Romeis-Mikroskopische Technik Probeseiten

Anleitung A2.31
Anwendung von DiI an post
mortem-Material
1. Die Inkubation der Fluoreszenzfarbstoffe in Fixierlösung (4% Paraformaldehyd) kann von 3 Tagen bis zu
mehreren Monaten dauern. Dabei sollte das Präparat
immer lichtgeschützt in einem gut verschlossenen
Gefäß in genügend Fixativ liegen. Die Temperatur
kann von 4 °C bis 37 °C gewählt werden, wobei höhere Temperaturen die Qualität des Gewebes evtl.
beeinträchtigen
2. für die Aufarbeitung wird der Gewebeblock in abgekühltem Agar-Agar eingebettet, mit Sekundenkleber
auf ein Holzblöckchen geklebt und am Vibratom in
Na-PB 80–100 µm dick geschnitten
3. die Schnitte werden mit einem Pinsel auf unbeschichtete Objektträger aufgetragen und noch nass mit
einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Einbettmedium (z. B. Mowiol, Gelmount) eingedeckelt
und im Kühlschrank lichtgeschützt bis zur weiter
Verwendung gelagert
4. für eine Orientierung im Präparat empfiehlt sich jeweils einige Schnitte einer Serie für Nissl-Färbung zu
verwenden oder einige Schnitte einer DAPI Färbung
zu unterziehen
Bemerkung: Um eine möglichst gute Feinstruktur an
fixiertem Material zu erhalten, sollte die Zeit zwischen
dem Beginn der Fixierung des Materials und der Farbstoffapplikation möglichst gering gehalten werden und
bei etwa 2 Tagen liegen.
2
77
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Unter­suchung und Präparation lassen sie sich direkt oder nach Fixierung (Kap. 2.3) weiter
verkleinern und für die direkte Beobachtung, für Färbun­
gen und Lokalisationsstudien oder für die weitere Präpara­
tion (z. B. für die TEM) vorbereiten.
Die Gewinnung von Proben für biochemische Un­
tersuchungen kann die mikroskopische Beobachtung und
Kontrolle erfordern. Dazu werden hier ebenfalls einige
Techniken (Zellfraktionierung, Lasermikrodissektion) vor­
gestellt, auch wenn die Mikroskopie dabei zumeist nur eine
(wichtige) Nebenrolle spielt.
2.2.1 Abstrichpräparate
Von zugänglichen Epitheloberflächen lässt sich Material
abnehmen und auf einem Objektträger abstreichen. Diese
einfache, nicht-invasive Untersuchungsmethode hat enor­
me Bedeutung in der Präventivmedizin erlangt und reprä­
sentiert die Grundlage der Cytodiagnostik. Die meisten
Präparate werden wohl in der Gynäkologie vom Vaginalund Zervikalepithel (Epithel der Vagina, der Portio vagi­
nalis cervicis und des Canalis cervicis uteri) angefertigt,
doch auch Abstriche anderer Schleimhäute, wie Mund­
schleimhaut, Tonsillenoberfläche, Conjunctiva usw., sowie
von Wundrändern exulzerierter Areale, sind üblich.
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Unter­
suchung und Präparation
Die meisten biologischen und medizinischen Untersu­
chungsobjekte sind zu groß und/oder zu dick, um sie direkt
zu mikroskopieren. Normalerweise muss man die Zellen
oder Gewebeteile, die von Interesse sind, zunächst aus ihrem
Umfeld isolieren. Dabei sollen die morphologischen und
biochemischen Eigenschaften möglichst erhalten bleiben.
Zellen lassen sich direkt durch verschiedene Abstrichund Abtupfverfahren gewinnen oder durch Mazerationsme­
thoden aus einem Gewebeverband lösen. Aus Suspensionen
können sie durch Filtration oder Zentrifugation angereichet
werden. Ihre spezifischen Eigenschaften werden genutzt, um
sie zu sortieren und in getrennten Fraktionen anzureichern.
Organ- oder Gewebeproben werden mit feinen Sche­
ren, speziellen Nadeln, Rasierklingen oder scharfem Skal­
pell entnommen. Durch verschiedene Schnitttechniken
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Endozervix
Ektozervix
endo
endo
ekto
Abb. 2.21: Vorgehensweise beim Zervikalabstrich
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2
78
Die Abnahme des Zellmaterials, zusammen mit aufge­
lagertem Schleim, Detritus, Bakterien und anderem, erfolgt
mit einem Wattetupfer oder einem Holz- oder Plastikspatel
oder endoskopisch mit einer Bürste. Ist die Epithelober­
fläche schon makroskopisch mit Schleim oder Belägen
bedeckt, werden diese erst vorsichtig entfernt, bevor man
das Zellmaterial für die eigentliche Untersuchung gewinnt.
Dieses Material wird dann auf den Objektträger gebracht,
indem man den Wattetupfer abrollt oder den feuchten Spa­
tel abstreift (Abb. 2.21)
Es ist entscheidend, die Ausstriche vor der Fixierung
nicht eintrocknen zu lassen, um Schrumpfungen und Zer­
reißungen zu vermeiden.
Üblich sind folgende Fixierungen:
• Sprayfixierung z. B. mit Merckofix (Abstand Sprayfla­
sche zum Präparat: 30 cm)
• in eine Küvette mit 96 % Ethanol (oder 1:1verdünnt mit
Ether) einstellen für mindestens 30 min bis maximal
mehrere Tage. Alternative Fixanzien sind 99 % Isopro­
panol oder 90 % Aceton
Durch Zusatz von Eisessig (bis 3 %) kann man bei stark
bluthaltigen Abstrichen die Erythrocyten hämolysieren
und so den Überblick verbessern.
Gefärbt wird nach Papanicolaou (A107).
2.2.2 Ausstrichpräparate
2.2.2.1 Ausstriche von Zellsuspensionen
Zellsuspensionen werden zur mikroskopischen Untersu­
chung ausgestrichen. Dazu kann man einfach mit einer
Platinöse einen Tropfen der Suspension aufnehmen und
auf einem Objektträger durch Hin- und Herbewegen der
Öse oder durch kreisende Bewegung verteilen. Punktatflüs­
sigkeiten, Harnsediment oder Sperma kann in dieser Weise
aufgebracht werden, die Verteilung der zellulären Elemente
ist allerdings oft recht unregelmäßig. Eine gleichmäßige
Verteilung der suspendierten Partikel erzielt man dagegen
durch den Objektträgerausstrich, wie er als Blutausstrich
(Abb. 2.22) beschrieben ist (A2.32). Die gleichmäßige Ver­
teilung ist Voraussetzung für quantitative Auswertungen.
Nach dem Lufttrocknen eines Ausstriches folgt meist
eine Fixierung in Methanol (z. B. vor einer Giemsa-Färbung,
A3.103). Will man mit der May-Grünwald-Lösung
(A3.104) zuerst färben, so ist die Fixierung mit Methanol
nicht nötig, da die Farbstofflösung selbst Methanol enthält.
Der getrocknete Ausstrich kann aber auch in Ethanol oder
in gleichen Teilen Ethanol und Ether fixiert werden. In al­
len Fällen stellt man die trockenen Objektträger für 10 min
in eine Küvette mit dem Fixiermittel, zieht sie dann heraus
Romeis.indd 78
2 Präparations­methoden
und stellt sie schräg auf einen Streifen Filterpapier, wo sie
wieder trocknen.
Zur Hitzefixierung von Ausstrichen fasst man den Ob­
jektträger mit einer Pinzette und zieht ihn 2–3-mal durch
die Flamme eines Bunsenbrenners (Reduktionsflamme).
Die Dauer der Hitzeeinwirkung wird bei dieser Vorgehens­
weise allein durch die Erfahrung bestimmt.
Zur Fixierung noch feuchter Ausstriche verwendet
man Formoldämpfe oder Osmiumdämpfe (Kap. 2.3). Dazu
werden die frisch hergestellten Ausstriche in eine feuchte
Kammer gebracht, die das gewählte Fixiermittel enthält.
Anleitung A2.32
Blutausstrich
Material:
• unbeschichtete, fettfreie Objektträger
Man legt die Objektträger in eine Ether-Ethanolmischung und reibt sie vor Gebrauch mit einem sauberen Leinenlappen ab. Die Ausstrichfläche niemals mit
dem Finger berühren!
Durchführung (Abb. 2.22):
1. Bluttropfen (oder einen Tropfen der Zellsuspension)
auf einen Objektträger A (etwa 1,5 cm von dessen
Ende entfernt) geben
2. zweiten Objektträger B schräg auf die Mitte von A
setzen
3. Objektträger B an den Tropfen heranziehen, bis er ihn
berührt
4. warten, bis sich die Flüssigkeit durch die Kapillarwirkung in der Kante zwischen Objektträger A und B
gleichmäßig auseinanderzieht
5. Objektträger B in unverändert schräger Stellung über
den Objektträger A schieben, so dass die Flüssigkeit
im Winkel zwischen A und B auf dem Objektträger A
ausgestrichen wird. Die Bewegung muss gleichmäßig
und nicht zu rasch, aber doch zügig erfolgen. Nach dem
Ausstreichen nimmt man Objektträger A auf und sorgt
durch Hin- und Herbewegen für rasche Lufttrocknung.
Folgendes ist zu beachten:
• Die Dicke des Ausstrichs hängt vom Winkel (in
Abb. 2.22 mit a bezeichnet) zwischen den Objektträgern A und B ab. Je kleiner dieser Winkel ist, desto
dünner wird der Ausstrich. Ein Winkel von etwa 45°
bringt gute Resultate. Lässt man auf dem getrockneten Ausstrich Licht reflektieren, so sollte er grünlich
aufleuchten. Erscheint der Ausstrich dagegen rot, so
ist er zu dick geraten.
• Das Volumen des aufgesetzten Bluttropfens soll so
bemessen sein, dass die Flüssigkeit noch vor dem
Absetzen des vorgeschobenen Objektträgers B aufgebraucht ist. War das Volumen zu groß, bleibt ein
dicker, nur langsam antrocknender Rand am Ende
des Ausstrichs stehen. War das Volumen zu gering,
wird der Ausstrich zu kurz.
Fortsetzung
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2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Unter­suchung und Präparation Fortsetzung
2.2.3 Tupf- oder Abklatschpräparate
• Erfolgt das Vorschieben des Objektträgers B zu hastig
oder ruckartig, kann der Flüssigkeitsfilm abreißen.
Der Ausstrich wird umso dicker, je langsamer der
Vorschub erfolgt.
• Erfolgt das Vorschieben des Objektträgers B nicht
gleichmäßig und zügig, wird der Ausstrich unterschiedlich dick.
• Der Objektträger B zum Ausziehen des Tropfens sollte möglichst geschliffene Kanten besitzen.
• Nach dem Aufsetzen des Bluttropfens muss sofort
ausgestrichen werden.
Bei einem gelungenen Ausstrich bedecken die Blutkörperchen in dünner Schicht und voneinander separiert die
Oberfläche. Übereinanderliegen und Verkleben der Blutkörperchen ist meist eine Folge zu großer Bluttropfen.
Deformierte Blutkörperchen oder zerquetschte Leukozyten weisen auf falsche Bewegung des ausstreichenden
Objektträgers hin. Stechapfelformen der Erythrozyten
treten bei langsamem Trocknen des Ausstrichs auf. Dies
ist wiederum eine Folge von zu dickem Ausstreichen
und/oder zu großem Bluttropfen. Benetzt der Flüssigkeitsfilm den Objektträger nicht gleichmäßig, so waren
auf der Oberfläche noch Fettspuren vorhanden.
a
a
Schubrichtung
Warten
Schubrichtung
Abb. 2.22: Blutausstrich
2.2.2.2 Organausstriche
Zur Herstellung von Organausstrichen streicht man mit
der Kante eines Objektträgers über eine frische Schnittflä­
che des zu untersuchenden Organs und stellt dann aus dem
so gewonnenen Medium ein Ausstrichpräparat her, wie es
für Blut beschrieben wurde. Die noch feuchten Ausstriche
werden beliebig für 10 min fixiert, zum Studium des hä­
matopoetischen Systems am günstigsten nach Helly oder
Maximow (Kap. 2.3).
