DISSERTAÇÃO Paulo R R B Nogueira

Transcrição

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO CIÊNCIA E TECNOLOGIA
FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA AMBIENTAL
MESTRADO EM ENGENHARIA AMBIENTAL
MODALIDADE PROFISSIONAL
IMOBILIZAÇÃO DE ACETILCOLINESTERASE PARA
CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES DE PESTICIDAS.
PAULO ROBERTO RODRIGUES BRANDÃO NOGUEIRA
CABO FRIO/RJ
2015
ii
PAULO ROBERTO RODRIGUES BRANDÃO NOGUEIRA
IMOBILIZAÇÃO DE ACETILCOLINESTERASE PARA
CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES DE PESTICIDAS.
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-
Graduação em Engenharia Ambiental, do Instituto
Federal
de
Educação,
Ciência
e
Tecnologia
Fluminense, Campus Cabo Frio, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Engenharia Ambiental, modalidade profissional na
área de concentração desenvolvimento regional, linha
de pesquisa Avaliação e Gestão Ambiental.
Orientador: Dr. Manildo Marcião de Oliveira
CABO FRIO/ RJ
2015
iii
iv
DEDICATÓRIA
À minha família, que está sempre ao meu lado nos momentos difíceis.
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador Prof. D.Sc Manildo Marcião Oliveira, que é um exemplo de
humildade e um profissional de extrema qualidade. À Universidade Estácio de Sá, por
me proporcionar através de incentivos a possibilidade de crescimento profissional.
vi
RESUMO
O crescimento populacional vem aumentando de forma exponencial e a demanda por
alimentos segue o mesmo patamar. Neste contexto, a produção agrícola mundial é
afetada drasticamente pela ação de insetos e outras pragas. Para minimizar essa perda,
os agrotóxicos, que constituem defensivos agrícolas físicos, químicos ou biológicos,
têm sido rotineiramente utilizados em ampla escala no mundo e sobretudo no Brasil, em
função de suas dimensões territoriais. Dentre os pesticidas mais utilizados atualmente
no Brasil, os organofosforados e carbamatos ganham destaque por apresentarem alta
toxicidade aos insetos e outras pragas.E causando, em pequenas concentrações,
toxicidade também a seres humanos. Estas substâncias tóxicas vêm sendo introduzidas
anualmente nos ecossistemas aquáticos, causando rápida diminuição na qualidade dos
corpos hídricos, exigindo, assim, estratégias de proteção. Atualmente, biossensores com
a enzima acetilcolinesterase (AChE) imobilizadas estão sendo construídos e utilizados,
com o propósito de identificar, através da inibição enzimática, a presença dos pesticidas
organofosforados e carbamatos. Porém, o processo de imobilização em determinados
suportes (sílica mesoporosa e quitosana com glutaraldeído), dentre outras, é a fase mais
crítica para a estabilidade da enzima, pois um bom processo de imobilização melhora o
desempenho e a reprodutibilidade do sinal analítico, levando à obtenção de resultados
fidedignos. Os objetivos deste estudo
foram: realizar primeiramente uma revisão
bibliográfica sobre biossensores com AChE, para posteriormente realizar o processo de
imobilização enzimática de AChE encontrada no extrato enzimático bruto retirado de
cérebro de camundongos suíços, em dois suportes (Sílica mesoporosa e quitosana com
glutaraldeído), analisando a atividade enzimática pós-imobilização e avaliando o tempo
de reutilização da enzima. Um dos principais resultados obtidos pela pesquisa foi a
constatação da ocorrência de imobilização de AChE em sílica mesoporosa e em
quitosana com glutaraldeído, apresentando um tempo de reutilização nas amostras de
sílica mesoporosa de 8 meses, e em quitosana com glutaraldeído de 23 dias. Também
observou-se que a sílica mesoporosa mostrou-se uma matriz mais efetiva do que a
quitosana
com
acetilcolinesterase.
glutaraldeído.
Palavras-chave:
Sílica
mesoporosa,
quitosana,
vii
ABSTRACT
Population growth is increasing exponentially and the demand for food follows the
same baseline. In this context, the world's agricultural production is affected
dramatically by the action of insects and other pests. To minimize this loss, pesticides,
agrochemicals which are physical, chemical or biological, have been routinely used in
large scale in the world and especially in Brazil, due to its territorial dimensions.
Among the pesticides most widely used in Brazil, organophosphates and carbamates are
highlighted because they have high toxicity to insects and other pests. And causing, at
low concentrations, also toxicity to humans.. These toxic substances are being
introduced annually in aquatic ecosystems, causing rapid decline in the quality of
hydrous organisms therefore requiring protection strategies. Currently, biosensors with
acetylcholinesterase enzyme (AChE) immobilized are being built and used, with the
purpose of identifying by enzyme inhibition, the presence of organophosphates and
carbamates pesticides. However, the process of immobilization on certain supports
(mesoporous silica with glutaraldehyde and chitosan), among others, is over
criticalphase for the stability of the enzyme AChE, as a good immobilization process
improves the performance and reliability of the analytical signal, leading to obtaining
reliable results. The goals of this study were first to perform a bibliographic review of
biosensors with AChE, later to carry out the enzyme immobilization process of AChE
enzyme found in raw enzyme extract taken from the brain of Swiss mice in two
supports (mesoporous silica and chitosan with glutaraldehyde), analyzing enzyme
activity after immobilization and assessing the time of reuse of the enzyme. One of the
main results of the research, was verified the occurrence of AChE immobilization on
mesoporous silica and chitosan with glutaraldehyde, with a reuse time of the
mesoporous silica samples of eight months, and chitosan with glutaraldehyde of 23
days. It was also observed that the mesoporous silica was found to be more effective
than the chitosan matrix with glutaraldehyde.
Key-words: Mesoporous silica, chitosan, acetylcholinesterase.
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1:
Princípio de funcionamento de um biossensor. Biomaterial aderido à superfície de um
transdutor, que converte o sinal para medição.
FIGURA 2:
Hidrólise da acetilcolina.
FIGURA 3:
Biossensores para identificação de pesticidas.
FIGURA 4:
Esquema representativo dos principais processos de imobilização de enzimas sobre
suportes sólidos: A) adsorção, B) encapsulação, C) ligação covalente e D) covalente
cruzada.
FIGURA 5:
Curva de substrato de iodeto de acetiltiocolina, (A) para obtenção dos parâmetros
cinéticos (VMax e KM) da AChE livre. (B) Gráfico do duplo reciproco (LineweaverBurk).
FIGURA 6:
Atividade enzimática de AChE imobilizada em sílica mesoporosa.
FIGURA 7:
Leitura da absorvância da atividade enzimática realizada durante o processo de
imobilização em quitosana com glutaraldeído após coleta do sobrenadante em 1 hora.
FIGURA 8:
Leitura da absorvância da atividade enzimática realizada durante o processo de
imobilização em quitosana com glutaraldeído após coleta do sobrenadante em 3 horas.
FIGURA 9:
Ensaio da atividade enzimática em sílica nova imobilizada com AChE e sílica de reuso,
armazenada por 22 dias.
FIGURA 10:
FIGURA 11:
ix
FIGURA 12:
Ensaio da atividade enzimática em sílica de reuso imobilizada com AChE, após 128
dias de armazenamento.
FIGURA 13:
Ensaio da atividade enzimática em sílica de reuso imobilizada com AChE, após 312
dias de armazenamento.
FIGURA 14:
Absorvância da atividade enzimática de AChE imobilizada em quitosana-glutaraldeído
de reuso após 23 dias de armazenamento.
FIGURA 15:
Absorvância da atividade enzimática de AChE imobilizada em quitosana-glutaraldeído
de reuso após 112 dias de armazenamento.
FIGURA 16:
Comparação das absorvâncias das atividades enzimáticas em matriz de reuso sílica
mesoporosa e quitosana-glutaraldeído imobilizadas com AChE.
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1:
Dosagem de proteínas, realizadas durante o processo de imobilização enzimática em
quitosana com glutaraldeído e sílica mesoporosa.
xi
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AChE: acetilcolinesterase.
AOH: Ácido acético
APTS: Aminopropiltrimetóxisilano
BhE: Butirilcolinesterase
BSA: Albumina sérica bovina
CG: Cromatrografia Gasosa
CL: Cromatrografia Liquida
ChE: Colinesterase
DDT: Diclorodifeniltricloretano
DNA: Ácido desoxirribonucleico
DTNB: ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzoico
EA: Enzima acetilada
EH: Enzima livre
EHAX: Complexo enzima substrato
FAO: Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura.
GMBS: éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)-succinimida
HX: Molécula de colina
MPTS: mercaptopropiltrimetóxisilano
OMS: Organização mundial da saúde
PVA-SbQ: glutaraldeído e álcool polivinílico
PX: Pesticidas organofosforados
RPM: Rotações por minuto
SBA 15: Sílica mesoporosa com poros de 5 a 13 nanometros
SMA: Estireno-Anidrido Maleico
TNB: ácido tionitrobenzóico
xii
LISTAS DE SÍMBOLOS
AgCl: Cloreto de prata
g: Grama
KM: Constante de Michaelis-Menten
M: Mol
μL: Microlitros
mL: mililitros
Mol/L: Mol por litro
m2/g: Metro quadrado por grama
NaOH: Hidróxido de sódio
nm: nanometro
pH: Potencial de Hidrogênio
U/mL: Unidades por mililitros
Vmax: Velocidade máxima
V/V: volume por volume
xiii
SUMÁRIO
1. APRESENTAÇÃO.................................................................................................... 1
2. ARTIGO CIENTÍFICO I........................................................................................... 3
RESUMO......................................................................................................................... 3
ABSTRACT..................................................................................................................... 3
INTRODUÇÃO................................................................................................................ 4
I.
