Zur Bachelor-Arbeit - Bickel, Susanne, apl. Prof. Dr. - Heinrich

Bau und Leben
extrem halophiler Archaea
Bachelorarbeit
im
Studiengang Biologie
der Heinrich- Heine-Universität
Düsseldorf
Chantal Jansen
Erstprüfer:
Zweitprüfer:
Prof. Dr. Bickel
Prof. Dr. Alfermann
Bearbeitungszeitraum: 15.07.2007- 15.10.2007
Ratingen, den 15.10.2007
- 2-
Zusammenfassung
Bei den halophilen Archaea handelt es sich um Bakterien, die unter extremen
Lebensbedingungen gefunden werden. Sie benötigen zum Überleben eine Minimum
Salzkonzentration von 9%. Bei einer maximalen Salzkonzentration von 32% ist
Wachstum möglich, aber in einer verlangsamten Form. Sie werden hauptsächlich in
Salinen, im Toten Meer, aber auch in unterirdischen Salzvorräten gefunden. Hier sind
sie
nicht
nur
hohen
Salzkonzentrationen
ausgesetzt,
sondern
auch
hohen
Temperaturen, Sauerstoffmangel und UV-Licht. Durch einen stabilen Aufbau der
Membran und durch besondere Formen der Atmung wird es ihnen ermöglicht bei
diesen extremen Bedingungen zu überleben. In meiner Arbeit beziehe ich mich zum
größten Teil auf Halobakterium salinarum, da dies Halobakterium bis jetzt am
weitesten erforscht wurde.
Schlagwörter: Halophile Archaea, extreme hohe Salzkonzentrationen, Totes Meer,
9% Salzkonzentration, Membranaufbau, H. salinarum
Abstract
The extremly halophilic archaea is a microorganismus with a feature of long-term
microbial survival. They need to survive a minimum of 9% of salt concentration and
with a maximum of 32% it is able to grow smoothly. You can find them mainly in e.g.
the Dead Sea, natural brins, alkaline salt lakes and marine solar salterns where we
have high temperature, low water activity, ultraviolet-light and less oxygen. With the
strong structure of their membrane and the specific way of respiration they are able to
survive this extreme environment. Most of them has not been researched deeply. The
results of my investigation is based mainly on Halobacteria salinarum.
Keywords: extremly halophilic archaeon, Dead Sea, hypersaline soil, 9% salts,
Halobacteria salinarum
- 3-
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ....................................................................................................... 2
Abstract ......................................................................................................................... 2
Inhaltsverzeichnis......................................................................................................... 3
Abbildungsverzeichnis................................................................................................. 5
Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ 7
1
Einleitung ........................................................................................................... 8
2
Die dritte Domäne des Lebens ....................................................................... 11
2.1
Arten .................................................................................................................. 11
2.2
Vorkommen........................................................................................................ 12
3
Extrem Halophile Archaea .............................................................................. 15
4
Beispielorganismus Halobakterium salinarum............................................. 17
5
Wie können die Archaeen in Salzgewässern leben? ................................... 19
5.1
Membranaufbau................................................................................................. 19
5.1.1 Die Purpurmembran .......................................................................................... 20
5.2
Die Energiegewinnung....................................................................................... 21
5.2.1 Fermentation (Gärung) ...................................................................................... 22
5.2.3 Lichtabhängige Ionen- Pumpen......................................................................... 22
5.2.3.1 Aufbau von Bakteriorhodopsin (BR) ................................................................. 22
5.2.3.2 Der Chromophor- dasRetinal ............................................................................ 23
5.2.3.3 Funktion von BR ............................................................................................... 23
5.2.3.4 Photozyklus von Bakterirhodopsin (BR) ........................................................... 24
5.2.3.5 Halorhodopsin (HR) .......................................................................................... 25
5.2.3.6 Photozyklus von HR ......................................................................................... 26
5.2.4
Na+/H+ Antiporter (Langzeitenergiespeicher) .................................................. 28
6
Motilität ............................................................................................................. 29
7
Signaltranduktion ............................................................................................ 31
7.1
7.1
Photoensorische Pigmente: Sensory Rhodopsine SRI und SRII ...................... 31
Rezeptoren
................................................................................................. 32
9
UV-Schutz ......................................................................................................... 34
10
Die industrielle Bedeutung von halophilen ArchaeenBakteriorhodopsin als photochromes Sicherheitspigment ........................ 35
- 4-
Literaturverzeichnis.................................................................................................... 38
Erklärung ..................................................................................................................... 40
Stichwortverzeichnis .................................................................................................. 41
- 5-
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Phylogenetischer Stammbaum nach Woese 1990. Der anhand
von rRNA Sequenzen erstellte Stammbaum zeigt die Verwandtschaftsgrade der
drei Domänen des Lebens Bakterien, Archaea und Eukaryoten zueinander
9
Abbildung 2: Haloferax volcanii zeigt hier Wachstum auf einer Agarplatte und
in einer Kultur. Typische Rotfärbung der Halobakterien durch Carotinoide ist
hier deutlich zu erkennen
(http://www.nottingham.ac.uk/genetics/people/allers/research.php).
12
Abbildung 3: Lake Magadi in Kenia eine der größten Sodaquellen der Welt.
(www.lazypics.de/.../thumbnails/lake_magadi.jpg)
14
Abbildung 4: Der hohe Salzgehalt im Toten Meer verhindert das Untergehen
(http://www.kultour.ch/media/images/TOTES_MEER_Zeitung.jpg).
14
Abbildung 5: Saline (Salzgewinnungsstätten), San Francisco Bay (www.unigiessen.de/.../extrem_halophile.html).
15
Abbildung 6: Vorkommen der Archaea (www.unigiessen.de/..extrem _haloph
ile.htm).
16
Abbildung 7: Extrem Halophile: Die Farben dieser Teiche, aus denen
Meerwasser verdunstet, werden durch das dichte Wachstum von extrem
Halopohilen hervorgerufen. Das Wasser muss einen Salzgehalt von 15-20 %
erreichen. Die Teiche sind Teil einer Salzgewinnungsanlage; die halophilen
Archaea sind harmlos (Neil A. Champell/ Jane B. Reece).
16
Abbildung 8: Zeigt das stäbchenförmige Halobakterium salinarum.
(www.visindavefur.hi.is/myndir/halobakteria_09...)
Abbildung 9: Halobakterium salinarum: vom Ort des Vorkommens
von H.salinarum
Membranaufbau
17
Phänotyp
eingelagertes Bakteriorhodopsin mit den
sieben Helicen (www.bph.ruhr-uni-bochum.de/bilder/br_abb01.jpg)
Abbildung 10: Lipide der Purpurmembran
18
(Besir, Hüseyin
(2001):“Untersuchung der lipidvermittelten Kristallisation der Ionenpumpen
Bakteriorhodopsin und Halorhodopsin aus Halobakterium salinarum“).
20
Abbildung 11: Schematischer Aufbau des Bakteriorhodopsins. All-transRetinal ist über SB (Schiff`sche Base) an das Protein gebunden
(http://www.biophysik.uni-freiburg.de/projekte/diplom_br.html)
Abbildung 12: Retinalchromophor beim Übergang von all- trans zum 13-cis
Retinal. (Doktorarbeit Jamila Guijarro (2006): „Untersuchung des
22
- 6-
lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium
pharaonis mit statistischer und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“)
23
Abbildung 13: Die sechs wichtigsten Schritte des Photozyklus von BR mit den
dazu gehörigen Intermediaten (J, K, L, M1, M2, N, O) und ihren
Apsorptionsmaxima: Isomerisierung; T: Ionen-Transport; S:
Zugänglichkeitsänderung/ Switch (Jamila Guijarro Doktorarbeit 2001)
24
Abbildung 14: Schematischer Photozyklus von HR (Jamila Guijarro Seite 26)
(2006), „Untersuchung des lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin
aus Natronobakterium pharaonis mit statistischer und zeitaufgelöster FTIRSpektroskopie“).
26
Abbildung 15: Schematische Darstellung der zwei Photorezeptoren BR und
HR. Das Retinal ist als Schiff` sche Base an die Proteine gebunden und liegt in
der Mitte des Protonen- bzw. Chloridionenkanals (Kates, 1993) (Jamila Guijarro
S.18 (2006), „Unter -suchung des lichtgetriebenen Chloridtransports in
Halorhodopsin aus Natronobak- terium pharaonis mit statistischer und
zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“)
27
Abbildung16: Schematische Modelldarstellung des Schaltzyklus im
Flagellarmotor (Oesterhelt, Dieter; Marvan Wolfgang (01/05): „Salz in der Suppe
des Lebens“ BiospektrumS.60
29
Abbildung 17: Bioenergetische Systeme und die Aktivierung des
Flagellarmotor (Oesterhelt, Dieter; Marvan Wolfgang (01/05): „Salz in der Suppe
des Lebens“ Biospektrum S. 60-62).
