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Transcrição

TALITA TREVIZANI ROCCHETTI
Detecção Bacteriana e de Genes de Resistência a
Antimicrobianos pela Técnica de PCR em Tempo Real em
Infecções de Corrente Sanguínea de Pacientes Submetidos
a Transplante de Órgãos Sólidos
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
Infecções de Corrente Sanguínea de Pacientes Submetidos
a Transplante de Órgãos Sólidos
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos
Pignatari
Este
trabalho
foi
realizado
com
auxílio
financeiro fornecido pela Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Processo nº 2008/04761-8
São Paulo
2011
ROCCHETTI, Talita Trevizani
Detecção bacteriana e de genes de resistência a antimicrobianos pela técnica de
PCR em Tempo Real em infecções de corrente sanguínea de pacientes
submetidos a transplante de órgãos sólidos – Talita Trevizani Rocchetti - São
Paulo, 2011. xx, 156 p.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Real-time Polymerase Chain Reaction for Detection of
Bacterial and Antimicrobial Resistance Genes in Blood Cultures of Solid Organ
Transplanted Patients.
1. Diagnóstico molecular; 2. Bacteremia; 3.PCR em Tempo Real; 4. Transplante
de órgãos; 5. Genes de resistência.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
CHEFE DO DEPARTAMENTO:
Prof. Dr. Angelo Amato Vicenzo de Paola
COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO:
Prof. Dr. Ricardo Sobieh Diaz
São Paulo
2011
iii
Infecções de Corrente Sanguínea de Pacientes
Submetidos a Transplante de Órgãos Sólidos
BANCA EXAMINADORA:
Titular: Prof. Dr Luis Fernando Aranha Camargo
Titular: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Titular: Prof. Dr Eliezer Silva
Suplente: Profa. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado
iv
Não se deve ir atrás de objetivos fáceis.
É preciso buscar o que só pode ser alcançado
por meio dos maiores esforços.”
Albert Einstein
v
Dedico este trabalho
ao meu amado pai Vanderlei (in memoriun),
a minha amada mãe, Maria Regina e
aos meus amados irmãos Thiago e Taisa...
Vocês são além da minha razão de vida,
minha inspiração profissional!!
vi
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por todo
crescimento profissional que tive,
pelas oportunidades de aprendizado,
os
ensinamentos e pela grande orientação. Tenho no senhor uma imensa adimiração e
inspiração profissional.
À Liana Carbalo Menezes, por todos os ensinamentos, paciência e carinho
que recebi. Se eu aprendi um pouco do que você sabe de Biologia Molecular, saio
vitoriosa dessa primeira etapa no LEMC.
À Profª Dra. Ana Cristina Gales, pelos constantes ensinamentos, pelo
exemplo de caráter e profissionalismo.
Ao André Doi, por toda orientação, atenção, ajuda e amizade ao longo da
elaboração deste trabalho.
À equipe do Laboratório Central, Dra. Antonia, Eliete, Thomas, Flavia,
Fernando, Clarice, por todo aprendizado, paciência e dedicação na coleta e
separação das amostras deste projeto.
Ao grupo de Transplantes do Hospital São Paulo e Hospital do Rim, em
especial ao Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo e ao Dr. Moacyr Silva Jr, por
todo apoio e colaboração quanto ao rumo e perfil que este trabalho deveria tomar.
A equipe do SCIH do Hospital do Rim, principalmente à Dra Lucy Corrêa, por
toda ajuda e por me abrir as portas para acessar ao programa TASY onde pude
selecionar meu material de estudo.
Aos meninos do SAME do Hospital do Rim, por toda dedicação e ajuda na
coleta dos prontuários.
À Jussimara Monteiro, que proporcionou meu primeiro contato e meus
primeiros aprendizados dentro da Biologia Molecular. Você faz parte da inspiração que
tenho profissional.
Ao Paulo Bispo, um grande amigo que fiz e que me ensinou com todo seu
conhecimento, agradeço por toda confiança depositada em mim.
À Eloiza Helena Campana, minha amiga, vizinha, companheira de laboratório
e de baladas. Você me apoiou em cada momento que tive ao longo dessa minha
vii
jornada no mestrado. Conhecê-la foi uma das melhores coisas que me aconteceu
desde meu regresso a São Paulo.
À Karen Bauab, amiga querida, que tive prazer em conhecer. Deu-me todo
apoio que precisei, nos meus experimentos, na viajem ao Rio de Janeiro, com
conversas, você é uma grande amiga e companheira de laboratório.
Luiz Roberto Chirotto Filho, meu primeiro amigo do laboratório e que faço
questão de preservar. Fico feliz de podermos nos ajudar em nossos projetos e de
podermos manter essa nossa amizade. Você terá sempre meu apoio.
À Renata Picão, por todo ensinamento e ajuda valiosa que me proporcionou.
Tenho grande admiração por você e tive o prazer de ter convivio fora do laboratório.
Ao Danilo Elias, por toda amizade, momentos de conversa e descontração que tive
ao seu lado, fico triste de você não estar aqui para prestigiar esse momento comigo.
Às amigas Cynthea, Paula Peraro, Adryella, Thaís, Jéssica por toda
conversa e apoio que tive de vocês. Aos meus grandes amigos e colegas do
LEMC/ALERTA, Adriana Nicoletti, Lorena, Milene, Ana Carolina, Fernanda Inoue,
Raquel Girardello, Thiago, Rodrigo Cayô, Anderson, Loren, Kelly, Martha, Zonta,
Fernanda Marques, Vinicius, Thomas, Cecília Cergole, Cecília Godoy, Paula
Ignez, Paula Koga, Alinne, Katia, Mirian e Amilton e aos que recentemente
entraram para o nosso grupo, pelo convívio agradável e carinho demonstrado durante
a realização deste trabalho.
À Rosana Capecce, pela dedicação e valioso apoio em todos os momentos.
Ao Charles, por toda colaboração eu tive ao longo do meu mestrado.
Aos professores da DIPA por todo aprendizado.
Á minha prima Gabriela, e aos meus amigos Ademar e Monica, por
acreditarem em mim quando eu havia desacreditado.
A Rosalina, por todo companheirismo, carinho e apoio, durante toda essa
etapa da minha vida.
À minha família, Vanderlei, Maria Regina, Thiago e Taisa, obrigada por
sempre estarem ao meu lado.
A todos que participaram diretamente ou indiretamente do meu trabalho, o meu
muito obrigada!
viii
SUMÁRIO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................ 13
ÍNDICE DE TABELAS ..................................................................................... 16
ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................... 19
RESUMO.......................................................................................................... 21
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 22
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 24
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 25
3.1. Transplante de Órgão Sólido..................................................................... 25
3.1.1. Transplante no Brasil ...................................................................... 25
3.1.2. Epidemiologia em Transplantados .................................................. 26
3.2. Infecões de Corrente Sanguínea............................................................... 28
3.2.1. Infecção de Corrente Sanguínea em Transplantados de Órgãos
Sólidos ...................................................................................................... 29
3.3. Genes de Resistência a Antimicrobianos .................................................. 32
3.3.1. Gene mecA ..................................................................................... 32
3.3.2. Genes vanA e vanB ........................................................................ 33
3.3.3. -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs) ............................... 36
3.3.5. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) .............................. 41
3.3.4. Metalo--Lactamases ...................................................................... 43
3.4. Sistemas Automatizados no Processamento de Hemoculturas ................ 47
3.5. Microbiologia Molecular Aplicada no Diagnóstico Clínico ......................... 50
3.5.1. Reação de Polimerização em Cadeia - PCR, PCR Multiplex e PCR
em Tempo Real ......................................................................................... 50
3.5.2. Validação de Novos Métodos de Diagnósticos ............................... 52
ix
4 - MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 54
4.1. Casuística.................................................................................................. 54
4.1.1. Variáveis Clínicas ............................................................................ 54
4.2. Coleta das Hemoculturas de Acesso Periférico ........................................ 57
4.2.1. Coleta das Hemoculturas de Acesso Central – Cateteres .............. 57
4.3. Processamentos das Amostras pelo Método Fenotípico .......................... 57
4.3.1. Determinação da positividade e negatividade das hemoculturas pelo
aparelho Bactec® ...................................................................................... 57
4.3.2. Resultado Parcial da Hemocultura Positiva pela Coloração de Gram
.................................................................................................................. 58
4.3.3. Resultado Final da Hemocultura pelo Sistema Automatizado
Phoenix® ................................................................................................... 58
4.4. Pdronização da PCR em Tempo Real ...................................................... 59
4.4.1. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real ...................... 62
4.4.2. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff” ...................... 65
4.4.3. Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade) ........... 66
4.5. Aplicação nas Amostras de Hemocultura ................................................. 67
4.5.1. Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura ................... 68
4.5.2. Aplicação da PCR em Tempo Real para o Gene HFE de Controle
Interno de Extração ................................................................................... 69
4.5.3. Detecção do DNA Bacteriano PCR em Tempo Real pelo Sistema
TaqMan ..................................................................................................... 69
4.5.4. Detecção dos Genes que Conferem Resistências aos
Antimicrobianos por PCR em Tempo Real pelo Sistema SYBR Green .... 70
4.6. Testes Direto do Isolado Bacteriano Referente à Hemocultura................. 71
4.6.1. Teste de Triagem com Disco-Difusão para Ertapenem................... 72
4.6.2. Teste de Hidrólise para Detecção de Metalo-β-Lactamases ........... 73
4.6.3. Detecção Fenotípica de ESβL......................................................... 74
4.6.4. Determinação da Suscetibilidade a Vancomicina ........................... 75
4.6.5. Determinação da Suscetibilidade a Oxacilina ................................. 76
4.6.6. PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano ........................ 76
4.7. Análise Estatística dos Dados ................................................................... 77
x
5. RESULTADOS ............................................................................................. 79
5.1. Amostras de Hemoculturas Incluídas no Estudo ....................................... 79
5.2. Validação Analítica da PCR em Tempo Real ............................................ 79
5.2.1. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real ...................... 80
5.2.2. Padronização da PCR em Tempo Real Sistema TaqMan para o
Gene Bacteriano 16S rDNA ...................................................................... 82
5.2.3. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff” ...................... 84
5.2.4. Determinação do Limite de Detecção – LoD ................................... 84
5.2.5. Determinação da Curva ROC para as Reações dos Genes de
Resistência a Antimicrobianos e para a Reação Multiplex Gram-positivo e
Gram-negativo por PCR em Tempo Real ................................................. 86
Na Figura 4 encontram-se as curvas Roc dos genes estudados. .................... 86
5.3. Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de Hemocultura .......... 89
5.3.1. Detecção do Gene HFE de Controle Interno da Extração............... 89
5.3.2. Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA ....................................... 89
5.3.3. Detecção PCR dos Genes que Conferem Resistência aos
Antimicrobianos em Bactérias Gram Negativas ........................................ 93
Antimicrobianos em Bactérias Gram Positivas .......................................... 96
5.4. Testes Direto do Isolado Bacteriano ......................................................... 99
5.4.1. Confirmação de Susceptibilidade a Oxacilina e Gene de Resistência
mecA pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano
Referente a Amostra de Hemocultura ....................................................... 99
5.4.2. Confirmação da Produção de Carbapenemase e Gene de
Resistência blaKPC pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado
Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ................................... 100
5.4.3. Confirmação da Produção de Metalo-β-Lactamases e Genes de
Resistência blaIMP, blaVIM e blaSPM pelo Método da PCR em Tempo Real
Direto do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ....... 101
5.4.4. Confirmação da Produção de ESβL e Genes de Resistência blaSHV,
blaTEM e blaCTX-M pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do Isolado
Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura ................................... 102
xi
5.5. Variáveis Clínicas, Análise e Comparação do Tempo de Liberação dos
Resultados pelo Método Fenotipico e Tratamentos antes e Após os Resultados
em Relação ao Resultado Obtido pela PCR em Tempo Real ........................ 105
5.5.1. Hemoculturas Positivas para Isolados Gram Positivos ................. 106
5.5.2. Hemoculturas Positivas para Isolados Gram Negativos ................ 109
6. DISCUSSÃO .............................................................................................. 113
7. CONCLUSÕES .......................................................................................... 127
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 128
9. ABSTRACT................................................................................................ 149
10. ANEXOS .................................................................................................. 151
ANEXO 1. Dados referentes aos 117 pacientes e 185 hemoculturas incluídas
no estudo........................................................................................................ 151
ANEXO 2. Drogas Testadas para os respectivos Painéis do Sistema
automatizado Phoenix. ................................................................................... 154
ANEXO 3. Apresentação no 50 th ICAAC 2010. ............................................ 156
xii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTO – Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos
AIM – Australian Imipenemase
ATCC - American Type Cuture Collection
CCIH – Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CDC – Center for Disease Control
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical Laboratory Standards Institute
Ct – Ciclo threshold
CTX-M – Cefotaximase
CVC – Cateter Venoso Central
DD – Disco Difusão
DM – Diabete Mellitus
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DIM – Dutch Imipenemase
EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético
ESL - Extended Spectrum -Lactamase
EUA – Estados Unidos da América
GIM – German Imipenemase
HAS – Hipertensão Arterial
HFE – Hemocromatose
ICS – Infecção de Corrente Sanguínea
IMP – Imipenemase
IS - Insertion Sequence
IUPAC – The International Union of Pure and Applied Chemistry
xiii
KHM – Kyorin Health Science metallo-β-lactamase
KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
LB - Luria Bertani
LED – Diodos emissores de luz
LEMC – Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
ML – Metallo--Lactamase
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina
NDM – New Delhi metallo-β-lactamase
OMP – Outer Membrane Protein
PBP – Penicillin Binding Protein
PBP2a – Proteína Ligadora de Penicilina Adicional
PCR – Polymerase Chain ReaCtion
PFGE – Pulsed Field Gel EleCtrophoresis
SCOPE – Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance
SCoN – Staphylococcus coagulase negativo
SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel EleCtrophoresis
SIM – Seul Imipenemase
SNT – Sistema Nacional de Transplantes
SPM – São Paulo metallo-β-lactamase
SUS – Sistema Único de Saúde
TBE – Tris-Borato-EDTA
TSB – Tryptone Soy Broth
TM – Temperatura de Melting
TMB – Tripoli metallo-β-lactamase
UFC – Unidade formadora de colônia
xiv
UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo
UTI – Unidade de Terapia Intensiva
UV – Ultravioleta
VIM – Verona Imipenemase
VRE – Enterococcus Resistente a Vancomicina
VRSA – Staphylococcus aureus Resistente a Vancomicina
xv
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Lista de iniciadores de amplificação da região codificadora dos
genes estudados.........................................................................................
60
Tabela 2. Relação dos microrganismos testados para validação das
reações de PCR em Tempo Real..........................................................
64
Tabela 3. Resultados dos controles dos genes de resistência e os Tm
dos produtos amplificados...........................................................................
80
Tabela 4. Desvio Padrão e media do Tm, Eficiência da reação de PCR,
Ct e Tm da ultima diluição............................................................................
82
Tabela 5. Resultados da padronização dos protocolos de PCR em
Tempo
Real
utilizando
sondas
TaqMan-MGB
multiplex
Gram
especificas..................................................................................................
83
Tabela 6. Resultados de cutoff e LoD para cada gene especifico dos
microrganismos avaliados...........................................................................
85
Tabela 7. Sensibilidade, especificidade e Ct delimitado pela curva ROC
para os genes que conferem resistência a antimicrobianos e para o gene
16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo.........................................
88
Tabela 8. Sensibilidade, especificidade pela curva ROC de acordo com o
LoD para os genes que conferem resistência a antimicrobianos e para o
gene 16S rDNA para Gram positivo e Gram negativo.................................
xvi
88
Talela 9. Resultado da PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan para
o gene 16S rDNA nas 126 hemoculturas positivas pelo Bactec®................ 91
Talela 10. Resultado da PCR em tempo real sistema SYBR Green para
os genes de resistência em Gram negativos e resultado do sistema
Phoenix®.....................................................................................................
95
Talela 11. Resultado da PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para
os genes de resistência de Gram positivos e resultado do Phoenix®.......... 97
Tabela 12. Resultado do Etest para Oxacilina e PCR em Tempo Real
sistema SYBR Green para o gene de resistência mecA direto da colônia
e comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura.......................
99
Tabela 13. Resultado do método de disco difusão e PCR em Tempo
Real sistema SYBR Green para o gene de resistência blaKPC direto da
colônia e comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura........... 101
Tabela 14. Resultado do teste de hidrólise e PCR em Tempo Real
sistema SYBR Green para os genes de resistência blaSPM, blaVIM e blaIMP
direto da colônia e comparação com a PCR direto do frasco de
hemocultura................................................................................................
102
Tabela 15. Resultado do disco aproximação para ESβL e PCR em
Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os genes de resistência
blaSHV, blaCTX-M e blaTEM direto da colônia e comparação com a PCR
direto do frasco de hemocultura..................................................................
xvii
104
Tabela 16. Dados referentes aos resultados dos testes fenotípicos e da
PCR em Tempo Real liberados direto das hemoculturas e avaliação do
tratamento recebido pelos pacientes...........................................................
107
Tabela 17. Dados referentes aos resultados dos testes fenotípicos e da
PCR em Tempo Real liberados direto das hemoculturas e avaliação do
tratamento recebido pelos pacientes...........................................................
xviii
110
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Etapa da Transpeptidação: Formação das ligações cruzadas
nas cadeias peptídicas................................................................................
34
Figura 2. A - Amplificação do DNA de Gram positivo (curva em amarelo)
e Gram negativo (curva em vermelho); B- Sonda Gram Positivo (GP) e
Sonda Gram Negativo (GN)......................................................................... 62
Figura 3. Fluxograma do processamento das amostras............................. 67
Figura 4. Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos e
sondas Gram Positivo e Sonda Gram Negativo: A – Gram Positivo; BGram Negativo; C - blaTEM; D - vanA; E - vanB; F - blaCTX; G - blaSHV; H mecA; I - blaKPC............................................................................................
87
Figura 5. Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo
sistema automatizado Phoenix®..................................................................
92
Figura 6. Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo
sistema automatizado Phoenix®..................................................................
Figura 7. Total de amostras positivas pela metodologia da PCR
93
em
Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os respectivos genes de
resistência estudados..................................................................................
xix
98
Figura
8.
Número
e
porcentagem
de
pacientes
referentes
a
hemoculturas em que foram isoladas bactérias Gram positivas,
recebendo
tratamento
inadequado
no
momento
da
coleta
da
hemocultura, depois do resultado do Gram da hemocultura e depois do
resultado final da Hemocultura....................................................................
Figura
9.
Número
e
porcentagem
de
pacientes
referentes
108
a
hemoculturas em que foram isoladas bactérias Gram negativas não
fermentador, recebendo tratamento inadequado no momento da coleta
da hemocultura, depois do resultado do Gram da hemocultura e depois
do resultado final da Hemocultura...............................................................
111
Figura 10. Número e porcentagem de pacientes referentes a
hemoculturas em que foram isoladas bactérias Gram negativas
enterobacteriaceas, recebendo tratamento inadequado no momento da
coleta da hemocultura, depois do resultado do Gram da hemocultura e
depois do resultado final da Hemocultura.................................................... 112
xx
RESUMO
RESUMO
Pacientes transplantados de órgãos sólidos apresentam alto risco para infecção da
corrente sanguínea. A instituição da terapia antimicrobiana apropriada guiada por um
diagnóstico rápido e preciso das infecções da corrente sangüínea está relacionada a
um resultado satisfatório. O objetivo deste estudo foi a detecção de bactérias Grampositivas e Gram-negativas em hemocultura automatizada (Bactec®, Becton
Dickinson), com a utilização do multiplex para reação da polimerase em cadeia (PCR)
em Tempo Real e detecção de genes de resistência. Métodos: Um total de 185
hemoculturas, 126 positivas e 59 negativas, foram obtidos de 117 pacientes
submetidos a transplante de órgãos sólidos, dois centros de transplante na cidade de
São Paulo, Brasil, Hospital São Paulo e Hospital do Rim e Hipertensão. DNA das
culturas de sangue foi extraído pelo método fenol clorofórmio (Brazol®, LGC, Brasil). A
detecção do DNA bacteriano foi realizada utilizando iniciadores universais do gene
16S rRNA. A diferenciação entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas foi
feito por hibridização com sondas específicas por multiplex TaqMan em Tempo
Real. Os genes de resistência: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC, blaSPM, blaVIM, blaIMP,
vanA, vanB e mecA foram detectadas utilizando iniciadores específicos, em Tempo
Real sitema SYBR Green. A adequação do tratamento antimicrobiano foi avaliada pela
revisão do prontuário dos pacientes. Resultados: Cinqüenta e nove amostras foram
positivas para bactérias Gram-positivas e sessenta e sete amostras foram positivas
para bactérias Gram-negativas. Todas as amostras (100%) foram concordantes entre
hemocultura e PCR. Trinta e duas amostras foram positivas para o gene mecA, cinco
para o gene blaCTX-M, uma para o gene blaKPC, uma para o gene blaSHV e uma para
blaTEM. Oitenta e oito foram negativas para todos os genes. A detecção de genes de
resistência a antimicrobianos favoreceria a adequação da antibioticoterapia,
particularmente no descalonamento no tratamento de bacteremias causadas por
bactérias Gram positivas e na adequação precoce no tratamento de bacteremias por
bacilos Gram negativas multiresistentes em pacienetes tranplantados de órgãos
sólidos. Conclusão: A PCR multiplex “in house” para bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas e detecção de genes de resistência aos antimicrobianos por PCR em
Tempo Real poderia ser útil para o diagnóstico rápido da infecção da corrente
sangüínea
em
pacientes
submetidos
a
transplante
de
órgão
