1 Transport, Photosynthese - Lehrstuhl Pflanzenphysiologie

Modul:
Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
WS 2009/2010
Lehrstuhl Pflanzenphysiologie
Aufgabe Transport und Photosynthese
Induktion eines Hexosetransportsystems in Chlorella kessleri
Einleitung
Versuchsdurchführung
Anhang
1
4
10
Messung der Hill-Reaktion der Photosynthese
Einleitung
Versuchsdurchführung
Anhang
20
23
30
1
Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Induktion eines Hexosetransportsystems in
Chlorella kessleri
1. Einleitung
Der Versuch dient mehreren Zwecken. Zum einen soll die Bedeutung von
Transportprozessen in Pflanzen und deren Energetik exemplarisch vertieft werden, zum
anderen führt das Experiment in den Umgang mit radioaktiven Substanzen ein.
Das Versuchsobjekt ist die einzellige Grünalge Chlorella (Abb. 1). Die Gattung Chlorella
wird als Sammelgattung bezeichnet weil in ihr bedingt durch die geringe Zahl
morphologischer Merkmale nicht näher miteinander verwandte Arten in einer Gattung
vereinigt sind. Molekularbiologische Methoden legen nahe, dass die Vertreter von
Chlorella in mindestens 2 Klassen der Chlorophyta verteilt sind. Man findet Chlorella als
frei lebende Algen im Süßwasser und an feuchten Oberflächen, aber auch als
Endosymbionten in Paramaecium, Hydra, Strudelwürmern und einigen Flechten. Chlorella
besitzt einen einzigen, napfförmigen Chloroplasten und keine Zentralvakuole (Abb. 1B).
Die Vermehrung geschieht ausschließlich asexuell. Der Protoplast der Zelle teilt sich
mehrmals und bildet innerhalb der Zellwand der „Mutterzelle“ 4, 8 oder 16 Tochterzellen
mit deren jeweilig eigenen Zellwand. Schließlich platzt die Zellwand der „Mutterzelle“ auf
und entlässt die Tochterzellen, die dann wieder zu ihrer typischen Größe heranwachsen.
Die Zellwand der „Mutterzelle“ bleibt als „Leiche“ zurück.
Die frei lebende Form von Chlorella lässt sich relativ rasch auf anorganischem Medium
photoautotroph mit einer Verdopplungszeit von ca. 1 Tag anziehen. Sie hat als
„pipettierbare“ Pflanze eine große Bedeutung in der Pflanzenphysiologie erlangt. An ihr
wurden beispielsweise der Calvin-Zyklus aufgeklärt, der Mineralstofftransport und die
Mineralstoffassimilation erforscht und schließlich wurde an Chlorella zum ersten Mal ein
pflanzliches Zuckertransportsystem charakterisiert und kloniert.
B
A
5 µm
Abb. 1
Chlorella sp.
A: Lichtmikroskopische Aufnahme
B: Schematischer Aufbau
1
Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Physiologie des Zuckertransports bei Chlorella
Wird autotroph gewachsene Chlorella kessleri in ein Medium mit Glukose (oder einem
Glukoseanalog) überführt, ist die Aufnahmegeschwindigkeit von Glukose gering. Nach 30 60 Minuten Inkubation in Glukose steigt jedoch die Geschwindigkeit der Aufnahme stark
an, denn es wird ein Glukosetransportsystem induziert. Die aufgenommene Glukose wird
sofort metabolisiert, hauptsächlich zu Saccharose und Stärke. Lässt man Chlorella jedoch
ein nicht-verstoffwechselbares Glukoseanalog wie 3-O-Methylglukose oder 6Desoxyglukose aufnehmen, wird das Glukoseanalog in den Zellen akkumuliert, d.h.
Chlorella ist in der Lage, Hexosen gegen einen Konzentrationsgradienten aus dem Medium
aufzunehmen, ein Hinweis darauf, dass es sich bei der Aufnahme um einen aktiven
Transportprozess handelt. (Das Enzym Hexokinase kann die obigen Glukose-Analoge nicht
phosphorylieren, sodass damit jeder weitere Weg im Stoffwechsel verhindert ist.) Die
Frage, wo die Energie für diesen aktiven Transportprozess herkommt, konnte durch den
Befund geklärt werden, dass Glukose nicht allein sondern gemeinsam mit einem Proton
aufgenommen wird (Glukose-H+ Symport). Über die Plasmamembran besteht ein
elektrochemischer
Gradient
von
Protonen
(zusammengesetzt
aus
einem
Protonengradienten, ΔpH, innen alkalisch, und einem Membranpotential, innen negativ,
außen positiv), der von einer H+-transportierenden ATPase aufgebaut wird (primär aktiver
Transport von Protonen). Dieser Gradient liefert die Energie für den (sekundär) aktiven
Transport der Glukose.
H
pH 6,5
H
Glukose
120 mV
ADP + P
ATP
Plasmalemma
pH 7,5
Abb. 2
Schema des Glucose-H+ Symports und des protonmotiven Potentials am Plasmalemma
Molekularbiologie
Die molekulare Grundlage der Induktion des Hexosetransportsystems in Chlorella sind der
verstärkte Einbau von Zuckertransportproteinen in die Plasmamembranen dieser Zellen.
Dieser verstärkte Einbau ist direkt auf die vermehrte Expression der entsprechenden Gene
zurückzuführen. Es sind aus Chlorella kessleri z.Zt. drei Hexosecarrier-Gene bekannt, die
HUP1, HUP2 und HUP3 bezeichnet werden (HUP steht für hexose uptake). Obwohl
wahrscheinlich alle drei Genprodukte an der Glukoseaufnahme beteiligt sind, ist die
Aktivität von HUP1 am stärksten, deshalb beschränkt sich dieses Praktikum auf die
molekularbiologische Analyse von HUP1 (siehe Aufgabe Transcriptanalyse). Wird zu
Chlorella-Zellen Glukose gegeben, so führt dies über eine noch nicht genauer bekannte
Signalkette zur verstärkten Expression bestimmter Gene, u. a. des HUP1-Gens. Die
Expression eines Gens lässt sich grob in zwei Schritte zerlegen. Im ersten Schritt wird der
kodierende Strang des Gens in RNA umgeschrieben (Transkription), die im Kern
prozessiert wird und als sog. mRNA in das Cytosol transportiert wird. Dort wird im
zweiten Schritt die RNA-Sequenzinformation in eine Aminosäuresequenz übersetzt
2
Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
(Translation). Das neu synthetisierte Protein wird dann in die Plasmamembran transportiert,
die Signalsequenz die zu dieser Lokalisierung führt ist nicht bekannt.
Literatur:
- Tanner, W. (1985) Ionenströme und Substratflüsse, BIUZ, 15;8-15
- Sauer, N., Tanner, W. (1993) Molecular biology of sugar transporters in plants. Bot.
