Positivkontrollen

39. ADKA-Kongress
Hamburg,
Validierung der Sterilitätsprüfung von parenteralen
TM
Ernährungslösungen mittels BD BACTEC Blutkulturflaschen
15. - 18. Mai 2014
Hintergrund
Gemäß ADKA-Leitlinie „Aseptische Herstellung und Prüfung applikationsfertiger Parenteralia“ können bei der
aseptischen Herstellung Blutkulturflaschensysteme als mikrobiologische Schnelltests zur Prozesskontrolle
(Rezepturen) bzw. zur Sterilitätsprüfung (Defekturen) eingesetzt werden. In der Apotheke der Universitätsmedizin
Mainz wird hierzu ein Aliquot des hergestellten Arzneimittels in aerobe bzw. anaerobe BACTECTM plus/F
Blutkulturflaschen (BKF) (s. Abb. 1) überführt und entsprechend bebrütet.
Für die obige Nutzung sollte eine Kontamination nach nur 48 stündiger Bebrütung nachweisbar sein. Das BACTECTM
System ist seitens des Herstellers nicht für die Sterilitätsprüfung von Parenteralia validiert. Das vorliegende Projekt
hatte zum Ziel, die Eignung von BD BACTECTM plus/F BKFs zur Prozesskontrolle der aseptischen Herstellung
parenteraler Ernährungslösungen (TPE) zu prüfen.
J. Thiesen
I. Krämer
Apotheke
Universitätsmedizin
Mainz
Langenbeckstr. 1
55131 Mainz
aerob
anaerob
Abb. 1: BactecTM plus/F BKF‘s
Methode
Testkeime:
Inokulation der Prüflösungen und Beimpfung der BKFs:
Die Auswahl orientierte sich an Ph. Eur. 7.8, Monographie 2.6.1:
Die Keimsuspensionen wurden 10 Sekunden gevortext. Für jeden
• Staphylococcus aureus (ATCC 6538),
Keim wurden jeweils 3 TPE-Prüflösungen mit je 0,66 ml (= 100 KBE)
• Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027),
Keimsuspension inokuliert. Es resultierten TPE-Prüflösungen mit 0,4
• Candida albicans (ATCC 10231).
KBE/ml. Nach sorgfältiger Durchmischung (manuelles hin und her
Von jedem Keim wurde eine Suspension der Konzentration 150
Schwenken) wurden jeweils 8 ml Aliquot jeder inokulierten TPEKoloniebildende Einheiten (KBE)/ml hergestellt. Keimidentität und
Prüflösung in je eine aerobe BKF bzw. für die mit S. aureus
Keimkonzentration wurden vor Beginn des Versuchs verifiziert.
inokulierten TPEs zusätzlich in je eine anaerobe BKF überführt.
Prüflösungen:
Die Inokulationsmenge von 100 KBE entspricht der Keimzahl eines
Es wurden 9 TPE-Beutel folgender Zusammensetzung hergestellt:
unbehandschuhten Fingerprints und wurde in Anlehnung an Ph. Eur.
• Glucose-Lösung 70%
57,14 ml
7.8, Monographie 2.6.1 gewählt.
• Aminosäuren-Lösung 10%
100,00 ml
Bebrütung der BKFs:
• NaCl-Lösung 5,85%
12,00 ml
TM
Alle
BKFs
wurden
im
BACTEC
• Glycerophosphat-Na+-Lösung
6,00 ml
Brutschrank Modell 9240 (s. Abb. 2) bei
• Calciumgluconat-Lösung 10%
26,09 ml
35 ± 1°C bis zum Keimwachstum (d.h.
• KCl-Lösung 7,46 %
12,00 ml
bis zur Positivmeldung), längstens jedoch
• Magnesiumaspartat-Lsg. 0,5 molar
4,00 ml
14 Tage bebrütet. Durch Keimwachstum
• Unizink
3,11 ml
in den BKFs freigesetztes CO2 reagiert
• Aqua ad inject.
29,60 ml.
mit einem Farbstoff, die resultierende
Negativkontrollen:
Fluoreszenz
wird
vom
System
8 ml Aliquot der TPE-Prüflösungen wurden unmittelbar vor Inokulation automatisch detektiert. Eine Probe aller
in je eine aerobe bzw. anaerobe BACTECTM plus/F BKF überführt.
positiven
BKFs
wurde
zwecks
Keimdifferenzierung
auf
Agarplatten
Positivkontrollen:
8 ml Keimsuspension wurden in je eine aerobe bzw. für S. aureus ausgestrichen, um eine eventuelle
(fakultativ anaerober Keim) zusätzlich in eine anaerobe BKF überführt. Fremdkontamination auszuschließen.
Abb. 2: BactecTM Brutschrank.
Ergebnis
Diskussion
• Negativkontrollen blieben alle steril.
• Positivkontrollen zeigten nach maximal 20 h Keimwachstum,
Ausnahme: S. aureus lies sich in aerober BKF nicht nachweisen.
• Für die TPE-Prüfösungen meldete das BACTECTM System binnen
22 h Bakterienwachstum (detaillierte Ergebnisse s. Tab. 1; Bsp. für
Ausdruck aus der BACTECTM Software s. Abb. 3).
• C. albicans lies sich in den TPE-Prüflösungen nicht nachweisen.
• Positive BKFs waren nicht fremdkontaminiert.
S. aureus
BKF-Typ
P. aeruginosa
C. albicans
aerob
anaerob
aerob
aerob
Negativkontrolle
kein
Wachstum
kein
Wachstum
kein
Wachstum
kein
Wachstum
Positivkontrolle
Zeit bis zum Keimnachweis (h)
kein
Wachstum
11,84
11,54
20,21
1
14,01
21,71
-
-
2
14,19
20,38
-
-
3
14,71
19,34
-
-
Prüflösungen 1-9
Zeit bis zum Keimnachweis (h)
Zeit bis zum Keimnachweis in den
Prüflösungen, Mittelwert (h)
4
-
17,59
-
5
-
15,56
-
6
-
16,08
-
7
-
-
kein
Wachstum
8
-
-
kein
Wachstum
9
-
-
kein
Wachstum
16,41
-
14,30
20,48
Tab. 1: Übersichtstabelle Dauer bis zum Keimnachweis in Stunden (h).
• Bakterienwachstum trotz geringer Keimkonzentration (3,2 KBE/8 ml
Aliquot = 0,4 KBE/ml) binnen der geforderten 48 h nachgewiesen.
• Fehlender C. albicans Nachweis vermutlich bedingt durch niedrige
Keimkonzentration und die Neigung von C. albicans in Lösung zu
verklumpen. Vortexen der TPE-Prüflösungen vor Aliquotierung hatte
C. albicans homogen verteilt und Nachweis eventuell ermöglicht.
• Ergebnis durch geringen Probenumfang statistisch nicht valide,
einheitliche Zeiten bis zum Keimnachweis belegen jedoch die hohe
Aussagekraft der Ergebnisse.
Abb.3: Fluoreszenzkurve unter Angabe der Nachweisdauer.
Kontakt:
Schlussfolgerung
judith.thiesen@
Das BACTECTM System ist zur prozessbegleitenden Sterilitätsprüfung bei der TPE-Herstellung geeignet. Innerhalb von 24 h bis maximal 48 h
wird Bakterienwachstum nachgewiesen.
unimedizin-mainz.de
Wir danken den Pharmaziepraktikantinnen Sun Hee Kim und Esther Herres sowie Claudia Goldschmitt und Dr. Ekkehard Siegel vom Institut für Mikrobiologie der Universitätsmedizin Mainz für die Unterstützung bei dem Projekt.