono et al., 1989), die 3 bzw. 8 Schritte erfordert, waren bei der Reinigung der rec-PheDH nur zwei Schritte nötig. Tabelle 6: Zusammenfassung der Reinigung der recPheDH aus E.coli-Rohextrakt Reinigungsschritt Aktivität Proteingehalt Spez. Aktivität Ausbeute Reinigungs- [U/ml) [mg/ml] [U/mg] [%] faktor Rohextrakt 2000 8 250 100 1 Hitzedenaturierung 2300 6.6 348 86 1.4 DEAE-Sepharose FF 121 0,16 756 58 3 Aufkonzentrierung 4500 7 690 51 3 + Sephadex G25 (Centriprep 10) Ergebnisse 62 5.1.8 Substratspektrum und KM-Werte Die Phenylalanin Dehydrogenase katalysiert die oxidative Desaminierung von L-Phenylalanin und mehrerer anderer L-Aminosäuren und die reduktive Aminierung von Phenylpyruvat und P-Hydroxophenylpyruvat. Das Enzym benötigt NAD+ als natürliches Coenzym. Verschiedene Aminosäuren und 2-Ketosäuren sind als Substrate für die Wildtyp-PheDH vom Rhodococcus sp. M4 bekannt (Tabelle 7) (Hummel et al., 1987). In dieser Arbeit wurden die biochemischen Eigenschaften (Tabelle 8) der Wildtyp-PheDH mit der Rec-PheDH verglichen und eine 100 %ige Ähnlichkeit festgestellt. Das bedeutet, dass beide Enzyme identische Eigenschaften besitzen. Tabelle 7: Untersuchte Substrate der Rec-PheDH. Substrat Vmax KM Phenylpyruvat 100 1.6?10-4 p-Hydroxyphenylpyruvat 5 2.3?10-3 Indolpyruvat 3 7.9.10-3 2-Keto-4-methylmercaptobutyrat 33 2.1.10-3 A: Reduktive Aminierung: Der Wert des Vmax ist relativ zum Phenylpyruvat als 100 Substrat Vmax KM L-Phenylalanin 100 7.2?10-4 L-Tyrosin 12 3.4?10-3 L-Tryptophan 2 1.7?10-2 L-Methionin 4 4.8?10-4 B : Oxidative Desaminierung: Der Wert des Vmax ist relativ zum L-Phe Tabelle 8: Kinetische Parameter für die Rec-PheDH Reduktive Aminierung KM (PPy) 0.13 mM KI (PPy) 7.34 mM KI (Phe) 2.96 mM KM (NADH) 0.13 mM KI (NAD+) 1.27 mM KM (NH4+) 387 mM Oxidative Desaminierung Ergebnisse 63 KM (Phe) 0.87 mM KI (Phe) 17.85 mM KI (PPy) 0.07 mM KM (NAD) 0.27 mM KI (NADH) 0.002 mM 5.1.9 Temperaturstabilität Es wurde eine Desaktivierungskinetik zur Ermittlung der Temperaturstabilität durchgeführt. Die Proben wurden bei Temperaturen zwischen 20 und 50°C inkubiert und in bestimmten Zeitintervallen (1 h, 2 ½ h, und 36 h) zur Bestimmung der Restaktivität Aliquots entnommen. In Abbildung 23 ist die Bestimmung der Aktivität nach 36 h bei verschiedenen Temperaturen dargestellt. 100 rec-PheDH 90 WT-PheDH 80 Aktivität (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Temperatur (°C) Abbildung 23: Temperaturstabilität der rec-PheDH im Vergleich zur WT-PheDH im Rohextrakt. Nach 36 h konnten bei 37°C noch 90 % Restaktivität der rec-PheDH gemessen werden. Im Vergleich dazu wurden nur noch 56 % Restaktivität bei einer 36 stündigen Inkubation der recPheDH bei 50°C ermittelt. Die Wildtyp-PheDH zeigte nach 36h bei 30°C nur noch etwa 50 % Restaktivität . Ergebnisse 64 5.1.10 Temperaturoptimum Die Reaktionstemperatur wurde direkt in der Küvette gemessen. Die Ansätze wurden auf die jeweiligen Messtemperaturen (20-50°C) temperiert, anschließend das Enzym hinzugegeben und die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit gemessen. 100 90 rec-PheDH WT-PheDH 80 Aktivität (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Temperatur (°C) Abbildung 24: Temperaturoptimum der recPheDH im Vergleich zur WT-PheDH, Enzym-Präparate aus dem Rohextrakt JM105. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 270 U/mg, und im WT-PheDH 24 U/mg. Die optimale Temperatur sowohl für die rec-PheDH als auch für WT-PheDH liegt bei 50°C, die Enzymtests und Synthesereaktionen wurden jedoch aus Stabilitätsgründen bei 30°C durchgeführt. 5.1.11 pH-Optimum Die meisten Enzyme zeigen bei einem charakteristischen pH-Wert ihre maximale Aktivität, oberhalb und unterhalb dieses Wertes nimmt die Aktivität ab. Eine mögliche Erklärung für die Abhängigkeit der Enzymaktivität ist, dass saure und basische Aminosäuren pH-Wert-abhängig ionisiert oder nicht ionisiert vorliegen. Ausserdem beeinflusst die Protonenkonzentration bei Beteiligung von H+ an der Reaktion ihr thermodynamisches Gleichgewicht. Für die Bestimmung des pH-Optimums der rec-PheDH wurde der Enzymtest bei verschiedenen pH-Werten von 5.0-11 durchgeführt. Dabei wurde Ergebnisse 65 der Tris/HCl-Puffer im Bereich von pH-Wert 7-10 mit NaOH bzw. HCl eingestellt. Für niedrige sowie extrem hohe pH-Werte wurde der Puffer Glycyl-Glycin benutzt. Dieser besitzt in diesen Bereichen eine hohe Kapazität. 100 90 rec-PheDH 80 WT-PheDH Aktivität (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH-Wert Abbildung 25: pH-Optimum der rec-PheDH für die reduktive Aminierung. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 190 U/mg, und im WT-PheDH 16 U/mg. Die Messung wurde bei 30°C durchgeführt. 12 Ergebnisse 66 5.2 Hochzelldichte Fermentation (HZD) 5.2.1 Zuführung von Nährstoffen, Nebenproduktbildung und Wachstum Der als konservierte 1 ml Kultur bei –80°C gelagerte rekombinante Stamm E. coli JM 105 wurde als Vorkultur in 400 ml LB amp-Medium bei 37°C 18 h inkubiert. Damit wurde ein 10L Fermenter (Hochzelldichte Medium) 4 %ig angeimpft. Die Form der Nährstoffzuführung ist ein kritisches Parameter bei der HZD-Fermentation, da nicht nur die maximal erreichbare Zelldichte, sondern auch die Zellproduktivität beeinflusst wird (Lee, 1996). Denkbar sind sowohl konstante als auch kontinuierlich veränderbare Fütterungsraten. Beide Möglichkeiten der Nährstoff-Zuführung wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf Wachstumsrate, erreichbare End-Zelldichte und Acetatbildung des PheDH- Produktionsstammes E. coli JM105 (rec-pKK-223-3-PheDH) untersucht. Die Ergebnisse sind in den Abbildung 26 und 27 dargestellt. 90 Feedlösung [g/std] 80 OD 630 70 Acetatkonzentration [mM] 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zuführungszeit [Std.] Abbildung 26: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK-223-3-PheDH] bei linearer Erhöhung der Glucosezufuhr in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C. Die Acetatbildung wurde mittels HPLC bestimmt. Ergebnisse 67 250 Feedlösung [g/std] 200 OD 630 Acetatkonzentration [mM] 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Zuführungszeit [Std.] Abbildung 27: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK223-3-PheDH] in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C und exponentieller Erhöhung der Glucosezufuhr. Anders als die erreichte End-Zelldichte während der Nährstoffzuführung über 14 Stunden, waren unterschiedliche Konzentrationen des gebildeten Acetats bei den zwei verschiedenen Zuführungssystemen zu beobachten. Während Acetat bei linearer Zuführung der C-Quelle ständig gebildet wurde, war bei exponentieller Zuführungsstrategie kein Acetat nachweisbar. Daher wurden weitere Experimente mit exponentieller Zuführung der C-Quelle durchgeführt. Nach Literaturangaben von Riesenberg (Riesenberg, 1991) und Fieschko (Fieschko, 1989) erfolgt die Bildung wachstumsinhibierender Nebenprodukte wie Acetat in komplexen Medien, bei Wachstumsraten oberhalb von 0,2 h-1 (Riesenberg et al., 1991) und in definierten Medien bei Wachstumsraten oberhalb von 0,35h-1. Mit abnehmender spezifischer Wachstumsrate steigt die Expression des rekombinanten Proteins (Fieschko, 1989). Daher war für die Kultivierung des Expressionsstammes JM105 eine spezifische Wachstumsrate von 0,2 h-1 angebracht. Ergebnisse 68 5.2.2 Bestimmung des Induktionszeitpunkts Abbildung 28 zeigt den Einfluss des Induktionszeitpunkts auf die Systemproduktivität. Dies wurde mittels zweier Experimente abgeschätzt, die die Zunahme der Volumenaktivität an PheDH und die Plasmidkopienzahl nach Induktion am Anfang bzw. in der Mitte der Fütterungsphase bestimmten. Die Ergebnisse wiesen daraufhin, dass ähnlich zu Versuchen in Schüttelkultur eine signifikante Abhängigkeit der recPheDH-Expression vom Induktionszeitpunkt besteht. 1400 Volumenaktivität [U/ml] 1200 Induktion nach 1h Induktion nach 5 h 1000 800 600 400 200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Zuführungszeit [h] Abbildung 28: Entwicklung der PheDH-Volumenaktivität in Abhängigkeit vom Induktionszeitpunkt während der Zufütterungsphase. Die Entwicklung der Plasmidkopienzahl, erkennbar an der Zunahme der Plasmidmenge aus Präparationen gleicher Zellkonzentration wurde im Agarosegel überprüft (Abbildung 29). Ergebnisse 69 Zeit nach Induktion (Std.) 3h 5h 8h 10 h 11 h 2.0 kb 1.6 kb Abbildung 29: 0.8 %iges Agarosegel zum Nachweis der Konzentrationszunahme an rec-pKK-223-3 bei Induktion 1h nach Beginn der Glucose-Zuführung während der Fermentation. Aus Abbildung 29 ist die Erhöhung der Plasmidkopienzahl zu entnehmen. Eine Abnahme der Menge an Plasmiden war bei einer Induktion in der Mitte der Zufütterungsphase Abbildung 30 zu beobachten. 5 kb 0h 2h 4h 6h 2 kb Zeit nach Induktion (Std.) Abbildung 30: Zu- und Abnahme der Plasmidkopienzahl bei Induktion 5 h nach Beginn der Glucosezuführung. Ergebnisse 70 5.3 Klonierung des malic enzymes 5.3.1 Präparation genomischer DNA Das malic enzyme- Gen wurde mittels PCR mit genomischer DNA als Template amplifiziert. Die genomische DNA aus E. coli K12 wurde durch enzymatische Vorbehandlung der Zellwand mit Lysozym und Fällung der Proteine mit CTAB gewonnen. Die Reinheit der DNA wurde durch ein 0.5 % Agarose Gel überprüft. Die präparierte genomische DNA war hochmolekular und intakt. Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer bei 4°C aufbewahrt. 5.3.2 Genisolierung und Klonierung des malic enzymes im recPhe-pKK-223-3 Für die Amplifikation des malic enzymes aus der genomischen DNA des E. coli K12, wurde der 5’Forward-Primer aus der bekannten N-Terminus-Sequenz abgeleitet (Mahajan et al., 1990; Stols & Donnelly, 1997). Da der C-Terminus des NAD-abhängigen malic enzymes aus E. coli K12 (zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Arbeiten) nicht veröffentlicht war, wurde mit Hilfe des 5’Forward Primers ein Einzelstrang ampilifiziert, und die genomische DNA, die als Template im PCR-Ansatz vorlag, mit dem Restriktionsenzym DpnI verdaut. Somit konnte der Einzelstrang erhalten und gewonnen werden, das dann für eine zweite PCR verwendet werden konnte. Da die Taq-Polymerase ca. ein Kb pro Minute amplifiziert, wurde eine Elongationszeit im PCR-Zyklus von 1,7 min gewählt. Somit konnte ein ca. 1,6-1,8 Kb großer Einzelstrang, der der Größe des malic enzymes entspricht, amplifiziert werden. In einer zweiten PCR wurden drei Ansätze vorbereitet, bei denen als Primer sowohl der 5’Forward-Primer als auch je ein 5’-Reverse-Primer (siehe unten) Verwendung fanden. 1: 5’-Forward: N’-Malic-pst 5’CTGCAGAGCCCAGGGATGGATATTC 3’ 2: 5’-Reverse A TTATTATTATTATTA 3: 5’-Reverse B CTACTACTACTACTA 4: 5’-Reverse C TCATCATCATCATCA Ergebnisse 71 Konzentration jeweils 100 pmol/µl Die Primer für den C-Terminus wurden aus den Stopcodons abgeleitet. Da das Stopcodon des malic enzymes zum Zeitpunkt der Klonierung nicht bekannt war, wurden 3 verschiedene Primer, denen die 3 Stopcodons entsprechen, konstruiert (2-4). Mit einer Kombinationen aus dem bekannten 5’-Forward-Primer (1) und je einem Reverse-Primer (5’-ReverseA-C) wurden 3 PCR-Ansätze durchgeführt (Abbildung 31). 5' 3' genom. DNA 3' 5' Denaturierung 94°C 5' 3' Annealing 59°C 5'-Forward 5' 3' Amplifizierung 72°C 1,7 min 5' 3' Verdau der genomischen DNA und Gewinnung des Einzelstranges 5' 5' 3' 3' 3' 5' 5'-Rev C 5'-Rev A 3' 5' Annealing 50°C 5'-Rev B Kein Produkt 5' 3' Kein Produkt malic enzyme Abbildung 31: Neue PCR-Strategie zur Amplifikation des malic enzymes. Es wurde ein Einzelstrang amplifiziert, der als Template für eine zweite PCR dient. Ergebnisse 72 Da das Triplett für die Stopcodons mehrmals im Gen vorkommt, wurden durch diese Methode bei der Amplifikation des Einzelstranges entsprechend mehrere Fragmente amplifiziert. Aufgrund der bekannten Größe des malic enzyme-Gens konnte ein Fragment aus dem Gel isoliert und für die Ligation eingesetzt werden. Die restlichen Banden sind Teilfragmente vom malic enzyme. Mit dieser vollkommen neuen Methode konnte ein doppelsträngiges Fragment amplifiziert werden, das dann an der SmaI-Schnittstelle im pUC18 blunt ends ligiert und sequenziert wurde. 