freshsperm

XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Efeito do Resfriamento sobre a Qualidade Espermática de Tilápia do Nilo Oreochromis niloticus
(Variedade UFLA)1
Cooling Effect on Sperm Quality of Nile Tilapia Oreochromis niloticus (UFLA Variety)
Pedro Santiago Reis2, Antônio Carlos Silveira Gonçalves3, Hortência Aparecida Botelho4, Natália
Michele Nonato Mourad5, Carlos Cicinato Vieira Melo5, Matheus Hernandes Leira6, Amanda
Carvalho Rosado7 e Rilke Tadeu Fonseca de Freitas8
1
Parte do projeto de Pós-Doutorado do segundo autor, financiado pelo CNPq.
Graduando em Zootecnia – Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasil. Bolsista de
Iniciação Científica do CNPq.
3
Pós-Doutorando em Zootecnia – Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasil. Bolsista
do CNPq. E-mail: [email protected]
4
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia – Universidade Federal de Lavras, Lavras,
Minas Gerais, Brasil. Bolsista do CNPq.
5
Doutorando (a) do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia – Universidade Federal de Lavras, Lavras,
Minas Gerais, Brasil. Bolsista da CAPES.
6
Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias – Universidade Federal de Lavras,
Lavras, Minas Gerais, Brasil.
7
Graduanda em Ciências Veterinárias – Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasil.
Bolsista de Iniciação Científica da FAPEMIG.
8
Professor do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia – Universidade Federal de Lavras, Lavras,
Minas Gerais, Brasil.
2
Resumo: Objetivou-se com este trabalho estabelecer um protocolo de utilização do sêmen de tilápia do
Nilo O. niloticus, através do processo de resfriamento do sêmen fresco (in natura), e diluído em BTS® e
água de coco. O experimento foi realizado na estação de piscicultura da Universidade Federal de Lavras
(UFLA), com 18 machos (320 ± 110 g), estocados em caixas de 250 L. Os parâmetros de qualidade de
água foram controlados. Para a coleta do sêmen, os animais foram anestesiados em água com óleo de
cravo. O sêmen foi coletado em tubos Eppendorf, estocados em caixas de isopor com gelo artificial e
transportados até o laboratório de Ciências Veterinárias da UFLA, para posterior refrigeração. Foi
realizado um pool do sêmen, a cada dois animais, totalizando nove análises. Além do sêmen in natura,
amostras do sêmen fresco foram diluídas em BTS® e água de coco natural, para avaliação da motilidade e
vigor espermáticos, através de microscópio de luz. O sêmen in natura e o sêmen diluído em BTS®
apresentaram alta qualidade espermática em até 24 h de resfriamento. A curto prazo (24 a 72 h), apenas o
sêmen diluído em BTS® manteve alta qualidade espermática. O sêmen diluído em água de coco
apresentou baixa qualidade espermática em todas as análises.
Palavras–chave: diluidores, melhoramento genético, motilidade seminal, peixe, reprodução artificial
Abstract: This work objetive to establish a protocol for use of sperm of Nile tilapia O. niloticus through
the cooling process of the fresh sperm (in natura), and diluted in BTS™ and coconut water. The
experiment was conducted at the fish culture station of Federal University of Lavras (UFLA), with 18
males (320 ± 110 g) stored in boxes of 250L. The water quality parameters were controlled. For sperm
collection, the animals were anesthetized in water with clove oil. The sperm was collected in Eppendorf
tubes, stocked in styrofoam boxes with artificial ice and carried to the laboratory of Veterinary Science in
UFLA to further cooling. One sperm pool every two animals were perfomed, totaling nine analysis. In
addition to the in natura sperm, samples were diluted in BTS™ and natural coconut water, to the
evaluation of motility rate and motility quality score, by light microscope. The in natura sperm and sperm
diluted in BTS™ presented high sperm quality within 24 h of cooling. In the short term (24 to 72 h) only
the sperm diluted in BTS™ kept high sperm quality. The sperm diluted in coconut water showed low
sperm quality in all analysis.
Keywords: artificial reproduction, breeding, extenders, fish, sperm motility
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Introdução
A Tilapicultura é a criação de peixes de maior produção nacional, segunda produção piscícola em
escala mundial. A tilápia do Nilo Oreochromis niloticus destaca-se pela grande adaptação ao clima e a
qualidade da água brasileira, sendo uma espécie de grande rusticidade; além disso, apresenta rápido
crescimento, maturação sexual precoce e sua carne possui grande qualidade, com boa aceitação no
mercado nacional. Entretanto, o fato da tilápia reproduzir naturalmente em cativeiro é um complicador
nos métodos de avaliação genética dos indivíduos ou das famílias e na predição acurada de seus valores
genéticos. Assim, biotecnologias reprodutivas são utilizadas para promover a reprodução artificial da
espécie. O resfriamento do sêmen consiste em manter a viabilidade espermática por algumas horas ou
dias, dispensando a presença do macho no momento da desova, aumentando a eficiência na utilização
espermática. Este trabalho objetiva estabelecer um protocolo de utilização do sêmen de tilápia do Nilo O.
niloticus (variedade UFLA), a curto prazo, através do processo de resfriamento do sêmen fresco (in
natura), e diluído em BTS® e água de coco.