Acta 106;277-286
- Stadler, R., Wolf, K., Hilgarth, C., Tanner, W., Sauer, N. (1995) Subcellular
localization of the inducible Chlorella HUP1 monosaccaride-H+ symporter and
cloning of a co-induced galactose-H+ symporter. Plant Physiol. 107;33-41
Programm:
A) Induktion des Hexosetransportsystems
1) Herstellung einer Algensuspension mit normierter Dichte
2) Induktionsansätze
3) Zuckerbestimmung nach Folin-Wu
B) Aufnahme von (14C)3-O-Methylglukose durch induzierte bzw. nicht-induzierte
Algen
1) Aufnahme von (14C)-3-O-Methylglukose
Zeitplan:
1. Tag
2. Tag
Vormittag
Vorbesprechung, Strahlenschutz
Ernte der Algen,
Induktionsansatz
3. Tag
Auswertung, Nachbesprechung
Nachmittag
Ansetzen der Puffer
Aufnahmeversuch,
Messung der Radioaktivität
3
Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
2. Versuchsdurchführung
2.1 Induktion des Hexosetransportsystems
Es soll das Hexosetransportsystem in Chlorella durch Glukose induziert werden. Die
Induktion soll durch einen Zuckertest (Abschn. 2.1.3) in 15-min Abstand und anschließend
durch die Messung der mRNA eines Monosaccharid-Carrier-Gens bei 0, 15 und 60 min
(HUP1, Abschn. 2.4) gezeigt werden.
Versuchsvorbereitung:
Schüttelwasserbad auf 27°C vorheizen; 1,5ml-Reagier-Gefäße in Eis vorkühlen
Wichtig: Bei allen Arbeiten mit Algen, hier und in den folgenden Abschnitten, unbedingt
die Suspension gut schütteln, bevor die Proben entnommen werden, denn die Algen setzen
sich verhältnismäßig schnell ab und werden u. U. anaerob.
Herstellung einer Algensuspension mit normierter Dichte
Die 3-4 Tage in anorganischem Medium im Licht bei Belüftung mit Pressluft und 1%
Kohlendioxid angezogenen Algen (in dieser Form werden sie gestellt) werden in einer
Erntezentrifuge 5 min bei 3.000 Upm abzentrifugiert. Die sedimentierten Algen werden in
insgesamt 30 ml dest. H2O aufgeschwemmt und in einen Messzylinder überführt (in Eis
aufbewahren). Zur Bestimmung des Zellvolumens der Algen werden 1 ml Algensuspension
in ein “Hämatokrit”-Zentrifugenglas (mit 100-µl-Markierung) pipettiert und 10 min bei
2.000 Upm zentrifugiert. Die im Kapillaransatz sedimentierten Algen lassen sich mit der
Markierung in µl “gepackte Zellen” (packed cells = p.c.) bestimmen. Die Algensuspension
wird nun mit dest. H2O so eingestellt, dass die Algendichte (50 µl p.c./ml) beträgt. Zur
Berechnung der Aufnahmegeschwindigkeit und des Akkumulatonsfaktors (siehe
Auswertung) muss bedacht werden, dass 30% Zwischenzellwasser abgezogen werden muss
um das tatsächliche Zellvolumen zu erhalten.
Induktionsansätze
Folgende Volumina werden jeweils in 50 ml Erlenmeyerkolben zusammen pipettiert und in
einem Schüttelwasserbad bei 27°C geschüttelt:
A-1)
10 ml Algen (50 µl p.c /ml)
5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,0
4 ml dest. H2O
B-1)
10 ml Algen (50 µl p.c./ml)
5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,0
5 ml dest. H2O
Nach 10 min wird die Induktion in Ansatz A-1 durch Zugabe von 1 ml 140 mM
Glukoselösung gestartet. Aus diesem Ansatz werden sofort 0,5 ml Algen entnommen, in
ein gekühltes 1,5 ml-Reagier-Gefäß gegeben und 1 min bei maximaler Umdrehung
zentrifugiert. Vom Überstand werden 0,1 ml in ein 1,5 ml-Reagier-Gefäß gegeben und auf
Eis aufbewahrt. In gleicher Weise werden Proben aus Ansatz A-1 jede weitere
Viertelstunde für insgesamt 120 min entnommen und aufgearbeitet. Mit diesen Proben wird
sodann die Zuckerbestimmung (2.1.3) durchgeführt. Ist anhand des Zuckertestes die
Induktion positiv verlaufen, kann mit Abschn. 2.2 weitergemacht werden (Ansätze nicht
verwerfen!).
Zuckerbestimmung nach Folin-Wu
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Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Der Nachweis von Glukose beruht auf der folgenden Reaktion von zweiwertigem Kupfer
mit Aldehydgruppen:
Folin-Wu A mit Zucker:
Ox:
R-CHO + 2 OHRed:
2 Cu2+ + 2 e- + 2 OHRedOx: R-CHO + 2 Cu2+ + 4 OH-
Î R-COOH + 2 e- + H2O
Î Cu2O (Ð rot) + H2O
Î R-COOH + Cu2O (Ð rot) + 2 H2O
Folin-Wu B mit einwertigem Kupfer:
Ox:
Cu(I)
Î Cu(II)
Red:
MoO3 + xH
Î MoO3-x(OH)x
Es entsteht eine tiefblaue kolloidale Lösung von Mischoxiden des vier- (x = 2) bis
sechswertigen (x = 0) Molybdäns.
Zur quantitativen Auswertung muss eine Eichkurve erstellt werden. Dazu werden 0,01 /
0,025 / 0,05 / 0,075 / 0,1 und 0,2 µmol Glukose und eine Wasserprobe (Nullwert) dem Test
in gleicher Weise unterzogen, d.h. in 10-µl-Mengen eingesetzt. Mit Hilfe folgender
Tabelle, in der die stark-umrandeten Felder von Ihnen ergänzt werden sollen, können aus
einer 20 mM Glukoselösung die entsprechend konzentrierten Testlösungen hergestellt
werden.
Testkonz.
(µMol in µl)
0,2 in 10 µl
0,1 in 10 µl
0,075 in 10 µl
0,05 in 10 µl
0,025 in 10 µl
0,01 in 10 µl
0 in 10 µl
entspricht einer
Konzentration von
(mM)
1 ml Testlösung besteht aus
x µl
x µl
20 mM Glukose
Wasser
• Die Proben von 10 µl (klarer Überstand aus Induktionsansatz sowie Testlösungen)
werden mit dest. H2O auf 100 µl aufgefüllt;
• dann wird 100 µl Lösung Folin-Wu A zugegeben, gemischt, und bei 100°C 7 min
lang gekocht.
• Anschließend werden die Proben 3 min in kaltem Wasser gekühlt
(Reagiergefäßständer ins Waschbecken stellen), und sodann 100 µl Lösung Folin-Wu B
zugegeben, gut durchmischt und nach 10 min mit 1 ml dest H2O aufgefüllt.
• Nach 40 min wird die Extinktion bei 650 nm in Halbmikroküvetten gemessen.