30
Abbildung 18: Schematische Darstellung der Retinalproteine aus H. salinarum
und ihre Funktionen (Jamila Guijarro S.12 (2006), „Untersuchung des
lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium
pharaonis mit statistischer und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“).
32
Abbildung 19: Schematische Beschreibung der Signaltransduktion und der
bioenergetischen System und daran beteiligten Ionenbewegung (Martina Ufer,
1994 "Untersuchung über die Aktivität der Nitratreduktase in dem
Archaeabakterium Haloferax volcanii")
33
Abbildung 20: Strukturen von den wichtigsten Bacterioruberinen und
Carotinoiden (Susanne Bickel-Sandkötter, Martina Ufer, Kerstin Steinert,
Michaela Dana: “Leben im Salz- Halophile Archaea“).
35
Abbildung 21: Die verschiedenen Farbwechsel von BR-Druckfarben: Auf der
linken Seite die unbelichtet Farbe von BR und rechst der Farbwechsel nach
Lichtinduzierung (Prof. Dr. Norbert Hampp: „Biologische Sicherheitspigmente
und optischer Datenspeicher“ Philipps Universität Marburg)
37
- 7-
Abbildung 22: Schematische Darstellung des Bakteriorhodopsins mit den
sieben Alpha-Helices und den C und N terminalen Sequenzen, die außerhalb
der Membran liegen
(http://www.techportal.de/uploads/publications/504/InfoPhysTech40.pdf)
38
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Vergleich der drei Domänen des Lebens (Neil A. Campbell
S.639 6. Auflage 2003) ..................................................................................... 13
- 8-
Abkürzungsverzeichnis
AS= Aminosäure
Asp= Aspartat
BR= Bakteriorhodopsin
DMS= Dimethlysulfid
DMSO= Dimethylsulfoxid
e.g= for example
Glu= Glutamat
HCl= Salzsäure
HR= Halorhodopsin
H4= Halocin
kDa= Kilodalton
NaCl= Natriumchlorid
PMK= Protonenmotorische Kraft
PMF= proton motive force= Protonengradient
PZ= Photozyklus
SB= Schiff`sche Base
SR I /II= Sensorische Rhodopsine
TMAO= Trimethylamin N-Oxid
TMA= Trimethylamin
ZKS= Zwei-Komponenten-System
z.B.= Zum Beispiel
- 9-
1 Einleitung
Als das Leben vor mehr als vier Mrd. Jahren begann, bestand es zunächst aus
einfachen organisierten Zellen. Es dauerte dann noch 2,5 Mrd. Jahre, bis Organismen
entstanden, die einen Zellkern besaßen und noch weitere 600 Mio. Jahre, bis
mehrzellige Lebewesen zunehmend auftraten.
Die heute auf der Erde lebenden Spezies werden in drei Domänen unterteilt: Bakterien,
Archaeen und Eukaryoten. Bei den Eukaryoten kommen sowohl mit dem Auge
sichtbare (makroskopische) Tiere und Pflanzen vor, so wie auch winzige Einzeller, die
mit dem Auge nicht sichtbar sind. Die Archaea und auch die Bakterien lassen sich
hingegen nur unter dem Mikroskop beobachten. Abgesehen von einigen filamentösen
Spezies wie Streptomyceten und Cyanobakterien, welche eine primitive Form der
Differenzierung zeigen, sind alle Archaeen und Bakterien Einzeller. Es wird geschätzt,
dass nur eine geringe Anzahl (ca. 1%) der bakteriellen und archealen Vertreter
bekannt sind und bis jetzt ist es auch nur gelungen ca. 5000 Arten zu kultivieren.
Anhand von rRNA Sequenzen wurde ein phylogenetischer Stammbaum (Abb.1)
erstellt. In diesem Baum wird der Verwandtschaftsgrad der archealen ribosomalen
RNA zu der eukaryotischen rRNA aufgeführt.
Abb.1 : Phylogenetischer Stammbaum nach Woese 1990. Der anhand von rRNA
Sequenzen erstellte Stammbaum zeigt die Verwandtschaftsgrade der drei Domänen
des Lebens Bakterien, Archaea und Eukaryoten zueinander
Heute ist bekannt, dass die Archaea Homologien zu den Eukaryoten aufweisen. Die
Promotorstruktur, der Transkriptionsapparat und Teile der Proteinbiosynthese ähneln
sich stark. Die Ähnlichkeit zu den Bakterien beruht auf der Morphologie: kernlos und
- 10-
einzellig. In ihrer Größe unterscheiden sie sich allerdings. Die Archaea sind kleiner als
die Bakterien.
Die Halobakterien erreichen in ihren Lebensräumen eine hohe Populationsdichte, da
sie kaum Konkurrenten besitzen. Aus Versuchen unter natürlichen Bedingungen sind
Verdoppelungen der Population zwischen 3 und 23 Tagen gemessen worden. Sie
vermehren sich durch Zweiteilung und bilden keine Dauerstadien oder Sporen aus.
Unter Laborbedingungen ist es möglich, eine Populationsverdopplung in wenigen
Stunden zu erhalten.
Die Halobakterien produzieren Peptid-Antibiotika, die Halocine, die das Wachstum
anderer extrem halophiler Archaea inhibieren. Es gibt insgesamt 15 verschiedene
Halocingruppen. Halocin H4 ist das bis jetzt am weitesten erforschte und bekannteste
Peptid- Antibiotika. Es wird von Haloferax mediterranei produziert, es ist thermolabil
und salzabhänging. Die Membran der Zielzelle wird durch das Halocin H4 verändert,
was zur Folge eine Permeabilitätsänderung hat und schließlich dazu führt, dass sich
die Zellen auflösen. Alle unsere Ergebnisse der Halocine stammen aus Versuchen aus
dem Labor (Susanne Bickel-Sandkötter, Martina Ufer, Kerstin Steinert und Michaela
Dane (1994) „ Leben Im Salz- Halophile Archaea“)
Eine biochemische Besonderheit der Archaea ist, dass sie keine Fettsäuresynthese
haben, aber sie bilden Lipide, in denen isoprenoide Seitenketten als Ether mit dem
Glycerinteil verknüpft sind. Dieses Merkmal ist nur auf die Archaea bezogen. Ihre
Plasmamembran besteht bei allen bisher bekannten aus Di- und Tetraetherlipiden und
nicht aus Esterlipiden. Ihre Membran wird unter anderem ausgezeichnet durch einen
großen Anteil an sauren Aminosäuren (Aspartat und Glutamat). Sie enthalten einen
geringen Anteil an hydophoben Aminosäuren, auf Grund des hohen Ionenanteils im
Cytoplasma. Die Membran wird stabilisiert durch Natrium-Ionen. Die eingelagerten
Lycopene (C-40 Carotinoide) und Bakterioruberine (C-50 Carotinoide) verleihen der
Membran eine charakteristische Rotfärbung und schützen die Halobakterien vor UVSchäden. Alle Archaea sind gramnegativ (komplexe Struktur der Membran).
Charakterisiert werden die halophilen Archaea als unbeweglich oder beweglich durch
Geißelbüschel. Die Wenigen von ihnen die auch beweglich sind, besitzen einen
Flagellenmotor, der durch die photosensorischen Pigmente (SRI und SRII) gesteuert
wird.
Erwähnt werden sollte auch, dass die Halobakterien kleine Gasvesikel besitzen. Die
Vesikel sind wasserundurchlässig, mit Gas gefüllte intrazelluläre Hohlkörper, die aus
Proteinen aufgebaut sind. Durch starke lichtbrechende Eigenschaften, sind die Vesikle
unter dem Phasenkontrastmikroskop gut sichtbar. Die Gasvesikel verschaffen den
Zellen Auftrieb, um in Wasserschichten mit höheren Sauerstoffkonzentrationen zu
kommen (Walsby 1994). Ihre lichtbrechenden Eigenschaften könnten jedoch auch als
Schutz vor photooxidativen Schäden dienen. Zu den Spezialisten der Gasvesikelbildung gehören Halobakterium salinarum, Haloferax mediterranei und Halorubrum
vacuolata, aber auch andere halophile Archaea und auch Bakterien sind in der Lage
Gasvesikel zu bilden.
- 11-
2 Archaea die dritte Domäne des Lebens
Die Archaeen werden in die drei Abteilungen der Crenarchaeota, Korarchaeota und der
Euryarchaeota unterteilt. Die halophilen Archaeen gehören zu der Abteilung der
Euryarchaeota.
Domäne: Archaea
Stamm: Euryarchaeota
Klasse: Halobakteria
Ordnung: Halobakteriales
2.1 Arten
Zu den halophilen Archaeen gehören 17 Gattungen:
Halobakterium
Haloalcalophilium
Halorubrum
Halobaculum
Haloferax
Haloarcula
Halococcus
Halogeometricum
Halorhabdus
Halosimplex
Haloterrigenea
Natronobacterium
Natronorubrum
Natrinema
Natrialba
Natronomonas
Natronococcus
- 12-
Bei den letzten sechs handelt es sich um Gattungen, die durch Alkaliphilie
gekennzeichnet sind. Natronobacterium wächst bei einer niedrigen Magnesiumkonzentrationen und einem pH-Wert um 9-11.