Material e Métodos
O trabalho foi realizado em novembro de 2014, utilizando-se 18 machos (320 ± 110 g) de tilápia
do Nilo, da variedade UFLA, provenientes da estação de piscicultura da Universidade Federal de Lavras
(UFLA). Os animais foram estocados em caixas de 250 L, sendo um peixe por caixa. Os parâmetros de
qualidade da água foram controlados, com temperatura mantida a 28oC e iluminação 12:12 (luz:escuro).
Os peixes receberam ração comercial com 36% de proteína bruta (ad libitum), duas vezes ao dia, durante
a fase de adaptação, sendo realizado um jejum de 24 horas antes da coleta do sêmen. Para a coleta, os
peixes foram anestesiados em água contendo óleo de cravo (120 mg/L). A papila urogenital foi
cuidadosamente limpa, para não haver contaminação por água, fezes ou urina. Em seguida, realizou-se
massagem na cavidade celomática, no sentido craniocaudal, para a retirada do sêmen, através de seringas
de 1 mL esterilizadas. O sêmen coletado foi armazenado em tubos Eppendorf, com a tampa aberta,
estocado em caixa de isopor com gelo artificial (9-11oC), e transportado até o laboratório de Ciências
Veterinárias da UFLA, para posterior refrigeração (4-6 oC). Como a quantidade de sêmen foi insuficiente
para as avaliações, utilizou-se um pool a cada dois animais, totalizando nove análises de sêmen. Foram
avaliados: taxa de motilidade (%) e vigor espermático (0-5, sendo: 0 – sem movimento e 5 – máxima
movimentação), de acordo com Viveiros et al., 2011. Além do sêmen in natura, amostras do sêmen fresco
foram diluídas em BTS® (79,9% de glicose, 12,7% de citrato de sódio, 2,7% de EDTA, 2,7% de
NaHCO3, 1,5% de KCl e 0,5% de sulfato de gentamicina) a 5% e água de coco natural (Nosso Coco;
0,6% de sódio, 5,4% de potássio, 1,8% de carboidrato total, 1,5% de cálcio, 1,5% de fósforo, 54,5% de
vitamina C e 1,5% magnésio), sendo avaliadas a cada dia, até apresentar 30% de motilidade espermática
(mínimo) ou até o prazo máximo de 72 horas (três dias). O sêmen (5 µL) foi avaliado subjetivamente em
microscópio de luz a 400x (L100, Bioval), após adição de 50 µL de água das caixas para ativação
espermática. Os valores de motilidade e vigor espermáticos foram expressos em média ± desvio-padrão.
As análises estatísticas foram realizadas através do programa computacional R (2010). Dados que não
apresentaram distribuição normal foram transformados por arco-seno. Foi realizado análise de variância
(ANOVA) seguida de teste Scott-Knott, quando aplicável, ao nível de 5%.
Resultados e Discussão
O sêmen coletado dos machos apresentou volume médio de 0,33 mL, valor semelhante ao
observado por Mataveli et al. (2010), na mesma espécie. Como a tilápia reproduz-se várias vezes ao ano,
a quantidade de sêmen liberado é baixa em relação às espécies de piracema. Dessa maneira, o pool de
sêmen torna-se necessário para todas as avaliações realizadas. O pool foi obtido a cada dois peixes,
apresentando em média, volume de 0,62 mL. No tempo 0 (antes do resfriamento), sêmen in natura e
sêmen diluído em BTS® não apresentaram diferenças significativas (P>0,05) para a motilidade (94 ± 7%
e 84 ± 5%, respectivamente) e vigor espermático (5,0 ± 0,0 para ambos tratamentos). Porém, o sêmen
diluído em água de coco apresentou menor (P<0,05) motilidade e vigor espermáticos (29 ± 22% e 3,3 ±
0,9). Como o sêmen diluído em água de coco apresentou motilidade espermática abaixo de 30%, o
mesmo não foi avaliado em outros tempos. Com 24 horas de resfriamento, o sêmen diluído em BTS®
apresentou maior (P<0,05) motilidade espermática em relação ao sêmen in natura (83 ± 9% e 49 ± 22%,
respectivamente), porém não apresentaram diferença significativa (P>0,05) para vigor espermático (5,0 ±
0,0 e 4,4 ± 0,7, respectivamente). Novamente, após 48 horas de resfriamento, o sêmen diluído em BTS®
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apresentou maior (P<0,05) motilidade espermática em relação ao sêmen in natura (81 ± 11% e 43 ± 24%,