Bitte beachten Sie die Gefahrstoffhinweise am Ende dieser Versuchsbeschreibung!
Auswertung
- Die in den Proben enthaltenen Zuckermenge (µmol Glucose / ml Medium) wird
gegen die Zeit (h) aufgetragen.
- Berechnen Sie die Aufnahmerate zu Beginn der Induktion und im Zustand der
Induktion in [µmol / (h ml p.c.)].
- Diskutieren Sie die Ergebnisse.
5
Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
2.2 Aufnahme von (14C) 3-O-Methyl-Glukose durch induzierte und durch nichtinduzierte Algen
Vor der Durchführung des Versuches muss unbedingt das Kapitel über radioaktive Isotopen
(Abschn. 3) gelesen werden. Dort finden Sie einige grundlegende Informationen zur
Quantifizierung und zum Strahlenschutz.
In diesem Versuchsteil sollen die Aufnahmekinetik und die Akkumulation eines nicht
metabolisierbaren Glukoseanalogs in Chlorella bestimmt werden.
Aufnahmeansatz
Mit den beiden Algensuspensionen aus Abschn. 2.1.2 werden nun folgende
Aufnahmeansätze hergestellt:
A-2)
9,8 ml Ansatz A-1 (induzierte Algen)
0,2 ml 14C-markiertes Substrat bestehend aus:
0,1 ml 20 mM 3-O-Methylglukose
0,1 ml 1 µCi/ml (14C) 3-O-Methylglukose, (38,3 mCi/mmol)
B-2)
9,8 ml Ansatz B-1 (Kontrolle)
0,2 ml 14C-markiertes Substrat bestehend aus:
0,1 ml 20 mM 3-O-Methylglukose
0,1 ml 1 µCi/ml (14C) 3-O-Methylglukose, (38,3 mCi/mmol)
Von diesen Aufnahmeansätzen werden Proben auf Membranfilter abfiltriert (die
Membranfilter vorher mit H2O anfeuchten). Dazu werden 0,5 ml auf den Filter in der
Absaugbank pipettiert und einmal mit etwa 5 ml eiskaltem Phosphatpuffer (25 mM, pH
6,0) gewaschen (zwischen den Waschschritten den Hahn schließen). Die Filter werden mit
einer Pinzette vorsichtig in Szintillationsgläschen überführt und am Ende des Versuches
mit 10 ml Szintillationslösung versetzt.
Proben werden zu folgenden Zeiten entnommen: 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 min. Außerdem
wird etwa nach 20 und 110 min je ein “Gesamtwert” entnommen, d.h. 0,5 ml des
Aufnahmeansatzes werden ohne Filtration direkt in die Szintillationsgläschen pipettiert.
Auswertung
•
Die Radioaktivität in den einzelnen Proben wird gegen die Zeit (h) aufgetragen.
•
Berechnen Sie die anfänglichen Aufnahmeraten [µmol / (h ml p.c.)] bei
induzierten und bei nicht induzierten Algen. Benutzen Sie dazu entweder eine Tangente
zum anfänglichen Kurvenverlauf, oder Tabellenkalkulationsprogramme (MS Excel oder
SigmaPlot), die Trendlinien (Regressionskurve) berechnen, die Sie zur Bestimmung der
anfänglichen Aufnahmerate hernehmen können.
•
Berechnen Sie die Anreicherung der 3-O-Methylglukose in den Algenzellen
gegenüber dem Außenmedium am Ende der Inkubation (120 min). Beachten Sie, dass
die in die Chlorella-Zellen bereits aufgenommene Zuckermenge natürlich nicht mehr im
Medium vorhanden ist.
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Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Berechnen von Geschwindigkeit, Akkumulationsfaktor und Energiebetrachtung.
Berechnen von Aufnahmegeschwindigkeit aus der Aufnahmerate von radioaktiv
markiertem Zucker:
Man geht davon aus, dass Enzyme und Transportproteine nicht unterscheiden können, ob
ein Zuckermolekül an irgendeiner Stelle ein 12C- oder ein 14C-Atom trägt (es gibt auch
Hinweise für diese Annahme). Somit steht die Aufnahme radioaktiv markierten Zuckers
repräsentativ für die Aufnahme auch des nicht markierten Zuckers und man kann aus der
Radioaktivitätsaufnahme die Zuckeraufnahme errechnen.
Beispiel: Die Zellen (10 µl gepacktes Volumen) haben in 5 min 3000 cpm Radioaktivität
aufgenommen, d.h. die Aufnahmegeschwindigkeit betrug 600 cpm/min.
Im Versuchsansatz liegen 1 mM (= 1 µmol/ml) Zucker vor und zugleich 10000 cpm/ml. Da
die Zuckermenge praktisch ausschließlich durch den nicht-radioaktiven Zucker bestimmt
wird (die Menge an nicht-radioaktiv markiertem Zucker überwiegt bei weitem die geringe
Menge an radioaktiv markiertem Zucker; siehe Hinweis unten), repräsentieren 10000 cpm
folglich 1 µmol Zucker. 600 cpm repräsentieren demnach 60 nMol, und die
Aufnahmegeschwindigkeit ist 60 nMol/min und 10 µl gepackte Zellen. So einfach!
Hinweis: Die sog. spezifische Radioaktivität gibt den Anteil einer markierten Substanz an
der Gesamtmenge dieser Substanz an. Die in Abschnitt 2.2.2 verwendete 3-OMethylglukose-Stammlösung hat folgende Spezifikation:
Spez. Aktivität:
38,1 mCi/mMol
(= 1410 MBq/mMol)
Konzentration:
0,1 µCi/ml
(= 3,7 kBq/ml)
Daraus kann der Anteil markierten Zuckers am Gesamtzucker im Aufnahmeansatz
berechnet werden (Umrechnungsfaktoren: 1 mCi = 37 MBq; 1 Bq = 60 dpm)
Der Akkumulationsfaktor:
Unter Akkumulation versteht man in unserem Fall den Faktor, mit dem eine Konzentration
in der Zelle höher ist als im umgebenden Medium. Man errechnet also zum Zeitpunkt des
stationären Zustands (wenn die Konzentrationen in der Zelle und im Medium konstant
bleiben) die Zuckerkonzentration in den Zellen und die Zuckerkonzentration im Medium
und bildet den Quotienten.
Im Fall unseres Versuchs könnte man alleine mit der Radioaktivität rechnen, denn diese
steht repräsentativ für den Zucker.
Beispiel: Die Zellen in 1 ml Aufnahmeansatz haben 8000 cpm aufgenommen, im Medium
waren zu Beginn 10000 cpm/ml. Die Zelldichte im Aufnahmeansatz war 10 µl gepacktes
Volumen pro ml. Im gepackten Zellvolumen sind 30% Zwischenzellwasser enthalten (=
dichte Kugelpackung), d.h. reines Zellvolumen ist 6,67 µl/ml.
