- Mestrado em Horticultura Irrigada
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB) Pró-Reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG) Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS) Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada – Mestrado (PPHI) Morgana Mateus Santos HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola E POTENCIAL DE USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis PARA CONTROLE DA BACTÉRIA JUAZEIRO – BA 2013 UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB) Pró-Reitoria de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG) Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS) Programa de Pós-Graduação em Horticultura Irrigada - Mestrado (PPHI) Morgana Mateus Santos HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola E POTENCIAL DE USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis PARA CONTROLE DA BACTÉRIA Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Horticultura Irrigada do Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais da Universidade do Estado da Bahia (PPHI/ DTCS/UNEB), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de Concentração: Horticultura Irrigada. Orientadora: Prof. Dra. Ana Rosa Peixoto Co-orientadora: Prof. Dra. Cristiane Domingos da Paz JUAZEIRO - BA 2013 2 MORGANA MATEUS SANTOS HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola E POTENCIAL DE USO DE ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis PARA CONTROLE DA BACTÉRIA Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Horticultura Irrigada do Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais da Universidade do Estado da Bahia (PPHI/ DTCS/UNEB), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de Concentração: Horticultura Irrigada. Aprovada em: 12/03/2013 Comissão Examinadora Prof. Dra. Ana Rosa Peixoto Universidade do Estado da Bahia (UNEB) Dr. José Mauro da Cunha e Castro Pesquisador da Embrapa Semiárido (EMBRAPA) Dra. Ana Valéria Vieira de Souza Pesquisadora da Embrapa Semiárido (EMBRAPA) 3 iv DEDICATÓRIA Dedico esse trabalho ao meu marido Esmailly, grande incentivador e parceiro, que me cerca de carinho e respeito, e aos meus pais, Josefa e João Carlos, que me deram AGRADECIMENTOS muito apoio nos momentos mais difíceis da minha vida. Obrigada por tudo! 4 v AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Deus por sua presença na minha vida e por ser minha força espiritual. Agradeço ao meu grande amor e esposo (Esmailly de Sousa Pessoa) por sua paciência e compreensão; por me tranquilizar nos momentos difíceis e me dar forças para superar os obstáculos. Jamais conseguirei expressar esse sentimento e tudo que essa pessoa representa na minha vida. Agradeço aos meus amados pais e a minha irmã (Vanessa) que são fundamentais em minha vida; minha fonte de juventude, pois sempre serei a caçulinha. Eles são meu conforto, minha segurança e alicerce. Agradeço à Dona Rose, Liemara e Mirna que, com o passar dos anos, tornaram-se grandes amigas, sempre me ajudando e aconselhando. Agradeço aos meus mestres, que tiveram presença fundamental na minha vida profissional e pessoal. As minhas amadas e eternas professoras: Professora Ana Rosa Peixoto que, com seu sorriso e tranquilidade, soube me tranquilizar quando, nervosa e agitada, chegava para conversar sobre a dissertação. Tornou-se uma grande amiga no decorrer deste tempo. Professora Cristiane Domingos da Paz que sempre esteve presente na minha caminhada na graduação e no mestrado, que me ensinou, aconselhou e estimulou. Uma grande mulher que admiro imensamente. Professora Grécia Cavalcanti por quem, desde o período da graduação tenho grande carinho e admiração, pessoa especial que me ensinou inúmeras coisas. Professora Lindete Mírian Martins que está sempre disposta a ajudar e se preocupa com todos seus alunos, sempre estimulando e protegendo. É uma pessoa muito especial, por quem tenho enorme admiração e carinho. Agradeço à Doutora Maria Angélica Guimarães Barbosa que me deu a oportunidade de trabalhar em parceria com a Embrapa Semiárido no projeto sobre o “Estudo da gama de hospedeiros do cancro-bacteriano em plantas invasoras e em outras espécies de plantas cultivadas”. Agradeço à Doutora Ana Valéria Vieira de Souza, também pesquisadora da Embrapa Semiárido, pela oportunidade de trabalhar no projeto sobre a 5 vi “Ação antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis no crescimento in vitro de Xanthomonas campestris pv. Viticola (Xcv)”. Agradeço à Doutora Rosa de Lima Ramos Mariano da Universidade Federal Rural de Pernambuco pela oportunidade de executar e realizar a etapa de identificação e caracterização molecular dos isolados de Xcv. Agradeço ao Doutor Marco Aurélio Gama da Universidade Federal Rural de Pernambuco por me ensinar e ajudar a realizar a identificação molecular dos isolados de Xcv. Agradeço ao professor Carlos Aragão pela ajuda nas estatísticas do meu trabalho de Dissertação. Agradeço à Helena, Mariana, Márcia e Laíse, bolsistas de iniciação científica, pela grande ajuda na avaliação dos experimentos. Agradeço a ajuda de todos os funcionários do campo, da faxina, os técnicos dos Laboratórios de Solos e de Fitopatologia. Em especial, Seu Bernadino, Tia Lucilha, Dona Carmem e Tia Neuma. Agradeço a todas as pessoas que contribuíram para o aprimoramento deste trabalho. Incontáveis foram os incentivos dos familiares, amigos, professores e orientadores. A todos vocês, deixo registrados meus sinceros agradecimentos às ações executadas, às palavras encorajadoras, às demonstrações de compreensão e amor que me fizeram acreditar e vencer esse desafio. 6 vii SUMÁRIO PÁG. RESUMO GERAL.............................................................................................X GENERAL ABSTRACT...................................................................................XII 1. INTRODUÇÃO..............................................................................................14 2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................16 2.1 IMPORTÂNCIA DA CULTURA DA VIDEIRA.......................................16 2.2 O CANCRO BACTERIANO DA VIDEIRA.............................................20 2.2.1 HISTÓRICO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA.........................20 2.2.2 ETIOLOGIA ...............................................................................21 2.2.3 SINTOMATOLOGIA. .................................................................22 2.2.4 DIAGNOSE.................................................................................23 2.2.5 DISSEMINAÇÃO.........................................................................25 2.2.6 SOBREVIVÊNCIA.......................................................................26 2.2.7 HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS.............................................27 2.2.8 ESTRATÉGIAS DE CONTROLE........................... .....................28 2.3 ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE ALTERNATIVO DE DOENÇAS DE PLANTAS..................................................................................................30 2.3.1. ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia...................................................31 7 viii 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................33 4. OBJETIVO....................................................................................................44 CAPÍTULO I......................................................................................................45 ESPÉCIES ESPONTÂNEAS E OLERÍCOLAS COMO HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola RESUMO ...................................................................................................46 ABSTRACT ...............................................................................................47 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................48 2. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................49 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................53 4. CONCLUSÕES .............. .......................................................................61 AGRADECIMENTOS..................................................................................61 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................61 CAPÍTULO II...............................................................................................66 EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia gracilis SOBRE CRESCIMENTO “IN VITRO” DE Xanthomonas campestris pv. viticola O RESUMO ...................................................................................................67 ABSTRACT ...............................................................................................68 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... ...68 8 ix 2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................70 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................73 4. CONCLUSÕES .............. .......................................................................79 AGRADECIMENTOS..................................................................................80 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................80 CONSIDERAÇÕES GERAIS...........................................................................86 9 x RESUMO GERAL A cultura da videira tem se expandido, significativamente, na região do Submédio do Vale do São Francisco, nos últimos anos. No entanto, o cancro bacteriano da videira, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola – Xcv, tem proporcionado elevadas perdas a esta cultura, constituindo-se na doença bacteriana mas importante da videira na região. No presente trabalho, foi estudado o potencial de 19 espécies espontâneas, seis espécies comerciais e de Azadirachta indica, como hospedeiras alternativas do patógeno; bem como, avaliou-se a ação antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis, no crescimento “in vitro” de Xcv. As plantas em teste foram inoculadas com a suspensão do isolado de Xcv (A570= 0,4 correspondente a 10 8 UFC mL-1), incubadas em casa de vegetação e observadas diariamente quanto aos componentes epidemiológicos do cancro bacteriano: período de incubação (PI) e incidência de folhas com sintomas (INC). O isolado de Xcv obtido de cada hospedeiro alternativo foi identificado molecularmente por iniciadores (“Primers”) específicos na Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, Recife, PE. Os menores PI foram observados em Glycine sp.(2,6 dias) e Senna obtusifolia (3 dias). Todas as espécies pertencentes à família Poaceae, Bidens subalternans, Emilia fosbergii, Praxelis pauciflora, Macroptilium lathyroides e Portulaca oleracea apresentaram PI=42 dias, não sendo hospedeiras alternativas do patógeno. Os maiores índices de incidência da doença foram verificados em Glycine sp.,S. obtusifolia, Desmodium discolor, Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanun esculentum e Vigna unguiculata que apresentaram 100%, enquanto que os menores valores de INC foram observados em Leonotis nepetifolia e Tridax procumbens com 50 e 60%, respectivamente. As amplificações com os oligonucleotídeos específicos, a partir do DNA genômico purificado do isolado de Xcv, obtido das 10 diferentes hospedeiras, resultaram em fragmentos de 240pb, característicos de Xcv. A ação microbiana de oito óleos extraídos de L. gracilis cultivada com e sem adubação mineral, adubação orgânica e irrigação, foi testada em três dosagens diferentes (200; 250 e 300 ppm), testemunha com o oxicloreto de cobre (controle padrão) e a testemunha absoluta. A suscetibilidade do isolado 10 xi Xcv3 aos óleos testados foi avaliada na primeira etapa pela presença e ausência do crescimento bacteriano e, na segunda etapa, pela porcentagem de inibição do crescimento bacteriano. Os tratamentos referentes aos óleos 01, 06 e 07, extraídos de L. gracilis cultivada com adubação mineral (NPK) e adubação orgânica, apresentaram as maiores porcentagens de inibição no crescimento bacteriano de Xcv, ou seja, 94,75%, 96,50% e 94,02%, respectivamente. Os óleos 4 e 16 proporcionaram menores porcentagens de inibição no crescimento bacteriano de Xcv, porém causando inibição superior ao tratamento com oxicloreto de cobre. Os resultados encontrados neste trabalho confirmam a ação bactericida do óleo essencial de L. gracilis, sobre o crescimento de Xcv. O uso destes óleos tem potencial e pode ser uma alternativa no manejo integrado do cancro bacteriano da videira, necessitando desta forma, a continuar este trabalho, em condições de campo. Palavras chaves: Sobrevivência; Cancro bacteriano da videira; PCR; Ação antimicrobiana; Óleo essencial. 