II.
III.
Biossensores................................................................................................... 5
Biossensores para detecção de pesticidas....................................................... 6
Estudo de imobilização de enzimas................................................................ 7
CONCLUSÃO................................................................................................................ 10
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 11
3. ARTIGO CIENTÍFICO II........................................................................................ 14
RESUMO....................................................................................................................... 14
ABSTRACT................................................................................................................... 15
INTRODUÇÃO...............................................................................................................16
METODOLOGIA............................................................................................................17
Delineamento experimental.............................................................................................18
Extração de acetilcolinesterase de cérebro de camundongos suíços...............................18
Ensaios da acetilcolinesterase..........................................................................................18
Parâmetros cinéticos da acetilcolinesterase.....................................................................19
Ensaio da atividade enzimática das alíquotas de proteínas retiradas do sobrenadante
durante o processo de imobilização em quitosana com glutaraldeído e sílica mesoporosa
pelo método de peterson (1977)......................................................................................19
Imobilização enzimática em sílica mesoporosa...............................................................19
Ensaio da atividade enzimática da AChE imobilizada em sílica mesoporosa...............19
Imobilização enzimática em quitosana............................................................................20
Confecção de esferas de quitosana..................................................................................20
Ativação com glutaraldeído.............................................................................................20
Imobilização da acetilcolinesterase em quitosana com glutaraldeído............................20
xiv
Ensaio da atividade enzimática da AChE imobilizada em quitosana com
glutaraldeído....................................................................................................................20
Ensaio da atividade enzimática nos testes de reutilização da AChE imobilizada em sílica
mesoporosa e quitosana com glutaraldeído.....................................................................21
RESULTADOS...............................................................................................................21
DISCUSSÃO...................................................................................................................27
CONCLUSÕES...............................................................................................................28
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................29
2
APRESENTAÇÃO
Os pesticidas utilizados no Brasil têm como composição uma grande variedade
de substâncias químicas. Aproximadamente 600 ingredientes ativos são registrados e
utilizados na agricultura, como organofosforados, carbamatos, organoclorados,
piretróides, derivados de uréia, bipiridílio e nitrocompostos que, consequentemente, têm
diferentes modos de ação, biotransformação e eliminação. Dentre estes destacam-se
pelo alto grau de toxicidade, os organofosforados e carbamatos que são comercializados
e utilizados em grande escala.
Nos últimos anos, o Brasil tem avançado consistentemente no desenvolvimento
de ações importantes na Ciência, Tecnologia e Inovação, com resultados concretos na
produção científica e tecnológica, particularmente em determinados campos como os da
nanotecnologia e da nanociência. Inseridos neste contexto encontram-se os biossensores
com acetilcolinesterase (AChE), associados a nanoparticulas de sílica mesoporosa,
nanofios, nanocavidades e quitosana com glutaraldeído, que estão sendo cada vez mais
utilizados para detecção de pesticidas. As pesquisas atuais tentam aumentar a robustez
dos testes de pesticidas com biossensores. Porém, as enzimas são materiais caros e
ainda não se sabe, com precisão, qual a durabilidade destes biossensores, o que muitas
vezes inviabiliza sua comercialização.
Recentemente pesquisadores criaram um biossensor com AChE que detecta em
minutos, na água, no solo e em alimentos, a presença de um pesticida altamente tóxico
que está sendo banido no Brasil, mas que ainda é usado em diversas lavouras no país: o
metamidofós (organofosforado). Porém, a enzima AChE purificada tem um alto custo.
Para este custo ser minimizado, necessita-se de mais estudos realizados com
extratos enzimáticos brutos de AChE, que podem ser retirados de cérebros de
camundongos
suíços
e
posteriormente
imobilizados
em
diversos
tipos
de
nanoestruturas.
Esta pesquisa foi realizada no Laboratório de Ecotoxicologia e Microbiologia
Ambiental (LEMAN) do IFFluminese campus Cabo Frio, RJ,
pois este processo
mostra-se inovador na construção de biossensores para detecção de pesticidas
organofosforados e carbamatos, uma vez que estudos sobre extratos enzimáticos brutos
de AChE são escassos.
O objetivo deste trabalho foi imobilizar a enzima AChE encontrada no extrato
enzimático bruto em dois suportes que são sílica mesoporosa e quitosana reticulada.
3
Como objetivos específicos deste trabalho, incluem-se: i) dosar a concentração
de proteínas durante o processo de imobilização enzimática. ii) realizar testes de
imobilização enzimática da AChE retirados de cérebros de camundongos suíços; iii)
avaliar o tempo de reutilização da enzima, pós-imobilização, nas duas matrizes;
No artigo científico 1, foi realizada uma revisão bibliográfica referente a
biossensores eletroquímicos, biossensores baseados em AChE e imobilização de AChE,
com o objetivo de servir de base de referências para o desenvolvimento prático da
pesquisa.
No artigo científico 2, foram realizados testes de bancada de dosagens de
proteínas coletadas do sobrenadante, durante o processo de imobilização enzimática em
dois suportes (sílica mesoporosa e quitosana com glutaraldeído), testes de imobilização
e reutilização de AChE encontradas no extrato enzimático bruto e também avaliação da
atividade enzimática nos suportes sílica mesoporosa e quitosana com glutaraldeído pós
processo de imobilização.
Os resultados obtidos mostraram a ocorrência de imobilização de AChE nos dois
suportes testados revelando que as enzimas imobilizadas estão ativas mesmo depois do
processo. A sílica mesoporosa apresentou melhor resposta em relação à quitosana com
glutaraldeído em todos os parâmetros testados: dosagem de proteínas, atividade
enzimática durante a imobilização e atividade da enzima após períodos de estocagem e
reutilização (reuso) mesmo após 100 dias de armazenamento.
4
ARTIGO CIENTÍFICO 1
(Publicado na revista eletrônica transdisciplinar Logos e Veritas – UNESA)
Biossensores para detecção de pesticidas: processos de imobilização da enzima
acetilcolinesterase1
Paulo Roberto Rodrigues Brandão Nogueira
Maurilio Geraldete Pereira
Murilo Costa Moraes
João André Duarte Silva
Paulo Roberto Brasil de Oliveira Marques
Victor Barbosa Saraiva
Manildo Marcião Oliveira
Resumo:
O Brasil é o primeiro no ranking em consumo de pesticidas, sendo estes amplamente
utilizados na agricultura(FAO, 2013). Desse modo, existe um consenso a respeito da
necessidade de se monitorar continuamente o teor destes contaminantes químicos nos
cursos das águas naturais e nos efluentes industriais liberados nestes recursos hídricos.
Este monitoramento pode ser realizado através de biossensores. A acetilcolinesterase é
uma enzima que é inibida por pesticidas organofosforados e carbamatos. Nos últimos
anos, o desenvolvimento de metodologias mais seguras e baratas vem sendo empregadas
no monitoramento ambiental destes contaminantes químicos. Assim sendo, surge a
necessidade de utilização de alternativas viáveis para o monitoramento de pesticidas. A
construção de biossensores utilizando matrizes biológicas mais baratas é um caminho
promissor a utilização deste método no monitoramento de poluentes, sendo que a etapa de
imobilização do material biológico necessita de atenção para o melhor desempenho e
reprodutibilidade de sinal analítico.
Palavras-chave: Acetilcolinesterase; Biossensores, Pesticidas; Monitoramento Ambiental
Abstract:
Brazil is the first in the ranking of pesticide consumption, which are widely used in
agriculture (FAO, 2013). Thus, there is a consensus on the need to continuously monitor
the content of these chemical contaminants in the courses of natural water and industrial
effluents released on these hydrous resources. This monitoring can be performed by
biosensors. Acetylcholinesterase is an enzyme that is inhibited by organophosphates and
carbamates pesticides. In the last years, the development of safer and cheaper methods
has been used in environmental monitoring of these chemical contaminants. Therefore,
the need arises to use viable alternatives to pesticides monitoring. The construction of
biosensors using cheaper biological matrices is a promising way to use this method in the
monitoring of pollutants, given that the immobilization stage of the biological material
needs attention for the best performance and analytical signal reproducibility.
Keywords: Acetylcholinesterase; Biosensors, Pesticides; Environmental Monitoring
5
Introdução.
Na história da humanidade a demanda por alimentos é sempre crescente, pois deve
acompanhar o crescimento da população e essa ocorre de forma exponencial. Porém, a produção
agrícola mundial é afetada drasticamente pela ação de insetos e outras pragas. Estima-se que
cerca de US$ 250 bilhões são perdidos anualmente por esse motivo). Para minimizar essa perda,
os agrotóxicos, que constituem defensivos agrícolas físicos, químicos ou biológicos, têm sido
rotineiramente utilizados em ampla escala no mundo, particularmente em países da América do
Sul que possuem grande extrato de sua economia baseados no agronegócio ,e sobretudo no
Brasil, em função de suas dimensões territoriais. Dentre esses agrotóxicos, os denominados
pesticidas, que são substâncias químicas ou misturas de substâncias capazes de controlar pragas,
se destacam tanto na fabricação e comercialização, quanto no volume de uso como defensivo.
Existem atualmente cerca de 600 ingredientes ativos registrados e usados em suas formulações
pesticidas, destes, 350 contribuem com 98% dos pesticidas mais utilizados (GALLI et al, 2006).