sólidos.
21
INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
A introdução de técnicas moleculares na medicina diagnóstica e sua
aplicação no diagnóstico de doenças infecciosas estabelecem uma nova era na
detecção e caracterização de microrganismos na rotina de processamento de
amostras clínicas.
A presença de bacteremia agrava o quadro clínico do paciente e quando
se trata de pacientes transplantados há a necessidade do diagnóstico precoce
e rápido de Infecções de Corrente Sanguínea (ICS), uma vez que a taxa de
mortalidade relacionada a esta infecção nesta população é alta, principalmente
quando ocorre o agravamento do quadro clínico como o choque séptico
(Ferraresso & Berardineli, 2005).
Normalmente, as hemoculturas levam em média 24 a 36 h após a coleta
para positivar. A terapia antimicrobiana pode ser otimizada com base na
identificação presuntiva do agente bacteriano. Porém a completa identificação
do microrganismo e perfil de susceptibilidade normalmente não está disponível
antes de 24 a 72h. O uso da PCR tem sido sugerido em diagnóstico molecular,
pois além de ser uma técnica sensível também diminui o tempo de liberação
dos resultados quando comparado com o método fenotípico (Valones et al.,
2009).
A PCR convencional em pesquisa já é usada habitualmente e seu uso
no diagnóstico clínico cresce a cada dia. Porém no diagnóstico clínico a
sensibilidade e a rapidez na liberação dos resultados podem ser otimizados
pela técnica da PCR em Tempo Real, já que a amplificação e leitura são feitos
simultanemente.
22
INTRODUÇÃO
Em um recente trabalho, realizado por Lehmann e colaboradores (2010),
foi elaborado um método de detecção bacteriana, usando o gene 16s rDNA
diretamente da hemocultura. Os resultados apontaram que a técnica da PCR
foi duas vezes mais sensível que o método convencional, sugerindo assim a
importância e aplicabilidade da PCR nesses casos. Entretando, apesar da
disponibilidade de Kits comerciais para detecção de microrganismos e de
genes de resistência direto de amostras clínicas, até o momento, nenhum
trabalho relata a aplicação da PCR em Tempo Real, e a padronização “in
house” para o diagnóstico rápido de ICS em transplantados de órgãos sólidos.
23
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Principal
1. Padronizar a técnica de PCR em Tempo Real para a pesquisa de
bactérias e dos principais genes que codificam resistência aos
antimicrobianos;
2.2. Objetivos Secundários
1. Aplicar a técnica de PCR em Tempo Real padronizada para a pesquisa
de bactérias e dos principais genes que codificam resistência aos
antimicrobianos em amostras de frascos de hemocultura coletada de
pacientes submetidos a transplante de órgãos sólidos;
2. Correlacionar os resultados obtidos com a detecção molecular de
bactérias e de genes de resistência aos antimicrobianos, realizada
diretamente da amostras clínica com os resultados de identificação
bacteriana e teste de sensibilidade automatizado obtidos com o isolado
da respectiva hemocultura;
3. Avaliar o possível impacto dos testes moleculares no tratamento de
Infecções de Corrente Sanguínea nos pacientes submetidos a
transplantes de órgão sólidos;
24
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Transplante de Órgão Sólido
3.1.1. Transplante no Brasil
O Brasil tem o maior programa público de transplantes de órgãos e
tecidos do mundo, sendo o Sistema Único de Saúde (SUS) responsável por
92% dos procedimentos. Este programa é composto por uma rede de 1.376
equipes médicas e 548 unidades credenciadas, porém, 63.866 pacientes
aguardam por um órgão no Brasil, de acordo com o Sistema Nacional de
Transplantes (SNT) em 2009 (Ministério da Saúde, 2009).
Em 2009, foram notificados 42.783 transplantes no Brasil, sendo 5.998
de órgãos sólidos. Destes, 4.259 foram transplantes de rim, ocupando o
primeiro lugar no número de transplantes nacionais, seguido por fígado (1.322),
coração (200), pâncreas (158) e pulmão (59) (Associação Brasileira de
Transplantes de Órgãos - ABTO, 2009).
Entre os centros de transplantes no Brasil, encontram-se o Hospital São
Paulo/Unifesp (HSP) e o Hospital do Rim e Hipertensão (HRH). No HSP são
realizados transplantes de rim, medula óssea, coração, osso, pulmão, córnea e
fígado. Sola e colaboradores (2007), em estudo retrospectivo, registraram 81
transplantes de órgãos sólidos no período de janeiro de 2004 a março de 2005.
Destes, 35 foram de rim-pâncreas, 17 apenas de rim, 17 de fígado, 20 de
coração.
O programa de transplante de rim do HSP teve início em 1976 como
uma modalidade de tratamento renal, pela divisão de Nefrologia da
25
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Na época, menos de 10
transplantes eram realizados. Este número aumentou para 178 em 1998,
mesmo ano em que foi inaugurado o HRH filiado a UNIFESP, e em 2004 foram
realizados 654 transplantes (Medina-Pestana, 2006), ocupando o primeiro lugar
no ranking mundial em transplantes de rim. Hoje o setor de transplantes do
Hospital do Rim e Hipertensão é referência em todo país.
O último levantamento de 2009 aponta que foram realizados 352
transplantes de rim, equivalente a 8,3% do total realizado em todo Brasil
(Associação Brasileira de Transplantes de Órgãos, 2009).
3.1.2. Epidemiologia em Transplantados
O transplante de órgãos sólidos representa hoje a melhor terapia
substitutiva para pacientes com doença crônica terminal. Apesar de o rim ser o
órgão mais transplantado no país, os transplantes de outros órgãos sólidos tem
crescido
gradativamente
nos
últimos
anos
(Associação
Brasileira
de
Transplantes de Órgãos, 2009).
O transplante renal é uma alternativa terapêutica para pacientes com
doenças renais em estágio terminal, oferecendo assim melhor qualidade de
vida para aproximadamente 77.589 indivíduos registrados em programas de
diálise no Brasil (Sesso, 2010). No país, 6.500 pessoas apresentam doença
hepática avançada, risco de morte ou qualidade de vida comprometida e
aguardam na fila de transplante de fígado. No estado de São Paulo foram
realizados 200 transplantes de coração no ano de 2009. Entretanto, 305
pessoas se encontravam na lista de espera, sendo que aproximadamente 50%
não foram atendidos reservando-se o procedimento àqueles indivíduos com
26
alto risco de falecer de doença cardíaca em menos de um ou dois anos
(Ministério da Saúde, 2009).
O número de transplantes realizados por doadores falecidos se
sobrepõe ao numero realizado por doadores vivos. Este dado pode parecer
óbvio, porém há 10 anos, o número de doadores vivos para transplante de rim
era maior. Esse aumento se deve a inúmeras campanhas em todo país para
com intuito de incentivar a população à doadoção de órgãos (Associação
Brasileira de Transplantes de Órgãos, 2009). O transplante de rim, pâncreas,
medula óssea, fígado e pulmão intervivos pode ser realizado somente se não
trouxer prejuízo ou representar riscos à saúde do doador (Sistema Nacional de
Transplantes, 2011).
Os transplantes de órgãos sólidos apresentam alto risco de rejeição. As
rejeições agudas e crônicas são as principais causas de perda de órgãos
transplantados. A resposta imune pode ser tanto mediada por células T, sendo
a mais importante em rejeição aguda de órgãos transplantados, ou por
anticorpos produzidos por linfócitos B, que tem grande contribuição no
processo de rejeição (La Rosa et al., 2007).
Os avanços das técnicas cirúrgicas e dos tratamentos com terapia
imunossupressora levaram a diminuição nos índices de rejeição aguda, com a
sobrevivência dos enxertos após um ano em cerca de 90% dos transplantes.
(Danovitch, 2001; Mies, 1998). Os imunossupressores, apesar de reduzir
substancialmente as taxas de rejeição, apresentam efeitos colaterais
indesejáveis como imunodeficiência e toxicidade em outros órgãos (Halloran,
2004).
27
Apesar da excelente evolução na sobrevida dos pacientes e do enxerto,
o transplante de órgão sólido não é isento de complicações. A infecção é a
principal complicação no pós-transplante (Fishman & Rubin, 2005), sendo as
infecções de corrente sanguinea, uma das mais prevalentes (Nusair et
al.,2008). No primeiro mês pós-transplante, as infecções bacterianas são
responsáveis por 90% das complicações infecciosas, sendo que o risco destas
infecções ocorrerem varia com o tempo, principalmente em decorrência da
imunossupressão (Fishman, 2007).
3.2. Infecões de Corrente Sanguínea
Infecção de Corrente Sanguínea (ICS) é caracterizada pela presença de
bactéiras ou fungos em uma ou mais amostras de hemoculturas associada a
um quadro clínico compatível com sepse (Bone et al., 1992).
A microbiota humana normalmente não causa infecção e pode proteger
o organismo humano contra outros patógenos por competir pelos nutrientes e
locais de ligação nas superfícies celulares (Donnelly & De Paum, 2005). O
responsável pelo controle desta microbiota é o sistema imunológico. Quando a
imunidade celular e humoral encontra-se intacta, oferece uma proteção contra
a maioria dos microrganismos agressores devido a boas condições clínicas,
bom estado nutricional e função normal dos órgãos (Donnelly & De Paum,
2005). Entretanto um déficit específico de imunidade aumenta a suscetibilidade
a infecções, que seriam erradicadas em um organismo íntegro normalmente
pelo mecanismo de defesa (Halloran, 2004).
Como consequência da resposta imune celular deficitária, os pacientes
estão mais sujeitos a infecção por patógenos e apresentam também maior
28
gravidade no quadro clínico. Alguns dos fatores que agravam as condições de
imunossupressão são a dose e duração da terapia imunossupressora, doenças
auto-imunes, deficiências imunológicas funcionais, neutropenia e linfopenia,
condições metabólicas como diabetes, desnutrição e infecção por vírus
imunomoduladores como citomegalovírus (Fishman & Rubin, 1998; Halloran,
2004).
3.2.1. Infecção de Corrente Sanguínea em Transplantados de
Órgãos Sólidos
A incidência de infecção em transplantados é determinada pela
interação
entre
a
exposição
a
agentes
infecciosos
e
a
terapia
imunossupressora. Esta varia devido a inúmeros fatores, tais como o tipo de
órgão transplantado, a quantidade de medicamento imunossupressor usado, a
necessidade do uso de terapia adicional contra rejeição e complicações póscirurgicas (Patel & Paya, 1997).
ICS é considerada uma das causas mais importantes de mortalidade
em pacientes que realizaram transplante de órgãos sólidos (Singh et al, 2000;
Rodriguez et al., 2006; Husain et al., 2006). Estima-se que a incidência de
bacteremia seja de 28 a 30% em transplante hepático, 5 a 11% em transplante
renal e 10% em transplantados cardíacos (McClean et al., 1994; Moreno, et al,,
1994).
Moreno e colaboradores (2007), em um estudo realizado na Espanha,
no período de julho de 2003 a abril de 2005, incluíram 3.926 casos de
transplantes, sendo que destes, 2.935 eram de órgão sólido e 991 de células
hematopoiéticas. Dos 2.935 casos de transplantes, 321 (10%) apresentaram
29
ICS,
sendo
que
134
foram
em
transplantados
hepáticos,
121
em
transplantados de rim, 32 em transplantados cardíacos, 17 em transplantados
de pulmão e 17 em transplantados de pâncreas. Com exceção do transplante
de rim, Staphylococcus coagulase negativo (SCoN) foi o microrganismo mais
isolado seguido de Escherichia coli. Outros patógenos como Acinetobacter
baumannii, Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Staphylococcus aureus,
Klebsiella spp., Enterobacter spp., Streptococcus viridans, Streptococcus
pneumoniae, Corynebacterium spp. e Stenotrophomonas maltophilia também
foram identificados mas em menor freqüência. Entre os isolados de S. aureus,
16% eram resistentes a meticilina (MRSA), 14,5% das enterobactérias eram
resistentes a cefalosporinas e 10% dos bacilos gram negativos eram
multiresistentes.
Um estudo retrospectivo realizado em um hospital terciário da cidade de
São Paulo avaliou 81 transplantes de órgãos sólidos realizados no período de
janeiro de 2004 a março de 2005. Dos pacientes avaliados, 9% adquiriram ICS.
O transplante hepático apresentou a maior taxa de ICS (29%) e nenhum caso
foi relatado em transplantados renais. Os agentes infecciosos mais prevalentes
foram K. pneumoniae (33,3%), P. aeruginosa (33,3%) e A. baumannii (33,3%).
Porém, diferente do estudo de Moreno e colaboradores (2007), não foi
encontrado nenhum caso de infecção por bactéria Gram positiva (Sola et al.,
2007).
Em um recente estudo, realizado no Brasil, Silva Jr e colaboradores
(2010) avaliaram 3.308 tranpslantes realizados no HRH e HSP, entre os anos
de 2000 e 2006 e constataram uma incidência de 4,11% de ICS nestes
transplantes, sendo E. coli (30,3%) o principal agente isolado nessas infecções.
30
Cinco isolados de E. coli, 8 K.pneumoniae e 8 E. aerogenes foram
multiresistêntes aos antimicrobianos. Entre os Gram positivos, 5 SCoN e 6 S.
aureus foram resistentes a meticilina. Nenhum VRE foi relatado.
Alguns trabalhos demonstram um maior número de bactérias Gram
negativas isoladas (Candel et al, 2005; Rodriguez et al, 2006) enquanto outros
relatam um maior número de bactérias Gram positivas (Berger et al, 2006).
Entretanto há concordância entre as principais espécies encontradas e a
resistência aos antimicrobianos (Linares et al., 2007).
A ICS representa uma falência do hospedeiro em controlar a infecção de
um foco primário. Choque séptico é a complicação mais severa no contexto da
bacteremia, aumentando a chance de morte em até 50% (Candel et al, 2005).
Michalak e colaboradores (2005) estudaram 102 pacientes transplantados de
rim-pâncreas. Bacteremia ocorreu em 13 dos pacientes e destes, 5 (38%)
tiveram choque séptico, sendo que, 100% dos pacientes foram a óbito. Dentre
os sítios de infecção primária, o catéter venoso central aparece em maior
frequência em transplantados de órgão sólido (Rodriguez et al., 2006; Singh et
al., 2000). Outros trabalhos relatam que o órgão doado proveniente de um
doador apresentando infecção ou sendo um doador cadáver, aumenta a
possibilidade do paciente receptor apresentar infecção (Battaglia et al., 2004;
Dantas et al., 2006).
A presença de bacteremia em pacientes transplantados em vigência de
terapia imunossupressora requer atenção dos profissionais da área da saúde,
uma vez que é frequente a presença de microrganismos multirresistentes, o
que restringe a escolha da terapia antimicrobiana apropriada.
31
3.3. Genes de Resistência a Antimicrobianos
3.3.1. Gene mecA
Os antibióticos betalactâmicos produzem um efeito bactericida pela
inibição das enzimas responsáveis por catalisar um estágio vital da biossíntese
do peptideoglicano, principal componente da parede celular das bactérias
Gram positivas (Giesbrecht et al., 1998).
A
resistência
apresentada
pelos
estafilococos
aos
antibióticos
betalactâmicos deve-se principalmente a dois mecanismos distintos, porém não
dissociados, pois ambos podem interagir. O primeiro mecanismo desenvolvido
pela bactéria é produção da enzima betalactamase que hidrolisa o antibiótico.
O segundo mecanismo está associado à alteração do sítio de ação do
antibiótico betalactâmico pela produção de uma proteína ligadora de penicilina
adicional, a PBP2a (também denominada PBP2’), que está ausente nos
Staphylococcus spp. sensíveis à meticilina (Hackbarth et al., 1989).
A codificação desta nova PBP está relacionada à aquisição do gene
mecA por Staphylococcus spp. Este gene faz parte de um elemento genético
móvel encontrado em todos os isolados de S. aureus e Staphylococcus
Coagulase
Negativo
(SCoN)
resistentes
a
meticilina.
Katayama
e
colaboradores, em 2000, demonstraram que o gene mecA faz parte de um
elemento genômico designado cassete estafilocócico do cromossomo mec
(“staphylococcal cassette chromosome mec” - SCCmec), integrado ao
cromossomo de S. aureus .
Atualmente, o gênero Staphylococcus compreende 40 espécies. (Cunha
et al., 2004). Entre seus representantes, S.aureus é considerado o patógeno
32
mais virulento e importante, mas a incidência de infecções causadas por SCoN
vem aumentando em todo o mundo (Sakai, 2004).
Em um recente estudo do Programa de Vigilância SENTRY ("SENTRY
“Antimicrobial Surveillance Program”) realizado com 3.907 amostras de
bactérias Gram positivas coletadas de centros médicos no Brasil, entre o
perído de janeiro de 2005 a setembro de 2008, constatou-se que S. aureus foi
o microrganismos mais prevalente em infecções de corrente sanguínea
seguido por SCoN. Neste mesmo estudo, 31% dos isolados de S. aureus e
80% dos SCoN apresentaram resistência a meticilina (Gales et al., 2009). Em
um estudo realizado em pacientes transplantados de órgãos sólidos, esta
prevalência também foi observada. Diversos autores relataram alta incidência
de infecção de corrente sanguínea por Staphylococcus spp. resistentes a
meticilina. (Linares et al., 2009; Bert et al., 2010).
3.3.2. Genes vanA e vanB
Da mesma maneira que os antimicrobianos β-lactâmicos, a classe dos
glicopepitideos (vancomicina) agem no metabolismo de construção da parede
celular bacteriana, através da ligação da porção terminal D-Ala-D-Ala de um
pentapeptídeo encontrado em precursores de peptidoglicano, interferindo na
etapa de transpeptidação (Figura 1) (Silveira et al., 2006; Eggert et al., 2001).
33
Figura 1. Etapa da Transpeptidação: Formação das ligações cruzadas nas
cadeias peptídicas (Eggert et al., 2001).
A resistência bacteriana à vancomicina em enterococos ocorre através
de uma modificação genética no gene bacteriano, sintetizando, como exemplo,
D-alanina-D-lactato (D-Ala-D-Lac) ao invés do dipeptídeo D-alanina-D-alanina
(D-Ala-D-Ala) (Silveira et al., 2006). A modificação do aminoácido terminal Dalanina por D-lactato introduz uma interação eletrostática repulsiva no lugar da
ligação de hidrogênio. Em conseqüência, a afinidade da vancomicina com a
camada de peptidoglicano diminui em uma escala superior a 1000 vezes
(MacComas et al., 2003).
A aquisição do mecanismo de resistência a vancomicina é mediada por
vários genes (Werner et al., 2008). Embora a origem da sensibilidade de
enterococos frente à teicoplanina envolva mecanismos diferentes daquele da
vancomicina, essas características de sensibilidade e resistência frente aos
dois glicopeptídeos servem como base para uma classificação clínica (Silveira
et al., 2006).
Dos sete fenótipos descritos atualmente (A,B,C,D,E,G,L), os genes vanA
e vanB são, de longe, os mais prevalentes no mundo e são descritos
34
principalmente entre as espécies E. faecalis e E. faecium. Cepas de
enterococcus com fenótipo vanA apresentam alto grau de resistência a
vancomicina e teicoplanina e a resistência pode ser induzida pela presença de
glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina, avorpacina, ristocetina) e por
agentes não glicopeptídeos, como bacitracina e polimixina B (Cetinkaya et al.,
2000). O fenótipo vanB apresenta altos níveis de resistência a vancomicina
enquanto a sensibilidade a teicoplanina é mantida. Ambos os genes podem ser
encontrados em plasmídeos ou no cromossomo bacteriano e ser transferidos
entre espécies enterocócicas (Cetinkaya et al., 2000).
Uma situação mais preocupante foi o temor de que genes que conferem
resistência à vancomicina presentes nos VRE (Enterococcus Resistente a
Vancomicina) fossem transmitidos para os MRSA. Isto foi recentemente
confirmado em alguns casos isolados (n=7) surgidos na América do Norte,
sendo conhecidos como VRSA (S. aureus Resistente a Vancomicina) (Tenove,
2008; Zhu et al., 2008).
Em uma publicação de 2003, Chang e colaboradores reportaram em um
isolado de VRSA de uma ponta de cateter, a presença concomitante do gene
de resistência mecA e do gene vanA. Tal evidência foi confirmada através da
PCR localizado em um plasmídeo de 60 kb e a seqüência de DNA do gene
vanA VRSA foi idêntica à de uma amostra de E. faecalis resistente à
vancomicina isolada a partir da mesma cultura de ponta cateter (Chang et al.,
2003).
A consolidação da vancomicina como um antimicrobiano importante
frente a bactérias Gram positivas multiresistentes, trouxe um período de certa
tranqüilidade para a contenção destes agentes e tratamento nos centros
35
médicos. Entretanto, com o surgimento dos primeiros isolados de enterococos
resistentes a vancomicina e a emergência da sua disseminação no ambiente
hospitalar, levou a necessidade da busca de novos antimicrobianos para o
tratamento deste patógeno multirresistente (Silveira et al., 2008).
Este fato se agrava quando estes microrganismos são isolados em
infecções de corrente sanguínea. Dentre os Gram positivos, as espécies de
Enterococcus spp. aparecem entre os primeiros microrganismos mais isolados
nestas infecções (Cervera et al.,2009; Erdem et al.,2009). No Brasil Gales e
colaboradores, em um estudo multicêntrico em 2009, apontaram estes
microrganismos como oitavo entre todas as epécies encontradas e terceiro
entre os Gram positivos. De todos os isolados de enterococcus, 7,7% eram
VRE.
Enterococcos é frequentemente isolado em pacientes transplantados,
especialmente em transplantes de rim e fígado (Patel et al., 2001). Nestes
pacientes, infecções de corrente sanguínea é uma das mais comuns infecções
causadas por VRE. Esta infecção frequentemente é severa e associada a uma
bacteremia recorrente e persistente, e maior risco de morte (Nusair et al., 2008;
Asensio et al., 2008; Bhavinani et al., 2000; Lodise et al., 2002; Ghanen et al.,
2007).
3.3.3. -Lactamases de Espectro Ampliado (ESLs)
Os -lactâmicos são os agentes antimicrobianos utilizados com maior
frequência para o tratamento de infecções bacterianas. A ampla utilização
destes agentes principalmente das cefalosporinas de segunda e terceira
gerações, para o tratamento de infecções causadas por enterobactérias, foi
36
acompanhada pelo surgimento e disseminação de cepas bacterianas
resistentes produtoras de enzimas do tipo ESβL. A resistência aos -lactâmicos
dificulta o tratamento das infecções causadas por estes patógenos,
aumentando a morbi-mortalidade dos pacientes acometidos assim como os
custos diretos e indiretos relativos às internações (Tumbarello et al. 2006).
ESLs são enzimas capazes de hidrolisar todos os antimicrobianos βlactâmicos com exceção das cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) e dos
carbapenenêmicos (imipenem, meropenem) e são inibidas pelo ácido
clavulânico, tazobactam e sulbactam. Pertencem à classe molecular A de
Ambler (1980) e estão distribuídas no grupo 2be de Bush e Jacoby (2010). As
ESL apresentam um resíduo serina no seu sítio ativo e são codificadas por
genes localizados em plasmídeos que podem também codificar resistência aos
aminoglicosídeos,
tetraciclina,
cloranfenicol,
quinolonas
e
trimetoprim/sulfametoxazol (Rossolini et al. 2008d;Winokur et al. 2001).
Outras ESLs tais como PER, VEB, BES, GES, BEL, TLA e SFO,
também foram descritas, porém SHV, TEM e CTX-M são as mais prevalentes
entre as enterobactérias (Harada et al.,2008).
3.3.3.1. TEM
As ESBLs do tipo TEM são derivadas das beta-lactamases de espectro
restrito do tipo TEM-1 e TEM-2. A descrição da primeira β-lactamase desta
classe, denominada TEM-1 ocorreu em 1960. Esta enzima foi encontrada em
uma amostra clínica de Escherichia coli isolada da corrente sanguínea de uma
jovem paciente grega chamada Temoniera, origem da sigla da β-lactamase
TEM (Turner 2005). A β-lactamase TEM-2 foi a primeira derivada da TEM-1
37
(Barthelemy et al. 1985). Já a β-lactamase TEM-3, reportada em 1988, foi a
primeira a apresentar o fenótipo ESβL (Sougakoff et al. 1988). Atualmente
existem
mais
de
160
derivados
de
TEM
(http://www.lahey.org/Studies/temtable.asp) sendo que algumas são resistentes
aos inibidores de β-lactamase e a grande maioria apresenta o fenótipo ESβL
(Bradford 2001b). Esta enzima é codificada por genes localizados, usualmente,
em elementos genéticos móveis, plasmídeos e transposons, que por meio de
uma série de eventos de transposição e rearranjos, migram para diferentes
plasmídeos que circulam entre microrganismos da mesma espécie ou de
espécies diferentes. Devido à grande facilidade de disseminação, esta enzima
tem sido descrita em diversas espécies de Enterobactérias, e em outras
espécies bacterianas (Paterson and Bonomo 2005). Embora essas βlactamases sejam mais frequentemente relatadas em E. coli, Klebsiella spp.,
EnterobaCter aerogenes, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus
rettgeri, e Salmonella spp. (Bonnet et al. 1999;Marchandin et al. 1999;Morosini
et al. 1995;Palzkill et al. 1995;Perilli et al. 2000;Tessier et al. 1998), têm sido,
também, reportadas entre bactérias Gram negativas não Enterobacteriaceae.
3.3.3.2. SHV
A denominação da sigla SHV vem de uma propriedade bioquímica da
enzima variável sulfidrila (“sulphydryl variable”) (Tzouvelekis and Bonomo
1999a). O fenótipo ESβL é caracterizado a partir de substituições de
aminoácidos que ocorrem no gene blaSHV-1, e estas alterações assemelham-se
as que acontecem com as ESβL do tipo TEM (Huletsky et al. 1993).
38
Em 1983, foi descrito o primeiro relato de uma SHV de espectro
ampliado, denominada SHV-2, encontrada em amostras clínicas de K.
pneumoniae, K. ozaenae e Serratia marcescens (Knothe et al. 1983). Em 1988,
SHV-3 e SHV-4 foram descritas por Jarlier e colaboradores (Jarlier et al. 1988)
e Buré e colaboradores (Bure et al. 1988), respectivamente. Ambas foram
encontradas em amostras clínicas de K. pneumoniae recuperadas de hospitais
franceses. SHV-5 foi descrita na Grécia e Tailândia (Chanawong et al., 2001; ,
Neonakis et al., 2003; Poirel et al., 2004a), enquanto SHV-12 foi identificada,
até o momento, somente na Tailândia (Chanawong et al., 2001). Desde 1982,
quando a ceftazidima foi disponibilizada para o uso clínico, até o presente
momento, foram descritas mais de 140 variantes da β-lactamase da classe