Die (Radioaktivitäts-)Konzentration in den Zellen ist folglich 8000 cpm/6,67 µl, im
Medium 2000 cpm/993,3 µl (die Summe der von den Zellen aufgenommenen sowie der im
Medium verbliebenen Radioaktivität muss ja 10000 cpm sein!). Der Akkumulationsfaktor
(Zelle/Medium) ist dann
8000cpm 993,3μl
×
= 596 (ohne Benennung!)
6,67 μl
2000cpm
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Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Die Energiebetrachtung:
Die Akkumulation einer Substanz muss durch einen metabolischen Energieeinsatz
ermöglicht werden. Im konkreten Fall des Zuckertransports ist es auf Grund des H+Cotransports die protonmotive force, d.h. die osmotische Energie im Protonengradienten
(ΔpH) plus die elektrische Energie im Membranpotential (ΔE).
Wie stark können nun Chlorella-Zellen Zucker akkumulieren, wenn realistische
Protonengradienten (z.B. ΔpH = 1,5) und Membranpotentiale (z.B. –120 mV) zugrunde
gelegt werden? Folgende Gleichungen helfen uns dazu:
Einerseits lässt sich aus einem bekannten Konzentrationsunterschied der dafür notwendige
Energiebetrag berechnen:
a) Die erforderliche Energie für akkumulierte Teilchen ist:
⎛K
⎛K
⎞
⎞
ΔG = − RT × ln⎜ innen ⎟ oder ΔG = − RTα × log⎜ innen ⎟
⎜K
⎜K
⎟
⎟
⎝ außen ⎠
⎝ außen ⎠
K ist der Akkumulationsfaktor, genauer die Gleichgewichtskonstante des betrachteten
Prozesses, d.h. Zuckerkonz.innen/Zuckerkonz.außen. Zur Vereinfachung wurde ln in log
umgewandelt und die Formel mit einem Korrekturfaktor α versehen.
Die Konstanten R, T und α ergeben 1,3 kcal/Mol oder 5,5 kJ/Mol
Fazit: Ein Transport gegen eine 100fache Akkumulation benötigt 11 kJ/Mol transportierte
Substanz.
Andererseits lässt sich aus der Energie die ‚protonmotive force’ bei bekanntem
Transportmechanismus eine maximale Akkumulation abschätzen:
b) Die Energie im Protonengradienten (ΔpH) ist:
+
⎛ H außen
⎞
⎜
⎟
ΔG = − RT ln
⎜ H+ ⎟
⎝ innen ⎠
Bildet man aus dem Quotienten der Protonenkonzentrationen den dekadischen Logarithmus
(log) und korrigiert mit einer Konstante α, so ergibt sich:
ΔG = − RTα × ΔpH
ΔpH ist wie log (Ki/Ka) der dekadische Logarithmus eines Konzentrations-verhältnis,
nämlich H+außen/H+innen).
Fazit: ΔpH sei 1,5; die Energie dieses pH-Gradienten ist also:
ΔG pH = 1,5 × 5,5kJ / Mol = 8,25kJ / Mol
c) Die Energie im Membranpotential (ΔE) ist:
ΔG = − nF × ΔE
wobei
n die Stöchiometrie ist (Ladung pro transportiertem Teilchen, oft = 1),
F = e N = 96,5 kJ / (V Mol)
Fazit: Ein Membranpotential von –120 mV entspricht also einem Energiebetrag von:
ΔG = −1 × 96,5 kJ / (V Mol ) × −0,12 V = 11 kJ / Mol
Faustregel: Unter physiologischen Bedingungen (ca 25°, 1 bar) bedeutet ein
Konzentrationsgleichgewicht von 10 etwa 5,5 kJ oder 60 mV.
Achtung: Die Gleichgewichtsfunktion ist logarithmisch!
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Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Materialliste für Versuch Hexosetransport
Lösungen: (von Studenten herzustellen)
•
- 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 6,0
Menge
1 Liter
800 ml 0,1 M NaH2PO4
200 ml 0,1 M Na2HPO4
pH-Wert durch Zugabe von etwas Na2HPO4 zu NaH2PO4 einstellen (diese Menge reicht
auch, um den untenstehenden 25 mM Puffer anzusetzen; den Rest aber nicht verwerfen)
• 25 mM Natruimphosphatpuffer pH 6,0
aus 0,1 M Natruimphosphatpuffer pH 6,0 verdünnen
2 Liter
• 140 mM Glukose
50 ml
(diese Menge reicht auch, um die untenstehenden 20 mM Glukoselösung anzusetzen;
den Rest aber nicht verwerfen)
• 20 mM Glukose
aus 140 mM Glukosekösung verdünnen
5 ml
Lösungen, die gestellt werden:
Folin-Wu A: 40 g Natriumcarbonat (wasserfrei) in 400 ml H2O lösen
+ 7,5 g Weinsäure
+ 4,5 g CuSO4 * 5H2O
H2O ad 1000 ml
Folin-Wu B: 35 g Molybdänsäureanhydrid
in 400 ml 5% NaOH 30 min kochen
nach dem Abkühlen
125 ml 85% Phosphorsäure zugeben
H2O ad 500 ml
9
Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
Gefahrstoffe:
Bitte beachten Sie die in der Anleitung angegebenen Gefahrhinweise!
Aceton:
Gefahrenhinweise: F - Leichtentzündlich
R-Sätze: 11
S-Sätze: 9-16-23.2-33
Chloroform
Gefahrenhinweise:
Xn - Mindergiftig (gesundheitsschädlich)
R-Sätze: 20/22-38-40-47-48
S-Sätze: 36/37-53
Kupfer(II)-Sulfat x 5 H2O
Gefahrenhinweise:
Xn - Mindergiftig (gesundheitsschädlich
R-Sätze: 22-36/38
S-Sätze: 22
Ethanol
Gefahrenhinweise: F - Leichtentzündlich
R-Sätze: 11
S-Sätze: 7-16
Kaliumpermanganat
Gefahrenhinweise:
Xn - Mindergiftig (gesundheitsschädlich),
O - Brandfördernd
R-Sätze: 8-22
S-Sätze: 2
Methanol
Gefahrenhinweise:
T - Giftig,
F - Leichtentzündlich
R-Sätze: 11-23/25
S-Sätze: 2-7-16-24
Molybdän(VI)-Oxid
Gefahrenhinweise: T - Giftig
R-Sätze: 25
S-Sätze: 24-44
Natronlauge (2 - 5%)
Gefahrenhinweise: Xi - Reizend
R-Sätze: 34
S-Sätze: 2-26-37/39
Natronlauge (>5%)
Gefahrenhinweise: C - Ätzend
R-Sätze: 35
S-Sätze: 2-26-37/39-45
Natriumcarbonat
Gefahrenhinweise: Xi - Reizend
R-Sätze: 36
S-Sätze: 22-26
Phenol
Gefahrenhinweise: T – Giftig
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Modul Bioenergetik
Transport
Teilversuch I
R-Sätze: 24/25-34
S-Sätze: 2-28.1-44
Phosphorsäure
Gefahrenhinweise: C - Ätzend
R-Sätze: 34
S-Sätze: 26
Weitere Internetadressen zu diesem Thema:
- Universität Bayreuth, Gefahrstoffe und Umweltschutz
http://www.uni-bayreuth.de/verwaltung/referat/a7/ztechnik/gefahrstoffe.html
- Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin
(BgVV);
http://www.bgvv.de/fbs/chem/
- FU Berlin;
http://www.chemie.fu-berlin.de/chemistry/safety/chemsafety.html
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Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
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Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
Messung der Hill-Reaktion der Photosynthese
1. Einleitung
Ziel dieser Aufgabe ist es, den photosynthetischen Elektronentransport und, indirekt, die
Photophosphorylierung zu untersuchen. Thylakoidmembranen (Abb. 3) werden aus
Chloroplasten isoliert, mit entsprechenden Elektronenakzeptoren und Substraten für die
ATP-Synthese inkubiert und belichtet. Die Wirkung von verschiedenen Hemmstoffen als
auch das stöchiometrische Verhältnis zwischen Elektronentransport und der ATP-Synthese
werden untersucht.