Abb. 2: Haloferax volcanii zeigt hier Wachsetum auf einer Agarplatte und in einer
Kultur. Typische Rotfärbung der Halobakterien durch die Carotinoide ist hier deutlich zu
erkennen (http://www.nottingham.ac.uk/genetics/people/allers/research.php).
2.2 Vorkommen
Archaea sind einzellige Mikroorganismen, die zu der einfachsten Form des Lebens
zählen. Ihr häufigstes Vorkommen ist in extremen Habitaten nachgewiesen worden,
wie zum Beispiel bei extrem hohen Salzkonzentrationen, Temperaturen um den
Siedepunkt, Druck, aber auch bei extrem hohen und niedrigen pH-Werten. Diese
Bedingungen wären für andere Organismen tödlich, aber auch unter normalen und
gemäßigten Lebensbedingungen sind sie zu finden. Die extremen Habitate erinnerten
Carl Woese an frühere Bedingungen auf der Erde. Er gab den Archaea Ihren Namen,
den er mit dem griechischen Wort archaios für ursprünglich verband.
- 13-
Tabelle 1: Vergleich der drei Domänen des Lebens (Neil A. Campbell S.639 6. Auflage
2003).
Halobakterien wurden aus verschiedenen natürlichen Habitaten isoliert. Im Toten Meer
(Haloferax volcanii), aus dem Lank Magadi in Kenia (Halorubrum vacuolatum). Sie sind
auf Grund ihrer roten Pigmentierung auch mit dem bloßen Auge zu erkennen. In
Salzseen können 10 7 bis 19 8 Zellen pro ml vorkommen (Grand & Larsen, 1989).
Halophile Mikroorganismen kommen bevorzugt in hypersalinen Habitaten vor. Die
Salzkonzentration liegt in diesen Habitaten mit 3,5% Na /Cl höher, als die des
Meerwassers. Die Habitate halophiler Archaea enthalten Na, K, Mg und Ca als
dominierende Kationen und Cl, SO4 und CO3 als Anionen. Intrazellulär kommen Cl und
K am häufigsten vor. Viele hypersaline Gewässer entstehen durch die Evaporation von
Meerwasser (sogenannte thalassohaline Habitate) und stellen daher einen Teilbereich
der marinen Biotope dar. Zu ihnen zählen Salzquellen mit unterirdischen Salzvorräten,
Salinen und natürliche Meerwasser nahe Spritzgewässer. Der NaCl-Gehalt ist hier sehr
hoch und es herrscht ein neutraler bis alkalischer Zustand. Hypersaline Gewässer nicht
mariner Biotope (oder nicht hauptsächlich marine) werden als athalassohalin
bezeichnet. Sie entstehen zum Beispiel in trockenen Gebieten durch Verdunstung von
Süßwasser oder durch Auflösung von Salzschichten. Ihre Ionenzusammensetzung ist
somit stark von der Geologie, Topographie und den klimatischen Bedingungen
abhängig und unterscheidet sich stark von der des Meerwassers. Hierfür ist das Tote
Meer (ein See) ein typisches Beispiel, in dem die Konzentration an Mg²+ und Ca²+ die
der Na+ und K+ übertreffen und der pH-Wert mit etwa 6 sehr niedrig liegt (Oren, 2002).
- 14-
Abb. 3: Lake Magadi in Kenia eine der größten Sodaquellen der Welt
(www.lazypics.de/.../thumbnails/lake_magadi.jpg)
Abb. 4: Der hohe Salzgehalt im Toten Meer verhindert das Untergehen
(http://www.kultour.ch/media/images/TOTES_MEER_Zeitung.jpg).
- 15-
3 Extrem halophile Archaea
Ihren Namen haben die halophilen Archaea von ihrem extremen Lebensort (vom
griechischen: halo für „Salz“ und philos für „Freund“), direkt übersetzt Salzliebe. Diese
Organismen
lieben
das
Salz,
das
heißt
sie
sind
nicht
nur
an
höhere
Salzkonzentrationen angepasst, sondern sie benötigen das Salz zum Leben. Diese
Organismen brauchen zum Leben eine minimale Salzkonzentration von 1,5 M NaCl
(9%). Für ein optimales Wachstum (zum Beispiel unter Laborbedingungen) liegt eine
Salzkonzentration von 3,5 und 4,5 M (21-27%) im Außenmedium vor (Grant und
Larsen, 1989). Auch bei einer höheren Salzkonzentration (5,2M 32% =Sättigungskonzentration) ist noch Wachstum möglich, dieser findet dann aber in verlangsamter
Form statt. Es lässt sich über die halophilen Archaeen sagen, dass sie zur
dominierenden Population werden, sobald die Salzkonzentration eine Molarität von
mindestens 2,5 erreicht (Norten 1992, Grant und Larsen 1989). Die Halobakterien
produzieren Halocin, die das Wachstum halophiler Konkurrenten hemmen.
Anhand dieser Organismen lässt sich untersuchen wie Leben unter extremen
Bedingungen möglich ist.
Abb. 5: Saline (Salzgewinnungsstätte), San Francisco Bay (www.unigiessen.de/.../extrem_halophile.html)
- 16-
Abb. 6: Vorkommen der Archaea (www.uni-giessen.de/.../extrem_halophile.html)
Abb. 7: Extrem Halophile: Die Farben dieser Teiche, aus denen Meerwasser
verdunstet, werden durch das dichte Wachstum von extrem Halopohilen
hervorgerufen. Das Wasser muss einen Salzgehalt von 15-20 % erreichen. Die Teiche
sind Teil einer Salzgewinnungsanlage (Neil A. Champell/ Jane B. Reece).
- 17-
4 Beispielorganismus Halobakterium salinarum
Abb. 8: Zeigt das stäbchenförmige Halobakterium salinarum
(www.visindavefur.hi.is/myndir/halobacteria_09...)
Halaobakterium salinarum gehört zu der Familie der Halobacteria. H. salinarum ist ein
stäbchenförmiger Prokaryont, der vier Flagellen besitzt, etwa 5 Mikrometer lang ist und
dessen Zellen einen Durchmesser von einem halben Mikrometer aufweisen. Geringe
Sauerstoffkonzentrationen
und
hohe
Lichtintensität
prägen
das
Habitat
des
Halobakterium salinarum.
Der Organismus ist stets einem osmotischen Stress ausgesetzt, da er sein optimales
Wachstum bei einer außergewöhnlich hohen Natriumchlorid- Konzentration (4M)
besitzt. Fällt die NaCl- Konzentration auf 3M ab, so tritt die osmotische Lyse der Zelle
ein (Stoeckenius, 1976). H. salinarum ist im Toten Meer zu finden, aber auch in
Salinen und in Kalifornien in dem Salzsee Orwenslake.
Die meisten Halobakterien sind aerob, chemoorganothrophe Mikroorganismen, die
verschiedene Aminosäuren für ihr Wachstum benötigen. Fehlt Sauerstoff, so kann H.
salinarum unter anaeroben Bedingungen Arginin zu Ornithin, Ammoniak und
Kohlendioxid abbauen (Oren, 1994). In die Purpurmembran des Halobakterium
salinarum ist das Bakteriorhodopsin eingelagert, das als einfaches System der
Photosynthese fungiert, indem es mittels absorbierter Lichtenergie über der Membran
einen Protonenkonzentrationsgradienten erzeugt (Beschreibung siehe unter 5.2.2.2).
- 18-
Abb. 9: Halobakterium salinarum zu sehen: vom Ort des Vorkommens → Phänotyp
von H. salinarum → der Membranaufbau von oben → eingelagertes Bakteriorhodopsin
mit den sieben Helicen→ Bakteriorhodopsin mit dem eingelagerten Retinal (gelb
makiert) (www.bph.ruhr-uni-bochum.de/bilder/br_abb01.jpg).
- 19-
5 Wie können die Archaea bei diesen extremen
Bedingungen überleben?
Bei hohen Salzkonzentrationen werden normalerweise Proteine und Makromoleküle
zerstört. Die Struktur der Proteine zerfällt aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen oder die Proteine aggregieren, weil ihnen die Hydrathülle entzogen wird.
Außerdem werden die essentiellen elektrostatischen Wechselwirkungen innerhalb oder
zwischen den Makromolekülen durch die Ladungen gestört. Die Verfügbarkeit von
Wasser wird durch die Hydratation der Salzionen reduziert (Dennis& Shimmin, 1997).