11 xii GENERAL ABSTRACT The culture of the vine has expanded significantly in the sub-medium of Vale of San Francisco in recent years. However, the grapevine bacterial canker (Xanthomonas campestris pv. Viticola - Xcv) has provided high losses to this crop, constituting the bacterial disease more important in the region. In this work, we studied the potential of 19 spontaneous species, six vegetables species and the Azadirachta indica, as alternative hosts of the pathogen, as well as evaluated the antimicrobial activity of essential oil of Lippia gracilis on growth "in vitro" of Xcv. Plants with the possibility to being alternative hosts of Xcv were inoculated with the suspension of isolated Xcv3 (A570 = 0.4 corresponds to 10 8 CFU mL-1), incubated in a greenhouse and observed daily for epidemiological components of bacterial canker: incubation period (IP) and incidence of leaves with symptoms (ILS). The isolated Xcv3 obtained from each alternative host was identified molecularly by primers ("Primer") specifics in UFRPE, Recife-PE. The minors IP were observed in Glycine sp. (2.6 days) and Senna obtusifolia (3 days). While all species of the family Poaceae, the Poaceae, Bidens subalternans, Emilia fosbergii, Praxelis pauciflora, Macroptilium lathyroides e Portulaca oleracea showed IP = 42 days, not being therefore, alternate hosts of the pathogen. The highest incidence rates of the disease were observed in Glycine sp., S. obtusifolia, Desmodium discolor, Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanun esculentum and Vigna unguiculata wich showed 100%, while the lowest values were observed in the ILS and Leonotis nepetifolia Tridax procumbens with 50 and 60%, respectively. The amplifications from genomic DNA purified from isolated Xcv with specific primers, obtained from the 10 different hosts have resulted in fragments with the expected size of 240pb. The microbial action of eight oils extracted from L. gracilis grown with and without chemical fertilization, organic fertilization and irrigation, were tested in three different doses (200, 250 and 300 ppm), using as check treatment the Copper oxychloride (standard control) and absolute standard. The susceptibility of isolated Xcv3 to the oils tested was evaluated in the first stage through the presence or absence of bacterial growth in the second stage through the percentage of growth inhibition. The treatments 12 xii relating to oil 01, 06 and 07 extracted from L. gracilis grown with mineral fertilizer (NPK) and organic fertilization presented the highest percentages of inhibition of bacterial growth to Xcv, 94.75%, 96.50% and 94.02%, respectively. The 4 and 16 oils that gave smaller percentages of inhibition of bacterial growth in Xcv, however produced inhibition superior to treatment with copper. The results of this study confirmed the bactericidal action from oils, on bacterial growth of Xcv. The use of these oils has potential and can be an alternative in the integrated management of bacterial canker of grapevine, so needed to be continued this work in field conditions. Keywords: Survival; Cancer bacterial vine, PCR; Antimicrobial action; Essential oil. 13 INTRODUÇÃO A intensificação do cultivo da videira e o plantio de cultivares suscetíveis, além do manejo inadequado prevalentes no Submédio do Vale do São Francisco, têm propiciado o surgimento de problemas fitossanitários, afetando diretamente a produção. Dentre as várias doenças, o cancro bacteriano, causado por Xanthomonas camprestris pv. viticola Nayudu (Dye) (Xcv), tem se destacado, tanto pelos prejuízos causados quanto por sua distribuição, restrita a algumas regiões produtoras no Nordeste brasileiro (TAVARES, 1995). Xcv tem a capacidade de sobreviver de um ciclo para outro em videiras, bacelos e mudas infectadas; epifiticamente em folhas e ramos assintomáticas; em áreas de produção (ARAÚJO, 2001); em restos culturais (NASCIMENTO et al., 2000) e em hospedeiras alternativas (PEIXOTO et al., 2007). A bactéria, além de sobreviver em restos culturais e em tecidos vivos infectados de videira, também consegue infectar outras espécies vegetais que apresentem afinidade com a cultura. Nessas espécies, essas plantas exibem sintomas semelhantes ou não àqueles obeservados em videira, atuando, em condições naturais, como nicho alternativo do patógeno e fonte de inóculo nos parreirais (NAYUDU,1972). O controle do cancro bacteriano da videira é complexo devido à ausência de produtos registrados específicos e ao uso de compostos cúpricos pouco efetivos. Além disso, existem estirpes de Xcv que apresentam variabilidade na tolerância ao cobre, tornando o uso contínuo destes produtos químicos no Submédio do Vale do São Francisco pouco promissor no manejo da doença em médio prazo. Esse comportamento é agravado pela seleção e dominância das estirpes mais tolerantes na população bacteriana (LIMA et al., 2009; MARQUES et al., 2009). Um dos enfoques da agricultura moderna é o controle alternativo de doenças, incluindo o uso de óleos essenciais com atividade antimicrobiana. Vários trabalhos vêm sendo realizados, buscando demonstrar o potencial da utilização desses óleos no controle de fitopatógenos. Os constituintes dos óleos 14 essenciais variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre. Tais compostos se apresentam em diferentes concentrações; normalmente um deles é o composto majoritário, existindo outros em menores teores e alguns em baixíssimas quantidades (SILVA et al., 2003). A combinação desses compostos nos óleos essenciais confere atividades biológicas de interesse contra insetos, plantas daninhas e micro-organismos. (PRABUSEENIVASAN et al., 2006). A identificação de hospedeiros alternativos e a busca de produtos naturais para o controle alternativo de Xcv são passos importantes para a construção de propostas de manejo do cancro bacteriano. Assim, os objetivos desse estudo foram: a) identificar plantas espontâneas hospedeiras de Xcv, b) testar plantas de interesse comercial e de uso como quebra-vento, cultivadas na região, para verificar seu potencial como hospedeiras alternativas de Xcv e c) estudar a eficácia do óleo essencial de L. gracilis, na inibição do crescimento “in vitro” de Xcv. 15 2.REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Importância da cultura da videira A videira (Vitis spp. L.) está entre as espécies cultivadas mais antigas do mundo (POMMER & MAIA, 2003). Registros fósseis encontrados em Kannish, uma antiga cidade comercial da Turquia, mostraram que a viticultura era praticada há cerca de 3.500 anos a.C. (LEÃO & POSSÍDIO, 2009). Tem como centro de origem a região do Cáucaso, de onde foi difundida por toda a costa mediterrânea há centenas de anos, para produção de fruta, consumo in natura e como matéria-prima para a elaboração de vinhos. Na costa do mediterrâneo, ao longo dos séculos, foram selecionadas milhares de variedades de Vitis vinifera que se espalharam pelo mundo (CAMARGO, 2009). A videira pertence à ordem Rhamnales, família Vitaceae, composto pelas secções Muscadinia e Euvitis, e gênero Vitis. A família Vitaceae é dividida em várias subfamílias que compreendem um grande número de gêneros e espécies, dentre os quais se destacam as espécies V. vinifera L. (de origem europeia) e V. labrusca L. (de origem americana), que são as mais cultivadas devido às suas características agronômicas superiores (TEIXEIRA & AZEVEDO, 1996). Existem cerca de 10 mil variedades de videira, adaptadas a vários tipos de solo e clima, o que possibilita o cultivo em mais de 40 países no mundo. Embora amplamente produzidas, as uvas são bem sensíveis e variam de acordo com as condições edafoclimáticas em que se desenvolvem, apresentando características diferenciadoras como sabor, acidez, doçura, formato, coloração, resistência da casca, tamanho, quantidade de sementes e formato dos cachos (QUEIROZ-VOLTAN & PIRES, 2003; TONIETTO, 2009). A partir da introdução do cultivo da videira no Brasil, ocorrida em 1535, muitos estados brasileiros em diferentes regiões, chegaram a experimentar e a desenvolver o cultivo da videira e a produção de vinhos. Contudo, a vitivinicultura somente ganhou impulso e tornou-se atividade de importância 16 socioeconômica a partir do final do século XIX, com a chegada dos imigrantes italianos, sobretudo no Estado do Rio Grande do Sul (TONIETTO, 2009). A viticultura vem contribuindo significativamente para o êxito do agronegócio brasileiro de frutas. Embora a uva seja produzida tradicionalmente em clima temperado, a videira é cultivada numa enorme diversidade de condições climáticas. Em terras brasileiras, é produzida também como fruta tropical, permitindo atender aos mercados internacionais no período de entressafra dos demais países produtores, uma vez que pode haver oferta de uva ao longo do ano em distintas regiões do País (PEDRO JÚNIOR & SENTELHAS, 2003; SILVA et al., 2009). Atualmente, o Brasil é o 4º produtor mundial de uvas de mesa, com uma produção de 1.300.000 toneladas de uvas frescas, o que corresponde a 8,2% da produção mundial que, na média anual de 2010- 2011, se situou em 15.942.000 toneladas. A China com 38,9%, seguida da Turquia e União Europeia com 13,5 e 11,9%, respectivamente (USDA, 2012), são os três maiores produtores. A viticultura brasileira ocupa uma área de aproximadamente 83.484 hectares, com produção anual 1.453.395 toneladas. A maior parte da produção da uva está localizada na região Sul do Brasil, com 981.705 t, que corresponde a 67,8% da produção nacional. A maior parte desta produção é destinada à industrialização de vinhos e sucos. A região Nordeste aparece em segundo, lugar participando com 19,7% na produção nacional (IBGE, 2012). A produção nordestina, que em 2002 foi de 186.548 toneladas, alcançou 285.047 t em 2012, ou seja, um aumento de 52,8%. Esse avanço na produção foi alavancado pelo Estado de Pernambuco com um aumento na produção em 224,8%. A Bahia apresentou uma queda na produção de 27,6%. Pernambuco aumentou a sua participação regional de 53% para 78,8% de um censo ao outro, enquanto a Bahia diminuiu sua produção, de 44,6% em 2002, para 21,2% em 2012 (IBGE, 2012). 17 O Submédio do Vale do São Francisco é o principal centro produtor e exportador de uvas de mesa no Brasil, participando com 93% do que se produz na região Nordeste. Os munícipios de Petrolina, Lagoa Grande, Santa Maria da Boa Vista e Orocó, no Estado de Pernambuco, seguidos dos municípios de Juazeiro, Casa Nova, Curaçá, Sobradinho e Sento Sé, no Estado da Bahia (IBGE, 2010), são os maiores produtores. As variedades cultivadas nos núcleos viticultores do polo Juazeiro– Petrolina são de diferentes genótipos de V. vinifera para a produção de uvas finas de mesa. As variedades Itália, Benitaka, Brasil e Ribier são as predominantes. Red Globe foi uma importante variedade cultivada em diversas áreas, mas, devido à sua elevada suscetibilidade ao cancro bacteriano e ao dispendioso custo para o convívio com a doença, foi sendo erradicada (LOPES, 2006). Há apenas pequenas glebas que ainda preservam seu cultivo. Entre as variedades sem sementes, destacam-se a Festival, também chamada de Sugraone, Superior Seedless ou White Seedless, Crimson Seedless e Thompson Seedless (LEÃO et al., 2009a; LEÃO et al., 2009b). Nas áreas produtores do Submédio do Vale do São Francisco predomina o cultivo das variedades Festival (60%), Thompson Seedless (35%) e Crimson Seedless (5%) (ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2009). A viticultura no Submédio do Vale do São Francisco tem características dinâmicas e peculiares, que a diferencia daquelas praticadas nas tradicionais regiões vitivinícolas brasileiras. Atualmente, essa relevância está voltada para o polo agroindustrial que engloba as cidades de Petrolina, Lagoa Grande, Juazeiro e Casa Nova ou polo da agricultura irrigada do Submédio do Vale do São Francisco, às margens do rio. Essas áreas de plantio irrigadas fornecem uvas, de elevada qualidade em quase todos os meses do ano. A irrigação, aliada à programação de podas, permite adaptar as parreiras a ciclos sucessivos, possibilitando a administração da oferta, fazendo-a coincidir com as entressafras das demais regiões vitivinícolas brasileiras e internacionais, driblando entraves inerentes à sazonalidade (SILVA et al., 2009). 18 Os níveis elevados de radiação na região, aliados a altas temperaturas, reduzem os ciclos da videira em 30 dias, o que permite até 2,5 safras por ano com produtividade acima da média nacional (PEDRO JÚNIOR & SENTELHAS, 2003; POMMER & MAIA, 2003). Essas condições tornaram o Submédio do Vale do São Francisco uma região de grande importância na viticultura brasileira, considerando-se que mais de 90% das uvas finas de mesa são exportadas do Brasil. Entretanto, a ocorrência simultânea de várias fases fenológicas da planta nesta região aliado às condições climáticas, ao uso de material propagativo sem sanidade comprovada e à importâção irregular de materiais genéticos, entre outros, são alguns dos fatores que têm propiciado a intensificação e o surgimento de novos problemas fitossanitários na cultura (LIMA et al., 2009). A videira está sujeita a diversos problemas fitossanitários, entre os quais, doenças causadas por fungos, vírus e bactérias. Dentre as doenças de etiologia bacteriana, apenas duas, causadas por Agrobacterium vitis Ophel & Kerr e Agrobacterium sp., haviam sido descritas até o ano de 1998, no Brasil. A formação de galhas induzida pela bactéria não apresenta expressão para a cultura e já foi descrita em parreirais dos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Norte, São Paulo, Bahia e Pernambuco (LIMA & MOREIRA, 2002). No Brasil, de acordo com a portaria Ministerial nº180 de março de 1996, publicada no diário Oficial da União de 25 de março de 1996, são relatadas 221 pragas de importância quarentenária. A legislação brasileira considera pragas A1 aquelas ausentes no País, mas com características de serem potenciais causadores de danos econômicos, se introduzidas. Em videira, somente a Xylophilus ampelinus Willems é descrita como praga A1. As pragas quarentenárias A2 são aquelas de importância econômica potencial, mas já presentes no país, em áreas restritas, estando sob programa oficial de controle. Em videira, somente X. campestris pv. viticola é citada nesta categoria (BRASIL, 2007). 