Romeis.indd 79
2
79
Tupft man die frische Schnittfläche eines unfixierten Organs
auf die Oberfläche eines gut gereinigten Objektträgers, so
bleibt eine Anzahl isolierter Zellen auf der Glasoberfläche
haften. Bei weichen Geweben, wie z. B. Milz, Lymphknoten
oder Knochenmark, genügt es, das Material aufzutupfen; im
Fall von konsistenteren Geweben streift man mit der Ober­
fläche unter mildem Druck über den Objektträger. Meist
lässt man das Präparat lufttrocknen und färbt mit der Lösung
nach May-Grünwald (A3.104). Diese äußerst einfache und
schnelle Untersuchungsmethode kann als Ersatz oder zur Er­
gänzung der Schnellschnittdiagnostik Verwendung finden.
2.2.4 Isolationspräparate (Zupfpräparate)
Kleine Gewebeproben können durch Zerzupfen mit Präpa­
riernadeln in einem Tropfen von 0,75 % Kochsalzlösung so
weit zerteilt werden, dass die entstehenden Fragmente, Zell­
gruppen und Einzelzellen nach Auflegen eines Deckglases
mikroskopiert werden können. Der Grad des Zerzupfens
hängt von der Struktur des zu untersuchenden Organs ab.
Von Organen mit einfach zu isolierenden Elementen, (z. B.
Thymus, Lymphknoten, Milz) hat man bereits nach kurzer
Zeit ausreichend viele zelluläre Elemente isoliert, wie die
Trübung des Flüssigkeitstropfens, in dem man arbeitet, an­
zeigt. Konsistentere und kohärente Organe dagegen muss
man ausdauernd zerzupfen, geordnete Strukturen, wie z. B.
Skelettmuskel, zerreißt man nicht planlos, sondern zieht
immer senkrecht zur Längsrichtung der Fasern.
Nach dem Zerzupfen des Gewebes wird sofort ein
Deckglas aufgelegt. Ein Andrücken des Deckglases muss
auf jeden Fall vermieden werden, da es sonst zum Quet­
schen und damit zur Formveränderung empfindlicher
Strukturen kommt. Sicherheitshalber bringt man an den
Ecken der Deckgläser Wachsfüßchen an. Ist zu wenig Flüs­
sigkeit unter dem Deckglas, lässt man vom Rand her etwas
Kochsalzlösung zufließen.
2.2.5 Isolation von Zellen
2.2.5.1 Entnahme von adhärenten Zellen
aus Zellkulturen
Zellmonolayer werden mit einem Kunststoffspatel vorsich­
tig von der Unterlage gekratzt.
Adhärente Zellen aus Kulturschalen können durch eine
kurze (3–5 min) Inkubation (37 °C) mit Trypsin-EDTA-
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2
80
2 Präparations­methoden
Lösung (z. B. 0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA in Ca2+- und
Mg2+-freiem PBS, pH 7,8) abgelöst und isoliert werden.
2.2.5.2 Anreicherung von Suspensionszellen
Suspensionszellen werden durch sanfte Zentrifugation an­
gereichert. Zur Aufkonzentrierung von Protozoen o. ä.
ist schonend zu zentrifugieren (ca. 100–500 U/min). Gut
geeignet sind z. B. Cytozentrifugationskammern zur Anrei­
cherung. Der Überstand wird dekantiert.
Alternativ kann die Suspension durch einen Polycarbo­
natfilter entsprechender Maschenweite (5,0 µm, Nucleopo­
re) filtriert werden.
Einzellige, aktiv schwimmende Organismen können auch
aufkonzentriert werden, indem man ausnutzt, dass sie be­
stimmte Bedingungen ihrer Umgebung meiden oder bevor­
zugen. Paramecium (Ciliat) beispielsweise wird angereichert,
indem man die Kultur in einen Kolben mit englumigem
Flaschenhals gibt (Abb. 2.23). Der Kolben wird bis etwa zur
Mitte des Halses gefüllt. Darauf wird ein lockerer Watte­
bausch gelegt, darüber bis zum Rand frisches Medium gege­
ben (Abb. 2.23a). Die Zellen schwimmen entlang des Sauer­
stoffgradienten nach oben und sammeln sich nach einigen
Stunden über der Watte; Detritus und Bakterien bleiben in
dem Kolben zurück (Abb. 2.23b). Weitere Möglichkeiten der
Anreicherung von Einzellern sind in Kapitel 5 beschrieben.
Isolationsmedium
im Basismedium werden gelöst:
• 0,15% Hyaluronidase (Sigma, Typ II)
oder
• 0,33 % Dispase (Protease aus Bacillus polymyxa, Boeh­
ringer)
oder
• 0,33 % Pronase (Sigma)
Ein anderes, nur durch Calciumentzug wirksames Medi­
um wurde von Harrison und Webster (1969) angegeben
(Tab. 2.9).
Die Wirksamkeit aller genannten Medien ist durchaus
vergleichbar. Das Ablösen von Zellen kann noch mecha­
Frisches
Medium
Wattestopfen
Kulturmedium
mit Zellen
a
Zuerst wird die Oberfläche mit gekühlter 0,9 % (w/v)
Kochsalzlösung gewaschen. Dazu verwendet man eine In­
jektionsspritze mit feiner Kanüle. Der relativ scharfe Flüs­
sigkeitsstrahl entfaltet genügend mechanische Kraft, um
auch fest anhaftende Schleimsubstanzen grob abzulösen.
Anschließend bringt man die Oberflächen in die Isolations­
medien. Hohlorgane werden mit den Medien gefüllt und ab­
geklemmt (z. B. Darmsegmente). Während die Isolationsme­
dien einwirken, kann man die Oberflächen von Zeit zu Zeit
deformieren, z. B. ein gefülltes Hohlorgan zwischen Daumen
und Zeigefinger sanft kneten. Man behandelt 15–20 min. bei
37 °C und spült dann mit 0,9 % gekühlter Kochsalzlösung.
Hohlorgane werden mehrmals gefüllt und entleert, Oberflä­
chen werden wie beim Reinigen mit Kochsalzlösung abge­
spritzt. Die gesammelten Wasch- und Inkubationslösungen
mit den darin enthaltenen Zellen werden zentrifugiert und
der Bodensatz in einer geeigneten Lösung resuspendiert.
Beim Ansetzen des Isolationsmediums geht man von
einem Basismedium (Tab. 2.8) aus, in dem dann verschie­
dene Enzyme gelöst werden können.
Tabelle 2.8: Basismedium zur Herstellung von Zellsuspensionen nach Towler et al. 1978
b
Abb. 2.23: Methode der schonenden Aufkonzentrierung von
Paramecien. a) Direkt nach Einfüllen der Kultur. b) Ansammlung der Zellen in frischem Medium nach acht Stunden
96,0 mM NaCl
18,0 mM KH2PO4,
50,0 mM Na-Citrat
5,6 mM Na2HP04
1,5 mM KCl
0,25 % BSA (Rinderserumalbumin)
pH 7,2
2.2.5.3 Zellsuspensionen von Epithelien
Mit Hilfe von Calciumentzug und durch milde Behandlung
mit proteolytischen Enzymen lassen sich Epithelien rasch
ablösen und bis zu Einzelzellsuspensionen aufbereiten. Be­
sonders einfach gestaltet sich die Prozedur bei Hohlorga­
nen, die mit der zur Isolation verwendeten Lösung gefüllt
werden können.
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Tabelle 2.9: EDTA-Medium nach Harrison und Webster
1969
96,0 mM NaCl
8,0 mM KH2PO4
5,6 mM Na2HPO4
1,5 mM KC1
10,0 mM EDTA (Ethylendiamintetraacetat)
pH 6,8
25.03.2010 17:42:03
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Unter­suchung und Präparation nisch durch vorsichtiges Schaben der Oberflächen (bei
geeignetem Relief) mit einem Gummistempel unterstützt
werden. Sind in der erzielten Zellsuspension noch größere
Zellverbände, und wünscht man auch diese zu trennen,
bringt man sie nochmals in eine der erwähnten Isolierflüs­
sigkeiten. Man saugt die Suspension mit einer Pasteurpi­
pette mehrmals hoch und spritzt sie wieder aus.
2.2.5.4 Mazerationsmethoden von Zellverbänden
Mazerationsmethoden zielen darauf ab, in ihrer Form fixierte
Einzelzellen aus dem Verband zu lösen, um sie morpholo­
gisch studieren zu können. Während die isolierten lebenden
Zellen drastische Änderungen ihrer äußeren Form zeigen,
sobald sie aus dem Epithelverband gelöst sind, ist dies nach
Mazeration durch die gleichzeitig erfolgte Fixierung nicht der
Fall. Mazerationsmethoden zählen zu den klassischen Unter­
suchungstechniken der Histologie, wie sie vor der Einführung
der Mikrotome angewandt wurden. Unfixierte Epithelfetzen
oder kleine Stücke epithelial ausgekleideter Organe (z. B.
Trachea, Harnblase) werden bei 37 °C in die Mazerationsflüs­
sigkeit eingelegt. Dabei soll die Flüssigkeitsmenge etwa dem
Volumen des Gewebestücks entsprechen, höchstens aber das
Dreifache betragen. Verwendet man mehr Flüssigkeit, so
wirkt die Lösung zu stark fixierend. Nach einer gewissen
Zeit (gewöhnlich 2–3 Stunden) können die Epithelzellen
durch Schütteln, Klopfen oder Zupfen isoliert werden. Man
untersucht in der Mazerationsflüssigkeit, in Wasser oder in
Glycerin. Farbstoffe können der Untersuchungsflüssigkeit
zugesetzt werden (Eosin, Pikrokarmin, Hämalaun).
Das gebräuchlichste Mazerationsmittel für humanes
Gewebe ist 30 % Ethanol. Kleine Stücke der epithelbedeck­
ten Gewebe werden in wenig Lösung bis zu 12 Stunden
eingelegt.
Epithelzellen und Zellverbände können dann einfach
durch Schütteln, Abstreifen mit einem Messer oder Beklop­
fen der Oberfläche gelöst und abgespült werden. Weitere
Isolation erzielt man durch Zerzupfen größerer Epithelbe­
zirke, oder man füllt die Zellsuspension in ein Probenröhr­
chen, verschließt es mit einem Stopfen und schüttelt sehr
kräftig. Die Zellsuspension kann durch Zentrifugieren an­
gereichert werden. Die gewünschte Färbung wird durchge­
führt, indem man zwischen den einzelnen Arbeitsgängen
immer wieder zentrifugiert. Ein anderes Verfahren sieht
vor, die konzentrierte erste Zellsuspension auf einem Ob­
jektträger auszustreichen und den noch feuchten Ausstrich
eine halbe Stunde in Bouinsche Flüssigkeit (Tab. 2.10) zu
stellen, um ihn dann wie ein Schnittpräparat zu behan­
deln (Auswaschen in 50 % Ethanol, Wässern, Färben, Ent­
wässern und Eindecken). Andere Mazerationsflüssigkeiten
sind stark verdünntes wässriges Osmiumtetroxid (1 %; Ma­
zerationsdauer 24 h), wässrige Chromsäurelösung (1 % bis
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2
81
0,1 %; Mazerationsdauer 24 h) oder verdünnte Müllersche
Flüssigkeit (1:100) (Tab 2.10).
Die stark verdünnten Lösungen lässt man über Wochen
einwirken, es ist dann ein Zusatz von Thymol nötig. Am
raschesten mazeriert l–2 % wässrige Natriumfluoridlösung.
Zur Mazeration von Pflanzengewebe werden die Zell­
wandbestandteile aufgelöst. Sie erfordert andere Lösungen
und Enzyme und eine andere Vorgehensweise. Ein Beispiel
dafür ist in Kapitel 5 beschrieben.
2.2.6 Isolation von Gewebeteilen
Gewebe- oder Organproben werden zur direkten mikrosko­
pischen Untersuchung oder zur licht- oder elektronenmik­
roskopischen Präparation entnommen. Die Probenentnah­
me von lebenden Patienten erfordert besonders schonende
Verfahren, bei denen nur geringe Verletzungen verursacht
werden. Häufig muss man sich hier mit wenig Probenmate­
rial begnügen. Hier wird man eine Biopsie vornehmen.
Proben für pathologische oder biologische Untersu­
chungen werden häufig von vorfixiertem Material (Kap. 2.3)
entnommen. Kleine Tiere (Arthropoden, Mollusken, etc.)
werden nach Betäubung oder Abtöten direkt in den Fi­
xierungslösungen geöffnet und entsprechend zerteilt (Kap.