SHV (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#SHV).
A enzima SHV já foi relatada em vários membros da família
Enterobacteriaceae e em Acinetobacter spp. (Poirel et al., 2004a, Zavascki et
al., 2010). Em P. aeruginosa, poucos isolados foram descritos como produtores
dessa (Bush et al.,1995) enzima. Em K. pneumoniae, a enzima SHV-1 é
responsável por até 20% da resistência a ampicilina mediada por plasmídeos
nesta espécie (Tzouvelekis and Bonomo 1999b). Em muitas cepas de K.
pneumoniae o gene blaSHV-1, ou outro gene relacionado, apresenta-se integrado
ao cromossomo bacteriano (Livermore 1995). Inúmeros relatos de surtos
envolvendo K. pneumoniae produtoras de -lactamases de espectro ampliado
têm sido reportados (Coque et al. 2008).
Apesar de grande parte das -lactamases do tipo SHV apresentar
fenótipo ESβL, algumas, como por exemplo, SHV-10 e SHV-11, possuem
fenótipo de resistência aos inibidores das -lactamases e apesar de hidrolisar
39
as penicilinas, essa enzima apresenta uma hidrólise reduzida para as
cefalosporinas e, dessa forma, não é classificada como ESβL (Bradford 2001a).
3.3.3.3. CTX-M
As ESBL do tipo cefotaximase (CTX-M) são codificadas por genes
localizados em plasmídeos. Essas β-lactamases têm a propriedade de conferir
resistência a todas as cefalosporinas de espectro ampliado, porém,
apresentam como substratos preferenciais a cefotaxima e a ceftriaxona
(Bonnet 2004a;Cartelle et al. 2004;Rossolini et al. 2008c).
O primeiro relato da produção de CTX-M ocorreu em 1990, a partir de
um isolado clínico de E. coli recuperado na Alemanha (Bauernfeind et al.,
1990). Desde então, essas enzimas vêm se disseminando mundialmente em
diferentes gêneros de enterobactérias (Bonnet 2004b;Rossolini et al. 2008e).
Atualmente, encontram-se descritos na literatura mais de 80 tipos de CTX-M
diferentes (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).
No início da década de 1990, a β-lactamase CTX-M-2 disseminou-se
rapidamente na Argentina e em países vizinhos (Rossolini et al. 2008b). Outros
membros da família CTX-M estão distribuídos em diversos lugares do mundo;
CTX-M-9 e CTX-M-14 predominantemente na Ásia e na Espanha (Hernandez
et al. 2005;Munday et al. 2004), CTX-M-3 e CTX-M-15 na Europa. Apesar de
não ter sido isolada no Reino Unido antes de 2001, a enzima CTX-M-15 é
atualmente a ESβL mais prevalente em amostras bacterianas de E. coli e K.
pneumoniae nesta região (Livermore and Hawkey 2005).
Durante muitos anos, a identificação da enzima CTX-M esteve restrita
aos membros da família Enterobacteriaceae. Porém em isolados clínicos de P.
40
aeruginosa já foram descritas as enzimas CTX-M-1, CTX-M-43 (al Naiemi et
al., 2006; Celenza et al., 2006) e CTX-M-2 (Picão et al., 2009a; Picão et al.,
2009b). A disseminação das β-lactamases do tipo CTX-M está causando
importantes e imprevisíveis mudanças na epidemiologia da resistência aos
antibióticos β-lactâmicos (Rossolini et al. 2008a).
3.3.5. Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Os carbapenêmicos são considerados os agentes mais potentes contra
infecções causadas por bactérias Gram negativas devido à sua elevada
afinidade pelas PBPs, estabilidade diante da maioria das β-lactamases e pela
excelente permeabilidade através da membrana externa bacteriana (Woodford
et al., 2004). No entanto, nos últimos anos, o isolamento de bactérias Gram
negativas resistentes também aos carbapenêmicos vêm se tornando mais
frequente em diversas partes do mundo (Nordmann and Poirel 2002).
Em enterobactérias, a resistência a esta classe de antimicrobianos pode
ser causada pela produção de carbapenemases. As carbapenemases do tipo
KPC (sigla para “Klebsiella pneumoniae carbapenemase”), incluídas na classe
A (Ambler 1980b) ou grupo 2f de Bush (Bush et al. 1995b) são enzimas que
são capazes de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e
carbapenêmicos (Queenan and Bush 2007b).
A primeira descrição da enzima KPC-1 ocorreu no ano de 2001, na
Carolina do Norte (EUA), a partir de um isolado de K. pneumoniae coletado em
1996, durante um estudo de vigilância denominado ICARE (“Intensive Care
Antimicrobial Resistance pidemiology”). No entanto, uma recente correção na
sequência de nucleotídeos do gene blaKPC-1 indicou que as enzimas KPC-1 e
41
KPC-2 são idênticas (Yigit et al., 2001). A partir de então, relatos de KPC-2
tornaram-se frequentes na Costa Leste dos Estados Unidos e rapidamente
expandiu-se, sendo descrito em diversas partes do mundo (Queenan and Bush
2007a).
Até
o
momento,
onze
variantes
de
KPC
foram
descritas
(http://www.lahey.org/studies).
O gene que codifica a enzima KPC está frequentemente localizado em
um elemento genético móvel com grande potencial para disseminar-se. Esta
característica somada ao fato deste gene ser, frequentemente, encontrado em
cepas de K. pneumoniae, que é conhecida por sua capacidade de acumular e
transferir determinantes de resistência, é motivo de muita preocupação pelas
agências nacionais de saúde (Queenan and Bush 2007c). Embora as
carbapenemases do tipo KPC sejam predominantemente descritas em cepas
de K. pneumoniae, existem relatos dessa enzima em cepas de Enterobacter
spp. (Hossain et al. 2004); (Bratu et al. 2005b), Escherichia coli (NavonVenezia et al. 2006), Salmonella spp. (Miriagou et al. 2003), Citrobacter
freundii, Pseudomonas aeruginosa (Villegas et al. 2007), entre outras espécies
(Sacha et al., 2009). O tratamento de infecções causadas por microrganismos
que expressam esse determinante de resistência é extremamente difícil,
resultando muitas vezes em altas taxas de mortalidade, devido à resistência a
múltiplos agentes antimicrobianos (Bratu et al. 2005a).
A enzima KPC-2 foi primeiramente descrita no Brasil por Monteiro e
colaboradores (2009), em quatro amostras de K. pneumoniae isoladas entre
setembro e novembro de 2006 em um hospital de Recife. Desde então,
isolados de K. pneumoniae e E. cloacae produtores de KPC-2 também foram
descritas no Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul, revelando que a
42
emergência deste mecanismo de resistência em hospitais brasileiros vem
ocorrendo desde o ano de 2005 (Pavez et al., 2009; Peirano et al., 2009;
Zavascki et al., 2009a).
Em um recente estudo do Programa de Vigilância SENTRY (SENTRY“Antimicrobial Surveillance Program”), realizado com 3.220 amostras de
bactérias Gram negativas, coletadas de centros médicos no Brasil, entre o
período de janeiro de 2003 a maio de 2008, constatou-se que Klebsiella spp. foi
o segundo microrganismo mais prevalente em infecções de corrente
sanguínea, porém nenhum isolado apresentou KPC (Andrade et al., 2008). Em
2010, Linares e colaboradores, avaliaram 1.057 transplantes de órgão sólidos
realizados em um centro Médico na Espanha, entre o período de julho de 2003
a dezembro de 2007,e observaram
116 episódios de infecções por K.
pneumoniae sendo que mais de 50% desses eram ICS. Dos isolados desse
estudo, nenhum apresentou produção de carbapenemase. O mesmo fato se
repetiu em outro estudo, agora realizado no Brasil, no qual K. pneumoniae foi a
segunda espécie de Gram negativo mais prevalente em ICS e nenhum isolado
de KPC foi relatado (Silva JR et al.,2010).
3.3.4. Metalo--Lactamases
As metalo-β-lactamases (MBL) são pertencentes ao grupo 3 de Bush
(Bush et al. 1995a) e à classe molecular B de Ambler (Ambler 1980a).
Apresentam potente atividade contra carbapenêmicos e hidrolisam todos os lactâmicos
comercialmente
disponíveis,
exceto
os
monobactâmicos
(aztreonam). Este grupo requer íons Zn+2 ou outros cátions divalentes como
cofatores no sítio ativo. São resistentes à ação dos inibidores das serino-β43
lactamases como ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Queenan and
Bush 2007d), embora sofram inibição por agentes quelantes (EDTA, derivados
de tiol e do ácido dipicolínico); (Payne et al., 1997a; Payne et al., 1997b; Laraki
et al., 1999; Bebrone, 2007).
As MBLs, como todas as β-lactamases, podem ser divididas em
cromossomais e codificadas por genes móveis. As MLs intrínsecas são
normalmente mediadas por cromossomo (Walsh et al. 1994) e são encontradas
em um número limitado de espécies, como: Bacilus cereus, Aeromonas
hydrophila, Flavobacterium odoratum, Legionella gormanii, Bacteroides fragilis,
Stenotrophomonas maltophilia (Hirakata et al. 1998). MLs adquiridas
apresentam-se em estruturas genéticas móveis que fornecem mobilidade ao
gene, facilitando a disseminação dessa enzima entre diferentes espécies
bacterianas. Atualmente, são conhecidas 10 sub-classes de MBLs adquiridas:
IMP (imipenemase), VIM (Verona imipenemase), SPM (São Paulo metallo-βlaCtamase), GIM (German imipenemase), SIM (Seul imipenemase), AIM
(Australian imipenemase), KHM (Kyorin Health Science MBL), NDM (New Delhi
metallo-β-laCtamase), DIM (Dutch Imipenemase) e TMB (Tripoli metallo-βlaCtamase) (Osano et al., 1994; Lauretti et al., 1999; Toleman et al., 2002;
Castanheira et al., 2004; Lee et al., 2005; Yong et al., 2007a, Sekiguchi et al.,
2008; Salabi et al., 2009; Poirel et al., 2009).
Embora essas enzimas sejam mais frequentemente isoladas em
espécies de bactérias Gram negativas não-fermentadoras, como Pseudomonas
aeruginosa e Acinetobacter baumannii, cada vez mais estas enzimas têm sido
reportadas
em
membros
da
família
Enterobacteriaceae,
incluindo
K.
pneumoniae (Lincopan et al. 2005b;Morfin-Otero et al. 2009).
44
O primeiro relato de MβLs adquirida ocorreu em 1994 (Osano et al.
1994), sendo descrito como uma subclasse denominada IMP-1. Esta enzima foi
encontrada em uma cepa clínica de Serratia marcescens isolada no Japão, a
qual apresentava fenótipo de resistência a imipenem e cefalosporinas de amplo
espectro. Diversas variantes dessa enzima foram então descritas em P.
aeruginosa, Acinetobacter spp. e enterobactérias de praticamente todos os
continentes (Walsh et al., 2005; Walsh et al., 2008). As variantes IMP-1, IMP-16
e IMP-18 já foram reportadas em isolados clínicos brasileiros de P. aeruginosa
(Mendes et al., 2004; Mendes et al., 2007b; Xavier et al., 2007). Em 2005,
Lincopan e colaboradores relataram o primeiro caso de K. pneumoniae
produtora de IMP-1 isolada de uma única amostra, na América Latina
(Lincopan et al. 2005a).
Em 1999, a segunda subclasse descrita de MBL adquirida foi
denominada VIM foi observada em uma amostra de P. aeruginosa originária de
Verona, Itália (Lauretti et al., 1999). Muitas variantes de VIM já foram descritas,
tanto em microrganismos fermentadores da glicose, quanto em não
fermentadores. Embora a maioria das descrições tenha ocorrido na Europa,
algumas 25 variantes já foram identificadas na América e Ásia (Queenan &
Bush, 2007; Walsh et al., 2005; Walsh et al., 2008).
Em 2002, foi descrita uma nova subclasse de MBL, a SPM-1 (São Paulo
Metalo-β-lactamase). Esta enzima foi isolada de uma P. aeruginosa recuperada
do trato urinário de uma paciente de quatro anos hospitalizada no complexo
HSP/UNIFESP
(Toleman
et
al.,
2002).
Esta
enzima
parece
estar
especificamente relacionada à espécie de P. aeruginosa, uma vez que, até
então, não foi encontrada em demais patógenos. Amostras produtoras desta
45
enzima foram isoladas em diversas cidades brasileiras, tais como São Paulo,
Brasília, Salvador, Fortaleza, Santo André, Londrina, Maringá, Curitiba, Recife,
Rio de Janeiro, Porto Alegre e São Luiz (Gales et al., 2003; Pellegrino et al.,
2002; Poirel et al., 2004b; Nouér et al., 2005; Vieira et al., 2005; Zavascki et al.,
2005), sendo que na maioria destas descrições foi encontrado um perfil clonal
predominante, denominado clone SP. A única descrição da produção de SPM1 fora do Brasil ocorreu em 2010, na Suiça. Entretanto, a amostra de P.
aeruginosa, em que o gene blaSPM-1 foi detectado, foi isolada de um paciente
que havia sido atropelado e possuía internação prévia no Hospital Geral
Regional, em Recife (Salabi et al., 2010).
Em 2002, cinco isolados de P. aeruginosa foram recuperados de
diferentes pacientes de um centro médico em Dusseldorf, Alemanha. Estes
isolados codificavam uma nova β-lactamase da classe B, denominada GIM-1
(German imipenemase) (Castanheira et al., 2004). Em 2005, Lee e
colaboradores reportaram uma nova enzima do tipo MBL, SIM-1 que foi
identificada em sete isolados clínicos de Acinetobacter baumannii na Coréia, os
quais haviam sido isolados entre setembro de 2003 e novembro de 2004.
Recentemente, foram descritas novas subclasses de MBLs adquiridas:
AIM-1(Australian imipenemase), recuperada de um isolado clínico de P.
aeruginosa, em 2007, na Austrália (Yong et al., 2007b); KHM-1 (Kyorin Health
Science metalo-β-lactamase), descrita em 2008, no Japão, em um isolado
clínico de C.freundii (Seikiguchi et al., 2008); NDM-1 (MIM- 1) (New Delhi
metalo-β-lactamase), descrita em 2008, na Índia, em um isolado clínico de K.
pneumoniae, e posteriormente, sua ocorrência também foi relatada em
enterobactérias na Inglaterra (Doumith et al., 2009; Yong et al., 2009); TMB-1
46
(Tripoli MBL), recuperada de um isolado clínico de P. aeruginosa detectado da
Libia (África), em 2008 (El Salabi et al., 2009) e DIM-1 (Dutch Imipenemase),
descrita em 2009 a partir de um isolado de P. stutzeri originário da Holanda
(Poirel et al., 2010).
3.4. Sistemas Automatizados no Processamento de Hemoculturas
O sangue é um dos espécimes clínicos mais importantes dentro de um
laboratório de microbiologia. A hemocultura permite a identificação de
microrganismos na corrente sanguínea e é o método disponível mais sensível
na detecção da bacteremia.
A automação no laboratório de microbiologia ocorreu inicialmente em
1970 com a introdução do primeiro sistema semi-automatizado de hemocultura.
Posteriormente, em 1990 estes sistemas foram aperfeiçoados e criados os
equipamentos de hemocultura que realizam monitoramento contínuo do
crescimento microbiano.
Os métodos dos sistemas automatizados disponíveis comercialmente
baseiam-se na inoculação de amostra de sangue dentro de um frasco
hermeticamente fechado e estéril que contêm meio de cultura enriquecedor
que favorece o crescimento dos microrganismos, acrescido de substâncias que
inativam ou adsorvem os antibióticos.
Cada frasco possui meios específicos que, por suas características
químicas, permitem a seleção do microrganismo que deseja-se isolar: aeróbios,
anaeróbios, fungos ou micobactérias.
Os frascos de hemocultura são incubados a 37C dentro de
equipamentos automatizados que vão promover a agitação contínua do meio
47
de cultura. Na base do frasco de hemocultura existe um sensor de CO 2 que
monitora a quantidade e CO2 no meio. Dentro do equipamento, próximo à base
onde o frasco de hemocultura é colocado, um diodo emissor e receptor de luz é
posicionado e vai detectar alterações de cor e/ou fluorescência.
Com o crescimento bacteriano e conseqüente produção de CO 2, o
sensor localizado dentro do frasco promove, através de uma reação química,
alteração de cor ou emissão de fluorescência, com conseqüente alteração da
luz refletida detectada pelo diodo presente no equipamento. Este sinal é
transmitido a um computador acoplado ao equipamento. O computador possui
diversos algorítimos para reportar a detecção de um frasco positivo: (a) quando
a reflectância excede o ponto de corte estabelecido, (b) quando o instrumento
reconhece um aumento linear nos níveis de CO2 ou (c) quando ococrre
alteração nas taxas de CO2 produzido (Nolte et al.,1993).
Algumas metodologias, além de utilizar detecção colorimétrica ou
fluorimétrica podem também utilizar detecção manométrica da produção do
CO2.
Apesar do aperfeiçoamento das metodologias automatizadas para
aumentar a sensibilidade e reduzir o tempo de detecção do crescimento
microbiano a técnica é dependente de condições pré-analíticas ideais como:
volume da amostra, quantidade de amostras, momento e técnica de coleta.
Estudos revelam que 0,20 a 6% das amostras apresentam resultados
falso-negativos, onde o paciente apesar de apresentar episódio de bacteremia
o agente não é isolado (Shiguei et al., 1995; Smith et al., 1995; Ziegler et al.,
1998).
48
Após a detecção do crescimento do agente no equipamento de
hemocultura automatizado é realizado diretamente do frasco, pesquisa do
microrganismo com coloração pelo método de Gram e semeadura em meios
seletivos e enriquecedores para o isolamento do agente.
Após 24 horas de incubação é possível observar em placa o crescimento
dos microrganismos e proceder à etapas de identificação e teste de
sensibilidade.
A identificação dos agentes pode ser realizada por técnicas manuais,
onde características bioquímicas e físicas são observadas e interpretadas, ou
através de técnicas automatizadas, através de diversas provas bioquímicas em
que se estabelece um perfil bioquímico característico de cada.
Os métodos automatizados além de fornecer maior precisão nos
resultados proporciona rapidez na identificação, podendo esta ocorrer a partir
de 2 horas, a depender do microrganismo. No Brasil, os sistemas
automatizados mais utilizados são: Vitek®; Vitek-2® (bioMérieux, Hazelwood,
MO); Walk-Away® (DADE, West Sacramento, CA); BD Phoenix®, sendo que o
Phoenix apresenta no mesmo painel identificação e teste de susceptibilidade
(Anvisa, 2008).
O teste de sensibilidade também pode ser realizado através de
metodologia manual ou automatizada. A metodologia manual baseia-se na
técnica de Kirb-Bauer de disco difusão onde os halos de inibição são
interpretados de acordo com as recomendações do CLSI (Clinical Laboratory
Intitute). Outros métodos, tais como os Epsilométricos, como ETEST também
podem ser utilizados quando pretende-se realizar a determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM) a determinados antimicrobianos.
49
Já as técnicas automatizadas baseiam-se na técnica de microdiluição
em caldo onde diversas concentrações de antibióticos são utilizadas para
chegar à determinação da CIM. Estas concentrações são interpretadas pelos
equipamentos de acordo com as recomendações vigentes do CLSI (2010).
Tanto a metodologia manual como a automatizada permitem a detecção
de alguns mecanismos de resistência específicos, seja pela técnica de disco
aproximação seja pela técnica de uso combinado de antibióticos. Os fenótipos
geralmente reportados são a presença de ESBL e MLSb (Macrolídeos,
Lincosaminas e Estreptograminas).
3.5. Microbiologia Molecular Aplicada no Diagnóstico Clínico
3.5.1. Reação de Polimerização em Cadeia - PCR, PCR Multiplex e
PCR em Tempo Real
A técnica da PCR, idealizada em 1983 por Kerry Mullis tornou-se
realidade após o isolamento e purificação da enzima Taq DNA polimerase a
partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Esta
técnica passou a ser a mais utilizada em laboratórios de pesquisa e consiste de
uma reação de amplificação do DNA extraído e adicionado com dNTPs
(desoxirribunucleotídeos trifosfatos), oligonucleotídeos (primers) iniciadores da
reação e Taqpolimerase. É facil de ser executada e é realizada em três fases:
desnaturação, anelamento e extensão. Na primeira etapa, desnaturação, a
dupla fita de DNA é separada, na segunda etapa, anelamento, os primers se
posicionam no DNA, na terceira etapa a Taq polimerase inicia a extensão do
DNA (Konenam et al. 2006b).
50
A partir do uso rotineiro da PCR, outros métodos e aplicações puderam
ser elaborados. Uma delas é a PCR Multiplex. Este consiste na amplificação de
mais de um alvo simultaneamente pela adição de diferentes conjuntos de
primers específicos para cada alvo no mesmo tubo de reação. Para isto,
devem-se tomar alguns cuidados com os conjuntos de primers escolhidos, tais
como a temperatura de anelamento dos primers usados deve ser semelhante,
os conjuntos de primers devem gerar produtos com tamanhos moleculares
distintos, e estes devem apresentar especificidade de anelamento apenas com
uma sequência alvo. Apesar de ser uma estratégia de amplificação de uso
conveniente para detecção de DNA de agentes infecciosos, apresenta maior
dificuldade no desenvolvimento da metodologia e menor sensibilidade quando
comparada com amplificação de uma única sequência alvo (Hayden, 2004).
A técnica de PCR em Tempo Real é um refinamento da técnica original
de PCR, pois combina a amplificação e a quantificação de uma sequência de
DNA alvo por meio da detecção de fluorescência utilizando sondas específicas
marcadas com fluoróforos, ou com base na determinação da temperatura de
desnaturação de uma seqüência de DNA dupla fita (“melting temperature” Tm) marcada com substância intercalante fluorescente (Klein, 2002; Kubista et
al., 2006). É considerado um método homogêneo de amplificação de DNA, no
qual amplificação e detecção são realizadas no mesmo tubo de reação,
podendo eliminar processamentos pós-PCR, diminuindo o manuseio de
produtos de amplificação e o risco de contaminação cruzada (Hayden, 2004).
Os princípios aplicados para detecção de uma sequência alvo por PCR em
Tempo Real são baseados na mensuração de fluorescência durante a reação.
A quantidade de produto formado é monitorada durante o decorrer da reação
51
por meio da detecção da fluorescência detectada por diferentes filtros de
captação em determinados comprimentos de onda. A fluorescência é
proporcional à quantidade de produto formado em cada ciclo e o número de
ciclos de amplificação necessários para obter uma determinada quantidade de
DNA é registrado (Cicldo Threshold- Ct). Com a alta eficiência dos reagentes,
sensibilidade dos instrumentos e otimização de técnicas, o número de
moléculas de DNA de uma determinada seqüência presente em uma amostra,
pode ser determinado com grande sensibilidade (Mackay, 2004; Kubista et al.,
2006).
Hoje se encotram disponíveis Kits que utilizam a metodologia da PCR
em Tempo Real para o diagnóstico rápido em infecções de corrente sanguínea,
sendo o SeptFast (LightCycler SeptiFast assay; Roche Diagnostics) o mais
conhecido. Porém se trata de um método comercial em que seu uso fica
restrito em laboratórios de analises clínicas, pois requer excelente habilidade
técnica para o manuseio e é muito caro quando comparado a cultura (Lehman
et al., 2009).
3.5.2. Validação de Novos Métodos de Diagnósticos
A introdução de um novo método de diagnóstico em laboratório clínico
necessita de uma validação analítica e clinica, principalmente com os métodos
in house, para garantir uma maior confiabilidade ao protocolo escolhido. A
validação analítica avalia a acurácia, precisão, sensibilidade e especificidade
do método, que são indicadores das características do teste e por isso, não
dependem da prevalência da doença ou de doenças correlacionadas com a
população em que o teste de diagnóstico vai ser utilizado. A sensibilidade
52
analitica é testada medindo o mais baixo limite de detecção do alvo ou do
microrganismo desejado. A especificidade analítica mede a capacidade do
teste em detectar outro DNA que não o do microrganismo desejado.
Cada protocolo de diagnóstico molecular, após ter seus parâmetros
analíticos testados, também deve ter sua validação clínica determinada na
população a que se destina. Essa validação clínica é realizada analisando-se o
desempenho do teste em um número adequado de pacientes. A utilidade
clínica de um teste de diagnóstico para a população em que será aplicado pode
ser avaliada pelos valores preditivos (positivo e negativo), que são calculados a
partir de análise dos parametros de validação clínica comparados com a
prevalência da doença (Rossetti et al., 2006).
De acordo como documento MM3-A2 do “Clinical Laboratory Standard
Institute” (CLSI, 2006), um roteiro de avaliação para introdução de novo método
de diagnóstico deve ser seguido, como a determinação da sensibilidade
analítica (limite de detecção – LoD), especificidade analítica, precisão, cutoff
(valor
de
corte),
sensibilidade
e
especificidade
diagnóstica,
acurácia
diagnóstica, valores preditivos e diagnóstico.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA regulamenta
através da RDC 302/2005, que tanto laboratórios clínicos quanto de pesquisa
devem validar os métodos desenvolvidos no próprio laboratório fornecendo
evidências quanto ao desempenho (RDC 302/2005; Normas e Manuais
Técnicos, 2005).
53
MATERIAIS E MÉTODOS
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Casuística
Foram selecionadas para o estudo as hemoculturas positivas e as cinco
primeiras hemoculturas negativas de cada mês, independente do centro
referente, provenientes de pacientes submetidos a transplante de órgãos
sólidos internados no HSP e no HRH, coletadas entre fevereiro de 2009 a
fevereiro de 2010.
Foram incluídas no presente estudo 59 hemoculturas negativas e 126
hemoculturas positivas pelo sistema automatizado Bactec® (Becton Dickinson,
EUA). Destas, 4 hemoculturas negativas e 14 hemoculturas positivas foram
provenientes de 11 pacientes admitidos na unidade de transplantados de
órgãos sólidos (rim, rim e pâncreas, pulmão, fígado e coração) localizada no
10º andar do HSP e 55 hemoculturas negativas e 112 hemoculturas positivas
foram provenientes de 106 pacientes do serviço de transplante de órgãos
sólidos (rim e rim e pâncreas) do HRH.
4.1.1. Variáveis Clínicas
Os dados clínicos dos pacientes foram coletados no Same (Serviço de
Arquivo Médico) do HRH e no Same do HSP. O estudo foi retrospectivo
incluindo pacientes submetidos a transplantes de órgãos sólidos (rim,
rim/pâncreas, pulmão, coração e fígado), como também os pacientes
internados nos hospitais avaliados com intercorrências clínicas pós-transplante.
Os laudos com os resultados da hemocultura e antibiograma foram fornecidos
pelo Laboratório Central do HSP, UNIFESP.
54
Para descrever os episódios de ICS e analisar os fatores de risco
presentes no momento da coleta da hemocultura, foram coletadas as
informações relacionadas abaixo:
1- Dados do Paciente:

Nome;

Data de Nacimento;

Sexo;
2- Dados da Internação:

Hospital de Internação (HSP, HRH);

Data da Internação;
3- Dados do Transplante:

Data do Transplante;

Tipo de Doador: Vivo ou Falecido;

Órgão transplantado;

Tempo de Transplante até a bacteremia;
4- Dados da Infecção:

Data da coleta da bacteremia;

Tempo de Internação até a Bacteremia;

Resultado da coloração de Gram da hemocultura;

Data de validação do Gram;

Resultado da Hemocultura (microrganismos e antibiograma);
55

Data de validação da Hemocultura;
5- Dados do Tratamento:

Data de recebimento da coloração de Gram pelo médico;

Antibióticoterapia até quatro dias antes do resultado do Gram;

Antibióticoterapia até quatro dias após o resultado do Gram;

Avaliação da adequação da antibioticoterapia após o Gram;

Data de recebimento da Hemocultura pelo médico;

Antibióticoterapia até quatro dias antes do resultado da
Hemocultura;

Antibióticoterapia até quatro dias após o resultado da
Hemocultura;

Avaliação da adequação da antibioticoterapia após o resultado
do Gram;

Adequação da terapía empírica após o resultado da
Hemocultura;
A adequação da antibioticoterapia foi avaliada por 2 médicos e definida
como
adequada
quando
o
paciente
utilizava
pelo
menos
um
dos
antimicrobianos ao qual a bactéria identificada era sensível “in vitro” e
inadequada quando o microrganismo isolado não era sensível “in vitro” a
nenhum dos antimicrobianos utilizado pelo paciente ou se este não estava em
uso de nenhum antimicrobiano, porém não foi avaliada quanto a abordagem
clínica da infecção (Pereira, 1997).
56
4.2. Coleta das Hemoculturas de Acesso Periférico
Frente a suspeita de infecção, as coletas de hemocultura foram
realizadas pela equipe de enfermagem seguindo normas preconizadas pelas
Comissões de Controle Infecção Hospitalar (CCIH) do HSP e do HRH.
Dos pacientes adultos, foram coletados 10 mL de sangue no frasco
BACTEC Plus Aerobic/F® e das crianças foram coletados 5 mL de sangue no
frasco BACTEC Plus Pediatric/F®.
Na persistência da febre uma coleta adicional de hemocultura foi
realizada a critério do médico assistente após 24 horas da primeira coleta.
4.2.1. Coleta das Hemoculturas de Acesso Central – Cateteres
A coleta de hemocultura de cateter foi realizada em pacientes portadores
de cateter venoso central (CVC), nos quais não é possível ou não está indicada
à punção periférica, para coleta de amostra sanguínea. O procedimento foi
realizado pela equipe de enfermagem seguindo normas preconizadas pelas
CCIH do HSP e do HRH.
4.3. Processamentos das Amostras pelo Método Fenotípico
As hemoculturas do HSP e do HRH foram processadas no setor de
microbiologia do Laboratório Central do Hospital São Paulo, UNIFESP.
4.3.1.
Determinação
da
positividade
e
negatividade
das
hemoculturas pelo aparelho Bactec®
Após a coleta, os frascos de hemocultura foram processados pelo
equipamento Bactec 9240® (Becton Dickinson, Maryland, EUA), um sistema
57
automatizado que realiza a monitorização contínua do crescimento bacteriano.
O meio de cultura do frasco possui nutrientes que são metabolizados frente à
presença de microrganismos viáveis na amostra. Esta metabolização resulta na
produção de CO2 e esta alteração pode ser detectada e interpretada pelo
sistema como amostra positiva.
4.3.2. Resultado Parcial da Hemocultura Positiva pela Coloração de
Gram
Frente à positivação da hemocultura pelo sistema Bactec®, foi realizada
coloração pelo método de Gram e semeadura em meios enriquecedores e
seletivos para cultura. Os meios utilizados para o crescimento bacteriano
foram: ágar chocolate, ágar sangue e ágar eosino-metileno-blue (EMB).
4.3.3. Resultado Final da Hemocultura pelo Sistema Automatizado
Phoenix®
A identificação dos microrganismos e o teste de susceptibilidade a
antimicrobianos foram realizadas pelo equipamento Phoenix® 100 (Becton
Dickinson Microbiology Systems, Coceysville, Md.) Este sistema utiliza painéis
(PMID-121 para isolados Gram negativo, PMID-123 para Gram negativo não
fermentador e PMID-104 para Gram positivo (Anexo 2)) nos quais há provas
para identificação bacteriana e drogas antimicrobianas desidratadas. O sistema
utiliza indicadores colorimétricos e fluorométricos para leitura dos testes de
identificação e antibiograma. Todas as amostras positivas e negativas foram
encaminhadas ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC da
58
Disciplina de Infectologia da UNIFESP, onde as metodologias genotípicas
foram aplicadas.
4.4. Padronização da PCR em Tempo Real
Os iniciadores utilizados para detecção do controle interno da reação
foram desenhados para o gene da hemocromatose (HFE). A diferenciação
entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas foi feita por multiplex
TaqMan (TaqMan-MGB) em Tempo Real utilizando iniciadores universais do
gene 16S rRNA (Bispo et al., 2011). Os iniciadores para Gram positivas, Gram
negativas, controle interno e os genes de resistência blaKPC, blaSHV, blaTEM,
blaCTX, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB e mecA padronizados no presente
estudo, estão apresentados na Tabela 1.
Todos os iniciadores testados para a PCR em Tempo Real utilizando o
sistema TaqMan foram testado em concentrações diferentes.
59
Tabela 1. Lista de Iniciadores de amplificação da região codificadora dos genes
estudados.
Sequencias (5’3’)
Iniciador
HFE_ F
GATGACCAGCTGTTCGTGTTCTAT
HFE_R
CCACATCTGGCTTGAAATTCTAC
16S NT-341Fw
GACTCCTACGGGAGGC
16S 522Rv
Sonda GP
GCGGCTGCTGGCAC
CTGYSSAGCAACGCCGCG-MGB
Sonda GN
CCTGAYSCAGAMATGCCGCG-MGB
blaSHV-F
ATGCGTTATACGCCTGTG
blaSHV-R
TGCTTTGTATTCGGGCCAA
blaTEM-F
TGCCGCATACACTATTCTCAGAATGA
blaTEM-R
ACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT
Resistência
Genes
Tamanha do
Fragmento (PB)
-
HFE
-
16 S rDNA
-
93
192
-
- -
blaCTX-F
ATGT
GCAG(C/T))ACCAGTAA(A/G)GT(G/T)ATGGC
blaCTX-R
TGG
GT(A/G)AARTA(A/G)GTSACCAGAA(C/T)CAGCGG
blaKPC-F
ATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTC
blaKPC-R
CAATCCCTCGAGCGCGAGTC
blaIMP-F
GAATAG(A\G) (A\G)TGGCTTAA(C\T)TCTC
blaIMP-R
CAAAC(C\T)ACTA(G\C)GTTATC
blaVIM-F
GTTTGGTCGCATATCGCAAC
blaVIM-R
AATGCGCAGCACCAGGATAG
blaSPM-F
CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG
blaSPM-R
CCTTTTCCGCGACCTTGATC
mecA-F
AAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACC
mecA-R
GAAAGGATCTGTACTGGGTTAATCAG
vanA-F
CATGACGTAATCGGTAAAATC
vanA-R
ACCGGGCAGRGTATTGAC
vanB-F
CATGATGTGTCGGTAAAATC
vanB-R
ACCGGGCAGRGTATTGAC
Cefalosporina
blaSHV
1018
Cefalosporina
blaTEM
868
Cefalosporina
blaCTX
600
Carbapenêmicos
blaKPC
800
Carbapenêmicos
blaIMP
188
Carbapenêmicos
blaVIM
382
Carbapenêmicos
blaSPM
798
Meticilina
mecA
147
Glicopeptidio
vanA
732
Glicopeptidio
vanB
635
PB= Pares de base
A amplificação da reação de PCR em Tempo Real foi realizada no
equipamento 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, CA) utilizando
o Kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix (Invitrogen, California, EUA) e
TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, EUA). As
condições de termociclagem foram: 2 minutos a 50°C, seguidos de 10 minutos
a 95°C e 45 ciclos de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C. Todos os
60
iniciadores testados para a PCR em Tempo Real utilizando o fluoroforo SYBR
Green foram submetidos à análise da curva de desnaturação (melting curve)
para garantir a correta amplificação de cada conjunto de iniciador e assim,
determinar a temperatura de desnaturação (Tm- Temperatura de melting) dos
produtos de PCR para cada gene. O ciclo de dissociação dos produtos para a
curva de desnaturação (melting curve) foi: 95°C por 10 minutos, seguidos por
40 ciclos de 40 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C, e uma etapa para
realização da curva de desnaturação que variou de 68°C até 95°C, com
aumento gradual na temperatura de 0,5°C/s. Dessa forma, foi determinada a
temperatura de desnaturação (Tm) dos produtos de PCR dos genes analisados.
Tanto para o sistema SYBR Green quanto para o sistema TaqMan foi
avaliado o Ct em que ocorreu a detecção da positividade.
Para a PCR pelo sistema TaqMan, a positividade foi analisada a partir
da sonda detectada. Na figura 2 está esquematizada a detecção de uma
bactéria Gram negativa e Gram positiva. Quando há amplificação e a sonda
VIC , trata-se de uma bactéria Gram negativa. Quando detectada a sonda FAM
na amplificação trata-se de uma bactéria Gram positiva.
61
GP
GN
A
B
Figura 2. A - Amplificação do DNA de Gram positivo (curva em amarelo) e
Gram negativo (curva em vermelho); B- Sonda Gram Positivo (GP) e Sonda
Gram Negativo (GN).
4.4.1. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real
A eficiência (E) das reações para os protocolos de PCR em Tempo Real
foi calculada após construção de uma curva padrão utilizando a fórmula: E =
10(-1/-slope) -1, onde E = especificidade, “slope” = inclinação da curva no 7500
Software v2.0.4 . O valor corresponde à eficiência da reação em porcentagem
quando multiplicado por 100. As curvas foram avaliadas por um ensaio com as
amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de 5
pontos e foram avaliadas as diferenças intra ensaio, com intervalo de confiança
de 95%.
Para determinar a eficiência da PCR em Tempo Real foram utilizadas
cepas controles que apresentam genes de resistências que foram cedidas
gentilmente por outros grupos de pesquisas e que estão armazenadas no
banco de microrganismos do LEMC. Todas as amostras bacterianas foram
62
recuperadas em ágar sangue de carneiro (5%) após incubação por 24 horas
em atmosfera aeróbia ou microaerófila. Os respectivos controles utilizados para
os genes de resistência se encontram na Tabela 2. O limite mínimo de
detecção de DNA para o gene HFE foi avaliado utilizando DNA extraído dos
frascos Bactec®. Estes foram diluídos a partir de 10 ng/µl até 100 fg/µl. Em um
tubo contendo 4 mL de salina foi preparada uma suspensão bacteriana na
escala 0,5 de Mc Farland (1,5 x 108 UFC/mL). 1 mL da solução foi transferida
para tubo de 2mL estéril e assim foi extraído o DNA bacteriano por fervura, 10
minutos a 100°C e centrifugado a 16.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi
transferido para um tubo de 2 mL estéril. Para a preparação das amostras para
a curva padrão, foi realizado uma diluição seriada de 10 -1 a 10-7 a partir do tubo
da escala 0,5 de Mc Farland (1,5 x 108 UFC/mL) para cada gene testado. Para
a padronização as curvas foram realizadas em triplicata.
A determinação da especificidade analítica foi abordada em dois
aspectos: reação cruzada e falsos positivos, conforme o documento MM3 do
CLSI. Foram avaliados a capacidade de amplificação dos alvos amplificados e
a incapacidade de amplificação cruzada de microrganismos relacionados aos
microrganismos alvo. Uma reação contendo todos os reagentes, com exceção
do DNA da amostra, também foi utilizada como controle negativo.
63
Tabela 2. Relação dos microrganismos testados para validação das
reações de PCR em Tempo Real.
MICRORGANISMO
CEPA e n° Banco
Gene controle
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
GP
ATCC 43300
mecA
S. haemolyticus
ATCC 29968
GP
S. epidermidis
ATCC 12228
GP
Amostra clinica*
GP
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
GP
ATCC 51299
vanB
Enterococcus faecium
ATCC 51559
vanA/GP
Streptococcus pyogenes
ATCC 18615
GP
Streptococcus pneumoniae
ATCC 49619
GP
Streptococcus viridans
Amostra clinica*
GP
Streptococcus mitis
Amostra clinica*
GP
Escherichia coli
ATCC 25922
GN
EnterobaCter aerogenes
ATCC 13048
GN
Amostra clínica*
GN
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
GN
Controle 1088*
SPM-1
Controle 131*
IMP-1
Controle 225
VIM-2
ATCC 700603
Controle 28005*
GN
Staphylococcus warneri
Serratia marcescens
Klebsiella pneumoniae
AcinetobaCter baumannii
Salmonella SP
KPC/CTX-M/SHV/TEM
ATCC 19606
GN
Amostra clinica*
GN
ATCC - American Type Collection Culture; * - Número da amostra
referente ao Banco de microrganismos dos Laboratórios LEMC/ALERTA
64
4.4.2. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff”
A determinação do Ct do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff point” foi
realizada usando amostras negativas. O “cutoff”, limiar o qual um resultado
abaixo dele é relatado como positivo e acima como negativo, foi calculado de
acordo com o documento EP12 e EP17 do CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute) e Chandelier et al.(2010).
Para dados paramétricos com distribuição dos Ct das amostras negativas
correspondentes a uma distribuição normal, com 95% de confiabilidade e valor
de α de 5%, o LoB foi calculado pela equação:
LoB = µCtN + 1.645 σCtN
CtN= Ct da amostras negativas.
Para dados não paramétricos com distribuição não correspondente a
distribuição normal e resultados quando truncado com zero, foi considerado p =
(100-α) = 95. Os valores mensurados foram ordenados de acordo com o
resultado e o percentil foi estimado pela observação dos valores classificados.
O LoB foi determinado pela posição do Ct correspondente ao 95 percentile
pela equação:
LoB = PctB(100-α)
LoB = NB (p/100) + 0,5
Quando o valor da posição não for um valor inteiro, para o cálculo da
posição do 95 percentile, foi realizado a interpolação linear. Se a posição foi
X1,5 a posição foi a média entre duas posições. Se a posição do 95 percentile
corresponder a uma posição X1,25 , a posição foi calculada como X1 + 0,25 (X2 –
X1).
65
O ciclo de “cutoff” foi determinado a partir do Ct de amostras negativas.
Os valores de Ct determinado pelas amostras negativas puderam ser
considerados quando determinados e quando foram “undetermined” os
resultados do Ct foram considerados como valores Ct correspondentes a 40,
ou seja, o último ciclo do PCR usando o método em tempo real (Chandelier et
al., 2010).
4.4.3. Determinação do Limite de Detecção - LoD (Sensibilidade)
Para métodos laboratoriais de análises clínicas foi recomendado pelo
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) no qual o limite inferior de
detecção pode ser determinado conforme o documento EP17. Foi sugerido
para determinar o LoD um número mínimo de 60 resultados de amostras
positivas com baixa concentração.
O limite inferior de detecção das reações de PCR foi obtido pela equação:
LoD = LoB + cβ SDS
LoD – limite de detecção
LoB – limite do branco
cβ – derivado do percentil de 95% da distribuição padrão Gaussiana e
fator de correção.
SDS – desvio padrão estimado para a população
66
4.5. Aplicação nas Amostras de Hemocultura
A figura 3 ilustra o fluxo do processamento das amostras.
COLETA DE HEMOCULTURA EM TRASPLANTADOS
DE ÓRGÃO SÓLIDO HSP/HRH
LABORATÓRIO CENTRAL/ BACTEC
HEMOCULTURA NEGATIVA
BACTEC
HEMOCULTURA POSITIVA
BACTEC
LEMC
COLORAÇÃO DE GRAM
EXTRAÇÃO DO DNA PELA
TÉCNICA DO BRAZOL
SISTEMA AUTOMATIZADO
PHOENIX
PCR EM TEMPO REAL
SYBER GREEN PARA O GENE HFE
MICRORGANISMO
ISOLADO ENCAMINHADO
PARA INCLUSÃO NO
BANCO DE
MICRORGANISMO
PCR EM TEMPO REAL TAQMAN PARA O GENE 16S
rDNA
NEGATIVO
POSITIVO
GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS
COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS PHOENIX/PCR EM TEMPO REAL
CULTIVO DE BACTÉRIAS REFERENTES ÀS HEMOCULTURAS
DISCORDANTES DO SISTEMA AUTOMATIZADO PHOENIX
TESTE FENOTIPICOS PARA OS RESPECTIVOS
GENES DE RESISTÊNCIA
PCR EM TEMPO REAL PARA OS RESPECTIVOS
GENES DE RESISTÊNCIA
Figura 3. Fluxograma do processamento das amostras.
67
4.5.1. Extração do DNA Direto dos Frascos de Hemocultura
O DNA do microrganismo presente na corrente sanguínea de cada
paciente foi obtido a partir do sangue dos frascos de hemocultura positivos e
negativo detectados pelos sistemas automatizados. Antes de proceder à
extração do DNA foi realizada a anti-sepsia da tampa do frasco do sistema
Bactec®, com algodão ou gaze embebido em álcool a 70%. Uma agulha e
seringa foram acopladas à tampa do frasco e uma alíquota foi aspirada. Em um
microtubo foram colocados 500 µL de Brazol e a esse volume foram
adicionados 500 µL de sangue do frasco de hemocultura, e a mistura foi
homogeneizada de 3 a 5 segundos no vórtex. Em seguida foram adicionados
180 µL de clorofórmio gelado e novamente foi realizada homogeneização de 3
a 5 segundos no vórtex. O microtubo foi centrifugado a 20.000g por 12 min a
8oC. O sobrenadante foi retirado e transferido para outro microtubo contendo
500 µL de etanol gelado que foi agitado por 3-5 segundos no vórtex. O
microtubo foi centrifugado a 20.000g por 15min a 8oC. O sobrenadante foi
retirado com cuidado para não perder o pellet. O pellet foi lavado com 500 µL
de etanol gelado e em seguida foi centrifugado a 20.000g por 12 min a 8oC. O
sobrenadante foi retirado com cuidado e o pellet deixado a temperatura
ambiente para secagem e depois solubilizado em 50 µL de água dEPC e
incubado a 65º C por 30 minutos. Após o procedimento de extração, seguiu-se
diretamente para a realização das técnicas genotípicas ou as amostras foram
congeladas a -20ºC até o uso.
68
4.5.2. Aplicação da PCR em Tempo Real para o Gene HFE de
Controle Interno de Extração
Todas as hemoculturas positivas e negativas para o Bactec®, após a
extração do DNA, foram submetidas a PCR para o controle interno da reação.
A PCR em Tempo Real pelo sistema SYBR Green foi realizada em um volume
de reação de 25 μL contendo 12,5 μL Platinum kit SYBR Green qPCR Super
Mix (Platinum Taq DNA polimerase, SYBR Green I dye, Tris-HCl, KCl, 6 µM
MgCl2, 400 µM dGTP, 400 µM dATP, 400 µM dCTP, 800 µM dUTP, uracil DNA
glicosilase, e estabilizadores) (Invitrogen, California, EUA); 0,75 μL (10 µM) de
cada iniciador; 6 μL de água ultra pura e 5 μL de DNA. As reações foram
realizadas no aparelho 7500 Tempo Real PCR System (Applied Biosystems,
CA), utilizando o seguinte programa: 2 min a 50 º C, 10 min a 95 º C, seguida
de 40 ciclos de 15 segundos a 95 º C e 60 segundos a 60 º C. A dissociação
dos produtos para a curva de desnaturação (melting curve) foi a 95°C por 10
minutos, seguidos por 40 ciclos de 40 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C, e
uma etapa para realização da curva de desnaturação que variou de 68°C até
95°C, com aumento gradual na temperatura de 0,5°C/s. Dessa forma, foi
determinada a temperatura de desnaturação (Tm) dos produtos de PCR do
gene da hemocromatose.
4.5.3. Detecção do DNA Bacteriano PCR em Tempo Real pelo
Sistema TaqMan
As amostras de hemocultura com resultado positivo para o controle
interno de extração foram submetidas à detecção do DNA bacteriano. A PCR
em Tempo Real sistema TaqMan foi realizada em um volume de reação de
69
20μL contendo 10μL TaqMan Universal 2X Master Mix (Applied Biosystems,
CA); 0,5 μL (10 µM) de cada iniciador 0,6 μL (5 µM) da sonda para Gram
negativo 0,2 μL (5 µM) da sonda para Gram positivo, 5,2 μL de água ultra pura
e 3 μL de DNA. As reações foram realizadas no aparelho 7500 Tempo Real
PCR System (Applied Biosystems, CA), utilizando o seguinte programa: 2 min a
50 º C, 10 min a 95 º C, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95 º C e 60
segundos a 60º C .
4.5.4. Detecção dos Genes que Conferem Resistências aos
Antimicrobianos por PCR em Tempo Real pelo Sistema SYBR
Green
Para as amostras identificadas pela sonda de Gram negativo pela PCR
em Tempo Real foi realizada a PCR dos genes que codificam as ESΒLs,
metalo-β-lactamases e KPC. Para as amostras identificadas pela sonda de
Gram positivoo pela PCR em Tempo Real foi realizada a PCR para os genes
vanA, vanB e mecA.
A amplificação da reação de PCR em Tempo Real para os genes blaSHV,
blaTEM, blaCTX, blaKPC, vanA, vanB e mecA foi realizada no equipamento 7500
Tempo Real PCR System, Applied Biosystems, CA, utilizando 12,5 µL Kit
Platinum SYBR Green qPCR Super Mix (Platinum Taq DNA polimerase, SYBR
Green I dye, Tris-HCl, KCl, 6 mM MgCl2, 400 µM dGTP, 400 µM dATP, 400 µM
dCTP, 800 µM dUTP, uracil DNA glicosilase, e estabilizadores) (Invitrogen,
California, EUA) e 0,75 μL (10 µM) de cada iniciador; 6 μL de água ultra pura
e 5 μL de DNA. As condições de termociclagem foram dois minutos a 50°C,
seguidos de 10 minutos a 95°C e 45 ciclos de 15 segundos a 95°C e um minuto
70
a 60°C. A dissociação dos produtos para a curva de desnaturação (melting
curve) foi a 95°C por 10 minutos, seguidos por 40 ciclos de 40 segundos a
95°C 1 minuto a 60°C, e uma etapa para realização da curva de desnaturação
que variou de 68°C até 95°C, com aumento gradual na temperatura de 0,5°C/s.
Dessa forma, foi determinada a temperatura de desnaturação (Tm) dos
produtos de PCR dos diferentes genes de resistências.
A detecção dos genes blaIMP, blaSPM, blaVIM
por PCR multiplex em
Tempo Real pelo sistema SYBR Green foi realizada em um volume de reação
de 25 μL contendo 12,5 μL Platinum kit SYBR Green qPCR Super Mix
(Invitrogen, Califórnia, EUA), 0,125 μL (10 mM) de cada iniciador
para os
genes blaSIM, blaSPM, blaVIM e blaGIM ; 1,25 μL (10 mM) de cada iniciador para
blaIMp; 6 μL de água ultra pura e 3 μL de DNA. As reações foram realizadas no
aparelho 7500 Tempo Real PCR System (Applied Biosystems, CA), utilizando o