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 ATGGATATTC TATATCCCTT TTCAGCATGG ACCATCGAAG GACAAACACA GTAAACAATC TGTGAGCGTT CGGCACAATA GTGACTGACG CCGATCGGTA CCGGTGGTGC GGCTGGCGTA CAGGCTGTGA AATGCGATGC CAGGGCACTG CAGTTAAGCG GAAATGATCA GTCTTTATGG CAGACCAAAC CTGTCACTGC CAGACCGGGC ATCGTGATGC GCCTGGACCG AAAGATAAAA CTGGGTGTTA GAAACGCTGG CTGAAAGATA CAGCAAGGCG TTCTGGCAAG AAAAAAGAGT ACGCTGGCCC AAGAACGCCG AACAAGCGGA TCTACCTGCG ATCTTGATGA TTTCTGAGAT TGGACGATAT GTGAACGCAT AACTGTCGCT TGGATGTCGG ATCCGCGTAT AACAACGCTG CGTTACTTAA CGGCGGTAAC AGAAAAAAAT TCTCCCAGAC TCGATCGCTT TGGTGCAGAA TGGATGTGGT TGTTTACGGA CGCTGTCTAA AAGGTAACGC TCTACCCTAT TTGCTTCCGG CGCAGTATTC TTCAGAAAGT TGGCGGTGAA CCGAATACCG GAGTGACATG TGTACTGCTG TAACTTCAAC ACGAGCATGG TAACATCCAG GATGATGCCT CTACCGCCGT TCTGCAAAAC TCTGGGGCTT CTATACCGCC AACGAACAAC CACTGACGAC GCCAGACGTG CCGCTATCGC AGTCGGCACA CGTCTTCCTT CCAGCGCGAA TGGCTTGCTG GCGCGAAAAC GCGCAATGTA AGAGATCATC CCCGACGTCA GCTGGTCGCC CGCCCAGTGT CGCGTCACGT ACCATTGGTG CTCCCGCGCA AACCTCTGCC CGACTACCGC GAACCAAAAA GAATTTCCGT CTGCTGGGGT ATCCAGTATC GACACTAACG GTTATTTATA TCACGCGGCG GTGCCGAACC GGTGACCAGG TGTGGCGGCA CAACAGCTGC GAATACTATG CTGTTGCAGT AATGAAATTT CTGATCGCAG GGCGCAGGTT GGATTAAGCG ACTGACAAGA CTCAGTGACT AAACCAGATA CGTGAGATGC CGCGTGGAAG ACGGGCAGCC AACAACGCCT ATCACCGATG CTGAACGGCG ATTGCGTTTG GAAGCCCTGC CGTACCTCCA Abbildung 32: DNA-Sequenz des malic enzymes aus E. coli K12. CAAAAAAACA TGTTGAATAA TACTGCCGGA AGGGATTCAA AAACCCTCTT CCCCAACCGT TGTTTATCTC ATAATATTAA GCATCGGCGG TCAGCCCGGC TTAACGATCC AATTCGTTGA TTGAAGACTT GTTCTTTTAA CAAGCCGCGC CAGCGGGATG AGGAAGCGGC TGCCGAACCT GGGATACCGA TTCTGATTGG ATAAACACTG CCACACCGCA CGTTTAATCC TTATTTTCCC AGATGCTGAT AAGGTATGGT CGGTTGGCAA AACAGGCCAT TCTAA GCGTTCGCTT AGGCAGTGCC AGTGGTCGAA AACCGAAATC CTACCGTCTG CGGCGCAGCC TTACCAGAAC AGTGATTGTG GATGGGCATT GTATACCCTT GCTGTATATG TGAATTTATC TGCTCAAAAA CGATGACATT GGCAGGTGGT CGGCATTGCC GCGGCAGAAA GCTGCCTTTC CAGCGATGTG CGTCTCAGGA TCCGCGTCCG GGACATTATC AGTGGTATGG GGGCATCGGC GTCGGCAAGT ACTGCCGGAA AATGGCGCAG TGACGATAAT Ergebnisse 73 1 MDIQKRVSDM EPKTKKQRSL YIPYAGPVLL EFPLLNKGSA FSMEERRNFN LLGLLPEVVE 61 TIEEQAERAW IQYQGFKTEI DKHIYLRNIQ DTNETLFYRL VNNHLDEMMP VIYTPTVGAA 121 CERFSEIYRR SRGVFISYQN RHNMDDILQN VPNHNIKVIV VTDGERILGL GDQGIGGMGI 181 PIGKLSLYTA CGGISPAYTL PVVLDVGTNN QQLLNDPLYM GWRNPRITDD EYYEFVDEFI 241 QAVKQRWPDV LLQFEDFAQK NAMPLLNRYR NEICSFNDDI QGTAAVTVGT LIAASRAAGG 301 QLSEKKIVFL GAGSAGCGIA EMIISQTQRE GLSEEAARQK VFMVDRFGLL TDKMPNLLPF 361 QTKLVQKREN LSDWDTDSDV LSLLDVVRNV KPDILIGVSG QTGLFTEEII REMHKHCPRP 421 IVMPLSNPTS RVEATPQDII AWTEGNALVA TGSPFNPVVW KDKIYPIAQC NNAFIFPGIG 481 LGVIASGASR ITDEMLMSAS ETLAQYSPLV LNGEGMVLPE LKDIQKVSRA IAFAVGKMAQ 541 QQGVAVKTSA EALQQAIDDN FWQAEYRDYR RTSI Abbildung 33: Proteinsequenz des malic enzymes aus E. coli K12 abgeleitet von der DNA-Sequenz. Die Proteinsequenz des malic enzymes aus E.coli wurde mit verschiedenen Sequenzen aus der Datenbank „National Center for Biotechnology Information“ verglichen (Abbildung 34) und hohe Homologie festgestellt. Dabei konnten unterschiedliche Sequenzbereiche der einzelnen Proteine in der Datenbank der „National Center for Biotechnology Information“ als charakteristisch für malic enzyme identifiziert werden. Eine starke Homologie findet man in der Coenzym-Bindungsstelle des malic enzymes verschiedener Ursprünge. NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli 10 20 30 40 50 60 | | | | | | ---------MDEQLKQSALDFHEFPVPGKIQVSPTKPLATQRDLALAYSPGVAAPCLEIE --------------------------------------------------------------------MDAQLRQAALDFHEFPTPGKIEVTPTKSLATQRDLALAYSPGVAVPCLEIQ MTKKPSSPSTRSDFDEAALFFHRYPKPGKLEIQATKPLGNQRDLALAYSPGVAAPCLAIH --------------------MDIQKRVSDMEPKTKK----QRSLYIPYAGPVLLEFPLLN NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli 70 80 90 100 110 120 | | | | | | KDPLAAYKYTARGNLVAVISNGTAVLGLGNIGALAGKPVMEGKGVLFKKFAGIDVFDIEV -----------------------------------------------------------ADPAASYRYTSRGNLVAVISNGTAVLGLGNIGALAGKPVMEGKGVLFKKFAGVNVFDIEI DDPATAAEYTARGNLVAVVSNGTAVLGLGNIGALASKPVMEGKAVLFKKFADIDVFDIEI KGSAFSMEERRNFNLLGLLP-----EVVETIEEQAERAWIQYQG--FKTEIDKHIYLRNI NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli 130 140 150 160 170 180 | | | | | | DELDPDKFINVVAALEPTFGGINLEDIKAPECFYIEQKLRERMNIPVFHDDQHGTAIIST --------------------------------------------------DQHGTAIIST DERDPDKLVDIIASLEPTFGGINLEDIKAPECFYIEQKLRERMKIPVFHDDQHGTAIISA DAHEINRIVDVVSALEPTFGGINLEDIKAPECFEVEEQLRERMNIPVFHDDQHGTAIIVA QDTNETLFYRLVNNHLDEMMPVIYTPTVGAACERFSEIYRRSRGVFISYQNRHNMDDILQ ::*. * Ergebnisse NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli 74 190 200 210 220 230 240 | | | | | | AAILNGLRVVEKNISDVRMVVSGAGAAAIACMNLLVALGMQKHNIVVCDSKGVIYKGREP AAILNGLRVVEKNISDVRMVVSGAGAAAIACMNLLVALGLQKHNIVVCDSKGVIYQGREP AAILNGLRIVKKDIAKVKLIASGAGAASIACLNLLVSLGLPRENIIVCDSKGVIFHGRDE SAVLNGLELAGKKIEEAKIVTSGAGAAALACLNLLVNLGAKRENIWVCDIEGVVYDGRNT NVPNHNIKVIVVTDGERILGLGDQGIGGMGIPIGKLSLYTACGGISPAYTLPVVLDVG-. :.:.: . : .. * ..:. : * .* . *: . 250 260 270 280 290 300 | | | | | | NMAETKAAYAVDDSGKRTLDEVIDGADIFLGCSGPKVLTQEMVKKMARAPMILALANPEP NMAETKAAYAVVDDGKRTLDDVIEGADIFLGCSGPKVLTQEMVKKMARAPMILALANPEP RMDETKKLYAIEDNGKRTLAEVINDADIFLGCSAAGTLTQDMVKTMAANPLILALANPDP LMDRWKEVYAQKTD-ARTLADVIGGADVFLGLSAAGVLKPELLKQMAEKPLIMALANPKP -----------------TNNQQLLNDPLYMGWRNPRITDDEYYEFVD--EFIQAVKQRWP * : : . :::* . : : : :* *: : * 310 320 330 340 350 360 | | | | | | EILPPLAKEVRPDAIICTGRSDYPNQVNNVLCFPFIFRGALDVGATAINEEMKLAAVRAI EILPPLAKEVRPDAIICTGRSDYPNQVNNVLCFPFIFRGALDVGATAINEEMKLAAVRAI EILPPLAKAVRPDAIVCTGRSDYPNQVNNVLCFPFIFRGALDVSATAINEEMKLAAVHAI EIMPEEARAARADAMICTGRSDFPNQVNNVLCFPYIFRGALDVGATVINEEMKLAAVRAI DVLLQFEDFAQKNAMPLLNR------YRNEICS---FNDDIQGTAAVTVGTLIAASRAAG ::: .: :*: .* .* :* *.. :: *:. : *: * 370 380 390 400 410 420 | | | | | | AELAHAEQSEVVASAYGDQDLSFGPEYIIPKPFDPRLIVKIAPAVAKAAMDSGVATRPIA AELAHAEQSEVVASAYGDQDLSFGPEYIIPKPFDPRLIVKIAPAVAKAAMESGVATRPIA ADLALAEQSEVVTSAYGETELSFGPEYLIPKPFDPRLIVKIAPAVAKAAMDSGVATRPIK ASLAREEPSDVAARAYSGDTPTFGPDYIIPSPFDQRLILRIAPAVAKAAMETGVATRPIE GQLSEKKIVFLGAGSAG---------------------CGIAEMIISQTQREGLSEEAAR ..*: : : : : . ** : . : *:: .. 430 440 450 460 470 480 | | | | | | DFDAYIDKLTEFVYKTNLFMKPIFSQARKD--PKRVVLPEGEEARVLHATQELITLGLAK DFDVYIDKLTEFVYKTNLFMKPIFSQARKA--PKRVVLPEGEEARVLHATQELVTLGLAK DFDAYIEKLTQFVYKTNLFMKPVFAQAKQN--KKRVLLTDGEESRVLHAVQEIATLGIAT DMEAYLDRLNRFVFRSGLIMKPVFAAARTQGAPMRVIYADGEDERVLRAAQVVIEERIAA QKVFMVDRFGLLTDKMPNLLP--FQTKLVQ---KRENLSDWDTDSDVLSLLDVVRN-VKP : :::: :. : :: * * .: : : : : : 490 500 510 520 530 540 | | | | | | PILIGRPSVIEMRIQKLGLQIKAGVDFEIVNNESDPRFKEYWSEYYQIMKRRGVTQEQAQ PILIGRPNVIEMRIQKLGLQIKAGVDFEIVNNESDPRFKEYWTEYFQIMKRRGVTQEQAQ PILLGRPSVIAQKIKQLGLHIQEGRDFELVDIENNPYFEECYKTYHNLLKRKGITPAGAQ PILVGRPQVVETRLRRYGLKIRPGTDFELINPEDDPRYRDYVDLYLSYTGRQGVTPEAAR DILIGVSGQTGLFTEEIIREMHKHCPRPIVMPLSNP------------------T----**:* . .. .:: :: .:* * 550 560 570 580 590 600 | | | | | | RAMIGNHTAIGAIMVQRGEADAMICGTIGDYHEHFSVVKAVFGYRDGVHTAGAMNALLLP RALISNPTVIGAIMVQRGEADAMICGTVGDYHEHFSVVKNVFGYRDGVHTAGAMNALLLP RKMLHNPTVIGATLLQLGKADAMLCGLVGPYASHLSNIKEVIGVQPCVPTPATVNGLVLP TIVRTNSTAIAALAVMRDEADAMICGLEGRFERHLRVVRQIIGKVPGIRDYSALSLLISQ ----SRVEATPQDIIAWTEGNALVATGSPFNPVVWKDKIYPIAQCNNAFIFPGIGLGVIA . . : :.:*::. :. :. : Ergebnisse 75 610 620 630 640 650 660 | | | | | | SGNTFIADTYVNEDPTPEQLAEIAVMAAETVRRFGIEPKVALLSHSNFGSSNSLSASKMR SGNTFIADTYVNDEPDAEELAEITLMAAETVRRFGIEPRVALLSHSNFGSSDCPSSSKMR TGNLFITDTFVNHNPTAQELAEITIMAANEVSRFGIEPKVALVSHSNFGTFDDPSAVKMR RGALFLTDTYVNAEPDANEIAEMAVLAAREISRFGIEPKAALVSHSNFGSKESASAEKMR SGASRITD-------------EMLMSASETLAQY---S-PLVLNGEGMVLPELKDIQKVS * ::* *: : *:. : :: . ::. ..: : . *: NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli 670 680 690 700 710 720 | | | | | | ETLERVRERAPDLMIDGEMHGDAALVESIRNDRMPDSPLKGAANILVMPNMEAARISYNL QALELVRERAPELMIDGEMHGDAALVEAIRNDRMPDSSLKGSANILVMPNMEAARISYNL EVLHLVKEKAPDLIIDGEMHCDVALNEKLRQDIMPDSPLKGAANLLVMPNMEAARISLNL QAAAILAEKAPDLESDGEMHGDAALSQTLRDRVFPNSRLKGEANLLVFPNLDAANITLNV RAIAFAVGKMAQQQGVAVKTSAEALQQAIDDNFWQAEYRDYRRTSI-------------.. : .: . ** : : : . . . : NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli 730 740 750 760 770 | | | | | LRVSSSEGVTVGPVLMGVSKPVHVLTPIASVRRIVNMVALAVVEAQTTPL-----LRVSSSEGVTVGPVLMGVAKPVHVLTPIASVRRIVNMVALAVVEAQTQPL-----LQGTATP-ITVGPILMGMNKPVHILTSASSVRRIINMVAIAAANVEPTCK-----VKAVTDA-LHVGPILLGATRPAHILTPSVTSRGVVNMTALAVVEALQKNASNRRQN -------------------------------------------------------- NADP_Salmonella NADP_Ecoli Mdh_Pasteurella NAD_Brucella NAD_Ecoli Abbildung 34: Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener malic enzymes. NADP- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (Parkhill et al., 2001), Mdh Pasteurella multocida (May et al., 2001), NAD-Brucella melitensis (DelVecchio et al., 2002), NADP-E.coli (Blattner et al., 1997). 5.4 Konstruktion eines Expressionsvektors mit heterologer Expression Aus der Sequenz des amplifizierten Fragmentes (Abbildung 32) wurden Primer mit integrierten Restriktionsschnittstellen und ein Codon für die ribosomale Bindungsstelle konstruiert. Nach der Amplifikation des malic enzymes aus dem rekombinanten pUC18 wurde das PCR-Fragment in den rekombinanten recPhe-pKK-223-3-Expressionsvektor hinter der PheDH-Sequenz an der PstI und HindIII-Restriktionsschnittstellen kloniert (Abbildung 35 und Abbildung 37). HindIII PstI Ptac RBS ATG PheDH TAG RBS ATG ME TAA Abbildung 35: Konstruktion des Plasmids für eine heterologe Expression zur L-Phe Synthese mittels Ganzzellumsetzung. Ergebnisse 76 5’-Forward: N’-Malic-pst 5’CTGCAGAGCCCAGGGATGGATATTCAAAAA 3’ Konzentration 100 pmol/µl 5’-Reverse: C’-Malic-Hin 5’AAGCTTTTAGATGGAGGTACGGCGGTAGTC 3’ Konzentration 100 pmol/µl In Tabelle 9 sind die Konzentrationen aufgeführt, die für die Isolierung des malic enzymeGens erforderlich sind. Tabelle 9: PCR Protokoll zur Amplifizierung des malic enzymes aus dem rekombinanten pUC18-Plasmid. Variiert wurden die Konzentrationen der Template-DNA. Template DNA N’-Malic-pst C’-Malic-Hin dNTP Puffer Taq-Polymerase H2O recpUC18 Prim 1 Prim 2 50ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 83µl 25ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 83µl 10ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 83µl Ein Zyklus besteht aus: Denaturierungsschritt : 94°C Annealingschritt: 59°C Amplifizierungsschritt: 72°C 1: 10ng Template 2: 25 ng Template 3: 50 ng Template 1 2 3 1.6kb 1 kb Abbildung 36: PCR-Ausbeute des malic enzyme-Gens bei verschiedenen Konzentrationen an TemplateDNA (rec-pUC18). Ergebnisse 77 pstI Abbildung 37: Vektorkarte des rec-pKK-223-3 PheDH-malic. malic enzyme wurde 3’zur PheDH an der Pst1- und HindIII-Schnittstelle mit eigener Ribosomenbindungsstelle kloniert. Das neue Konstrukt des rekombinanten Plasmids wurde in kompetente E. coli-Zellen JM 105 bzw. HB 101 transformiert. Mit der Klonierung des malic enzyme 3’zur PheDH an der Pst1- und HindIII-Schnittstelle mit eigener ribosomalen Bindungsstelle konnte eine Expression beider Enzyme gleichzeitig erfolgen. 5.4.1 Coexpression der PheDH und des malic enzymes Von den positiven Klonen wurden einige zur Expression ausgewählt. Eine Einzelkolonie der jeweiligen Klone wurde in 5 ml LBamp –Medium überimpft, und nach Erreichen von OD580 = 0,6 mit 1 mM IPTG induziert. Die Induktion erfolgte über Nacht und die geernteten Zellen wurden mit Ultraschall aufgeschlossen. Ergebnisse 78 Der rekombinante Stamm HB101 zeigt eine malic enzyme- Aktivität von 100 U/ml und ebenso eine PheDH –Aktivität von 130 U/ml. Die Aktivität beider Enzyme im rekombinanten Stamm JM 105 ist eindeutig höher und liegt bei ~ 600 U/ml für malic enzyme und ~1200 U/ml für die PheDH. Die beiden rekombinanten Stämme wurden im 10 L Fermenter kultiviert und die Aktivität beider Enzyme bestimmt. Tabelle 10: Aktivitätsbestimmung der exprimierten Enzyme in einem 10 L Fermenter mit LB-Medium als batch-Fermentation. Aktivität PheDH Aktivität malic enzyme (U/ml) (U/mg) (U/ml) (U/mg) E. coli HB101 400 33 220 22 E. coli JM105 1300 118 640 71 Aus den Daten der Expression (Tabelle 10) ist zu entnehmen, dass der E. coli Stamm JM 105 deutlich bessere Aktivität für beide Enzyme zeigt, daher wurden alle weiteren Versuche mit diesem Stamm durchgeführt. Die Qualität der Expression hängt unter anderem vom Alter der kompetenten Zellen ab, die dafür eingesetzt werden. Ebenso spielt die Behandlung in der Herstellung von kompetenten Zellen eine große Rolle bei der Expression. Beide kompetente Stämme, sowohl JM 105 als auch HB 101, wurden gleichzeitig hergestellt. Daher sind Fehler, die auf o.g. Faktoren zurückzuführen sind, ausgeschlossen. 5.4.2 Optimierung der Aktivität Um die maximale Aktivität der erhaltenen Rohextrakte ausschöpfen zu können, wurden mehrere Parameter untersucht und variiert. Beide heterolog exprimierten Enzyme zeigen bei unterschiedlichen Bedingungen beste Stabilitätseigenschaften. Von Interesse war es, die optimalen Eigenschaften für beide Enzyme im gleichen System zu ermitteln. Die nachfolgenden Versuche wurden mit Blick auf diese Tatsache durchgeführt. Ergebnisse 79 ??Optimierung des Aufschlusspuffer 1 g Zellen JM105 wurde in 0,1 M Tris- bzw. 0,1 M Kpi-Puffer mit/ohne BSA (1,5 g/l) 30 %ig aufgeschlossen. Der Aufschluss erfolgte mit Ultraschall bei 70 cont. Cycles. Zusätzlich zu den Puffern wurden 1,5 g/l BSA zur Stabilisierung der Enzyme zugegeben. Tabelle 11: Aktivitätsvergleich in Abhängigkeit des Aufschlusspuffers 0,1M Tris 0,1M Kpi - BSA + BSA - BSA + BSA PheDH 520 U/ml 610 U/ml 730 U/ml 1100 U/ml malic enzyme 430 U/ml 720 U/ml 320 U/ml 610 U/ml Der Zusatz an BSA führte in beiden Fällen zu einer Steigerung der Aktivität. Ebenso beeinflusste der Aufschluß-Puffer die Aktivitäten. Hierbei war zu beobachten, dass der geeignete Aufschluß-Puffer für die einzelnen Enzyme verschieden war. Der Kpi-Puffer war für die PheDH besser geeignet als für das malic enzyme, da aber die Aktivitätsabnahme des malic enzymes im Kpi-Puffer relativ gering war, wurden die rekombinanten Zellen nach der heterologen Expression weiterhin in diesem Puffer aufgeschlossen. ??Aufschlussdauer zur Untersuchung der Stabilität Ebenso wurde die Aufschlussdauer überprüft und der kritische Punkt zur Stabilität der Enzyme während dieses Vorganges bestimmt. Aus den Daten in Abbildung 38 ist die optimale Aufschlussdauer zu entnehmen. Ergebnisse 80 1600 PheDH Malic enzyme Aktivität (U/ml) 1200 800 400 0 60secx2 30secx4 30secx8 Aufschlusszeit (Sec) Abbildung 38: Stabilitätsbestimmung der PheDH bzw. des malic enzymes nach verschiedenen Aufschlusszeiten mittels Ultraschalls. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30 Sekunden abgekühlt. Für diesen Versuch wurde folgende Suspension verwendet: 1g rekombinante Zellen (JM105) 3 ml Kpi-Puffer 0,1 M Bei längerer Behandlung der Zellen mit Ultraschall nimmt die Aktivität der PheDH drastisch ab, wogegen die Aktivität des malic enzymes erhalten bleibt. Die idealen Aufschlussbedingungen für einen 25 %igen Aufschluß von 1 g rekombinantem E. coli JM105 sind daher 4 x 30 s Ultraschallbehandlung mit zwischenzeitlich 3 x 30s Abkühlung im Eisbad. Bei längeren Behandlungen mit Ultraschall wird die Probe erhitzt, was zu einer Denaturierung der Enzyme führen kann. Die Proteinmenge wurde bei diesem Versuch bestimmt und ist aus Tabelle 12 zu entnehmen. Ergebnisse 81 Tabelle 12: Proteinbestimmung beider exprimierten Enzymen, PheDH und malic enzyme, nach Variation der Aufschlusszeit. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30Sekunden abgekühlt. 