2.3.1.2.2). Wirbeltiere können nach Betäubung mit Fixier­
lösung perfundiert werden, um schwer zugängliche Organe
optimal zu erhalten. Die anfixierten Präparate werden an­
schließend mit einem scharfen Skalpell oder Rasiermesser
zugetrimmt und weiter fixiert.
Anleitung A2.33
Feinnadelpunktion
Durchführung (Abb. 2.2.4):
1. Die Punktionsnadel (12er- bis16er-Kanüle) wird in den
zu untersuchenden Gewebebereich eingeführt (a)
2. durch Zurückziehen des Spritzenstempels erzeugt
man Unterdruck (b)
3. die Nadel wird mehrmals rasch vor- und zurück geschoben. Dabei schwenkt man sie leicht fächerförmig (c)
4. durch langsames Vorgleitenlassen des Spritzenstempels wird der Unterdruck ausgeglichen (d)
5. die Punktionsnadel wird herausgezogen (e)
6. die Nadel wird von der Spritze entfernt (f)
7. der Spritzenstempel wird zurück gezogen, um Luft
einzusaugen
8. das Zellmaterial in der Kanüle wird auf einen vorher
beschrifteten Objektträger gespritzt (g)
9. ausstreichen ohne Druck, nicht zu dick, mit einem
zweiten Objektträger (Abb. 2.25). Fixieren des Zellausstrichs innerhalb von Sekunden durch Eintauchen in
eine Küvette mit 96 % Ethanol oder durch Sprayfixierung (Kap. 2.1).
Fortsetzung
25.03.2010 17:42:03
2
82
2 Präparations­methoden
Fortsetzung
Abb. 2.24: Feinnadelpunktion
a
b
c
e
d
f
g
Abb. 2.25: Ausstrich des punktierten Materials
a
b
c
2.2.6.1 Biopsie
Je nach Gewebetyp und -lage werden zur Entnahme unter­
schiedliche Biopsienadeln und -stanzen und unterschiedli­
che Techniken verwendet.
Die durch die Punktion von Zysten gewonnene Zysten­
flüssigkeit wird zur Fixierung in ein mit 96 % Ethanol teilge­
fülltes Gefäß gespritzt (Verhältnis Punktat : Ethanol ca. 1:1).
2.2.6.2 Native Schnitte
Schnitte von unbehandeltem Gewebe benötigt man ins­
besondere für Lebenduntersuchungen und physiologische
Experimente. Sie sind darüber hinaus geeignet, um Enzy­
maktivitäten oder Antigene zu lokalisieren.
2.2.6.2.1 Freihandschnitte
Handschnitte zur Mikroskopie von lebendem Gewebe
sind von Pflanzenmaterial normalerweise relativ einfach
(Kap. 5), von tierischem oder humanem Material zumeist
schwieriger anzufertigen.
Historische Hinweise zum Herstellen von Rasiermes­
serschnitten von Humangewebe sind bei Romeis (1968,
Romeis.indd 82
§§ 135, 136) nachzulesen. Wichtig für den Erfolg ist die
Auswahl geeigneter Rasierklingen. Es sollten nur extrem
dünne Qualitätsklingen verwendet werden. Man arbeitet
unter der Stereolupe und benützt Kork oder eine mit Den­
talwachs oder Silikon ausgegossene Petrischale als Unter­
lage. Stets sollte ziehend geschnitten werden und ohne mit
der Schneide auf das Gewebe zu drücken. Um die Gewebe
schneidbar zu machen und um Konsistenzunterschiede
in den Geweben auszugleichen, kann man die Objekte
tief frieren, man sollte dann aber konsequenterweise die
Schnitte auch gleich mit einem Kryostaten (Kap. 2.7) an­
fertigen.
2.2.6.2.2 Herstellung von Schnitten mit Hilfe
des Handmikrotoms
Handmikrotome werden fast ausschließlich für die Bear­
beitung von pflanzlichem Material eingesetzt. Es lassen
sich damit gleichmäßig dicke Schnitte von relativ festen
und nicht zu dünnen Gewebeteilen (Spross, Stängel, Wur­
zel) herstellen. Die Schnitte können direkt mikroskopiert
oder für die hochauflösende Mikroskopie (TEM, REM)
präpariert werden.
Die Technik der Handmikrotomie wird in Kapitel 5
beschrieben.
25.03.2010 17:42:04
2.2.6.2.3 Herstellung von Schnitten mit Hilfe
des Vibratoms
Mit dem Vibratom können unfixierte wie auch fixierte Ma­
terialien in Schnittdicken von 30–400 µm und mehr sehr
schonend geschnitten werden. Die Technik basiert darauf,
dass das auf einem Blöckchen befestigte Gewebe in der mit
Puffer gefüllten Vibratomwanne unter einer sehr dünnen,
horizontal schwingenden (vibrierenden) Klinge hindurch­
geführt wird. Sowohl das Gewebe als auch das Messer sind
dabei in Flüssigkeit eingetaucht. Zartes Material (Nerven,
Netzhaut) bettet man vor dem Schneiden in Agar (2–4 % in
Puffer) ein, der mitgeschnitten wird (Abb. 2.26).
Der Anwendungsbereich für Vibratomschnitte ist sehr
groß. Vibratomschnitte werden für Standardfärbungen und
in der Immunhistochemie eingesetzt, sowie in der in vitroHirnschnittpräparation. Ein detailliertes Vorgehen zum
Schneiden von Frischpräparaten mit dem Vibratom ist in
A2.19 beschrieben.
Schwer penetrierbare Proben (z. B. kleine Arthropoden,
Pflanzenmaterial) können manchmal mit Hilfe des Vibra­
Abb. 2.26: a) Vibratom (Leica VT
1000S), b) Vibratomschnitte von in
Agar eingebettetem Pflanzenmaterial
(Gerstenblatt)
2
83
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Unter­suchung und Präparation toms für die Fixierung vorbereitet werden. Vibratomschnit­
te von frischem oder fixiertem Hirn (A2.19) oder Nerven­
gewebe dienen häufig als Ausgangsmaterial für Immunmar­
kierungen nach der preembedding-Technik (Kap. 9).
Vibratomschnitte werden aber auch gern von fixiertem
Gewebe gemacht, vor allem dann, wenn Gefrierschnitte
oder Kryostatschnitte nicht eingesetzt werden können. Bei
der Aufarbeitung von Gehirngewebe für die Elektronenmi­
kroskopie wird das durch Perfusion fixierte Gehirn (A2.27)
erst an einem Vibratom in ca. 100 µm dicke Scheiben
geschnitten, um dann von diesen Schnitten anhand einer
leichten Toluidinfärbung im Puffer die gewünschten Re­
gionen identifizieren und herausstanzen zu können. Diese
100 µm dicken Gewebestückchen werden dann für die
Flacheinbettung (Kap. 2.4.2.1.6) verwendet und in ent­
sprechende Kunstharze eingebettet, von denen dann Ultra­
dünnschnitte angefertigt werden können.
Müssen beim Schneiden von Frischpräparaten, deren
Vitalität zu erhalten im Vordergrund steht, diverse Vorkeh­
rungen getroffen werden (A2.19), so ist die Handhabung
von fixiertem Material am Vibratom recht einfach.
a
b
Anleitung A2.34
Herstellung von Vibratomschnitten von fixiertem Gehirngewebe
Material:
•
•
•
•
•
•
feiner Pinsel
Mikrotiterplatten (netwells)
Sekundenkleber (Roticoll, Roth)
fusselfreie Papiertücher (z. B. Kimwipes)
Rasierklingen
Vibratom
Lösungen:
PBS oder Phosphatpuffer nach Sörensen, pH 7,4 (siehe
Puffertabelle im Anhang)
Durchführung:
1. Halter (Plattform) zum Aufblocken des Gehirns (oder Gehirnteils) aus der Schneidewanne nehmen und die Pufferlösung für die Wanne bereitstellen. Die Titerplatten
zum Auffangen der Vibratomschnitte werden mit Puffer
gefüllt
2. Gehirngewebe aus der Fixierlösung nehmen und die
überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipes leicht abtupfen.
Dann das Gewebe mit einer Rasierklinge entsprechend
der Schnittebene (z. B. transversal oder sagittal) zuschneiden
Fortsetzung
Romeis.indd 83
25.03.2010 17:42:05
2
84
2 Präparations­methoden
Fortsetzung
3. Gehirnstück mit der soeben gemachten Schnittfläche
vorsichtig in einen großen Tropfen Sekundenkleber auf
dem Halter aufsetzen. Dann den Halter in die Schneidewanne einspannen und vorsichtig Puffer in die Schneidewanne gießen. Gießt man zu früh oder zu schnell,
dann kann Sekundenkleber von der Basis der Plattform
hochsteigen, was beim Schneiden hinderlich ist. Wartet
man zu lange, leidet die Struktur
4. die Klinge wird in den Messerhalter des Vibratoms
gespannt. Vor dem ersten Schneidevorgang wird der
Messerhalter so hoch gedreht, dass es über dem zu
schneidenden Gehirn steht. Die Schnittdicke, die je
nach weiterer Anwendung zwischen 20 und 100 µm
liegen kann, wird am Gerät eingestellt, sowie auch die
Frequenz des Messerschwingens und die Geschwindigkeit für den Vorschub
Für in vitro-Hirnschnittpräparate werden sehr dicke Vi­
bratomschnitte (350–400 µm) benötigt, da möglichst viel
intaktes Frischgewebe für die weiteren im allgemeinen elek­
trophysiologischen Untersuchungen erhalten bleiben soll.
2.2.6.2.4 Herstellung von Schnitten mit Hilfe
des Kryostaten
Mit Hilfe des Kryostaten können Schnitte bis etwa 50 µm
Dicke von gefrorenen (vorfixierten oder nativen) Proben
angefertigt werden. Wird natives Material verwendet, sind
die Schnitte insbesondere für Immunmarkierungen, En­
zymnachweise und in situ-Hybridisierungen sowie für bio­
chemische Aufbereitungen nach der Lasermikrodissektion
geeignet. Kryostatschnitte von vorfixierten Proben sind
u. a. für die TEM-Präparation verwendbar.
Die Anfertigung von Kryostatschnitten wird in Kapi­
tel 2.7 beschrieben.
2.2.7 Isolation von Zellkompartimenten und Organellen
Durch Zellfraktionierung können aus einem Zellverband
bestimmte Zellkompartimente (z. B. Golgi-Apparat), Or­
ganellen (z. B. Mitochondrien) oder Strukturelemente (z. B.
Mikrotubuli) isoliert und untersucht werden (Alexander
and Griffiths 1993, Dashek 2000, Robinson and Hinz
2001). In aufeinander folgenden Schritten wird das Gewe­
be zunächst homogenisiert, die Zellverbände und Zellen
schonend aufgebrochen, und die Bestandteile dann durch
Gelfiltration oder Zentrifugationsverfahren sortiert. Man
erhält verschiedene Fraktionen, deren Zusammensetzung
und Reinheitsgrad auch elektronenmikroskopisch kont­
rolliert werden sollte. Dazu werden Proben der Fraktio­
Romeis.indd 84
5. zu Beginn des Schneidens wählt man eine hohe Geschwindigkeit. Je nach Güte der Fixierung verändert man
die Parameter. Im Allgemeinen ist die Frequenz immer
auf sehr hoher Stufe, die Geschwindigkeit wird eher
niedrig gehalten, um das Gewebe möglichst schonungsvoll zu schneiden
6. nach jedem Schneidevorgang wird der Schnitt mit dem
Pinsel vom Messer abgenommen und in eine Titerplatte
überführt.
Am Ende des Schneidens nimmt man den Probehalter aus der
Wanne heraus und kratzt die Reste und den Kleber sauber ab.
Das Messer wird herausgenommen, gereinigt und verstaut,
der Puffer aus der Wanne entfernt. Die Vibratomschnitte können jetzt weiter verarbeitet werden (z. B. für die Elektronenmikroskopie) oder auf Objektträger aufgezogen werden.
nen fixiert und nach Negativkontrastierung (Kap. 2.6) oder
Schnittpräparation (Kap. 2.4.2) im TEM untersucht.