seguinte programa: 2 min a 50 º C, 10 min a 95 º C, seguida de 40 ciclos de 20
segundos a 94 º C , 30 segundos a 53 º C e 60 segundos a 60 º C. Para o
SYBR Green PCR, a temperatura da amostra foi aumentada gradualmente
para 95°C para gerar curvas de dissociação (Mendes et al., 2007).
4.6. Testes Direto do Isolado Bacteriano Referente à Hemocultura
A metodologia da PCR Tempo Real foi comparada com os resultados
liberados pelo método automatizado Phoenix®. Para os resultados discordantes
entre as duas metodologias, foram realizadas testes fenotípicos e moleculares
a partir da cultura do isolado bacteriano referente à hemocultura testada. Os
exemplares
bacterianos
encontram-se
armazenados
no
banco
de
71
microrganismos do LEMC. Estas amostras foram retiradas do banco e
semeadas em meio ágar sangue e incubadas em estufa a 37 o C por 24 horas.
Um segundo repique foi realizado, para as bactérias Gram negativas em meio
MacConkey e para as Gram positivas em meio ágar sangue e incubadas em
estufa a 37o C por mais 24 horas.
4.6.1. Teste de Triagem com Disco-Difusão para Ertapenem
Para amostras de K. pneumoniae sugestivas como produtoras de
carbapenemase, mas negativas para o gene blaKPC na metodologia de PCR em
Tempo Real, foi realizado o teste de sensibilidade por disco-difusão para
ertapenem. A preparação do inóculo bacteriano foi realizada após o
crescimento em placas de ágar MacConkey por 24 horas. Com o auxílio de
alça de semeadura, uma a três colônias isoladas de K. pneumoniae foram
transferidas para tubos contendo 4 mL de salina (NaCl - Sigma, St. Louis, MO).
A suspensão bacteriana foi homogeneizada e a turvação medida em
turbidímetro digital (Baxter®, Sacramento, EUA), para a obtenção de uma
concentração bacteriana correspondente a 0,5 da escala de McFarland, em
seguida as amostras foram semeadas em placa de ágar Müeller-Hinton (Oxoid,
Basingstoke, Inglaterra) com auxílio de swab estéril. O perfil de sensibilidade foi
realizado utilizando discos de ertapenem (10µg), (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra). As placas foram incubadas em aerobiose a 37ºC por 18 a 24 horas.
Após este período, a leitura foi realizada e o halo de inibição interpretado de
acordo com os critérios estabelecidos pelo CLSI para EnterobaCteriaceae.
Dessa forma, as amostras foram classificadas como sensíveis (S) ou
resistentes (R) (CLSI, 2010).
72
4.6.2. Teste de Hidrólise para Detecção de Metalo-β-Lactamases
O teste de hidrólise foi realizado nos isolados que foram sugestivos para
a produção de metalo-β-lactamases pelo sistema Phoenix®, porém com reação
de PCR em Tempo Real direto da amostra clínica para os genes blaSPM, blaIMP
e blaVIM negativa. O teste de hidrólise teve como objetivo principal a detecção
da atividade enzimática nas amostras avaliadas. Depois de isoladas, 10
colônias foram inoculadas em 10 mL caldo de TSB (Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra) com 4 µg/mL de cefoxitina. Os tubos ficaram incubados na estufa a
37C por 18 horas sob agitação. A suspensão bacteriana foi transferida para
um tubo cônico e passou por uma centrifugação de 15 minutos à 3.000 rpm.
Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspenso em 1
mL de solução de hidrólise (Tris-HCl 1 mM e ZnSO4 1 mM). As amostras
suspensas foram ultrasonicadas com 4 ciclos de 30 segundos e o produto
sonicado foi transferido para tubo de microcentrífuga que então, foi
centrifugado por 3 minutos à 4ºC e 13.000 rpm (Centrifuge 5415R, Eppendorf,
Hamburg, Germany). O sobrenadante (extratos brutos de proteínas) foi
transferido para um novo tubo e as amostras mantidas no gelo até o momento
do ensaio.
Para verificar a atividade de hidrólise foram preparadas soluções de
imipenem em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0 a uma absorbância de
aproximadamente 1,5 a 2 unidades de absorbância a 260 nm. Em uma cubeta
de quartzo foram adicionados 900 µL da solução de antimicrobiano, juntamente
com 100 µL do extrato bruto de β-lactamase. O monitoramento da absorbância
da solução foi realizado por 1 minuto em espectrofotômetro. A diminuição da
absorbância da solução de antimicrobianos indica um resultado positivo para a
73
produção de metalo-β-lactamases. A variação da absorbância foi calculada
pela diferença entre o valor de absorbância final e inicial após um minuto de
leitura (Abs/min). Posteriormente, as amostras foram submetidas à inibição
por EDTA para confirmar se tratar de uma amostra produtora de metalo-βlactamases.
Como controle positivo do teste foi utilizada a amostra de P. aeruginosa
(Banco do LEMC número P1088) carreadora do gene blaSPM (Monteiro et al.
2009).
4.6.3. Detecção Fenotípica de ESβL
Em todos os isolados que foram identificados como produtores de ESβL
pelo método automatizado Phoenix® e que tiveram reações negativas para a
detecção dos genes blaSHV, blaCTX-M, blaTEM pela metodologia da PCR em
Tempo Real realizada diretamente da amostra clínica, foi realizada a detecção
fenotípica da produção de ESβL pela metodologia da disco-aproximação
(Jarlier et al., 1988). Foi preparada uma suspensão bacteriana com turbidez
correspondente a 0,5 da escala de McFarland. Após homogeneização, a
suspensão foi semeada em uma placa de ágar Müeller-Hinton utilizando swab
estéril. Foram dispensados os discos de aztreonam (30μg), ceftriaxona (30μg),
ceftazidima (30μg) e cefepima (30μg) a uma distância de 25 mm (centro a
centro) de um disco de amoxicilina/ácido clavulânico (30μg/10μg), que foi
colocado no centro da placa. Os discos utilizados foram os da Oxoid®
(Basingstoke, Inglaterra). As placas foram incubadas por 18 a 24 horas, em
temperatura de 35°C.
74
O teste da disco-aproximação foi considerado positivo para a produção
de ESβL quando houve o aparecimento de deformações do halo de inibição ou
o de uma zona fantasma entre o substrato e o inibidor. Como controle
positivodo teste foi incluída a cepa de K. pneumoniae ATCC 700603, produtora
de ESΒL, e a cepa de E. coli ATCC 25922 foi utilizada como controle negativo.
4.6.4. Determinação da Suscetibilidade a Vancomicina
Todos os isolados resistentes a vancomicina pelo método automatizado
Phoenix® e que tiveram resultado negativo para a pesquisa dos genes vanA e
vanB pelo método da PCR em Tempo Real realizado diretamente da amostra
clínica, foram submetidas a determinação da CIM, pela metodologia Etest ®,
conforme recomendações do fabricante. Foi preparada uma suspensão
bacteriana ajustada a 0,5 da escala de McFarland foi uniformemente semeada
na placa de ágar Müeller-Hinton e, quinze minutos após, a fita de Etest ®
contendo vancomicina foi dispensada sobre a placa. As placas foram
incubadas em aerobiose a 37ºC por 18 a 24 horas. A CIM foi determinada
como sendo a concentração indicada na intersecção entre a fita de Etest ® e a
zona elíptica de inibição do crescimento bacteriano. As amostras foram
classificadas em sensíveis ou resistentes de acordo com os pontos de corte
preconizados pelo CLSI para métodos diluicionais. Como controle foi utilizada a
cepa Staphylococcus aureus ATCC® 29213.
75
4.6.5. Determinação da Suscetibilidade a Oxacilina
Todos os isolados sensíveis a oxacilina pelo método automatizado
Phoenix® e pesquisa positiva do gene mecA pela PCR em Tempo Real direto
da amostra clínica foram submetidos a determinação da CIM, pela metodologia
Etest®, conforme recomendações do fabricante. Foi preprarada uma suspensão
bacteriana ajustada a 0,5 da escala de McFarland foi uniformemente semeada
na placa de ágar Müeller-Hinton suplementado com 2% NaCl e, quinze minutos
após, a fita de Etest® contendo oxacilina foi dispensada sobre a placa. As
placas foram incubadas em aerobiose a 37ºC por 18 a 24 horas. A CIM foi
determinada como sendo a concentração indicada na intersecção entre a fita
de Etest® e a zona elíptica de inibição do crescimento bacteriano. As amostras
foram classificadas em sensíveis ou resistentes de acordo com os pontos de
corte preconizados pelo CLSI para métodos diluicionais. Como controle foi
utilizada a cepa Staphylococcus aureus ATCC® 29213.
4.6.6. PCR em Tempo Real Direto do Isolado Bacteriano
Os mesmos isolados submetidos ao teste fenotípico foram submetidos
ao PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para detecção dos genes de
resistência. Após o isolamento das colônias, foi realizado em um tubo contendo
4 mL de salina uma suspensão bacteriana na escala 0,5 de Mc Farland (1,5 x
108 UFC/mL). 1 mL desta suspensão foi transferida para um tubo de 2mL
estéril e assim foi extraído o DNA bacteriano por fervura, 10 minutos a 100°C e
centrifugado a 20.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um
tubo de 2 mL estéril. Para a reação de PCR foi realizada um diluição a 10 -1 do
DNA estraído. Para os isolados submetidos ao teste confirmatório para ESBL,
76
foi realizado a PCR para os genes blaCTX-M, blaSHV e blaTEM. Para os isolados
submetidos ao teste DD para ertapenem, foi realizado a PCR para blaKPC. Para
os isolados submetidos ai teste de hidrólise, foi realizado a PCR para os genes
blaIMP, blaSPM e blaVIM. Já para os isolados submetidos ao E-test para oxacilina
foi realizado a PCR para o gene mecA. As concetrações e condições de
ciclagem foram as mesmas dos testes realizados direto da hemocultura.
4.7. Análise Estatística dos Dados
A análise dos dados consistiu na descrição geral, a partir de Tabelas
utilizando o programa de planilha Microsoft Excel 2007 e SSPS 17.0 (SPSS
Inc., Chicago, IL).
Os valores preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN) foram calculados
como medidas de eficácia diagnóstica da PCR em Tempo Real para o gene
16S rDNA em relação aos resultados do Phoenix®.
O grau de concordância entre os resultados da PCR em Tempo Real
para o gene 16S rDNA em relação aos resultados do Phoenix® foram
estabelecidos pelo cálculo do coeficiente kappa (K).
O Kappa é uma medida de concordância inter-observador e mede o grau
de concordância além do que seria esperado tão somente pelo acaso. Esta
medida de concordância tem como o valor máximo o “1”, valor que representa
o máximo de concordância e o “0” que indica ausência de concordância. Um
eventual valor de Kappa menor que zero sugere que a concordância
encontrada foi menor do que aquela esperada por acaso. Sugere, portanto,
discordância, mas seu valor não tem interpretação como intensidade de
discordância (Feinstein et al., 1990).
77
A acurácia analítica foi calculada pela curva ROC. Esse é o resultado
da plotagem dos resultados de sensibilidade (eixo y) e especificidade
subtraída de 1 (eixo x), para diferentes pontos de corte. A área abaixo da
curva (AAC) é comumente utilizada como uma medida do desempenho do
teste, podendo ser traduzida como a probabilidade do observador em
classificar amostras corretamente ou como a sensibilidade média entre toda a
faixa de valores possíveis de sensibilidade. Assim, para uma curva na qual a
AAC é igual a 1, o teste é 100% sensível e específico, e a chance de o
observador errar ao utilizar o teste para caracterizar uma determinada amostra
é nula. Se o teste não for discriminatório, a AAC aproxima-se a 0,5, o que
significa 50% de probabilidade de o observador acertar ao classificar uma
amostra por esse método, ou seja, a classificação é realizada ao acaso (Eng,
2005).
Este foi elaborado tanto para os genes de resistência a
antimicrobianos pelo método da PCR em Tempo sistema SYBR Green quanto
para o gene 16S rDNA pelo método da PCR em Tempo sistema TaqMan,
utilizando apenas amostras controles bem caracterizadas como negativas e
positivas.
78
RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1. Amostras de Hemoculturas Incluídas no Estudo
Durante o período de fevereiro de 2009 a fevereiro de 2010, 185
hemoculturas de 117 pacientes transplantados de órgão sólidos foram incluídas
no estudo, das quais 18 hemoculturas (4 hemoculturas negativas e 14
hemoculturas
positivas
provenientes de 11
pelo
sistema
automatizado
Bactec®)
foram
pacientes admitidos na unidade de transplantados de
órgãos sólidos (rim, rim e pâncreas, pulmão, fígado e coração) localizada no
10º andar do HSP e 167 hemoculturas (55 hemoculturas negativas e 112
hemoculturas positivas) foram provenientes de 106 pacientes do serviço de
transplantados de órgãos sólidos (rim e rim/ pâncreas) do HRH.
5.2. Validação Analítica da PCR em Tempo Real
As temperaturas de desnaturação (Tm) obtidas na detecção do controle
interno (gene HFE) e dos genes que conferem resistências aos antimicobianos
para cada controle positivo ATCC testado foram observadas, permitindo o
estabelecimento de um intervalo experimental de Tm possíveis. O Tm médio e
o desvio padrão observados para os genes avaliados estão apresentados na
Tabela 3.
79
RESULTADOS
Tabela 3. Resultados dos controles dos genes de resistência e os Tm dos
produtos amplificados.
Tm
Desvio
Genes
Menor
Maior
Media
Padrão
mecA
71,37
72,54
71,92
0,29
vanA
85,32
85,67
85,48
0,08
vanB
74,28
74,61
74,41
0,14
blaSHV
91,04
91,82
91,67
0,22
blaTEM
85,53
86,01
85,85
0,22
blaCTX
88,80
88,96
88,85
0,09
blaKPC
91,19
91,35
91,31
0,07
blaIMP
76,15
76,33
76,27
0,10
blaSPM
84,73
84,85
0,10
blaVIM
89,37
84,91
89,55
89,43
0,10
HFE
81,05
82,16
81,72
0,30
5.2.1. Eficiência e Especificidade da PCR em Tempo Real
A eficiência das reações apresentados na Tabela 4 foram de 81,487%
para blaSHV, 81,96% para blaTEM, 86,40 para blaCTX, 81,233% para blaKPC, 100%
para blaIMP, 80,07% para blaSPM, 128,765% para blaVIM, 93,772% para vanA,
116,911% para vanB e 108,939% para mecA. Para o gene HFE (controle
interno) a eficiência foi de 89,47%.
Para calcular a especificidade foram testados os iniciadores para
amplificar o DNA dos genes apresentados na Tabela 4.
Todos os genes
apresentaram capacidade de positivar as amostras controles por PCR em
Tempo Real utilizando o fluoróforo SYBR Green. As amostras controles foram
80
RESULTADOS
testadas e foram amplificadas para o gene HFE, controle interno. Todas as
amostras foram PCR positivas para os seus respectivos genes de resistência, e
os controles negativos apresentaram resultados negativos.
A reação para detecção do gene HFE, controle interno, não apresentou
reação cruzada com DNA de microrganismos. E uma reação contendo todos os
reagentes, com exceção do DNA da amostra, também foi utilizada como
controle negativo e apresentou PCR negativa
A detecção da ultima diluição foi calculada a partir da diluição seriada de
amostras controles para cada gene avaliado. Para o gene HFE, o controle
utilizado foi uma amostra de sangue periférico com concentração de DNA de
100 pg/uL. A diluição seriada variou de 10 -1 a 10-7 e a menor diluição detectada
foi a 10-4 e a menor de DNA foi de 100 fg/uL. Para os genes blaSHV, blaTEM,
blaCTX, blaKPC, blaIMP, blaSPM, blaVIM, vanA, vanB, mecA e as menores diluições
foram de 10-6, 10-7, 10-6, 10-6, 10-7, 10-7, 10-7, 10-7, 10-6 e 10-7 respectivamente.
81
RESULTADOS
Tabela 4. Desvio Padrão e media do Tm, Eficiência da reação de PCR, Ct e Tm
da ultima diluição
HFE
blaSHV
blaTEM
blaCTX
blaKPC
blaIMP
blaSPM
blaVIM
vanA
mecA
vanB
Controle
100 pg/ul
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala
0,5 MF
escala 0,5
MF
Tm maior
82,16
91,83
86,01
88,96
91,36
76,33
84,91
89,56
85,68
72,55
74,61
Tm menor
81,05
91,04
85,54
88,80
90,98
76,15
84,73
89,38
85,32
71,37
74,28
media Tm
81,72
91,67
85,85
88,86
91,27
76,27
84,85
89,56
85,68
71,92
74,41
DP Tm
0,30
0,22
0,22
0,09
0,13
0,10
0,10
0,10
0,08
0,29
0,14
Eficiencia%
89,47
81,49
81,96
86,40
81,23
100,00
80,07
128,77
93,77
108,94
116,91
Slope
-3,60
3,86
3,85
3,70
-3,87
-3,30
-3,92
-2,78
3,48
-3,13
-2,97
-6
-7
-6
Sensibilidade
diluiçao
10
10
-4
-6
-7
-7
-7
-6
-7
10
10
10
10
10
10
10
10
10-6
Ct diluição
35,91
38,21
37,41
30,92
36,84
36,50
35,72
36,13
30,74
35,93
36,94
Tm diluição
81,05
91,04
85,54
88,80
91,20
76,15
84,73
89,43
85,32
71,37
74,45
UFC/mL por
reação
100 fg/uL
15,0
1,50
15,00
15,0
1,50
1,50
1,50
15,0
1,50
15,0
5.2.2. Padronização da PCR em Tempo Real Sistema TaqMan para o
Gene Bacteriano 16S rDNA
A reação do gene 16S rDNA foi avaliado por um ensaio com as
amostras em triplicata. A regressão linear foi construída com o mínimo de 5
pontos e foram avaliadas as diferenças intra ensaio, com intervalo de confiança
de 95%. As sondas Gram especificas foram testadas quanto à capacidade em
diferenciar as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas utilizadas na
padronizaçao e apresentados na Tabela 5.
Para calcular a especificidade foram testados os iniciadores e sondas
Gram específicas para amplificar o gene 16S rDNA e estes mostraram ser
capazes de positivar as amostras controles S. aureus (ATCC 43300), E. coli
(ATCC 25922) e P. aeruginosa (ATCC 27853) por PCR em Tempo Real
utilizando sondas TaqMan-MGB.
82
RESULTADOS
Tabela 5. Resultados da padronização dos protocolos de PCR em Tempo
Real utilizando sondas TaqMan-MGB multiplex Gram especificas.
PCR TaqMan Multiplex
Microrganismo
Linhagem
Sonda Gram-
Sonda Gram-
ATCC 25923
Positiva
Positivo
Negativa
Negativo
ATCC 43300
Positivo
Negativo
Staphylococcus haemolyticus
ATCC 29968
Positivo
Negativo
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228
Positivo
Negativo
Amostra clinica
Positivo
Negativo
ATCC 29212
Positivo
Negativo
ATCC 51299
Positivo
Negativo
ATCC 51559
Positivo
Negativo
Streptococcus pyogenes
ATCC 18615
Positivo
Negativo
ATCC 49619
Positivo
Negativo
Streptococcus viridans
Amostra clinica
Positivo
Negativo
Streptococcus mitis
Amostra clinica
Positivo
Negativo
Escherichia coli
ATCC 25922
Negativo
Positivo
Enterobacter aerogenes
ATCC 13048
Negativo
Positivo
Amostra clínica
Negativo
Positivo
ATCC 27853
Negativo
Positivo
Controle (P1088)
Negativo
Positivo
Controle 131
Negativo
Positivo
Controle 225
Negativo
Positivo
ATCC 700603
Negativo
Positivo
Controle(A28005)
Negativo
Positivo
ATCC 19606
Negativo
Positivo
Amostra clinica
Negativo
Positivo
Serratia marcescens
Acinetobacter baumannii
Salmonella SP
83
RESULTADOS
5.2.3. Determinação do Limite do Branco (LoB) ou “cutoff”
O Ct (ciclo threshold) de “cutoff” foi calculado para os genes resistência
a antimicrobianos e para as sondas Gram específicas. De acordo com o
número de amostras negativas, este número variou entre os genes e estão
apresentados na Tabela 6. A partir deste ciclo de “cutoff”, as amostras que
apresentarem resultados abaixo do Ct foram consideradas positivas e acima,
negativas.
5.2.4. Determinação do Limite de Detecção – LoD
O Ct (ciclo threshold) do limite inferior de detecção, o LoD foi calculado
para os genes resistência a antimicrobianos e para as sondas Gram
específicas a partir de amostras positivas mas com baixa concentração. O Ct
LoD está apresentado na Tabela 6.
84
RESULTADOS
Tabela 6. Resultados de cutoff e LoD para cada gene avaliados.
Nº Amostra
Negativa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
41
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
GP
GN
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
37,74
33,98
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
41,00
39,44
39,44
39,29
39,23
38,82
38,47
38,30
37,54
37,36
37,31
37,29
37,08
36,96
36,89
36,79
35,88
65
34,02
66
33,03
mecA bla SHV bla CTX-M vanA vanB bla KPC bla TEM
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
36,93
36,93
35,94
35,06
33,6
29,83
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
39,1427
39,1427
37,918
37,4123
36,5065
35,6181
35,3588
35,0958
34,2808
34,198
34,1476
33,8952
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
38,274689
37,055664
37,020847
37,003807
36,766258
36,717575
36,521244
36,477421
36,187653
36,152454
35,818134
35,381996
34,501266
33,048428
28,741648
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
39,25
39,2
37,29
36,92
36,12
35,62
35,53
35,15
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
37,701
37,701
37,55
37,55
37,037
37,037
36,615
36,615
36,26
36,26
34,982
33,286
31,476
31,476
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
38,2736
38,1545
38,1545
37,0442
34,9422
34,9422
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
41
37,1618
30,202
67
68
69
70
Nº Total
62
66
37
39
35
41
54
51
25
NB
59,40
63,20
35,65
37,55
33,75
38,50
51,80
48,95
24,25
Cutoff
LoD
40,00
38,68
36,61
34,47
34,97
33,91
34,19
33,26
33,77
32,62
35,57
33,67
33,32
32,29
37,98
36,67
36,04
34,53
85
RESULTADOS
5.2.5. Determinação da Curva ROC para as Reações dos Genes de
Resistência a Antimicrobianos e para a Reação Multiplex Grampositivo e Gram-negativo por PCR em Tempo Real
Na Figura 4 encontram-se as curvas Roc dos genes estudados.
A
B
C
D
E
F
86
RESULTADOS
G
H
I
Figura 4. Curva ROC para genes de resistência a antimicrobianos e sondas
Gram positivo e Sonda Gram negativo: A – Gram positivo; B- Gram negativo; C
- blaTEM; D - vanA; E - vanB; F - blaCTX; G - blaSHV; H - mecA; I - blaKPC
Na Tabela 7 encontram-se os valores de sensibilidade, especificidade e
respectivo Ct, de acordo com a curva ROC. De acordo com a curva ROC os