60sec x 2 30sec x 4 Spez. Aktivität: U/mg 30sec x 8 Spez. Aktivität: U/mg Spez. Aktivität: U/mg PheDH 30 105 16 malic enzyme 20 90 110 Bei einer Reinigung des malic enzymes bis zur Homogenität konnte eine spezifische Aktivität von 466 U/mg erreicht werden. Die Reinigungsschritte sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Tabelle 13: Aufreinigung des rekombinanten malic enzymes Volumen(ml) Aktivität(U) Protein(mg) Spez.Aktivität(u/mg) Ausbeute(%) Faktor Ultrazentrifugation 0.6 820 13 63 100 1 Hydroxyapatit 9 470 5 94 57 1.49 Q-Sepharose 7 496 2.1 236 60 3.74 Phenylsepharose 1.9 280 0.6 466 34 7.39 5.4.3 Km-Wertbestimmung Für das Substrat und das Coenzym des malic enzymes wurden die KM-Werte bestimmt. Die KM-Werte wurden an homogenen oder partiell gereinigten rec-malic enzyme Proben bestimmt. L-Malat: 0,29 mM NAD+ 0,14 mM 5.4.4 Gekoppelte L-Phenylalanin Synthese unter Regeneration des Coenzyms NADH Wichtige Faktoren für eine gekoppelte Reaktion sind das pH-Optimum sowie die Temperaturstabilität der beiden Enzymen. Zusätzlich zu der Stabilität der Enzyme spielen weitere Faktoren wie z.B. der Einfluss der verschiedenen Substrate auf die Enzyme eine Rolle. Ergebnisse 82 In Bezug auf das pH-Optimum wurde eine Kinetik durchgeführt und die pH-Abhängigkeit der Synthese bestimmt. In Abbildung 39 ist die Zunahme der Aktivität bei steigendem pH-Wert zu entnehmen, wobei für die Synthese aus Gründen der Coenzymsstabilität ein pH-Wert von 8.0 ausgewählt wurde, in dem beide Enzyme zwar nicht die höchste Aktivität zeigen, aber bei dem das Coenzym stabil bleibt. pH-Optimum 100 90 Aktivität (%) 80 70 60 malic enz. PheDH 50 40 30 20 10 0 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 pH-Wert Abbildung 39: pH-Optimum von malic enzyme und der PheDH. Die Aktivität beider Enzyme nimmt bei Zunahme des pH-Wertes zu. Die Messungen wurden mit partiell gereinigtem Enzym durchgeführt. Für die Phenylalanin Dehydrogenase wurde die reduktive Aminierung gemessen. Ergebnisse 83 Ein zweiter Faktor für die gekoppelte Enzymreaktion ist die geeignete Temperatur (Abbildung 40), bei der beide Enzyme für längere Zeit stabil erhalten bleiben. Daher wurde ein weiterer Versuch zur Bestimmung des Temperaturoptimums durchgeführt. Temperatur-Optimum 100 90 80 70 Aktivitäten (%) 60 malic enz. 50 PheDH 40 30 20 10 0 20 25 30 35 40 45 50 Temperatur(°C) Abbildung 40: Temperaturoptimum. Die Messungen wurden bei pH 8,5 und in 0,1M HEPES-Puffer durchgeführt. Wie aus Abbildung 40 zu entnehmen ist, liegt das Temperaturoptimum beider Enzyme bei 50°C. Bei 30°C beträgt die gemessene Aktivität nur 60 % davon. Das malic enzyme ist für längere Zeit bei 45°C stabil. Da die PheDH aber bei diesem Temperaturwert instabil wird (Abbildung 23), wurden die Synthesen bei 30°C durchgeführt, damit die Stabilität beider Enzyme sowie des Coenzyms über längere Zeit gewährleistet werden konnte. Enzyme erreichen ihre optimale Aktivität im jeweils geeigneten Puffer. Beide Enzyme wurden mit zwei verschiedenen Puffern in je einem Reaktionsansatz getestet (Tabelle 14). Ergebnisse 84 Tabelle 14: Vergleich der PheDH- bzw. der malic enzyme-Aktivität in verschiedenen Reaktionspuffern. Die Aktivitäten sind in Prozent vom Optimalen zu sehen. 0,1M HEPES-Puffer (pH 8.0) 0,1M Tris-Puffer (pH 8.0) PheDH 84 % 100 % malic enz. 100 % 42 % Da die Aktivität der PheDH in HEPES-Puffer nicht erheblich abnimmt, wurde die gekoppelte Enzymreaktion in diesem Puffer durchgeführt. Mit der Bestimmung der Puffer-, pH- und Temperatur-Werte konnten geeignete Bedingungen und Medien für die Synthese von Phenylalanin durch eine gekoppelte Enzymreaktion mit Regeneration des Coenzyms ausgewählt werden. Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM Ammoniumsulfat, 100 mM HEPESPuffer, 70 mM L-Malat, 2 mM NAD+, 2 mM Mg 2+ , 25U PheDH (partiell gereinigt) und 30U malic enzyme. Die Proben werden mittels HPLC analysiert (Abbildung 41). L-Phenylalanin Abbildung 41: HPLC-Analytik zur Nachweis von in situ Regenerationsystems gebildeten L-Phenylalanin. Die Synthese wurde über mehrere Stunden verfolgt (Abbildung 42). Nach 4 h waren ca. 50 % des eingesetzten Substrates Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin umgesetzt. Ergebnisse 85 L-Phe (%) bezogen auf Konz. PhePyr 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Inkubationszeit (h) Abbildung 42: Bildungskinetik für L-Phe. Die Bildung von L-Phe wurde in situ durchgeführt. 5.5 Ganzzellumsetzung Ein wesentlicher Vorteil der Ganzzellumsetzung liegt darin, dass auf die Präparation, möglicherweise Reinigung der Enzyme sowie den Zusatz an freiem Coenzym verzichtet werden kann. Als neue Parameter, die bei ganzen Zellen berücksichtigt werden müssen, kommen jetzt allerdings Transportprozesse durch die Zellmembran hinzu. Ein weiterer zu beachtender Faktor im Vergleich zur Verwendung isolierter Enzyme betrifft die Metabolisierung von Substraten. Als Standard- Ansatz für die Ganzzellumsetzung wurde folgendes Medium verwendet: 0.1 M HEPES-Puffer (pH 8.0) 40 mM Phenylpyruvat 0.1 M L-Malat 0.1 M Ammoniumsulfat 2 mM MgCl2 Die Umsetzung erfolgte bei 30°C und mit 1g rekombinanten E.coli-Zellen. Das gebildete Phenylalanin wurde mittels HPLC nachgewiesen (Abbildung 43). Ergebnisse 90,0 86 OPA-IBC #86 mV 0,2 Sd Int_Chan_1 L-Phenylalanin 80,0 2 - L-Phe - 22,302 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 4 - 30,402 20,0 3 - 29,334 1 - 5,190 10,0 6 - 33,157 5 - 32,240 min -2,5 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 42,0 Abbildung 43: Produktnachweis nach einer 5 stündigen Umsetzung mit ganzen rekombinanten E. coli Zellen. Die Bildung von L-Phe durch rekombinante E.coli –Zellen wurde über 20 h verfolgt und die Ausbeute bestimmt (Abbildung 44). 100 90 L-Phe Bildung (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Inkubationsszeit (h) Abbildung 44: Ganzzellumsetzung zur Produktion von L-Phe. Die Bestimmung von L-Phe erfolgte mittels HPLC. Ergebnisse 87 Eine Metabolisierung des entstandenen Produktes L-Phe konnte nach 20h Inkubation nicht nachgewiesen werden. 5.6 Gezielte Mutagenese Im Rahmen der Dissertation sollten weiterhin PheDH- Mutanten erzeugt werden, die ein deutlich verändertes Substratspektrum als das der PheDH aufweisen. Als Ausgangsgen für eine Mutagenese zur Amin- bzw. Lactat- Dehydrogenase wurde das Phenylalanin Dehydrogenase - Gen aus den folgenden Gründen ausgewählt: ??Gen ist verfügbar ??gutes Expressionsystem verfügbar ??Enzym zeigt eine hohe Aktivität (>2000 U/ml, 250 U/mg) ??Raumstruktur bekannt ??breites Substratspektrum ??Ergebnisse übertragbar auf LeuDH, AlaDH, GluDH In Abbildung 45 ist der Reaktionsmechanismus der PheDH katalysierten reduktiven Aminierung von Phenylpyruvat dargestellt. PheDH COOH COOH NH2 O Phenylpyruvat NADH + NAD+ NH4+ H2 O L-Phenylalanin Abbildung 45: Reaktionsmechanismus der reduktiven Aminierung von Phenylalanin mittels PheDH. Für die Durchführung einer gezielten Mutagenese wurde die räumliche Struktur der PheDH mittels Computereinsatz modelliert und die Position des Substrates bestimmt (Abbildung 3). Ziel ist die Erweiterung des Substratspektrums durch den Austausch von Lysin 66 durch weitere Aminosäuren, die sowohl in Größe, Hydrophobizität als auch Ladung variieren. Durch eine gezielte Mutagenese von Lysin 66 gegen Isoleucin bzw. Arginin sowie Lysin 78 gegen Isoleucin wurde versucht, der Phenylalanin Dehydrogenase neue Aktivitäten auf weitere Substrate (Tabelle 15) zu verleihen. Die Lysinreste an Position 66 und 78 sind im Ergebnisse 88 aktiven Kanal der PheDH lokalisiert. Interessant ist dieses, da Lysin 66 die Bindungsstelle für die Carboxylgruppe und Lysin 78 für die Ketogruppe im Substrat sind (Vanhooke et al., 1999). Für die Umsetzung ähnlicher Substrate, welche aber eine Methylgruppe anstatt Carboxylgruppe besitzen, könnte der Austausch des basischen Lysins gegen eine neutrale Aminosäure wie z.B. Isoleucin zum Erfolg führen. Tabelle 15: Möglichkeiten zur Substratumsetzung nach einer Mutagenese. Durch den Austausch des Lysins in Isoleucin (neutrale Aminosäure) könnte die Methylgruppe des Ketons akzeptiert werden und somit das Keton zum Amin umsetzen. Es wird eine direkte Hydrierung der Ketosäure zur Hydroxysäure bei einer Mutagense des Lysin 66 in Arginin erwartet. Substrat Produkt Keton = Substrat Amin CH3 O CH3 NH2 Reduktive Aminierung des Phenylacetons Ketosäure = Substrat Hydroxysäure COOH O COOH OH Reduktion der Ketosäure Phenylpyruvat 5.6.1 Mutation des Lysin 66 Um eine veränderte Phenylalanin Dehydrogenase herstellen zu können, musste die Sequenz auf DNA-Ebene verändert werden. Die gezielte Mutagenese erfolgte nach dem Prinzip der überlappenden PCR (Ho et al., 1989). Hierbei wurden Primer verwendet, die zwei DNAFragmente mit überlappenden Enden erzeugten. In einer zweiten PCR hybridisierten diese Fragmente, wobei das überlappende 3’-Ende jedes Stranges als Primer für die Synthese des Gegenstranges diente (Abbildung 46). Die Mutationen, die in die Oligonucleotid-Primer eingeführt wurden, fanden sich zu 100 % im Produkt wieder. Das resultierende Fusionsprodukt wurde durch weitere PCR mit den „äußeren“ Primern, die den gesamten Bereich einschließen, amplifiziert. Ergebnisse 89 5' P1 P2 * 5' Templat-DNA K66 * P1' PCR mit den Primern P1+P1' 5' 5' P2' PCR mit den Primern P2+P2' 5' 1.Produkt * * 2.Produkt 5' PCR mit den Primern P1+P2' und Produkt 1+2 als Template Fusionsprodukt 5' * 5' Abbildung 46: Schema zur Mutagenese mittels PCR nach der Methode der „overlapping extension“, ausgetauscht wurde das Lysin 66 gegen Isoleucin. Mittels dieser Technologie wurde die Aminosäure Lysin 66 gegen Isoleucin ausgetauscht. Das erhaltene mutierte DNA-Fragment wurde „blunt ends“ in den pKK-223-3 an der SmaISchnittstelle kloniert (Abbildung 47). Die Auswahl dieses Plasmids und die Klonierung an der SmaI- Schnittstelle, die etwa 13 bp von der Ribosomenbindungsstelle entfernt ist, wurde zur Vermeidung von inclusion bodies gewählt, da bei Klonierungen der PheDH in anderen Plasmiden solche aufgetreten sind (5.1.5.3). Ergebnisse 90 SmaI K66 PheDH SmaI pUC18 SmaI 2.8 kb pKK-PheDH Stop PCR der Teilfragmente/überlappende PCR 5' K66I 1.Produkt * * K66I 2.Produkt SmaI Zweites PCR mit den äußeren Primern Mutation K66I * pKK223-3 SmaI 4.8kb Stop SmaI Bluntends Ligation und Transformation in E.coli Xl1-blue Isolierung des Plasmids Sequenzierung Restriktion mit EcoRI/BamHI Isolierung des Fragmentes und der Behandlung mit Klenow K66I 5' Mutation K66I * PheDH-K66I 3' Stop Ligation pKK-PheDH-K66I Stop Abbildung 47: Klonierungsstrategie zur Einführung der Mutation PheDHK66I. Im ersten Schritt wurden zwei Fragmente amplifiziert, die die gleiche Mutation tragen; beim zweiten Schritt hybridisierten sie zum ganzen Gen. Somit konnte das amplifizierte Gen in den Expressionsvektor ligiert werden. Ergebnisse 91 Auswahl der Primer Dass Codons, die für die gleiche Aminosäure codieren, in den einzelnen Spezies unterschiedlich häufig verwendet werden, liegt an der unterschiedlichen Basenzusammensetzung in den DNAs verschiedener Organismen (Sharp et al., 1988). Selbst innerhalb eines Organismus existieren zum Teil beträchtliche Unterschiede zwischen der Codonnutzung in Genen, die stark exprimiert werden, und solchen, die weniger häufig exprimiert werden. Diese Unterschiede können zur Genregulierung genutzt werden. Es gibt z.B. für selten genutzte Codons in der E. coli-Zelle auch nur geringere Mengen der passenden tRNA. Das hat zur Folge, dass mRNA von Genen mit vielen „seltenen“ Codons auch verzögert translatiert wird (Grantham et al., 1981). Dies ist bei mutierten Proteinen, die überexprimiert werden sollen, nicht erwünscht. Die ausgesuchten Codons wurden hinsichtlich dieses Kriteriums, wie oft dieses Codon in der Wt-PheDH genutzt wird, überprüft. Für den Austausch von Lysin in Isoleucin wurde das Codon ATT unter Berücksichtigung der Codon-Usage von E. coli verwendet. Mutagenese-Primer P1': GCT CAC TGC CAT AAT CAA CGT CAT CGC CCC P2 : GGG GCG ATG ACG TTG ATT ATG GCA GTG AGC Äußere Primer P1 : ATC AAG GGG TAC ATC ATG AGT ATC GAC AGC P2': TTA CTA GGC AGT CGC TGT CGT TGT CGA GGC Bei der Herstellung der beiden Teilfragmente der PheDH, die die gewünschten Mutationen tragen, bestand der Reaktionsansatz aus: 10 mM Tris pH 8.3 50 mM KCl 1.5 mM MgCl2 jeweils 200 µM dATP, dCTP, dTTP, dGTP 20-40 pmol jedes Oligonucleotid-Primers 2.5 U Taq-Polymerase pro 100 µl Ansatz Ergebnisse 92 10 ng Plasmid-DNA als PCR-Template (pKK-223-PheDH) Die PCR Amplifikation wurde auf einem automatischen DNA-Thermal-Cycler (Robocycler, Fa. Stratagene) nach folgendem Programm durchgeführt: ??3 min Denaturierung bei 94°C (zu Anfang des Programms) ??1 min Denaturierung bei 94°C ??1 min Annealing der Primer bei 65°C ??1 min Extension (Verlängerung der Primer durch die Taq-Polymerase) bei 72°C ??zyklisches Wiederholen der letzten drei Schritte (25 x) ??5 min Extension (nach Abschluss der Zyklen, um eine vollständige Verlängerung eventuell vorher abgebrochener DNA-Produkte zu gewährleisten) Nach der PCR wurden die erhaltenen Fragmente gelelektrophoretisch aufgetrennt und isoliert (Abbildung 48). Die zweite PCR zur Überlappung der Fragmente enthielt equimolare Mengen beider Fragmente, wobei von dem kürzeren ca. 60ng eingesetzt wurden (die Menge des größeren Fragmentes wurde dementsprechend berechnet). Die Annealing- Temperatur richtete sich nach der Schmelztemperatur der resultierenden Überlappungsregion. Somit konnte ein großes Fragment von 1,1 kb amplifiziert werden (Abbildung 49). Alle hergestellten Muteine wurden sequenziert und die Mutationen bestimmt. Die gezielte Mutagenese nach Ho et al. (Ho et al., 1989) führte in den meisten Fällen sowohl zu niedriger Ausbeute des gewünschten Produktes als auch zu unerwünschten Mutationen. Nach einer Optimierung des PCR-Ansatzes in Bezug auf das Verhältnis der zu fusionierenden Fragmenten sowie der dNTP- Konzentrationen konnten sowohl gute Ausbeuten als auch gewünschte Mutationen erreicht und unerwünschte Mutationen vermieden werden. Zur Einführung der Mutationen wurde nicht das ganze PheDH-Gen (1068 bp) amplifiziert, sondern nur ca. 891 bp bzw. 213 bp große Fragmente und dann hybridisiert und amplifiziert. Ergebnisse 93 1 2 3 4 3 kb 1 kb Abbildung 48: Agarosegelanalyse der PCR zur K66I- Mutagenese. Spur 1: kb-Leiter; Spur 2 unspezifische Amplifikation der Teilfragmente; Spur 3 und 4 sind gewünschte Amplifikate nach einer Optimierung der PCR- Bedingungen mit einer Größe von ca. 200 bp bzw. 900 bp. 3 kb 1 kb 1,1 kbFusionsprodukt Abbildung 49: Sauberes PCR-Produkt nach der Fusion der beiden Fragmente (Abbildung 48; Bahn 3+4) mit einer Größe von 1.1 kb. Die nach der zweiten PCR erhaltenen DNA-Fragmente, die die Mutation K66I enthalten sollten, wurden in den SmaI geschnittenen pUC18 bzw. pKK223-3 kloniert und vollständig sequenziert. Ergebnisse 94 Die rekombinanten Klone wurden mittels Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein und die richtige Orientierung des Inserts geprüft. Mit einem positiven Klon wurde anschließend der Expressionsstamm JM105 transformiert und das PheDH-Mutein exprimiert. 