2.2.8 Trennen und Sortieren von
Zellen
2.2.8.1 Durchflusscytometrie
Die Durchflusscytometrie (FACS = fluorescence activated
cell sorting) ermöglicht das Zählen und die Analyse von
physikalischen und molekularen Eigenschaften von Parti­
keln (z. B. Zellen) in einem Flüssigkeitsstrom. Eine Hauptan­
wendung besteht darin, mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Proben (Antikörper, Rezeptoren, Streptavidin,
usw.) bestimmte Eigenschaften von Zellen oder Zellpopu­
lationen auf Einzelzellebene zu dokumentieren. Mit Hilfe
von RNA/DNA-Farbstoffen lassen sich Zellzyklus-Analysen
und Apoptoseassays durchführen. Außerdem gibt es Fluo­
reszenzfarbstoffe, die eine Analyse des intrazellulären pHWertes und des Ionenflusses an Zellmembranen erlauben.
In der Medizin wird die Durchflusscytometrie meist
für die Untersuchung von Zellen des Blutes oder Knochen­
marks eingesetzt. Die dabei gewonnenen Informationen
dienen vor allem der Diagnose und Verlaufsbeobachtung
von Leukämien (Blutkrebs) und Immunschwächekrank­
heiten (HIV-Infektion).
Mit einigen FACS-Geräten (z. B. FACStarPlus oder
FACSAria, BD Biosciences) ist es möglich, fluoreszenzmar­
kierte Zellen nicht nur zu charakterisieren, sondern auch
zu trennen. Diese FACS-Durchflusscytometer umhüllen
die Zellen nach dem Gang durch den Laserstrahl in einen
Flüssigkeitsfilm, der mit einer positiven oder negativen
Ladung versehen ist. Die geladenen Tropfen lenkt ein elek­
trisches Feld ab und leitet sie in Auffanggefäße. Es lassen
sich Zellsubpopulationen aber auch Einzelzellen in diverse
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Hüllflüssigkeit
Vibrator
Magnetisches
Bead
Probe
Biotin
Bindung der
Beads an
die Zelle
Messeinheit
Laser
2
85
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Unter­suchung und Präparation Streptavidin
Antikörper/
Lektin
Zelle
Antigen
Detektor
488 nm
Sammeleinheit
Ablenkplatten
+
– – ––
–
–– ––
–
++ ++
+ +
++ ++
Ladungselektrode
(+/0/–)
– – ––
–
–– ––
–
–
++ ++
+ +
++ ++
–
–– ––
Sammelgefäße
Abb. 2.27: Cell-Sorting im Durchflusscytometer
Probengefäße und Kulturplatten steril sortieren. Moderne,
leistungsfähige Instrumente erlauben standardmäßig die
Analyse und Sortierung von 5000 Partikeln pro Sekunde.
Die Geschwindigkeit kann unter Umständen mit Zusatz­
ausstattung auf 20 000 Partikel pro Sekunde und mehr
gesteigert werden. Dennoch ist das Verfahren aufwendiger
und benötigt mehr Zeit als die Isolationsmethode mit para­
magnetischen Kügelchen (beads).
2.2.8.2 Zelltrennung mit Hilfe para­
magnetischer Kügelchen (beads)
Zur Isolation von Zellen mit spezifischen Oberflächenei­
genschaften von anderen Zellen, partikulären Verunrei­
nigungen oder aus Medien kann man paramagnetische
Romeis.indd 85
Abb. 2.28: Prinzip der Bindung paramagnetischer beads an
eine Zelle
beads (z. B. Dynabeads von InVitrogen) benutzen, die mit
entsprechenden Bindeproteinen (Antikörpern, Lektinen,
Enzymen, etc.) beschichtet sind. Bei der positiven Selekti­
on verwendet man beads, die z. B. mit Antikörpern gegen
ein bestimmtes Oberflächenprotein der gesuchten Zellen
beschichtet sind. Die beads werden mit dem Zellgemisch
inkubiert und dann mit den daran hängenden Zellen mit­
tels eines Magneten herausgetrennt. Magneten sind bei
Herstellern der beads erhältlich; ebenso sind NdFeB-Mag­
neten (Neodym-Magnet) aus dem Fachhandel einsetzbar.
Steht für die gesuchten Zellen kein geeignetes spe­
zifisches Bindeprotein zur Verfügung, dann kann man
gegebenenfalls eine negative Selektion (depletion) vorneh­
men, indem man mit entsprechend beschichteten beads
alle anderen Zellen/Partikel aus dem Medium entfernt.
Die gewünschten Zellen bleiben in der Lösung zurück und
können durch Zentrifugation konzentriert werden.
2.2.9 Lasermikrodissektion
Die Lasermikrodissektion dient dazu, unter mikrosko­
pischer Kontrolle bestimmte Areale aus histologischen
Schnitten auszuschneiden, um sie insbesondere für mole­
kulare oder biochemische Untersuchungen zu verwenden.
Die Methode eignet sich dafür, DNA, RNA oder Proteine
aus bestimmten Gewebe- oder Zellarealen zu gewinnen
bzw. anzureichern.
Ausgangsmaterial sind meist entparaffinierte und ge­
färbte Schnitte; je nach Fragestellung und Anbieter können
sich darüber hinaus lebende Zellkulturen, Handschnitte
von Pflanzengewebe, Kryostatschnitte oder sogar Kunst­
harzschnitte eignen. Die Präparate müssen auf speziellen
25.03.2010 17:42:06
2
86
2 Präparations­methoden
Histologische Probe
vom Membranträger
Pflanzenforschung
Neurologie
Zellbiologie
Cytospin vom
Glasobjektträger
Cytospin
Chromosomen vom
Membranträger
Pathologie
Zytogenetik
Onkologie
Lebende Zellen aus
der Kulturschale
Zellkulturen
DNA
RNA
Abb. 2.29: Anwendungen der Lasermikrodissektion. Bild: Palm Laser Technologies
Abb. 2.30: Mikroskopische
Aufnahme des Mikrodissektionsprozesses. a) Gefärbter Schnitt
eines Löwenzahnblattes auf der Objektträgermembran. b) Nach dem Einsatz des La-
sers erscheint eine helle Lücke
um das umfahrene Gewebe. c) Schnitt, nachdem der umfahrene Bereich herauskatapultiert
wurde. d) Herauskatapultierter
Gewebeteil im Sammelgefäß.
Aufnahme: Palm Laser Technologies
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Pipettieren
Inkubieren
Abzentrifugieren
Proteine
a
b
c
d
25.03.2010 17:42:13
Folien liegen, die als Petrischalenboden oder Objektträger
dienen. Die Anlage von Palm (Palm Laser Technologies)
kann auch auf Glasobjektträgern liegende Schnitte behan­
deln (Abb. 2.29).
Eine Lasermikrodissektionsanlage besteht aus einem
motorisierten Lichtmikroskop und einem eingekoppelten,
computergesteuerten Laser. Im Lichtmikroskop wählt man
die zu isolierenden Areale (Organellen, Zellen, Zellgrup­
pen) aus. Sie werden dann mit dem Laserstrahl, der durch
das Objektiv auf das Präparat trifft, mitsamt der Folie aus­
geschnitten (Abb. 2.30) und in sterile Gefäße (Reaktionsge­
fäße) transferiert. Das Arcturus XT von Molecular Devices
kombiniert die Infrarot-Laser-capture-Mikrodissektion
(LCM) mit dem UV-Laser-Schneiden. Das Material wird
von unten aufgefangen (Leica), mit dem Deckel abgetupft
(Olympus) oder berührungsfrei in den Deckel katapultiert
(Palm). Nachdem man genügend Material gesammelt hat,
wird das Gefäß geschlossen, aus der Halterung am Mikro­
skop entfernt, und man kann mit der Probenaufbereitung
beginnen. Dafür sind Kits im Handel erhältlich (z. B. von
Quiagen oder AmpTec).
2.3 Fixierungen für Licht- und
Elektronenmikroskopie
Viele mikroskopische Verfahren (z. B. REM, TEM), histo­
logische Färbungen und Nachweise eignen sich nicht für
Lebendmaterial. Daher steht am Anfang vieler Präparati­
onsgänge das Abtöten der Zellfunktionen bei gleichzeitiger
Erhaltung der -strukturen, die sogenannte Fixierung. Fi­
xierte Proben können, je nach Eignung und Fragestellung,
geschnitten, gefärbt und mikroskopiert werden. Sie können
für das REM getrocknet und beschichtet werden (Kap. 2.5).
Oder Sie werden in Paraffin bzw. Kunststoff eingebettet
und für licht- oder elektronenmikroskopische Untersu­
chungen geschnitten (Kap. 2.4).
2.3.1 Theorie der Fixierung
Durch die Fixierung möchte man Zellen und Gewebe für
die Untersuchung in ihrem natürlichen, momentanen Zu­
stand erhalten. Alle Bestandteile sollen in Größe und Form
unverändert und in ihrem normalen Umfeld bleiben. Die
Fixierung soll Moleküleigenschaften, Färbbarkeit, Antige­
nität und Enzymaktivitäten nicht verändern. Und sie soll
auf die weitere Präparation vorbereiten, also das Gewebe
festigen und schneidbar machen und nicht brüchig oder
aufgeweicht. Die Fixierung ist damit einer der wesentlichen
Schritte in der Präparation von biologischem Material für
die licht- oder elektronenmikroskopische Untersuchung.
Romeis.indd 87
2
87
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie
2.3.1.1 Ziel der Fixierung
Es gibt keine Fixierungsweise, die gleichmäßig alle der oben
genannten Kriterien erfüllt. Die größte Annäherung er­
hält man sicherlich durch eine Kryopräparation, die jedoch
einen hohen Aufwand an Gerätetechnik und Erfahrung
erfordert (Kap. 2.7). Für die meisten Anwendungen, insbe­
sondere für die lichtmikroskopische Untersuchung, wird
eine solche optimale Fixierung gar nicht benötigt. Man soll­
te sich daher vor der Präparation klar darüber sein, welches
Ziel man verfolgt, um dafür den einfachsten, preiswertesten
oder schnellsten Weg bei guten Ergebnissen zu wählen.
Strukturerhaltung
Die verschiedenen Komponenten von Zellen und Geweben
haben unterschiedliche Eigenschaften und reagieren daher
auch unterschiedlich auf eine Fixierung. Zum Beispiel sind
pH-Wert, Wassergehalt und Osmolarität in Kompartimen­
ten, Organellen und im Cytoplasma nicht gleich. Folglich
reagieren sie in verschiedener Weise auf die Fixierungsbe­
dingungen und die nachfolgende Präparation. Fixierungen
für eine generell befriedigende Strukturerhaltung sind also
nicht optimal für alle Strukturen. Will man eine bestimmte
Struktur möglichst lebensnah erhalten, wird man eine auf
diese angepasste Fixierung wählen.
Histologische, cytologische oder ultrastrukturelle Unter­
suchungen stellen unterschiedliche Anforderungen an die Fi­
xierungstechnik. Je höher die erforderliche Auflösung ist, mit
der das Präparat betrachtet werden soll, desto besser müssen
die Strukturen erhalten und desto genauer müssen die Bedin­
gungen der Fixierung (Osmolarität, pH-Wert, Temperatur,
Fixanzien) auf das Präparat abgestimmt werden.
Nachweise
Nicht alle Bestandteile eines biologischen Präparates werden
durch die chemische Fixierung stabilisiert. Während viele
größere Proteine durch Fällung oder Vernetzung erhalten
bleiben, werden Lipide mehr oder weniger stark extrahiert.
Polysaccharide werden nur indirekt (durch stabilisierende
Proteine) fixiert. Kleine Moleküle (Zucker, Peptide, Ionen)
gehen bei einer chemischen Fixierung zumeist verloren.
Nachweise von Zellkomponenten, die im Schnittpräpa­
rat nicht oder nur sehr aufwendig mit Hilfe von Kryotech­
niken erhalten werden können, gelingen häufig besser am
lebenden Objekt mit Hilfe von spezifischen Fluoreszenz­
farbstoffen. Mitochondrien, Golgi-Vesikel oder ER sind
mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bereits im Lebendprä­
parat erkennbar (Kap. 2.1.2).
Für eine Immunmarkierung (Kap. 9) müssen die Zu­
gänglichkeit und die Antigenität des zu lokalisierenden
Moleküls erhalten werden. Gleichzeitig soll das Antigen am
natürlichen Platz bleiben. Die Strukturen müssen so fixiert
werden, dass sie im Licht- oder Elektronenmikroskop noch
erkannt und zugeordnet werden können.
25.03.2010 17:42:14
2
88
Nachweise von Enzymaktivität (Kap. 8) erfordern eben­
falls sanfte Fixierungen, die Proteinstruktur und –funktion
erhalten, die Enzyme jedoch gleichzeitig in ihrer natürli­
chen Umgebung festhalten.