valores da sensibilidade foram altas para os genes estudados, porém as
especificidades para os genes de blaKPC, blaSHV e blaCTX-M ficaram baixas. Na
Tabela 8 encotram-se a especificidade e sensibilidade delimitado pela curva
ROC para o respectivo Ct calculado pelo LoD. De acordo com a curva ROC a
especificidade foi alta, porém a sensibilidade para os genes blaTEM, blaSHV,
blaCTX-M e vanB foi baixa.
87
RESULTADOS
Tabela 7. Sensibilidade, especificidade e Ct delimitado pela curva ROC para os
genes que conferem resistência a antimicrobianos e para o gene 16S rDNA
para Gram positivo e Gram negativo.
Gene
Gram Positivo
Gram Negativo
blaTEM
vanA
vanB
blaCTX-M
blaSHV
mecA
blaKPC
N ° de
amostras
Positivas
24
34
55
51
19
24
35
83
52
N ° de
amostras
Negativa
62
66
25
40
54
35
39
37
51
Área
Sensibilidade
Especificidade
CT
0,992
0,973
0,966
0,99
0,961
0,896
0,863
0,976
0,984
0,958
0,941
0,909
0,98
0,947
0,917
0,943
0,976
0,942
0,968
0,864
0,92
0,845
0,852
0,6
0,74
0,89
0,41
39,23
37,36
37,37
37,17
36,87
38,15
38,65
36,79
37,6
Tabela 8. Sensibilidade, especificidade pela curva ROC de acordo com o LoD
para os genes que conferem resistência a antimicrobianos e para o gene 16S
rDNA para Gram positivo e Gram negativo.
Gene
Gram Positivo
Gram Negativo
bla TEM
N ° de
amostras
Positivas
N ° de
amostras
Negativas
Área
Sensibili
dade
Especifici
dade
Ct LoD
24
34
62
66
0,992
0,973
0,875
0,765
0,968
0,985
38,68
34,47
55
25
0,966
0,673
0,96
34,53
blaCTX-M
24
35
0,896
0,708
0,971
32,62
bla SHV
35
39
0,863
0,257
1
33,26
bla KPC
52
83
51
19
51
37
40
54
0,984
0,976
0,99
0,961
0,827
0,783
0,745
0,579
0,961
0,946
1
0,963
36,67
33,91
33,67
32,29
mec A
van A
van B
88
RESULTADOS
5.3. Aplicação da PCR em Tempo Real nas Amostras de
Hemocultura
5.3.1. Detecção do Gene HFE de Controle Interno da Extração
Todas as amostras de Hemoculturas, sendo elas negativas ou positivas
pelo aparelho Bactec®, foram submetidas à extração de DNA e a PCR em
Tempo Real para o gene HFE. O Tm dos controles positivos variou de 81,076 –
81,245. As amostras foram consideradas positivas quando a Temperatura de
melting (Tm) se encontrava neste intervalo. Somente quando o resultado de
PCR foi positivo para esta reação, é que as mesmas foram encaminhadas para
realizar a PCR em Tempo Real para os demais genes em estudo. Todas as
amostras incluídas foram positivas para o gene HFE indicando que houve
extração e evitando a possibilidade de falso negativo para os demais genes.
5.3.2. Detecção do Gene Bacteriano 16S rDNA
Todas as amostras que tiveram resultado positivo para o gene HFE
foram submetidas à detecção do gene 16S rDNA por PCR em Tempo Real.
Nenhuma das 59 hemoculturas negativas pelo sistema Bactec®
apresentou positividade por PCR para o gene 16S rDNA. Na Tabela 9 estão
apresentados os resultados da PCR para o gene 16S rDNA aplicada às 126
hemoculturas
positivas.
Das
66
amostras
identificadas
pelo
sistema
automatizado Phoenix® como espécies de bactérias Gram negativas, em cinco
não foi possível a amplicação na PCR para o gene 16S rDNA, porém das 62
hemoculturas aplicadas houve concordância de 100% entre o resultado do
sistema automatizado Phoenix® e da PCR. Para as 59 amostras identificadas
pelo Phoenix® como espécies de bactérias Gram positivas, em 19 não foi
89
RESULTADOS
possível a aplicação da PCR para o gene 16S rDNA, porém, das 40
hemoculturas aplicadas houve concordância de 100% entre o resultado do
sistema automatizado Phoenix® e da PCR. Uma única amostra de hemocultura
que apresentou dois tipos de bactérias, uma Gram positiva e outra Gram
negativa, a PCR detectou apenas a bactéria Gram negativa. A média de Ciclo
threshold (CT) apresentada pelas amostras positivas para Gram positiva e para
Gram negativo foi 24.
Das 126 hemoculturas positivas pelo sistema automatizado Bactec®, 60
bactérias Gram positivas e 67 Gram negativas foram identificadas pelo sistema
automatizado Phoenix®.
Cento e vinte e cinco hemoculturas apresentaram
apenas uma bactéria, sendo 59 Gram positivas e 66 Gram negativas e apenas
uma das hemoculturas teve crescimento de duas bactérias distintas, uma Gram
negativa e outra Gram positiva, identificadas como AcinetobaCter spp. e
Staphylococcus haemolyticus.
As 60 bactérias Gram positivas identificadas foram: 21 SCoN (9 SCoN, 5
Staphylococcus epidermidis, 4 Staphylococcus haemolyticus, 1 Staphylococcus
equorum, 1 Staphylococcus capitis, 1 Staphylococcus warneri; 14 S.aureus 5
Streptococcus pneumoniae; 3 Listeria monocytogenes; 3 Enterococcus
faecium; 1 Enterococcus faecalis; 1 Enterococcus durans e 1 Corynebaterium
jeikeium (figura 5).
90
RESULTADOS
Talela 9. Resultado da PCR em Tempo Real pelo sistema TaqMan para o
gene
Nº HEMO
83
146
107
48
49
50
84
82
85
86
66
6
7
94
69
70
76
109
137
138
139
92
11
152
88
47
176
177
12
36
120
40
41
12
31
126
91
150
168
169
170
90
13
33
42
44
45
46
43
61
55
75
123
16
68
130
58
59
23
16S
rDNA
nas
GRAM POSITIVO
Identificação
GRAM
Phoenix®
Fenotipico
C.jeikeiun
GP
E.durans
GP
E.faecalis
GP
E.faecium
GP
E.faecium
GP
E.faecium
GP
L. monocytogenes
GP
Listeria spp.
GP
Listeria spp.
GP
Listeria spp.
GP
S.warneri
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.aureus
GP
S.capitis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.epidermidis
GP
S.equorum
GP
S.haemolyticus
GP
S.haemolyticus
GP
S.haemolyticus
GP
S.pneumoniae
GP
S.pneumoniae
GP
S.pneumoniae
GP
S.pneumoniae
GP
S.pneumoniae
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
SCN
GP
126
HFE 16S rDNA
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
hemoculturas
CT 16S
rDNA
GP
GP
28,552
25,32
GP
GP
GP
GP
GP
29,24
22,725
34,813
35,101
28,9
GP
17,917
GP
GP
GP
25,719
27,765
28,596
GP
22,04
GP
GP
19,907
17,89
GP
GP
21,764
27,499
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
2,448
23,135
23,305
30,748
18,531
20,709
22,583
32,04
22,274
19,883
30,079
GP
28,675
GP
GP
GP
GP
33,088
31,197
21,101
31,248
GP
34,935
GP
GP
17,766
21,102
GP
24,851
GP
GP
GP
GP
26,178
17,014
15,502
24,181
Nº HEMO
111
10
60
64
67
113
114
160
73
155
37
32
17
110
34
157
1
38
39
20
77
78
166
9
18
163
51
133
108
143
74
158
121
122
154
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
164
165
63
117
142
87
147
178
2
3
118
185
183
54
127
128
19
81
136
140
26
184
positivas
pelo
GRAM NEGATIVO
Identificação
GRAM
HFE
Phoenix®
Fenotipico
A.baumannii
GN
Pos
A.baumannii
GN
Pos
A.baumannii
GN
Pos
AC.SPP/S. haemo.
GP/GN
Pos
B.cepacia
GN
Pos
E. cloacae
GN
Pos
E. cloacae
GN
Pos
E.aerogenes
GN
Pos
E.aerogenes
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
E.coli
GN
Pos
Enterobacter spp.
GN
Pos
Enterobacter spp.
GN
Pos
Enterobacter spp.
GN
Pos
K.oxytoca
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
K.pneumoniae
GN
Pos
L. adecarboxylata
GN
Pos
M. morganii
GN
Pos
M. morganii
GN
Pos
N. meningitides
GN
Pos
P.aeruginosa
GN
Pos
P.aeruginosa
GN
Pos
P.aeruginosa
GN
Pos
P.aeruginosa
GN
Pos
P.aeruginosa
GN
Pos
P.aeruginosa
GN
Pos
P.mirabilis
GN
Pos
S. maltophilia
GN
Pos
S. maltophilia
GN
Pos
Salmonella spp.
GN
Pos
Salmonella spp.
GN
Pos
Bactec®.
GN
GN
GN
GN
CT 16S
rDNA
36,025
29,845
20,997
17,7
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
16,645
15,968
22,139
24,345
21,722
20,407
30,323
18,65
22,762
24,158
17,308
17,005
32,853
31,034
22,538
27,004
18,188
30,205
26,15
34,779
23,525
19,815
18,606
36,995
32,997
17,748
18,408
20,282
24,631
23,15
28,089
GN
GN
GN
19,415
29,076
19,397
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
28,712
25,412
33,535
21,429
20,489
23,866
21
17,814
20,168
16,898
30,222
22,205
33,221
19,921
33,399
25,569
17,737
21,824
26,248
19,449
25,695
29,144
GN
GN
22,622
21,097
16S rDNA
HFE= PCR para o gene da Hemocromatose; Pos=Positivo; GP=Gram positivo;
GN=Gram negativo. CT= Ciclo threshold.
91
RESULTADOS
2% 2% 2%
1% 2%
Staphylococcus epidermidis
2%
25%
5%
Staphylococcus Coagulase Negativo
5%
7%
Staphylococcus haemolyticus
Listéria monocytogenes
8%
24%
15%
Staphylocuccos equorum
Staphylococcus capitis
Enterococcus durans
Corynebacterium jeikeium
Figura 5. Prevalência de espécies Gram positivas identificadas pelo sistema
As 67 bactérias identificadas pelo sistema automatizado Phoenix® como
Gram negativas foram: 22 Klebsiella pneumoniae; 17 Escherichia coli; 6
Pseudomonas aeruginosa; 3 Acinetobacter baumannii; 3 Enterobacter spp.; 2
Enterobacter cloacae; 2 Enterobacter aerogenes; 2 Morganella morgani; 2
Stenotrophomonas maltophilia; 2 Salmonella spp.; 1 Acinetobacter spp.; 1
Burkolderia cepacia; 1 Klebsiella oxytogenes; 1 Leclercia adecarboxylata; 1
Neisseria meningitidis e 1 Proteus mirabilis (Figura 6).
92
RESULTADOS
1%
1% 1%
3%
3%
1% 1% 1%
Escherichia coli
3%
33%
Acinetobacter baumannii
Enterobacter spp.
3%
3%
Enterobacter cloacae
4%
Enterobacter aerogenes
Morganella morgani
4%
Stenotrophomonas maltophilia
9%
Salmonella spp.
25%
Acinetobacter spp
Burkolderia cepacia
Klebsiella oxytogenes
Leclercia adecarboxylata
Neisseria meningitidis
Proteus mirabilis
Figura 6. Prevalência de espécies Gram negativas identificadas pelo sistema
A especificidade, a sensibilidade, o valor preditivo positivo, o valor
preditivo negativo e a concordância estimada pelo teste Kappa foi de 100%, já
que nenhuma amostra negativa pelo sistema automatizado foi considerada
positiva para a PCR em Tempo Real e as amostras consideradas Gram
positivo e Gram negativo pelo sistema automatizado concordaram com o
resultado da PCR.
Antimicrobianos em Bactérias Gram Negativas
Totas as 67 hemoculturas Gram negativas, foram submetidas a PCR em
Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os genes de resistêcia de ESβL
(blaSHV, blaCTX-M, blaTEM), K. pneumoniae carbapenemase (blaKPC) e metalo-βlactamases (blaIMP, blaSPM e blaVIM), apesar de 5 não apresentarem resultado
93
RESULTADOS
para a PCR de 16S rDNA. Das 67 hemoculturas Gram negativas, três amostras
apresentaram o gene blaCTX-M, uma blaKPC, uma blaCTX-M e blaTEM e uma blaCTXM
e blaSHV. Os respectivos Tm e Ct estão na Tabela 10. Das cinco amostras
que apresentaram positividade na PCR para os genes de ESβL uma não foi
considerada produtora de ESβL pelo sistema automatizado. Dezenove
amostras consideradas produtoras de ESβL pelo sistema automatizado não
apresentaram positividade na PCR para os genes de ESβL. Apenas uma
amostra apresentando K.pneumoniae foi positiva na PCR para blaKPC, porém
no antibiograma liberado pelo sistema Phoenix® essa não foi resistente para os
carbapenêmicos meropenem e imipenem. Já duas amostras de K.pneumoniae
consideradas resistentes a estes carbapenêmicos não foram positivas na PCR
para blaKPC. Três amostras de P. aeruginosa e uma de A. baumannii
apresentaram resistênciaum a pelo menos um dos carbapenens (meropenem
e/ou imipenem), porém foram negativas na PCR para os genes de metalo-βlactamases.
94
RESULTADOS
Talela 10. Resultado da PCR em tempo real sistema SYBR Green para os
genes
de
resistência
em
Gram
negativos
e
resultado
do
sistema
Phoenix®.
Nº
Hemo
60
10
111
64
67
113
114
73
160
18
34
17
157
21
155
166
1
110
9
77
163
37
38
78
39
20
133
51
108
143
147
104
142
158
102
63
87
164
165
154
74
121
95
96
122
97
98
117
99
100
101
103
178
2
3
118
183
19
54
127
128
185
81
140
136
26
184
Sistem Automatizado Phoenix®
Identificação
A. baumannii
A. baumannii
A. baumannii
AC.SPP/S. HAEMO
B.cepacia
E. cloacae
E. cloacae
E.aerogenes
E.aerogenes
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
E.coli
Enterobacter spp.
Enterobacter spp.
Enterobacter spp.
K.oxytoca
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
L. adecarboxylata
M. morganii
M. morganii
N. meningitides
P.aeruginosa
P.aeruginosa
P.aeruginosa
P.aeruginosa
P.aeruginosa
P.aeruginosa
P.mirabilis
S.maltophilia
S.maltophilia
Salmonella spp.
Salmonella spp.
ES?L
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
SIM
NÃO
NÃO
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
IMP/MERO
CTX-M
TEM
PCR em Tempo Real
GENES RES bla
SHV KPC IMP VIM SPM
CT RES
TM RES
R/R
CTX-M
CTX-M
14,26
29,008
CTX-M
KPC
CTX-M
SHV
88,453
89,247
27,941
23,132
28,171/29,46
88,6
91,061
89,2/91,318
22,979/26,932
88,8/85,772
R/R
R/R
R/I
R/R
R/R
CTX-M
TEM
RES = Resistência ; Ct RES= Ciclo Threshold; Tm RES= Temperatura de
melting; R= resistente; I= Intermediário; Imp= imipenem; mero= meropenem.
95
RESULTADOS
Antimicrobianos em Bactérias Gram Positivas
Totas as 59 hemoculturas Gram positivas, foram submetidas a PCR em
Tempo Real pelo sistema SYBR Green para os genes de resistêcia mecA,
vanA e vanB, apesar de 19 não apresentarem resultado para a PCR de 16S
rDNA. Trinta e duas amostras foram positivas para o gene de resistência mecA.
No entanto, 5 amostras sendo 4 identificadas pelo sistema Phoenix® como S.
aureus e uma S. epidermidis foram sensíveis para oxacilina. Uma amostra de
E. durans foi postiva para a PCR do gene mecA e uma amostra de S.
pneumoniae foi resistente a oxacilina pelo sitema automatizado e negativa para
o gene mecA. Nenhuma amostra foi positiva para os genes de resistência vanA
e vanB nem resistente a vancomicina pelo sistema Phoenix®. Os respectivos
Tm e Ct estão apresentados na Tabela 11.
Com relação aos resultados de susceptibilidade a oxacilina liberados
pelo sistema automatizado Phoenix® e a detecção do gene mecA pelo método
da PCR em Tempo Real, houve 86,7% de concordância entre as duas
metodologias e 13,3% de discordância.
96
RESULTADOS
Talela 11. Resultado da PCR em Tempo Real sistema SYBR Green para os
genes de resistência de Gram positivos e resultado do Phoenix®.
Nº Hemo
83
146
107
48
49
50
84
85
82
86
66
137
11
76
138
139
94
88
109
92
69
70
152
6
7
47
36
12
40
150
176
177
91
169
41
120
126
31
168
125
170
90
13
33
42
61
44
45
46
43
58
123
59
16
55
23
130
68
75
Sistema automatizado Phoenix®
Identificação
OXA VANCO
C.jeikeiun
E.durans
E.faecalis
E.faecium
E.faecium
E.faecium
L. monocytogenes
Listeria spp.
Listeria spp.
Listeria spp.
S. warneri
S. aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S. aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.capitis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.equorum
S.haemolyticus
S.haemolyticus
S.haemolyticus
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
SCN
SCN
SCN
SCN
SCN
SCN
SCN
SCN
SCN
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
R
R
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
S
S
S
R
R
R
R
NA
NA
NA
NA
S
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
PCR em Tempo Real
GENES RES
CT RES
mec A
van A
van B
TM RES
mec A
20,157
72,143
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
11,545
15,533
29,331
30,106
30,186
30,166
19,763
72,143
72,315
71,799
71,971
72,315
72,315
72,83
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
13,427
13,581
12,778
13,322
12,701
17,97
15,395
30,047
17,683
28,299
18,176
19,396
72,658
72,658
71,283
72,315
72,315
72,315
72,486
72,143
71,627
72,143
72,486
72,43
mec A
mec A
mec A
mec A
13,079
13,388
12,503
19,202
72,143
71,799
71,112
71,799
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
mec A
13,514
16,351
11,803
12,589
10,967
14,197
14,25
18,48
72,315
72,315
72,143
71,283
72,486
72,658
72,658
72,19
Ct RES= Ciclo Threshold; Tm RES= Temperatura de melting; R= resistente;
S= Sensível ; OXA= oxacilina; VANCO= Vancomicina; NA= Não aplicado.
97
RESULTADOS
No total, foram identificadas 5 amostras que apresentaram blaCTX-M, uma
blaTEM, uma blaSHV, uma blaKPC, 32 apresentaram mecA, e nenhuma
apresentou vanA, vanB, blaVIM, blaSPM e blaIMP pela PCR em Tempo Real
sistema SYBR Green (figura 7).
Figura 7. Total de amostras positivas pela metodologia da PCR em Tempo
Real pelo sistema SYBR Green para os respectivos genes de resistência
estudados
98
RESULTADOS
5.4. Testes Direto do Isolado Bacteriano
5.4.1. Confirmação de Susceptibilidade a Oxacilina e Gene de
Resistência mecA pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do
Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura
Para as amostras que apresentaram positividade para o gene mecA pela
PCR em Tempo Real sistema SYBR Green, mas que foram consideradas
sensíveis a oxacilina pelo sistema Phoenix®, o exemplar bacteriano referente a
amostra de hemocultura, armazenada no Banco de Microrganismo do LEMC,
foi submetido aos testes confirmatórios de susceptibilidade a oxacilina e a PCR
em Tempo Real sistema SYBR Green para confirmação da presença do gene
mecA. Os resultados dos testes se encontram na Tabela 12.
Tabela 12. Resultado do Etest para oxacilina e PCR em Tempo Real sistema
SYBR Green para o gene de resistência mecA direto da colônia e comparação
com a PCR direto do frasco de hemocultura.
Sistema automatizado Phoenix®Direto da Hemocultura Testes direto do Isolado Bacteriano
Nº HEMO
76
11
138
139
169
Real Time
Identificação doSusceptibilidade Real Time para o gene
Etest
para o gene
CIM E-test
Microrganismo a Oxacilina
mecA
Oxacilina
mecA
S. aureus
S
mecA
Negativo
S
0,125
S. aureus
S
mecA
Negativo
S
0,125
S. aureus
S
mecA
NT
NT
NT
S. aureus
S
mecA
Positivo
R
>256
S. epidermidis
S
mecA
Negativo
S
0,125
NT= Não Testado; S= sensível; R= resistente
99
RESULTADOS
O exemplar referente à amostra 138 não foi localizado, portanto não
foram realizados os testes. Para as testadas, três amostras, duas de S. aureus
e uma de S. epidermidis confirmaram ser sensível a oxacilina, porém negativas
para o gene mecA. Em uma amostra observamos discordância do método
automatizado Phoenix® em que foi sensível a oxacilina, e no teste direto do
isolado apresentou resistência a oxacilina e a presença do gene mecA.
5.4.2. Confirmação da Produção de Carbapenemase e Gene de
Resistência blaKPC pelo Método da PCR em Tempo Real Direto do
Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura
Duas amostras de K. pneumoniae apresentaram resistência a imipenem
e meropenem pelo sistema automatizado Phoenix®. Porém, apresentaram
resultado negativo na PCR em Tempo Real pelo sistema SYBR Green para o
gene blaKPC. Outra amostra de K. pneumoniae apresentou sensibilidade a
A
imipenem e meropenem pelo sistema automatizado Phoenix®, mas apresentou
resultado positivo na PCR em Tempo Real pelo sistema SYBR Green para
blaKPC. As três amostras de K. pneumoniae foram isoladas de hemoculturas
provenientes de um mesmo paciente , porém os dois isolados resistentes aos
carbapenêmicos
não
se
encontravam
armazenados
no
banco
de
microrganismo do LEMC. Assim, foi selecionado o isolado sensível a
carbapenêmicos com PCR em Tempo Real positivo para o gene blaKPC
adicionalmente a outros 4 isolados de K. pneumoniae provenientes do mesmo
paciente e que se encontravam no banco de microrganismo do LEMC, os quais
eram sensívies aos carbapenemicos e com resultado negativo para o gene
blaKPC pelo método da PCR em Tempo Real e todos foram submetidos a ao
100
RESULTADOS
teste de disco difusão para ertapenem e PCR em Tempo Real direto da
colônia para blaKPC. Os resultados estão apresentados na Tabela 13.
Dos
cinco isolados retirados do banco de microrganismos do LEMC, todos
apresentaram resistência a ertapenem e positividade na PCR em Tempo Real
para blaKPC.
Tabela 13. Resultado do método de disco difusão e PCR em Tempo Real
sistema SYBR Green para o gene de resistência blaKPC direto da colônia e
comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura.
Dados da Hemocultura e do Paciente
Nº HEMO Nº Paciente
95
96
97
98
103
99
100
104
101
102
64
64
64
64
64
64
64
64
64
64
Data da
hemocultura
13/11/2009
13/11/2009
21/11/2009
21/11/2009
02/12/2009
03/12/2009
03/12/2009
10/12/2009
15/12/2009
15/12/2009
Identificaçao
CIM/DD
do
para ERT
Microrganismo
K.pneumoniae
14mm
K.pneumoniae
14mm
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
22mm
K.pneumoniae >4µg/mL
K. pneumoniae >4µg/mL
Direto da
Hemocultura
Testes direto do Isolado Bacteriano
CIM para
PCR em Tempo PCR em Tempo
Susceptibilidad
IMP/MERO
e a IMP/MERO
Real para bla KPC Real para bla KPC
(µg/mL)
S/S
≤1/≤1
Negativo
KPC
S/S
≤1/≤1
Negativo
KPC
S/S
≤1/2
Negativo
KPC
S/S
≤1/2
Negativo
NT
Negativo
NT
S/S
NL
Negativo
KPC
Negativo
NT
S/S
NL
KPC
KPC
R/R
>8/>8
Negativo
NT
R/R
>8/>8
Negativo
NT
DD para DD para ERT
ERT
(mm)
R
R
R
NT
NT
R
NT
R
NT
NT
15mm
15mm
15mm
NT
NT
15mm
NT
15mm
NT
NT
NT= Não Testado; S= sensível; I= Intermediário
5.4.3. Confirmação da Produção de Metalo-β-Lactamases e Genes
de Resistência blaIMP, blaVIM e blaSPM pelo Método da PCR em Tempo
Real Direto do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de
Hemocultura
Quatro amostras, 3 de P. aeruginosa
e 1 de A.baumannii foram
resistentes a pelo menos um carbapenem (imipenem e/ou meropenem),
sugerindo a produção de metalo-β-lactamases. Para esses exemplares foi
realizado o teste de hidrólise e a PCR em Tempo Real sistema SYBR Green
direto da colônia bacteriana referente à hemocultura para os genes blaIMP,
101
RESULTADOS
blaVIM. blaSPM. Todas as amostras apresentaram hidrólise negativa e a PCR em
Tempo Real negativa para os 3 genes (Tabela 14).
Tabela 14. Resultado do teste de hidrólise e PCR em Tempo Real sistema