5.6.2 Sequenzierung der K66I Das neukonstruierte Mutein wurde sequenziert und den Austausch des Lysin 66 zu Isoleucin bestimmt. ATGAGTATCGACAGCGCACTGAACTGGGACGGGGAAATGACGGTCACCCGATTCGACCGGGAGAC TGGTGCCCATTTCGTCATTCGACTCGATTCGACCCAACTCGGACCGGCGGCCGGAGGCACCAGAGC CGCACAGTACTCACAGCTGGCGGACGCCCTCACCGACGCCGGCAAATTGGCGGGGGCGATGACGT TGATTATGGCAGTGAGCAACCTTCCGATGGGCGGGGGCAAATCCGTCATTGCGCTTCCTGCGCCGC GTCATTCGATCGATCCGAGCACGTGGGCACGCATCCTCCGAATCCACGCCGAGAACATCGACAAGT TGTCCGGCAACTACTGGACCGGACCGGACGTCAACACCAATTCGGCAGACATGGATACTCTGAACG ACACCACCGAGTTCGTGTTCGGACGGTCGCTCGAACGCGGCGGCGCGGGTTCGAGCGCGTTCACCA CCGCCGTTGGCGTGTTCGAGGCGATGAAGGCGACCGTCGCGCACCGTGGGCTGGGCTCACTCGACG GTTTGACGGTCCTGGTCCAAGGACTGGGGGCAGTCGGAGGATCATTGGCATCCCTGGCCGCCGAAG CGGGTGCGCAACTCCTGGTGGCAGACACCGACACCGAGCGAGTAGCGCACGCTGTTGCGTTGGGC CACACAGCGGTTGCCCTCGAGGACGTTCTGTCCACCCCGTGTGATGTCTTCGCACCCTGCGCAATG GGCGGCGTCATCACCACCGAGGTGGCGCGAACACTCGACTGTTCCGTCGTGGCCGGTGCCGCCAAC AACGTCATCGCCGACGAGGCCGCCTCGGACATCCTGCACGCACGCGGAATTCTGTACGCTCCCGAC TTCGTGGCCAACGCCGGCGGTGCCATCCACCTCGTAGGCCGGGAGGTTCTCGGTTGGTCCGAGTCG GTTGTCCACGAACGAGCAGTTGCCATAGGCGACACCCTGAATCAGGTCTTCGAGATCTCCGACAAC GACGGCGTCACCCCGGACGAGGCCGCCCGCACTCTCGCTGGACGGCGCGCCCGCGAGGCCTCGAC AACGACAGCGACTGCCTAGTAA Abbildung 50: Gensequenz des K66I- Muteins. 5.6.3 Expression der PheDH-Mutante K66I Da E. coli JM-105 sich als geeigneter Stamm für die Expression der PheDH erwiesen hat, wurde das neuhergestellte PheDH-Mutein „pKK-223-K66I“ in diesen Stamm transformiert und zur Expression eingesetzt. Die Anzucht erfolgte in 250 ml LB-amp, induziert wurde mit 1mM IPTG bei einer OD590 von 0,6. Der Aktivitätstest dieses Muteins erfolgte sowohl mit Phenylpyruvat (um die Restaktivität der PheDH zu überprüfen) als auch für die gewünschte Aktivität mit Phenylaceton als Substrat. Erwartungsgemäß besitzt das Mutein keine Aktivität mehr gegenüber Phenylpyruvat als Substrat. Da die Bindungsstelle Lysin66 im aktiven Zentrum der PheDH zur Carboxylgruppe Ergebnisse 95 des Phenylpyruvats (Abbildung 51a) durch eine Aminosäure mit neutraler Seitenkette „Isoleucin“ ausgetauscht (Abbildung 51b) wurde, verlor die PheDH die Aktivität auf reduktive Aminierung des Phenylpyruvats. Lys66 Ile66 Lys78 Lys78 Phenylpyruvat NAD+ (A) (B) Abbildung 51: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin 66 durch den Austausch in Isoleucin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin 66 und der Carboxylgruppe des Substrates in der PheDH; (B) Mutein K66I, Lysin wurde gegen Isoleucin ausgetauscht, das keine Wasserstoffbindung zur Carboxylgruppe des Substrates bildet. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. Die Aktivität des neukonstruierten Muteins wurde auf eine Aminierung des Phenylacetons überprüft. In Abbildung 52 ist der Mechanismus der reduktiven Aminierung dargestellt. PheDH-Mut CH3 NH2 O Phenylaceton CH3 NADH + NAD++ + NH4+ H2O L-Phenylpropylamin Abbildung 52: Reaktionsmechanismus der reduktiven Aminierung von Phenylaceton. Ergebnisse 96 Eine Aktivität bezüglich des Phenylacetons konnte nicht nachgewiesen werden. Durch diesen Austausch konnte zwar die Ladung der Bindungsstelle zum Substrat verändert werden, aber für die Akzeptanz eines neuen Substrates, könnten neben der Mutagenese von Lysin 66 noch weitere Aminosäurenaustausche notwendig sein. Da die räumliche Struktur ähnlicher Amin Dehydrogenasen wie die der gewünschten nicht bekannt sind, war es nicht möglich die weitere Optimierung durch gezielten Aminosäurenaustausch durchzuführen. Das Mutein K66I trägt die gewünschte Mutation (5.6.2), trotzdem konnte keine Aktivität bezüglich Phenylaceton festgestellt werden. Dies könnte konformationsbedingt sein, was zu der Überlegung führte, die Sequenz dieses Muteins ungezielt mittels Zufallsmutagenese (directed evolution) zu verändern. Daher wurde dieses Mutein als Template benutzt und für die weitere Optimierung eingesetzt. 5.6.4 Herstellung weiterer Muteine Aufgrund der Überlegung, basische Aminosäuren durch neutrale auszutauschen, um eine Aminosäure Dehydrogenase in eine Amin Dehydrogenase umzuwandeln (zu diesem Zeitpunkt war die Kristallstruktur noch unbekannt), wurden die Muteine R210I bzw. R140I hergestellt. Bei der Expression der Mutante R210I konnte kein aktives Protein nachgewiesen werden. Da Arginin bei dem benutzten pH-Wert eine positive Ladung aufweist und dadurch Interaktionen mit anderen Aminosäuren hervorruft, kann ein Abstoßungseffekt bei Austausch gegen eine neutrale Aminosäure (Isoleucin) auftreten. Es wurde eine verminderte PheDH-Aktivität (83 % der urprünglichen PheDH-Aktivität gegen Phenylpyruvat) bei dem exprimierten Protein der Mutante R140I beobachtet. Durch diesen Austausch konnte die Proteinfaltung verlangsamt und dadurch ein proteolytischer Abbau begünstigt werden. Vereinfacht: Das Mutein ist für Proteasen angreifbarer. Die gewünschte Amin Dehydrogenase Aktivität gegenüber Phenylaceton war nicht nachzuweisen. Das Mutein PheDH-R210I zeigt keine Aktivität, weder die ursprüngliche PheDH Aktivität noch eine neue Amin Dehydrogenase Aktivität. Obwohl Arginin 210 nicht im aktiven Zentrum beteiligt ist, führt eine Deletion bzw. Substitution zum Verlust der PheDH-Akitivität. Ergebnisse 97 5.6.5 Mutation von Lysin 66 zu Arginin und Lysin 78 zu Isoleucin Ein Austausch von Lysin 66 gegen Arginin könnte theoretisch eine direkte Reduktion der Ketogruppe von Phenylpyruvat verursachen und somit eine Ähnlichkeit zum Lactat Dehydrogenase-Mechanismus führen (Hart et al., 1987). Dieser Fall einer direkten Reduktion der Ketogruppe ist bei Lactat-Dehydrogenasen zu beobachten. Um einen ähnlichen Mechanismus wie bei der Lactat-Dehydrogenase und damit eine Reduktion der Ketogruppe des Phenylpyruvats durch die PheDH zu erreichen, wurden die Bindungsstellen zum Substrat beider Enzymen verglichen. In der Lactat Dehydrogenase ist Arginin für die Bindung der Carboxylgruppe verantwortlich (Luyten et al., 1989), wogegen in der PheDH wie bei allen Aminosäure-Dehydrogenasen Lysin diesen Part übernimmt. Ein weiterer Unterschied ist, dass eine direkte Reduktion der Ketogruppe im Phenylpyruvat nicht stattfinden kann, weil die Entfernung zwischen dem C4 des Nicotinamidrings und der Ketogruppe am C? des Phenylpyruvat größer als 6 Å ist. Diese Entfernung wird durch die Bindung von Lysin 78 sowie Lysin 66 an die Ketogruppe bzw. an die Carboxylgruppe des Substrates, das dann umorientiert und von NADH entfernt wird, verursacht. Der dadurch vergrößerte Abstand verhindert einen direkten Hydridtransfer. Infolgedessen entsteht im ersten Schritt ein Imin, das erst im nächsten Schritt reduziert werden kann (Vanhooke et al., 1999). Anders als bei der PheDH ist bei der Lactat-Dehydrogenase für die Bindung zur Ketogruppe des Substrates Histidin verantwortlich. Luyten et al. haben postuliert, dass durch den Autausch der Aminosäure Arginin 171 (Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Substrat) in der Lactat-Dehydrogenase gegen eine neutrale Aminosäure, die Reduktion des Substrates vermieden werden kann. Dieser Austausch Arginin 171 gegen Tyrosin bzw. Tryptophan führte nicht zur Verlust der LDH –Aktivität. Überraschenderweise war die Aktivität in diesen zwei Muteinen höher als in einem Mutein mit dem Austausch der basischen Aminosäure Arginin gegen das basische Lysin (Luyten et al., 1989). Es besteht eine Ähnlichkeit in der PheDH zur LDH in Bezug auf die Bindung zur Carboxylgruppe bzw. Ketogruppe des Substrates. Sowohl in der LDH als auch in der PheDH sind die beteiligten Aminosäuren basisch. Da nach Luyten et al. der Austausch der basischen Aminosäure (Bindungsstelle für die Carboxylgruppe im Substrat) keinen Einfluss auf die Orientierung brachte, wurde in dieser Arbeit ebenso die Bindung zur Ketogruppe untersucht. Durch die Mutation des Lysin 78 gegen Isoleucin könnte obiger Abstand verringert und die Umorientierung des Substrates verhindert werden, so das eine Hydrierung der Ketogruppe stattfinden könnte. Ergebnisse 98 5.6.6 PCR der K66R- Mutanten und deren Klonierung Zur Klonierung der PheDH Mutante K66R wurde das gesamte Ursprungsplasmid (pKK-2233-PheDH-Gen; Abbildung 53) mittels PCR amplifiziert (Deng & Nickoloff, 1992). K66 PheDH pKK-PheDH Stop PCR des gesamten Plasmids mit Mutageneseprimern K66R PheDH-Gen Stop * * Verdau der methylierten nicht-mutagenisierten parentalen DNA mit DpnI und Transformation der nicked-dsDNA in kompetente E.coliXl1-blue K66 pKK-PheDH-K66R Stop Abbildung 53: Klonierungsstrategie der PheDH-Mutanten am Beispiel der PheDH-K66R. Das ganze rekombinante Plasmid wird mittels Mutagenese-Primer amplifiziert und in E.coli-Zellen transformiert. Ergebnisse 99 Beide Primer beinhalten die gewünschte Mutation. P1: GCT CAC TGC CAT TCT CAA CGT CAT CGC CCC P2: GGG GCG ATG ACG TTG AGA ATG GCA GTG AGC Im Anschluß an die PCR wird die parentale Template-DNA mit dem Restriktionsenzym DpnI abgebaut. DpnI erkennt ausschließlich methylierte DNA. Die verbliebene mutierte DNA wird in kompetente E. coli Xl1 Blue bzw. JM105 transformiert, wobei eventuelle Einzelstrangbrüche vom bakteriellen Reparatursystem behoben werden. Der Anteil mutierter Plasmide ist ? 80 % (Stratagene). Positive Klone wurden sequenziert und ein fehlerfreies mutiertes Plasmid zur Expression eingesetzt. 5.6.7 Aktivitätsnachweis des PheDH-Muteins K66R und K78I Die Muteine PheDH-K66R und K78I wurden in 200 ml Maßstab kultiviert und die Expression erfolgte ausschließlich in E. coli JM105. Während die Expression der rec-PheDH (pKK223-3-PheDH) in E. coli JM105 zu einem Anteil von ca. 13 % PheDH des löslichen Gesamtproteins führte, beträgt der Anteil der PheDH-K66R nur 10 % und der K78I etwa 4 % des löslichen Zellproteins. Das natürliche Substrat der wt-PheDH ist Phenylpyruvat, das mit Zusatz von Ammoniumionen durch eine reduktive Aminierung zum Phenylalanin umgesetzt wird. Bei der Aktivitätsbestimmung des Muteins PheDH-K66R bzw. K78I wurde neben der reduktiven Aminierung auch ein Parallelversuch ohne Ammoniumzusatz durchgeführt, um zu prüfen, ob eine direkte Reduktion stattfinden kann, was auf einen Reaktionsmechanismus analog der Lactat Dehydrogenase hinweisen würde. COOH O NADH PheDH-K66R COOH OH Abbildung 54: Reaktionsmechanismus zur Umsetzung der Ketosäure Phenylpyruvat zur Hydroxysäure Phenyllactat. Eine Veränderung der PheDH durch den Austausch des Lysin 66 in Arginin führte nicht zur drastischen Abnahme der PheDH-Aktivität. Bei diesem Mutein K66R waren etwa 90 % der PheDH Aktivität noch nachweisbar. Die gewünschte Erweiterung des Substratspektrum durch Ergebnisse 100 gezielte Mutagenese, konnte nicht erreicht werden. Das basische Lysin wurde zwar durch die Mutagenese durch die basische Aminosäure Arginin ausgetauscht, dies hat aber nicht zu einem geänderten Reaktionsablauf (Reduktion statt reduktiver Aminierung) geführt. Durch den Austausch der basischen Aminosäure Lysin gegen eine neutrale Aminosäure im Mutein K78I, ist die ursprüngliche PheDH- Aktivität verloren gegangen. Die gewünschte Aktivität mit einem direkten Hydridtransfer konnte ebenso durch diesen Austausch nicht erreicht werden. Tabelle 16: Zusammenfassung der hergestellten Mutanten und deren neue Eigenschaften . (O) getestet aber keine Aktivität, ( -) nicht getestet. Die Restaktivität bezieht sich auf der rec-PheDH. Mutante Reduktive Aminierung Reduktion Reduktion Phenylpyruvat Phenylpyruvat Phenylaceton K 78 I O O - K 66 R 90 % Restaktivität O O K 66 I O - O R 210 I O - O R 140 I 83 % Restaktivität O O Ergebnisse 101 5.7 Zufallsmutagenese In dieser Arbeit wurde bereit die gezielte Mutation der K66I, K66R und K78I beschrieben. Diese Austausche führten zu keiner Erweiterung des Substratspektrums bzw. detektierbaren Expression eines aktiven Enzyms. Da die gezielte Mutagenese nicht zu den gewünschten Aktivitäten geführt hat, wurde eine Zufallsmutagenese durchgeführt. Als Template wurden sowohl die rekombinante PheDH als auch in einer zweiten Versuchsreihe die Muteine K66I und K66R als DNA-Template eingesetzt. Die error-prone PCR-Methode für die Zufallsmutagenese wurde für die Erzeugung der Mutanten verwendet. Dafür wurde das folgende PCR-Protokoll verwendet: 10 µl 10x Mutagenese Puffer inkl. MgCl2 10 µl 10x Mutagenese-dNTP-mix 0-10 µl 5 mM MnCl2 (0-0.5 mM Endkonz.) 2 fmol Template-DNA (ca. 7.5 ng eines 5.7 kb Plasmid) je 40 pmol upstream and downstream primer 1µl Taq- Polymerase ad 100µl Millipor- A-dest Mit Mineralöl überschichten Mutagenese Puffer: 70 mM MgCl2 500 mM KCl 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 bei 25°C 0,1 %(W/V) Gelatine Mutagenese dNTP-mix (10x): 2 mM dGTP 2 mM dATP 10 mM dTTP 10 mM dCTP Mit der Optimierung des PCR-Protokolls und dem Einsatz bestimmter Konzentrationen an dNTPs bzw. MnCl2 konnten 2-4 Mutationen eingeführt werden. Falsche Konzentrationen an MgCl2 führten bei der PheDH-Amplifikation aufgrund des GC-Gehaltes zu unkontrollierter Zahl an Mutationen. Ergebnisse 102 Es wurden etwa 12.000 Kolonien aus der Zufallsmutagenese sowohl gegen Phenylaceton als auch Phenylpyruvat getestet. Die Aktivität gegen Phenylpyruvat wurde sowohl bezüglich reduktiver Aminierung (mit (NH4)2SO4) als auch bezüglich einfacher Reduktion ohne (NH4)2SO4 überprüft. Aufgrund der hohen Zahl an erzeugten Muteinen wurde ein schneller Farbtest zum Screening der Klone entwickelt. 