respectivamente) e não apresentou diferença significativa (P>0,05) para vigor espermático (5,0 ± 0,0 e 3,9
± 1,6, respectivamente). Contudo, após 72 horas, o sêmen diluído em BTS® manteve sua alta qualidade
espermática, com 72 ± 12% de motilidade e 4,9 ± 0,3 de vigor, enquanto o sêmen in natura apresentou
baixa motilidade e vigor espermáticos (24 ± 8% e 2,7 ± 0,5). A tilápia do Nilo é uma espécie muito
prolífera, se reproduzindo várias vezes ao ano. Por essa facilidade, poucos trabalhos foram realizados
envolvendo manipulação de gametas. Nas espécies nativas brasileiras, alguns trabalhos foram realizados
com o resfriamento de sêmen. Em pirapitinga Brycon nattereri, o sêmen in natura e o diluído em BTS®
mantiveram mais de 30% e 80% de motilidade espermática, respectivamente, por 72 horas de
resfriamento (Oliveira et al., 2007). Em piracanjuba Brycon orbignyanus, o sêmen in natura e o diluído
em BTS® mantiveram menos de 10% e mais de 40% de motilidade espermática, respectivamente, por 72
horas de resfriamento (Maria et al., 2006a). Os trabalhos citados comprovam a funcionalidade do BTS®
como diluidor, a curto prazo. Este é comumente utilizado para criopreservação de sêmen suíno, embora
tenha sido utilizado com sucesso para resfriamento e criopreservação de diversas espécies de peixe. Além
da composição de sais e glicose presentes no BTS®, o sulfato de gentamicina pode auxiliar na prevenção
do surgimento de bactérias no sêmen. Em piracanjuba B. orbignyanus, o sêmen in natura apresentou mais
de 50% de motilidade espermática e o sêmen diluído em água de coco não apresentou motilidade
espermática, após 48 horas de resfriamento (Maria et al., 2006b). Para algumas espécies, a água de coco
não funciona como diluidor de sêmen resfriado, embora apresente sais e glicose em sua composição,
assim como o BTS®. É possível que, a presença ou ausência de algum composto necessário à manutenção
da célula espermática torne a água de coco inviável como diluidor.
Conclusões
O sêmen in natura de tilápia do Nilo pode ser estocado em refrigerador por menos de 24 horas,
para manter sua capacidade de fertilização (vitalidade). Após este tempo, a utilização de um diluidor se
faz necessária.
A curto prazo (até 72 horas), somente o diluidor consegue manter a célula espermática hidratada e
funcional, papel bem exercido pelo BTS®.
A longo prazo, além do diluidor, torna-se necessário a utilização de um crioprotetor, que evitará a
cristalização da célula espermática, e por consequência, impedirá seu rompimento.
Literatura citada
MARIA, A.N.; VIVEIROS, A.T.M.; FREITAS, R.T.F.; OLIVEIRA, A.V. Extenders and cryoprotectants
for cooling and freezing of piracanjuba (Brycon orbignyanus) semen, an endangered Brazilian teleost
fish. Aquaculture, 260:298-306, 2006a.
MARIA, A.N.; VIVEIROS, A.T.M.; ORFÃO, L.H.; OLIVEIRA, A.V.; MORAES, G.F. Effects of
cooling and freezing on sperm motility of the endangered fish piracanjuba Brycon orbignyanus
(Characiformes, Characidae). Animal Reproduction, 3:55-60, 2006b.
MATAVELI, M.; MORAES, G.V.; STREIT JUNIOR, D.P.; RIBEIRO, R.P.; GASPARINO, E.
Qualidade do sêmen em tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), alimentada com dietas contendo
diferentes níveis de vitamina C. Acta Scientiarum - Animal Sciences, 32(3): 345-349, 2010.
OLIVEIRA, A.V.; VIVEIROS, A.T.M.; MARIA, A.N.; FREITAS, R.T.F.; IZAÚ, Z.A. Sucesso do
resfriamento e congelamento de sêmen em pirapitinga (Brycon nattereri). Arquivo Brasileiro de
Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.1509-1515, 2007.
R DEVELOPMENT CORE TEAM. A Language and Environment for Statistical Computing. Version
2.12.0. R Foundation for Statistical Computing, 2010.
VIVEIROS, A.T.M.; AMARAL, T.B.; ORFÃO, L.H.; ISAÚ, Z.A.; CANEPPELE, D.; LEAL, M.C.
Sperm cryopreservation of tiete tetra Brycon insignis (Characiformes): effects of cryoprotectants,
extenders, thawing temperatures and activating agents on motility features. Aquaculture Research,
42:858-865, 2011.
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