19 2.2. O cancro bacteriano da videira 2.2.1. Histórico e distribuição geográfica O cancro bacteriano da videira foi detectado pela primeira vez em V. vinifera cv. Anab-e-shahi em Tirupati (Andhra Pradesh), em 1960 (NAYUDU, 1972). Este autor estudou a doença e identificou o organismo causal como Pseudomonas viticola. Mas, posteriormente, foi renomeada como Xanthomonas campestris pv. viticola (DYE, 1978). A doença também foi identificada em 1984 na cultivar Thompson Seedless em Sangli e nos distritos de Solapur, em Maharashtra (PATIL, 1988), onde causou uma perda de 60 a 70% da produção (CHAND & KISHUN, 1990). O segundo relato mundial da bacteriose ocorreu em lavouras de cultivo comercial, no polo Juazeiro, BA – Petrolina, PE (LIMA et al., 1999; MALAVOLTA Jr. et al., 1999a). A Índia e o Brasil permanecem como as únicas fronteiras internacionais da doença, onde causa graves prejuízos (JAMBENAL, 2008). No Brasil, no início do ano de 1998, os sintomas do cancro bacteriano da videira foram detectados, pela primeira vez, em parreirais comerciais do Submédio do Vale São Francisco, doença, até então, desconhecida na região. Na ocasião, plantas de V. vinifera da variedade Red Globe foram coletadas, apresentando sintomas nas folhas, nos ramos, nas ráquis e nas bagas. Os sintomas foram constatados, inicialmente, em plantios novos, com 2 a 3 anos após enxertia, com incidência de até 100% em Red Globe e nas variedades sem sementes, oriundas de ‘Thompson Seedless’. Também foram registrados sintomas do cancro bacteriano em videiras das cultivares Perlette, Itália, Festival, Brasil, Ribier, Piratininga, Patrícia, Catalunha e Benitaka (MALAVOLTA Jr. et al., 2003). Acredita-se que a introdução do cancro bacteriano da videira no Brasil tenha ocorrido em 1996 ou 1997, com a utilização de material propagativo infectado originário da Índia (ROBBS & RODRIGUES NETO, 1999; LIMA et al., 1999; MALAVOLTA Jr. et al., 1999a; ARAÚJO, 2000). Estudos mostraram que as estirpes brasileiras e o isolado tipo NCPPB 2475, da Índia, são altamente 20 relacionados geneticamente, indicando uma origem comum, em acordo com a hipótese da introdução (TRINDADE et al., 2005). Segundo Freire & Oliveira (2001), o patógeno foi introduzido inadvertidamente por produtores do Submédio do Vale São Francisco, diretamente da Índia, por meio de estacas contaminadas da variedade Red Globe contaminada. O segundo relato desta doença no Brasil ocorreu no município de Teresina, PI, em maio de 1998. Os sintomas, desta vez, foram observados em ramos e folhas das variedades Red Globe, Itália e Ribier (MALAVOLTA Jr. et al., 1999b). Em 1999, a doença já havia sido disseminada nos municípios de Petrolina e Santa Maria da Boa Vista, PE; Curaçá, Casa Nova, Juazeiro e Sento Sé, BA e Teresina, PI. Em 2001, a doença já havia chegado ao município de Jaguaruana, CE, infectando plantas de ‘Red Globe’, ‘Flame Seedless’ e ‘Festival’ (FREIRE & OLIVEIRA, 2001). Em 2006, foi confirmada a presença do cancro bacteriano em Boa Vista, RR e no município de Formosa, GO (HALFELD-VIEIRA & NECHET, 2006; JUNQUEIRA et al., 2006). O último relato oficial do cancro bacteriano da videira ocorreu em agosto de 2010, em Tatuí, SP, demonstrando, mais uma vez, a capacidade de disseminação da bactéria. A região foi mantida em inspeção por fiscais fitossanitários da Coordenadoria de Defesa Agropecuária de São Paulo, sob a supervisão do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento e todas as videiras com sintomas da doença foram eliminadas (BRASIL, 2011). 2.2.2. Etiologia A etiologia do cancro bacteriano foi esclarecida por meio do isolamento do agente causal, a partir de amostras de V. vinifera, variedade Red Globe, coletadas em cultivos comerciais no Submédio do Vale do São Francisco. Em seguida, foram realizados testes bioquímicos, culturais, fisiológicos e de patogenicidade. Por meio destes testes o agente causal foi identificado como X. campestris pv. viticola (MALAVOLTA Jr. et al.,1999a; LIMA et al.,1999). Xcv apresenta células em forma de bastonetes Gram-negativos, medindo 0,6 x 1,2-2,5 µm, não encapsulados e possuem um flagelo polar. 21 Produz colônias arredondadas, brilhantes com bordos lisos e de coloração esbranquiçada em xantomonadina – meio ágar-nutritivo, pigmento devido característico das à não produção bactérias do de gênero Xanthomonas (NAYUDU, 1972; CHAND & KISHUN, 1990b). Seu crescimento ótimo em meio de cultura ocorre entre 27 e 29°C, pH 7,5 e concentração de até 3% de NaCl. Não utiliza nitrato como fonte de nitrogênio, mas cresce bem em sais de amônio e ácido glutâmico, embora seu crescimento seja melhor em caseína hidrolisada (NASCIMENTO et al., 2005). Nayudu, em 1972, realizou os testes: vermelho de metila; do indol; de Voges-Proskauer; urease; oxidase; uso de asparagina como única fonte de nitrogênio e carbono; redução de nitrato a nitrito e produção de acetoína, que foram negativos para a bactéria em estudo. Realizou, também, os testes para produção de catalase e hidrólise de amido e gelatina que apresentaram resultados positivos. O teste de hipersensibilidade foi positivo em folhas de tomateiro ‘Santa Clara’, mas negativo em fumo (LIMA et al.,1999; MALAVOLTA et al., 1999), confirmando a identificação de Xcv. 2.2.3. Sintomatologia Os sintomas do cancro bacteriano da videira aparecem, preferencialmente, em épocas de alta umidade e elevadas temperaturas, períodos em que a infecção é mais intensa. Em plantas infectadas, os sintomas manifestam-se, inicialmente, nas folhas, como pontos necróticos de 1 a 2 mm de diâmetro, com ou sem halos amarelados, podendo aparecer próximos às nervuras ou espaçados na superfície foliar e evoluem para manchas angulares escuras, algumas vezes, coalescendo e causando crestamento e morte de extensas áreas do limbo foliar (Figura 1). Nas nervuras e pecíolos das folhas, ramos (Figura 2) e ráquis dos frutos, formam-se manchas escuras alongadas, que evoluem para fissuras longitudinais de coloração negra, conhecidas como cancros. As bagas são desuniformes em tamanho e cor, podendo apresentar lesões necróticas e, quando severamente afetadas, são pequenas e murchas, em decorrência da necrose da ráquis e dos pedicelos. Nesse estágio, as folhas se tornam amareladas e caem. A presença de cancros na ráquis e bagas 22 favorece, ainda, a proliferação de patógenos secundários, aumentando a incidência de podridões de cachos. Alcançando o sistema vascular da planta, a bactéria assume caráter sistêmico. Os sinais da doença podem ser visualizados na forma de descoloração vascular, em pequena extensão próximo aos cancros (NAYUDU, 1972; NASCIMENTO et al., 2000; LOPES, SANTOS, M.M. , 2012. 2006; LIMA et al, 2009). SANTOS, M.M. , 2012. Figura 1. Sintomas do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola na cultivar Red Globe, observados pelas manchas localizadas nas nervuras e no limbo foliar. Figura 2. Sintomas do cancro bacteriano da videira causado por Xanthomonas campestris pv. viticola na cultivar Red Globe, observados no pecíolo foliar. 2.2.4. Diagnose O diagnóstico do cancro bacteriano da videira é feito com base nos sintomas observados nas folhas, cachos e caules, seguido pelo isolamento bacteriano e identificação por meio de testes bioquímicos, nutricionais e de patogenicidade (LIMA et al., 1999; MALAVOLTA Jr. et al., 1999a). 23 Para o isolamento de Xcv, Peixoto & Mariano (2006) desenvolveram um meio de cultura semisseletivo, o NYDAM (extrato de carne 3 g.L-1, peptona 5 g.L-1, glicose 10 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1, ágar 18 g.L-1, ampicilina 0,1g.L-1), que impede o crescimento de bactérias epifíticas, como Mycobacterium barkeri, sempre presentes nos isolamentos e citadas desde os trabalhos de Chand & Kishum (1990). Esse meio favorece o crescimento e desenvolvimento de Xcv, facilitando, assim, o isolamento bacteriano e a identificação da doença. A utilização dos métodos de isolamento, dos testes bioquímicos e da patogenicidade para a detecção e identificação de Xcv em partes de plantas de videira e/ou material propagativo, quer sintomática ou não, é um processo demorado. Diante disso, Araújo et al. (2005) desenvolveram anticorpos policlonais para Xcv que são usados para diagnóstico sorológico pelo método Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) indireto e para imunomarcação a partir de amostras de folhas e ramos de videira infectados. Os anticorpos mostraram-se altamente reativos e específicos para o patovar viticola e a imunomarcação confirmou a presença da bactéria em amostras sintomáticas e assintomáticas por meio de microscopia eletrônica de transmissão. A diagnose do cancro bacteriano também pode ser realizada por métodos moleculares. Trindade et al. (2005) verificaram que 41 estirpes de Xvc, caracterizadas pelo método molecular de rep-PCR (REP, ERIC e BOX), apresentaram presença de bandas diagnósticas e um padrão de bandas distintos de outras patovares do gênero Xanthomonas. Em 2007, os mesmos autores, desenvolveram um método molecular para detecção de Xcv, em tecidos vegetais, com a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A bactéria não foi detectada diretamente por PCR a partir do macerado de tecidos de videira infectados e sintomáticos, mas, a detecção foi possível após o enriquecimento em meio de cultura, numa etapa anterior à PCR, a partir de tecidos sintomáticos. O tempo total necessário para a detecção e identificação de Xcv por PCR foi de 3 a 4 dias, o que é uma vantagem do método, quando comparado com as técnicas convencionais. Pelo menos 10 dias são 24 necessários para isolamento e a identificação por testes bacteriológicos e de patogenicidade tradicionais. Porém, os autores ainda não recomendam a técnica para detecção a partir de amostras assintomáticas ou de hospedeiros alternativos. 2.2.5. Disseminação A disseminação de Xcv ocorre a partir de restos culturais de videira infectados presentes nos parreirais, que constituem importante fonte de inóculo e de sobrevivência da bactéria. Os restos culturais podem ser transportados em veículos, contentores e aderidos a roupas. As operações de desbaste, desbrota, poda, torção de ramos e raleio de cachos também disseminam as bactérias devido às injúrias causadas as plantas. Essas injúrias, além das aberturas naturais, são um dos principais sítios utilizados pela bactéria para penetração e infecção dos tecidos vegetais (ARAÚJO, 2001; LOPES, 2006). Após a penetração, a bactéria se multiplica rapidamente, colonizando os espaços intercelulares e atingindo o sistema vascular, sendo transmitida a todos os órgãos da planta (NASCIMENTO& MARIANO, 2004). Em condições de elevada precipitação pluviométrica, associada a fortes ventos, ocorrem lesões no limbo foliar e outros tecidos tenros da videira, o que facilita à penetração da bactéria, e a ocorrência de temperaturas elevadas contribui para o seu crescimento acelerado (LIMA, 2003). A irrigação também atua disseminando a bactéria, por meio dos respingos. Essa disseminação é potencializada quando ocorre exsudação bacteriana na planta. As gotas de água dissolvem os aglomerados bacterianos, presentes nos tecidos doentes da planta, e se fragmentam, formando gotículas bem menores que ficam em suspensão no ar. Pela ação do vento, são depositadas nos órgãos da própria planta ou carreadas para plantas vizinhas, resultando em uma inoculação natural (LIMA & MOREIRA, 2002; ROMEIRO, 2005). À longa distância, Xcv também pode ser disseminada pela aquisição de mudas ou bacelos infectados (ARAÚJO, 2001). 25 2.2.6. Sobrevivência Romeiro (2005) relatou que as bactérias que incitam doenças em plantas de interesse econômico sobrevivem, dependendo da espécie considerada, associadas às sementes, partes propagativas, órgãos vegetais, restos culturais, epifiticamente ou endofiticamente em planta cultivadas ou de plantas espontâneas. Segundo Leben (1981), uma das principais formas de sobrevivência das fitobactérias é a fase hipobiótica, condição em que sobrevivem dentro de tecidos infectados de difícil decomposição. Muitas bactérias podem, também, permanecer latentes no tecido hospedeiro, como mecanismo de sobrevivência, e, estrategicamente, aguardam até que o hospedeiro seja enfraquecido por condições desfavoráveis do meio para iniciar o processo de infecção e desenvolvimento da doença (VALE et al, 2004). A bactéria exerce parte do seu ciclo numa fase residente, em que populações desta se multiplicam na superfície das plantas hospedeiras sem infectá-las, constituindo fonte de inóculo na ausência da doença (ROMEIRO, 2005). Esse mecanismo de multiplicação e sobrevivência epifítica já era citado por Chand et al. (1999), como um mecanismo adaptativo de Xcv, exibido na espera por condições favoráveis à infecção no hospedeiro. Xcv tem a capacidade de sobreviver de um ciclo para outro em videiras, bacelos e mudas infectadas, epifiticamente em folhas e ramos de videiras assintomáticas (ARAÚJO, 2001); em restos culturais (NASCIMENTO et al., 2000), e em hospedeiras alternativas (PEIXOTO et al., 2007): Em restos de poda de videira infectados a bactéria pode sobreviver, durante, pelo menos, 80 dias do ciclo da cultura, constituindo fonte de inóculo primário para plantas sadias (SILVA et al., 2009). Nascimento et al. (2005), observaram que, em condição de laboratório (25ºC), este patógeno foi capaz de sobreviver por até 150 dias, em folhas de videira herborizadas. Xcv também consegue infectar outras espécies vegetais que apresentem afinidade, por vezes exibindo sintomas semelhantes ou não aqueles observados em videira. Nayudu (1972) já citava, em seu trabalho, a 26 possibilidade de outras espécies vegetais atuarem, em condições naturais, como um nicho alternativo do patógeno e fonte inóculo nos parreirais. A mangueira e o nim, na Índia, são exemplos que confirmam essa observação. Em condições adversas do ambiente, as fitobactérias têm a capacidade de sobreviver, epifiticamente no hospedeiro, sem causar doença ou de encontrar hospedeiras alternativas. Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae foi encontrada epifiticamente em 50% das principais plantas daninhas presentes em pomares de manga na Índia (RAM et al.,1994). Robinson et al. (2006) verificaram que Xanthomonas campestris pv. vitians (Brown) sobrevivia em alface, tomate, pimentão, beterraba e, também, nas principais plantas daninhas encontradas em campos de produção na Califórnia/EUA, utilizando essas plantas como hospedeiras alternativas. Kurozawa e Pavan (2005) também descreveram a sobrevivência de Xanthomonas vesicatoria (Doidge) em Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Datura spp., Digitaria sanguinalis, Portulaca oleraceae, Setaria glauca, Solanum nigrum e Physalis spp., sendo plantas hospedeiras potenciais na sobrevivência de forma epifítica da bactéria em culturas de tomateiro. 2.2.7. Hospedeiras alternativas Na Índia, segundo Desai et al. (1966) e Nayudu (1972), Xcv além de infectar a videira, também infecta naturalmente plantas de nim (Azadirachta indica A. Juss e Phyllanthus maderaspatensis L. com sintomas semelhantes àqueles observados em V. vinifera. No Brasil, Xcv foi capaz de infectar, por meio de inoculação artificial, mangueira (Mangifera indica L.), cajueiro (Anacardium occidentale L.), cajámanga (Spondias dulcis G. Forst.), umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda) e aroeira (Schinus terebenthifolius Raddi), resultando em infecções características. Contudo, infecções naturais não foram registradas nessas espécies (ARAÚJO et al., 1999). 27 Também, a partir de inoculações artificiais, Peixoto et al. (2007) observaram sintomas típicos do cancro bacteriano em plantas espontâneas como erva-de-santa-luzia [Chamaesyce hirta (L.) Millsp.], capim-pé-de-galinha [Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd], capim-meloso (Eragrostis pilosa P. Beauv.), quebra-pedra rasteiro (Euphorbia prostata) e madrepérola (Pilea sp.). Por outro lado, Braga e Ferreira (2000) não observaram sintomas da doença quando, artificialmente, inocularam a bactéria em plantas de fumo, cebola, tomate, beterraba, cenoura, repolho, pepino, soja, feijão e alface. No Submédio do Vale São Francisco, Peixoto et al. (2007) realizaram de levantamento do cancro bacteriano da videira e observaram infecção natural de Xcv em plantas espontâneas como apaga-fogo (Alternanthera tenella Colla), bredo (Amaranthus sp.), soja-perene (Glycine sp.), fedegoso (Senna obtusifolia L.), melão-de-são-caetano (Mormordica charantia L.) e Phyllanthus sp. Moreira et al. (2006) observaram plantas de nim com lesões necróticas e, a partir do isolamento, conseguiram obter a bactéria em cultura pura. Desta forma, nas condições climáticas do Submédio do Vale do São Francisco, o nim é uma hospedeira alternativa do patógeno, podendo servir como fonte de inóculo potencial já que é muito utilizado como quebra-vento (NASCIMENTO et al., 2001). A infecção desta planta por Xcv leva a manchas foliares e cancros em ramos e pecíolos, sintomas semelhantes aos observados em videira (LIMA & MOREIRA 2002). Robbs & Neto (1999), também levantaram a possibilidade de um ciclo epifítico de Xcv em mangueiras, devido às semelhanças na sintomatologia e epidemiologia entre Xcv e X. campestris pv. mangiferaeindicae. 2.2.8. Estratégias de controle O controle do cancro bacteriano da videira é complexo por causa da ausência de produtos registrados específicos (GAVA, 2006). O controle desta doença deve ser realizado de forma preventiva, com compostos cúpricos e calda bordalesa, logo após a poda, a brotação, e quando ocorrerem ferimentos nas plantas. Ensaios com termoterapia de bacelos, indutores de resistência e antibióticos podem ser alternativas de manejo da doença para as regiões 28 produtoras (MALAVOLTA Jr. et al., 1999a; LOPES, 2006). Porém, o uso exclusivo de compostos à base de cobre nem sempre é efetivo, por causa da existência de estirpes de Xcv que apresentam variabilidade na tolerância ao cobre (MARQUES et al., 2009). Isso torna o uso contínuo destes produtos químicos no Submédio do Vale do São Francisco pouco promissor no manejo da doença, em médio prazo, podendo levar a seleção e dominância das estirpes mais tolerantes na população bacteriana (LIMA et al., 2009; MARQUES et al., 2009). Medidas preventivas são recomendadas para interferir no ciclo da bactéria, sua sobrevivência e disseminação. Segundo a Instrução Normativa nº 09 de 20 de abril de 2006, para as medidas de prevenção e controle de Xcv é necessário que todo o material resultante das podas de produção seja retirado da área e queimado; o produtor deve vistoriar, periódicamente, o talhão com o objetivo de detectar a presença da bactéria; todo material com sintoma deve ser retirado e incinerado. Durante o período chuvoso, nos talhões plantados com variedades suscetíveis, deve ser realizado o controle químico a partir do início das brotações, com produtos recomendados. As podas em variedades altamente suscetíveis não deverão ser feitas durante o período chuvoso e, deve-se, ainda, eliminar as plantas que sejam hospedeiras alternativas dessa bactéria (LIMA, 2002; BRASIL, 2006; PEIXOTO et al., 2007). A eficácia do controle químico do cancro bacteriano da videira, pela pulverização das plantas com produtos bactericidas, tem sido de pouca magnitude nos parreirais, devido à baixa eficiência dos produtos usados. Pesquisas desenvolvidas evidenciam a ineficácia das pulverizações dos produtos à base de cobre no controle da doença. Os isolados brasileiros de Xcv diferem em sua sensibilidade ao sulfato de cobre, e cepas mais tolerantes ocorrem naturalmente em vinhedos nos estados de Pernambuco e Bahia (MARQUES et al., 2009). O uso contínuo de compostos cúpricos como uma das medidas adotadas para prevenir a disseminação da doença, pode ter levado à seleção dessas estirpes mais tolerantes (ARAÚJO, 2001). Por esse motivo, a utilização de métodos alternativos de controle, entre os quais se inclui 29 o uso de produtos naturais com atividade antimicrobiana, vem sendo pesquisada. 2.3. Óleos essenciais no controle alternativo de doenças de plantas Um dos enfoques da agricultura moderna é o controle alternativo de doenças, o qual inclui o controle biológico, a indução de resistência em plantas e o uso de produtos naturais com atividade antimicrobiana (SCHWAN et al., 2003). Dentre os produtos naturais com atividade antimicrobiana, os óleos essenciais vêm tendo grande interesse na investigação das suas propriedades químicas e farmacológicas (SILVA et al., 2003; BARBOSA, 2006). Em muitos casos, estas substâncias servem como mecanismo de defesa da planta contra micro-organismos, insetos e herbívoros (SCHULTES, 1978). Os óleos essenciais estão sendo considerados como uma alternativa importante no controle microbiano em plantas. De origem natural, são seguros para o ambiente, pois apresentam menor risco de promover resistência microbiana, já que são misturas de vários compostos que apresentam diferentes ações antimicrobianas (DAFERERA et al., 2003). Vários trabalhos vêm sendo realizados, buscando demonstrar o potencial da utilização dos óleos essenciais no controle de fitopatógenos (ARRAS & USAI, 2001; GADELHA et al., 2003; SILVA et al., 2004; AMORIM et al, 2011; NETO et al., 2012). Os constituintes dos óleos essenciais variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre. Na mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes concentrações; normalmente um deles é o composto majoritário, existindo outros em menores teores e alguns em baixíssimas quantidades (SILVA et al., 2003). As combinações de um grande número de compostos presentes nos óleos essenciais confere atividades biológicas de interesse, tais como: inseticida, herbicida e ação antimicrobiana (PRABUSEENIVASAN et al., 2006). 30 Estudo realizado por Bergonzelli et al. (2003) identificou 16 óleos essenciais, disponíveis comercialmente, que apresentavam atividade antiHelicobacter, in vitro. Os constituintes puros de alguns desses óleos essenciais mostraram a presença dos compostos carvacrol, isoeugenol, nerol, citral e sabineno, mostrando forte poder de inibição de Helicobacter pylori. Vários trabalhos têm mostrado que extratos e óleos inibem o crescimento de fitopatógenos in vitro, incluindo bactérias. Vigo-Schultz et al. (2005) relataram a atividade de extratos alcoólicos de erva-cidreira, alecrim e guaco in vitro sobre o crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith). Oliveira et al. (2010), trabalhando com óleo, extratos vegetais e sais sobre bactérias fitopatogênicas, obtiveram a inibição do crescimento de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Doidge e X. campestris pv. campestris Pammel com extratos de hortelã. O crescimento dessas bactérias, e de Pectobaterium carotovorum subsp. carotovorum Jones, também foi inibido com extratos de alho. O óleo essencial e extrato de pimenta-longa (Piper aduncum L.) e extrato etanólico de comigo-ninguém-pode (Dieffenbachia picta Schott) apresentam capacidade de inibição do crescimento de Ralstonia solanacearum (Smith) (VÉRAS & YUYAMA, 2001; VÉRAS et al., 2002). 2.3.1. Óleo essencial de Lippia O gênero Lippia inclui aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e árvores de pequeno porte, sendo caracterizado pela presença de óleos essenciais com atividade antimicrobiana, em cuja constituição, substâncias como timol e carvacrol estão presentes. Segundo estudos realizados por Goodmam e Gilman (1978), o óleo de Lippia sidoides Cham, constituído de timol (50 a 60%) e carvacrol (5 a 8%), apresenta efeito bactericida sobre espécies de fungo do gênero Penicilium. Estudos realizados por Leal et al. (2003) também verificaram que este óleo apresenta atividade antibacteriana, no controle de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Streptococcus mutans, Corynebacterium xerosis, e antifúngica a Candida albicans, Trichophyton rubrum e T. interdigitale, dentre outros. 31 Os óleos de Lippia alba (Mill) N.E.Br. mostraram-se com atividade antimicrobiana sobre bactérias de interesse clínico, principalmente aquelas Gram positivas (ALEA et al., 1997). Segundo trabalho realizado por Oliveira (2000), esses óleos também apresentavam efeito inibidor sobre o fungo Geotrichum spp. Os óleos mostraram-se altamente efetivo no controle da germinação de teleosporos de Ustilago scitaminea Sydow e conídios de Colletotrichum falcatum Went e de Curvularia lunata Wakker, apresentando efeito superior a fungicidas comerciais no controle de fungos patogênicos de plantas (RAO et al., 2000). O alecrim da chapada (Lippia gracillis Schauer) é um subarbusto pouco ramificado, com folhas aromáticas e altura variando de 1,2 a 3,0 m. É encontrado na região Nordeste no município de Piripiri-PI, nas proximidades do Parque Nacional de Sete-Cidades (MATOS, 1998; MATOS et al., 2004). É uma planta rica em óleo essencial, cuja composição é constituída pelo timol (10%) e carvacrol (41,7%) (RASSOLI & MIRMOSTAFA, 2003; ALBUQUERQUE, 2005). O óleo de L. gracilis apresenta elevada atividade antimicrobiana e antifúngica (Matos et al., 1999). Segundo Albuquerque et al. (2006), este óleo é eficiente na inibição de algumas bactérias que comumente causam contaminação em laboratórios de cultura de tecidos de plantas, tais como Salmonella sp., Klebsiella pneumoniae e Bacillus cereus. Também mostrou atividade antifúngica contra Geotrichum candidum White, Aspergillus flavus, Curvularia lunata e Aspergillus niger. A determinação da atividade biológica desses compostos, com referência ao efeito antimicrobiano, poderá contribuir para o desenvolvimento de novos defensivos agrícolas, fundamentais para o manejo de doenças de plantas, minimizando o aparecimento de micro-organismos resistentes, bem como a contaminação do ambiente. 32 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBUQUERQUE, C. C. Ação do óleo essencial Lippia gracilis Schauer sobre fungos contaminantes do ar e bactérias endofíticas cultivadas de helicônias in vitro. 85 p. Tese (Doutorado em Botânica)-Universidade Federal Rural de Pernambuco, Pernambuco. 2005. 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Assim, os objetivos desse estudo foram: a) identificar plantas espontâneas hospedeiras de Xcv, b) testar plantas de interesse comercial e de uso como quebra-vento, cultivadas na região, para verificar seu potencial como hospedeiras alternativas de Xcv e c) estudar a eficácia do óleo essencial de L. gracilis, na inibição do crescimento “in vitro” de Xcv. 44 CAPÍTULO I IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola 45 IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS HOSPEDEIRAS ALTERNATIVAS DE Xanthomonas campestris pv. viticola Morgana Mateus Santos1; Ana Rosa Peixoto1; Esmailly de Sousa Pessoa1; Marco Aurélio Gama2; Rosa Lima Ramos Mariano2; Maria Angélica Guimarães Barbosa3. 1 Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia, CEP 48900-000, Juazeiro, BA, email: [email protected], 2 Departamento de Agronomia, Área de Fitossanidade, Universidade Federal Rural de Pernambuco, CEP 521713 030, Recife, PE. EMBRAPA- Semiárido, Cx. Postal 23, CEP 56302-970, Petrolina, PE RESUMO Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv), agente causal do cancro bacteriano da videira, sobrevive em hospedeiras alternativas, plantas infectadas e epifiticamente em órgãos da parte aérea. O presente trabalho teve como objetivo investigar possíveis hospedeiras alternativas do patógeno, visando fornecer subsídios para o manejo da doença. Foram testadas 26 espécies vegetais, entre elas, oleráceas, espécies espontâneas e quebra vento, comumente encontradas nos parreirais, nas quais inoculou-se o patógeno na concentração de 10 8 UFC/mL pelo método de fricção por dupla gaze, em condições de casa de vegetação, no DTCS/UNEB, Juazeiro, BA. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 27 tratamentos e cinco repetições. A suscetibilidade das plantas ao isolado de Xcv foi avaliada pelas variáveis epidemiológicas: período de incubação (PI) e incidência da doença (INC). Após a observação dos sintomas de Xcv nas espécies citadas, realizaram-se os Postulados de Koch nas mesmas, bem como em mudas de videira ‘Thompson seedless’. O isolado de Xcv 3, utilizado nos testes e obtido de cada hospedeiro alternativo foi identificado molecularmente, utilizando-se a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) com iniciadores (“Primers”) específicos, na Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE. Nas espécies inoculadas, os menores PI foram observados em Glycine sp.