Die biologischen Membranen sind wasserdurchlässig, dieses würde für die halophilen
Archaeen bedeuten, dass sie Wasser an ihre Umgebung abgeben müssten. Man
spricht auch davon, dass hypersaline Biotope „physiologisch trocken“ genannt werden,
d.h. die Umgebung entzieht den Zellen das Wasser aufgrund des hohen osmotischen
Drucks. Damit sie in der Lage sind unter diesen hohen Salzkonzentrationen zu leben,
mussten sie unterschiedliche Strategien entwickeln. Bei Halobakterien wurde entdeckt,
dass sie durch Osmose die hohen Salzkonzentrationen der Umgebung mit den inneren
Kaliumchloridkonzentrationen ausgleichen (Kuschner und Kamekura 1988; Andreas
Tebbe 2005). Unter anderem spielt der Aufbau der Zellwand eine sehr große Rolle.
5.1 Membranaufbau
Die Zellwand der halophilen Archaeen besteht nicht aus Peptidoglykan wie bei den
Bakterien sondern aus Proteinen und Glykoproteinen, dem sogenannten S-Layer. Mit
überwiegend sauren Aminosäuren, wie Glutamat, Aspartat und nur einem geringen
Anteil an hydrophoben Aminosäureresten. Es wird vermutet, dass bei einem
physiologischen pH- Wert die sauren Aminosäurereste aufgrund der negativ geladenen
funktionellen Gruppen stärker hydratisiert werden, als die anderen Aminosäurereste.
Auf
diese
Weise
würde
sich
das
hydrierte
Salzionen-Netzwerk
Proteinoberfläche besser koordinieren lassen (Dennis&
auf
der
Shimmin, 1997). Die
Hydrophobizität wird durch die negativ geladenen Seitenketten verringert und
verhindert so die Aggregation (Aussalzen) der Proteine. Eine Stabilisation entsteht
durch die Gegenständigkeit, der negativ geladenen Säuregruppen der Aminosäuren
und der positiven Natriumionen des Außenmediums. Sind im Außenmedium keine Na+
vorhanden drängen sich die negativ geladenen Säuregruppen der Aminosäuren
auseinander, das Protein entfaltet sich und somit lysieren die Zellen. Es ist also eine
hohe Salzkonzentration nötig, damit die Zellwände bestehen bleiben.
- 20-
5.1.1 Die Purpurmembran (PM)
Die Purpurmembran (PM) ist bis jetzt nur bei dem Stamm Halobakterium
(Halobakterium salinarum) gefunden wurden. Die Membran besteht zu 75 % aus BR,
die
restlichen
25%
bilden
die
archaealen
Lipiden
aus:
Archaeol
(sn-2-3-
Diphythanylglycerol), Phospholipide und Squalen. Aus biochemischen Untersuchungen
wurde ein Verhältnis von 10 Lipidmolekülen pro BR-Molekül in der PM abgeleitet,
wobei 2-3 Glykolipide, 6-7 Phospholipide und ein Squalenmolekül pro BR gefunden
wurde (Grigorieff, 1995). Die PM-Flecken sind ca. 5nm dick und zeigen eine
unregelmäßige Form in ihrem Durchmesser von 500 bis 1000 nm.
Abb. 10: Lipide der Purpurmembran (Besir, Hüseyin (2001):“Untersuchung der
lipidvermittelten Kristallisation der Ionenpumpen Bakteriorhodopsin und Halorhodopsin
aus Halobakterium salinarum“).
In der Purpurmembran ist das BR in Form eines zweidimensionalen hexagonalen
Gitters eingelagert, wobei sich jeweils drei BR zu einem Trimer organisieren, die sich
wiederum in einer Lipiddoppelschicht befinden. Durch die Ausbildung des Kristallgitters
aus Protein und den umgebenden Lipidmolekülen wird die Membran stabilisiert. Die
Purpurmembran ist mit dem bloßen Auge durch ihre purpur (lila) Färbung zu erkennen.
Ihre Farbe kann sich von lila nach gelb verändern. Die Veränderung der Farbe beruht
auf einer Konformationsänderung des BR, die durch unterschiedliche Lichtinduktion
zustande kommt. Die PM zeigt eine hohe thermische und auch chemische Stabilität.
Bei Temperaturen im Wasser bis zu 80 Grad Celsius und in trockener Form sogar bis
zu 140 Grad Celsius bleibt sie stabil. Bei einem pH-Wert von 2-12 oder aber auch,
wenn sie Lösungsmitteln ausgesetzt wird, behält sie ihre Form bei. H. salinarum und
- 21-
auch andere extrem halophile Archaeen bilden bei niedrigem Sauerstoffgehalt
purpurfarbene (lila) Bereiche in der Membran aus, wobei bei den anderen Archaeen
die Färbung auf Carotinoide zurück zu führen ist, die in die Membran eingelagert sind
(Doktorarbeit: Hüseyin, Besir 2001).
5.2 Energiegewinnung (Bioenergetik)
Bei den halophilen Archaeen ist der Sauerstoffgehalt bei diesen extremen
Lebensbedingungen sehr knapp. Die Löslichkeit von Sauerstoff ist bei hohen
Salzkonzentrationen gering. Die Archaeen sind jedoch in der Lage unter anaeroben
Bedingungen weiter zu leben. Ihnen stehen weitere Elektronenakzeptoren zur
Verfügung, wie zum Beispiel bei den Gattungen Haloferax und Halobakterium wurde
entdeckt, dass sie in der Lage waren Fumarat als Elekronenakzeptor zu nutzen und zu
Succinat zu reduzieren (Oren, 1991).
Außerdem kommt die Reduktion von Nitrat zu Nitrit über eine der Membran außen
aufsitzenden Nitratreduktase vor. Die Nitrat- reduktase wurde bei Haloferax
mediterranei und Haloferax volcanii entdeckt (Ufer und Bickel-Sandkötter, 1995).
Als weitere Elekronenakzeptoren stehen den Halobakterien Dimethylsulfoxid und
Trimethylamin N-Oxid zu Verfügung. Bei den meisten untersuchten Stämmen wurde
festgestellt, dass sie Dimethylsulfoxid (DMS) zu DMSO reduzieren oder Trimethylamin
(TMA) aus Trimethylamin N-Oxid (TMAO) produzieren (Oren und Trüper, 1990). Die
Elekronenakzeptoren übernehmen in diesem Fall die Rolle des Sauerstoffs. Auch die
Fermentation von Arginin stellt eine Methode der Energie- gewinnung dar, die bei H.
salinarum gefunden wurde.
Eine andere Möglichkeit der Energiegewinnung besitzt das Halobakterium H.
salinarum. H.salinarum kann mit Hilfe von Sonnenlicht Energie gewinnen. Es lässt sich
nicht mit der Photosynthese vergleichen, da hier keine CO2 Fixierung stattfindet und
auch keine Kohlenhydrate erzeugt werden. Hier spielt nicht Chlorophyll eine wichtige
Rolle, sondern Bakteriorhodopsin. H. salinarum erzeugt bei Abwesenheit von Sauerstoff, mit Hilfe der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin eine protonmotorische Kraft, die die ATP- Synthase so effizient antreibt, dass die Zellen
phototroph wachsen können. Es wird nicht Wasser gespalten, sondern es wird ein
Konzentrations- unterschied zwischen innerem und äußerem Cytoplasma aufgebaut.
5.2.1 Fermentation (Gärung)
Unter Fermentation versteht man die Umsetzung von biologischem Materials mittels
Bakterien zu Energiegewinnung bezeichnet, die bei Abwesenheit von Sauerstoff
abläuft. Steht der Zelle kein Sauerstoff, kein Licht oder keine Kaliumbatterie (s. u
Langzeitenergiespeicher) zur Verfügung, so kann H. salinarum Arginin zu Ornithin
abbauen und das dabei entstehende Carbamylphosphat dazu nutzen um ATP umzu-
- 22-
wandeln (Oesterhelt, Dieter; Marvan Wolfgang (01/05): „Salz in der Suppe des Lebens“
Biospektrum S. 60-62)
Bei fermentativem Wachstum erzeugt die archeale ATPase durch ATP-Hydrolyse die
notwendige ionenmotorische Kraft für Ionenaustausch, Transportprozesse und
Bewegung.
5.2.2 Lichtabhängige Protonen-Pumpen
5.2.2.1 Aufbau von Bakteriorhodopsin (BR)
Eine besondere Art der Energiegewinnung ist durch das in Halobakterium salinarum
entdeckte Bakteriorhodopsin möglich. Bakteriorhodopsin gehört zu den integralen
Membranproteinen und ist in die Purpurmembran eingelagert.