Langkettige Nucleinsäuren lassen sich durch Fällung
(z. B. durch Wasserentzug) und Vernetzung mit anliegen­
den Proteinen stabilisieren. Für in situ-Hybridisierungen
(Kap. 10) darf die Vernetzung nicht zu stark sein, um den
Zugang der Sonde zu ermöglichen. Dies wird in der Regel
durch möglichst kurze Fixierungszeiten erreicht. Wichtig
ist außerdem, während der Präparation die Aktivität frem­
der und zelleigener DNasen bzw. RNasen zu unterbinden.
2.3.1.2 Fixierungsverfahren
Eine Fixierung kann durch physikalische Einwirkungen
oder chemische Substanzen erreicht werden.
Physikalische Fixierung
• Trocknung: Durch Wasserentzug werden Proteine de­
naturiert und wasserunlöslich gemacht. Biologisches
Material kann daher durch Trocknung fixiert werden.
Vorteilhaft dabei ist, dass keine Substanzen verloren
gehen. Die einfache Lufttrocknung führt jedoch zu un­
gleichmäßigen Schrumpfungen und zum Kollabieren
der Zellen. Je dicker das Material ist, desto größer sind
die morphologischen Schäden. Die Methode eignet
sich deshalb nur zur Fixierung von dünnen Schnitten
(z. B. Kryostatschnitte) oder sehr dünnen Präparaten
(z. B. Blutausstrich) für die Lichtmikroskopie. Eine bes­
sere Strukturerhaltung bekommt man durch Gefrier­
trocknung oder Kritische-Punkt-Trocknung (Kap. 2.5).
• Hitzefixierung: Eine Erhitzung von biologischem Ma­
terial auf über 55 °C führt u. a. zu einer Denaturie­
rung und damit Ausfällung der meisten Proteine und
zu einem schnellen Erlöschen aller Lebensfunktionen.
Hitzebehandlung ist daher ein mögliches Verfahren,
Zellen oder Gewebe für die Mikroskopie zu fixieren.
Bakterienabstriche zum Beispiel werden zur Fixierung
häufig auf dem Objektträger über einer Flamme er­
hitzt. Für eine gute Strukturerhaltung sollte die Hit­
ze allerdings kontrolliert und gleichmäßig einwirken.
Gasbläschen, wie sie beim Kochen entstehen, können
erheblichen Schaden anrichten.
• Behandlung in der Mikrowelle: In der Praxis kann
man zur Hitzefixierung ein Mikrowellengerät ver­
wenden. Wichtig sind eine genaue Temperaturkont­
rolle und -regulation im Inneren des Präparates, die
mit haushaltsüblichen Mikrowellengeräten nicht er­
reicht werden. Entsprechend ausgestattete Mikrowel­
lenöfen für den Laborbedarf sind sehr teuer. Sie sind
allerdings in der histologischen Präparation vielseitig
einsetzbar:
Romeis.indd 88
2 Präparations­methoden
– Die Mikrowellenbehandlung in Kombination mit
einer chemischen Fixierung beschleunigt und er­
leichtert das Eindringen der Lösungen und die
Wirkung der Fixanzien auf die Zellkomponenten.
– Entwässerung und Einbettung biologischer Proben
werden durch Mikrowellenbehandlung stark be­
schleunigt.
– Mikrowellenbehandlungen können Färbungen und
Immunmarkierungen erleichtern.
Ausführliche Anleitungen zum Einsatz von Mikrowel­
lengeräten in der licht- und elektronenmikroskopi­
schen Präparation findet man in der Fachliteratur (z. B.
Giberson and Demaree 2001).
• Gefrierfixierung: Schnelles Abkühlen auf tiefe Tem­
peraturen beendet abrupt die Stoffwechselvorgänge
und fixiert Moleküle und Strukturen in lebensnaher
Konformation und Lokalisation. Die Kryofixation ver­
langt ebenfalls kontrollierte Bedingungen, damit es
nicht zu zerstörerischer Eiskristallbildung in den Pro­
ben kommt. In Kombination mit einer Reihe weiterer
Kryotechniken (Kap. 2.7) gehört sie zu den Verfahren,
mit denen man ein nahezu realistisches Bild der Zelle
zum Zeitpunkt der Fixierung erreichen kann.
Chemische Fixierung
Die am meisten verbreitete Methode der Fixierung beruht
auf der Wechselwirkung chemischer Substanzen mit den
Komponenten von Zellen und Geweben. Je nachdem, wie
das biologische Material mit den Fixanzien zusammen
gebracht wird, unterscheidet man verschiedene Vorgehens­
weisen.
• Immersionsfixierung: Die Zellen oder Gewebestück­
chen werden in die Fixierungsflüssigkeit eingetaucht.
Die Fixanzien dringen mehr oder weniger schnell von
außen nach innen in die Proben ein. Bei ihrem Eindrin­
gen verändern sie ihre Umgebung: Manche Substanzen
wandern mit der eindringenden Front mit, manche
werden ausgeschwemmt, andere vernetzt. Nachfolgende
Fixanzien finden veränderte Bedingungen vor. Ihnen
wird der Weg ins Innere der Probe erschwert. Daher
ist bei der Immersionsfixierung die Gefahr von Arte­
faktbildung (z. B. Quellung, Schrumpfung, Substanz­
flucht) sehr groß. Sie kann begrenzt werden durch die
sorgfältige Auswahl der Proben und die bestmögli­
che Zusammenstellung eines Fixierungsgemisches, bei
dem nachteilige Wirkungen eines Fixativs durch andere
ausgeglichen werden, und das zu dem Probenmaterial
passt. Wichtig ist weiterhin, dass die Proben in eine aus­
reichende Menge von Fixierungslösung gelangen und
von dieser von allen Seiten umspült werden.
• Injektion von Fixanzien: Das gleichmäßige Eindrin­
gen der Fixanzien wird verbessert, wenn das Fixans
nicht (nur) von außen sondern auch von innen appli­
ziert wird. Man injiziert mit Hilfe einer feinen Kanüle,
25.03.2010 17:42:14
die in das Gewebe eingeführt wird, und lässt eisgekühl­
te Fixierungslösung aus einer Spritze mit wenig Druck
einsickern. Sehr dichte Gewebeteile kann man damit
zusätzlich zur Immersionsfixierung behandeln. Kleine
Organismen mit einem festen Chitinpanzer (Insekten,
Krebse) oder anderen schwer durchdringbaren Hüllen
werden nach Betäubung in vivo behandelt und damit
im Inneren besser erhalten.
Die Fixierungslösung kann auch in situ in Organe
injiziert werden. Postmortale Schäden durch die Or­
ganentnahme werden damit weitgehend vermieden.
Man legt das zu fixierende Organ am betäubten Tier
frei und führt die Nadel in zuführende Blutgefäße
oder mittig in das Organ selbst ein. Nachdem die kalte
Lösung 5–20 min eingewirkt hat, wird das Organ ent­
nommen, zerkleinert und in frisches Fixans gelegt.
• Auftropfen von Fixanzien: Die Präparate werden in
situ mit Fixierlösung überspült und nach der Entnah­
me durch Immersionsfixierung nachbehandelt. Damit
wird Schädigungen beim Heraustrennen von Geweben
entgegen gewirkt.
• Perfusionsfixierung: Das Fixans wird im narkotisierten
Tier über die Gefäße in die Organe transportiert. Das
Verfahren gibt ausgezeichnete Resultate, kann aber na­
turgemäß in vielen Fällen nicht angewendet werden.
Man durchspült isolierte Organe vom präparierten Hi­
lus, ganze Versuchstiere vom linken Herzventrikel aus.
Dabei kann man den großen vom kleinen Kreislauf
trennen oder die obere Körperhälfte isoliert durch Ab­
klemmen der Aorta descendens durchspülen. Stets ist
auch für den freien Abfluss des Fixiermittels zu sorgen;
also z. B. das rechte Herzohr abschneiden oder die ent­
sprechenden Hohlvenen eröffnen. Nach 15–20 Minuten
Perfusion kann man die Organe entnehmen, zerkleinern
und in Fixans einlegen. Als Fixiermittel eignen sich z. B.
5 % Formaldehydlösung, Formol-Alkohol nach Schaffer
(Tab. 2.10) und Kaformacet (Tab. 2.11). Für Semidünn­
schnitte und für elektronenmikroskopische Präparate
fixiert man mit 2 % Glutaraldehyd in 0,2 M Pufferlösun­
gen. Beispielhaft ist eine Perfusionsfixierung in Kapitel
2.1 beschrieben. Ausführliche Anleitungen zur Perfusi­
onsfixierung finden sich z. B. bei Hayat (1989).
2.3.1.3 Mechanismen der chemischen
Fixierung
Fixanzien wirken auf unterschiedliche Weise stabilisierend
auf die Zellkomponenten:
• Sie entziehen Molekülen ihre Hydrathülle und fällen
sie damit aus dem Cytoplasma aus. Derart koagulie­
rend wirken zum Beispiel konzentrierte Lösungsmit­
tel (Alkohole, Aceton) und Salze (Ammoniumsulfat).
Ausschließlich durch Koagulation fixierte Präparate
Romeis.indd 89
2
89
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie
zeigen eine schlechte Strukturerhaltung. Färbbarkeit
und Antigenität sind dagegen meistens gut.
• Sie denaturieren die Proteine, verändern also ihre
Tertiär- und Quartärstruktur, und ermöglichen damit
neue Bindungen und Vernetzungen untereinander. Da­
bei können Enzymaktivität oder Antigenität verloren
gehen. Denaturierend wirken z. B. starke Säuren (Essig­
säure) oder Hitze.
• Sie verbinden sich mit Proteinen oder Lipiden und
bilden dabei Brücken zwischen den Molekülen. Je stär­
ker die Moleküle untereinander vernetzt werden, des­
to besser bleibt die Struktur erhalten, desto geringer
werden jedoch auch Enzymaktivität und Antigenität.
Vernetzende Fixanzien (Aldehyde, Osmiumtetroxid,
Kaliumpermanganat, Rutheniumrot) werden bei der
Fixierungsreaktion verbraucht. Um eine gute Fixierung
zu erhalten, muss daher eine ausreichende Menge an
Fixanzien eingesetzt und die Lösung während der Fixie­
rungsperiode mehrmals durch frische ersetzt werden.
• Saure Fixanzien zerstören manche Zellkomponenten,
insbesondere Mitochondrien. Sie fällen Kernproteine
und trennen Bindungen zwischen Proteinen und Nu­
cleinsäuren. Das Cytoplasma erscheint netzartig; Spin­
del und Chromosomen bleiben erhalten. Im Gegensatz
dazu erhalten basische Fixanzien die Mitochondrien,
während viele andere cytoplasmatische Bestandteile
verloren gehen.
Häufig verwendet man Fixierungsgemische, bei denen sich
die Vor- und Nachteile der Einzelkomponenten ausgleichen.
2.3.2 Fixanzien für die Licht- und
Elektronenmikroskopie
Für lichtmikroskopische Untersuchungen werden norma­
lerweise andere Fixanzien eingesetzt als für die Elektro­
nenmikroskopie. Wegen der wesentlich geringeren Auflö­
sung des Lichtmikroskops steht hier weniger die optimale
Strukturerhaltung der Präparate als die Färbbarkeit im
Vordergrund. Da in der Regel größere Proben präpariert
werden, sind ebenfalls Penetrationsgeschwindigkeit und
–tiefe wichtig bei der Auswahl der Fixanzien. Nicht zuletzt
spielt auch der Preis eine Rolle.
2.3.2.1 Fixanzien für die Histologie
Für histologische Zwecke finden eine Vielzahl von Fixanzi­
en Verwendung. Lösungen, die für fast alle Organe einge­
setzt werden können und daher vielfach eingesetzt werden,
sind in Tabelle 2.10 aufgeführt. Weitere Gemische findet
man in Tabelle 2.11.