Das pflanzliche Objekt sind Thylakoide aus Spinatblättern. An Spinatchloroplasten wurden
viele Photosyntheseenzyme isoliert und charakterisiert. In der Regel synthetisieren
Pflanzen eine Vielzahl von Abwehrstoffen als Fraßschutz, Stoffe die Enzyme inaktivieren,
Membranen angreifen und diese Pflanzen auch als menschliche Nahrung ungenießbar
machen. Nur die vom Menschen durch Züchtung „entschärften“ Pflanzen wie
beispielsweise Spinat haben einen geringen Anteil dieser Stoffe, sodass aus diesen Pflanzen
am ehesten funktionell intakte Organelle und Enzyme extrahiert werden können.
Abb. 3:
Schema des Chloroplasten einer Höheren Pflanze und der Thylakoidmembranen.
Der photosynthetische Elektronentransport
Die photosynthetische Elektronentransportkette der Höheren Pflanzen besteht aus drei, die
Membran überspannenden Multiproteinkomplexen: (a) dem Wasserspaltungs-Komplex und
dem Photosystem 2, (b) dem Cytochrom b6/f-Komplex und (c) dem Photosystem 1. Zwei
mobile Carrier übertragen die Redoxäquivalente auf den jeweils folgenden
Multiproteinkomplex. Ubichinone leiten die Redoxäquivalente von PS2 zum Cytochrom
b6/f-Komplex; Plastocyanin vermittelt zwischen dem Cytochrom b6/f-Komplex und
Photosystem 1. Der hauptsächliche Endakzeptor für Elektronen ist NADP+ (Abb. 4).
Redoxäquivalente können aber auch für Stickstoff- oder Schwefelreduktion verwendet
werden. Ebenso können Redoxäquivalente auf O2 übertragen werden ("Mehler"- Reaktion),
vor allem wenn andere Akzeptoren fehlen.
Jedes Redoxäquivalent, das von H2O auf NADP+ übertragen wird, muss beide
Photosysteme durchlaufen. Daher sind mindestens zwei Photonen nötig, um ein
Redoxäquivalent durch dieses sog. "Z-Schema" zu schleusen. (Bei eventuell auftretender
13
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
Energiedissipation bzw. -ineffizienz werden mehr Photonen benötigt.) Photosyntheseraten
werden üblicherweise in µmol O2 x mg Chl-1 x Stunde-1 angegeben (1 O2 entspricht 4
Elektronen). Ein Spinatblatt kann Photosyntheseraten von 200-300 µmol O2 x mg Chl-1 x
Stunde-1 erreichen. Manchmal werden andere Einheiten verwendet. Zum Beispiel werden
bei Betrachtung der ATP-Synthese (siehe unten) oft 2 Elektronen (entsprechen 1/2 O2 bzw.
1 NADPH) als Bezugsgröße gewählt, in Anlehnung an den Gebrauch bei der oxidativen
Phosphorylierung in Mitochondrien.
Abb. 4:
Schema des Ablaufs des Elektronentransports in der Thylakoidmembran und der Kopplung
zur ATP-Synthese.
Die "Hill"-Reaktion
Bei der Isolierung der Thylakoide gehen das wasserlösliche Komponenten der
Photosynthese verloren, darunter das Protein Ferredoxin, wodurch die Reduktion des
natürlichen Akzeptors NADP+ unterbunden wird. Unter der Hill-Reaktion der
Photosynthese (benannt nach R. Hill, Cambridge, der diese Reaktion 1940 erstmals
nachgewiesen hat) versteht man die Reduktion eines zugesetzten ("künstlichen")
Elektronenakzeptors bei Belichtung von isolierten Chloroplastenfragmenten. Dabei wird
O2 aus Wasser freigesetzt, und Kaliumferricyanid (der "Hill"-Akzeptor) wird reduziert. Die
Elektronen werden in der Nähe des Ferredoxins auf Kaliumferricyanid übertragen. Die
Hill-Reaktion kann entweder photometrisch durch die Reduktion von Fe3+, oder über die
O2-Entwicklung, wie in diesem Kurs, gemessen werden.
4 K3[Fe(CN)6] + 2H2O + 4 K+
→
4 K4[Fe(CN)6] + 4H+ + O2
14
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
Elektronen- und Protonenverschiebung
Die Schritte des Elektronentransports führen entweder zu einer Ladungstrennung über die
Membran oder zu einer Protonenverlagerung über die Membran. In Chloroplasten besteht
die daraus resultierende "Proton Motive Force" (PMF) zum großen Teil aus einem pHGradienten (ΔpH = 3-4), das Membranpotential (ΔE ) ist relativ klein (+60 mV). In
Mitochondrien hingegen besteht die PMF vor allem aus dem Membranpotential (ΔE = 120
mV, ΔpH = 1). Relevant für energieabhängige Prozesse ist die Summe der beiden
Komponenten. Dabei muss man sich erinnern, dass ein pH-Gradient von 1,0 und ein
Membranpotential von ca. 60 mV energetisch äquivalent sind. Aus dem Aufbau der
Elektronentransportkette lässt sich ableiten, dass die Übertragung von2 Elektronen von
H2O auf NADP+ (bzw. Kaliumferricyanid) mit einem Transport von 4 H+ in den
Thylakoidinnenraum verbunden ist (4H+/2e-). Die tatsächliche Protonenausbeute könnte
noch höher liegen, wenn auch der Cytochrom b6/f-Komplex in der Lage ist, Protonen über
die Membran zu befördern ('Q-cycle').