Die Primärsequenz besteht aus 248 Aminosäuren (Stöckenius, 1971) und besitzt ein
Molekulargewicht von 26784 Dalton. Die Sekundärstruktur des BR ist aus sieben
annähernd parallelen Alpha-Helices aufgebaut, die sich ringförmig anordnen und
senkrecht in der Membran stehen. Ein Ionenkanal wird von vier dieser Helices (B, C, F
und G)
gebildet. Durch diesen Ionenkanal findet der Protonentransport in der
Zellmembran statt. Im Grundzustand des Proteins ist dieser cytoplasmatische Kanal
geschlossen und somit kann kein Ionentransport statt finden. BR kann über hundert
Protonen in der Sekunde durch die Membran transportieren. Das Bakteriorhodopsin
zeigt eine große Ähnlichkeit mit dem menschlichen Sehpigment Rhodopsin. Das
lichtabsorbierende Element im Bakteriorhodopsin (BR) ist das Retinal (hydrophobes
Molekül).
Abb.11: Schematischer Aufbau des Bakteriorhodopsins. All- trans- Retinal ist über SB
(Schiff`sche Base C═N) an das Protein gebunden (http://www.biophysik.unifreiburg.de/projekte/diplom_br.html).
- 23-
5.2.2.2 Der Chromophor- das Retinal
Das Retinal ist ein Isoprenoid und ein Aldehyd von Vitaminen A. Absorbiert der
Chromophor Licht, wird es von der all- trans Form in die 13 cis Form überführt. Das
Retinal ist zwischen cytoplasmatischer und extrazelluärer Halbpore als protonierte
Schiff`sche Base (SB) an das Lysin K216 (in der G Helix) gebunden (Oesterhelt, 1998).
Das Protein hat ein Molekulargewicht von 260 Dalton. Das Retinal lagert sich unter
anaeroben
Bedingungen
dicht
und
regelmäßig
in
der
Cytoplasmamembran
(Purpurmembran) ein und sorgt bei den Archaeen für die sichtbare Rotfärbung.
Anhand von zahlreichen biochemischen und spektroskopischen Untersuchungen mit
BR-Mutanten
wurde
nachgewiesen,
dass
nur
die
SB
unerlässlich
für
die
Funktionsfähigkeit der Protonenpumpe ist. Alle anderen Stationen spielen keine
ausschlaggebende Rolle (Lanyi 1997, Subramaniam 1999). Das Retinalmolekül kann
durch Licht aktiviert werden und dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung.
Es wird reversibel von all trans zu 13-cis Retinal isomerisiert.
Abb. 11: Retinalchromophor beim Übergang von all- trans zum 13-cis Retinal.
(Doktorarbeit Jarmila Guijarro (2006): „Untersuchung des lichtgetriebenen
Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium pharaonis mit statistischer
und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“)
5.2.2.3 Funktion von Bakteriorhodopsin (BR)
Durch das Pumpen der Protonen aus dem Cytoplasma durch die Pore auf die
extrazelluläre Seite entsteht ein Protonengradient (PMF= proton motive force). Die
lichtgetriebene Protonenpumpe, das Bakteriorhodopsin, treibt die Bildung dieses
Protonengradienten über die Zellmembran unter anaeroben Bedingungen an. Der
entstandene Protonengradient wird dafür genutzt, dass ATP durch das Enzym ATPase
synthetisiert werden kann. Bakteriorhodopsin schützt unter anderem die Zellen vor
- 24-
photooxidativen Schäden, die hervorgerufen werden durch die starke Sonneneinstrahlung.
5.2.2.4 Photozyklus von Bakteriorhodopsin (BR)
Der Photozyklus kann in sechs Schritten beschrieben werden (Abb.12). Wenn
Sonnenlicht auf das purpurfarbene Bakteriorhodopsin (BR 568) trifft, wird damit eine
lichtgetriebene Ionenpumpe in Gang gesetzt. Es kommt zu einer Konformationsänderung des Retinalchromophors. Im unbelichteten Zustand liegt das Retinal in der
trans-Form vor. Nach der Isomerierung (nach Belichtung) geht es in die 13-cis-Form
über und startet den Photozyklus (Stoechenius, 1979). Die Farbe des Bakteriorhodopsin ändert sich mit der Konformationsänderung. Durch mehrere Zwischenstufen
(K, L) verändert sie sich von purpur nach gelb (M1).
Abb.12: Die sechs wichtigsten Schritte des Photozyklus von BR mit den dazu
gehörigen Intermediaten (J, K, L, M, N, O) und ihren Absorptionsmaxima. Im Inneren
des Zyklus sind die zwei unterschiedlichen Konformationszustände von Retinal zu
sehen (Susanne Bickel-Sandkötter, Wolfgang Gärtner, Michaela Dane: Springer
Verlag1996 „Conversion of energy in halobacteria: ATP synthesis and phototaxis“).
Das Lysin, mit dessen Hilfe die Schiff`sche Base gebildet wird, ist die zentrale
Proteinbindestelle des Proteins. Im Grundzustand liegt sie protoniert vor. Beim
Übergang von L(550) zum ersten langlebigen M- Intermediat wird die Schiff`sche Base
deprotoniert. Gleichzeitig wechselt das Gegenion der Schiff`schen Base zum Asp 85
(Protonenakzeptor) in die protonierte Form. Außerdem wird ein Proton (H+) von der
Region nahe Glutamat 194 und Glutamat 204 durch die Zellmembran transportiert und
- 25-
nach außen abgegeben. Hier liegt ein blauverschobenes Absorptionsmaximum von
410 nm vor. Bei der Reaktion von M nach N wird die deprotonierte Schiff`sche Base
von Aspartat 96 reprotoniert und ein Proton wird aus der cytoplasmatischen Oberfläche
wieder aufgenommen. An der letzten Station von O nach BR findet wieder eine
Deprotonierung
des
Asp
85
statt
und
das
Retinal
kehrt
durch
thermale
Reisomerisierung in die all-trans Form zurück. Das BR besitzt an dieser Stelle
schließlich wieder seinen purpurfarbenen Ausgangszustand.
Als Photozyklus werden die reversiblen Photoreaktionen bezeichnet, die wieder in ihre
Ausgangszustand zurück gehen. Das Bakteriorhodopsin und auch das Halorhodopsin
durchlaufen den Photozyklus in etwas mehr als 10ms.
5.2.2.5 Halorhodopsin (HR)
Ein weiteres Retinalprotein ist das Halorhodopsin, welches nicht wie das BR bis jetzt
nur
bei
einem
Organismus
gefunden
wurde,
sondern
weiter
verbreitet
ist.
Halorhodopsin stellt eine nach innen gerichtete, lichtgetriebene Chloridpumpe da. Die
Chloridpumpe ist für Bakterien bei hohen Salzkonzentrationen lebenswichtig. Die
Pumpe benutzt genau wie BR Retinal als Lichtempfänger.
Die halophilen Archaea müssen, bevor sie sich teilen können, ihr Volumen vor der
Zellteilung vergrößern. Durch Absorption von zwei Photonen kann HR Protonen in die
Zelle transportieren. Dazu werden negativ geladene Chlorid-Ionen in das Zellinnere
gepumpt und als Gegenionen folgen Kaliumkationen durch Ionenkanäle passiv in das
Innere der Zelle (KCl Konzentration innen und NaCl Konzentration außen etwa gleich =
Einsalzstrategie).
Mittels Anionenimport lädt HR ebenfalls wie BR die Membran negativ auf, fungiert aber
nicht als photosyntetisches Pigment, sondern erhält den osmotischen Druck des
cytoplasmatischen und extrazellulären Mediums in der Balance, indem es Licht über
einen gerichteten Ionentransport in elektrochemische Energie umwandelt und so die
Aufnahme von Salz (K und Cl) erlaubt.
Halorhodopsin liegt unter Laborbedingungen in 3D Kristallen zu Trimeren angeordnet
vor und bildet einen Kanal in der Membran. Dieser cytoplasmatische Kanal ist im
Grundzustand geschlossen und somit nicht für Ionen-Transport durchlässig. Das
Halorhodopsin (HR) hat eine ähnliche Struktur, wie das Bakteriorhodopsin. Jedoch gibt
es einen entscheidenden Unterschied im aktiven Zentrum, dort wo das Cl-Anion
gebunden wird. Bei BR sitzt an derselben Stelle die gleichfalls negativ geladene
Gruppe einer AS, die für die vorübergehende Aufnahme des Protons während des
Pumpprozesses zuständig ist. Da das Chlorid-Anion einen unfangreicheren Platz aus
Größengründen braucht, fehlt hier die entsprechende Aminosäure. Chlorid wird nur
über wenige gerichtete ionische Wechselwirkungen gehalten. Im ionischen Leitweg
bindet das Chlorid wohl nur über Aminosäurereste. Eine weitere auffallende
Besonderheit ist, dass das Anion von mehreren Wasserstoffatomen umgeben wird.
Obwohl C-O-Bindungen nur ein schwaches Dipolmoment besitzen, reicht die
Anhäufung von solchen Gruppen um das Chlorid-Ion aus, um dessen Bindung zu
- 26-
stabilisieren
(http://www.mpg.de/bilderBerichteDokumente/dokumentation/PresseMitteilungen/2000/
p ri49_00.htm).