Segundo a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO, 2013), o
Brasil está entre os países que mais utilizam pesticidas em lavouras, superando em sete vezes a
média mundial de 0,5 kg/hab. A utilização indiscriminada destes produtos tem impacto direto
sobre a saúde e o meio ambiente. Não existem dados seguros acerca da quantidade exata de
pessoas que apresentam intoxicações agudas por pesticidas. A Organização Mundial da Saúde
(OMS) estima um número de 220 mil mortos/ano decorrentes destes processos de intoxicação,
sendo 70% destes casos em países subdesenvolvidos, ou em desenvolvimento Esse dado
fortalece e direciona as ações de monitoramento destes poluentes, principalmente em ambientes
aquáticos, principal meio de disseminação destes e cuja importância é devida ao crescente
número dessas substâncias potencialmente nocivas inseridas neste compartimento ambiental.
Atualmente, os pesticidas mais utilizados compreendem grande variedade de substâncias
químicas, com diferentes grupos funcionais tais como: piretróides, ditiocarbamatos, derivados
de uréia (carbamidas), organofosforados, bipiridílio, formicidas, organoclorados e
nitrocompostos, que consequentemente tem diferentes modos de ação, biotransformação e
eliminação (UNNEVER et al, 1997). Alguns pesticidas da classe dos organoclorados e
organofosforados, que estão entre as mais tóxicas existentes, tiveram seu uso proibido, devido à
possibilidade de desenvolvimento de tumores cancerígenos, e vários outros problemas
relacionados à saúde humana (GALLI et al, 2006; NUNES, 1999).
A análise de resíduos de pesticidas por processos convencionais depara-se com problemas
operacionais complexos devido à gama de substâncias existentes que devem ser determinadas
em distintos produtos (BARCELÓ, 1993). Diversos métodos têm sido desenvolvidos nas
últimas décadas, sendo que a maioria baseia-se em espectrofotometria e cromatografia líquida
(CL) ou gasosa (CG). São métodos validados, muito sensíveis e cada vez mais utilizados em
análises químicas (LARTIGES, 1995). Porém, os altos custos das análises e a dificuldade de
serem realizadas in loco restringem o monitoramento de determinados poluentes, pois envolvem
aquisição, preparação e análise de laboratório, impondo limitações no número de amostras que
podem ser analisadas para um determinado projeto de monitoramento ambiental (KARUBE et
al, 1995).
_________________________
Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor a ser apresentado ao Programa de PósGraduação Stricto sensu em Engenharia Ambiental, do Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia Fluminense do Campus Macaé, na área de concentração de Gestão e Planejamento
Ambiental, linha de pesquisa Avaliação e Gestão Ambiental, sob a orientação do Prof. Dr.
Manildo Marcião de Oliveira.
6
Segundo Rosatto et al (2001), essa lacuna tem criado uma demanda por tecnologias
analíticas que possam permitir um aumento no número destas análises num menor tempo e com
custos acessíveis. Dentre as variadas propostas atuais para métodos alternativos de análises,
destacam-se os imunoensaios e os biossensores, que vêm sendo continuamente exploradas pelos
químicos, bioquímicos, biólogos e profissionais afins, sendo consideradas ótimas ferramentas de
detecção e análise de poluentes orgânicos (FATIBELLO-FILHO, 1992).
Os biossensores, que são sensores modificados com material biológico, são uma ferramenta
promissora para suplementar as técnicas existentes, devido sua alta especificidade, seletividade,
custo de construção e estocagem insignificante quando comparado às técnicas tradicionais, alto
potencial para miniaturização, facilidade de automação e construção de equipamentos simples e
portáteis para um monitoramento in loco rápido. Os biossensores têm encontrado aplicações em
praticamente todas as áreas científicas como: engenharia genética, indústria alimentícia,
biotecnologia, pecuária, na agricultura para o monitoramento de pesticidas e para detecção de
patógenos (HANSEN, 2011, LIMA, et al 2007). Dentre as etapas de construção dos
biossensores, o processo de imobilização do material biológico tem sido considerado um dos
mais críticos, visto que pode alterar a desempenho deste material, sobretudo quando se faz uso
de enzimas, pois estas têm limitações que devem ser respeitadas quando se trata de fixá-las em
um suporte sólido.
I – Biossensores.
O conceito de biossensor diz respeito a um sensor que deve ser modificado com
material biológico intimamente ligado a superfície de um transdutor, que deve monitorar uma
reação biológica, traduzindo esta em sinal monitorável. O processo reacional é utilizado para
reconhecimento de elementos e moléculas específicas que apresentam relação ou interação com
a reação biológica, aliando-se seletividade biológica com sensibilidade analítica (FATIBELLOFILHO, 1992). O esquema a seguir apresenta o princípio de funcionamento de um biossensor.
Fonte: Marques; Yamanaka, 2008.
Dentre as várias classes de biossensores, os eletroquímicos têm sido muito estudados,
dentre os quais se destacam os amperométricos, os potenciométricos e os condutimétricos. Os
primeiros, mais relevantes, baseiam-se na medida de intensidade de corrente resultante dos
processos oxidativos em uma superfície eletródica a qual se submete uma diferença de
potencial. Como vantagem, tem-se uma relação direta entre a intensidade de corrente obtida do
processo para com concentração da espécie eletroativa, de forma independente do volume
(THÉVENOT et al, 2001; WANG et al, 2008). Já os potenciométricos são baseados na
determinação da diferença do potencial entre o eletrodo indicador e o de referência
(THÉVENOT et al, 2001) enquanto que os condutimétricos baseiam-se na medição de
mudanças na condutância devido ao uso de materiais biológicos que produzem ou consomem
espécies iônicas alterando a quantidade de portadores de carga móvel no eletrólito (WANG et
al, 2008).
Uma vez definido o transdutor, necessita-se escolher o procedimento de imobilização
do material biológico, com posterior avaliação da manutenção da atividade biológica, seguido
de estudo dos parâmetros de reprodutibilidade e aplicação na detecção de moléculas alvo. Como
7
mencionado, a etapa de imobilização é considerada crítica na construção dos biossensores, visto
que as reações biológicas podem ser facilmente alteradas quando aderidas a superfícies, devido
a mudanças conformacionais que alteram estruturas moleculares essenciais para a atividade do
biomaterial. Alterações no pH do meio, bem como na salinidade, viscosidade e na temperatura
podem acarretar na inativação ou perda parcial da atividade, sobretudo quando se trabalha com
biossensores enzimáticos (MARQUES; YAMANAKA, 2008).
Dentre as variadas aplicações, merecem destaque os estudos de detecção de substâncias
potencialmente tóxicas no ambiente. Hansei (2008) apresenta uma revisão sobre biossensores e
ecotoxicologia, apontando as principais substâncias tóxicas detectadas por biossensores na
literatura, tais como, os pesticidas orgafosforados, microcistinas, disruptores endócrinos (DDT)
e herbicidas, indicando os biossensores como futuros aliados em diagnósticos relativos à saúde
humana.
II - Biossensores para Detecção de Pesticidas.
O aumento da atividade agrícola mundial elevou o número de casos de intoxicações por
contaminações por pesticidas, direcionando vários estudos para as áreas de saúde e proteção
ambiental (OMS). Biossensores para detecção de pesticidas são em geral construídos com
enzimas colinesterases (ChE’s), pois estas são comercializadas com alta atividade específica, a
qual pode ser facilmente monitorada por métodos eletroanalíticos. Elas são o sítio alvo dos
inseticidas organofosforados e carbamatos, que são estudados quase sempre em conjunto,
devido ao mesmo mecanismo de ação e sítio alvo em organismos vivos. As enzimas ChE’s
classificam-se em dois tipos: acetilcolinesterases (AChE’s) e butirilcolinesterases (BChE’s),
estas últimas também conhecidas como pseudocolinesterases. As colinesterases atuam no
sistema nervoso controlando impulsos e transmissões dos estímulos nervosos (NUNES, 1996).
A acetilcolina, que é o substrato destas enzimas, em condições normais, é hidrolisada e
convertida a colina e ácido acético, conforme a reação que segue demonstrado na figura 2.
HX
A
a
EH + AX  EHAX  EA  EH + AOH
HX
EH + PX  EHPX  EP
B
b
Inicialmente, forma-se o complexo enzima substrato (EHAX); a molécula de colina
(HX) é liberada, sendo formada uma enzima acetilada (EA), que é imediatamente hidrolisada,
formando o ácido acético (AOH), e liberando a enzima livre (EH)(figura 2a). Os pesticidas
organofosforados (PX) atuam sobre o centro esteárico da enzima colinesterase, inibindo a sua
ação, provocando acúmulo de acetilcolina, e levando a respostas repetidas e descontroladas nas
células nervosas estimuladas (sinápses), que podem, por fim, levar à convulsão, seguida de
morte. A reação de inibição enzimática é similar à do substrato, porém a enzima fosforilada
(EP) é bem mais estável que a acetilada, acarretando na inibição que pode ser irreversível
(aging). A figura 2b mostra o mecanismo de inibição por um inseticida organofosforado, onde o
grupo de partida é liberado e o resíduo do centro ativo da enzima é substituído, sendo formada a
enzima fosforilada (EP), que é inativada.
8
Este processo pode ser monitorado de várias formas, dependendo do transdutor. Quando
se utilizam eletrodos em conjunto com métodos amperométricos, pode se efetuar a leitura dos
processos de oxidação da tiocolina produzida na reação. Esta molécula oxida a potenciais
elevados o que pode acarretar em sinais passíveis de interferentes, assim, faz-se uso de
mediadores eletroanalíticos que baixam o potencial para regiões mais confiáveis. Os sinais de
corrente obtidos são proporcionais a catálise, então, a ação dos pesticidas sobre as enzimas
AChE leva à diminuição desta catálise e, consequentemente, à diminuição do sinal de corrente,
de forma proporcional à concentração do inibidor no meio de análise. Plota-se então uma curva
analítica relacionando a porcentagem de inibição com a concentração do pesticida inibidor
(NUNES, 1996).
