SOP Einfuegen von Mutationen

Einfügen von Mutationen SOP
2012
13.04.12
SOP: Einfügen von Mutationen
(auch im Sambrook Band 2, 13.20)
sense/antisense Primer mit Mutation in der Mitte
Sambrook:
- mindestens re und li 12 bp mit match; Tm sollte 78°C oder höher seinverhindert falsches Primermatch )
- Primer sollten auf G oder C enden
es gibt zwei Möglichkeiten der Mutagenese:
1.) Mutagenese primer wie oben beschrieben, anschließend PCR vom kompletten
Plasmid
2.) PCR nur des zu mutierenden inserts mit 3 PCR-Schritten
1.PCR mit einem äußeren for Primer(mit Schnittstelle, um das Stück wieder in
Vektor anschließend zu ligieren+rev Mutageneseprimer(siehe oben)
 Aufreinigen über Gel (um Primer zu entfernen!);Eluieren in 50µl
(lt.Sebastian)
2.PCR mit for Mutageneseprimer (gleiche Sequenz wie der rev!)+äußerer rev
Primer mit Schnittstelle

Aufreinigen über Gel (um Primer zu entfernen!) !);Eluieren in 50µl
(lt.Sebastian)
3. PCR von ca. 1µl (bei normaler Ausbeute) beider PCR Fragmente mit den
äußeren Primern
 Auftragen übers Gel (ggf. noch PCR Produkt aus 1. oder 2. PCR als
Kontrolle mit auftragen, um zu sehen, dass die PCR des gesamten
Sequenzstückes geklappt hat); Aufreinigung; Verdau mit
flankierenden Restriktionsenzymen, Säulenaufreinigung und
anschließende Ligierung zurück mit dem Vektor
Falls die 3. PCR nicht klappen sollte, kann man auch ein PCR Programm einstellen,
in dem erst ein paar Zyklen mit weniger Annealing Temp. gefahren werden (das
begünstigt das annealen der komplementären Sequenzabschnitte der
Einzelfragmente), später Zyklen mit hohen Temp.
PCR im 50ul Ansatz:
50ng DNA
125ng Primer sense+ antisense
2ul dNTPs (aus 10mM Stock=400 uM pro Nt.)
1ul Pfu Polymerase (2,5U) (muß thermostab. Polymerase sein, AG Brummer: Pfu
ultra HF)
10ul 5x Puffer
Rest dH2O
!
Pfu Polymerase am Schluß dazu, da ohne dNTP’s die 3‘ 5‘
Exonukleaseaktivität der Proof-reading Polymerase die Primer degradiert
Einfügen von Mutationen SOP
!
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neg. Kontrollen nicht vergessen (Ohne Polym.)
95°C 30´´
für ca 4kb großen Vektor
95°C 30´´
55°C 1´
68°C 8´
(2‘ pro 1kb)
finaler Elongationsschritt 10‘ 68°C
4°C 2´
16 Zyklen (siehe Diplomarbeit, abh. von Art der Mut.)
 Austausch ein Nt. 12 Zyklen
 Austausch AS 16 Zyklen
 bei Insertionen, Deletionen verschiedener Größe 18 Zyklen
-
5ul (1/10) vom PCR Ansatz auf Kontrollgel
-
DpnI-Verdau mit dem Rest (ohne vorherige Aufreinigung, gleich ins PCR
fragment (ist nötig um template vector der PCR zu eliminieren, da nur methyl
Basen von DpnI erkannt werden):
-
1ul DpnI (inklusive Puffer NEB Puffer 4) 1h bei 37°C
-
Aufreinigung DNA (ev. optional, unter Schulung ist ein pdf:“site directed
mutagenesis“, auch hier wie unten im methodbook ist Aufreinigung nicht aufgeführt)
-
Transformation 1, 2, oder 5µl
Achtung Ligation ist optional, normalerweise ligieren die Bakterien selbst, falls aber
keine Klone wachsen, würde ich den Schritt einfügen!!!!
Anderes Beispiel aus Internet: http://www.methodbook.net/pcr/pcrmut.html
Transform 5 µl and 45 µl of the reaction into competent E.coli. (50µl Ansatz PCR)
There is no need to carry out a ligation before the transformation. The PCR product is a
'nicked' circle with the nicks in opposite strands displaced by 42 bp. This is identical to a
classical de-phosphorylated vector plus insert transformation (with a 42 bp insert).
-
Ausbeute nach Transformation ca. 10 Bak.kolonien oder mehr!
Achtung, die Mutagenese kann auch mit an einander stoßenden Primern
erfolgen, die Schnittstelle enthalten, hier ist Ligation wichtig!!!