5.2.2.6 Photozyklus von HR
Der Photozyklus läuft bei Halorhodopsin sehr ähnlich ab. Die Schlüsselaminosäuren
Asp85 und Asp 96 in BR sind in HR durch Threonin 111 bzw. Alanin 122 ersetzt. Aus
diesem Grund liegt hier die Schiff`sche Base während des gesamten Zyklus protoniert
vor (Oesterhelt 1995). Es finden also keine M- Zustände statt.
Abb. 13: Schematischer Photozyklus von HR mit den dazu gehörigen
Absorptionsmaxima. I: Isomerisierung; T: Ionen- Transport; S:
Zugänglichkeitsänderung/ Switch (Jarmila Guijarro Seite 26 (2006), „Untersuchung des
lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium pharaonis
mit statistischer und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“)
Das erste rotverschobene Intermediat HR600 entspricht dem K590 von BR mit 13-cisRetinal. Im darauf folgenden Schritt zu HR 520 wird das Chloridion von seiner
ursprünglichen Position zur protonierten Schiff´schen Base verschoben (genaue
Position noch nicht bekannt). Die Änderung der Lage des Chloridions, muss jedoch
dazu führen, dass eine stärkere Lokalisation der positiven Ladungen an der
protonierten Schiff´schen Base stattfindet, was durch die geänderte Absorption (von
600 zu 520nm) zu erklären wäre. Anschließend findet der Übergang von HR520 in das
kurzlebige HR640 (rot) statt, wobei ein Cl-Ion in das Cytoplasma abgegeben wird und
danach eine Absorption von 565 nm (O-Intermediat) gemessen wird. Nach thermischer
Isomerisierung zu all- trans- Retinal wird aus der extrazellulären Seite ein Cl-Ion
aufgenommen und der Ausgangszustand mit der protonierten Schiff´schen Base und
- 27-
das mit Chlorid besetzte aktive Zentrum wieder erreicht. Der Zyklus von HR ist bis jetzt
noch weniger erforscht, als der von BR (Jamila Guijarro (2006), „Untersuchung des
lichtgetriebenen Chloridtransports in Halo- rhodopsin aus Natronobakterium pharaonis
mit statistischer und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“).
Der entschiedene Unterschied der beiden Retinalproteine HR und BR lässt sich durch
eine einzige Mutation einer Aminosäure aufheben. Nur der Ersatz einer negativ
geladenen AS (von Asp 85) als Protonenakzeptor in BR, durch ein Cl-Anion in HR,
führt zu einer kompletten Änderung der Ionenspezifität von Kationen und Anionen. BR
kann somit zu einer Chloridpumpe durch eine Aminosäuremutation konvertiert werden.
Abb. 14: Schematische Darstellung der zwei Photorezeptoren 1.BR und 2.HR. Das
Retinal ist als Schiff`sche Base an die Proteine gebunden und liegt genau in der Mitte
des Protonen- bzw. Chloridkanals (Jarmila, Guijarro S.18 (2006), „Untersuchung des
lichtgetriebenen Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium pharaonis
mit statistischer und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“)
5.2.4 Na+/ H+ Antiporter (Langzeitenergiespeicher)
Die Halobakterien können überschüssige Lichtenergie, die nicht direkt zur ATPSynthese
benötigt
wird,
elektroneutral
in
großem
Umfang
speichern
(der
Protonengradient kann selber nicht gespeichert werden, da die elektrische Kapazität
der Zellmembran limitiert ist). Der Protonengradient treibt einen H+/Na+- Antiporter an,
der in der Cytoplasmamembran verankert ist. Die zuvor nach außen gepumpten
- 28-
Protonen (H+) fließen zurück in die Zelle. Na+ wird nach außen gepumpt und
gleichzeitig fließt K+ durch einen selektiven Kaliumkanal nach innen und neutralisiert
so die Zelle. So wird ein Kaliumspeicher molarer Konzentrationen im Inneren
aufgebaut. Nach Sonnenuntergang läuft der ganze Prozess umgekehrt ab. Die Batterie
wird dann entleert, indem die Zelle den Kaliumdiffusionsgradienten wieder in einen
Protonengradienten umbaut, der wie das Bakteriorhodopsin (bei Licht) die ATPSynthase antreibt (Dieter Oesterhelt, Wolfgang Marwan 2005). So ermöglicht der
Kaliumgradient der Zelle eine lichtunabhängige ATP-Synthase und gewährleistet auch
im Dunkeln eine Energieversorgung bis 24 h. Dieser elektrochemische Gradient kann
von Sekundär-Transportsystemen genutzt werden um wiederum die Aufnahme anderer
Stoffe an zutreiben (Norten, 1992).
- 29-
6 Motilität
An H. salinaum wurde das Schwimmverhalten im Laufe der letzten 20 Jahre eingehend
untersucht. Die fünf bis zehn Geißeln bilden ein helikales Bündel. Im Gegensatz zu den
eukaryotischen Geißeln, die peitschenartig schlagen, werden die Geißeln der
Halobakterien durch einen Rotationsmotor bewegt. Der Motor kann sich gegen oder im
Uhrzeigersinn drehen. Die Drehrichtung des Bündels bestimmt, in welche Richtung die
Zellen schwimmen. Im Urzeigersinn bewegt sich das Halobakterium vorwärts. Der
Richtungswechsel (Umkehr) wird durch äußere Reiße wie zum Beispiel ultraviolettes
Licht oder aber auch ganz zufällig durch Kollision mit einem Partikel.
Die molekularen Komponenten des archealen Flagellarmotors zu identifizieren hat sich
bis heute nicht erfüllt. Die zunächst angenommene Ähnlichkeit mit dem aufgeklärten
Geißelmotor der Enterobakterien konnte nicht bestätigt werden. Es wird heute
angenommen, dass der zweifellos nach dem rotatorischen
Prinzip arbeitende
archaeale Flagellarmotor aus völlig anderen Komponenten konstruiert sein muss, als
der der Bakterien.
Ernst Dieter Gilles und Dieter Oesterhelt haben zusammen ein Modell der
Signalkaskade entworfen. Sie stellten fest, dass ein Teil der sensorischen
Informationsverarbeitung im Schaltkomplex des Geißelmotors stattfindet.
Abb.16: Schematische Modelldarstellung des Schaltzyklus im Flagellarmotor
(Oesterhelt, Dieter; Marvan Wolfgang (01/05): „Salz in der Suppe des Lebens“
Biospektrum S. 60-62).
- 30-
Hier spielt das Schaltsignal (Che YP), aber auch die konformativen Zustände des
Schaltkomplexes selbst eine große Rolle. Mit Hilfe des Signals und der konformativen
Zustände ermittelt die Zelle die für sie besten Umweltbedingungen und die dort heraus
resultierende Schwimmrichtung. In der Abb. 16 werden die acht Zustände des
Schaltkomplexes und ihre Aktivitätszustände dargestellt. Die acht Zustände fassen
eine komplexe Folge von Konformationsänderungen der Untereinheiten zusammen. Es
können vier unter- schiedliche Aktivitätszustände vorliegen: Stopp, refraktär (ref),
kompetent (comp) und aktiv (act). Außerdem kann der Kreislauf gegen den
Uhrzeigersinn (ccw) oder im Uhrzeigersinn (cw) ablaufen. Die Übergänge von refraktär
nach kompetent und von kompetent nach aktiv werden durch eine Stimulation reguliert,
woraus eine Änderung der CheY- Phosphatkonzentration hervorgeht. Eine steigende
Konzentration an CheY verlangsamt den Übergang von refraktär nach kompetent und
beschleunigt den Übergang von kompetent nach aktiv. Die Schwimmphase wird
dadurch aber im Ganzen verkürzt.
Die Aktivierung der Rezeptoren wird reguliert durch die Autophosphorylierungsaktivität
der Histidinkinase CheA, die über ein Kopplermolekül
CheW
an die Rezeptoren
gebunden wird. Der Phosphatrest wird auf einen Antwortregulator CheY~P übertragen,
der dann am Flagellarmotor den Schaltzyklus moduliert. Parallel zur Änderung der
CheY-
Phosphatkonzentration
wird
von
aktivierten
Rezeptoren
die
Fumarat-
ausschüttung bewirkt, welche ebenfalls direkt am Flagellarmotor wirkt. Bleibt der Reiz
konstant, kehrt das CheY- Phosphatsignal auf den Wert vor der Stimulation zurück,
was durch die konstante Aktivität der Metyltransferase (CheR) und durch die von der
Histidinkinase (CheA) regulierten Esterase (CheB) bewirkt wird.