SYBR Green para os genes de resistência blaSPM, blaVIM e blaIMP direto da
colônia e comparação com a PCR direto do frasco de hemocultura.
Direto da
Hemocultura
Real Time para os Real Time para
Identificação do Susceptibilidade
Nº HEMO
Genes bla
os genes bla Teste de Hidrólise
Microrganismo
a IMI/MERO
IMP/VIM/SPM IMP/VIM/SPM
60
A.baumannii
R/I
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
19
P. aeruginosa
R/R
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
127
P. aeruginosa
R/R
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
128
P.aeruginosa
R/R
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
Sistem automatizado Phoenix®
NT= Não Testado; S= sensível; I= Intermediário
5.4.4. Confirmação da Produção de ESβL e Genes de Resistência
blaSHV, blaTEM e blaCTX-M pelo Método da PCR em Tempo Real Direto
do Isolado Bacteriano Referente a Amostra de Hemocultura
Vinte e quatro amostras, sendo elas 20 de K. pneumoniae, três de E.coli
e um de P. mirabilis foram ESβL positivas pelo método automatizado. Destas,
duas E.coli e uma K. pneumoniae foram positivas para o gene blaCTX-M e um
P.mirabilis foi posistiva tanto para o gene blaCTX-M quanto para blaTEM. Em uma
amostra foi detectado o gene blaCTX-M e blaSHV, porém esta foi negativa para
ESβL pelo Phoenix®. Das 25 amostras, 7 não foram encontradas no banco de
microrganismos do LEMC, sendo que destas 2 foram positivas para genes de
ESβL não podendo ser confirmado. Das 18 amostras submetidas ao teste de
disco aproximação para ESβL e para a PCR em Tempo Real direto da colônia,
uma E. coli, positiva para ESβL pelo método automatizado e negativa para a
102
RESULTADOS
PCR em Tempo Real direto da hemocultura, não confirmou a positividade à
ESβL pelo método fenotípico e nem para a PCR direto da colônia. As outras
17 amostras confirmaram ser ESβL positiva pelo método do disco aproximação
e 9 apresentaram positividade para pelo menos um gene ESβL. Destas 9, 6
foram negativas para o gene ESβL direto da hemocultura. Em 3 amostras
houve detecção do gene ESβL tanto na amostra de hemocultura quanto direto
do isolado bacteriano, porém em uma destas amostras foi detectado direto da
hemocultura o gene blaCTX-M e na colônia apenas blaSHV e em outra havia sido
detectado os genes blaCTX-M e blaTEM e direto da colônia foi detectado apenas o
gene blaCTX-M (Tabela 15).
103
RESULTADOS
Tabela 15. Resultado do disco aproximação para ESβL e PCR em Tempo Real
pelo sistema SYBR Green para os genes de resistência blaSHV, blaCTX-M e
blaTEM direto da colônia e comparação com a PCR direto do frasco de
hemocultura.
Nº HEMO
Identificaçao do
Microrganismo
ESBL
Phoenix
20
34
18
63
142
147
87
164
165
154
74
121
95
96
122
97
98
117
99
100
E.coli
E.coli
E.coli
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
SIM
SIM
SIM
SIM
NÃO
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
101
102
103
104
81
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
P.mirabilis
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
Direto da
Hemocultura
PCR em Tempo
PCR em Tempo
Real para CTX- Real para CTX-M/
M/ TEM/SHV
TEM/SHV
NEGATIVO
NEGATIVO
CTX-M
CTX-M
CTX-M
NT
NEGATIVO
NEGATIVO
SHV/CTX-M
NT
CTX-M
SHV
NEGATIVO
TEM/CTX-M
NEGATIVO
CTX-M/SHV
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
TEM/CTX-M/SHV
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
SHV
NEGATIVO
CTX-M/SHV
NEGATIVO
CTX-M
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NT
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NT
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
CTX-M/TEM
NT
NT
NT
NEGATIVO
CTX-M
ESβL Côlonia
NEGATIVO
ESβL
NT
ESβL
NT
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
ESβL
NT
ESβL
ESβL
NT
NT
NT
NT
ESβL
ESβL
NT= Não Testado
104
RESULTADOS
5.5. Variáveis Clínicas, Análise e Comparação do Tempo de
Liberação dos Resultados pelo Método Fenotipico e Tratamentos
antes e Após os Resultados em Relação ao Resultado Obtido pela
PCR em Tempo Real
Foram obtidas 185 amostras, 59 negativas e 126 positivas pelo sistema
automatizado Bactec®, coletadas de 117 pacientes submetidos a transplante de
órgão sólido. Dos 117 pacientes, 10,16% (11/117) foram admitidos na unidade
de transplantados de órgãos sólidos do HSP e 89,84% (106/117) no serviço de
transplantados de órgãos sólidos (rim e rim e pâncreas) do HRH. Em relação
ao sexo, 27,97% (32/117) dos pacientes eram do sexo feminino e 72,03%
(85/117) do sexo masculino. A idade média foi de 45,17 anos, sendo a idade
máxima de 74 anos e a mínima de 2 anos. Quanto ao tipo de transplante,
89,74% (105/117) pacientes foram submetidos a transplante de rim; 6,84%
(8/117) a transplante de rim e pâncreas; 1,70% (2/117) a transplante de fígado;
0,85% (1/117) a transplante de fígado e rim e 0,85% (1/117) a transplante de
coração. Em relação ao tipo de doador, 35,04% (41/117) pacientes receberam
o órgão transplantado de um doador vivo e 74,96% (76/117) pacientes de um
doador falecido.
Comparando as datas de coleta das 185 hemoculturas com a data de
transplante dos pacientes, o tempo médio em que os pacientes se
encontravam transplantados até a coleta da hemocultura foi de 331,15 dias
sendo que o menor tempo foi de 2 dias e o maior foi de 7300 dias (20 anos)
(Anexo 1).
105
RESULTADOS
5.5.1. Hemoculturas Positivas para Isolados Gram Positivos
Cinquenta e nove hemoculturas foram identificadas pelo sistema
automatizado Phoenix® com bactérias Gram positivas. A mediana em relação
ao tempo de liberação do resultado do Gram foi de 1 dia e para liberação final
de 4 dias.
A inadequação do tratamento, de acordo com o tempo de liberação dos
resultados parciais e finais é demonstrada na Figura 8. Durante o tratamento
empírico, isto é, antes da liberação do resultado do Gram, em 8 casos
(13,56%) os pacientes recebiam tratamento considerado inadequado; após a
liberação do resultado do Gram foi observada inadequação em 4 casos
(6,78%) e após a liberação final da hemocultura, 5 (8,48%) apresentavam
inadequação. Os critérios de inadequação adotados seguem padronização já
citada anteriormente.
A amostra 139 referente ao paciente 88, destacada na Tabela 15, foi
oxacilina sensível pelo método automatizado, porém o isolado retirado do
banco de microrganismos foi resistente a oxacilina pelo E-test. Neste caso o
paciente recebeu oxacilina no tratamento após o resultado final da hemocultura
e mesmo assim a antibioticoterapia foi adequada, pois foi considerado o
resultado do sistema automatizado para essa avaliação.
Dos cinco casos em que os pacientes receberam tratamento inadequado
mesmo após a liberação do resultado final, dois isolados eram SCoN
resistentes a oxacilina com gene mecA positivo tratados com levofloxacina e
bactrim respectivamente. Outros dois, um SCoN e um S. aureus, ambos
sensíveis a oxacilina e gene mecA negativos, não foram tratados. Um isolado
de Listeria spp. foi tratado com Bactrim (Tabela16).
106
RESULTADOS
Tabela 16. Dados referentes aos resultados dos testes fenotípicos e da PCR
em Tempo Real liberados direto das hemoculturas e avaliação do tratamento
recebido pelos pacientes.
Identificação
amostra
Nº
Nº HEMO GRAM
PACIENTE
5
5
9
10
10
11
17
22
24
27
30
30
31
32
33
33
33
34
35
35
35
39
40
40
41
43
45
46
46
49
50
54
55
56
56
56
58
60
60
61
63
65
66
76
78
80
81
83
88
88
88
92
94
96
106
106
106
110
110
6
7
11
12
13
16
23
31
33
36
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
55
58
59
61
66
68
69
70
75
76
82
83
84
85
86
88
90
91
92
94
107
109
120
123
125
126
130
137
138
139
146
150
152
168
169
170
176
177
Trat.=
PCR em
Tempo Real
Teste fenotipico/Phoenix®
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
MICRORGANISMO
OXA
S.aureus
S.aureus
S. aureus
S.epidermidis
S.haemolyticus
SCN
SCN
S.epidermidis
S. haemolyticus
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.haemolyticus
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.capitis
E.faecium
E.faecium
E.faecium
SCN
SCN
SCN
S.pneumoniae
S. warneri
SCN
S.aureus
S.aureus
SCN
S.aureus
Listeria spp.
C.jeikeiun
L. monocitogenes
Listeria spp.
Listeria spp.
S.aureus
S.equorum
S.epidermidis
S.aureus
S.aureus
E.faecalis
S.aureus
S.epidermidis
SCN
S.epidermidis
S.epidermidis
SCN
S.aureus
S.aureus
S.aureus
E.durans
S.epidermidis
S.aureus
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
S. epidermidis
S
S
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
NA
NA
S
NA
NA
NA
R
R
R
NA
R
R
S
S
S
S
NA
NA
NA
NA
NA
S
R
R
S
R
NA
S
R
R
S
R
R
R
S
S
NA
R
S
S
S
S
R
R
Tratamento;
VANCO GN/GP
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GENES
RES
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
GP
GP
GP
GP
mecA
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
GP
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
GP
GP
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
mecA
GP
mecA
GP
mecA
mecA
Ade=
Informações do Prontuário
TEMPO
LIBERAÇÃO
GRAM
1
1
2
2
1
2
3
2
2
1
3
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
2
1
2
2
2
1
1
1
1
2
2
2
2
1
1
1
2
1
2
2
1
2
1
3
1
2
2
2
1
1
2
2
1
1
3
1
3
1
TEMPO
TRAT. NA TRAT. APÓS
TRAT. NA
TRAT. APÓS
TRAT. APÓS GRAM TRAT. APÓS
LIBERAÇÃO COLETA DA GRAM DA
COLETA DA
FINAL HMC
DA HMC
FINAL HMC
HMC
HMC
HMC
HMC
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Oxa
Oxa
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Teico
3
A
A
A
Vanco
Teico
Teico
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Bactrim
Vanco
Vanco
3
I
A
I
Bactrim
Vanco +Bactrim
Bactrim
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Roce+Bac+levo Roce+Bac+levo Roce+Bac+levo
4
A
A
A
Roce+clari
Roce+clari
Roce+clari
4
A
A
A
Roce+clari
Roce
Roce
4
A
A
A
Roce+clari
Roce
Roce
4
I
I
I
3
A
Vanco
Vanco
3
A
Vanco
Vanco
3
A
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Line
Line
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
6
A
A
A
Levo
Levo
Levo
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
I
I
I
Levo
Levo
Levo
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Roce
Vanco
Roce
3
I
I
I
6
I
I
I
Bactrim
Bactrim
Bactrim
4
5
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
6
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
6
A
A
A
Vanco
Vanco
amp
3
A
A
A
Cip+roce
Cip+roce
Cip+roce
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Roce
Vanco
Oxa
5
I
A
A
Bactrim
Vanco
Vanco
3
I
A
A
Roce
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Oxa
Oxa
Oxa
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Bactrim
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
5
A
A
A
Vanco
Vanco
Oxa
5
A
A
A
Vanco
Vanco
Oxa
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Vanco
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Roce+clari
5
A
A
A
Vanco+Cip+roce
Cip+roce
Cip+roce
3
A
A
A
Vanco
Vanco
Roce
4
A
A
A
Line
Line
Vanco
4
A
A
A
Vanco
Line
Line
Adequação
da
antibióticoterapia;
HMC=
Hemocultura; OXA= Oxacilina; Vanco= Vancomicina; GP= Gram Positivo; GN=
Gram Negativo
107
RESULTADOS
16
14
12
10
8
Numero de pacientes
6
Porcentagem de
pacientes
4
2
0
Coleta da
Gram da
Final da
Hemocultura Hemocultura Hemocultura
Figura 8. Número e porcentagem de pacientes referentes a hemoculturas em
que
foram
isoladas
bactérias
Gram
positivas,
recebendo
tratamento
inadequado no momento da coleta da hemocultura, depois do resultado do
Gram da hemocultura e depois do resultado final da Hemocultura.
108
RESULTADOS
5.5.2. Hemoculturas Positivas para Isolados Gram Negativos
Sessenta e sete hemoculturas foram identificadas pelo sistema
automatizado Phoenix® apresentando bactérias Gram negativas. A mediana
em relação ao tempo de liberação do resultado do Gram foi de um dia. Com
relação ao tempo de liberação da espécie e susceptibilidade a antimicrobianos
do isolado foi de três dias. Durante o tratamento empírico, isto é, antes da
liberação do resultado do Gram, 19 (28,4%) dos casos de hemoculturas os
pacientes recebiam tratamento considerado inadequado. Destes, 14 (20,9%)
eram espécies de enterobacteriaceas e 4
(7,5%) espécies de não
fermentadores. Após a liberação do resultado do Gram, 14 (20,9%)
apresentavam-se
em
tratamento
inadequado,
sendo
11
(16,42%) de
enterobacteriaceas e 3 (4,48%) de não fermentadores. Após a liberação do
resultado final da hemocultura, 3 (4,5%) apresentavam-se em tratamento
inadequado sendo, 2 (2,99%) de enterobacteriaceas e 1 (1,51%) de não
fermentador (figuras 9 e 10). Destas 3 hemoculturas, 1 foi positiva para o gene
de resistência CTX-M e 2 negativas para qualquer gene de resistência
pesquisado, sendo que apenas a mostra CTX-M positiva foi ESβL positiva para
o sistema automatizado (Tabela 17).
109
RESULTADOS
Tabela 17. Dados referentes aos resultados dos testes fenotípicos e da PCR
em Tempo Real liberados direto das hemoculturas e avaliação do tratamento
recibido pelos pacientes.
Identificação
amostra
Nº
Nº
PACIENTE HEMO
1
2
2
7
8
11
12
13
14
19
23
25
28
29
29
36
38
40
42
43
44
47
48
51
51
53
57
64
64
64
64
64
64
64
64
64
64
65
67
68
70
70
73
74
77
77
81
81
86
87
88
90
90
92
97
98
99
99
101
103
104
104
105
110
115
116
117
1
2
3
9
10
17
18
19
20
26
32
34
37
38
39
51
54
60
63
64
67
73
74
77
78
81
87
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
108
110
111
113
114
117
118
121
122
127
128
133
136
140
142
143
147
154
155
157
158
160
163
164
165
166
178
183
184
185
PCR em Tempo
Real
Teste fenotipico/Phoenix®
GRAM
MICRORGANISMO
GN
E.coli
GN
M. morganii
GN
M. morganii
GN
E.coli
GN
A.baumannii
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
P.aeruginosa
GN
E.coli
GN
Salmonella SPP.
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
Enterobacter SPP.
GN
P.aeruginosa
GN
A.baumannii
GN
K.pneumoniae
GP/GN AC. spp./S. haemolyticus
GN
B.cepacia
GN
E.aerogenes
GN
K.penumoniae
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
P. mirabilis
GN
K.penumoniae
GN
K.penumoniae
GN
K.penumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
K.penumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
Enterobacter spp.
GN
E.coli
GN
A.baumannii
GN
E. cloacae
GN
E. cloacae
GN
K.penumoniae
GN
N. meningitides
GN
K.pneumoniae
GN
K.pneumoniae
GN
P.aeruginosa
GN
P.aeruginosa
GN
Enerobacter spp.
GN
S.maltophilia
GN
S.maltophilia
GN
K.pneumoniae
GN
K.oxitoca
GN
K.pneumoniae
GN
K.penumoniae
GN
E.coli
GN
E.coli
GN
K.pneumoniae
GN
E.aerogenes
GN
E.coli
GN
K.penumoniae
GN
K.penumoniae
GN
E.coli
GN
L. adecarboxylata
GN
P.aeruginosa
GN
Salmonella spp.
GN
P. aeruginosa
ESβL
IMI/MERO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
SIM
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
NÃO
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
NÃO
SIM
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
SIM
SIM
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
NÃO
R/I
R/R
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
R/R
R/R
R/R
R/R
TEMPO
LIBERAÇÃO
GRAM
1
1
1
1
1
2
CTX-M
1
1
1
3
2
CTX-M
1
1
1
1
1
3
2
2
4
1
2
1
1
1
CTX/TEM
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
KPC
1
3
1
1
5
3
1
1
1
1
1
1
1
1
2
SHV/CTX-M
2
2
CTX-M
1
1
1
2
1
1
1
1
5
1
3
2
4
1
GN/GP GENES RES
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
GN
Informações do Prontuário
TEMPO
LIBERAÇÃO
HMC
3
3
3
2
3
3
3
3
2
5
3
3
3
4
3
3
5
3
4
4
5
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
5
4
4
2
4
6
4
4
2
3
3
3
3
3
3
4
3
3
4
3
2
3
3
3
4
6
6
3
6
4
6
3
TRAT. NA
COLETA DA
HMC
A
A
A
A
A
A
I
I
A
A
A
I
A
A
A
A
A
A
A
A
I
A
I
A
A
A
I
I
I
A
I
A
A
A
A
A
A
I
A
A
I
I
I
I
A
A
A
A
A
I
I
A
A
A
I
A
A
A
A
A
I
I
A
A
A
A
A
TRAT. APÓS TRAT. APÓS
GRAM DA HMC FINAL HMC
A
A
A
A
A
A
I
A
A
A
I
A
A
A
A
A
A
A
A
A
I
A
I
A
A
A
I
I
I
A
I
A
A
A
A
A
A
I
A
A
I
I
A
A
A
A
A
A
I
I
A
A
A
I
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
I
A
A
A
I
A
A
A
A
A
A
A
A
A
I
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Trat.= Tratamento; HMC= Hemocultura; IMI = Imipenem; Mero = Meropenem; GP=
Gram Positivo; GN= Gram Negativo
110
RESULTADOS
14
12
10
8
Numero de pacientes
6
Porcentagem de
pacientes
4
2
0
Coleta da
Gram da
Final da
Hemocultura Hemocultura Hemocultura
que foram isoladas bactérias Gram negativas não fermentador, recebendo
tratamento inadequado no momento da coleta da hemocultura, depois do
resultado do Gram da hemocultura e depois do resultado final da Hemocultura.
111
RESULTADOS
25
20
15
Numero de pacientes
10
Porcentagem de
pacientes
5
0
Coleta da
Hemocultura
Gram da
Hemocultura
Final da
Hemocultura
que foram isoladas bactérias Gram negativas Enterobacteriaceas, recebendo
tratamento inadequado no momento da coleta da hemocultura, depois do
resultado do Gram da hemocultura e depois do resultado final da Hemocultura.
112
DISCUSSÃO
6. DISCUSSÃO
Infecções de Corrente Sanguínea é uma das infecções mais sérias que
um paciente hospitalizado pode apresentar, sendo o quadro agravado quando
se trata de pacientes em recuperação ou em condições debilitantes. Em
pacientes
transplantados
de
órgão
sólidos,
bacteremia
é
uma
das
complicações mais frequentes e está fortemente associada a altas taxas de
morbidade e mortalidade (Singh et al., 2000).
O diagnóstico precoce de ICS é essencial para a instituição de uma
terapia adequada em casos de pacientes transplantados favorecendo uma
maior chance de sobrevida e sucesso pós-transplante. Entretanto, a
terapêutica empírica pode ser dirigida a bactérias Gram positivas ou Gram
negativas, e mesmo para leveduras, dependendo das características clínicas
dos pacientes. Além disso, a probalilidade de bactérias carreando diversos
genes de resistência dificulta a adequação terapêutica que se confirma apenas
com o resultado final da identificação do microrganismo e antibiograma,
geralmente em não menos de 72 horas após a coleta da hemocultura mesmo
com a utiização de métodos fenotípicos automatizados. A utilização de testes
moleculares para a detecção precoce de microrganismo em corrente
sanguínea e a detecção de genes de resistência pode trazer contribuição para
a
adequação
do
tratamento
antimicrobiano
com
diminuição
de
morbi/mortalidade (Ferraresso & Berardineli, 2005).
O uso da técnica da PCR para fins de diagnóstico estabelece a nova era
na detecção e caracterização de microrganismo direto de amostras clínicas. A
partir do uso rotineiro da PCR, outros métodos e aplicações puderam ser
elaborados entre elas a PCR Multiplex e a técnica da PCR em Tempo Real.
113
DISCUSSÃO
Esta ultima é um refinamento da técnica original de PCR, pois combinam a
amplificação e a quantificação de uma sequência de DNA alvo por meio da
detecção de fluorescência. É considerado um método homogêneo de
amplificação de DNA, no qual amplificação e detecção são realizadas no
mesmo tubo de reação, podendo eliminar processamentos pós-PCR (corrida
de eletroforese em agarose), diminuindo o manuseio de produtos de
amplificação e o risco de contaminação cruzada (Hayden, 2004).
A abordagem da PCR em Tempo Real para fins de diagnóstico tem
ganhado crescente aceitação como uma técnica de laboratório adequado,
porém, a interpretação dos resultados pode ser duvidosa. A amostra poderia
ser considerada negativa, enquanto que ela contém o patógeno (resultado falso
negativo). Tal situação pode ocorrer devido à baixa concentração de
patógenos, ou quando a amostra apresentar inibidores de PCR. Em contraste,
a amostra poderia ser considerada como positiva, enquanto ele não contém o
patógeno (resultado falso positivo). Esta situação pode ser encontrada quando
o desenho dos iniciadores e / ou sonda não são ideais, ou em caso de
contaminação do DNA, durante a etapa de extração, ou durante a PCR, como
mostrado por Stals e colaboradores (2009) para PCR em Tempo Real. Embora
estes problemas possam ser minimizados com o uso de controles adequados,
é de fundamental importância a determinação do cutoff (Limite de Detecção
Branco- LoB) e de um limite de detecção (LoD) do método para ajudar na
interpretação confiável.
No presente estudo foram realizados os cálculos do LoD e cutoff para o
gene 16S rDNA para detecção de bactérias Gram positivos e Gram negativos
além dos genes de resistência. Porém, para os genes blaIMP, blaSPM e blaVIM, a
114
DISCUSSÃO
interpretação dos resultados foi conforme Mendes e colaboradores (2007).
Além dos cálculos do LoD e Cutoff foi realizada, através da curva ROC, uma
análise direta de especificidade e sensibilidade dos iniciadores para os genes
estudados. Através do LoD e cutoff fica possível a interpretação confiável dos
resultados de forma qualitativa (presença e ausência).
O limite de detecção de Unidade Formadora de Colônia (UFC) por
reação para os respectivos genes em estudo mostrou o teste muito sensível,
sendo possível a detecção dos genes na presença de 15 á 1,5 UFC, porém
quando determinado o Cutoff e o LoD este limite aumenta a UFC por reação
para a maioria dos genes avaliados. Para o genes blaKPC, blaSHV e blaCTX-M a
especificidade mostrou-se mais baixa quando comparamos com os demais
genes, já os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e vanB mostrou uma sensibilidade
mais baixa quando comparados com os demais genes. Levando-se em conta