25.03.2010 17:42:14
2
90
2 Präparations­methoden
Tabelle 2.10: Gebräuchliche Fixierungen für die Histologie
Romeis.indd 90
Name
Zusammensetzung
Anwendung
Eignung
BOUINsches
Gemisch
• 15 ml gesättigte wässrige
Pikrinsäure
• 5 ml 40 % Formalin
• 1 ml Eisessig
• direkt vor Gebrauch mischen
• 2-24 h fixieren
• in 70–80 % Ethanol mehrmals
waschen
• entwässern und einbetten
• Übersichtspräparate
• Cytologische Präparate
• Protozoen
• Embryonen
• in situ-Hybridisierung
• Immunmarkierung
CARNOYsches
Gemisch
• 600 ml 99,9 % Ethanol
• 300 ml Chloroform
• 100 ml Eisessig
• direkt vor Gebrauch mischen
• je nach Größe 1–4 h fixieren
• Glykogennachweis
• Darstellung von Kern­
strukturen
Formol nach
LILLIE
• 100 ml 36 % Formol
• 4 g NaH2PO4 x H2O
• 6,5 g Na2HPO4
• 900 ml H2O
pH 7,0
• direkt vor Gebrauch mischen
• je nach Größe 1–3 Tage bei 4 °C
fixieren
• Histologische Färbungen
Formol-Calcium
nach BAKER
• 10 ml 36 % Formol
• 1 g CaCl2
• 90 ml H2O
• zur Neutralisation einige Stücke
CaCO3 hinzufügen
• in dunkler Flasche aufbewahren
• Hartgewebe
Formol-Alkohol
nach BURKHARD
• 324 ml 36 % Formol
• 540 ml Ethanol oder Methanol
(absolut)
• 130 ml Barbital-NatriumPuffer, pH 7,4
• 6 g Glucose
• Aufbewahrung in dunkler Flasche
• Hartgewebe
Ethanol-Essig­
säure-Gemisch
nach WOLMAN
und BEHER
• 950 ml 99,9 % Ethanol
• 50 ml Eisessig
• bis 1 cm Größe: 4 h fixieren bei
–6–8 °C
• Nachbehandlung:
– über Nacht in 99,9 % Ethanol
bei RT
– 2× 20 min in reinem Benzol
– Paraffineinbettung
• Nachweise:
– alkalische Phosphatase
– Lipase
– Phosamidase
– Cholinesterase
MAXIMOWsches
Gemisch
• 100 ml Müllersche Flüssigkeit
• 5 g HgCl2
• 10 ml Formol
• 10 ml 2 % OsO4 in H2O
• direkt vor Gebrauch mischen
• 1–6 h fixieren
• auswaschen in Leitungswasser
• Blut, Blutbildungsorgane
• Fett
MÜLLERsche
Flüssigkeit
• 2,5 g Kaliumdichromat
• 1 g Natriumsulfat
• 100 ml H2O
Pikrinsublimat
nach RABL
• 100 ml gesättigte, wässrige
Pikrinsäure
• 100 ml gesättigte, wässrige
Sublimatlösung (HgCl2)
• 200 ml H2O
• direkt vor Gebrauch mischen
• 12 h fixieren
• Nachbehandlung:
– Übertragen in niedrig konzen­
triertes Ethanol
– aufsteigende Ethanol-Reihe
– Zusatz von Iodtinktur und
Lithiumcarbonat in 99,9 %
Ethanol
• ältere Embryonen
• Keimscheiben
ROSSMANNsche
Lösung
• 90 ml gesättigte, ethanolische
Pikrinsäure
• 10 ml 40 % Formalin
• direkt vor Gebrauch mischen
• 3–8 h fixieren
• in 99,9 % Ethanol übertragen
• Kohlehydrate
• Glykogennachweis
SCHAFFERsches
Gemisch
• 100 ml 36 % Formalin (neutralisiert mit CaCO3)
• 200 ml 80 % Ethanol
pH 7,2–7,4 (evtl. mit 1 N NaOH
einstellen)
• 1–2 Tage fixieren
• in 80 % Ethanol überführen
• Darstellung von Schleimen
• bei rascher Weiterbehandlung: dotterreiche Embryonen
• Hartgewebe
• fluorochrommarkierte
Gewebe
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2
91
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie
Tabelle 2.10: Fortsetzung
Name
Zusammensetzung
Anwendung
Eignung
STIEVEs Fixativ
• 76 ml gesättigte wässrige
HgCl2-Lösung
• 20 ml Formol
• 4 ml Eisessig
• vor Gebrauch mischen
• 3–6 h fixieren
• in 80 % Ethanol übertragen
• große Präparate
Sublimatalkohol
nach APATHY
• 3–4 g HgCl2
• 0,5 g NaCl
• 100 ml 50 % Ethanol
• vor Gebrauch mischen
• 12–24 h fixieren
• in 70 % Ethanol übertragen
Sublimat-Formol
nach HEIDENHAIN
• 4,5 g HgCl2
• 0,5 g NaCl
• 80 ml H2O
• 20 ml 40 % Formalin
• vor Gebrauch mischen
• 2–24 h fixieren
• in 70 % Ethanol übertragen
• bindegewebsreiche Organe
Sublimat-Essigsäure nach LANG
• 100 ml gesättigte, wässrige
Sublimatlösung (HgCl2)
• 5–10 ml Eisessig
• vor Gebrauch mischen
• 0,5–6 h fixieren
• in 70 % Ethanol übertragen
• Zellkernstruktur
• embryonales Gewebe
• bindegewebsarme Organe
SUSA-Gemisch
nach HAIDENHAIN
• Lösung A:
– 4,5 g HgCl2
– 0,5 g NaCl
– 70 ml H2O
• Lösung B:
– 10 ml 20 % Trichloressigsäure
• Lösung C:
– 20 ml Formol
• Lösung D:
– 4 ml Eisessig
• Lösungen A, B, C, D vor
Gebrauch mischen
• 1–24 h fixieren
• in 96 % Ethanol übertragen und
mehrmals wechseln
• Muskelgewebe
• kollagenes Bindegewebe
ZENKERsches
Gemisch
• 100 ml Müllersche Flüssigkeit
• 5 g Sublimat
• 0,5–5 ml Eisessig
• 5 ml 40 % Formalin
• vor Gebrauch mischen
• 1–6 h fixieren
• 24 h in fließendem Leitungs­
wasser waschen
• hämatologische Unter­
suchung
• Übersichtspräparate
2.3.2.1.1 Formalin und formalinhaltige Lösungen
Formalin bzw. Formol ist eine kommerziell erhältliche,
30–40 % wässrige Formaldehydlösung, die Zusätze zur
Stabilisierung (zumeist 10 % Methanol) aber auch Amei­
sensäure und zu einem hohen Prozentsatz FormaldehydPolymere enthält. Für histologische Zwecke wird 40 %
Formalin („mind. 37 %“) von Merck empfohlen, das
verdünnt werden kann. Kommerziell erhältlich ist für
die Routinefixierung gepuffertes 4,5 % Formalin (z. B.
Roth).
Formalin konserviert Form, Farbe und Struktur der
Präparate sehr gut und durchdringt auch größere Präpa­
rate. Fette und Lipoide bleiben gut erhalten. Darüber hi­
naus eignet sich Formalin sehr gut zur Aufbewahrung des
fixierten Materials, ohne die Färbbarkeit zu beeinflussen.
Es ist daher eines der gebräuchlichsten Fixierungsmittel
und in vielen Fixierungsgemischen enthalten (Tab. 2.10
und 2.11).
Romeis.indd 91
Formalinfixierte Präparate können mit fast allen ande­
ren Fixierungsgemischen nachfixiert werden. Formalin als
Zusatz sollte erst direkt vor Gebrauch zu anderen Fixanzi­
en gegeben werden.
Formol ist gut verschlossen (gesundheitsschädigend!)
und lichtgeschützt aufzubewahren. Unter Lichteinwirkung
bildet sich Ameisensäure. Ein geringer Anteil Säure ist bei
den meisten Anwendungen tolerabel, jedoch nicht, wenn
das Material für Silbermethoden verwendet werden soll.
Säurefreies Formol erhält man, wenn man das Formalin
über einer 1–2 cm dicken Schicht von gepulvertem Calci­
umcarbonat aufbewahrt.
2.3.2.1.2 Ethanol und ethanolhaltige Lösungen
Ethanol dringt sehr schnell in Gewebe ein. Da die Entwäs­
serung das Material stark härtet, darf die Fixierung nicht
lange durchgeführt werden. Die Präparate schrumpfen sehr
25.03.2010 17:42:15
2
92
stark. Dennoch wird die Ethanolfixierung für spezielle Fra­
gestellungen gern eingesetzt, da sie Substanzen erhält, die
mit anderen Mitteln nicht erhalten werden können. Dazu
gehören: Schleime, Glykogen, Harnsäure, Eisen, Calcium.
Gelöst werden dagegen: Fette und fetthaltige Substanzen,
Cholesterinverbindungen, chromaffine Substanzen und
viele Enzyme.
Zur Fixierung dient normalerweise 99,9 % Ethanol
(Ethanol absolut). Die Fixierungsdauer beträgt je nach
Größe der Proben 15 min bis 4 h.
Die Nachteile der Ethanolfixierung können durch Mi­
schung mit anderen Fixanzien z. T. ausgeglichen werden
(Tab. 2.10 und 2.11).
2.3.2.1.3 Fixierung in kalten Lösungsmitteln
Abstriche, Ausstriche, adhärente Zellkulturen oder Auf­
wuchsorganismen und Kryostatschnitte, die für Immun­
lokalisationen oder in situ-Hybridisierungen vorgesehen
sind, können in kalten Lösungsmitteln fixiert werden. Ge­
eignet sind 99,9 % Ethanol, Methanol oder Aceton. Die
noch feuchten Präparate auf Objektträgern werden in eine
Küvette mit den vorgekühlten (–20 °C) Lösungsmitteln ge­
stellt und im Gefrierschrank für einige Stunden bis zu
mehreren Wochen aufbewahrt. Vor der Verwendung wer­
den die Präparate auf 4 °C oder Raumtemperatur erwärmt
und in einer absteigenden Lösungsmittelreihe rehydriert.
2.3.2.1.4 Pikrinsäure und pikrinsäurehaltige
Lösungen
Pikrinsäure dient als Zusatz in einigen Fixierungsgemi­
schen. Es fördert das Eindringen von Formaldehyd, erhält
die Färbbarkeit der Präparate und die Antigenität für Im­
munmarkierungen. Die Säure wirkt allerdings entkalkend.
Verwendet wird Pikrinsäure als wässrige oder alko­
holische gesättigte Lösung. Bei der Aufbewahrung sollte
darauf geachtet werden, dass sich im Deckel (insbesondere
im Schliffstopfen) keine Kristalle absetzen. Pikrinsäure ist
explosiv; die Kristalle können durch Funken entzündet
werden.
Anleitung A2.35
Herstellung wässriger, gesättigter Pikrinsäurelösung
1. 50 g Pikrinsäure in 1–2 l-Flasche einwiegen
2. mit 500 ml heißem H2O übergießen und schütteln
– Lösung erkalten lassen
Romeis.indd 92
2 Präparations­methoden
Anleitung A2.36
Herstellung alkoholischer,
gesättigter Pikrinsäurelösung
1. 10 g Pikrinsäure in 100 ml 99,9 % Ethanol geben
2. häufig schütteln
2.3.2.1.5 Quecksilberchlorid (Sublimat) und
sublimathaltige Lösungen
Quecksilberchlorid (Achtung: stark giftig!) wird als Zusatz
zu einigen Fixierungsgemischen verwendet (Tab. 2.10 und
2.11). Man benötigt eine gesättigte, wässrige Lösung.
Anleitung A2.37
Herstellung einer gesättigten,
wässrigen Sublimatlösung
1. 1000 ml H2O in 2 l-Glaskolben bis zum Kochen erhitzen
2. 60 g Sublimat hinzugeben (Achtung: starkes Aufwallen!)
3. Lösung erkalten lassen
Bei der Fixierung mit Sublimat bildet sich in den Präparaten
häufig ein sogenannter „Sublimatniederschlag“. Die Entfer­
nung des Niederschlages wird unter A 2.41 beschrieben.
Histologische Untersuchungen erfordern manchmal
besonders geeignete Fixierungsgemische (Tab. 2.12).
Für nachfolgende Immunmarkierungen muss bei der
Fixierung darauf geachtet werden, dass die Antigene da­
bei nicht zerstört, extrahiert oder ihre Epitope verändert
werden. Wie für die in situ-Hybridisierung eignen sich
dazu nur bestimmte Fixanzien (Tab. 2.13), insbesondere
gepufferte Formaldehydlösungen. Speziell adaptierte Fi­
xierungsgemische sind auch kommerziell erhältlich (z. B.
ImmunoChem Fix von BBC).