Abb. 17: Bioenergetische Systeme und die Aktivierung des Flagellarmotor (Oesterhelt,
Dieter; Marvan Wolfgang (01/05):„Salz in der Suppe des Lebens“ Biospektrum S.60)
- 31-
7 Signaltransduktion
Die Signaltransduktion wird in halophilen Archaeen durch die Retinalproteine (SRI und
SRII) vermittelt. Die Retinalproteine sind in die Membran eingelagert. Sie sind in der
Lage, auf unterschiedliche Wellenlängen mit unterschiedlichen Reaktionen zu
reagieren. Die Drehrichtung des Geißelmotors ist also abhängig von der Wellenlänge,
die auf die Pigmente trifft.
7.1 Photosensorische Pigmente: Sensory Rhodopsin SRI und
SRII
Die Aufgabe von SRI und SRII besteht nicht darin, Ionen über die Zellmembran zu
pumpen, sondern ihre Aufgabe ist es die Intensität und die Wellenlängenbereiche des
einstrahlenden Lichtes zu messen.
Im Gegensatz zu den Energietransducern BR und HR agieren die beiden Sensory
Rhodopsine (SRI und SRII) als Informationstransducer indem sie drei Antworten zu
Lichteinwirkungen weiterleiten. Ein Hinschwimmen zu gelbem Licht wird durch SRI
erzeugt, wodurch HtrI(Einleiterprotein) aktiviert wird. Eine Fluchtreaktion findet statt,
wenn der Organismus mit UV Licht oder blauem Licht bestrahlt wird. Bei UV-Licht
schaltet sich das SRI ein, welches HtrI aktiviert. Bei blauem Licht wird das HtrII durch
das SRII aktiviert.
Durch das Einleiterprotein HtrI wird eine Signalkaskade ausgelöst, die die Drehrichtung des Geißelapparates der Zelle ändert und so ein Wegschwimmen von UVLicht und ein Hinschwimmen zum orangenen Licht ermöglicht. SRII ist ein
Blaulichtrezeptor und löst in der Zelle durch Absorption von blauem Licht eine
Fluchtreaktion aus. Die Weitergabe des Signals zu dem flagellaren Motor geschieht
über einen verzweigten Aktivierungsweg (Spudich 1995; Doktorarbeit Jarmila Guijarro,
2004). Diese Sensoren ermöglichen den extrem halophilen Archaeen, sich in ihrer
Umgebung zu orientieren und so die geeigneten Bedingungen für ihre Photosynthese
zu finden. Die primären photochemischen Prozesse sind bei den Energietransducern
und auch bei den Sensory Rhodopsinen gleich. Zuerst findet eine Isomerisierung von
dem all- trans Retinal (Grundzustand) zu dem 13-cis-Retinal statt. Die Konformationsänderung führt zur Aktivierung der assoziierten Einleiterproteine HtrI und HtrII. Nach
diesem Schritt folgen weitere Konformationsänderungen, bis schließlich der Grundzustand all- trans Retinal wieder erreicht wird.
Der entscheidende Unterschied der Pumpen und auch der Sensoren besteht in der
Lebensdauer des 13- cis Retinal Zustandes und in der Abgabe/Aufnahme der Ionen
- 32-
von den Pumpen. SR1 braucht 250 ms und SR2 700 ms, bis der Grundzustand im
Photozyklus wieder erreicht wird. Der Zeitunterschied, ist damit zu erklären, dass sie
mit Hilfe ihrer Photoprodukte katalytisch ein Signal bewirken müssen. Von den Pumpen
wird jedoch nur ein effektiver Ionentransport verlangt (Marvan 1987). Die Expression
von HR und auch die der von Sensory Rhodopsinen ist in den Halobakterien
anteilmäßig geringer.
Abb.18: Schematische Darstellung der Retinalproteine aus H. salinarum und ihre
Funktionen (Jarmila Guijarro S.12 (2006), „Untersuchung des lichtgetriebenen
Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium pharaonis mit statistischer
und zeitaufgelöster FTIR- Spektroskopie“).
7.2 Rezeptoren
Halobakterium salinarum besitzt 18 genomisch kodierte Rezeptoren, wobei nur 7 bis
jetzt identifiziert wurden. Die Überträger sind modular aufgebaut und besitzen eine
cytoplasmatische Domäne, die mit der Signaltransduktionskaskade wechselwirkt. Die
meisten der Übertäger sind über Transmembranhelices (besitzen 1, 2 oder 6 Helices)
in der Zellmembran verankert. Die Chemorezeptoren die extrazelluläre Reize
erkennen, besitzen eine extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne. Wird an den
Liganden gebunden kommt es zu einer Konformationsänderung, die über die
Transmembranhelices an die cytoplasmatische Domäne weitergeleitet wird und so die
Signalkaskade in den Gang setzt. Die zwei Rezeptoren BR (Bakteriorhodopsin) und
HR (Halorhodopsin) analysieren die Lichtverhältnisse. Bei sinkender Lichtintensität
arbeiten die Rezeptoren BR und HR nicht mehr mit voller Kapazität. In Htr1
(Überträgerprotein) und Htr2 wird der Photoaktivierungszustand, der SR1 und SR2
durch die Transmembranhelices an die cytoplasmatische Domäne weitergeleitet. Der
Rezeptor SR1 kann UV-Licht und gelbes Licht wahrnehmen. SR2 nimmt blaues Licht
- 33-
wahr. Die Rezeptoren SR1 und SR2 kommunizieren über die Transduktorproteine
(Htr1 und Htr2) in einem Zwei- Komponenten-System
(ZKS) bestehend aus einer
Histidinkinase CheA und einem Antwortregulator CheY mit dem Flagellarmotor und
steuern so die lichtgetriebene Bewegung des Flagellarmotors des Archaeons.
Abb.19: Schematische Beschreibung der Signaltransduktion und der bioenergetischen
Systeme und daran beteiligten Ionenbewegungen (Martina Ufer,1994 „Untersuchung
über die Aktivität der Nitratreduktase in dem Archaebakterium Haloferax volcanii“).
- 34-
8 UV-Schutz
Wie schon erwähnt sind die halophilen Archaea oft in südländischen Gebieten zu
finden, wo sie in den Seen und den Meeren einer starken Sonneneinstrahlung
ausgesetzt sind. Die Halobakterien sind in den Gewässern durch ihre auffällige
Rotfärbung mit dem bloßen Auge zu erkennen. Die typische Rotfärbung tritt nicht nur
bei den Halobakterien auf, die eine Purpurmembran mit Bakteriorhodopsin besitzen,
sondern auch bei anderen Halobakterein. In der Cytoplasmamembran der Halobakterien sind langkettige Isorenoide, Bacterioruberine (C-50 Isoprenoide) und auch
Carotinoide (C-40- Einheiten) wie Lycopin (Farbstoff der Tomate) eingelagert, die die
unterschiedlichen Färbungen der Salzseen hervorrufen. Welche Färbung ein
Organismus ausstrahlt, kommt auf die Mengenanteile der langkettigen Isoprenoide in
der Membran an.
Die Intensität der Pigmentierung ist bei den meisten Halobakterien von der
Salzkonzentration des Lebensraums abhängig. Bei hoher Salzkonzentration ist eine
starke Pigmentierung zu erkennen, nimmt die Konzentration ab, so wird auch die
Pigmentierung weniger.
Die Organismen schützen sich durch diese Pigmente vor photooxidativen Prozessen,
indem sie die UV-Strahlen abfangen (Susanne Bickel-Sandkötter und Horst Bickel,
1996: „Leben im Toten Meer: Halobakterien“). Durch das UV-Licht werden die
Sauerstoffmolekühle auf ein energetisch höheres Niveau gebracht und es werden
Peroxide und Oxide gebildet, die die Zellen normalerweise zerstören würden. Die in
der Cytoplasmamembran eingelagerten Carotinoide sind in der Lage die Energie von
den Elektronen des Sauerstoffs zu übernehmen, indem sie selber in einen energetisch
höheren Zustand (Triplettzustand) übergehen und die Energie in Form von Wärme
wieder abgeben (Susanne Bickel-Sandkötter, Martina Ufer, Kerstin Steinert, Michaela
Dana: “Leben im Salz- Halophile Archaea“).
O2 + Carotinoide → O2 + Carotinoide→ Carotinoide + Wärme
Die Färbungen beschreiben die Energiezustände: gelb= Triplett-Zustand; rot=
Singulett-Zustand
- 35-
Abb. 20: Strukturen von den wichtigsten Bacterioruberinen und Carotinoiden (Susanne
Bickel-Sandkötter, Martina Ufer, Kerstin Steinert, Michaela Dana: “Leben im SalzHalophile Archaea“).