Os biossensores que utilizam a acetilcolinesterase são sistemas rápidos, seletivos,
sensíveis, de fácil uso, com tempo de resposta bastante curto e necessitando de mínimo
tratamento da amostra, além das possibilidades de efetuar análises quantitativas e qualitativas
em tempo real. A facilidade de obtenção das enzimas na forma comercial torna-se um grande
atrativo para sua construção, haja vista, que é uma enzima útil para monitoramento de pesticidas
organofosforados e carbamatos estando estes, entre os compostos potencialmente tóxicos mais
estudados por estes sistemas de biodetecção, merecendo atenção por parte da comunidade
científica (MARQUES; YAMANAKA, 2008; Liu, et al, 2008).
Fonte: Agência Fapesp (2013).
III – Estudos de Imobilização de Enzimas.
Imobilização é um termo genérico empregado para descrever a retenção de uma
biomolécula no interior de um reator ou de um sistema analítico, ou seja, uma fixação de
enzimas ou células em um ambiente, de maneira que sua atividade catalítica não seja afetada
negativamente (CARDOSO et al, 2009). A imobilização de enzimas tem se mostrado, nos
últimos tempos, uma poderosa ferramenta para melhorar quase todas as propriedades
enzimáticas, como a alta atividade e seletividade. Este processo visa substitui a utilização da
enzima na forma solúvel, evitando a necessidade de remoção do meio da reação para posterior
aplicação, diminuindo assim, o custo da análise e aumentando a rapidez e a exatidão do
processo. O desempenho dos biossensores baseados em enzimas depende da atividade
enzimática e da utilização de uma técnica adequada para a imobilização de enzimas. A
imobilização não deve desnaturar o centro ativo das enzimas utilizadas, devendo ser realizada
através de grupos que não possuam atividade catalítica. O tipo de imobilização afeta de forma
considerável a estabilidade do biossensor. Um sensor biológico com enzima em solução é
menos estável do que um sensor com enzima imobilizada fisicamente, e menos ainda que os
com enzima imobilizada quimicamente (MARQUES; YAMANAKA, 2008).
9
As técnicas mais utilizadas para imobilizar enzimas são: ligação covalente (no suporte
ou por ligação cruzada entre a enzima e o suporte), adsorção (física e ou iônica em
nanopartículas de sílica e filmes de polianilina contendo nanopartículas de prata, dentre outras)
e encapsulamento (matriz ou em membranas), como apresentado na Figura 4 (ABEL; ASLAN,
2014).
Fonte: Marques; Yamanaka (2008).
O método de adsorção é considerado o mais simples e rápido, podendo ser utilizado
com diversos materiais e substratos eletródicos. Para ligação covalente, destaca-se a estabilidade
por conta da ligação através de grupos funcionais específicos entre a molécula alvo e o suporte
sólido. Os processos de encapsulação são rápidos, porém, têm desvantagens de retenção de
produtos enzimáticos dentro do material de imobilização (processos de transferência de massa).
A ligação covalente cruzada se destaca pela maior estabilidade do material biológico e poucos
processos de lixiviação. Destacam-se, também, os métodos com base na incorporação do
biomaterial no interior de pastas eletródicas, como em pasta de carbono e eletrodos compósitos.
Os filmes poliméricos ampliam o sinal analítico quando associados a processos biológicos em
biossensores amperométricos (ALFAYA; KUBOTA, 2002)
Andreescu e Marty (2006) publicaram uma revisão sobre as pesquisas em biossensores
de colinesterase nas ultimas décadas. Estes autores mencionaram os processos de imobilização
mais frequentes aplicados à construção destes biossensores. Com relação aos processos de
adsorção física, foi mencionado que são os que menos desnaturam as enzimas AChE, mantendo
uma atividade elevada da catálise, porém, o sinal analítico não se apresenta repetitivo por perda
de material biológico a cada lavagem. Para a técnica de ligação covalente, o glutaradeido tem
sido expressivamente utilizado, visto que é um agente homobifuncional que tem como função
realizar ligações cruzadas entre moléculas, tornando-as mais unidas e suscetíveis a ligações
peptídicas com a enzima elevando a reprodutibilidade de sinal analítico. Processo sol-gel foi
citado para encapsulação de AChE, pois é uma técnica amplamente utilizada na síntese de
materiais para obtenção de estruturas inorgânicas ou híbridos orgânico-inorgânicos. Outro
método de destaque foi o uso de monocamadas auto-organizadas de tiol sobre eletrodos de ouro,
sendo a enzima depositada sobre a monocamada, por ligações com os resíduos de aminoácidos.
10
Materiais à base de sílica, filmes poliméricos, filmes de náfion, glutaraldeído, álcool
polivinílico e gel de poliacrilamida são exemplos comuns de agentes utilizados para fixar as
enzimas sobre eletrodos para construção de biossensores. Com relação aos chamados novos
materiais, merecem destaque aqueles com base em nanoestruturas, como nanopartículas (ouro,
magnéticas, prata, etc), nanotubos e grafeno. Abel e Aslan (2012), demonstraram que
nanopartículas de ouro foram utilizadas para melhorar a adsorção e a estabilidade da
acetilcolinesterase na construção de biossensores, colaborando com a sensibilidade e a
seletividade do método para detecção de tiocolina em concentrações baixas, mantendo ao
mesmo tempo o desempenho da enzima mediante a imobilização, por até uma semana. Stoilova
et al (2010), imobilizaram acetilcolinesterase através de ligações covalentes em copolímeros de
Estireno-Anidrido Maleico (SMA), usando glutaraldeído como agente de ligação. Para que
ocorresse a imobilização os copolímeros foram imersos em solução aquosa de glutaraldeído
10% (v/v) durante 1 h a 4oC, seguido de enxague com água destilada. Posteriormente, foram
imersos em uma solução de 0,5 mg mL-1 de acetilcolinesterase em tampão de fosfato de sódio
0,1 mol L-1 (pH 7,0) durante 20 h a 4oC. Finalmente, os mesmos foram lavados cuidadosamente
com tampão fosfato de sódio 0,1 M para remover qualquer molécula de acetilcolinesterase não
imobilizada.
Em um estudo realizado por Vamvakaki e Chaniotakis (2007), a imobilização de
enzimas em sílica mesoporosa foi realizada por adição de 0,5 g de sílica com nanoporos de 10
nm em 500 μl da enzima acetilcolinesterase. A adsorção foi realizada a 4oC por 24 h e, em
seguida, a suspensão foi filtrada através de filtros de 0,2 nm. Os grânulos com a enzima
imobilizada foram cuidadosamente lavados com tampão, à temperatura ambiente e manteve-se a
-20 oC para posterior utilização.
Singh et al (1999) imobilizaram AChE em sílicas porosas a partir de dois ligantes
covalentes diferentes, o glutaraldeído – previamente imobilizado à sílica por um composto
amino-sililado (aminopropiltrimetóxisilano – APTS) , e o éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS) – previamente imobilizado à sílica por um composto sulfo-sililado
(mercaptopropiltrimetóxisilano – MPTS) . Na imobilização da enzima em sílica contendo
glutaraldeído 10% (v/v) os grânulos de sílica foram embebidos em água deionizada (80 ° C, 3
h); pH foi ajustado para 7,0. Depois de enxaguar, as amostras foram colocadas em uma solução
de aquosa de glutaraldeído 10% (v/v) em (temperatura ambiente, por 1 h). As amostras foram
extensivamente lavadas após o tratamento para remover o glutaraldeído e qualquer agente de
ligação cruzada adsorvido. Já na imobilização da enzima em sílica contendo GMBS, os grânulos
de sílica foram embebidos em tolueno anidro (em temperatura ambiente por 5 min, sob vácuo).
As amostras foram mantidas dentro de uma estrutura seca com umidade relativa do ar em 25%.
Posteriormente as amostras foram lavadas sequencialmente com tolueno e etanol e novamente
embebidas em GMBS (8 mM em etanol, temperatura ambiente, 1 h). As amostras foram lavadas
sequencialmente com etanol, água e tampão fosfato de sódio. Ambos os suportes sililados
apresentaram bons resultados na imobilização enzimática.
A imobilização da AChE realizada por Domínguez-Renedo et al (2012), se deu pela
técnica de ligação cruzada sobre a superfície de carbono, em que foram acrescidos 10 μL de
soluções de acetilcolinesterase (0,1% v /v), 5 μL de albumina bovina (6% v /v) e 5 μL de
glutaraldeído (2,5% v/v), preparados em 10 mmol L-1 de tampão fosfato pH 6,0. Posteriormente,
5 μL desta mistura foi gotejada sobre a superfície do eletrodo de trabalho, deixando em repouso
por 90 min a 4 ° C.
Nunes et al (2004) estudando processos de imobilização de acetilcolinesterases sobre
eletrodos do tipo descartáveis impressos, avaliaram sete procedimentos distintos, com base nos
agentes glutaraldeído e álcool polivinílico PVA-SbQ e na adição de soro albumina bovina, em
diferentes valores de pH e tempos de imobilização. O método a partir de fotopolimerização de
PVA-SbQ, em pH 8,0, com tempo de 3 h a 4 °C foi o que obteve melhor sinal analítico, mais
que o dobro de sinal do segundo melhor método. A reprodutibilidade do sinal foi testada em 20
medidas efetuadas com 20 eletrodos diferentes, com desvio padrão variando entre 6,5 % a 18%,
11
entre medidas efetuadas no mesmo dia e em dias diferentes. O biossensor foi aplicado para
detecção de pesticidas carbaril, carbofuran, metomil e aldilcarb.