Photophosphorylierung (ATP-Synthese)
Der aufgebaute pH-Gradient dient vor allem der Synthese von ATP aus ADP und Pi. Die
chloroplastidäre ATP-Synthase, die diese Reaktion katalysiert, zeigt eine enge
Verwandtschaft mit dem entsprechenden Protein aus Mitochondrien. Beide setzen sich
zusammen aus einem membranüberspannenden Protonenkanal (CFo bzw. Fo) und einem
"Kopf" (CF1 bzw. F1, siehe Abb. 4). Die CFo und CF1-Strukturen bestehen wiederum aus
vielen, zum Teil verschiedenen Untereinheiten. Drei bis vier Protonen müssen den Kanal
durchqueren um 1 Molekül ATP zu synthetisieren (4-5 H+/ATP).
Der Elektronentransport und die Synthese von ATP sind eng gekoppelt. Auf der einen Seite
wird der für die ATP-Synthese benötigte pH-Gradient mittels des Elektronentransports
aufgebaut. Andererseits steigt der pH-Gradient an, wenn keine ATP-Synthese stattfindet
(z.B. bei ADP-Mangel) und wirkt schließlich hemmend auf den Elektronentransport
(Rückstau). Die entsprechenden "pH-empfindlichen" Schritte sind höchstwahrscheinlich
die Reaktionen zwischen reduziertem PQH2 und dem Cytochrom b6/f-Komplex. Es ist
auch wahrscheinlich, dass steigende [H+] im Thylakoidinnenraum zu erhöhter
Energiedissipation im Photosystem 2 führt, obwohl die Mechanismen noch nicht geklärt
worden sind.
Auch wenn keine ATP-Synthese möglich ist, findet man immer eine basale
Elektronentransportrate in Thylakoiden. Diese basale Rate ist auf "Protonenlecks" in der
Thylakoidmembran zurückzuführen, die verschiedene Ursachen haben. Zum Beispiel
können einige ATP-Synthaseeinheiten im Laufe der Isolierung geschädigt werden.
Fettsäuren, die durch Aktivität von Lipasen in dem Homogenat entstehen, können als
"Entkoppler" (siehe unten) wirken. Ebenso Spuren von Detergenz, Seife und anderen
Verunreinigungen.
Verschiedene Klassen von Hemmstoffen
Drei verschiedene Klassen von Hemmstoffen können zu einer Hemmung der ATPSynthese führen:
(a) Elektronentransporthemmstoffe:
Diese Verbindungen hemmen die Elektronenübertragung. Infolgedessen können auch
keine Protonen transportiert werden, und ein ΔpH kann sich nicht ausbilden (z.B.
Dichlorophenyl-dimethylharnstoff: DCMU).
15
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
DCMU
QA
QB
PQH2
H2O
P680
Abb. 5:
DCMU bindet an der QB Bindungstelle des Photosystems 2 und hemmt die Weiterleitung
von Elektronen von QA auf Plastochinon.
(b) Entkoppler:
Substanzen, die die Thylakoide für Protonen durchlässig machen oder selbst Protonen
durch die Membran transportieren, nennt man Entkoppler. Solche Substanzen hemmen
die ATP-Synthese, da der dafür notwendige H+-Gradient nicht aufgebaut werden kann.
Gleichzeitig kommt es zu einer Stimulierung der Elektronentransportrate, da die pHKontrolle entfällt. NH4Cl z.B. wirkt ähnlich wie ein Entkoppler, weil es als
Protonenpuffer Protonen in den Thylakoiden bindet und somit den pH-Gradienten
erniedrigt. Da in den Thylakoiden die "Proton Motive Force" hauptsächlich durch
einen pH-Gradienten gebildet wird ist somit die ATP-Synthese verhindert.
NH4+
NH3
NH4+
NH3
H+
H+
Abb. 6:
Wirkung von Ammoniumionen in Thylakoiden.
Elektronentransport
(c)
Hemmstoffe der ATP-Synthase:
Diese Inhibitoren binden direkt an die ATP-Synthase, z. B. Dicyclohexyl-carbodiimid
(DCCD).
Zeitplan:
1. Tag
2. Tag
Vormittag
Vorbesprechung,
Präparation der Chloroplasten
und Thylakoide
3. Tag
Auswertung, Nachbesprechung
Nachmittag
Ansetzen der Lösungen
Messung der
Sauerstoffentwicklung
16
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
2. Versuchsdurchführung
Lösungen
Lösungen zur Isolierung der Thylakoide
300 ml Puffer A (Aufschlussmedium für die Chloroplastenisolierung)
0,4 M Saccharose
20 mM Tricin
10 mM NaCl
Mit 1 N NaOH auf pH 8.0 einstellen
200 ml Puffer B (Medium zum Aufbrechen der Chloroplasten)
10 mM NaCl
1 mM MgCl2
1 mM Tricin
Mit 1 N NaOH auf pH 8.0 einstellen
10 ml Puffer C (zum Suspendieren der Thylakoide bzw. zur Messung der Hillreaktion)
Puffer A plus
1 mM MgCl2
0.05% (w/w) Rinderserumalbumin (BSA)
Lösungen zum Messen der Hill-Reaktion:
1. Puffer C (siehe oben)
50 mM
2. 10 ml MgCl2
3. 1 ml K-Ferri-Cyanid
1M
0.9 M
4. 5 ml NH4Cl
50 mM (mit HCl auf pH 8 einstellen)
5. 5 ml K2HPO4
6. 0.5 ml ADP
10 mM (50 mM ADP wird gestellt, Gefrierschrank)
7. DCMU in DMSO
1 mM (wird gestellt, Kühlraum)
Zur Chlorophyll-Bestimmung
70 ml 80% Aceton
17
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
2.1 Herstellung der Thylakoide
Prinzip:
Die Spinatblätter werden in isotonischer Lösung homogenisiert und die Chloroplasten
durch differentielle Zentrifugation gewonnen. Durch das darauf folgende Suspendieren der
Chloroplasten in stark verdünnter Lösung zerplatzen die Chloroplasten und die
Chloroplastenbruchstücke (Thylakoide) können durch hochtourige Zentrifugation
gesammelt werden. Die Membranen enthalten Chlorophyll und die meisten Enzyme des
Elektronentransports. Die wasserlöslichen Substanzen des Chloroplasteninnenraums
(Substrate wie ATP, ADP, Mg usw., als auch die Enzyme der CO2-Fixierung) gehen dabei
in den Überstand.