2.3.2.1.6 Die HOPE-Fixierung
Die HOPE-Fixierung (DCS Innovative Diagnostik-Systeme,
Hamburg) eignet sich insbesondere zur schonenden Konser­
vierung von Gewebe, das zur Lokalisation von Nucleinsäu­
ren oder Proteinen vorgesehen ist. Sie ermöglicht nach Her­
stellerangaben die Immunhistochemie am Paraffinschnitt
ohne Antigen-Demaskierung, Enzymnachweise, verbesserte
RNA- und DNA-in situ-Hybridisierungen und hervorra­
gende Nucleinsäure-Erhaltung für PCR und RT-PCR. Nicht
geeignet ist sie für nachfolgende Kunstharzeinbettungen.
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2
93
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie
Tabelle 2.3.2.2: Weitere Fixierungsgemische für lichtmikroskopische Anwendungen
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Name
Zusammensetzung
Anwendung
Eigenschaften
cajalsches
Brom-FormolGemisch
• 15 ml Formalin
• 2 g Ammoniumbromid
• 85 ml H2O
• vor Gebrauch mischen
• 2–25 Tage fixieren
• gründlich wässern
Glia-Imprägnation
cajalsche
NeurofibrillenFärbung
• 40 ml Pyridin
• 30 ml 96 % Ethanol
• direkt vor Gebrauch
mischen
• 24 h fixieren
• unter fließendem Leitungswasser waschen
Neurofibrillen
Ciaccosches
Gemisch
• 80 ml 5 % Kaliumbichromat
• 20 ml Formol
• 5 ml Eisessig
• direkt vor Gebrauch
mischen
• 24 h fixieren
• unter fließendem Leitungswasser waschen
Fette, Lipide
Ethanol-
Eisessig I
• 95 ml 96 % Ethanol
• 5 ml Eisessig
• direkt vor Gebrauch
mischen
• mindestens 4 h fixieren
(Kühlschrank oder Eisfach)
• in 96 % Ethanol über­
führen und einbetten
Ethanol-
Eisessig II
• 3 Teile Ethanol
• 1 Teil Eisessig
• vor Gebrauch mischen
• Zellen darin bis zum
Gebrauch aufbewahren
(für längere Zeit bei –20 °C)
FLEMMINGsches
Gemisch
• 15 ml 1 % (w/v) Chromsäure in H2O
• 4 ml 2 % (w/v) OsO4
in H2O
• 1 ml Eisessig
Zusatz von 5 % Harnstoff
verbessert das Eindringen
• vor Gebrauch ansetzen
• Gewebe 1–3 mm: mindestens 24 h in mindestens 5× Volumen der
Probe fixieren (kann darin
lagern)
• 24 h unter fließendem
Wasser auswaschen
• dringt langsam
ein
• Histologie
• Fixierung von
Zellen (Blut)
FormaldehydPropionsäureEthanol (FPA)
• 50 ml 96 % Ethanol
• 5 ml Propionsäure
• 10 ml Formol
• 30 ml H2O
• vor Gebrauch ansetzen
• Gewebe: 18–24 h bei RT
fixieren (Aufbewahrung
darin möglich)
• dringt langsam
ein
• Schrumpfung
• Übersicht­
präparate (auch
Pflanzen)
HELLYsches
Gemisch
• 100 ml 2,5–3 % (w/v)
Kaliumdichromat in H2O
• 5 g Sublimat
• 5 ml Formalin
Zusatz von 2 % OsO4
fixiert auch Lipide
• Gewebe bis 4 mm Dicke:
1–6 h fixieren
• auswaschen in fließendem
Wasser
Heptan-
Formaldehyd
• Lösung A:
– 0,08 M EGTA
– 5 % (w/v) Form­
aldehyd
– 10 % DMSO
– in PBS + 1 % (v/v)
Tween 20
• Lösung B:
– Heptan
• Lösungen A und B direkt
vor Gebrauch 1:1 mischen
• kräftig schütteln und auf
das Gewebe geben
• 30–60 min fixieren (Fixans
mehrmals durch frisch
geschütteltes ersetzen)
• mit Methanol und Ethanol
auswaschen
• rasches Eindringen
Eignung
• Enzymhistochemie
• Immunmarkierung
• in situ-Hybridisierung
• Chromosomendarstellung und
Färbung (FISH)
• Histologie, insbesondere
Knochen
für Hämatologie 10 ml Formol verwenden
• sehr gutes
Eindringen
• Fixierung von
Gewebe oder
Organismen mit
wasserundurchdinglichen Deckschichten
• Immunmarkierung
• in situ-Hybridisierung
25.03.2010 17:42:15
2
94
2 Präparations­methoden
Tabelle 2.11: Fortsetzung
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Name
Zusammensetzung
Anwendung
Eigenschaften
Eignung
Kaformacet
• 85 ml 3 % (w/v) Kaliumdichromat in H2O
• 10 ml Formol
• 5 ml Eisessig
• direkt vor Gebrauch
mischen
• Gewebe bis 1 cm Dicke
6–24 h fixieren
• in 5 % (w/v) Li- oder
Na-Sulfatlösung (in H2O)
mehrmals waschen
• 24 h unter fließendem
Wasser waschen
• durch Sulfatlösung bleibt
Quellung gering
und Färbbarkeit
sehr gut
• Histologie
Kaliumdichromat-Essigsäure
• 100 ml 3 % (w/v) Kaliumdichromat in H2O
• 5 ml Eisessig
• vor Gebrauch mischen
• 1–2 Tage fixieren
• 1 Tag mit fließendem
Wasser waschen
• dringt schnell
ein
• fixiert Cytoplasma, Kerne, Bindegewebe
KOENIKs Fixans
• 5 Teile Glycerin
• 2 Teile Eisessig
• 3 Teile H2O
LILLIEsche Fixierung
• 8 g Bleinitrat
• 80 ml 96 % Ethanol
• 10 ml 4 % Formalin
• 10 ml H2O
• 24 h fixieren
LISON-VOKAERsche Glykogenfixierung
• 85 ml in 96 % Ethanol
gesättigte Pikrinsäure
• 10 ml Formalin
• 5 ml Eisessig
• 5–10 h bei 4 °C oder –20 °C fixieren
• in 96 % Ethanol über­
führen
Methanol-Essigsäure
• 3 Teile Methanol
• 2 Teile Eisessig
• vor Gebrauch mischen
• Zellen darin bis Gebrauch
aufbewahren
• Chromosomendarstellung und
Färbung (FISH)
Muskelfixans
• 5 % Formalin
• 5 % (w/v) TCA
• 1 % (w/v) Platinchlorid
in H2O
• Gewebe einige Stunden in
feuchte Kammer (Muskel
möglichst auf Hölzchen
spannen)
• 24 h in frischer Mischung
fixieren
• in 96 % Ethanol überführen, mehrmals wechseln
• Histologie (Muskel)
ORTHsches
Gemisch (modifiziert)
• 9 Teile 2,5 % (w/v) Kaliumdichromat in H2O
• 1 Teil Formol
• vor Gebrauch mischen
• 1–2 Tage im Dunkeln
fixieren
• 1 Tag mit fließendem
Wasser waschen
• Histologie
• Gefrierschnitte
SANNOMIYAsches Gemisch
• Lösung A:
– 3 g Sulfosalicylsäure
– 100 ml 96 % Ethanol
• Lösung B:
– 5 ml Eisessig
• Lösungen A und B direkt
vor Gebrauch mischen
• 2–4 mm Gewebestücke
2–3 h fixieren
• in 96 % Ethanol über­
führen und einbetten
• gute Erhaltung
von Schleimen
und Sekreten
• Verlust von
Färbbarkeit der
Kerne
• Histologie
SCHILLERsches
Gemisch
• Lösung A:
– 1 ml gesättigtes wässriges Uranylacetat
– 1 ml gesättigte wässrige Sublimatlösung
– 73 ml H2O
• Lösung B:
– 2 g Kaliumdichromat
– 1 g Magnesiumacetat
– 25 ml H2O
• Lösungen A und B direkt
vor Gebrauch mischen
• 12–14 h fixieren
• 2–3 h unter fließendem
Wasser waschen
• entwässern und einbetten
fixiert ohne Härtung
• Histologie
• Evertebraten
(Kapitel 5)
• Mastzellen
• Mucopolysaccharide
nahezu quantitative Erfassung des
Glykogens
• zur Darstellung
von Glykogen
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2
95
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie
Tabelle 2.11: Fortsetzung
Name
Zusammensetzung
Anwendung
Eigenschaften
Eignung
STEEDMANs
Fixans
Stammlösung:
• 100 ml Propylen­
phenoxetol
• 500 ml Propylenglykol
• 500 ml Formalin
Anwendung:
• 110 ml Stammlösung in
890 ml H2O
STEEDMAN-
Konservierung:
Stamm:
50 ml Propylenphenoxetol, 500
ml Propylenglykol
Verwendung:
10 ml der Stammlösung in 890 ml
A. dest.
Evertebraten (Kapitel 5)
TCA-Sublimat
Formol
• 25 ml gesättigte wässrige Lösung von Sublimat
• 20 ml 5 % (w/v) TCA
(Trichloressigsäure)
• 15 ml Formol
• vor Gebrauch mischen
• je nach Größe 1–24 h
fixieren
• in 80 oder 90 % Ethanol
übertragen, mehrmals
wechseln
• sehr gute
Form­erhaltung
auch bei stark
wasserhaltigem
Gewebe
ZIRKLEs
Gemisch
• 2,5 g Kaliumdichromat
• 2,5 g Ammoniumdichromat
• 2 g Kupfersulfat
• 400 ml H2O
• Gewebe 24–48 h fixieren
• mit H2O waschen
• entwässern und einbetten
• gute Erhaltung
von Mitochondrien, Chromatin
und Spindel­
fasern
Tabelle 2.12: Histologische Untersuchungsziele und Fixanzien
Romeis.indd 95
cytologische Präparate
Tabelle 2.12: Fortsetzung
Präparat / Untersuchungsziel
beste Fixierung
mögliche Fixierungen
Knorpel
Helly
• Lillie
• Formalin
Lipide
OsO4
• Ciaccio
• Sulfosalicylsäure
Mitochondrien
Flemming
• Zenker
• Formol
Susa
Mucopoly­
saccharide
Lillie
Kaliumbichromat
Fixanzien mit
HgCl2
Muskulatur
Susa
• Muskel­fixans
• Sannomiya
Glykogen
Lison-Vokaer
• Carnoy
• Ethanol
Myofibrillen
Sannomiya
Susa
Harnsäure
96 % Ethanol
Nervensystem
Cajal (Brom-Phenol)
Formalin
Hartgewebe (allgemein)
Formol nach Lillie
Formol-Calcium
nach Baker
Schaffersche
Lösung
Formol-Alkohol
nach Burkhard
Ethanol
Nebenniere
K-bichromat­haltige
Fixanzien
Neurofibrillen
Cajal (Pyridin)
Niere
Orth
Plasmastruktur
Helly
• Maximow
• Zenker
Hoden
Carnoy
Bouin
Punktate
Ethanol
Ether
Hypophyse
Bouin
Knochen
Helly
Übersichts­
präparate
Formalin
• Bouin
• Zenker
• Schaffer
Präparat / Untersuchungsziel
beste Fixierung
mögliche Fixierungen
Aorta, Gefäße
Sannomiya
• Lillie
• Maximow
Blutausstrich
Methanol
Blutbildungsorgane
Maximow
Helly
cytologische Präparate
Helly
• Zenker
• Flemming
Darm
Schaffer
Drüsen
• Formalin
• Susa
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2
96
2 Präparations­methoden
Tabelle 2.13: Fixanzien für Immunmarkierungen
Fixans
geeignet für
Konzentration und
Zusammensetzung
Bemerkungen
Formaldehyd (FA)
TEM und LM
2– 4 % (w/v)
• frisch aus Paraformaldehyd herstellen
• gepuffert verwenden
• bei 4 °C möglichst kurz fixieren
Glutaraldehyd (GA)
TEM und LM
0,1– 1 % (v/v)
• nicht für alle Antigene geeignet
• niedrig konzentriert kombinieren mit FA
• möglichst kurz fixieren
• gepuffert verwenden
• nach Fixierung quenchen (1 % NaBH4)
Aceton (-20 °C)
LM
100 %
geeignet für Zellmonolayer oder Schnitte bis 50 µm Dicke
Formaldehyd-EthanolEssigsäure (FAA)
LM
Formaldehyd-Pikrinsäure
TEM und LM
2 % FA
+ 0,2 % Pikrinsäure
in 0,1 M PP (pH 7,3)
(siehe Tabelle im
Anhang)
• penetriert schneller als konventionelle Fixative
• FA frisch aus Paraformaldehyd herstellen
TEM = Transmissionselektronenmikroskopie
LM = Lichtmikroskopie
HOPE ist abgeleitet von Hepes-Glutamic acid buffer
mediated organic solvent protection effect. Bei dieser Metho­
de wird das Untersuchungsmaterial zuerst in einer formal­
dehydfreien Lösung inkubiert und dann durch Acetonent­
wässerung konserviert. Da die HOPE Fixierung auch in
der pathologischen Routine eingesetzt werden kann, ist sie
eine echte Alternative zum Formaldehyd. Weitere Vorteile
sind ein geringerer Verbrauch und eine bessere Verträg­
lichkeit für den Anwender.
zentrationen (0,1–0,25 %) in Kombination mit Formaldehyd
setzt man ein, um Material zu fixieren, an dem Immunmar­
kierungen durchgeführt werden sollen.