Gogol et al (2001) utilizando o mesmo sensor eletroquímico e imobilizando enzimas
BChE’s em náfion (fluoropolímero-copolímero baseado em tetrafluoroetileno sulfonado) por
ligação cruzada com vapores de glutaraldeído, trabalharam com potenciais em torno de +400
mV versus Ag/AgCl em determinações de inibidores de colinesterases. Ion et al (2010)
imobilizaram a enzima AChE sobre material compósito de nanoplaquetas de grafite e quitosana,
sendo que o aumento da área superficial elevou o sinal analítico para detecção de clorpirofós1. A
quitosana também foi utilizada em conjunto com nanopartículas de ouro, para construção de
biossensores de AChE sobre eletrodo de carbono vítreo. A caracterização foi efetuada por
microscopia de varredura eletrônica e o sensor foi aplicado para detecção de monocrotofós2
(NOROUZI, 2010).
Viswanathan et al (2009) utilizaram uma mescla de polianilina depositada verticalmente
em nanotubos de carbono para imobilizar AChE. Os nanotubos foram acoplados ao DNA de
forma vertical, sendo um filme de polianilina depositado sobre os nanotubos de carbono e a
enzima ligada ao filme. O bloqueio da superfície não modificada foi efetuado com BSA e o
biossensor foi testado para metil paration e clorpirifós.
Diversas pesquisas demonstram que tem aumentado o interesse da aplicação de extratos
enzimáticos brutos no lugar de enzimas purificadas, para imobilização em biossensores. Dentre
estes extratos enzimáticos brutos, destaca-se a polifenol oxidase representada pelas lacases e
tirosinases e as peroxidases, oriundos de diversos vegetais e frutas como batata (Solanum
tuberosum), mandioca (Manihot ultilissima), inhame (Alocasia macrorhiza), pêssego (Prunus
pérsica), banana nanica (Musa acuminata), pêra (Pirus communis) e banana prata (Musa
parasidiaca) (SIGNORE; FATIBELO-FILHO, 1994; FATIBELLO-FILHO et al, 2002).
Oliveira e Vieira (2006) avaliaram variados procedimentos de imobilização de extratos de
peroxidase em quitosana, sendo que a melhor técnica foi baseada na conjugação entre
epiclorohidrina/glutaraldeído. Foram otimizados parâmetros de reprodutibilidade,
repetitividade, tempo de resposta e estabilidade do biossensor, sendo que o mesmo foi estável
por mais de 180 dias.
O processo de imobilização de uma enzima sobre um suporte pode influenciar ou até
modificar as respostas do biossensor. Em nível microscópio, pode ocorrer de a enzima fixar-se
ao substrato pela região da atividade, afetando a interação com o substrato. Podem ocorrer
distúrbios de carga nas regiões de imobilização, como por exemplo: a região de engate pode
ficar com carga oposta ao substrato e atraí-lo, dificultando o bioreconhecimento. O engate pode
ficar carregado com mesma carga que o substrato e repeli-lo. Pode ocorrer também o
superempacotamento da enzima, quando a carga enzimática é excessiva, e dificultar a interação
enzima substrato. Todos estes fatores podem ocorrer quando se efetua uma imobilização e são
de certa forma, independentes do método utilizado e do próprio analista (ZANG, 2000).
O advento das enzimas imobilizadas abriu novos promissores campos de atuação. Como
exemplos, os eletrodos enzimáticos que proporcionam um número muito maior de análises em
curtos espaços de tempo e reutilização da enzima por tempos prolongados de processo,
implicando numa grande redução de custo (BON et al.; 2008). O domínio dos processos de
imobilização evidenciam um melhor nível de sinal analítico e consequentemente melhorias nos
processos de detecção dos contaminantes orgânicos, como no caso dos pesticidas.
Conclusão
Nos últimos anos, o desenvolvimento de metodologias mais seguras vem sendo
empregado no monitoramento ambiental de contaminantes químicos nos cursos das águas
naturais e nos efluentes industriais descarregados nestes ambientes, sendo assim surge a
1 pesticida organofosforado
2 pesticida organofosforado
12
necessidade da busca de alternativas viáveis para o monitoramento de pesticidas, levando em
consideração que o Brasil é um dos maiores consumidores de pesticidas do mundo. A
construção de biossensores utilizando matrizes biológicas mais baratas é um caminho promissor
a utilização deste método no monitoramento de poluentes.
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Paulo Roberto Rodrigues Brandão Nogueira possui graduação em Biologia, Especialização em
Gestão Ambiental e Anatomia Humana e mestrando em Engenharia Ambiental peloIFFluminense. Leciona nos cursos de graduação e Pós Graduação Lato Sensu em Engenharia
Ambiental e Saneamento Básico na Unesa de Cabo Frio.
Maurilio Galdete Pereira é Graduando em Biologia pelo IFFluminense de Cabo Frio.
Murilo Costa Moraes é Graduando em Biologia pelo IFFluminense de Cabo Frio.
Manildo Marcião Oliveira é Doutor em Ciências – Área de concentração Biociências Nucleares
pela UERJ. Possui graduação em Licenciatura em Biologia pela Faculdade da Região dos Lagos
(1995), mestrado em Biologia (Biociências Nucleares) pela Universidade do Estado do Rio de
Janeiro (2000). Atualmente é professor de ensino básico, técnico e tecnológico e coordenador
do Laboratório de Ecotoxicologia e Microbiologia Ambiental (LEMAM) do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia Fluminense.
João André Duarte Silva é Doutor em Química – Química Inorgânica pela Universidade Federal
de Minas Gerais/University of Ottawa e leciona no Instituto Federal Fluminense – campus Cabo
Frio. Atualmente desenvolve pesquisas na área de síntese de compostos híbridos orgânicosililados e aplicações.
Paulo Roberto Brasil de Oliveira Marques é Pós Doutor pela Universidade Federal de São
Carlos, Doutor em Química pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho em
2009. (2010). Atua como membro do corpo docente e pesquisador do Mestrado em Química da
UFMA. É membro do grupo de pesquisa NARP e coordenador do grupo de pesquisa em ensino
de ciências naturais-GPECN. Efetuou estudos de doutorado sanduíche com o grupo de sensores
e biossensores da Universidade Autônoma de Barcelona, com a Profa. Dra Isabel Pividori, em
Barcelona (2008).
Victor Barbosa Saraiva é Pós doutor em Bioquímica de micro-organismos pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro (2010), doutor em Ciências (Biofísica) pela Universidade Federal do
Rio de Janeiro (2008), mestrado em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade Federal
do Rio de Janeiro (2004). Atualmente é professor do Instituto Federal de Educação Ciência e
Tecnologia Fluminense (IF Fluminense-campus Cabo Frio).
16
3 ARTIGO CIENTÍFICO II
(a ser submetido)
IMOBILIZAÇÃO DE ACETILCOLINESTERASE (AChE) EM
MATRIZES DE SILICA MESOPOROSA E QUITOSANA
Paulo Roberto Rodrigues Brandão Nogueira
Maurilio Geraldete Pereira
Diego da Silva Palência
João Andre Duarte Sílva
José Carlos Amaral Jevu
Manildo Marcião Oliveira
RESUMO
Uma vasta gama de substâncias tóxicas vem sendo introduzida, anualmente, nos
ecossistemas aquáticos, causando rápida diminuição na qualidade dos corpos hídricos,
exigindo, assim, estratégias de proteção. Inseridas neste contexto encontram-se os
pesticidas organofosforados e carbamatos que apresentam alta toxicidade aos insetos e
também podem intoxicar os seres humanos. Para detecção destes pesticidas,
biossensores com acetilcolinesterase (AChE) purificada estão sendo construídos e vêm
ganhando destaque no monitoramento ambiental. Entretanto, uma das etapas mais
críticas nesse processo de construção relaciona-se à imobilização enzimática, processo
esse que vem sendo empregado baseado nas ligações físicas e químicas entre a
biomolécula e o suporte (dentre outros sílica mesoporosa e quitosana). Outra questão
crítica é o alto custo da enzima AChE purificada, o que pode ser minimizado utilizando
extrato enzimático bruto, sendo esta a motivação desta pesquisa, pois há poucos estudos
realizados com extratos enzimáticos. Os objetivos desta pesquisa foram realizar testes
de imobilização enzimática da AChE retiradas de cérebros de camundongos suíços,
avaliando dois suportes: sílica mesoporosa e quitosana reticulada com glutaraldeído. E
avaliar o tempo de reutilização da enzima baseado na atividade enzimática pós
imobilização nos dois suportes citados anteriormente. Os resultados demonstraram que
houve imobilização de AChE nas matrizes sílica mesoporosa e quitosana com
glutaraldeído, pois a leitura da absorvância da AChE, aumentou discretamente nas duas
matrizes, porém a sílica mesoporosa apresentou melhor resposta em todos os
parâmetros testados: dosagem de proteínas na qual a leitura da absorvância durante o
processo de imobilização decresceu sugerindo que, quanto menor for sua absorvância
mais proteínas estão sendo imobilizadas nas matrizes. Observou-se, também, aumento
na leitura da absorvância de AChE durante a imobilização e após períodos de
estocagem e reutilização (reuso).
Palavras-chave: Organofosforados, biossensores, Acetilcolinesterase.