(2,6 dias) e Senna obtusifolia (3 dias). Os maiores valores de incidência da doença, iguais a 100%, foram verificados em Glycine sp., S. obtusifolia, 46 Desmodium discolor, Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanum licopersicum e Vigna unguiculata. Os menores valores de INC foram observados em Leonotis nepetifolia, Tridax procumbens e Mormodica charantia com 50, 60 e 40%, respectivamente. As espécies da família Poaceae, Bidens pilosa, Emilia fosbergii, Praxelis pauciflora, Macroptilium lthyroides e Portulaca oleracea apresentaram PI=43 dias, não sendo hospedeiras alternativas do patógeno. As amplificações a partir do DNA genômico purificado do isolado de Xcv, com os oligonucleotídeos específicos, resultaram em fragmentos de tamanho esperado de 240pb, confirmando a identidade do isolado testado como X. campestris pv. viticola. Palavras chaves: Sobrevivência; Cancro bacteriano da videira; PCR. ABSTRACT The grapevine bacterial canker caused by Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) survive on alternative hosts, and plants infected epiphytically organs in the aerial part. The present study aimed to investigate possible alternative hosts of the pathogen, to provide data for disease management. Were tested 19 species of weeds commonly found in vineyards, six species of vegetables grown in sub-medium San Francisco and Azadirachta indica, in which the pathogen was inoculated at a concentration of 10 8 CFU / mL by the method of friction pair gauze in greenhouse conditions, on the DTCS / UNEB, JuazeiroBA. The susceptibility of plants to isolate Xcv was evaluated by epidemiological parameters: incubation period (IP) and disease incidence (DI). After observing the symptoms of Xcv in the species mentioned, were applied the Koch's postulates in the same. The isolated Xcv3, utilized on the tests, obtained from each factitious host was identified molecularly using the PCR (Polymerase Chain Reaction) with primers ("primers") specific in UFRPE, Recife. In the inoculated species, the lowest PI was observed in Glycine sp. (2.6 days) and Senna obtusifolia (3 days). The highest values of disease incidence were observed in Glycine sp., Senna obtusifolia, Desmodium discolor, Amaranthus deflexus, Azadirachta indica, Solanum and Vigna unguiculata licopersicun that showed 100% INC. The lowest values of DI were observed in Leonotis 47 nepetifolia, Tridax procumbens and Mormodica charantia with 50, 60 and 40%, respectively. The species of the family Poaceae, Bidens pilosa, Emilia fosbergii, Praxelis pauciflora, Macroptilium Lathyroides e Portulaca oleracea showed IP = 42 days, not being alternate hosts of the pathogen. The amplifications from genomic DNA purified from isolated Xcv with the specific primers resulted in the expected size fragments of 240pb, confirming the identity of the isolated tested as Xanthomonas campestris pv. Viticola. Keywords: Survival; Canker bacterial vine, PCR (Polymerase Chain Reaction). INTRODUÇÃO A vitivinicultura vem contribuindo significativamente para o êxito do agronegócio brasileiro de frutas. A região Nordeste participa com 19,7% da produção nacional, sendo o Submédio do Vale do São Francisco o principal centro produtor e exportador de uvas de mesa do Brasil contribuindo, com 93% da produção da região Nordeste (IBGE, 2010). O cancro bacteriano, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv)(Nayudu) Dye, é uma importante doença da videira no Submédio do Vale do São Francisco, com incidência expressiva e causando perdas significativas em cultivares suscetíveis, como Red Globe, Thompson Seedless, Perlette, Itália, Festival, Brasil, Ribier, Piratininga, Patrícia, Catalunha e Benitaka (LIMA et al., 1999; LIMA & MOREIRA, 2002; MALAVOLTA Jr. et al., 2003). Os sintomas aparecem, preferencialmente, em épocas de maior umidade e elevadas temperaturas, que corresponde ao primeiro semestre, na região, manifestando-se nas folhas como pontos necróticos, com ou sem halos amarelados, podendo aparecer próximos às nervuras. Nas nervuras e pecíolos das folhas, ramos e ráquis dos frutos formam-se manchas escuras alongadas, que evoluem para fissuras, conhecidas como cancros (NASCIMENTO et al., 2000; ARAÚJO, 2001). Em condições adversas, as fitobactérias têm a capacidade de sobreviver epifiticamente em hospedeiras alternativas sem causar doença. Segundo Araújo (2001), Xcv tem a capacidade de sobreviver de um ciclo para outro em videiras, bacelos e mudas infectadas; epifiticamente 48 em folhas e ramos de videiras assintomáticas; em restos culturais (NASCIMENTO et al., 2000) e em hospedeiras alternativas (PEIXOTO et al., 2007). Nayudu (1972), mencionou a possibilidade de outras espécies vegetais atuarem em, condições naturais, como um nicho alternativo do patógeno e fonte inóculo nos parreirais. Silva et al. (2012), verificaram que Xcv era capaz de sobreviver em altas populações em restos de poda de videira infectados durante, pelo menos, 80 dias do ciclo da cultura, constituindo fonte de inóculo primário para plantas sadias. Nascimento et al. (2005) observaram que, em condição de laboratório, este patógeno era capaz de sobreviver por até 150 dias em folhas de videira herborizadas. A identificação de plantas hospedeiras alternativas de fitopatógenos em patossistemas agrícolas é um dos principais passos para a construção de propostas de manejo para o controle das doenças. Assim, os objetivos desse estudo foram: a) identificar plantas espontâneas hospedeiras de Xcv, e b) testar plantas de interesse comercial e de uso como quebra-vento, cultivadas na região, para verificar seu potencial como hospedeiras alternativas de Xcv. MATERIAL E MÉTODOS Foram realizadas visitas técnicas às fazendas produtoras de uvas, nos municípios de Juazeiro, BA e Petrolina, PE, registradas na ADAB (Agência Estadual de Defesa Agropecuária da Bahia) e ADAGRO (Agência de Defesa e Fiscalização Agropecuária de Pernambuco), com incidência do cancro bacteriano. Realizaram-se coletas de folhas e ramos de videira com sintomas da doença. Todo material sintomático coletado foi levado para o Laboratório de Fitopatologia do Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais – DTCS III da Universidade do Estado da Bahia, Juazeiro, BA, para isolamento do patógeno. Para isto utilizou-se a metodologia de Mariano e Silveira (2000), a partir de tecidos com lesões típicas da doença, preferindo-se os cancros dos ramos e pecíolo. A suspensão obtida foi plaqueada pelo método de estrias (MARIANO & SILVEIRA, 2000) em meio semi-seletivo de ágar nutritivo-dextrose-extrato de levedura e ampicilina (NYDAM) (NASCIMENTO et al., 2006). Os isolados foram 49 preservados em água destilada e esterilizada (ADE) (NASCIMENTO et al., 2005) para realização dos Postulados de Koch, com concentração da suspensão de Xcv ajustada em fotocolorímetro para A570 = 0,4 de absorbância (108 ufc/ml), conforme proposto por Nascimento et al. (2005). Inoculação artificial de Xanthomonas campestris pv. viticola nas espécies testadas Coletaram-se sementes de 19 espécies de plantas espontâneas, comumente encontradas nas áreas de produção de videira, para a realização da inoculação artificial de Xcv. Foram também testadas cinco espécies de plantas de interesse comercial e uma espécie de quebra-vento, comumente cultivadas no Submédio do Vale do São Francisco (Tabela 1). As sementes das 26 espécies citadas foram plantadas em sacos de polietileno (capacidade para 500g) com substrato 2:1:2 (Argila; areia; esterco) esterilizados em autoclave a 120ºC, por duas horas. Vinte dias após a emergência, essas espécies foram inoculadas artificialmente com Xcv pelo método de fricção com dupla gaze (NASCIMENTO et al., 2005). Compressas de gaze dobradas foram umedecidas com a solução bacteriana diluída em ADE, contendo Tween 20 (0,05%). Foram inoculadas cinco folhas por planta. Mudas de videira ‘Thompson seedless’ foram utilizadas como padrão de suscetibilidade (NASCIMENTO et al.,2006), e como as demais espécies testadas, foram submetidas à pré e pós-tratamento em câmara úmida por 48 horas (NASCIMENTO et al.,2005) e incubadas em condições de casa de vegetação, com temperatura e umidade relativa em torno de 30ºC e 75%, respectivamente. As avaliações tiveram início 48 horas após a inoculação artificial. As plantas foram avaliadas, diariamente, até os 42 dias da inoculação, por meio dos componentes epidemiológicos do cancro bacteriano: Período de incubação (PI) e Incidência da doença aos 42 dias após a inoculação (INC). 50 TABELA 01. Espécies vegetais inoculadas artificialmente com Xanthomonas campesris pv. Vitícola para determinação de hospedeiras alternativas da bactéria. Tratamentos Família Nome científico Nome comum T1 Amaranthaceae Amaranthus deflexus L. Bredo T2 Asteraceae Bidens pilosa DC. Picão-preto T3 Asteraceae Eclipta alba (L.) Hassk. Erva-de-botão T4 Asteraceae Emilia fosbergii Nicolson Falsa-emília T5 Asteraceae Praxelis pauciflora (Kunth) Couve-cravinho T6 Asteraceae Tridax procumbens L. Erva-de-touro T7 Cucurbitaceae Mormodica charantia L. T8 Lamiaceae Leonotis nepetifolia (L.) R. Br. Melão-de-sãocaetano Cordão-de-frade T9 Fabaceae Desmodium discolor Vogel Amor-agarradinho T10 Fabaceae Feijão miúdo T11 Fabaceae Macroptilium Lathyroides (L.) Urb Glycine sp. T12 Fabaceae Fedegoso T13 Poaceae Senna obtusifolia (L.) Irwin & Barneby Chloris barbata (L.) Swartz T14 Poaceae Setaria geniculata P. Beauv. T15 Poaceae Eluesine indica (L.) Gaertn T16 Poaceae T17 Poaceae Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd Digitaria horizontalis Willd. Capim rabo-degato Capim pé-degalinha Capim mão-desapo Capim-colchão T18 Poaceae Cenchrus echinatus L. Capim-carrapicho T19 Portulacaceae Portulaca oleracea L. Beldroega T20 Fabaceae Vignia unguiculata(L.) walp. Feijão-de-corda T21 Alliaceae Allium cepa L. Cebola T22 Meliaceae Azadirachta indica A. Juss. Nim T23 Solanaceae Solanum licopersicum Tomate IPA 6 T24 Cucurbitaceae Cucumis melo L. Melão T25 Cucurbitaceae Melancia T26 Cucurbitaceae Citrullus lanatus (Thunb.) & Nakai Curcubita pepo L. Soja perene Pé-de-galinha Abóbora 51 As avaliações foram feitas diariamente quanto ao PI, representado pelo número de dias entre a inoculação e o surgimento dos sintomas. Plantas que não apresentaram sintomas da doença tiveram o PI ajustado para 43 dias, correspondendo ao período de avaliação total acrescido de um dia, conforme proposto por Iamsupasit et al. (1993). A INC de folhas com sintomas, aos 42 dias após a inoculação, foi calculada pela porcentagem de folhas com sintomas em relação ao total de folhas avaliadas por planta. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com 27 tratamentos e cinco repetições por tratamento. A unidade experimental foi constituída de cinco folhas inoculadas. Avaliaram-se o período de incubação e a Incidência dos sintomas para a posterior identificação das espécies hospedeiras de Xcv. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Identificação de Xanthomonas campesris pv. viticola por meio de PCR As análises moleculares foram realizadas no Laboratório de Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE. Foi utilizado o isolado de Xcv patogênico, obtido por isolamento a partir das folhas inoculadas nas diferentes espécies testadas e que manifestaram sintomas da doença. Extração e quantificação do DNA genômico A extração do DNA genômico dos isolados que se mostraram patogênicos tanto as hospedeiras alternativas quanto às mudas de videira cv. Thompson seedless foi realizada utilizando-se o kit Axyprep para extração de DNA genômico bacteriano (Axygen Brasil). A quantificação do DNA genômico foi realizada por meio de análise comparativa com o marcador High DNA Mass Ladder (Invitrogen), utilizando-se uma mistura contendo 4 μl do DNA concentrado adicionado a 2 μl de tampão de carregamento (6X DNA Loading Dye, Fermentas Life Sciences) e a 1 μl de 52 Syber® Safe (Invitrogen). A análise foi realizada por meio de eletroforese em gel de agarose a 1% preparado em tampão TBE 0,5X (5,4 g de Tris-base; 2,75 g de ácido bórico e 0,375 g de EDTA, para 1000 ml) por 40 min a 80 V. Posteriormente, o gel foi fotodocumentado e, após a quantificação, as amostras foram diluídas para uma concentração final de 10 ng/μl de DNA sendo armazenadas a -20°C (AUSUBEL et al., 1992). Identificação com iniciadores (“Primers”) específicos A identificação molecular dos isolados foi realizada utilizando-se os “primers” Xcv1F/Xcv3R, de fragmento de 243 pb do gene hrpB (TRINDADE et al., 2005; TRINDADE et al., 2007). As reações de amplificação foram realizadas de acordo com Trindade et al. (2007), sendo compostas por: Master Mix 2X (1X) 0,5 μM de cada “primer” e 200 ng de DNA. Reações livres de DNA foram incluídas nas análises para assegurar a ausência de contaminantes. As amostras foram amplificadas em termociclador modelo MJ96 (Biocycler). Doze microlitros de cada reação de amplificação foram misturados a 3 μl do tampão de carregamento e a 2,5 μl de Syber® Safe, aplicando-se um volume total de 17,5 μl em cada poço do gel. A visualização dos fragmentos amplificados foi realizada em gel de agarose a 1% preparado em tampão TBE 0,5X. A corrida eletroforética foi realizada por 1 h e 10 min a 80 V em tampão TBE 0,5X, utilizando-se como marcadores 100pb-DNA Ladder (GenRulerTM) e 1kb-DNA Ladder (GenRulerTM). O foi gel fotodocumentado em seguida. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inoculação artificial de Xanthomonas campestris pv. viticola nas espécies testadas A partir das 27 diferentes espécies de plantas inoculadas com X. campestris pv. viticola, observou-se a manifestação de sintomas do cancro bacteriano em tomateiro e feijoeiro, nas plantas espontâneas: amor53 agarradinho, bredo, fedegoso, soja-perene, erva-de-touro, cordão-de-frade, melão-de-são-caetano, e no quebra-vento: nim, das quais foram isoladas em meio semi-seletivo NYDAM populações de bactérias semelhantes à Xcv, apresentando colônias arredondadas, coloração esbranquiçada, brilhantes com bordos lisos, células em forma de bastonetes, Gram-negativas. Por outro lado, as espécies testadas, pertencentes às famílias Poaceae, Cucurbitaceae, Portulacaceae e Alliaceae não manifestaram sintomas, não sendo hospedeiras alternativas de Xcv (Tabela 02). Os sintomas observados nas folhas do tomateiro, feijão-de-corda, fedegoso, soja perene, amor-agarradinho, bredo e nim, mostraram-se semelhantes àqueles observados em videira (Figura 01). Os sintomas nas folhas se apresentaram com pontuações minúsculas de coloração amarelada que evoluíram para manchas circulares necróticas com halo amarelado. Nas nervuras, formam-se manchas escuras alongadas, que E B C F G D H SANTOS, M.M. , 2012. A Figura 01: Sintomas observados a partir da inoculação artificial de Xanthomonas campestris pv. viticola nas folhas de videira (A), tomateiro (B), feijão-de-corda, fedegoso(D), soja-perene (E), amor-agarradinho (F), bredo (G) e nim (H) (com camada de abscisão da área lesionada com o avanço da bactéria, superando o mecanismo de defesa da planta). Juazeiro, BA, 2012. 54 evoluem para fissuras (cancros). Resultados semelhantes foram encontrados por Nascimento et al. (2004), que inocularam artificialmente, diferentes espécies de plantas com Acidovorax avenae subsp. citrulli Williems, agente causal da mancha-aquosa do melão. Os autores observaram reprodução dos sintomas da doença em plantas de mamão, melancia, melão, pimentão, maxixe, pepino, abobrinha, tomate e abóbora, comprovando o potencial dessas espécies como hospedeiras alternativas do patógeno. Existem vários trabalhos que relatam a sobrevivência de fitobacterias em hospedeiras alternativas. Gent et al. (2005), por exemplo, observaram população de Xanthomonas axonopodis pv. allii sobrevivendo epifiticamente em alfafa, feijão, lentilha e soja. Já Martins (2007) relatou que Ensete spp., uma planta nativa das regiões tropicais da África, é um hospedeiro alternativo de Xanthomonas campestris. pv. musacearum (Yirgou & Bradbury) Dye. A observação dos sintomas do cancro bacteriano em soja-perene, fedegoso e bredo confirma o que já havia sido citado por Peixoto et al. (2007), que observaram que essas espécies apresentaram infecção natural por Xcv em parreirais comerciais do Submédio do Vale do São Francisco. Estudos realizados por Kurozawa e Pavan (2005) também verificaram a sobrevivência de Xanthomonas vesicatoria (Doidge), agente causal do cancro bacteriano do tomateiro, em plantas espontâneas como Amaranthus retroflexus L., Chenopodium album L., Datura spp., Digitaria sanguinalis (L.) Scop, Portulaca oleraceae, Setaria glauca (Poir.) Roem. & Schult., Solanum nigrum L. e Physalis spp., constituindo-se em importantes fontes de inóculo do patógeno. Também Robinson et al. (2006), estudaram as formas de sobrevivência de Xanthomonas campestris pv. vitians (Brown) Dye e verificaram que plantas de alface, tomate, pimentão e beterraba e as principais plantas espontâneas encontradas em campos de produção na Califórnia/EUA eram hospedeiras alternativas, potenciais fontes de inóculo e de sobrevivência desta fitobactéria. 55 TABELA 02: Interação de Xanthomonas campestris pv. viticola, com espécies vegetais presentes no Semiárido brasileiro. Juazeiro-BA, 2012. Patogenicidade Espécie Videira * + + Família Nome comum Presença de sintomas Isolamento de Xcv Identificação molecular Vitaceae Videira + + Confirmado + + Confirmado + + - np np np np - np np np np + - np - - - np np np np + + Confirmado + + + + Confirmado + + + + Confirmado + + - np np np np + + Confirmado + + + + Confirmado + + + + Confirmado + + - np np - - - np np - - - np np - - - np np - - - np np - - - np np - - - np np - - - np np - - + + Confirmado + + + + Confirmado + + Amaranthaceae Bredo 1 1 Asteraceae Lamiaceae Fabaceae Picão-preto Erva de 1 botão 1 Falsa-emília Couve1 cravinho Erva-de1 touro Cordão-de1 frade Amor1 agarradinho Feijão2 miúdo 1 Soja perene 1 Poaceae Portulacaceae Alliaceae Meliaceae Solanaceae Fedegoso Feijão-decorda Capim pé1 de-galinha Capim rabo1 de-gato Capim pé1 de-galinha Capim mão1 de-sapo Capim1 colchão Capim 1 carrapicho 1 Beldroega 2 Cebola Nim 3 2 Tomate 2 Melão - np np - - 2 - np np - - 2 - np np - - + + Confirmado + + Melancia Cucurbitaceae Abóbora Melão-de1 são-caetano * Teste de patogenicidade realizado na espécie em estudo. 1 Plantas espontâneas encontradas nos parreirais. 2 Espécies de interesse comercial. 3 Quebra-vento. np = não pertinente. 56 As plantas de nim também se apresentaram como hospedeiras alternativas de Xcv, mostrando-se muito suscetíveis, confirmando o relato de Desai et al. (1966). Nayudu (1972), também relatou a possibilidade do nim atuar como fonte adicional de inóculo, principalmente, em áreas onde a videira tivesse sendo introduzida. Moreira et al. (2006) também observaram plantas de nim com lesões necróticas, em condições de campo, das quais obtiveram a bactéria em cultura pura. Além disso, o nim foi hospedeiro suscetível em diversas inoculações artificiais realizadas no Brasil (MALAVOLTA Jr. & ALMEIDA, 2000; NASCIMENTO et al, 2007). O nim também apresentou, com o início da infecção, um mecanismo de defesa conhecido como camada de abscisão, no qual se observou dissolução da lamela média nas células infectadas, resultando na queda do tecido infectado (AGRIOS, 2004), porém o avanço do patógeno foi sempre mais rápido do que o mecanismo de defesa da planta, proporcionando o avanço da doença (Figura 02, H). Os sintomas do cancro bacteriano nas folhas da erva-de-touro, cordão de frade e melão-de-são-caetano se manifestaram como manchas circulares a irregulares, deprimidas e de coloração esbranquiçada, que não são visualizadas em videira (Figura 02). É muito comum encontrar o mesmo patógeno manifestando diferentes sintomas em espécies distintas. Conforme observado por Kimati et al., (2005), os sintomas de Xylella fastidiosa Wells em algodoeiro, mostram-se diferentes daqueles observados em cafeeiro e em A B C SANTOS, M.M. , 2012. citros. Figura 02: Sintomas observados a partir da inoculação artificial de Xanthomonas campestris pv. viticola nas folhas de erva-de-touro (A), cordão-de-frade (B); e melão-desão-caetano (C). Juazeiro, BA, 2012. 57 Em relação ao PI, pode-se observar a formação de três grupos distintos: a soja perene, o fedegoso e a videira apresentaram período de incubação de 2,6; 3,0; 3,8 dias, respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si e diferindo das demais espécies testadas, mostrando-se como as espécies mais suscetíveis à infecção do patógeno. Em seguida, o amor-agarradinho e o tomateiro apresentaram PI de 5,6 e 5,8 dias, respectivamente. Os períodos mais longos foram observados em feijão-de-corda (11,0), nim (12,0), erva-detouro (12,5), melão-de-são-caetano (14,0), bredo (14,5) e cordão-de-frade (15,25) (Tabela 03). Todas as espécies testadas, pertencentes à família Poaceae, bem como picão-preto, beldroega, erva-de-botão, não mostraram falsa-emília, sintomas couve-cravinho, quando feijão-miúdo inoculadas com e Xcv, apresentando PI de 43 dias. Resultados semelhantes foram encontrados por Montovani et al. (2006). Esses autores testaram 31 espécies de gramíneas e observaram que apenas Sorghum bicolor (L.) Moench (sorgo), Zea mays L. (milho) e Avena sativa L. (aveia) apresentaram sintomas quando inoculadas com Xanthomonas sp.. Nascimento et al. (2007) também verificaram que as gramíneas Eragrostis pilosa (L.) P. Beauv (capim barbicha-de-leão) e Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd (capim mão-de-sapo), quando inoculadas artificialmente com Xcv, não manifestaram sintomas. Nascimento et al. (2004) também não observaram sintomas da mancha-aquosa do melão quando inocularam artificialmente o milho 'São José' com Acidovorax avenae subsp. citrulli, agente causal da doença. A incidência da doença causada por Xcv nas plântulas suscetíveis foi máxima (100%) nas Fabaceas, com exceção do feijãomiúdo (0%). O bredo, tomateiro e videira, não diferiram estatisticamente do nim que apresentou 90% de INC. Essas espécies se mostraram muito suscetíveis ao patógeno. A erva-de-touro e o cordão-de-frade apresentaram 60 e 50% de INC, respectivamente (Tabela 03). Dentre as espécies comerciais testadas, o tomateiro e o feijão-de-corda se mostraram como hospedeiras alternativas de Xcv discordando do trabalho realizado por Braga & Ferreira (2000), que não observaram sintomas da 58 doença inoculando-se, artificialmente, a bactéria em plantas de fumo, cebola, tomate, beterraba, cenoura, repolho, pepino, soja, feijão e alface. Neste trabalho, confirmaram-se os resultados obtidos por aqueles autores, TABELA 03 - Período de incubação (PI) e incidência (INC) do cancro bacteriano da videira, em diferentes hospedeiros, causadas por Xanthomonas campestris pv. viticola. Juazeiro-BA, UNEB, 2012. Família Nome comum Vitaceae Amaranthaceae Videira Bredo3 Picão-preto3 Erva-de-botão3 Falsa-emília3 Couve-cravinho3 Erva-de-touro3 Cordão-de-frade3 Amor-agarradinho3 Feijão-miúdo3 Soja perene3 Fedegoso3 Feijão-de-corda4 Pé-de-galinha3 C. rabo-de-gato3 C. pé-de-galinha3 Capim mão-de-sapo3 Capim-colchão3 Capim carrapicho3 Beldroega3 Cebola4 Nim5 Tomate 4 Melão4 Melancia4 Abóbora4 Melão-de-são-caetano3 CV % Asteraceae Lamiaceae Leguminosae Poaceae Portulacaceae Alliaceae Meliaceae Solanaceae Cucurbitaceae PI (Dias)1 3,8 e6 14,2 b 42,0 a 42,0 a 42,0 a 42,0 a 12,25 c 15,25 b 5,6 d 42,0 a 2,6 e 3,0 e 11,0 c 42,0 a 42,0 a 42,0 a 42,0 a 42,0 a 42,0 a 42,0 a 42,0 a 12,0 c 5,8 d 42,0 a 42,0 a 42,0 a 14,0 b 2,13 INC (%)2 100 c6 100 c 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 60,0 b 50,0 b 100,0 c 0,0 a 100,0 c 100,0 c 100,0 c 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 0,0 a 90,0 c 100,0 c 0,0 a 0,0 a 0,0 a 100,0 c 20,92 1 : Período de incubação representado pelo número de dias entre a inoculação e o surgimento da doença. 2 Incidência da doença aos 42 dias após a inoculação 3 Plantas espontâneas encontradas nos parreirais. 4 Espécies de interesse comercial. 5 Quebra-vento. 6 Média seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de significância. 59 verificando-se que plantas de cebola não manifestaram sintomas, quando inoculadas artificialmente com Xcv. Observou-se, ainda, que as plantas de melão, melancia e abóbora também não mostraram sintomas quando inoculadas com Xcv, apresentando PI de 43 dias. Em vista desses resultados, conclui-se que não há impedimento à continuidade do cultivo dessas espécies em áreas próximas ao parrerais. Por outro lado, deve-se evitar o plantio de tomate e feijão-de-corda próximo as áreas de plantio de videiras. Identificação de Xanthomonas campesris pv. viticola por meio de PCR As amplificações a partir do DNA genômico purificado do isolado obtido das diferentes espécies testadas, que manifestaram sintomas da doença, com os oligonucleotídeos específicos, resultaram em fragmentos de tamanho esperado de 243pb quando visualizados em gel de agarose (Figura 03). Os resultados obtidos, juntamente aos Postulados de Koch, confirmam a identidade do isolado como Xanthomonas campestris pv. viticola. O mesmo foi observado para o isolado de Xcv, IBSBF 2738, obtido da coleção da Universidade Federal Rural de Pernambuco que foi utilizado como controle 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 GAMA, M.A. , 2012. 1 Figura 03. Análise eletroforética da amplificação da sequência de 243 pb do gene hrpB do isolado de X. campestres pv. vitícola utilizado neste estudo com os primers Xcv1F/Xcv3R. M = Marcador 1Kb DNA Ladder (GenRulerTM). 1.Cordão-de-frade, 2. Erva-de-touro, 3. Bredo, 4. Nin, 5. Soja, 6. Xcv, 7.Tomate, 8. Feijão-de-corda, 9. Fedegoso, 10. Melão-de-São-Caetano, 11. Amor agarradinho, 12. controle negativo e 13 (IBSBF 2738 - Xanthomonas campestres pv. viticola). 60 positivo do experimento. Utilizando a mesma técnica de PCR, Trindade et al. (2007) permitiram a detecção e identificação da Xcv obtidas de tecidos de videira com manifestação de sintomas do cancro bacteriano. Este método está sendo muito usado para detectar e identificar fitopatógenos, incluindo várias bactérias fitopatogênicas (FATMI et al., 2005; MOLTMANN & ZIMMERMANN, 2005; PARK et al. , 2006). CONCLUSÕES É evidente a importância do estudo das hospedeiras alternativas de Xcv, pois a sobrevivência do patógeno nos parreirais pode estar relacionada aos cultivos de tomateiro e feijão-de-corda em áreas próximas as videiras e as plantas espontâneas como: amor-agarradinho, bredo, fedegoso, soja-perene, erva-de-touro e cordão-de-frade. Não há impedimento à continuidade do cultivo das plantas de melão, melancia e abóbora em áreas próximas aos parreirais. É importante a eliminação de plantas espontâneas comprovadamente hospedeiras alternativas do patógeno, bem como evitar o plantio do nim como quebra-vento ou em áreas próximas aos parreirais. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Universidade do Estado da Bahia – UNEB, à FAPESB pelo fornecimento da bolsa e à EMBRAPA Semiárido, em especial à Doutora Angélica Guimarães, pela parceria e disponibilização de materiais para a realização desse trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGRIOS, G. N. Plant Pathology. 5 ed. San Diego: Academic Press, 922 p. 2004. AUSUBEL, F. M.; BRENT, R.; KINGSTON, R. E.; MOORE, D. D.; SEIDMAN, J. G.; SMITH, J. A.; STRUHL, K. Current protocols in molecular biology. Vol. 1. Greene Publishing Association, New York. 1992. 