- 36-
9 Industrieller Nutzen (Nanobiologie)
Die Nanotechnologie beschäftigt sich mit Systemen in der Größe von hundert
Nanometern bis hinunter zu weniger als einem Nanometer. Dies ist genau der
Größenbereich der Bestandteile von Zellen. Durch die Zusammenarbeit von
Nanotechnologie und Biotechnologie ergeben sich deshalb besonders faszinierende
Möglichkeiten, wie zum Beispiel der Gebrauch von Halorhodopsin als photochromes
Sicherheitspigment (www.mpg.de/pdf/jahresbericht2000/jahresbericht2000.pdf)
9.1 Bakteriorhodopsin als photochromes Sicherheitspigment
Aufgrund von hoch modernen Druckern, Scannern und Farbkopierern ist das Fälschen
und Nachahmen von Dokumenten heute kein großes Problem mehr. Die Fälschung
von Führerscheinen, Personalausweisen, Reisepässen, Banknoten und Wertpapieren
wird heute stark beobachtet. Mit Hilfe des biologischen Farbstoffes Bakteriorhodopsin
war es möglich ein neues leistungsfähiges, weit über den Stand der Technik hinaus
gehendes Sicherungselement herzustellen. Bei dem veränderten Bakteriorhodopsin ist
ein mit dem Auge sichtbarer, lichtabhängiger Farbwechsel von lila nach gelb zu sehen,
wenn das Molekül belichtet wird. In diesem Spektralbereich ist die Empfindlichkeit des
Auges am größten. Der Lichtinduzierte Farbstoff schützt so vor Farbkopierern,
Scannern
und
Druckern.
Das
Molekül
bietet
des
Weiteren
noch
nützliche
Eigenschaften, die vor Fälschungen von Dokumenten schützt. Durch chemische und
gentechnische Modifizierung wird aus BR ein multifunktionales Material für die
Dokumentenfälschung und optische Datenspeicherung. An erster Stelle sei die
Möglichkeit erwähnt, Daten zu verschlüsseln und optisch zu speichern. Magnetstreifen
und Speicherchips können diese Speicherkapazitäten nicht aufbringen. Mit Hilfe von
biotechnologischen
Herstellungsverfahren
lassen
sich
große
Mengen
dieses
multifunktionellen Materials Bakteriorhodopsin preisgünstig herstellen, was eine
wichtige Voraussetzung für einen technischen Einsatz ist.
- 37-
Abb. 21: Die verschiedenen Farbwechsel von BR-Druckfarben: Auf der linken Seite die
unbelichtet Farbe von BR und rechst der Farbwechsel nach Lichtinduzierung (Prof. Dr.
Norbert Hampp: „Biologische Sicherheitspigmente und optischer Datenspeicher“
Philipps Universität Marburg).
Der Farbwechsel von lila nach gelb, der durch die Induktion von Licht entsteht, ist sehr
auffällig. Die spektrale Verschiebung (von 160nm) von lila nach gelb kann hervorgerufen werden durch die Belichtung mit grünem Licht. Die Umkehrung von gelb nach lila
kann durch sichtbares blaues Licht bewirkt werden. Das Bakteriorhodopsin zeigt eine
für ein Protein einzigartige Stabilität (siehe Aufbau der Membran). Die Membranbereiche die eine lila Färbung zeigen, in die das Bakteriorhodopsin eingelagert ist, wird
als Purpurmembran (PM) bezeichnet (siehe Aufbau PM). Das Bakteriorhodopsin zeigt
eine Resistenz gegen hohe Temperaturen, Lösungsmittel und auch unterschiedliche
pH-Werte, denen es ausgesetzt ist, scheint ihm nicht zu schaden. Durch eine gewisse
Unempfindlichkeit ist eine großtechnische Gewinnung immer besser möglich. In
diesem Fall ist jedoch die wichtigste und ausschlaggebende Eigenschaft, das BR durch
Lichtinduktion seine Farbe verändert und dieser Vorgang auch reversible ist. BR ist in
der Lage viele Millionen Male diesen Vorgang zu wiederholen. Schon mit einer
einfachen Lampe ist es möglich BR von lila nach gelb zu verändern und in Dunkelheit
wird der Vorgang reversible. Wichtig dieser Vorgang ist mit dem bloßen Auge sichtbar!
Auch im Kopierschutz ist es sehr wichtig, da es seine Farbe bereits während des
Kopiervorgangs verändert. Wird ein Dokument kopiert, auf dem zuvor eine mit BR
behandelte Stelle lila sichtbar war, ist diese nach dem Kopieren als gelbe sichtbar.
Sollte es sich um eine Fälschung handeln würde bei dem Kopiervorgang kein
Farbwechsel stattfinden.
Das Retinalprotein Bakteriorhodopsin besitzt 248 Aminosäuren (s. o. Aufbau BR). Viele
von diesen AS sind für das BR nicht essentiell und können somit ausgetauscht werden
gegen andere AS. Die meisten der AS sind in den sieben Alpha- Helices zu finden und
nur die N- und C-Termini liegen außerhalb. Mit Hilfe einer aufwendigen Methode
(Sequenzierung) ist es möglich die C-terminalen extramembranen Aminosäurekette zu
- 38-
ersetzen. Nicht das Ersetzen ist mit großem Aufwand verbunden, sondern die
Identifizierung der C-terminalen extramembranen Aminosäureketten stellt das Problem
dar.
Abb. 22: Schematische Darstellung des Bakteriorhodopsins mit den sieben AlphaHelices und den C und N terminalen Sequenzen, die außerhalb der Membran liegen
(http://www.techportal.de/uploads/publications/504/InfoPhysTech40.pdf).
Werden speziell veränderten Peptidstücke für die Dokumentensicherung hergestellt, ist
das veränderte BR zu seinem Hersteller zurück verfolgbar. Die veränderten
Sequenzen enthalten eine charakteristische Aminosäuresequenz durch die sie
identifiziert werden können. Bei einem Peptid mit 10 AS (siehe Abb. rot markierten AS)
können 1024 Codes gebildet werden. Die Veränderung der AS bildet quasi eine
Adresse, über die es immer wieder identifiziert werden kann. Die Funktion des BR
verändert sich nicht. Bei der Datenspeicherung handelt sich um den WORM-Speicher
(write- once- read- many). Der Speicher kann beschrieben werden, aber nicht mehr
gelöscht werden. Auf einem Abschnitt von 6cm × 1cm ist es möglich, Daten im
Megabit- Bereich zu speichern. Die Detektion kann preiswert maschinell durchgeführt
werden. Es können Bilder aber auch digitale Daten auf diesem Datenspeicher
festgehalten
werden
(http://www.uni-marburg.de/fb15/ag-
hampp/forschung/BR/Info/PDF2002DInfo PhysTech_BR).
- 39-
Literaturverzeichnis
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Kristallisation der Ionenpumpen Bakteriorhodopsin und Halorhodopsin aus
Halobakterium salinarum“
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Analysis of Halophilic Archaea
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Promotoren aus halophilen Archaea mit dem bgaH-Reportergen“
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Chloridtransports in Halorhodopsin aus Natronobakterium pharaonis mit
statistischer und zeitaufgelöster FTIR-Spekroskopie“
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Lebensräumen“
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and evidence that the genus name Haovibrio Fendrich 1989 with the type
species Halovibrio variabilis should be associated with DSM 3050”)
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S.18 www.bph.ruhr-uni-bochum.de/bilder/br_abb01.jpg
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S.25 http://www.mpg.de/bilderBerichteDokumente/dokumentation/press
emitteilungen/2000/pri49_00.htm
S. 35 www.mpg.de/pdf/jahresbericht2000/jahresbericht2000.pdf
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S. 37 http://www.unimarburg.de/fb15/aghampp/forschung/BR/Info/P
DF_2002_D_InfoPhysTech_BR
- 41-
S. 37 http://www.uni-marburg.de/fb15/ag-hampp/forschung/BR/Praesentation
BR/p08
- 42-
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit selbständig angefertigt
habe. Es wurden nur die in der Arbeit ausdrücklich benannten Quellen und Hilfsmittel
benutzt. Wörtlich oder sinngemäß übernommenes Gedankengut habe ich als solches
kenntlich gemacht.
Ort, Datum
Unterschrift
- 43-
Stichwortverzeichnis
Abbildungsverzeichnis 6
Kopierschutz 37
Abkürzungsverzeichnis 8
Lake Magadi 14
Abstract 2
Literaturverzeichnis 38, 39
Anaerobe Atmung 21
Meerwasser 14
Arten 11
Membranaufbau 19
Bakteriorhodopsin 24, 34, 35, 37
Motilität 29
Carotinoide 35
Na+/H+-Antiporter 28
Dritte Domäne 13
Photozyklus BR 24
Einleitung 9
Photozyklus HR 26
Erklärung 40
Pururmembran 20
extrem Halophil 15
Pylogenetischer Stammbaum 9
Fermentation 21
Photosensoren 31
Flagellarmotor 28
Retinalproteine 21, 22
Gasvesikel 9
Retinal 23
Geißeln 28
Rezeptoren 32
Halobakterium salinarum 17
Tabellenverzeichnis 7
Halorhodopsin 26, 27
UV-Schutz 33
Inhaltsverzeichnis 2
Vorkommen 12
Konkurrenz 9
Zusammenfassung 2