17
ABSTRACT
A wide range of toxic substances has been introduced annually in aquatic ecosystems,
causing fast decline in the quality of hydrous organisms, thus requiring protection
strategies. Inserted in this context organophosphate pesticides and carbamate are that
exhibit high toxicity to insects and may also intoxicated humans. For detection of these
pesticides, biosensors with acetylcholinesterase (AChE) purified are being built and
have been gaining attention in environmental monitoring, but one of the most critical
steps in this construction process relates to enzyme immobilization, a process that has
been placed based on Physical and chemical links between the biomolecule and the
support (among other mesoporous silica and chitosan). Another critical issueis the high
cost of purified enzyme AChE, which can be minimized using raw enzyme extract,
which is the motivation of this research, because there are a few studies of enzymatic
extracts. The goals of this research were performing enzyme immobilization tests AChE
taken from Swiss mice brains, evaluating two supports: mesoporous silica and chitosan
cross linked with glutaraldehyde. And assess the reusage time of the enzyme based on
the enzymatic activity after immobilization on the two carriers mentioned above. The
results showed immobilization of AChE in the matrices mesoporous silica and chitosan
with glutaraldehyde, as the absorbance reading of AChE, increased slightly in the two
matrices, but the mesoporous silica showed better response in all tested parameters:
protein dosage where reading absorbance during the immobilization process decreased
suggesting that the smaller its absorbance, more proteins being immobilized on matrices
also showed increase in the absorbance reading of AChE for the immobilization and
after periods of storage and reuse.
Key-words: Organophosphate, biosensors, acetylcholinesterase.
18
INTRODUÇÃO
Durante as últimas décadas, o aumento da atividade agrícola associada à
políticas impróprias de gestão de resíduos, levaram ao lançamento de uma vasta gama
de substâncias tóxicas nos ecossistemas aquáticos, causando rápida diminuição na
qualidade dos corpos hídricos, exigindo, assim, estratégias de proteção. Para isso,
programas de monitoramento necessitam de métodos rápidos, confiáveis e de baixo
custo para a avaliação do impacto toxicológico dos poluentes nas águas. Neste contexto,
os biossensores com determinadas enzimas são excelentes alternativas para a detecção
de pesticidas, sendo técnicas complementares para os métodos químicos convencionais.
(LAGARDE; JAFFREZIC-RENAULT, 2011).
Dentre estas substâncias tóxicas utilizadas na atividade agrícola ganham
destaque os pesticidas organofosforados e carbamatos, que são amplamente utilizados
devido à sua alta toxicidade para os insetos. Não obstante, baixos níveis destes
pesticidas também são tóxicos para os seres humanos, pois têm a capacidade de
modificar o sítio ativo da enzima Acetilcolinesterase (AChE), inibindo a hidrólise de
acetilcolina, impedindo assim, a transmissão dos impulsos nervosos (VAKUROV et al,
2004). Para detecção dos pesticidas citados anteriormente, biossensores com AChE
purificada vem ganhando destaque, porém uma das etapas mais críticas para construção
destes biossensores é o processo de imobilização enzimática. Esse processo é baseado
na retenção de uma biomolécula no interior de um reator ou de um sistema analítico
aumentando o tempo de vida e estabilidade da biomolécula em relação à temperatura, ao
pH e aos solventes orgânicos, utilizando pequenos volumes de amostras (CARDOSO et
al, 2009). Marques e Yamanaka (2008) relatam que várias técnicas de imobilização são
empregadas, baseadas nas ligações físicas e químicas entre a biomolécula e o suporte.
Dentre as mais utilizadas estão: adsorção, encapsulação, ligação covalente e ligação
covalente cruzada. A adsorção física da enzima é o modo mais simples e rápido de
imobilização, pois a enzima fica retida na superfície do suporte insolúvel. A técnica de
encapsulação é baseada no confinamento da enzima em uma membrana localizada na
superfície do eletrodo. Esta membrana retém a enzima, apresentando porosidade
controlada, de maneira a permitir a livre difusão do substrato e dos produtos da reação
através da mesma. Já nas ligações covalentes, a retenção da enzima na superfície do
suporte é efetuada por ligações entre os grupos funcionais da enzima e a superfície do
suporte. E por fim a ligação covalente cruzada é livre de suporte, e as enzimas estão
ligadas umas as outras, ou a proteínas inativas (albumina ou gelatina), formando uma
estrutura tridimensional complexa. Além do processo de imobilização enzimática, outra
lacuna existente é o alto custo da enzima purificada, que poderá ser minimizado
utilizando-se extratos enzimáticos brutos de AChE, que por sua vez foi a motivação
desta pesquisa, pois há poucos estudos relativos à imobilização realizada com extratos
brutos de AChE. Este extrato bruto pode ser uma alternativa viável para a diminuição
do custo efetivo desta enzima, tornando-a mais atrativa para a construção e
comercialização de biossenssores de inibição enzimática identificadores de pesticidas.
Estudos envolvendo imobilização enzimática vêm sendo amplamente
explorados, pois trata-se de uma técnica vantajosa que envolve enzimas em solução,
permitindo, assim, uma separação da enzima do meio reacional, e a possibilidade de
reutilização da mesma (CARDOSO et al, 2009).
Klein (2010) relata que existem várias técnicas de imobilização enzimática e
com isso muitos suportes e ou matrizes vêm sendo desenvolvidas para este fim, pois
não há uma matriz universal. Porém, existe uma classificação baseada em sua
19
morfologia. Nestas encontram-se os suportes não porosos, que geralmente apresentam
área superficial muito baixa, limitando a área de imobilização à superfície externa. Os
porosos apresentam uma grande área superficial por unidade de peso, aumentando sua
capacidade de imobilização quando os poros excederem de 5 a 10 vezes o tamanho do
glóbulo proteico. De acordo com Cabral et al (1991), as matrizes também podem ser
classificadas como orgânicas e inorgânicas. As orgânicas são representadas pelos
polímeros naturais ( celulose, quitosana, amido, ágar, agarose, dentre outras), polímeros
sintéticos (poliestireno, poliamidas, etc) e proteínas como colágeno, albumina, gelatina,
etc. As inorgânicas são representadas pelos minerais (bentonita, pedra pomes, areia,
titânio, etc) e pelos manufaturados (vidros de porosidade controlada, cerâmicas, géis de
sílica, etc).
Atualmente, materiais mesoporosos como a sílica, vêm ganhando destaque nas
pesquisas, justamente pela sua gama de aplicações, pois apresentam áreas de superfície
elevada, acima de 1000 m2 /g e mesoporos que variam de 2,0 nm a várias dezenas de
nanômetros, dependendo das condições de síntese (SOUSA; SOUSA, 2005).
O desenvolvimento da sílica SBA-15 (tamanho dos poros: 5-13nm) resolveu um
problema crítico na imobilização de enzimas de determinados tamanhos. Pequenas
modificações na sua estrutura, como o alargamento dos poros, aceleram a adsorção
destas enzimas (KIM et al, 2006).
Cardoso 2009, observando estas características, imobilizou a AChE em capilares
de sílica fundida, onde a enzima foi ligada covalentemente à parede do capilar,
utilizando glutaraldeído como espaçador. Além do glutaraldeído, outro ligante químico,
o éster de succinimida Ng-maleimidobutiriloxi (GMBS) pode ser usado para
imobilização por ligação covalente cruzada de AChE em sílcas porosas e não porosas
(SINGH et al, 1999).
Segundo Vamvakaki e Chaniotakis (2007), a sílica mesoporosa tem provado ser
muito útil na adsorção e na estabilização da AChE, justamente pela presença de
mesoporos de determinados tamanhos que desempenham um papel importante e talvez
essencial na estabilização da enzima.
Outras matrizes também podem ser utilizadas para imobilização de
AChE, como a quitosana, derivada da quitina, que é um polissacarídeo extremamente
abundante na natureza, sendo o principal constituinte das cascas de camarão e das
carapaças de caranguejo. A mesma se destaca por sua capacidade de agir como
quelante, podendo se ligar seletivamente a substâncias como proteínas, células
tumorais, íons metálicos e gorduras. No formato de esferas e microesferas, vem sendo
amplamente empregada em diversas áreas da biotecnologia, principalmente, como
veículo de transporte e liberação de drogas, pela sua alta capacidade de adsorção.
Contudo, essa capacidade de adsorção pode ser elevada quando a quitosana for
submetida ao entrecruzamento com o glutareladeído (GOY et al, 2004).
O objetivo dessa pesquisa foi realizar testes de imobilização enzimática da
AChE retirados de cérebros de camundongos suíços, avaliando a atividade enzimática e
dosando as concentrações de proteínas nas alíquotas retiradas durante o processo
realizado em dois suportes, sílica mesoporosa e quitosana reticulada com glutaraldeído
e avaliar o tempo de reutilização da enzima baseado na atividade enzimática pós
imobilização nos dois suportes citados anteriormente.
20
METODOLOGIA
Delineamento experimental
Tendo como objetivo avaliar dois métodos de imobilização enzimática nos
suportes sílica mesoporosa e quitosana com glutaraldeído, as estapas experimentais
estão descritas no esquema abaixo:
Extração de acetilcolinesterase de cérebro de camundongos suíços
Após realização da eutanásia, os cérebros dos camundongos suíços foram
utilizados para a extração da acetilcolinesterase do cérebro, que foram removidos e
homogeneizados em 3 a 5 volumes de Tampão fosfato 0,1mol/L pH 7,5, através de 20
passagens em aparelho homogeneizador de tecidos . Em seguida, este material foi
centrifugado a 20000 RPM por duas horas, a 5oC, descartando-se o sobrenadante. O
sedimento foi ressuspenso em 3 a 5 volumes de Triton X-100 a 0,5% e passado cinco
vezes no aparelho homogeneizador de tecidos. Após 30 minutos, sob agitação
constante, este material foi centrifugado nas mesmas condições anteriores. O
sobrenadante foi estocado para as análises de imobilização.