Durchführung:
Von 50 g gewaschenen kalten Spinatblättern werden Stiele und die gröbsten Mittelrippen
entfernt, die Blätter schnell in schmale Streifen geschnitten und zusammen mit 250 ml
Puffer A für 3 bis 5 sec im Mixer bei voller Tourenzahl zerkleinert. Das Homogenat wird
durch 6 Lagen Verbandsmull über einen kalten Trichter in einen kalten Erlenmeyerkolben
abgepresst. Der Presssaft wird auf gekühlte Zentrifugenbecher verteilt, schnell austariert
und in der gekühlten Zentrifuge 2 min bei 4000 U/min (bei r = 10,8 cm = 1800 g)
zentrifugiert. Der grüne Überstand, der Chloroplastenfragmente, Mitochondrien, etc.,
enthält, wird abgegossen und verworfen. Das Sediment enthält ganze Chloroplasten, die
durch portionsweise Zugabe von ca. 80 ml Puffer B (eiskalt) und durch Schwenken des
Bechers aufgeschwemmt und osmotisch aufgebrochen werden. Die Suspension wird in
zwei eiskalte Zentrifugenbecher dekantiert, die Becher exakt austariert und 2 min bei
12.000 U/min (bei r = 10,8 cm = 17.000 g) zentrifugiert. Der gelbliche Überstand (=
Chloroplastenextrakt mit wasserlöslichen Enzymen) wird abgegossen und verworfen. Das
grüne Sediment der Zentrifugenbecher wird durch vorsichtiges Aufschwemmen (so dass
keine Klumpen entstehen) mit einer Mikroliterpipette in 0.5 ml eiskaltem Puffer C
suspendiert (Schwenken und auf- und abziehen mit einer Pasteurpipette) und in ein
eiskaltes, graduiertes Reagenzglas (10 ml) gegeben.
2.2 Bestimmung des Chlorophyllgehalts
Die erhaltene Suspension soll nun auf einen Chlorophyllgehalt von 2 mg/ml eingestellt
werden. Die Chlorophyllkonzentration wird wie folgt bestimmt (Triplikate) : 10µl der
Suspension werden in ein Reagenzglas mit 20 ml 80% Aceton einpipettiert, geschüttelt und
mit Papierfilter abfiltriert (das Filtrat muss klar sein!). Die Extinktion wird bei 645 und 663
nm in einem Spektralphotometer gemessen.
20
20,2 E645 + 8,02 E663
___________________ x _____
1000
0.01
= mg Chlorophyll / ml Suspension
Die Thylakoidsuspension muss dann entsprechend mit Puffer C verdünnt werden.
Thylakoidfragmente bleiben bei 0°C im Dunkeln einige Stunden aktiv.
18
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
2.3 Messung der Hill-Reaktion
Die Messung der Hill-Reaktion erfolgt durch die Registrierung von gebildetem Sauerstoff
mittels polarographischer Messung mit einer Sauerstoff-Elektrode. Eine allgemeine
Anleitung zu diesem Verfahren finden Sie im Anhang.
Vorbereitungen (rechtzeitig treffen:)
- Die Sauerstoffelektrode einschalten (mindestens eine Stunde vor der Messung in
der "Standby"-Stellung laufen lassen).
- Die Messküvette auf ca. 17°C temperieren (Wasserbad und Kühlung anschalten!).
- Aqua bidest. in einem 100 ml Gefäß auf 17°C temperieren und mit Pressluft
durchspülen (zur Eichung).
- Papiergeschwindigkeitsregler auf 1 cm/min stellen.
- Lampen in Position bringen, aber noch nicht anschalten
- Bevor und zwischen Messungen die Küvette unbedingt mit Aqua bidest. beschicken
(Austrocknungsgefahr!).
Vorversuch als Übung
- Messküvette leersaugen und mit 1,5 ml Aqua bidest beschicken; Messkammer nicht
verschließen.
- Magnetrührer zur Umwälzung des Küvetteninhalts und Schreiber anschalten.
- Mit N2 begasen:
Schreiberbewegung verfolgen, bis eine Basislinie erreicht ist (= Null O2).
Schreiber so einstellen, dass die Basislinie knapp über dem unteren Rande
des Schreiberpapiers liegt.
- N2-Begasung bei geöffneter Küvette einstellen, 1-2 Min. warten. Messkammer
verschließen, 1 Min. warten.
25 µl luftgesättigtes Wasser mit einer 25 µl Hamilton-Spritze einspritzen, 1 Min.
warten.
Schreiberbewegung jeweils beobachten.
Hierbei wird die Handhabung der Messkammer, der N2-Begasung, des Schreibers und der
Hamilton-Spritze vertraut gemacht, und die Reaktion der Elektrode auf O2 demonstriert. Es
wird auch festgestellt, welcher Druck für eine wirkungsvolle Begasung notwendig ist.
Spülvorgang (sehr wichtig!)
Die Hill-Reaktion und ihre Abhängigkeit von und Beeinflussung durch verschiedener
Parameter werden in Messreihen untersucht (s. Folgendes). Dabei ist zu beachten:
- Die Küvette sollte zwischen den einzelnen Messreihen mindestens 5 x mit Aqua
bidest gespült werden; der Verschlussdeckel und die Belüftungshahn müssen ebenfalls
gespült werden. Die Hamiltonspritze muss 5 x sofort nach jeder Verwendung mit Aqua
bidest gespült werden.
- Nach Verwendung von DCMU sollte die Küvette, der Deckel, der Hahn und die
Spritze jeweils zuerst mit Äthanol gespült werden, und anschließend mindestens 6 x
mit Aqua bidest.
- wenn die nächste Messreihe nicht sofort angesetzt wird, muss die Küvette mit Aqua
bidest. gefüllt stehen gelassen werden!
19
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
Die Messreihen
Die Hill-Reaktion, ihre Abhängigkeit von Licht und Elektronenakzeptoren, und ihre
Beeinflussung durch die Photophosphorylierung, NH4Cl und DCMU werden in 4
Messreihen untersucht. Dabei werden Änderungen in der O2-Konzentration der
Küvettenflüssigkeit durch Aufzeichnungen mittels eines Schreibers laufend festgehalten
(die Relation des Schreiberausschlags zu der O2-Konzentration wird anschließend bei der
"Eichung der O2-Elektrode" ermittelt).
Die Schreiberaufzeichnungen sind die Messergebnisse der Versuche im unmittelbaren
Sinne, aus denen alle O2-Entwicklungsphänomene ersichtlich werden, und sie stellen die
Grundlage für alle Berechnungen von O2-Entwicklungsraten dar. Als solche müssen sie zur
Wiedergabe im Versuchs-Protokoll aufgehoben und vollständig beschriftet werden.
Bei den Arbeiten zu den verschiedenen Messreihen sollen mit Bleistift am laufenden
Schreiberpapier die Zeitpunkte und wesentliche Informationen zu den verschiedenen
Behandlungen markiert werden. Nach Beendung der Messungen sollen diese vorläufige
Markierungen sauber, vollständig und gut leserlich auf dem Schreiberpapier nachgearbeitet
werden.
Messreihe 1
1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit:
Aqua bidest:
1,12 ml
Puffer C:
0,2 ml
MgCl2:
0,05 ml
Kalium-Ferricyanid:
0,01 ml
2. Mit N2 begasen:
bis die Basislinie (fast) erreicht ist (wie in dem "Vorversuch").
3. 30 µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer
möglichst zügig verschließen und abdunkeln. Warten, bis sich ein konstant
verlaufendes Messsignal sich einstellt (1-2 Min.).