5.8 Entwicklung eines Farbtestes als Screeningsmethode Bei der Zufallsmutagenese produziert man eine große Zahl an Enzymvarianten, die einzeln auf Aktivität getestet werden müssen. Eine einfache Methode ist eine Überprüfung der Enzymaktivität direkt in den Zellen. Dafür wurde ein Farbtest entwickelt. Er beruht auf der Aufnahme und Umsetzung von Farbstoffen durch ganze lebende Mikroorganismen. Das Ausstreichen bzw. Sprühen von Farbstofflösungen auf Agarplatten mit Bakterienkolonien führt zur Aufnahme dieses Farbstoffes, der dann umgesetzt wird. Durch den Farbumschlag, der durch die folgende Umsetzung verursacht wird, können positive Zellen erkannt werden. NAD+ bzw. NADP+ -abhängige Enzyme sind durch diese Methode nachweisbar. Eine Mischung aus INT und PES (siehe unten) wird auf eine Agarplatte, die die zu untersuchenden Bakterien enthält, gegeben. Das Substrat befindet sich im Agar. Für die Induktion ist IPTG erforderlich. Nach Zugabe der Farbstofflösung wurde die Agarplatte mit Öl beschichtet (um die Re-Oxidation des gebildeten reduzierten Tetrazoliums zu vermeiden) und für 4 Stunden bei 30°C inkubiert. Der Farbstoff wird dadurch aufgenommen und umgesetzt. Der Farbumschlag ist ein Nachweis für die Aktivität des Enzyms. Substrat (L-Phenylalanin) 20 mM INT (oder TNBT) 25 mg PES 2 mg/ 100ml Puffer TEA pH 7.0 50 mM Ergebnisse 103 Produkt NADH PES Formazan PheDH Edukt NAD + PESH2 INT (Tetrazolium) Abbildung 55: Reaktionsschema zum Verlauf des Farbtests. Abbildung 56: Farbtest auf Agarplatten mit ganzen Zellen. Die gelben Zellen enthalten PheDH-Aktivität Zum Auffinden der gewünschten Mutanten wurde Phenylalanin als Donor zur Reduktion des Coenzyms NAD+ eingesetzt. Da die in dieser Arbeit hergestellten Mutanten unter anderem auf Amin-Dehydrogenase Aktivität überprüft werden sollten, konnte diese Methode nicht eingesetzt werden, da das einzusetzende Substrat Phenylpropylamin nicht kommerziell erhältlich und die Synthese dieses Substrates nicht etabliert ist. Die Screeningsmethode wurde für den Nachweis der K66R-Muteine mit Phenyllactat und LPhenylalanin als Substrate verwendet. Ergebnisse 104 5.8.1 K66R –Muteine Etwa 20.000 durch die Zufallsmutagenese hergestellten Kolonien wurden untersucht und ca.75% der Kolonien zeigten Expression einer aktiven PheDH. Die neuen Muteine behielten haben die PheDH-Aktivität und zwei Muteine davon zeigten zusätzlich die gewünschte Aktivität auf Reduktion von Phenylpyruvat. Die neuen positiven Muteine wurden auf die Reduktion des Phenylpyruvats ohne Ammoniumionen überprüft, wodurch eine Hydroxysäure als Produkt entsteht. Einige positiv gescreenten Muteine sind in Abbildung 57 dargestellt. Phenylpyruvat 120% Phenylpyruvat+NH4 100% 80% Aktivität (%) 60% 40% 20% Mutein11 Mutein9 Phenylpyruvat Mutein10 Positive Klone Mutein8 Mutein7 Phenylpyruvat+NH4 Mutein6 Mutein5 Mutein4 Mutein3 Mutein2 Mutein1 PheDH 0% Abbildung 57: Bestimmung der Aktivität der K66R-Muteine. Gezeigt werden einige Muteine mit den restlichen Aktivitäten im Vergleich zur Wt-PheDH. Bei zwei Muteinen (Mutein 2 und 8) konnte der natürliche Reaktionsmechanismus verändert und somit neue Eigenschaften erzielt werden. Das Mutein K66R-8 (hier Mutein 8) zeigt eine Aktivität von 12 U/ml auf Reduktion des Phenylpyruvat zur Phenyllactat. Die Bestimmung der Aktivität erfolgte photometrisch durch Detektion der Abnahme der Absorption des NADH bei 340 nm. Das rekombinante Plasmid wurde sequenziert und die Mutationen bestimmt. Zusätzlich zur Mutation an Position 66 (Austausch Lysin gegen Arginin), das bei der gezielten Mutagenese eingeführt worden ist, wurden zwei neue Mutationen T208A und E225D gefunden (Abbildung 58). Ergebnisse Wt_PheDH PheDH_K66R Wt_PheDH PheDH_K66R Wt_PheDH PheDH_K66R Wt_PheDH PheDH_K66R Wt_PheDH PheDH_K66R Wt_PheDH PheDH_K66R 105 10 20 30 40 50 60 | | | | | | MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL ************************************************************ 70 80 90 100 110 120 | | | | | | AGAMTLKMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV AGAMTLRMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV ******:***************************************************** 130 140 150 160 170 180 | | | | | | NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL ************************************************************ 190 200 210 220 230 240 | | | | | | VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDTERVAHAVALGHTAVALEDVLSTPCDVFAPCA VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDAERVAHAVALGHTAVALDDVLSTPCDVFAPCA ****************************:****************:************** 250 260 270 280 290 300 | | | | | | MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE ************************************************************ 310 320 330 340 350 | | | | | VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREASTTTATA VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREAS-TTATA ************************************************** ***** Abbildung 58: Aminosäurensequenz des Muteins K66R-8 im Vergleich zur PheDH-AS-Sequenz. 3 Mutationen K66R, T208A, E225D sind in diesem Mutein für die neue Aktivität verantwortlich. Basierend auf den Daten der dreidimensionalen Struktur der PheDH wurden die neuen Mutationen mittels 3D-Programm (Swiss PDB Viewer) modelliert. Abbildung 59 verdeutlicht die Lage der ausgetauschten Aminosäuren in der PheDH. Ergebnisse 106 Asp 225 Thr 206 Asp 205 Arg 66 Asp 207 Ala 208 NAD+ Phenylpyruvat Abbildung 59: Dreidimensionale Struktur des K66R-8-Muteins. Gezeigt sind die durch die Mutagenese ausgetauschten Aminosäuren. Die Mutationen K66R, T208A und E225D sind hervorgehoben. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. Die Aminosäure Asparaginsäure, wurde durch Glutaminsäure mittels Zufallsmutagenese an Position 225 substituiert und zeigt keine Wechselwirkung mit dem Coenzym bzw. mit den am Coenzym bindenden Aminosäuren (Asp 205). Aus Abbildung 59 ist eine Wechselwirkung zwischen Ala 208 zum Asp 205 bzw. zum Asp 207 ersichtlich. An einer direkten Wechselwirkung zum Coenzym ist diese zweite Mutation T208A nicht beteiligt, dennoch geht sie eine Wasserstoffbindung mit Asparaginsäure 205 ein. Asp 205 zeigt eine Wasserstoffbindung zum Coenzym (Abbildung 59). Die Modellierung der 3D-Struktur der Wt-PheDH zeigt eine Wasserstoffbindung zwischen Lysin 66 zur Carboxylgruppe des Substrates (Phenylpyruvat) (Abbildung 60a). Nach dem Austausch von Lysin 66 gegen Arginin konnte keine Wechselwirkung mehr festgestellt werden (Abbildung 60b). Ergebnisse 107 Lys66 Arg66 NADH Lys78 Lys78 Lys78 A B Abbildung 60: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin 66 durch den Austausch in Arginin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin 66 und der Carboxylgruppe des Substrates, (B) Arginin wird anders orientiert und geht keine Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe des Substrates ein. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. 5.8.2 Biochemische Charakterisierung des K66R-8-Muteins Das neuhergestellten Mutein, das die drei o.g. Mutationen trägt, zeigt eine neue Aktivität von 13 U/ml gegen Phenylpyruvat, das zu Phenyllactat reduziert wird. COOH O Mutein K66R COOH + NADH OH + NAD+ Abbildung 61: Reaktionsschema des K66R-8-Muteins. Das breite Substratspektrum der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 wurde bereits von Hummel et. al. (Hummel et al., 1987) eingehend untersucht. Die Mutagenese des PheDH-Gens führte zur Erweiterung des Substratspektrums und zu einer Eigenschaftsveränderung hinsichtlich der Reduktion von Phenylpyruvat zu Phenyllactat. Von einigen Substraten (Tabelle 17) wurde hier der Km-Wert bestimmt. Hierfür wurden partiell gereinigte Mutein-Extrakte eingesetzt. Ergebnisse 108 Tabelle 17: Km-Werte des Muteins K66R-8. Untersucht wurde Phenylpyruvat sowohl bei einer reduktiven Aminierung als auch bei einer Reduktion ohne Ammoniumionen. Substrat Km (mM) Km (mM) (WT-PheDH) (K66R) Phenylpyruvat (reduktive Aminierung) 0.13 0.17 Phenylalanin 0.87 0.7 (oxidative Desaminierung) Phenylpyruvat (Reduktion zum Phenyllactat) 18 Es wurde ebenso überprüft, ob die neuen Mutationen in der PheDH Einfluss auf die Temperatur- bzw. pH-Optima haben. Daher wurde der Aktivitätstest bei verschiedenen pHWerten von 5-10 (Abbildung 62) und Temperaturen zwischen 20 und 50°C (Abbildung 63) durchgeführt. Dabei wurde ein Tris/HCl Puffer (100 mM) im Bereich von pH-Wert 7-10 mit NaOH bzw. HCl eingestellt. Für niedrige pH-Werte wurde der Puffer Glycyl-Glycin (100 mM) benutzt, da er eine größere Pufferkapazität besitzt. 100 WT-PheDH K66R-Mutante Aktivität (%) 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 pH-Wert Abbildung 62: pH-Optimum des Muteins K66R-8 im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Der Aktivitätstest (Reduktion des Phenlpyruvats ohne Ammoniumionen) wurde bei verschiedenen pH-Werten zwischen pH 5 und pH 10 gemessen. Ergebnisse 109 100 WT-PheDH K66R-Mutante Aktivität (%) 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Temperatur (°C) Abbildung 63: Temperaturoptimum des K66R-8-Muteins im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Die Ansätze enthielten Tris/HCl Puffer (100 mM pH 8.0 + Phenylpyruvat und NADH) wurden auf den jeweiligen Meßtemperaturen (25-50°C) in der Küvette temperiert und gemessen. 5.8.3 Synthese von Phenyllactat mit dem Mutein K66R-8 Mit den eingeführten 3 Mutationen wurde der Reaktionsmechanismus geändert, das Substratspektrum der PheDH erweitert und somit ein ähnlicher Mechanismus wie der der Lactat-Dehydrogenase, also eine Reduktion des Eduktes ohne Zusatz von Ammoniumionen erreicht. Für den Nachweis des gebildeten Produktes wurde eine Synthese mit gekoppelter Enzymreaktion unter Regeneration des Coenzyms mit Formiat-Dehydrogenase durchgeführt. Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM HEPES-Puffer, 100 mM Formiat, 2 mM NAD+, 2 mM Mg 2+, 20U K66R-8 und 30U Formiat Dehydrogenase. Das durch das Mutein K66R-8, das die 3 Mutationen K66R, T208A und E225D trägt, gebildete Produkt Phenyllactat wurde mittels GC-Analyse nachgewiesen. Die ersten Ansätze zur Synthese wurden nach 2 h und nach 13 h gestoppt. Bei der GCAnalyse fiel auf, dass kein enantiomerenreines Phenyllactat hergestellt wurde. Nach 2h wurde ein ee-Wert von 82 % zu Gunsten von L-Phenyllactat gemessen (Abbildung 64a). Nach 13h Synthese wurde vollständige Racemisierung festgestellt (Abbildung 64b). Ergebnisse 110 L-Phenyllactat Abbildung 64a: GC-Chromatogramm des Syntheseansatzes der K66R-8 nach zweistündiger Inkubation. Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM HEPES-Puffer, 100 mM Formiat, 2 mM NAD+, 2 mM MgCl2, 20 U K66R-8 und 30 U Formiat Dehydrogenase. D-Phenyllactat L-Phenyllactat Abbildung 64b: GC-Chromatogramm des Syntheseansatzes der K66R-8 nach 13 h Inkubation. Für die Bestimmung des Zeitpunktes der Racemisierung wurde ein weiterer Test mit zwischenzeitlicher Entnahme und GC-Analyse einer Probe aus der Umsetzung durchgeführt. In den ersten 4 Stunden der Umsetzung wurde L-Phenyllactat im Überschuß gebildet. Nach etwa 8 Stunden konnte die Bildung eines Racemats an D- bzw. L-Lactat beobachtet werden (Abbildung 65). Ergebnisse 111 100 ee (%) 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 Zeit (h) Abbildung 65: Einfluss der Mutationen K66R, T208A und E225D, auf die Enantioselektivität Reduktion von Phenylpyruvat (30 mM) in Abhängigkeit von der Zeit. der Die Ergebnisse deuteten auf eine Racemase. Um dies nachzuweisen wurde als Substrat 30mM L-Phenyllactat mit Rohextrakten aus sowohl E. coli JM105 als auch Mutein K6R-8 eingesetzt und die Reaktion über 20 h verfolgt. Dabei konnte keine Racemisierung des L-Phenyllactat zum D-Phenyllactat beobachtet werden. Aufgrund der Ergebnisse bei der Umsetzung mit dem neuen Mutein K66R-8 und der schlechten Enantioselektivität wurden die 3 Mutationen genauer untersucht und eine gezielte Rückmutagenese durchgeführt. Dabei wurden die 3 Mutationen rückgängig gemacht und deren Einfluss auf Enantioselektivität und das Substratspektrums untersucht. In Tabelle 18 werden die verschiedenen Muteine verglichen und deren Einfluss auf die Aktivität erläutert. Tabelle 18: Vergleich der Reaktionsmechanismen verschiedener Muteine. Die 3 Mutationen wurden einzeln rückgängig mutiert. Die drei Mutationen sind als Kombination für die neue Eigenschaft der PheDH verantwortlich. Die Substitution der einzelnen Mutationen in die ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der LDH-Aktivität. Mutein PheDH-Aktivität (U/mg) Phenyllactat-DHAktivität R66K, T208A, E225D 70 - K66R, A208T, E225D 63 - K66R, T206A, D225E 82 - Ergebnisse 112 Aus Tabelle 18 ist zu entnehmen, dass die drei Mutationen im Mutein K66R-8 als Kombination für die neue Aktivität der PheDH verantwortlich sind. Die Substitution der einzelnen Mutationen zu den ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der LDH-Aktivität. 