Die Fixierung mit Glutaraldehyd bewirkt eine sehr gute
Erhaltung der Feinstruktur. Sie wird normalerweise nicht
für histologische Präparate verwendet.
O
H
2.3.2.2 Gängige Fixanzien für die Elektronenmikroskopie
Für die Elektronenmikroskopie werden normalerweise ver­
netzende Fixanzien verwendet, die eine gute bis sehr gute
Strukturerhaltung ergeben (Tab. 2.14).
2.3.2.2.1 Glutaraldehyd (GA)
Glutaraldehyd (chemisch korrekt: Glutardialdehyd) reagiert
insbesondere mit Aminogruppen. Es entstehen innerhalb
von Sekunden bis Minuten irreversible Quervernetzungen
der zellulären Proteine. Da bei der Reaktion Protonen frei
werden, sinkt der pH-Wert. Um dies zu vermeiden, wird
GA in entsprechendem Puffer (zumeist Na-Cacodylat) ver­
wendet. Üblich zur Fixierung sind Konzentrationen von
2,5–3,5 % GA allein oder 1–2 % GA in Kombination mit
anderen Fixanzien. Nach der Fixierung kann das Material in
1,5 % GA für Wochen aufbewahrt werden. Niedrigere Kon­
Romeis.indd 96
O
C CH2 CH2 CH2 C
Glutaraldehyd
H
O
H C
Formaldehyd
H
O
H2C CH C
O
Acrolein
H
O
Os
O
Osmiumtetroxid
O
O
O
Ru
O
Rutheniumrot
O
O
O
Mn
O
Permanganat
O
Abb. 2.31: Strukturformeln gängiger Fixanzien für die Elektronenmikroskopie
25.03.2010 17:42:16
2
97
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie
Tabelle 2.14: Fixierungsgemische für die Elektronenmikroskopie
Name
Zusammensetzung
Anwendung
Eignung
Formaldehyd-
Glutaraldehyd-
Pikrinsäure
(FGP)
• 1,25 % Formaldehyd
• 2,5 % Glutaraldehyd
• 0,03 % Pikrinsäure
in 0,1 M Cacodylatpuffer
(pH 7,2)
1. Gewebe: 1–2 h bei RT. Im Fixans in 1–2 mm große Stücke zerteilen
Zellen: 15–30 min bei RT
2. waschen und Postfixierung mit z. B. OsO4
• Vorfixierung für
gute Ultrastrukturerhaltung
Glutaraldehyd-
Osmiumtetroxid
• 2,5 % Glutaraldehyd
• 1 % OsO4
in 0,1 M Cacodylatpuffer
(pH 7,2)
• Mischung direkt vor Gebrauch ansetzen
(aus vorgekühlten Komponenten)
• für 1 h im Eisbad fixieren
• Zellkulturen (Tiere,
Pflanzen)
• Einzeller (Protozoen)
SpermidinphosphatGlutaraldehyd
• 0,2 M Spermidinphosphat
• 0,25 M Glutaraldehyd
in 0,05 M Collidinpuffer,
pH 7,8
1. Zellen 10 min bei RT fixieren
2. Nachfixierung für 20 min in 2,5 % GA in
0,05 M Collidinpuffer
3. waschen in Collidinpuffer
4. Nachfixierung mit 2 % OsO4
• Erhaltung von Actinfilamenten (Hauser
1978)
Osmiumtetroxid
nach DALTON
25 ml 5 % (w/v) Kalium­
dichromat
+ 25 ml 3,4 % NaCl
+ 50 ml H2O
mit 1 N NaOH auf pH 7.4
einstellen
1 g OsO4 darin lösen
filtrieren
• Postfixierung nach Aldehydfixierung bei
RT für 1 h
• kontrastreiche
Darstellung von
Mikrotubuli und
akzessorischen
Proteinen
OsmiumtetroxidKaliumferrocyanid
• 1 % OsO4
• 1,5 % Kaliumferrocyanid
in H2O
• Vorfixierung mit Aldehyd und waschen
• 1h bei RT im Dunkeln inkubieren
• Nachfixierung und
Kontrastierung
Periodat-LysinFormaldehyd
1. 1,827 g DL-Lysine (Sigma
L-6001) in 50 ml H2O
lösen
2. mit 0,1 M Na2HPO4
(etwa. 10 ml) auf pH 7,4
einstellen
3. mit 0,1 M NaPP auf 100
ml auffüllen
Bei 4°C für ca. 2 Wochen
haltbar
1. 30–60 min fixieren
2. mehrfach in NaPP waschen
• Immunmarkierung
bei relativ guter
Strukturerhaltung
RutheniumrotGlutaraldehyd
• 0,1 % (w/v) RutheniumRot (RR)
• 2,5 % (v/v) GA
• in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer, pH 7,4
1. für 1 h bei RT fixieren
2. 3 × 10 min in Puffer waschen
3. Nachfixieren mit 1 % (w/v) OsO4 mit 0,1 % RR in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer,
pH 7,4, für 1 h bei RT
Kontrastierungsfixierung zur Darstellung
von Zuckerresten
(Mucopolysaccharide
etc.)
Tannin-Uranylacetat
A: 1% (w/v) Tannin in Maleatpuffer
B: 1% (w/v) Uranylacetat in
Maleatpuffer
alle Schritte auf Eis durchführen:
1. 40 min in A inkubieren
2. 2 × in Maleatpuffer waschen
3. 40 min im Dunkeln in B inkubieren
4. 2 × in Maleatpuffer waschen
Nachfixierung (z. B.
nach Formaldehyd)
für Immunogoldmarkierung bei gutem
Kontrast
Zusammensetzung der Puffer: siehe Puffertabelle im Anhang
RT = Raumtemperatur
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2 Präparations­methoden
2.3.2.2.2 Formaldehyd (FA)
2.3.2.2.4 Osmiumtetroxid
Formaldehyd ist ein wasserlösliches Gas. In Lösung bilden
sich sehr schnell Polymere, so dass die Konzentration der
Formaldehydmonomere kontinuierlich sinkt. Reproduzier­
bare Ergebnisse erhält man daher nur, wenn frische Lösung
verwendet wird. Für Enzymnachweise, Immunmarkierun­
gen, in situ-Hybridisierungen und Ultrastrukturuntersu­
chungen sollte man sich frische Formaldehydlösungen aus
Paraformaldehyd ansetzen. Diese Lösungen sind bei –20 °C
ca. 6 Monate haltbar.
Die monomeren Formaldehydmoleküle dringen rasch
in das Gewebe ein. Die Vernetzung der Proteine erfolgt
allerdings recht langsam und ist locker. Darüber hinaus ist
sie reversibel; nach der Fixierung sollten die Proben daher
nicht zu lange in Wasser oder Puffer verweilen. Die Ult­
rastrukturerhaltung nach reiner Formaldehydfixierung ist
nicht besonders gut. Antigenität und Enzymaktivität vieler
Proteine bleiben jedoch erhalten.
Osmiumtetroxid (Osmium) reagiert mit ungesättigten Fett­
säuren und Amino- und Sulphhydryl-Gruppen anderer
Zellkomponenten. Damit stabilisiert es Lipide und Zellmem­
branen. Proteine werden durch Osmium angegriffen. Es
eignet sich daher nur eingeschränkt für Präparate, an denen
Immunmarkierungen oder Enzymnachweise geplant sind.
Auch für Paraffineinbettungen wird es nicht empfohlen.
Gepuffertes, 0,5–2 % Osmiumtetroxid wird in der Elek­
tronenmikroskopie regelmäßig als zweites Fixans nach Fi­
xierung mit Aldehyden eingesetzt. Für kurze Fixierungs­
zeiten (im Eis bis 1 Stunde) kann man auch GA (1–2 %)
und Osmium (1 %) als Gemisch verwenden.
Anleitung A2.38
Herstellung von 4 % Formaldehyd aus Para­
formaldehyd
1. 1g Paraformaldehyd in 15 ml Wasser geben
2. auf 60 °C erhitzen und rühren
3. mit einigen Tropfen 1 N NaOH Lösung klären (Tropfen
einzeln hinzu geben, jeweils warten; bei pH 7 klärt
sich die Lösung rasch)
4. mit H2O auf 25 ml auffüllen
5. abkühlen lassen
6. gegebenenfalls filtrieren (z. B. durch Faltenfilter)
7. direkt verbrauchen oder Aliquots einfrieren
Anleitung A2.39
Fixierung in Osmiumdämpfen
Zellen können fixiert werden, indem man sie für 30–60
min Osmiumdämpfen aussetzt. Man legt einige Osmiumtetroxidkristalle in eine kleine Glasschale, die man
in einer größeren Glaspetrischale platziert. Die größere
Schale wird als „feuchte Kammer“ mit einem wassergetränkten Streifen Filterpapier ausgestattet. Über die
Ränder der kleinen Schale legt man den Objektträger mit
den Zellen nach unten („hängender Tropfen“). Die große
Schale wird mit einem Deckel geschlossen.
Für die Rasterelektronenmikroskopie können Osmiumdämpfe verwendet werden, um die Leitfähigkeit stark
zerklüfteter Präparate zu verbessern. Die Dämpfe lässt
man dafür über mehrere Tage oder Wochen einwirken.
Anleitung A2.40
Ansetzen von Osmiumlösungen
Formaldehyd sollte gepuffert verwendet werden, da sonst
der pH-Wert bei der Fixierung sinkt.
2.3.2.2.3 Fixierungsgemische mit Glutaraldehyd und Formaldehyd
Gemische aus FA und GA sind besonders geeignet für die
Elektronenmikroskopie. Sie dringen gut ein und ergeben
eine sehr gute Strukturerhaltung. Karnovsky (1965) emp­
fahl eine gepufferte Mischung aus 4 % GA und 6 % FA.
Diese Mischung hat eine sehr hohe Osmolarität. Für die
meisten Anwendungen werden niedrigere Konzentratio­
nen (1–2 % FA mit 1–2,5 % GA) eingesetzt. Dabei kombi­
niert man häufig mit 0,03 % Pikrinsäure.
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Osmiumtetroxid wird zumeist in fester Form (0,25–1 g)
in Glasampullen geliefert. Die Kristalle lösen sich nur
langsam; die Lösung sollte daher spätestens 1 Tag vor
Gebrauch angesetzt werden. Im Notfall lässt sich der
Vorgang mit Hilfe von Ultraschall beschleunigen. Die
Ampulle wird mit Handschuhen angefasst und zunächst
gründlich mit Aceton und H2O von Etikettresten befreit.
Man arbeitet unter dem Abzug und mit Schutzbrille und
legt die Ampulle auf ein sauberes Stück Alufolie. Mit
einer Ampullensäge wird das Glas angeritzt, dann in die
Folie eingeschlagen und vorsichtig gebrochen. Glas und
Osmiumkristalle werden in ein sauberes und gut verschließbares Glasgefäß gegeben. Mit H2O setzt man eine
1–4 % Stammlösung an. Das Gefäß wird im Abzug lichtgeschützt aufbewahrt, bis die Kristalle gelöst sind. Die
Lösung wird dann in Reaktionsgefäße aliquotiert. Diese
bewahrt man bis zu Gebrauch in einem gut verschlossenen Behälter bei –20 °C auf.
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http://www.springer.com/978-3-8274-1676-6