4. Lampen anschalten:
Die Reaktion (die Veränderung des Messsignals) verfolgen, bis sie eindeutig
konstant ist (der Schreiber soll auf ca. 1/3 der Höhe des Schreiberpapiers
steigen).
5. Licht ausschalten für 2 Min.,
6. danach erneut belichten:
Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber auf ca. 2/3 der Höhe des
Schreiberpapiers gestiegen ist.
7. 10 µl NH4Cl mit der Hamilton-Spritze einspritzen:
Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber bis ans Ende des Schreiberpapiers
gelangt.
8. Küvette leersaugen und spülen (s. "Spülvorgang").
Messreihe 2
1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit:
Aqua bidest:
1,12 ml
Puffer C:
0,2 ml
MgCl2:
0,05 ml
2. Mit N2 begasen:
bis die Basislinie (fast) erreicht ist.
20
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
3. 30 µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer nach
15 Sek. verschließen und abdunkeln, Warten, bis sich ein konstant verlaufendes
Messsignal einstellt (1-2 Min.).
4. Lampen anschalten:
Die Reaktion verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist. Die konstant verlaufende
Reaktion soll ca. 2 Min. anhalten.
5. 10 µl Kalium-Ferricyanid-Lösung mit der Hamilton-Spritze einspritzen:
Die Reaktion verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist (der Schreiber soll auf ca.
1/3 der Höhe des Schreiberpapiers steigen).
6. Licht ausschalten für 2 Min., danach erneut belichten:
Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber auf ca. 2/3 der Höhe des
Schreiberpapiers gestiegen ist.
7. 10 µl NH4Cl mit der Hamilton-Spritze zugeben:
Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber ans Ende des Schreiberpapiers
gelangt.
8. Küvette leersaugen und spülen.
Messreihe 3
1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit:
Aqua bidest:
1,12 ml
Puffer C:
0,2 ml
MgCl2:
0,05 ml
Kalium-Ferricyanid: 0,01 ml
K2HPO4
0,05 ml
ADP (10 mM)
2,5 µl
2. Mit N2 begasen:
bis die Basislinie (fast) erreicht ist.
3. 30 µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer
verschließen und abdunkeln, Warten, bis ein konstant verlaufendes Messsignal sich
einstellt (1-2 Min.).
4. Lampen anschalten:
Eine konstant verlaufende Reaktion stellt sich ein: nach kurzer Zeit ändert sich die
Stärke des Signals, das dann einen neuen, konstant verlaufenden Wert annimmt.
Warten, bis der zweite konstante Wert sich eindeutig eingestellt hat, und der Schreiber
auf ca. 1/3 der Höhe des Schreiberpapiers erreicht hat.
5. 2,5 µl ADP (10 mM) mit der Hamilton-Spritze einspritzen:
Wie bei 4. stellen sich hintereinander zwei konstant verlaufenden Reaktionen ein.
Warten, bis der zweite konstante Wert sich eindeutig eingestellt hat, und der Schreiber
sich auf ca. 2/3 der Höhe des Schreiberpapiers befindet.
6. 10 µl NH4Cl mit der Hamilton-Spritze zugeben:
Reaktion verfolgen, bis der Schreiber ans Ende des Schreiberpapiers gelangt.
7. Küvette leersaugen und spülen.
Messreihe 4
1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit:
Aqua bidest:
1,12 ml
Puffer C:
0,2 ml
MgCl2:
0,05 ml
Kalium-Ferricyanid:
0,01 ml
2. Mit N2 begasen:
21
Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
bis die Basislinie (fast) erreicht ist.
3. 30 µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer zügig
verschließen und abdunkeln, Warten, bis ein konstant verlaufender Messsignal sich
einstellt (1-2 Min.).
4. Lampen anschalten:
Die Reaktion verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist (der Schreiber soll auf ca. 1/3 der
Höhe des Schreiberpapiers steigen).
5. 10 µl NH4Cl mit der Hamilton-Spritze zugeben:
Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber auf ca. 2/3 der Höhe des Schreiberpapiers
gelangt.
6. 10 µl DCMU mit der Hamilton-Spritze zugeben:
Die nachfolgende, mehrphasige Reaktion verfolgen, bis während eines Zeitraums von
mindestens 2 Min. keine Änderung im Verlauf des Messsignals mehr erfolgt.
7. Küvette leersaugen und spülen:
Beachten, dass nach DCMU-Zugabe die Küvette und die Hamilton-Spritze auch mit
Ethanol gespült werden müssen (s. "Spülvorgang").
Die Eichung der Sauerstoff-Elektrode
1. Küvette leersaugen und mit einer Mikroliterpipette mit 1,4 ml Aqua bidest
beschicken.
2. Mit N2 begasen:
bis die Basislinie (fast) erreicht ist.
3. Messkammer verschließen:
Warten, bis das Messsignal konstant bleibt.
4. 100 µl luftgesättigtes Wasser (17oC) mit einer 250 µl Hamilton-Spritze einspritzen:
Das Messsignal verstärkt sich: warten, bis es wieder einen konstanten Wert
angenommen hat (1-2 Min.).
Anschließend erneut 2 x je 100 µl des luftgesättigten Wassers einspritzen:
Jeweils wieder warten, bis das sich verstärkende Signal einen konstanten Wert
angenommen hat.
Die Aufzeichnung des Signals während der Eichung sieht somit folgendermaßen aus:
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Modul Bioenergetik
Transkriptanalyse
1 ml luftgesättigtes Wasser enthält bei 17oC und 1 atm 0,29 µmol O2. Der
Schreiberausschlag ist proportional der Konzentrationsänderung in der Küvette.
Berechnung von O2-Entwicklungsraten
Auf den fertig beschrifteten Schreiberpapieren werden alle konstant verlaufenden O2Reaktionen durch das Anliegen eines Lineals nachgezeichnet. Entsprechend diesen
Geraden werden dann die jeweiligen Steigungen ermittelt (Skalenanteile des
Schreiberpapiers oder Millimeter pro Zeiteinheit).
Anhand der Steigungswerte und des ermittelten Faktors für die Relation
Schreiberausschlag/O2-Konzentration wird die O2-Entwicklung in der Küvette als µmol
O2 entwickelt (bzw. verbraucht) pro Minute und ml Küvettenvolumen berechnet. Unter
Berücksichtigung der Konzentration an Chlorophyll in der Küvette wird schließlich die O2Entwicklungsrate als µmol O2 . mg Chlorophyll-1 . Stunde-1 ausgedrückt.
Anfertigung des Versuchsprotokolls
Die Darlegung der Fragestellungen zu dem Versuch, eine übersichtsmäßige Beschreibung
der angewandten Methoden und die Präsentation und die Diskussion der Messergebnisse
werden in einem Versuchsprotokoll dokumentiert. Eine Anleitung zur Anfertigung des
Protokolls ist in einer gesonderten Anlage zu finden.
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