Processo de Imobilização.
Ensaio da acetilcolinesterase
A atividade de colinesterase foi ensaiada pelo método de Ellman (1961)
adaptado. Para um volume final de reação de 2000 μL acrescenta-se, para medir a
atividade: 1890 μL de solução tampão de ensaio (fosfato de sódio 0,1mol/L, pH 7,5),
21
50μL de DTNB (6,4mol/L), 50 μL substrato de Iodeto de acetiltiocolina (Sigma) na
concentração final de 1,875mol/L e 10 μL do substrato enzimático bruto. Em todos os
casos a formação do produto foi medida pela absorção contínua em ensaio cinético,
durante 180 s a 412 nm, em espectrofotômetro Biospectro SP-22. Para os cálculos da
atividade enzimática foi usado o coeficiente de extinção molar de 14.150 M-1.cm-1 para
o ácido tionitrobenzóico (TNB) formado.
Parâmetros cinéticos da acetilcolinesterase
Os parâmetros cinéticos da acetilcolinesterase foram ensaiados pelo método de
Ellman (1961) adaptado. Para um volume final de reação de 2000 μL acrescentou-se,
para medir os parâmetros: concentrações entre 1790 μL a 1930 μL de solução tampão
de ensaio (fosfato de sódio 0,1mol/L, pH 7,5), 50 μL de DTNB (6,4mol/L), 0,005 μL a
200 μL substrato de Iodeto de acetiltiocolina na concentração final de 1,875mol/L e 10
μL do extrato enzimático bruto de AChE.
Dosagens de proteínas retiradas do sobrenadante durante o processo de
imobilização em quitosana com glutaraldeído e sílica mesoporosa pelo método de
Peterson (1977).
As dosagens de proteína das alíquotas retiradas do sobrenadante durante o
processo de imobilização foram colocadas em tubos de ensaio, e dosadas pelo método
de Peterson (1977). Para um volume final de reação de 2000 μL: 10 μL da alíquota
imobilizada retirada do sobrenadante de 1 em 1 h, foi acrescentada em 790 μL de água
deionizada, 800 μL do reativo A (solução de sulfato de cobre 0,1 %, tartarato de sódio e
potássio 0,2 % e carbonato de sódio 10 % e uma solução de Hidróxido de sódio NaOH e
dodecil sulfato de sódio SDS), agitando por 30 segundos em vortex (Lab dancer, marca
IKA), deixando em repouso por 10 minutos, posteriormente adicionou-se 400 μL do
reativo B (que é uma solução de Follin-Ciocalteau (Sigma-Aldrich) diluída cinco vezes
com água deionizada), agitando em vortex, e deixando repousar por mais 20 minutos,
realizando a leitura em espectrofotômetro (SP-22) a 750 nm.
Realizamos ensaios padrão com amostras de albumina sérica bovina (BSA) com
diferentes diluições (P 10 e P 100, 10 μl e 100 μl de albumina diluída 1:100,
respectivamente).
Imobilização enzimática em sílica mesoporosa
Foram pesados 1,2 g de sílica mesoporosa (em balança de precisão modelo AW
220 da marca Marte), e colocadas em becker contendo 10 mL de solução tampão fosfato
pH 7,0 0,1mol/L e 20 μL de extrato enzimático bruto. Sob agitação e temperatura
ambiente durante 24 h, retirando-se alíquotas de 100 μL do sobrenadante de 1 em 1 h,
durante as 4 primeiras horas, estas foram usadas nos testes de dosagens de proteínas e
ensaio de atividade enzimática
Ensaio da atividade enzimática da AChE imobilizada em sílica mesoporosa nova e
de reuso.
Atividade enzimática da AChE imobilizada em sílica mesoporosa foi ensaiada
pelo método de Ellman (1961) adaptado. Para um volume final de reação de 2000 μL
acrescenta-se, para medir a atividade: 1890 μL de solução tampão de ensaio (fosfato de
22
sódio 0,1mol/L, pH 7,5), 50μL de DTNB (6,4mol/L), 50μL substrato de Iodeto de
acetiltiocolina para a concentração final de 1,875mol/L e 0,0205g de sílica mesoporosa
imobilizada com AChE. Estes reagentes foram colocados em tubos tipo plástico de 2
mL, agitados no vortex por 10 minutos, sendo posteriormente centrifugados a 40C por 3
minutos à 5000 RPM. Depois o sobrenadante foi retirado e realizada a leitura em
espectrofotômetro.
Imobilização enzimática em quitosana
Confecção de esferas de quitosana
Foram dissolvidos 1,5 g de quitosana em 37,5mL de solução de ácido acético
(5%mm). Esta solução ficou em homogeneização por 10 minutos. Posteriormente, foi
gotejada com o auxílio de uma seringa de 1mL em uma solução NaOH 2,5mol/L para a
formação das partículas esféricas de quitosana. Após recolher as esferas formadas as
mesmas foram mantidas em solução alcalina por 16 h, filtradas e lavadas
abundantemente com água deionizada. Após este tempo, as esferas foram mantidas em
solução tampão fosfato de sódio (pH 7,5 a 1mol/L) até o inicio do processo de
encapsulação e imobilização enzimática (ASSIS, 2004).
Ativação com glutaraldeído
As esferas de quitosana limpas foram colocadas em solução aquosa de
glutaraldeído (3%m/m) e submetidas a agitação suave em um agitador eletromagnético
(MOD: 30x30 LS 666 marca LOGEM) em temperatura ambiente durante 24 h. No final
do processo as esferas foram lavadas com água deionizada para retirada do excesso de
glutaraldeído. Algumas esferas ativadas foram mantidas em tampão (fosfato de sódio
0,1mol/L pH 7,5) (CHAVITA, 2010), e outras desidratadas e segregadas.
Imobilização da acetilcolinesterase em quitosana com glutaraldeído
Foram colocados 7,43 g de esferas de quitosana ativadas com glutaraldeído, em
becker contendo 10 mL solução tampão (fosfato de sódio pH 0,1mol/L 7,5) e 20 μL de
extrato enzimático bruto (atividade previamente estabelecida em U/mL). Esta mistura
ficou em temperatura ambiente durante 24 h, sendo retirando alíquotas de 100 μL do
sobrenadante de 1 em 1 h, durante as 3 primeiras horas, para realização de testes de
dosagens de proteínas pelo método de Peterson (1977) e atividade enzimática.
Ensaio da atividade enzimática da AChE imobilizada em quitosana com
glutaraldeído nova e de reuso
Atividade enzimática da AChE imobilizada em quitosana com glutaraldeído foi
ensaiada pelo método de Ellman (1961) adaptado. Para um volume final de reação de
2000 μL acrescentou-se, para medir a atividade: 1890 μL de solução tampão (fosfato de
sódio 0,1mol/L, pH 7,5), 50 μL de DTNB (6,4mol/L), 50 μL substrato de Iodeto de
acetiltiocolina na concentração final de 1,875mol/L e 0,020 g de quitosana com
glutaraldeído imobilizada com AChE. Estes reagentes foram colocados em tubos tipo
plástico de 2 mL, agitados no vortex por 10 minutos, sendo posteriormente
23
centrifugados a 40C por 3 minutos a 5000 RPM. Depois o sobrenadante foi retirado para
realização da leitura em espectrofotômetro a 412 nm.
RESULTADOS
Esta pesquisa foi desenvolvida no laboratório LEMAM do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do campus Cabo Frio, RJ.
Curva de substrato de iodeto de acetiltiocolina
A curva de substrato de iodeto de acetiltiocolina da enzima livre, determinando
os parâmetros cinéticos da mesma, baseando-se na atividade enzimática do extrato
enzimático bruto de AChE cerebral, retirados de camundongos suíços, está representada
pela figura 5. Para os cálculos da atividade enzimática foram usado o coeficiente de
extinção molar de 14.150 M-1.cm-1 para o ácido tionitrobenzóico (TNB) formado, o KM.
e a VMAX.
Figura 5. Curva de substrato de iodeto de acetiltiocolina(A) e obtenção dos parâmetros
cinéticos (Vmax e Km) da ache livre. (B) gráfico do duplo recíproco (lineweaver-burk)
Comparação das dosagens de proteínas coletadas durante o processo de
imobilização enzimática
A comparação das dosagens de proteínas (método de Peterson 1977) das
alíquotas coletadas durante o processo de imobilização de AChE, em quitosana com
glutaraldeído e sílica mesoporosa está representada na tabela 1. Foram realizados testes
em intervalos de 1, 2, 3 e 4 h, sem repetições.
24
Tabela 1 – Dosagem de proteínas, realizadas durante o processo de imobilização
enzimática em quitosana com glutaraldeido e sílica mesoporosa (Concentração em
mg/mL).
1h
2h
3h
4h
Quitosana com glutaraldeido
0,163 0,160 0,131 0,152
Sílica mesoporosa
0,072 0,056 0,032 0,022
Atividade enzimática de AChE imobilizada em sílica mesoporosa
A atividade enzimática de AChE imobilizada na matriz sílica mesoporosa foi
ensaiada durante 90 minutos conforme figura 6.
Figura 6. Atividade enzimática de ache imobilizada em sílica mesoporosa.
Fonte: Próprio autor (2015).
Leitura da atividade enzimática de AChE imobilizada em quitosana com
glutaraldeído.
As leituras da absorvância da atividade enzimática de AChE após 1 e 3 horas do
início do processo de imobilização em quitosana com glutaraldeído estão ilustradas nas
figuras 7 e 8.