61 ARAÚJO, J.S.P. Perfil epidemiológico e subsídios para o controle de Xanthomonas campestres pv. viticola (Nayudu) Dye, agente do cancro bacteriano da videira (Vitis vinifera) no Brasil. 2001. 121p. tese (Doutorado em fitotecnia) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro. 2001. BRAGA, J.P. & FERREIRA, M.A.S.V. 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Diante disso, este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia de óleos essenciais de Lippia gracilis, no crescimento in vitro de X. campestris pv. viticola (Xcv). Foram testados oito óleos extraídos de L. gracilis, de diferentes manejos de cultivo: com e sem adubação mineral, adubação orgânica e irrigação, em três dosagens diferentes (200; 250 e 300 ppm), testemunha com o oxicloreto de cobre (controle padrão) e a testemunha absoluta. A suscetibilidade do isolado Xcv3 aos óleos testados foi avaliada na primeira etapa pela presença e ausência do crescimento bacteriano e, na segunda etapa, pela porcentagem de inibição do crescimento bacteriano. A análise da composição química dos óleos essenciais extraídos de L.gracilis por GC/MS e GC/FID, sob diferentes práticas agrícolas, mostrou o carvacrol (73,9 a 77%) como composto majoritário, além de timol (4,9 a 10,3%), ρ-cimeno (1,68 a 3,19%), Éter metil timol (0,46 a 2,36%) e o E-cariofileno (1,33 a 3,85). Os tratamentos referentes aos óleos 01, 06 e 07 foram os que apresentaram maiores porcentagens de inibição no crescimento bacteriano de Xcv, ou seja, 94,75%, 96,50% e 94,02%, respectivamente, sendo superiores ao oxicloreto de cobre (49,6%). Não houve diferença estatística nas dosagens utilizadas dos óleos, com exceção aos óleos 02, 05 e 15. As concentrações que apresentaram as melhores porcentagem de inibição do cresimento bacteriano 67 foi de 300 uL L -1 para os óleos 02 e 05; de 250 uL L -1 para o óleo 15 e de 100 uL L -1 para os óleos 01, 04, 06, 07 e 16, em condições de casa de vegetação e, posteriormente, em campo. Palavras-chaves: Timol, Carvacrol, Ação antimicrobiana, Oxicloreto de cobre, cancro bacteriano. ABSTRACT Xanthomonas campestris pv. viticola, causal agent of bacterial canker of grapevine presents variability in tolerance to copper-based compounds, which makes this product very promising in the management of this disease. Thus, this study was conducted with the aim of assessing the efficacy of essential oil of Lippia gracilis, in vitro growth of X. campestris pv. viticola (Xcv3). Eight were tested oils extracted from L. gracilis grown with and without chemical fertilization, organic fertilization and irrigation in three different doses (200, 250 and 300 ppm), using as check treatment the Copper oxychloride (standard control) and absolute standard. The susceptibility of isolated Xcv3 to the oils tested was evaluated in the first stage through the presence or absence of bacterial growth and in the second stage through the percentage of growth inhibition. The treatments relating to oil 01, 06 and 07 extracted from L. gracilis grown with mineral fertilizer (NPK) and organic fertilization presented the highest percentages of inhibition of bacterial growth in Xcv, 94.75%, 96.50% and 94.02%, respectively, and were superior to copper oxychloride (49 , 6%). There was no statistical difference in the dosages used oils, except the oils 2, 5 and 15. It is recommended to test the use of dosages of 300 uL L -1 oils to 2:05, 250 uL L -1 for oil and 15 uL of 100 L -1 for oils 1,4,6,7 and 16 under conditions of greenhouse and later at the field level. Keywords: Timol, Carvacrol, Antimicrobial action, Copper oxychloride, Bacterial canker. 68 INTRODUÇÃO Dentre as doenças que ocorrem em videira no Submédio do Vale do São Francisco, destaca-se o cancro bacteriano, causado por Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv) (Nayudu) Dye, de grande importância devido sua distribuição nas áreas de produção e as perdas severas que tem ocasionado na produtividade da cultura (LIMA et a.l, 2009). O controle da doença em condições que são favoráveis é considerado difícil. O uso de produtos à base de cobre no manejo desta doença nem sempre é efetivo, devido à existência de estirpes de Xcv que apresentam tolerância a esses compostos (MARQUES et al., 2009). Isso torna o uso contínuo destes produtos químicos, no Submédio do Vale do São Francisco, pouco promissor no manejo da doença, em médio prazo, devido à seleção e dominância de estirpes tolerantes na população bacteriana (LIMA et al., 2009; MARQUES et al., 2009). Um dos enfoques da agricultura moderna é o controle alternativo de doenças, o qual inclui o controle biológico e o uso de óleos essenciais com atividade antimicrobiana (SCHWAN et al., 2003). Vários trabalhos vêm sendo realizados buscando demonstrar o potencial da utilização desses óleos no controle de fitopatógenos (ARRAS & USAI, 2001; GADELHA et al.,2003; SILVA et al., 2005; AMORIM et al, 2011; NETO et al., 2012). O alecrim da chapada, (Lippia gracillis Schauer) é uma planta rica em óleo essencial, constituído pelo timol (10%) e pelo carvacrol (41,7%) que apresenta atividade antimicrobiana (RASSOLI & MIRMOSTAFA, 2003; ALBUQUERQUE, 2005;). Goodmam e Gilman (1978) observaram que o óleo de Lippia sidoides Cham, constituído de timol (50 a 60%) e carvacrol (5 a 8%), apresentou efeito fungicida sobre espécies de Penicilium. Leal et al. (2003) também verificaram que este óleo demostrou atividade antimicrobiana, no controle das bactérias de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Streptococcus mutans, Corynebacterium xerosis, e dos fungos Candida albicans, Trichophyton rubrum e T. interdigitale, dentre outros. 69 A utilização de adubação orgânica com esterco de aves maximizou o rendimento de óleo essencial de Origanum vulgare L., mostrando que a aplicação de esterco, aumentava a produção de hidrato de trans-sabineno. Porém se o interesse for a produção de timol, deve-se evitar a aplicação de adubos orgânicos (CORRÊA et al., 2010). Trabalho realizado por Rodrigues et al., (2004) também evidenciou que a adubação química com fósforo proporcionou o máximo de teor foliar de óleo essencial de menta. Fatores como variabilidade genética intraespecífica, condições ambientais, épocas de colheita, condições de cultivo, tipo de solo e parte da planta analisada podem influenciar no teor e na composição química dos óleos essenciais (MARTINS et al., 2006) e, com isso, também na eficiência dos mesmos na inibição de fitopatógenos. Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a ação antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis, obtido de diferentes manejos de cultivo, no crescimento in vitro de X. campestris pv. viticola. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia da Universidade do Estado da Bahia (UNEB), Juazeiro, BA, entre os meses de setembro a dezembro de 2012. O isolado utilizado de Xanthomonas campestris pv. viticola (Xcv3), foi proveniente da coleção de culturas bacterianas do Laboratório de Fitopatologia da UNEB, Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS), Campus III, Juazeiro, BA, que se encontrava preservado em água destilada esterilizada (ADE) à temperatura de 25°C, e identificado por PCR com primers específicos (Xcv1F/Xcv3R) (TRINDADE et al. 2007). O isolado Xcv3 foi repicado para a obtenção de colônias isoladas e multiplicado pelo método de estrias, em quatro placas de Petri contendo meio nutritivo ágar nutritivo-dextrose-extrato de levedura - NYDA (MARIANO et al., 2005) solidificado. Obtenção e composição química dos óleos essenciais de Lippia gracilis 70 O experimento de cultivo foi instalado no Campo Experimental de Bebedouro, pertencente a Embrapa Semiárido, município de Petrolina-PE (376 m de altitude e coordenadas geográficas de 09°23'35'' de latitude sul e 40°30'27'' de longitude oeste). As mudas foram produzidas a partir do enraizamento de estacas coletadas em plantas ocorrentes em ambiente natural de Caatinga, próximo a mesma instituição. O plantio das mudas foi realizado no período matutino em canteiros previamente preparados (1,5 x 1,0 m), em espaçamento de 0,5 m entre plantas e 1,0 m entre linhas. Os tratamentos foram diferentes doses de adubação orgânica (esterco de animal – ovino/caprino curtido) adicionado de 100 gramas do adubo mineral NPK para a formulação 15-9-20. As plantas foram irrigadas por gotejamento uma vez ao dia durante quatro horas. O experimento foi instalado em delineamento em blocos ao acaso em três repetições e cada parcela, constituiu-se de três plantas. A colheita das plantas foi realizada após 120 dias de cultivo no período matutino. Sendo as plantas da bordadura descartadas. Durante a condução do experimento, os tratos culturais foram capinas manuais para o controle das ervas infestantes (Tabela 01). TABELA 01: Caracterização, dos tipos de óleo essecial de Lippia gracilis, conforme os diferentes manejos de cultivo avaliados. Tratamento Adubação orgânica (t/ha) Adubação mineral (15-9-20) Irrigação por gotejamento T1 0 Presença Presença T2 0 Ausência Presença T3 20 Ausência Presença T4 40 Presença Presença T5 40 Ausência Presença T6 60 Presença Presença T7 60 Presença Ausência T8 60 Ausência Ausência 71 Atividade antimicrobiana 1. Seleção da concentração inibitória mínima dos óleos essenciais de Lippia gracilis para Xanthomonas campestris pv. viticola Testes qualitativos foram realizados a fim de selecionar uma dose mínima dos óleos essenciais de L. gracilis capazes de inibir o isolado Xcv 3. O crescimento bacteriano de Xcv 3 foram transferidos pelo método de estrias com alça de platina, em meio NYDA solidificado, contendo óleos de L. gracilis nas concentrações de 100, 200, 300 e 400 uL L -1, diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) a 2% do volume total do meio de cultura (HOOD et al., 2003). A inibição do crescimento de Xcv 3 foi avaliada a partir da menor dosagem capaz de impedir o crescimento do isolado no meio de cultura. Cada tratamento com quatro repetição, onde foi avaliada a presença e ausência de crescimento bacteriano na placa de petri. 2. Ação dos óleos de Lippia gracilis sobre Xanthomonas campestris pv. viticola cultivada in vitro A suspensão bacteriana de Xcv3 foi preparada em placas de Petri com 48 horas em meio de cultura NYDA. A diluição foi feita adicionando 10 ml de água destilada esterilizada (ADE) por placa. As suspensões foram transferidas para tubos de ensaio e homogeneizadas em misturador Vortex, ajustando a concentração para A 580 = 0,4 (correspondente a 108 UFC ml-1). A ação inibidora dos óleos de L. gracilis em meio líquido foi avaliada adicionando-se alíquotas de 1 ml da suspensão bacteriana em tubos de ensaio rosqueados contendo 10 mL de meio de NYD (meio nutritivo com dextrose e extrato de levedura). Os tratamentos foram constituídos pelos oito óleos de L. gracilis obtidos de diferentes manejos do cultivo (Tabela 01), nas dosagens de 200, 250 e 300 ppm, determinadas na etapa anterior, testemunha absoluta e oxicloreto de cobre (produto utilizado pelos produtores da região para o controle do patógeno, em condições de campo). A absorbância das suspensões foi avaliada após 48 horas. A porcentagem de inibição do crescimento da bactéria foi determinada pela aplicação da fórmula: I = [ ( CB c 72 CB t ) / CB c ] x 100, onde I = percentagem de inibição; CB c = crescimento bacteriano no controle; CB t = crescimento bacteriano no tratamento (Albuquerque et al., 2006). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, constituído por 26 tratamentos, sendo oito óleos de L. gracilis obtidos de diferentes manejos de cultivo, três dosagens para cada óleo (200; 250 e 300 ppm), testemunha com o oxicloreto de cobre (controle padrão) e a testemunha absoluta. Cada tratamento consta de quatro repetições. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade pelo software ASSISTAT 7.5, sendo a testemunha absoluta comparada com a média geral dos tratamentos. RESULTADOS E DISCUSSÃO Composição química do óleo essencial A análise da composição química dos óleos essenciais extraídos de L.gracilis por GC/MS e GC/FID, sob diferentes práticas agrícolas, mostrou o carvacrol (73,9 a 77%) como composto majoritário, além de timol (4,9 a 10,3%), ρ-cimeno (1,68 a 3,19%), Éter metil timol (0,46 a 2,36%) e o E-cariofileno (1,33 a 3,85) (Tabela 02). Resultados semelhantes foram encontrados por Albuquerque (2005) em que o óleo de L. gracilis era constituído por 10% de timol, e diferindo apenas nos teores de carvacrol que se apresentou com 41,7%. Nos resultados obtidos pode-se verificar flutuações nas porcentagens dos compostos majoritários com relação as diferentes práticas agrícolas, ao qual as plantas de L. gracilis foram submetidas, por exemplo, o tratamento 08 e 03 apresentaram 77% de carvacrol quando não houve adubação química e no tratamento 04 apresentou 73,4% quando houve presença da adubação química. Pode-se verificar, também, que a maior porcentagem de timol (10,3%) foi no tratamento 06 que apresentou 60 t ha-1 de adubação orgânica e adubação química. Este resultado está de acordo com aqueles obtidos por Corrêa et al. (2010), pois os autores verificaram que a utilização de adubação orgânica com esterco de aves maximizou o rendimento de óleo essencial de Origanum vulgare L.. Em seus trabalhos, a adubação orgânica aumentava a produção de hidrato de trans-sabineno; enquanto que se o interesse fosse a produção de timol, dever-se-ia evitar a aplicação de adubos orgânicos. 