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im Maniatis/Sambrook Bd.2/ S. 13.24 ist noch Phosphorylierung des PCR
Produktes angeraten bei schwierigen Mutagenesen:
siehe Protokoll verwendeter T4 Polynucleotid kinase (im 50 µl Ansatz),
anschließend Hitzeinaktivierung und Aufreinigung, danach Ligation
 Kontrollverdau mit geeigneten Enzymen, Sequenzieren
(Mit DpnI wird selektiv die Wildtyp-DNA zerschnitten, da diese DNA, aus Bakterien
stammend, im Gegensatz zum PCR-Produkt, methyliert ist, und DpnI nur methylierte
DNA schneidet.)
(lt. Britta kommt es häufig vor, dass Ausgangsvektor (PCR template) wieder in den
gewachsenen Klonen vorkommt, trotz DpnI Verdau
 DpnI könnte verantwortlich dafür sein, eventuell Zeit des Verdau’s erhöhen
oder Menge des Enzyms!)
Sebastian macht Mutagenisis nur mit kurzem PCR Stück und 2 PCR Reaktionen
(insgesamt 4 Primer), siehe PCR doppelt-mutieren einer Schnittstelle.pdf
In schwierigen Fällen bietet Stratagene Quick Change Mutagenese Kit.
TROUBLESHOOTING from Stratagene mutagenesis kit
When used according to the guidelines outlined in this instruction manual, this kit will provide a
reliable means to conduct site-directed mutagenesis at multiple sites using ds-DNA templates.
Variations in the base composition and length of primers, in length of the DNA template and in the
thermal cycler may contribute to differences in mutagenesis efficiency. Refer to the following
guidelines for troubleshooting the recovery of fewer than expected mutagenized plasmids.
Low transformation efficiency or low colony number
Ensure that sufficient DNA template is used in the mutagenesis reaction. Visualize the DNA
template on a gel to verify the quantity and quality.
Ensure that competent cells are stored at the bottom of a –80°C freezer immediately upon
arrival (see also Transformation Guidelines). Test the efficiency of the competent cells using
the pUC18 control plasmid.
Ensure that mineral oil is not transferred into the transformation reaction when pipetting
the Dpn I-treated DNA. Using the smallest pipet tips available, insert the pipet tip
completely below the mineral oil overlay and clear the pipet tip while it is submerged
beneath the overlay before collecting the sample.
Increase the amount of the Dpn I-treated DNA used in the transformation reaction to 4 μl.
Alternatively, ethanol precipitate the Dpn I digestion reaction, then resuspend and
transform with the entire sample.
Low mutagenesis efficiency or low colony number with the control reaction
Different thermal cyclers may vary in ramping efficiencies. Optimize the cycling parameters
for the control reaction, then repeat the protocol for the mutagenesis reactions.
Verify that the agar plates were prepared correctly. See Preparing the Agar Plates for Color
Screening, and follow the recommendations for IPTG and X-Gal concentrations carefully.
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For best visualization of the blue (β-gal+) phenotype, the control plates must be incubated
for at least 16 hours at 37°C.
Avoid multiple freeze-thaw cycles for the dNTP mix. Thaw the dNTP mix once, prepare
single-use aliquots, and store the aliquots at –20°C.
Low mutagenesis efficiency with the experimental mutagenesis reaction(s)
Add the Dpn I restriction enzyme below the mineral oil overlay and ensure proper mixing
of all components (especially the Dpn I) in the reaction.
Allow sufficient time for the Dpn I to completely digest the parental template; repeat the
digestion if too much DNA template was present.
Titrate the amounts of primer and template added to the thermal cycling reaction.
Verify that the template DNA was isolated from a dam+ E. coli strain. Plasmid DNA
isolated from dam— strains, such as JM110 or SCS100, lacks methylation and is not
digested by Dpn I.
If mutagenesis efficiency remains low (<30%) after addressing other possibilities, redesign
mutagenic primers to bind to the opposite strand of the plasmid.
Low colony number or low mutagenesis efficiency for long templates (>5 kb)
Titrate the amount of QuikSolution added from 0 to 1.5 μl per 25-μl mutant strand
synthesis reaction. For most long templates, up to 0.75 μl of QuikSolution is optimal, but
for certain long templates, including up to 1.5 μl of QuikSolution may increase recovery of
the desired mutants.
Mutagenesis of long templates may require optimization of the amounts of template and
primers added to the thermal cycling reaction.
Transformation efficiency will decrease as plasmid size increases. Transform XL10-Gold
Ultracompetent Cells with up to 4μl of the mutagenesis reaction, and plate a larger
proportion of the transformation reaction.
2012