25
Figura 7. Leitura da absorvância da atividade enzimática realizada durante o processo
de imobilização em quitosana com glutaraldeído após coleta do sobrenadante em 1 hora.
0.07
Absorvância (DO)
0.06
0.058
0.06
61
83
0.05
0.04
0.035
0.03
0.02
0.01
0.005
0.002
0
0
15
37
tempo (min)
Figura 8. Leitura da absorvância da atividade enzimática realizada durante o processo
de imobilização em quitosana com glutaraldeído após coleta do sobrenadante em 3
horas.
0.06
0.053
Absorvância (DO)
0.05
0.04
0.03
0.017
0.02
0.01
0.01
0
0
15
37
tempo (min)
Leitura da atividade enzimática de AChE imobilizada em sílica mesoporosa nova e
de reuso
Os ensaios das atividades enzimáticas em sílica mesoporosa nova e em sílica de
reuso com 22, 56 e 63 dias de armazenamento todas imobilizadas com AChE estão
demonstrados nas figuras 9, 10 e 11.
26
Figura 9. Ensaio da atividade enzimática em sílica nova imobilizada com ache e sílica
de reuso, armazenada por 22 dias.
1.6
1.39
Absorvância (DO)
1.4
1.2
1.192
1.24
1.184
1
0.8
0.538
0.6
Abs. Sílica Nova
0.352
0.4
Abs. Sílica reuso
0.227
0.108
0.2
0
10
20
30
45
tempo (min)
0.4
0.362
Absorvância (DO)
0.35
0.286
0.3
0.23
0.25
0.308
0.254
0.2
Abs. Sílica reuso
0.15
0.101
0.104
30
45
0.128
0.113
0.1
0.05
0
0
15
tempo (min)
60
75
Abs. Sílica Nova
27
0.25
0.206
Absorvância (DO)
0.2
0.156
0.152
0.15
0.134
0.107
0.125
0.105
Abs. Silica reuso
0.1
Abs. Silica Nova
0.065
0.05
0
41
56
69
86
Tempo (min)
Leitura da atividade enzimática de AChE imobilizada em sílica mesoporosa de
reuso
Os ensaios da atividade enzimática realizados em sílica mesoporosa de reuso
imobilizada com AChE após armazenamento de 128 e 312 dias estão ilustrados nas
figura 12 e 13.
Figura 12. Ensaio da atividade enzimática em sílica de reuso imobilizada com ache,
após 128 dias de armazenamento.
0.4
0.39
Absorvância (DO)
0.39
0.378
0.38
0.37
0.358
0.36
0.358
Abs. Silica reuso (128 dias)
0.35
0.35
0.34
0.33
30
43
53
Tempo (min)
63
73
28
Figura 13. Ensaio da atividade enzimática em sílica de reuso imobilizada com ache,
após 312 dias de armazenamento
0.4
0.364
Absorvância (DO)
0.35
0.3
0.252
0.25
0.276
0.234
0.2
Abs. Sílica reuso (312 dias)
0.15
0.1
0.05
0
20
40
60
80
Tempo (min)
Leitura da absorvância da atividade enzimática de AChE imobilizada em
quitosana com glutaraldeído.
Os ensaios da atividade enzimática realizados em quitosana com glutaraldeído
imobilizado com AChE, armazenada por 23 e 112 dias estão representadas nas figuras
14 e 15.
Figura 14. Absorvância da atividade enzimática de ache imobilizada em quitosanaglutaraldeído de reuso, após 23 dias de armazenamento
0.14
Absorvância (DO)
0.12
0.126
0.111
0.1
0.08
0.063
0.06
Abs. Quitosana glutaraldeido
reuso após 23 dias
0.04
0.02
0
30
45
Tempo (min)
60
29
Absorvância (DO)
Figura 15. Absorvância da atividade enzimática de ache imobilizada em quitosanaglutaraldeído de reuso, após 112 dias de armazenamento
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.444
0.373
0.364
0.113
20
40
60
Abs. Quitosana glutaraldeido
reuso (112 dias)
80
Tempo (min)
Comparação das leituras das atividades enzimáticas de AChE de reuso
imobilizadas em sílica mesoporosa e quitosana com glutaraldeído.
A comparação das atividades enzimáticas de AChE imobilizada na matriz de
reuso quitosana com glutaraldeído após 112 dias de imobilização e sílica mesoporosa
após 128 dias esta ilustrada na figura 16.
Figura 16. Comparação das absorvâncias das atividades enzimáticas em matriz de
reuso sílica mesoporosa e quitosana-glutaraldeído imobilizadas com AChE
30
DISCUSSÃO
Após análises dos parâmetros cinéticos, foi determinada que a velocidade
máxima enzimática da AChE livre, foi de 21,93 U.mL-1 em uma concentração de 0,125
mmol/L-1 de substrato como a Constante de Michaellis Menten . Com estes parâmetros
foi estabelecida a concentração de substrato utilizada nos ensaios enzimáticos
realizados no experimento (1,785 mmol.L-1, aproximadamente 10 vezes o valor da KM).
Matrizes inorgânicas e orgânicas são utilizadas na imobilização de
acetilcolinesterase, sendo as primeiras mais empregadas (DOMINGUES-RENEDO et
al., 2012; STOYLOVA et al., 2010; MILKANE et al. 2010). Após análises das
dosagens de proteínas coletadas durante o processo de imobilização, verificou-se uma
diminuição progressiva na dosagem, indicando que, quanto menor for a dosagem,
melhor será o processo de imobilização enzimática nos suportes sílica mesoporosa e
quitosana com glutaraldeído, pois demonstra que as proteínas deixaram o sobrenadante
e foram imobilizadas nos suportes. Entretanto, a sílica mesoporosa foi a matriz mais
eficaz do que a quitosana com glutaraldeído, pois apresentou uma maior diminuição em
sua dosagem. Embora não tenha apresentado o mesmo resultado que a sílica
mesoporosa a quitosana com glutaraldeído vem se destacando na área da biotecnologia,
aplicada como microesferas para liberação controlada de drogas (GOY et al, 2004).
Constatou-se no processo de imobilização de AChE no suporte sílica
mesoporosa, um aumento progressivo da atividade enzimática, o que faz dessa matriz
um bom suporte para imobilização de AChE, sendo estável nos testes de atividade
catalítica, estando de acordo com Cardoso et al (2009), que imobilizou AChE em
capilar de sílica fundida em que a mesma mostrou boa estabilidade e atividade
enzimática. Kim et al (2006) consideram a sílica mesoporosa um eficiente método de
adsorção de enzimas para fins de imobilização e estabilização.
Os ensaios da atividade enzimática realizados durante a primeira e a terceira
hora do processo de imobilização de AChE em quitosana com glutaraldeído,
demonstraram um aumento linear na leitura da absorvância, indicando que quanto
maior for o tempo do processo, melhor será o encapsulamento da AChE.
Em relação à comparação dos ensaios das atividades enzimáticas de AChE
imobilizadas em sílica mesoporosa nova e reuso armazenada durante 22, 56, 63 dias,
merece destaque a sílica mesoporosa de reuso que apresentou uma atividade enzimática
consistente e progressiva. Porém, seus altos valores na leitura das absorvâncias foram
resultados do armazenamento da amostra contendo pequena quantidade de sobrenadante
que continuou reagindo. Sendo assim, a sílica mostrou ser uma boa matriz para
imobilização e estabilização enzimática, o que vai ao encontro com estudos realizados
por Stoilova et al (2010), que mediram semanalmente a atividade enzimática de AChE
livre e imobilizada em microfibra armazenadas em tampão fosfato a 40C durante um
período de 60 dias, concluindo que a AChE imobilizada obteve maior atividade
enzimática do que a enzima livre durante todo o período.
Ficou demonstrado pelos ensaios, que as atividades enzimáticas de AChE de
reuso armazenadas durante 128 e 312 dias, persistiu ao longo do tempo, sendo a sílica
mesoporosa uma matriz eficiente para realização de imobilização e estabilização
enzimática, corroborando os estudos realizados por Singh et al (1999) que mediram a
atividade enzimática de AChE imobilizado em sílica mesoporosa durante um período de
1 ano, observando pouca perda da atividade enzimática ao longo do tempo.
Nos ensaios realizados na matriz de reuso de AChE imobilizada em quitosana
com glutaraldeído após armazenamento por 23 dias, constatou-se a ocorrência de uma
pequena variação não linear na atividade enzimática, porém após 112 dias de
31
armazenamento houve queda progressiva na atividade, sugerindo que a mesma não
mostrou ser uma boa matriz para reutilização prolongada das enzimas.
Na comparação das atividades enzimáticas de AChE de reuso imobilizadas na
matriz quitosana com glutaraldeído, após 112 dias de armazenamento e sílica
mesoporosa após 128 dias, ficou explícito que a sílica mesoporosa demonstrou ser uma
matriz mais eficiente para imobilização, estabilização e reutilização da AChE.
CONCLUSÕES
Após as análises realizadas concluiu-se que:
1. A sílica mesoporosa apresentou melhor resposta em todos os parâmetros
testados: dosagem de proteínas, atividade da enzima durante a imobilização e
atividade da enzima após períodos de estocagem e reutilização (reuso);
2. A sílica mesoporosa de reuso imobilizada com AChE é uma matriz mais eficaz,
pois apresentou aumento progressivo na leitura da absorvância da atividade
enzimática mesmo depois de 300 dias, o que não aconteceu com a quitosana
com glutaraldeído que apresentou queda na absorvância da atividade enzimática
após 112 dias;
32
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DISSERTAÇÃO Paulo R R B Nogueira

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