73 Tabela 02. Composição química dos óleos essenciais de L. gracilis caracterizados por GC/MS e GC/FID sob diferentes práticas agrícolas. IR a Composto a T1 T4 T6 T2 T3 T5 T7 T8 -1 Adubação orgânica (t ha ) 0 40 60 0 20 40 60 60 Irrigação ausente Irrigação presente (gotejamento) (gotejamento) Presença Ausência Presença NPK Ausência NPK NPK (15- NPK (15(15-9-20) (15-9-20) 9-20) 9-20) α-tujeno 945 α-pineno 951 0,04 1-octen-3-ol 984 0,06 0,15 Mirceno 994 0,31 0,36 0,37 α -terpineno 1020 ρ-cimeno 0,07 0,1 0,07 0,06 0,02 0,07 0,02 0,03 0,05 0,09 0,04 0,08 0,32 0,37 0,28 0,46 0,31 0,15 0,24 0,24 0,26 0,2 0,12 0,25 0,06 1027 2,22 2,37 2,23 2,32 2,63 1,68 3,19 2,68 1,8-cineol 1034 0,56 1,66 0,85 0,16 0,64 E-b-ocimeno 1048 0,03 Cis-sabinene hydrate Linalol 1061 0,84 1,76 1,48 1,89 1,28 0,68 1,44 0,35 1069 0,29 0,42 0,42 0,38 0,29 0,21 0,25 0,38 1102 0,58 0,63 0,41 0,89 0,6 1,06 0,38 0,45 Ipsdienol 1148 0,68 0,51 0,51 0,42 0,65 0,76 0,63 0,63 Terpinen-4-ol 1181 0,64 0,68 0,61 0,82 0,66 0,7 0,71 0,56 Éter metil timol 1238 1,82 1,35 1,31 2,36 2,3 0,46 2,05 1,36 Éter metil carvacrol 1247 0,2 0,25 0,25 0,23 0,35 0,26 0,3 0,32 Timol 1297 5,7 6,0 4,9 4,9 5,4 7,0 Carvacrol 1311 74,9 73,9 75,9 76,2 77,3 74,8 74,9 77,0 Acetato de timol Acetato de carvacrol E-cariofileno 1358 0,16 0,39 0,06 0,13 0,21 1375 1,03 1,78 0,38 0,65 0,45 1,7 0,12 1425 3,85 2,65 1,33 2,55 1,56 4,53 2,85 1,28 Aromadendreno 1443 0,07 0,41 0,25 0,33 0,06 0,24 α-humuleno 1458 0,27 0,2 0,04 ar-curcumeno 1484 0,2 α-zingibereno 1496 0,67 1509 0,51 0,28 0,29 0,23 0,37 0,52 0,14 0,32 1526 0,17 0,26 0,31 0,46 Espatulenol 1584 0,2 0,35 0,14 0,61 0,33 0,22 0,32 0,68 Óxido de cariofileno Epóxido de humuleno Total detectado (%) 1591 1,41 1,29 0,64 1,2 1,28 1,11 1,05 1,98 96,4 97 97,7 96,3 97,8 97,2 96,5 0,07 10,3 0,4 8,0 0,3 1616 97,4 Índice de retenção calculado utilizando a equação de Van den Dool e Kratz 1963 em relação a uma série homóloga de n-alcanos (nC9- nC18). b Valores do conteúdo dos compostos obtido pela média de três diferentes determinações obtidas por GC/MS e GC/FID. Traços indicam que o composto não foi encontrado. 74 Martins et al. (2006) também relataram que a disponibilidade de NPK no cultivo de Hyptis suaveolens (L.), para a extração de óleos, revelou-se um fator importante para a composição química do óleo essencial, reforçado a relação entre componentes do óleo e fatores edáficos. De acordo com o trabalho daqueles autores, os óleos extraídos das plantas cultivadas com NPK apresentaram as maiores concentrações dos principais constituintes (Espatulenol, Globulol, Desidro Abietol, α-Candinol, Abietol, γ-Cadineno e α-TBergamoteno) do óleo essencial de H. suaveolens. Gomes et al. (2011), relataram que a composição química do óleo de L. gracilis apresenta flutuações quantitativas dos componentes majoritários, provavelmente, devido a condições genéticas, em função do local e condições em que a planta foi cultivada. Segundo Neves et al. (2008), os compostos químicos presentes no óleo essencial de L.gracilis em dois locais da Caatinga de Pernambuco, foram diferentes. Em Buíque, mostraram a presença de carvacrol e p-cimeno foi observado como constituintes principais. Em Ouricuri, timol, g-terpineno e 4-metoxi-acetofenona apresentaram-se como compostos majoritários. Ouricuri, timol, g-terpineno e 4-metoxi-acetofenona apresentaramse como compostos majoritários. Atividade antimicrobiana Nos testes para obtenção da concentração mínima inibitória para Xcv 3, foi verificado que em 300 e em 400 uL L -1 houve inibição total do crescimento bacteriano para todos os óleos testados. Na dosagem de 200 uL L-1 houve inibição total do crescimento bacteriano apenas nos óleos 01, 05 e 06; já na dosagem de 100 uL L-1 não houve inibição do crescimento bacteriano (Tabela 03). Em face desses resultados, novas dosagens, em um intervalo de 50 ppm, foram testadas no segundo experimento (200, 250 e 300 uL L-1). A partir da Tabela 4, podem-se observar diferenças significativas entre as porcentagens de inibição do crescimento do patógeno para todos os óleos de L. gracilis, sob diferentes práticas agrícolas, apresentando valores entre 62,67% a 96,50%, valores desejáveis no controle in vitro de Xcv. Os tratamentos 01 e 06 na concentração de 300 uL L -1 , e o tratamento 05 na 75 concentração de 200 uL L -1, foram os que proporcionaram maior inibiçãodo de crescimento do patógeno, com uma porcentagem de controle de 94,75%, 96,50%, e 94,02%, respectivamente, não ocorrendo diferenças estatísticas entre as concentrações testadas. Para os tratamentos 06 as concentrações de 200 e 300 uL L -1 também não diferiram entre si. Já o tratamento 02 na dosagem de 300 uL L -1 foi o que proporcionou a maior inibição de Xcv 3, com uma porcentagem de controle de 91,20%. Os tratamentos 03, 06 e 08 apresentaram porcentagens de inibição do crescimento do patógeno de 81,60, 94,02, 81.70%, respectivamente, não havendo diferença estatística entre as concetrações avaliadas. Tabela 03: Seleção da concentração mínima inibitória dos óleos de Lippia gracilis, obtidos de diferentes manejos de cultivo, a partir da inibição total do crescimento bacteriano do isolado Xcv3. Juazeiro-BA, 2013. Dosagem (ppm) Óleo 1 2 3 4 1 100 200 300 400 2 3 IT IT SI 4 IP IT IT SI IP IT IT SI IP IT IT SI IT IT IT SI IT IT IT SI IP IT IT T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 SI IT SI IP IT IT ADE SI SI SI SI Dosagem utilizada do óleo essencial de Lippia gracilis. SI – Sem inibição do crescimento bacteriano do isolado Xcv 3. IT – Inibição total do crescimento bacteriano do isolado Xcv 3 . IP – Inibição parcial do crescimento bacteriano do isolado Xcv 3 Os ótimos resultados obtidos neste trabalho, com a alta porcentagem de inibição do crescimento de Xcv, bactéria Gram-negativa, refletem a capacidade do carvacrol e timol de desintegrar a membrana externa dessas bactérias, liberando lipopolissacarídeos, e consequentemente, gerando alterações na permeabilidade da membrana plasmática, o que resulta na morte da célula 76 bacteriana de um microrganismo gram-negativo (KNOWLES et al., 2005). No caso relatado por Burt (2007), existe interação entre o carvacrol e o timol, resultando em ação sinergística entre eles potencializando a ação de ambos frente ao controle das células bacterianas O óleo de L. gracilis apresenta elevada atividade antimicrobiana e antifúngica (MATOS et al., 1999). Segundo Albuquerque et al. (2006), este óleo é eficiente na inibição de algumas bactérias que comumente causam contaminação em laboratórios de cultura de tecidos de plantas, tais como Salmonella sp., Klebsiella pneumoniae e Bacillus cereus. Também mostrou atividade antifúngica contra Geotrichum candidum White, Aspergillus flavus, Curvularia lunata e Aspergillus niger. Oliveira et al. (2010), trabalhando com óleo e extratos vegetais sobre bactérias fitopatogênicas, obtiveram a inibição do crescimento Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Doidge e X. campestris pv. campestres Pammel com extratos de hortelã. Extrato de alho conseguiu inibir o crescimento dessas bactérias e de Pectobaterium carotovorum subsp. carotovorum Jones. Conforme Albuquerque et al. (2006), os compostos químicos presentes no óleo essencial, principalmente, os monoterpenos carvacrol e timol, das espécies do gênero Lippia, tem apresentado forte ação contra bactérias e fungos contaminantes, presentes em laboratório de cultura de tecido de helicônias. O óleo essencial e extrato de pimenta-longa (Piper aduncum L.) e extrato etanólico de comigo-ninguém-pode (Dieffenbachia picta Schott) apresentam capacidade de inibição do crescimento de Ralstonia solanacearum (Smith) (VÉRAS E YUYAMA, 2001; VÉRAS et al., 2002). Trabalho realizado por Amorim et al. (2011), também observaram que o óleo essencial de citronela (Cymbopogon nardus L.) e gengibre (Zingiber officinale Roscoe) foram capazes de inibir o crescimento de R. solanacearum em todas as concentrações testadas, sendo o óleo de cintronela capaz de controlar em 100% a incidência da doença, quando testado em mudas de bananeira. Estudos realizados por Leal et al. (2003), com óleo de L. sidoides Cham, que apresentam como componentes majoritários o timol e carvacrol, também verificaram que este óleo apresenta atividade antibacteriana, no controle de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., 77 Streptococcus mutans, Corynebacterium xerosis, controle de fungos fitopatogênicos. No entanto, a maioria dos trabalhos nessa linha de pesquisa relata o uso do óleo de L. gracilis no controle de fungos fitopatogênicos. Albuquerque et al. (2006) ao testarem o óleo essencial de L. gracilis verificou a inibição do crescimento de 100% contra os fungos Geotrichum candidum, Trichoderma viride, Torula herbarum, Paecillomyces sp, Aspergillus nidulans, Fusicoccum Tabela 04. Porcentagem de inibição do crescimento in vitro de Xanthomonas campestris pv. viticola, cultivada em meio com diferentes concentrações de óleo essencial produzido em distintos manejos de cultivo Lippia gracilis, Juazeiro,BA, 2013. Tratamento Concentração (ppm) 01 01 01 02 02 02 03 03 03 04 04 04 05 05 05 06 06 06 07 07 07 08 08 08 Oxicloreto de cobre 200 250 300 200 250 300 200 250 300 200 250 300 200 250 300 200 250 300 200 250 300 200 250 300 Dosagem recomendada pelo fabricante Testemunha absoluta CV% ---- Porcentagem de inibição (%) 93.67 a 93.70 a 94.75 a 62.67 d 62.67 d 91.20 a 81.35 c 80.62 c 81.60 c 85.20 c 86.25 b 94.37 a 96.50 a 91.17 a 94.40 a 92.97 a 90.80 a 94.02 a 83.07 c 86.95 b 86.95 b 78.87 c 81.70 c 79.95 c 49,6 e 0,0 f 4,90 1 Tratamento do óleo essencial extraído de Lippia gracilis em diferentes manejos de cultivo. 2 Concentração do óleo essencial de Lippia gracilis no meio de cultura NYD. 78 sp, Aspergillus flavus e Paecillomyces aeruginens; 95,58% contra Curvularia lunata e de 89,40% contra Aspergillus niger. Estudos realizados por Leal et al. (2003), com óleo de L. sidoides, também verificaram que este óleo apresenta atividade antifúngica a Candida albicans, Trichophyton rubrum e T. interdigitale, dentre outros. O óleo de Lippia alba (Mill) N. E. Brown, que também apresenta o timol e carvacrol como componentes majoritários, mostrou efeito inibidor sobre o fungo Geotrichum spp (Oliveira, 2000). Segundo trabalho realizado por Rao et al. (2000) o óleo de L. alba foi altamente efetivo no controle da germinação de teleosporos de Ustilago scitaminea Sydow e conídios de Colletotrichum falcatum Went e de Curvularia lunata Wakker, apresentando efeito superior a fungicidas comerciais no controle de fungos patogênicos de plantas. Todos os óleos testados proporcionaram uma porcentagem de inibição do crescimento bacteriano significativamente superior ao oxicloreto de cobre, produto padrão utilizado no campo para o controle de Xcv (MARQUES, 2009), que inibiu apenas 49,6 %. Estes resultados concordam com aqueles obtidos por outras pesquisas que evidenciam a ineficácia das pulverizações dos produtos à base de cobre no controle da doença, em condições de campo. Segundo Marques et al. (2009), os isolados brasileiros de X. campestris pv. viticola diferem em sua sensibilidade aos produtos a base de cobre, apresentando estirpes mais tolerantes naturalmente, em vinhedos nos estados de Pernambuco e Bahia. Os óleos de plantas apresentam menor risco de promover resistência microbiana, já que são misturas de vários compostos que apresentam diferentes ações antimicrobianas (DAFERERA et al., 2003). Vários trabalhos vêm sendo realizados, buscando demonstrar o potencial da utilização dos óleos essenciais no controle de fitopatógenos (GADELHA et al., 2003; SILVA et al., 2004; AMORIM et al, 2011; NETO et al., 2012). CONCLUSÕES O Carvacrol mostrouse como composto majoritário dos óleos extraídos de L.gracilis, sob diferentes práticas agrícolas. 79 O tipo de cultivo influencia diretamente na atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis. Apesar da existência de poucos trabalhos relacionados ao uso do óleo de L. gracilis no controle de fitobactérias, os resultados encontrados sugerem que o uso deste óleo tem potencial e pode ser uma alternativa no manejo integrado do cancro bacteriano da videira, necessitando, desta forma, continuar as pesquisas, em condições de campo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Universidade do Estado da Bahia – UNEB, à FAPESB pelo fornecimento da bolsa e à Embrapa Semiárido, em especial à Doutora Ana Valéria Vieira, pela parceria e disponibilização de materiais para a realização desse trabalho. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA ALBUQUERQUE, C.C. 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As espécies espontâneas amor-agarradinho, bredo, fedegoso, soja-perene, erva-de-touro, cordão-de-frade e melão-de-são- caetano são hospedeiras alternativas de Xcv, bem como plantas de nim, feijão e tomate. 2. Os menores PI foram observados em soja perene (2,6 dias), fedegoso (3,0 dias) e videira cv. Thompson seedles (3,8 dias); enquanto que, a INC foi de 100% nas plantas da família leguminosae. 3. As espécies testadas pertencentes as famílias Poaceae, Portulacaceae, Liliaceae e Cucurbitaceae não são hospedeiras alternativas de Xcv, bem como plantas de picão-preto, erva de botão, falsa-emília e couve cravinho, que apresentaram os maiores PI (42 dias para todas as espécies) 4. As amplificações a partir do DNA genômico purificado do isolado de Xcv, com os oligonucleotídeos específicos, resultaram em fragmentos de tamanho esperado de 240pb. 5. O Carvacrol mostrou-se como composto majoritário dos óleos extraídos de L.gracilis, sob diferentes práticas agrícolas. 6. O tipo de cultivo influencia diretamente na atividade antimicrobiana do óleo essencial de Lippia gracilis. 7. Todos os óleos testados proporcionaram inibição do patógeno superior as observadas por Oxicloreto de cobre, sendo que os óleos 1, 6 e 7 extraídos de L. gracilis cultivados com adubação mineral (NPK) e adubação orgânica foram os que apresentaram maiores porcentagens de inibição ao crescimento bacteriano de Xcv, 94,75%, 96,50%, e 94,02%, respectivamente . 8. As dosagens que proporcionaram maiores porcentagens de inibição do patógeno foram de 300 uL L -1 para os óleos 2 e 5; 250 uL L -1 para o óleo 15; e 200 uLL -1 para os óleos 1,4,6,7 e 16. 86