5.8.4 Austausch K66I Neben der Mutante K66R ist eine weitere durch gezielte Mutagenese erzeugt worden, bei der das Lysin 66 gegen Isoleucin (K66I) ausgetauscht worden ist. Auch dieses Mutein ist als Template für eine Reihe ungerichteter Mutationen verwendet worden. Mit diesem Template wurde eine Muteinbank von ca. 32000 Varianten konstruiert. Eine weitere Muteinbank wurde mit der wt-PheDH-DNA konstruiert und überprüft. Alle konstruierten Muteine wurden auf neue Aktivität gegen Phenylaceton mittels Schnelltest in Titerplatten überprüft. Die neu konstruierten Muteine aus der K66I-Enzymvariantenbank zeigten keine neue Aktivität gegenüber Phenylaceton. Zusätzliche Mutationen zur K66I konnten die Akzeptanz des Phenylacetons als Substrat nicht positiv beeinflussen. Da das Hauptinteresse an der Umsetzung von Ketonen zu Aminen bestand, wurde die neukonstruierte Enzymbank nicht auf neue Eigenschaften gegen weitere Substrate überprüft. Es ist aber von Interesse, diese Enzymbank zum weiteren Screening zu verwenden und nach Muteinen für neue Umsetzungen zu suchen. Etwa 60 % der Muteine aus der zweiten Enzymvariantenbank, die mit der wt-PheDH als Template hergestellt wurden, zeigten PheDH-Aktivität. Die Einführung der Mutationen in das PheDH-Gen hat keinen Einfluss auf die Enantioselektivität. Bei der Umsetzung von Phenylpyruvat (Abbildung 66) war der ee-Wert von dem der PheDH nicht zu unterscheiden und lag bei >99 %. Ergebnisse 113 L-Phe Abbildung 66: Produktnachweis nach einer 9 stündigen Umsetzung mit dem Mutein K66I. Zur Regenerierung des Coenzyms NADH wurden 40 U Formiat Dehydrogenase eingesetzt. Die reduktive Aminierung erfolgte mit (NH4)2SO4 und 30 mM Phenylpyruvat als Substrat. (L-Phe = 23 min; der Peak bei 29 min ist nicht identifiziert). In allen untersuchten Muteinen waren keine neuen Aktivitäten bezüglich der Umsetzung von Phenylaceton nachweisbar. Diese neukonstruierte Enzymbank wird in weiteren Arbeiten auf neue Eigenschaften und neue Umsetzungen von gewünschten Substraten Verwendung finden. Diskussion 114 6 Diskussion Klonierung und Expression der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 Das Gen der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987) ist wie die meisten Gene in Organismen der Actinomyces- Familie (Corynebacteria, Mycobacteria, und Nocardia) (Watts et al., 2001) hoch GC-reich (Anteil: 65 %) . Das führte zur Bildung von Sekundärstrukturen (Choi et al., 1999), was die Amplifizierung des PheDHGens mittels PCR erschwert. Durch Zugabe von DMSO (3%) und die Variation der Annealingstemperatur konnten Amplifikate gewonnen und kloniert werden. Die Klonierung führte anfänglich zur Bildung von „inclusion bodies“ (Hibino et al., 1994). Der Versuch zur Vermeidung dieses Problems mittels Klonierungen in verschiedenen Vektoren, pTRC99a, pET16b, pET11a, führte nicht zur Expression eines aktiven Proteins. Das exprimierte Protein wurde mittels SDS-Gel-Elektrophorese als „inclusion bodies“ analysiert. Nach Literaturangaben könnten unlöslichen Proteine durch physikalische bzw. biochemische Methoden (Temperatur, Induktion, Schüttelgeschwindigkeit) (Shin et al., 1997; Xu et al., 1994; Yang et al., 1997; Zhang et al., 1995) entfaltet werden, was aber bei der exprimierten PheDH nicht zu positiven Ergebnissen führte. Unlösliche Proteine werden durch eine zu schnelle Expression gebildet (Camacho et al., 2002), die den Proteinen nicht genügend Zeit und Raum zur Faltung lässt. Optimale Expression eines Enzyms erreicht man normalerweise, wenn das Startcodon des dazugehörigen Gens mit einem Abstand zwischen 7 und 9 bp von der Ribosomenbindungsstelle kloniert wird (Esipov et al., 1999; Vellanoweth & Rabinowitz, 1992). Da die Klonierung nach dieser Strategie zu inclusion bodies geführt hat, wurde die PheDH an der SmaI- Schnittstelle im Expressionsvektor pKK223-3 mit einer „nicht optimalen“ Entfernung von 14 bp des Startcodons zur Ribosomenbindungsstelle kloniert. Aufgrund dieses Abstandes konnte eine schwächere Translation erreicht werden, was zu einer langsameren und schwächeren Expression führte. Dem gebildeten Enzym bleibt dann genug Zeit und Raum zur Faltung und man erhält zwar weniger, dafür aber aktives Enzym. Zusätzlich dazu besitzt das verwendete Plasmid pKK223-3 einen schwächeren Promotor als beispielsweise die oben verwendeten pET-Systeme, was zu einer weiteren Abschwächung der Expression führt. Durch die Auswahl eines geeigneten Expressionsstammes E. coli JM105 konnte die Aktivität mit dem gleichen Plasmidkonstrukt auf das 3-fache im Vergleich zum E.coli -HB101 erhöht werden. Diskussion 115 Die Charakterisierung zeigt eine stabile rekombinante PheDH, die nach 36 h bei 30°C noch etwa 95 % Restaktivität besitzt. Eine Denaturierung erfolgt erst bei höhere Temperaturen von 50°C. Nach 36 h konnten bei 37°C noch 90 % Restaktivität der rec-PheDH gemessen werden. Im Vergleich dazu zeigte die Wildtyp-PheDH nach 36 h bei 30°C nur noch etwa 50 % Restaktivität. Da die Sequenz der Wt-PheDH und die der rec-PheDH gleich sind, kann eine falsche Faltung des Proteins ausgeschlossen werden. Die schlechte Stabilität der PheDH im Wildtyp beruht wahrscheinlich auf vorhandenen Proteasen, die das Enzym nach Aufschluss der Zellen abbauen(De Mot et al., 1998). Durch die Expression der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 in E. coli -JM105 und somit der Vermeidung von PheDH-spezifischen Proteasen, konnte die Stabilität des Enzyms erhöht werden. Die optimale Temperatur für eine Enzymreaktion liegt sowohl für die rec-PheDH als auch für WT-PheDH bei 50 °C, die Enzymtests und Synthesereaktionen wurden jedoch aus Stabilitätsgründen bei 30 °C durchgeführt. In einer ersten Arbeit, in der das Vorkommen der PheDH Rhodococcus sp. M4 beschrieben wurde, ist eine partielle Reinigung für dieses Enzym bereits veröffentlicht worden (Hummel et al., 1987). Die Reinigung der recPheDH aus E. coli- Rohextrakten erfolgte in Anlehnung an dieses Protokoll. Für die Reinigung bis zur Homogenität konnte allerdings ein zusätzlicher Reinigungsschritt zu den Literaturangaben durch eine Hitzedenaturierung der Begleitproteine in Gegenwart von 5 % (w/v) L-Phenylalanin eingefügt werden. Die Entfernung des L-Phenylalanins wurde mittels Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Optimierung und Fermentation der PheDH Neben der Auswahl eines geeigneten Vektor-Wirt-Systems wurden weitere Optimierungen, wie Induktionsparameter, variiert, um eine effiziente Proteinexpression zu erzielen. Einerseits wurde die Induktorkonzentration zwischen 0 und 3 mM IPTG (? -D-Isopropylthiogalaktosid) bei einem konstanten Induktionszeitpunkt (OD600= 0.6) variiert. Die Untersuchung führte zu dem Ergebnis, dass mit einer IPTG-Konzentration von 0.7 mM eine optimale Expression zu erzielen war. In der Kontrollexpression ohne IPTG-Induktion konnte nur geringe PheDHAktivität (35 U/ml) im Rohextrakt nachgewiesen werden. Folglich unterdrückte der lac IRepressor die Expression des PheDH-Gens im nicht induzierten Zustand fast vollständig (van den Bogaard et al., 2000). Dies ist von Vorteil, da die Expression des Fremdproteins eine Belastung des Zellstoffwechsels bedeutet und zu einer erheblich geringeren Zellausbeute Diskussion 116 führt. Eine hohe Konzentration an IPTG kann das Wachstum der Zellen hemmen (Rhee et al., 1997). Andererseits wurde der Zeitpunkt der Induktion nach Inokulation variiert, wobei alle Kulturen mit 1 mM IPTG induziert worden sind. Die Zellen wurden 24 h nach Inokulation geerntet und die spezifischen Aktivitäten in den zellfreien Rohextrakten bestimmt. Es zeigt sich, dass der Zeitpunkt der Induktion einen großen Einfluss auf das Wachstum der Zellen hat. Der Einfluss des Induktionszeitpunkts auf die Systemproduktivität wurde mittels zweier Experimente abgeschätzt, die die Zunahme der Volumenaktivität an PheDH nach Induktion am Anfang bzw. in der Mitte der Fütterungsphase bestimmten. Die Ergebnisse, die in Abbildung 21 dargestellt sind, wiesen daraufhin, dass, ähnlich zu Versuchen in Schüttelkultur, eine signifikante Abhängigkeit der recPheDH- Expression vom Induktionszeitpunkt besteht. Eine zu frühe Induktion kann die Zellen unter Stressfaktoren setzen, was zu einer Störung des Expressionsapparats führen kann (Donovan et al., 2000). Eine Induktion in der stationären Phase, in der die Wachstums- und Sterberate gleich sind, kann nicht zu einer produktiven Expression führen. Nach Riesenberg (Riesenberg, 1991) und Fieschko (Fieschko, 1989) erfolgt die Bildung von wachstumsinhibierender Nebenprodukte wie Acetat in komplexen Medien bei Wachstumsraten oberhalb von 0,2 h-1 (Riesenberg et al., 1991) und in definierten Medien bei Wachstumsrate oberhalb von 0,35 h-1. Mit abnehmender spezifischer Wachstumsrate steigt die Expression des rekombinanten Proteins (Fieschko, 1989). Da in dieser Arbeit die Kultivierung in komplexen Medien erfolgte, war für die Kultivierung des Expressionsstammes JM105 eine spezifische Wachstumsrate von 0,2 h-1 angebracht. Die Form der Nährstoffzuführung war ein kritischer Parameter bei der HZD-Fermentation; dadurch kann sowohl die Zelldichte als auch Zellproduktivität beeinflusst werden (Lee, 1996). Möglich waren konstante als auch kontinuierliche Fütterungsraten. Konstante Fütterungsraten wurden für das Expressionssystem E. coli JM105 nicht in Erwägung gezogen, da dies nach Lee et al. zur Verminderung der Wachstumsrate führt (Lee, 1996) und damit zur Verminderung von Produktbildung des Expressionssystems führt (Riesenberg, 1991). Die Wachstumsrate, Acetatbildung und End-Zelldichte wurden sowohl bei konstanter als auch linearer Zufütterungsrate untersucht. Nach Paalme et al. kann eine konstante Wachstumsrate durch eine exponentiell gesteigerte Zuführung der C-Quelle erreicht werden (Paalme et al., 1997). Eine lineare Erhöhung der Nährstoffzuführung ist mit geringeren Schwankungen der Wachstumsrate verbunden (Yee & Blanch, 1992). Diskussion 117 Die Untersuchungen in dieser Arbeit zeigten, dass Acetat bei linearer Zuführung der C-Quelle ständig gebildet wurde und im Gegensatz hierzu kein Acetat bei exponentieller Zuführung nachweisbar war. Daher wurden weitere Experimente mit exponentieller Zuführung durchgeführt. In der HZD-Fermentation wird zwar eine hohe Biomasse erzielt, dies wurde aber durch eine geringe spezifische Aktivität erkauft. Durch die Zugabe von Vitaminen, Spurenelementen und optimiertem Medium mit Nährstoffen können die Zellen schnell wachsen und eine hohe optische Dichte erreichen. Somit werden die Zellen aber unter Stress gesetzt, so dass die Expression nicht ideal verläuft, was sich auf die spezifische Aktivität niederschlägt. Bei einer ersten Fermentation der PheDH im Batch war die spezifische Aktivität geringer als bei der Anzucht im Kolben. Der Grund für die schwächere Aktivität lag möglicherweise im späten Erntezeitpunkt, da die Lyse der Zellen zur Desaktivierung der Enzyme führen kann. Erwartet war eine bessere Aktivität als im Kolben aufgrund der besseren Sauerstoffversorgung sowie der pH-Regulierung. Coexpression der PheDH und des malic enzymes Das in dieser Arbeit klonierte NAD abhängige E. coli malic enzyme zeigt Ähnlichkeit im Molekulargewicht (50 kDa) zum malic enzyme aus Bacillus stearothermophilus (Kobayashi et al., 1989), aber einen Unterschied zum NADP-abhängigen malic enzyme aus E.coli (62kDa) (Nakamura et al., 1986). Da der C-Terminus des NAD-abhängigen malic enzymes aus E. coli zum Zeitpunkt der Klonierung nicht zugänglich war, wurde mit Hilfe des 5’Forward Primers ein Einzelstrang ampilifiziert. Mit der Gewinnung des Einzelstranges konnte eine zweite PCR durchgeführt und ein doppelsträngiges Fragment amplifiziert werden. Mit dieser vollkommen neuen Methode war das gesamte Gen amplifizierbar. Die Klonierung von Genen ist somit wesentlich schneller und vereinfacht. Schwierigkeiten bei dieser Methode haben sich in GC-reichen Sequenzen ergeben. Ein Vergleichsversuch mit der PheDH ist anfänglich gescheitert, dennoch konnte durch Zusatz von DMSO im PCR-Ansatz eine vollständige Amplifikation GC-reicher Sequenzen erreicht werden. Hier sollte beachtet werden, dass Einzelstränge nicht stabil sind und daher der Umgang mit Einzelsträngen schonend durchgeführt werden muß. Für die Klonierung des malic enzymes 3’ zur PheDH an der PstI- und HindIII-Schnittstelle war eine eigene Ribosomenbindungsstelle notwendig, da am C-Terminus der PheDH ein Stopcodon angehängt war. Somit konnte eine Expression beider Enzyme gleichzeitig Diskussion 118 erfolgen. Interessant wäre, aus den zwei Enzymen (PheDH / malic enzyme) ein Fusionsprotein herzustellen. Dies kann durch die Deletion des Stopcodons am C-Terminus der PheDH sowie der Ribosomenbindungsstelle vor dem malic enzyme erreicht werden. Eine katalysierte Reaktion der PheDH kann theoretisch erfolgen, da das aktive Zentrum nicht am C-Terminus der PheDH liegt (Vanhooke et al., 1999). Somit kann sowohl die Umsetzung des Substrates als auch die Regeneration des Coenzyms im gleichen fusionierten Protein erfolgen. Da keine Kristallstruktur vom malic enzyme aus E. coli K12 vorliegt und noch nicht bekannt ist, wo das aktive Zentrum sich befindet, wäre eine erfolgreiche Umsetzung durch ein Fusionsprotein nur hypothetisch. Fraglich ist dabei auch, mit welcher Struktur die beiden Enzyme als Fusionsprotein exprimiert werden. Die Aktivität beider rekombinanten Enzyme im E. coli- Stamm JM 105 ist höher als im HB101 und liegt bei 300 U/ml für malic enzyme und 400 U/ml für die PheDH. Die Aktivität des malic enzymes in diesem Konstrukt mit einer exprimierten PheDH ist eindeutig niedriger als ein homolog exprimiertes malic enzyme allein. Es liegt daran, dass der Haushalt an Aminosäuren während der Translation auf mehrere Enzymen verteilt ist, sodass in dem Fall weniger Enzymmenge hergestellt wird als wenn die Aminosäuren einem exprimierten Enzym allein zur Verfügung ständen. Ganzzell-Umsetzung Als neue Parameter, die bei ganzen Zellen berücksichtigt werden müssen, kommen jetzt allerdings Transportprozesse durch die Zellmembran hinzu (Andersen et al., 2001; Sanden et al., 2002). Ein Versuch zur Immobilisierung der Zellen mit CTAB, um sie durchlässig zu machen, führte nicht zu Steigerung des Umsatzes. Das liegt daran, dass eine Aufnahme des Substrates Phenylpyruvat ohne Immobilisierung der Zellwand möglich war. Die Überlegung, dass die Substrate Phenylpyruvat und Phenylalanin als C-Quelle metabolisiert werden könnten, hat sich nicht bestätigt. Es konnten zwar nach der Umsetzung nur 90% des erwarteten Produktes L-Phenylalanin festgestellt werden, das ist aber nicht unbedingt auf Metabolisierung zurückzuführen ist. Ursache könnten die Reaktionsbedingungen sein, da die Reaktion im Batch Ansatz durchgeführt wurde und das Produkt nicht der Reaktion entzogen worden ist. Eine weitere Überlegung war, dass L-Malat über eine E. coli eigene Malat-Dehydrogenase metabolisiert wird. Aus diesem Grund wurde L-Malat im Überschuss zugegeben und somit dieses Problem vermieden. Im Vergleich zur Umsetzung mit isolierten Enzymen war es allerdings wahrscheinlich, dass Pyruvat, das durch die Umsetzung von L-Malat für die NADH Diskussion 119 Regenerierung entsteht, als leicht verwertbare C-Verbindung in den Primärstoffwechsel einfließt und nicht mehr als störendes Nebenprodukt, wie bei der Verwendung isolierter Enzyme vorliegt. Bei E. coli und anderen Bakterien wird Pyruvat durch PhosphoenolpyruvatSynthetase direkt phosphoryliert und fließt somit in den Stoffwechsel der Zellen ein (Geerse et al., 1989). PEP-Synthetase Pyruvat + ATP + H2O Phosphoenolpyruvat + AMP + Pi Der Vorteil der Formiat Dehydrogenase, die sich bis dato für die Regenerierung des Coenzyms NADH in situ durchgesetzt hat, liegt darin, dass bei der Regeneration durch Formiat nur CO2 und keine weiteren Nebenprodukte entstehen (Schütte et al., 1976). Da aber in dieser Arbeit nachgewiesen wurde, dass das malic enzyme ein durchaus erfolgreiches System darstellt und im Ganzellsystem keine Nebenprodukte das gewünschte Produkt verunreinigen, könnten solche in dieser Arbeit entwickelten Konstrukte technisch und wirtschaftlich interessanter sein. Dazu kommt der wirtschaftliche Faktor, da L-Malat im Vergleich zum Na-Formiat vergleichbar kostengünstig ist. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Ganzzellumsetzung liegt darin, dass auf die Präparation, möglicherweise Reinigung der Enzyme sowie den Zusatz an freiem Coenzym verzichtet werden kann. Für eine gekoppelte Reaktion zweier Enzyme wurden bestimmte Parameter für die Stabilität der beiden Enzymen untersucht, um optimale Verhältnisse zu schaffen. Wichtige Faktoren sind das pH-Optimum sowie die Temperaturstabilität der beiden Enzyme. Zusätzlich zu der Stabilität der Enzyme spielen weitere Faktoren, wie z.B. der Einfluss der verschiedenen Substrate auf die Enzyme eine Rolle (Brunhuber et al., 2000; Solovjeva & Kochetov, 1999). Die PheDH könnte durch Malat inhibiert werden bzw. malic enzyme durch das Phenylpyruvat. In Bezug auf diese Coexpression der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 und des malic enzymes aus E. coli konnte keine Inhibierung festgestellt werden. Vor der Übertragung dieser Technik auf weitere Enzyme sollte aber eine Untersuchung bezüglich der Inhibierung durchgeführt werden. Es wurde für einen wirtschaftlichen Einsatz der Ganzzell-Umsetzung untersucht, ob das malic enzyme durch D- Malat inhibiert wird. Eine Inhibierung war nicht festzustellen, daher ist es von wirtschaftlicher Bedeutung, das kostengünstigere racemische D,L- Malat für die Regenerierung des Coenzyms einzusetzen. Diskussion 120 Bei einer in situ Regenerierung führte der Zusatz an BSA zu einer Steigerung der Aktivität. Ebenso beeinflusste der Aufschluß-Puffer die Aktivitäten. Hierbei war zu beobachten, dass der geeignete Aufschluß- Puffer für die einzelnen Enzyme unterschiedlich war. Der KpiPuffer war für die PheDH besser geeignet als für das malic enzyme, da aber die Aktivitätsabnahme des malic enzyme im Kpi-Puffer nicht drastisch war, wurden die rekombinanten Zellen nach der heterologen Expression weiterhin im Kpi-Puffer aufgeschlossen. Dieses Konstrukt mit dem malic enzyme als Regenerationssystem eröffnet neue Möglichkeiten für Coexpressionen mit weiteren Dehydrogenasen und damit Ganzzell-Umsetzungen von verschiedenen Substraten. Entwicklung einer Screeningsmethode Um das Screening der durch die Zufallsmutagenese hergestellten Enzymvarianten- Bibliothek ermöglichen zu können, sind geeignete und effektive Selektionsmechanismen notwendig. Mit geeigneten Methoden können die gewünschten Eigenschaften detektiert werden. Zahlreiche erfolgreiche Screeningsmethoden wurden bereits entwickelt. Beispielsweise wurden pHIndikatoren auf Agarplatten eingesetzt, so dass beim Abbau des Substrates eine Abnahme des pH-Wertes stattfand und sich die Farbe des Indikators dadurch ändert (Zhou et al., 1996). Da aber bei vielen Umsetzungen (unter anderem bei reduktiver Aminierung) die Änderung des pH-Wertes nicht detektierbar wäre und man auf die Isolierung des Enzyms für photometrische Tests angewiesen ist, wurde in dieser Arbeit eine effektivere Screeningsmethode für den direkten Nachweis der positiven Klone entwickelt. Die neue Methode beruht auf dem Farbumschlag von Tetrazolium. Die Reduktion von Tetrazolium führt zur Veränderung seines Absorptionsspektrums, was eine schnelle Detektierung positiver Kolonien ermöglicht. Für die Evaluierung dieser Methode, wurde Phenylalanin als Donor zur Reduktion des Coenzyms NAD+ eingesetzt. Anfänglich haben sich alle Klone durch den Luftsauerstoff gefärbt. Die Vermeidung dieses Problems erfolgte durch die Überschichtung der Zellen mit Öl bzw. mit Agar. Dass die neue Methode nicht direkt für das Screening nach Muteinen, die Amin Dehydrogenase Aktivität zeigen, eingesetzt wurde, liegt am Mangel des einzusetzenden Substrates Phenylpropylamin. Phenylpropylamin ist nicht kommerziell erhältlich und seine Synthese noch nicht etabliert. Diese neue Screeningsmethode ist zum Screening von Dehydrogenasen soweit optimiert und somit eine schnelle und effektive Methode. Diskussion 121 Mutagenese Die Klonierung der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 war die Voraussetzung für die gezieltebzw. Zufallsmutagenese, um neue Enzymvarianten für die Herstellung von Aminen und Hydroxysäuren zu konstruieren. Zum Zeitpunkt der Planung der Mutagenese war die 3D-Struktur der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 noch nicht aufgeklärt. Die PheDH sollte in dieser Arbeit zu diesem Zweck kristallisiert werden, aber gleichzeitig während der Vorbereitung zur Kristallisation der PheDH wurden auch einige Mutationen durchgeführt. Die Postulierung, dass die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe des Substrates eine basische sein sollte, beruhte auf Literaturangaben zum Mechanismus (Clarke et al., 1986; Pasquo et al., 1998). Nach Literaturangaben kommen Arginin oder Lysin in Lactat Dehydrogenasen bzw. Aminosäuren Dehydrogenasen (Baker et al., 1995; Baker et al., 1997) im aktiven Zentrum vor. Um die Akzeptanz einer Methylgruppe anstelle der Carboxylgruppe im Substrat zu ermöglichen, sollte daher eine basische Aminosäure in eine neutrale Aminosäure umgewandelt werden (Nicholls et al., 1994). Da aber in der PheDH etwa zwanzig Arginine und fünf Lysine vorkommen, ist eine gezielte Mutagenese zur Erweiterung des Substratspektrums in diesem Falle nicht praktikabel und eine Zufallsmutagenese deutlich effektiver. Doch aus wissenschaftlichen Gründen wurden einige Versuche zur Substitution von Arginin in weitere neutrale Aminosäuren wie beispielsweise Isoleucin durchgeführt, um den Einfluss der Substitution von Arginin gegen neutrale Aminosäure zu untersuchen. Zwei Muteine R210I und R140I wurden konstruiert und auf Aktivität untersucht. Es wurde eine verminderte Expression und etwa 83 % Restaktivität der PheDH bei der Mutante R140I beobachtet. Durch diesen Austausch konnte die Proteinfaltung verlangsamt und dadurch ein proteolytischer Abbau begünstigt werden (Jiang et al., 2001). Vereinfacht: Das Mutein ist für Proteasen angreifbarer. Die gewünschte Amin Dehydrogenase Aktivität gegenüber Phenylaceton war nicht nachzuweisen. Keine Expression konnte bei der Mutante R210I festgestellt werden. Ein Grund dafür könnte die Ladung des Arginins sein. Da Arginin bei dem benutzten pH-Wert eine positive Ladung aufweist und dadurch Interaktionen mit anderen Aminosäuren hervorruft, kann ein Abstoßungseffekt bei Austausch gegen eine neutrale Aminosäure (Isoleucin) auftreten. Das Mutein PheDH-R210I hat durch diesen Austausch die ursprüngliche Aktivität der PheDH verloren, zeigt aber keine neue Amin Dehydrogenase- Aktivität. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Strukturaufklärung der PheDH durch Vanhooke (Vanhooke et al., 1999) durchgeführt und die am aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren bestimmt. Diskussion 122 Anhand der 3D-Struktur-Daten konnte das Enzym mittels Computereinsatz modelliert und die Mutationen simuliert werden. Dass es bei der PheDH nicht zu einem direkten Hydridtransfer auf die Ketogruppe kommen kann, liegt an der Entfernung zwischen dem C4 des Nicotinamidrings und C? des Phenylpyruvat, die mehr als 6 Å beträgt. Dieser Abstand kommt dadurch zustande, dass die Ketogruppe des Substrates eine Bindung zum Lysin 78 eingeht und somit das Substrat vom NADH weggezogen wird (Vanhooke et al., 1999). Eine weitere Bindung zum Substrat wird durch Lysin 66 verursacht. Durch die Simulierung der Substitution dieser Aminosäuren mittels Computereinsatzes konnte festgestellt werden, dass durch den Austausch von Lysin 66 gegen Isoleucin bzw. gegen Arginin keine Wechselwirkung mehr zur Carboxylgruppe des Substrates stattfinden kann. Um die Akzeptanz von Ketonen, die dem Phenylpyruvat strukturähnlich sind, und deren Umsetzung zu Aminen zu ermöglichen, wurde Lysin 66 gegen die neutrale Aminosäure Isoleucin substituiert. Weitere Muteine, die sich im Mechanismus von der PheDH unterscheiden und einen direkten Hydridtransfer verursachen, wurden durch den Austausch von Lysin 66 zu Arginin und Lysin 78 gegen Isoleucin konstruiert. Die Durchführung der einzelnen Substitutionen erfolgte nach dem Prinzip der überlappenden PCR „overlap extension“ (Ho et al., 1989). Dafür wurde das in dieser Arbeit klonierte PheDH- Gen als Template verwendet. Die Ausbeute der Hybride mittels dieser Technologie war anfänglich sehr gering. Es ist aus dem Literatur (Ho et al., 1989) zu entnehmen, dass man equimolare Mengen beider Fragmente einzusetzen hat, was aber in allen Fällen zu niedriger Ausbeute geführt hat. Das liegt daran, dass dadurch vier Fusionen entstehen können, wobei nur eine gewünscht ist. Daher erfolgte die Optimierung dieser Methode durch die Amplifikation der zur Hybridisierung gewünschten Einzelstränge aus den jeweiligen beiden Fragmenten, die dann in einer weiteren PCR eingesetzt wurden. Somit konnte die Ausbeute auf das 3 fache gesteigert werden. Im Gegensatz zur Expression der rec-PheDH betrug der Anteil des Muteins K66R nur 10 % und der K78I etwa 4 % des löslichen Zellproteins, wobei bei der rec-PheDH etwa 13 % des löslichen Gesamtproteins nachzuweisen waren. Ein Grund dafür könnte eine schlechte, durch die Mutagenese verursachte, Proteinfaltung sein. Eine Veränderung der PheDH durch den Austausch des Lysin 66 gegen Arginin führte nicht zur drastischen Abnahme der PheDH-Aktivität. Bei diesem Mutein K66R waren etwa 90 % der PheDH Aktivität noch nachweisbar. Die gewünschte Aktivität, ein direkter Hydridtransfer konnte durch diesen Austausch nicht erreicht werden. Das Lysin wurde zwar durch die Mutagenese gegen Arginin ausgetauscht, hat aber nicht zum gewünschten Mechanismus Diskussion 123 geführt. Das deutet darauf hin, dass noch weitere Aminosäuren an dem gewünschten Mechanismus beteiligt sind und ebenso substituiert werden müssen. Durch den Austausch der basischen Aminosäure Lysin gegen eine neutrale Aminosäure im Mutein K78I, ist die ursprüngliche PheDH- Aktivität verloren gegangen, da Isoleucin keine Wechselwirkung mit der Ketogruppe des Phenylpyruvats mehr eingeht und somit die reduktive Aminierung nicht mehr stattfinden kann. Ähnliche Mutation wurde durch Sekimoto et al. (Sekimoto et al., 1994) bei der Leucin Dehydrogenase aus Bacillus stearothermophilus durchgeführt, wo Lysin 68 im aktiven Zentrum der LeuDH gegen Alanin bzw. Arginin ausgetauscht wurde. Dadurch verlor die LeuDH ihre Aktivität aufgrund fehlender Bindung zum Coenzym. Trotz der erzielten Vermeidung der Wechselwirkung zwischen der Ketogruppe des Substrates und der Aminosäure und des dadurch bei der PheDH vorhandenen Abstands zwischen dem C4 des Nicotinamidrings und C? des Phenylpyruvats, konnte der gewünschte Reaktionsmechanismus und der direkte Hydridtransfer nicht erzielt werden. In diesem Fall spielen nicht nur die Ladung und die Größe der Aminosäuren für neue Umsetzungen eine Rolle, sondern auch die räumliche Struktur der PheDH, die wahrscheinlich durch Substitution einzelner Aminosäuren für eine Erweiterung des Substratspektrums nicht stark genug beeinflusst werden konnte. Da die räumliche Struktur ähnlicher Amin Dehydrogenasen, wie die gewünschte nicht bekannt ist, war es nicht möglich, eine Optimierung durch einen gezielten Aminosäurenaustausch durchzuführen. Die Muteine K66R und K66I wurden als Templates in der Zufallsmutagenese verwendet, wobei das K66R für die Herstellung von neuen Varianten mit Phenyllactat DehydrogenaseEigenschaften (Hydridtransfer), und das K66I zur Hersllung von Amin DehydrogenaseVarianten vorgesehen waren. Da die vorhandenen Austausche theoretisch wirksam sein könnten, und an unbekannten Positionen weitere Aminosäurenaustausche für eine Konformationsänderung notwendig sein könnten, war es durch Zufallsmutagenese möglich, weitere Mutationen an neuen Positionen einzuführen und gleichzeitig die Veränderung an Position 66 zu erhalten. Die durch die „error prone“ Methode neukonstruierten Muteine - ca. 32000 Varianten aus der K66I-Template - zeigten keine neue Aktivität gegen Phenylaceton. Zusätzliche Mutationen zur K66I konnten die Akzeptanz des Phenylacetons als Substrat nicht positiv beeinflussen. Da das Hauptinteresse an der Umsetzung von Ketonen zu Aminen bestand, wurde die neukonstruierte Enzymbank nicht besonders umfassend auf andere neue Eigenschaften gegen weitere Substrate überprüft. Es ist aber von Interesse, in zukünftigen Arbeiten diese Diskussion 124 Enzymbank für weitere Screenings zu verwenden und nach Muteinen für neue Umsetzungen zu suchen. Die Kombination aus zwei verschiedenen Methoden, sowohl der gezielten als auch der ungezielten Mutagenese, zeigte sich aber als Erfolgskonzept beim K66R- Template, und führte zu der gewünschten Aktivität. Das neu hergestellte Mutein trägt zwei Mutationen T208A, E225D zusätzlich zum K66R und setzt Phenylpyruvat zum Phenyllactat um. Aufgrund der Ergebnisse bei der Umsetzung mit diesem neuen Mutein (K66R-8) und der schlechten Enantioselektivität wurden die drei Mutationen genauer untersucht und mittels gezielter Mutagenese einzeln zurück mutiert zu den ursprünglichen Codons der PheDH, um festzustellen, welche der o.g. drei Mutationen für die Enantioselektivität bzw. für die Erweiterung des Substratspektrums verantwortlich ist. Die Substitution der einzelnen Mutationen gegen die ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der neuen LDHAktivität. Aufgrund dessen, sind die drei Mutationen in diesem Mutein (K66R-8) zusammen als Kombination für die neue Aktivität der PheDH verantwortlich. Obwohl die zwei neuen Mutationen T208A und E225D nicht am aktiven Zentrum beteiligt sind, kam es zu Veränderung des PheDH- Mechanismus. Die Aminosäure Alanin wurde gegen Threonin an Position 208 ausgetauscht, so daß eine Wechselwirkung mit der benachbarten Asparaginsäure 205 möglich ist, die wiederum eine starke Wechselwirkung zum Coenzym besitzt. Die Substitution dieser Aminosäure zum ursprünglichen Threonin führte zum Verlust der neuen Eigenschaft, wobei Threonin keine Wechselwirkung zum Asp 205 eingeht. Eine Suche in den Datenbanken Genbank, Swissprot und Blast-NCBI ergab eine hohe Homologie des K66R-8-Muteins mit der Lactat Dehydrogenase (LDH) aus Bifidobacterium longum (Iwata et al., 1994). Wie aus dem Sequenzvergleich hervorgeht, zeigen das Mutein K66R-8 und die LDH aus Bifidobacterium longum eine hohe Homologie in den Sequenzen für die Bildung von charakteristischen Sekundärstrukturen (Abbildung 67). Zwei der drei ein- geführten Mutationen, nämlich R 66 und A 208, findet man in der LDH aus Bifidobacterium longum wieder. An der Stelle der Asparaginsäure 225 in der K66R-8-Mutante kommt in der LDH allerdings ein Alanin vor. Diskussion Wt_PheDH K66R-8 LDH_Bifid 125 10 20 30 40 50 60 | | | | | | MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL ----------------------------PTKLAVIGAGAVGS-TLAFAAAQRGIAREIVL . : :*..* *: : :: .:: * Wt_PheDH 70 80 90 100 110 120 | | | | | | AGAMTLKMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV K66R-8 AGAMTLRMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV LDH_Bifid EDIAKERVEAEVLDMQHGSSFYPTVSIDGSDDPEICR------DADMVVIT----AGPRQ . . :: .. * * *.*. . : * **. :: :: :** Wt_PheDH K66R-8 LDH_Bifid 130 140 150 160 170 180 | | | | | | NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL KPGQSRLELVGATVNILKAIMPNLVKVAPNAIYMLITNPVDIATHVAQK-LTGLPENQIF :...: :: :. *.::: . : ....*: : : : **:: * .* :: Wt_PheDH 190 200 210 220 230 240 | | | | | | VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDTERVAHAVALGHTAVALEDVLSTPCDVFAPCA K66R-8 VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDAERVAHAVALGHTAVALDDVLSTPCDVFAPCA LDH_Bifid GSGTNLDSARLRFLIAQQ-TGVNVKNVHAYIAGEHGDSEVPLWESATIGGVPMSDWTPLP .* . .. * * *: : : * :..: ... . : ..* . ::* . Wt_PheDH K66R-8 LDH_Bifid Wt_PheDH K66R-8 LDH_Bifid 250 260 270 280 290 300 | | | | | | MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE GHDPLDADKREEIHQEVKN-AAYKIINGKGATNYAIGMSGVDIIEAVLHDTNRILPVSSM . : :: . :. .* ** ::* .:.*:: . . : : * : . * *. 310 320 330 340 350 | | | | | VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREASTTTATA--VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREAS-TTATA--LKDFHG--ISDICMSVPTLLNR--QGVNNTINTPVSDKELAALKRSAETLKETAAQFGF : .: : : .::: **: : :* ** . . * :*: *: **: Abbildung 67: Alignment der Aminosäurensequenzen der Wt-PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Brunhuber et al., 1994) mit der LDH aus Bifidobacterium longum (Iwata et al., 1994) und der Mutante K66R-8. Rot: Identische Aminosäuren; grün: ähnliche Aminosäuren; Durch Fettdruck hervorgehoben: Mutationen; blaue Pfeile: wichtige Reste zur Bildung der Rossmann fold. Nach Rosssmann et al. besteht die nukleotidbindende Domäne selbst aus zwei gleichartigen Abschnitten, die sich im Verlauf der Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahr entwickelt Diskussion 126 haben. Die einzelnen Dehydrogenasen (LDH: Lactatdehydrogenase, GAPDH: Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase, ADH: Alkoholdehydrogenase) unterscheiden sich durch ihre Substratspezifität. Die wiederum beruht auf der Verknüpfung der nukleotidbindenden Domänen mit zusätzlichen Abschnitten am C- oder N-terminalen Ende (Eventoff et al., 1976; Ruzheinikov et al., 2001). Alanin 208 ist nicht direkt an der „Rossmann fold“ beteiligt, liegt aber angrenzend dazu und geht eine Wechselwirkung mit Asparaginsäure 205 ein, die wiederum an der Rossmann fold beteiligt ist. Dass die rückgängige Substitution der Mutation Asparaginsäure 225 zum Verlust der neuen Aktivität geführt hat, war nicht zu erklären, da die Position 225 nicht an einer Wechselwirkung zum Coenzym bzw. zu benachbarten Aminosäuren oder auch zum Substrat beteiligt ist. Unerwarteterweise zeigen die HPLC-Chromatogramme des durch die Dreifach-Mutante gebildeten Phenyllactats, das die Reduktion nicht stereoselektiv erfolgt. L-Phenyllactat wird zwar deutlich bevorzugt, aber nicht ausschließlich gebildet. Zusätzlich verändert sich der eeWert noch im Verlauf der weiteren Umsetzung bis hin zum Racemat. Die HPLCChromatogramme zeigen, dass diese nachträglich Veränderung des Enantiomerenverhältnisses wahrscheinlich durch einen sekundären Abbau des L-Phenyllactats durch eine E. coli-eigene Lactat-Dehydrogenase bedingt ist. Auffallend ist aber die schwache Stereoselektivität des neuen Muteins. Diese konnte nicht durch Variation der Mutationen verändert werden, da durch die Rücksubstitutionen gezeigt wurde, dass alle drei Mutationen eine Rolle für die neue Eigenschaft spielen und die Deletion bzw. Substitution zum Verlust der Aktivität führte. Eine Erklärung für die schwächere Stereoselektivität wäre, dass Arginin 66, das gegen Lysin ausgetauscht wurde und im Gegensatz zum Lysin keine Wechselwirkung zur Carboxylgruppe im Substrat hat, dafür verantwortlich sein könnte. Durch die Bindung von Lysin 66 zur Carboxylgruppe im Substrat konnte ursprünglich das Substrat fixiert werden und in der richtigen Orientierung in der Reaktion umgesetzt werden. Da aber im neuen Mutein die Carboxylgruppe nicht mehr an Arginin bindet, könnte eine Reduktion nicht enantioselektiv erfolgen. Zusammenfassung 127 7 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden zwei NAD-abhängige Enzyme, Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) aus Rhodococcus sp M4 und das malic enzyme aus E. coli K12 im gleichen Expressionsvektor kloniert und deren Coexpression durchgeführt. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war die Mutagenese der Phenylalanin Dehydrogenase, die sowohl mittels Protein Design als auch durch Zufallsmutagenese (“directed evolution”) durchgeführt wurde. Die Mutagenese diente zur Erweiterung des Substratspektrums der PheDH und um Einblicke in deren Reaktionsmechanismus sowie Aufschluss über die Struktur – Funktionsbeziehungen dieses Enzyms zu gewinnen. Die Coexpression der PheDH und des malic enzymes diente der Ganzzellbiotransformation zur reduktiven Aminierung von aromatischen Ketosäuren. Somit können Ketosäuren umgesetzt und eine gleichzeitige Regenerierung des Coenzyms NADH mittels malic enzyme durchgeführt werden. Durch die Entwicklung einer neuen Klonierungsstrategie konnte das malic enzyme erfolgreich amplifiziert, 3’zur PheDH an der PstI- und HindIII- Schnittstelle kloniert und eine Coexpression beider Enzyme ermöglicht werden. Mithilfe des bekannten N-Terminus des malic enzymes konnten Einzelstränge amplifiziert und in weiteren PCR-Ansätze komplementär verlängert werden. Die PheDH und das malic enzyme wurden biochemisch umfassend charakterisiert und das neue Plasmid-Konstrukt in E. coli JM105 für eine Ganzzellbiotransformation zur reduktiven Aminierung von aromatischen Ketosäuren erfolgreich eingesetzt. Neben der Auswahl eines geeigneten Vektor-Wirt-Systems wurden weitere Optimierungen, beispielsweise Induktionsparameter, variiert, um eine effiziente Proteinexpression zu erzielen. Eine HochzelldichteFermentation führte zwar zu hoher Biomasse, dies wurde aber durch geringere spezifische Aktivitäten erkauft. Der Vorteil der Formiat Dehydrogenase, die sich bis dato für die Regenerierung des Coenzyms NADH in situ durchgesetzt hat, liegt darin, dass bei der Regeneration durch Formiat nur CO2 und keine weiteren Nebenprodukte entstehen. Da aber in dieser Arbeit nachgewiesen wurde, dass das malic enzyme ein durchaus erfolgreiches System darstellt und im Ganzellsystem keine Nebenprodukte das gewünschte Produkt verunreinigen, könnten solche in dieser Arbeit entwickelten Konstrukte technisch und wirtschaftlich interessanter sein. Das L- Malat ist im Vergleich zum Na-Formiat vergleichbar kostengünstig. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Ganzzellumsetzung liegt darin, dass auf die Präparation, möglicherweise Reinigung der Enzyme sowie den Zusatz an freiem Coenzym verzichtet werden kann. Zusammenfassung 128 Zur Erweiterung des Substratspektrums der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp M4, wurde die aufgeklärte Kristallstruktur mittels Computereinsatz modelliert und die am aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren genauer für die Planung der Mutagenese untersucht. Lysin 66 ist die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Substrat (Phenylpyruvat bzw. Phenylalanin). Für die Akzeptanz von Methylgruppen in Ketonen wurde der Austausch des basischen Lysins 66 gegen eine neutrale Aminosäure mittels gezielter Mutagenese postuliert. eine weitere Überlegung betraf die Änderung des Reaktionsmechanismus der PheDH von einer reduktiven Aminierung zu einer Reduktion vom Typ einer Lactat Dehydrogenase. Hierbei wurden Strukturen von Lactat-Dehydrogenasen verglichen und Arginin als eine charakteristische Bindungsstelle zu Carboxylgruppe identifiziert, das dann an der Stelle von Lysin 66 in der PheDH eingeführt worden ist. Beide Versuche führten mittels gezielter Mutagenese zu negativen Ergebnissen. Durch den Austausch der basischen Aminosäure Lysin 66 gegen das neutrale Isoleucin, verlor die PheDH ihre ursprüngliche Aktivität. Beim zweiten Versuch, die Mutation des Lysin 66 gegen Arginin und somit die Konstruktion einer Phenyllactat Dehydrogenase zu ermöglichen, ist die PheDH-Aktivität aufgrund des Austausches einer basischen Aminosäure gegen eine basische Aminosäure erhalten geblieben. Für die Erweiterung des Substratspektrums war eine Änderung der Ladung im Falle K66I nicht ausreichend. Daher wurden beide Mutanten, K66I und K66R, als Template in der Zufallsmutagenese („directed evolution“) eingesetzt. Durch eine Zufallsmutagenese mittels Variation der Konzentration an MgCl2 bzw. MnCl2 und dNTPs, konnte eine große Bank an Enzymvarianten mit unterschiedlichen Mutationen hergestellt werden. Ein Screening nach der gewünschten Phenyllactat Dehydrogenase erfolgte sowohl mittels einem in dieser Arbeit entwickelten Verfahren als auch photometrisch durch die Absorption des Coenzyms NADH. Sieben Mutanten aus ca. 20.000 Varianten zeigten Phenyllactat Dehydrogenase Aktivität wobei nur die aktivste Mutante näher untersucht und zwei Mutationen T208A und E225D zusätzlich zum K66R festgestellt wurden. Die Kombination aus zwei verschiedenen Methoden, sowohl der gezielten als auch der ungezielten Mutagenese, zeigte sich an diesem Beispiel als Erfolgskonzept und kann bei zukünftigen Arbeiten in Betracht gezogen werden. Anhang 129 DNA-Sequenz der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 ATGAGTATCG GAGACTGGTG GGCACCAGAG GCGGGGGCGA GTCATTGCGC CGAATCCACG AACACCAATT TCGCTCGAAC GCGATGAAGG GTCCAAGGAC CAACTCCTGG ACAGCGGTTG ATGGGCGGCG GCCGCCAACA CTGTACGCTC GTTCTCGGTT AATCAGGTCT CTCGCTGGAC ACAGCGCACT CCCATTTCGT CCGCACAGTA TGACGTTGAA TTCCTGCGCC CCGAGAACAT CGGCAGACAT GCGGCGGCGC CGACCGTCGC TGGGGGCAGT TGGCAGACAC CCCTCGAGGA TCATCACCAC ACGTCATCGC CCGACTTCGT GGTCCGAGTC TCGAGATCTC GGCGCGCCCG GAACTGGGAC CATTCGACTC CTCACAGCTG GATGGCAGTG GCGTCATTCG CGACAAGTTG GGATACTCTG GGGTTCGAGC GCACCGTGGG CGGAGGATCA CGACACCGAG CGTTCTGTCC CGAGGTGGCG CGACGAGGCC GGCCAACGCC GGTTGTCCAC CGACAACGAC CGAGGCCTCG GGGGAAATGA GATTCGACCC GCGGACGCCC AGCAACCTTC ATCGATCCGA TCCGGCAACT AACGACACCA GCGTTCACCA CTGGGCTCAC TTGGCATCCC CGAGTAGCGC ACCCCGTGTG CGAACACTCG GCCTCGGACA GGCGGTGCCA GAACGAGCAG GGCGTCACCC ACAACGACAG CGGTCACCCG AACTCGGACC TCACCGACGC CGATGGGCGG GCACGTGGGC ACTGGACCGG CCGAGTTCGT CCGCCGTTGG TCGACGGTTT TGGCCGCCGA ACGCTGTTGC ATGTCTTCGC ACTGTTCCGT TCCTGCACGC TCCACCTCGT TTGCCATAGG CGGACGAGGC CGACTGCCTA ATTCGACCGG GGCGGCCGGA CGGCAAATTG GGGCAAATCC ACGCATCCTC ACCGGACGTC GTTCGGACGG CGTGTTCGAG GACGGTCCTG AGCGGGTGCG GTTGGGCCAC ACCCTGCGCA CGTGGCCGGT ACGCGGAATT AGGCCGGGAG CGACACCCTG CGCCCGCACT GTAG Anhang 130 DNA-Sequenz des malic enzymes aus E.coli K12 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 ATGGATATTC TATATCCCTT TTCAGCATGG ACCATCGAAG GACAAACACA GTAAACAATC TGTGAGCGTT CGGCACAATA GTGACTGACG CCGATCGGTA CCGGTGGTGC GGCTGGCGTA CAGGCTGTGA AATGCGATGC CAGGGCACTG CAGTTAAGCG GAAATGATCA GTCTTTATGG CAGACCAAAC CTGTCACTGC CAGACCGGGC ATCGTGATGC GCCTGGACCG AAAGATAAAA CTGGGTGTTA GAAACGCTGG CTGAAAGATA CAGCAAGGCG TTCTGGCAAG AAAAAAGAGT ACGCTGGCCC AAGAACGCCG AACAAGCGGA TCTACCTGCG ATCTTGATGA TTTCTGAGAT TGGACGATAT GTGAACGCAT AACTGTCGCT TGGATGTCGG ATCCGCGTAT AACAACGCTG CGTTACTTAA CGGCGGTAAC AGAAAAAAAT TCTCCCAGAC TCGATCGCTT TGGTGCAGAA TGGATGTGGT TGTTTACGGA CGCTGTCTAA AAGGTAACGC TCTACCCTAT TTGCTTCCGG CGCAGTATTC TTCAGAAAGT TGGCGGTGAA CCGAATACCG GAGTGACATG TGTACTGCTG TAACTTCAAC ACGAGCATGG TAACATCCAG GATGATGCCT CTACCGCCGT TCTGCAAAAC TCTGGGGCTT CTATACCGCC AACGAACAAC CACTGACGAC GCCAGACGTG CCGCTATCGC AGTCGGCACA CGTCTTCCTT CCAGCGCGAA TGGCTTGCTG GCGCGAAAAC GCGCAATGTA AGAGATCATC CCCGACGTCA GCTGGTCGCC CGCCCAGTGT CGCGTCACGT ACCATTGGTG CTCCCGCGCA AACCTCTGCC CGACTACCGC GAACCAAAAA GAATTTCCGT CTGCTGGGGT ATCCAGTATC GACACTAACG GTTATTTATA TCACGCGGCG GTGCCGAACC GGTGACCAGG TGTGGCGGCA CAACAGCTGC GAATACTATG CTGTTGCAGT AATGAAATTT CTGATCGCAG GGCGCAGGTT GGATTAAGCG ACTGACAAGA CTCAGTGACT AAACCAGATA CGTGAGATGC CGCGTGGAAG ACGGGCAGCC AACAACGCCT ATCACCGATG CTGAACGGCG ATTGCGTTTG GAAGCCCTGC CGTACCTCCA CAAAAAAACA TGTTGAATAA TACTGCCGGA AGGGATTCAA AAACCCTCTT CCCCAACCGT TGTTTATCTC ATAATATTAA GCATCGGCGG TCAGCCCGGC TTAACGATCC AATTCGTTGA TTGAAGACTT GTTCTTTTAA CAAGCCGCGC CAGCGGGATG AGGAAGCGGC TGCCGAACCT GGGATACCGA TTCTGATTGG ATAAACACTG CCACACCGCA CGTTTAATCC TTATTTTCCC AGATGCTGAT AAGGTATGGT CGGTTGGCAA AACAGGCCAT TCTAA GCGTTCGCTT AGGCAGTGCC AGTGGTCGAA AACCGAAATC CTACCGTCTG CGGCGCAGCC TTACCAGAAC AGTGATTGTG GATGGGCATT GTATACCCTT GCTGTATATG TGAATTTATC TGCTCAAAAA CGATGACATT GGCAGGTGGT CGGCATTGCC GCGGCAGAAA GCTGCCTTTC CAGCGATGTG CGTCTCAGGA TCCGCGTCCG GGACATTATC AGTGGTATGG GGGCATCGGC GTCGGCAAGT ACTGCCGGAA AATGGCGCAG TGACGATAAT Literaturverzeichnis 131 8 Literaturverzeichnis Abrams W. 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Frank Schneider für die kritische Durchsicht der Arbeit, allen Mitgliedern meiner Arbeitsgruppe und allen anderen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts, die mir mit fachlichen Ratschlägen zur Seite standen.