que se trata de um teste elaborado para ser aplicado diretamente em amostras
clínicas, há a prioridade de manter uma boa sensibilidade com uma boa
especificidade. Para PCR em Tempo Real quanto maior o tamanho do produto
de amplificação maior é a especificidade e menor a sensibilidade do teste. E a
baixa sensibilidade encontrada para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M e vanB
pode ser devido ao tamanho dos produtos amplificados (Dorak, 2006) pois, os
iniciadores utilizados para estes genes foram os mesmos utilizados em PCR
convencional, que formam produtos de amplificação entre 700 a 1000 pb, para
posteriormente serem direcionados para o seqüenciamento. Outro motivo para
esses genes não terem sido detectados é por haver muito DNA não do gene
procurado. Uma quantidade muito grande de DNA humano pode atrapalhar a
amplificação do gene procurado e também a presença de excessos de
115
DISCUSSÃO
inibidores que o método de extração não retirou. A solução dessas
interferências deve aumentar a sensibilidade do teste.
A diminuição da especificidade para detectar Gram negativos pode ser
devido ao fato de haver interferência quanto à Taq polimerase. As preparações
podem conter uma quantidade pequena de DNA contaminante proveniente de
Escherichia coli ou Thermus aquaticus (Okhravi et al., 2000b, Carroll et al.,
1999) e também de Pseudomonas spp., Sphingomonas spp., Moraxella spp. e
AcinetobaCter spp. (Mühl et al., 2008), que podem ser suficientes para
amplificação de sinal positivo após amplificação pela metodologia da PCR em
Tempo Real. Quando a técnica de PCR em Tempo Real é utilizada para a
detecção de patógenos em amostras clínicas com pequena quantidade de DNA
a presença de sinal positivo para os controles negativos pode dificultar a
interpretação dos resultados das amostras positivas (Klaschik et al., 2002).
Levando-se em conta que estes genes (blaCTX-M e blaSHV) podem ser
encontrados nessas bactérias, a interferência é ainda maior.
Em um recente estudo, Lehmann e colaboradores (2008) avaliaram a
aplicação da PCR em Tempo Real na detecção de patógenos no sangue pelo
Kit LightCycler SeptiFast® (Roche-Molecular Diagnosis) e comparou os
resultados com os obtidos pelo Bactec® 9240 (Becton Dickinson GmbH,
Germany). Kit LightCycler SeptiFast® é padronizado para utilização no aparelho
automatizado SeptiFast, no qual a partir da amplificação do DNA, realliza-se in
vitro a identificação das 25 espécies mais importantes de bactérias e fungos
diretamente do sangue. Das 114 amostras positivas para a PCR, 46 foram
negativas pelo Bactec®. Das 58 amostras positivas para ambos os testes, 18
foram discordantes, podendo ter ocorrido tanto por algumas espécies que
116
DISCUSSÃO
foram identificadas pelo Bactec® não se encontrarem no painel de identificação
do SeptiFast ou porque foram consideradas contaminações na hemocultura.
No presente estudo, não houve discordância quanto a detecção de
bactérias Gram positivas e Gram negativas pelo método fenotípico de
coloração de Gram e a PCR em Tempo Real para o gene 16S rDNA. Contudo,
para esta avaliação foram excluídas 5 amostras que apresentavam bactérias
Gram negativas e 19 amostras que apresentavam bactérias Gram positivas.
Esta conduta foi necessária porque durante o desenvolvimento do trabalho
houve necessidade de resintetizar as sondas de Gram positivo e Gram
negativo. Porém estas amostras não foram excluídas das outras etapas do
estudo e foram avaliadas quanto à presença de genes de resistência. Uma
amostra identificada com a presença de uma bactéria Gram positiva e outra
Gram negativa foi positiva apenas para a sonda de Gram negativo, sendo a
bactéria Gram positiva não detectada. A bactéria Gram positiva se tratava de
um S. haemolyticus. Em hemoculturas é comum a contaminação da amostra
por esses microrganismos no momento da coleta. Em estudos, a taxa de
amostras consideradas contaminadas por SCoN chega a ser de 26% (Ikegaya
et al,, 2010) já que se trata de bactérias colonizantes da pele. Apesar deste
dado demonstrar a dificuldade do método em detectar a presença de diferentes
microrganismos, houve 100% de concordância entre a detecção de bactérias
Gram positivas e Gram negativas quando comparado com o método fenotípico.
Trabalhos que avaliam a prevalência de bactérias Gram positivas e
Gram
negativas
transplantados
de
presentes
em
hemoculturas
órgão
sólidos
apontam
referentes
para
à
maiores
pacientes
taxas
de
microrganismos Gram negativos (Bert et al., 2010; Silva Jr et al., 2010; Linares
117
DISCUSSÃO
et al., 2009; Al-Hasan et al., 2008). Porém, este dado pode variar de acordo
com o perfil epidemiológico da região estudada e do Hospital (Berger et al.,
2006). Neste estudo, a prevalência de bactérias Gram negativas foi de 53,17%,
e de Gram positivas de 46,83%, havendo pouca diferença entre as incidências.
Dentre as espécies Gram negativas identificadas no presente estudo
pelo sistema automatizado, K. pneumoniae foi a mais prevalente sendo que
destas, 90 % foram ESβL positivo e 2 resistentes a carbapenemicos. Na
literatura, esta espécie se apresenta entre os principais microrganismos isolado
em hemoculturas, inferior apenas a E. coli, sendo a taxa de exemplares ESβL
positivo bastante alta ( Linares et al., 2010; Andrade et al., 2008).
Dentre
as
espécies
Gram
positivas
identificadas,
o
gênero
Staphylococcus foi a mais prevalente. Destas, 59% apresentaram resistência a
oxacilina pelo sistema automatizado Phoenix®.
No presente estudo houve
predomínido de SCoN em relação a S. aureus, com altas taxas de resistência a
oxacilina, o mesmo encontrado na literatura (Gales et al., 2009). Em relação
ao
gênero
enterococcus,
este
é
comumente
isolado
em
pacientes
transplantados de órgão sólidos, especialmente em transplante de rim e fígado
(Patel et al.,2001).
Relatórios recentes mostram uma prevalência de colonização por VRE
entre 3,4% e 55% (Freitas et al., 2006; Hagen et al., 2003; Bakir et al.,
2001) e de infecção entre 4% e 11% (Patel et al., 2001; McNeil et al., 2005) em
transplantados de fígado e rim, respectivamente. Neste estudo houve 8,3% dos
casos de ICS por enterococos, porém nenhum isolado foi VRE.
Quando comparado os resultados dos testes de susceptibilidade em
isolados Gram negativos, liberados pelo sistema automatizado em relação a
118
DISCUSSÃO
PCR em Tempo Real para os genes de resistência, o método fenotípico
apontou a presença de 24 amostras ESβL positiva. Destas 24, apenas 4
apresentaram PCR positivo para ESβL direto da hemocultura. Uma amostra foi
ESβL positiva pelo método da PCR, mas não pelo método fenotípico. Porém,
quando avaliados os 15 isolados bacterianos referentes às hemoculturas em
que houve discordância entre a presença de ESβL pelo método automatizado e
a detecção molecular, uma amostra não confirmou ser ESβL pela técnica
fenotípica de disco aproximação.
Das 14 amostras em que foi confirmado a presença ESβL pelo método
da disco aproximação, 9 foram positivas para pelo menos um gene de ESβL,
sendo que destas, 6 que foram negativas para o gene ESβL
direto da
hemocultura mas foram positivas direto da colônia. Em 3 amostras houve
detecção de ESβL tanto na amostra de hemocultura quanto direto da colônia,
porém em uma destas amostras foi detectado direto da hemocultura o gene
blaCTX-M e na colônia apenas blaSHV e em outra havia sido detectado os genes
blaCTX-M e blaTEM e direto da colônia foi detectado apenas o gene blaCTX-M. Para
os resultados que foram ESβL positivo pelo sistema, mas negativa para a PCR
direto da amostra clínica quanto do isolado, possivelmente se trata de outro
mecanismo de resistência ou uma ESβL diferente das pesquisadas no estudo.
Quanto aos resultados em que houve detecção do gene de ESβL direto do
isolado, mas não direto da amostra clínica, este fato pode ser explicado por se
tratar de concentrações diferentes de DNA, isto é, na hemocultura a quantidade
de DNA era inferior a necessária para ser detectada pelo teste. A sensibilidade
do teste pode ser otimizada diminuindo o tamanho do produto de amplificação
fazendo-se novos desenhos de iniciadores para os respectivos genes.
119
DISCUSSÃO
O mesmo ocorreu para o gene blaKPC. Duas amostras de K. pneumoniae
foram resistentes a carbapenemicos, porém negativas para a PCR do gene
blaKPC direto
da
amostra
clínica.
Outra
amostra,
sensível
para
os
carbapenemicos foi positiva para a PCR do mesmo gene. Ao avaliarmos estas
amostras, elas foram isoladas do mesmo paciente. Foram então estudados 5
isolados bacterianos pertencentes a este mesmo paciente e que se
encontravam armazenadas no banco de microrganismos do LEMC. Dos 5
isolados, todos foram resistentes a ertapenem pelo método da disco difusão e
positivo para blaKPC. Este fato pode ser explicado como para ESβL. A
sensibilidade do teste foi reduzida ou por não haver quantidade de DNA
suficiente para ser detectado direto da amostra clínica ou também pela redução
da sensibilidade direto da amostra clínica devido ao tamanho do produto de
amplificação para este gene.
Já para Gram positivos, no caso o gene mecA, a concordância foi maior.
O tamanho do produto de amplificação para este gene é menor interferindo
menos na sensibilidade do teste. Das 32 hemoculturas positivas para o gene
mecA pela técnica da PCR em Tempo Real, apenas 6 foram sensíveis a
oxacilina pelo sistema automatizado e uma se tratava de um Enterococcus.
Nesta amostra possivelmente houve interferência ou por alguma contaminação
na coleta ou por uma infecção prévia com algum microrganismo do gênero
Staphylococcus. Quanto as 5 hemoculturas citadas anteriormente, quatro eram
S. aureus e 1 S. epidermidis. Os isolados bacterianos referentes a essas
hemoculturas retirados do banco de microrganismos do LEMC foram testados
pelo método fenotípico E-test para avaliação da susceptibilidade a oxacilina e
PCR direto da colônia. Quatro destes isolados foram sensíveis a Oxacilina e
120
DISCUSSÃO
negativos para a PCR em Tempo Real para o gene mecA. Porém, uma
amostra de S.aureus, foi resistente ao antimicrobiano em questão e positivo
para o gene mecA, neste caso foi considerado erro “muito grave”. A
metodologia da PCR em Tempo Real para este gene se apresentou mais
sensível. É comum a presença de contaminação em hemoculturas de SCoN e
estes são avaliados como contaminantes ou causadores da bacteremia de
acordo com a análise do médico que acompanha ao paciente. Esta
interferência do gene mecA ou por contaminantes ou por infecções prévias
pode
acarretar
resultados
falso
positivos.
Porém,
nenhuma
amostra
verdadeiramente resistente a oxacilina e positiva para o gene mecA deixou de
ser detectada, sendo este erro considerado erro “grave”. Em um recente
trabalho elaborado por Yanagihara e colaboradores, 2010, em que foi avaliada
a concordância entre a detecção de isolados de Staphylococcus resistentes a
oxacilina pelo método fenotípico e a detecção do gene mecA pelo Kit de
detecção SeptiFast®, o método molecular não foi capaz de detectar o gene
mecA em 2 amostras. Os autores sugerem que isto foi devido à diferença de
sensibilidade entre os dois testes (um foi realizado direto da amostra clinica e o
outro direto do isolado). De acordo com os resultados apresentados em nosso
estudo, a sensibilidade para o gene mecA foi capaz de detectar falso-positivo
mesmo direto de amostras clínicas, sendo alta a sensibilidade para o gene.
No Brasil, se encontram dois dos maiores centros que realizam
transplantes na América Latina. Estes são os HSP e HRH. Silva Jr e
colaboradores (2010) avaliaram todos os transplantes renais realizados nestes
dois centros entre os anos de 2000 a 2006. Um total de 3308 transplantes de
rim foram realizados. Mais de 50% dos casos foi referente a doador vivo e
121
DISCUSSÃO
receptor do sexo masculino. A incidência de ICS foi de 4,1% (185) sendo a
média de tempo pós-transplante para a ocorrência de infecção de 235 dias. No
presente estudo, só foram avaliados os transplantes em que ocorreu suspeita
de bacteremia. Dos 117 pacientes incluídos no estudo, a maioria (72%) foi do
sexo masculino e quase 90% foram submetidos a transplante de rim. O tempo
médio de pós-transplante até a coleta da hemocultura foi de 331 dias e quase
75% dos pacientes receberam transplante de doador falecido.
Não existe na literatura um consenso quanto ao maior risco de infecção
referente a transplante proveniente de doador vivo ou doador falecido. (Spees
et al., 1982; Dantas et al., 2006). Porém, alguns autores sugerem que o risco
infeccioso é maior em transplante de doador falecido. Isto se refere às
condições desfavoráveis do enxerto e a menor compatibilidade entre doador e
receptor, havendo a necessidade de tratamento imunossupressor mais
acentuado, facilitando os episódios de infecção (Dantas et al., 2006).
Normalmente, quando se refere a transplantes de rim, o número de
transplantes por doador vivo supera aos de doador falecido. Porém no presente
estudo, como referido anteriormente, só foram avaliados os episódios de
infecção, sendo assim a taxa de doador falecido foi superior.
O interesse da aplicação de um método molecular para o diagnóstico
direto de uma amostra clínica tem como principal objetivo a diminuição no
tempo do resultado, a escolha da terapia adequada em menor tempo, além de
maior sobrevida dos pacientes. A padronização aqui apresentada, leva em
média 8 horas para ser executada, desde o recebimento da hemocultura
positiva ou negativa pelo aparelho Bactec® até o resultado dos genes de
resistência. Levando-se em conta que quando o frasco de hemocultura é
122
DISCUSSÃO
aplicado ao método molecular já foi realizada a coloração de Gram pelo
laboratório de análises clínicas, o resultado de Gram positivo e Gram negativo
pelo método molecular pode não colaborar na rapidez do resultado.
Porém, no mesmo dia em que é realizada a PCR para a detecção da
presença de bactérias Gram negativas e Gram positivas pelo método
molecular, já é possível a avaliação da presença de genes que conferem
resistência. Considerando que a liberação do resultado final da hemocultura
levou de 3 a 4 dias para ser liberado pelo laboratório clínico após a positividade
pelo Bactec®, o método molecular poderia ser útil na antecipação do resultado
do gene de resistência.
Quanto ao tratamento dos pacientes apresentando hemoculturas
positivas para Gram positivos observamos uma inadequação da utilização
empírica em 11,86% na coleta da hemocultura, diminuindo para 6,78% quando
da liberação do resultado do Gram da hemocultura. O resultado final da
hemocultura incluindo o antibiograma não modificou a inadequação restante de
6,78% observada, sendo a maioria devido a hemoculturas positivas para
SCoN. Portanto, o nosso resultado molecular quando da realização do Gram
da hemocultura traria pouca contribuição para a adequação antimicrobiana
nessa população de pacientes e nessas instituições. Entretanto, poderia trazer
contribuição para racionalização do uso de antimicrobianos em hemoculturas
positivas para amostras sensíveis à oxacilina com gene mecA negativo. Em um
estudo realizado por Cattoir e colaboradores, 2011, houve 100% de
concordância entre o método fenotipico e molecular para detecção do gene
mecA em isolados do gênero Staphylococcus, porém muitos dos casos foram
definidos como uma possível contaminação da amostra pelo micorganismo
123
DISCUSSÃO
isolado. Neste mesmo estudo foi avaliada a possibilidade de interferência do
método molecular na adequação da antibióticoterapia e concluiu-se que a
rápida identificação de S. aureus e determinação de suscetibilidade à oxacilina
usando uma técnica de PCR não teve um impacto clínico importante devido ter
ocorrido 100% de concordância e pelo perfil de tratamento usado naquela
instituição.
No
presente
estudo
avaliamos
também
o
descalonamento
da
antibioticoterapia. De acordo com os resultados apontados, a PCR poderia ser
útil em 16 dos casos em que pacientes se encontravam em uso de
vancomicina e eram sensíveis a oxacilina. Destes casos, 11 poderiam ter sido
beneficiados pelo resultado negativo para o gene mecA e a antibioticoterapia
poderia ter sido modificada para oxacilina.
Para bacilos Gram negativos não fermentadores observamos uma
inadequação de 7,5% no momento da coleta da hemocultura, diminuindo para
4,48% quando da liberação do resultado do Gram da hemocultura, e uma
queda importante da inadequação (1,51%) apenas quando do resultado final da
hemocultura. Não houve detecção de nenunha metalo-β-lactamase. Para
enterobacterias observamos uma inadequação de 20,9% no momento da
coleta da hemocultura, diminuído para 16,42% quando da liberação do
resultado do Gram da hemocultura, e uma queda ainda mais significante
quando do resultado final da hemocultura (2,99%). Destas 2,99% apenas uma
hemocultura foi positiva para ESβL pelo método da PCR porém, o tratamento
continuou inadequado. Uma amostra apresentou PCR positivo para blaKPC e
neste caso houve adequação na antibioticoterapia. Sendo assim, a PCR para
esta amostra poderia antecipar a escolha do tratamento.
124
DISCUSSÃO
Em algumas amostras, não houve a detecção do mecanismo de
resistência, ou porque como foi sugerido anteriormente o método da PCR para
alguns genes estudados não foi sensível o suficiente para detectá-los direto da
hemocultura ou porque se tratava de outro mecanismo. Em bactérias Gram
negativas há um extenso tipo de mecanismos que podem levar a resistência
nessas bactérias. Entre eles, outras cabapenemases sem ser as que foram
estudas como, por exemplo, as carbapenemases do tipo OXA, além de
alterações em porinas, outras ESβL além das estudadas (Bush, 2010) e
aumento da expressão de bombas de efluxo (Lister et al., 2009). Em Gram
negativos fica difícil a possibilidade do teste colaborar num descalonamento do
tratamento, pois quando a PCR for negativa para os genes estudados, poderá
haver outro mecanismo e sendo assim a bactéria poderá ser resistente ao
antibiótico de escolha.
Para Gram negativos, houve uma considerável redução da inadequação
do tratamento após o resultado do Gram na hemocultura. Os resultados
moleculares aqui apresentados concordaram em 100% com os fenotípicos
quando para detecção de bactérias Gram positivas e Gram negativas. Assim
sendo, se o teste fosse realizado de amostras extraídas do sangue, por EDTA,
seria possível contribuir para que fosse alterado o tratamento empírico. De
acordo com os dados apontados no presente estudo, o tratamento empírico foi
inadequado em 28, 4% dos casos em que houve ICS causada por bactérias
Gram negativas. Na literatura há relatos de taxas de até 23,5% de tratamentos
empíricos inadequados, sendo que 54% são em ICS por bactérias Gram
negativas (Zaragoza et al., 2003).
125
DISCUSSÃO
Em relação à racionalização do uso de antimicrobianos, 11 pacientes
com bactérias Gram positivas isoladas em hemocultura e sensíveis a oxacilina
foram tratados com vancomicina. Apesar de 2 isolados sensíveis terem
apresentado gene mecA (falsos positivos), em 9
a ausência na detecção
molecular deste gene poderia ter auxiliado o descalonamento do antibiótico
(troca da vancomicina pela oxacilina). Já em relação aos Gram negativos o
contrário foi observado, o escalonamento foi realizado na maioria dos casos de
inadequação.
O tempo mediano para liberação do resultado final foi de 4 dias. Com a
aplicação da detecção molecular dos genes de resistência pela técnica de PCR
multiplex é possível reduzir o tempo para reajuste da terapia empírica. Como já
demonstrado neste trabalho, poderíamos reduzir as taxas de inadequação aos
antimicrobianos de 13,56% para 8,48% para Gram positivos e de 28,4% para
4,5% em relação aos Gram negativos. Apesar de existir poucos dados de
literatura, acreditamos que o ajuste precoce da terapia empírica utilizada
contribui no curso do tratamento do paciente.
Pretendemos dar continuidade a este estudo, agora avaliando a
detecção bacteriana e de genes de resistência direto do sangue coletado para
hemoculturas, aproveitando a experiência adquirida com a padronização dos
testes moleculares.
126
CONCLUSÕES
7. CONCLUSÕES
 Os ensaios moleculares foram capazes de detectar os genes de
interesse na diluição corresponde a 15 UFC até 1.5 UFC, porém com
baixa sensibilidade para os genes com produtos de amplificação entre
700 a 1.000 pares de bases e alta especificidade;
 Observamos 100% de concordância entre a detecção bacteriana pelo
método de hemocultura automatizado com coloração de Gram e a PCR
em Tempo Real direto do frasco de hemocultura;
 Para os genes de resistência a antimicrobianos em bactérias Gram
positivas observamos 87,6% de concordância na detecção do gene
mecA;
 Para os genes de resistência a antimicrobianos em bactérias Gram
negativas observamos maior variabilidade entre a detecção fenotípica e
molecular;
 A detecção de genes de resistência a antimicrobianos favoreceria a
adequação da antibioticoterapia, particularmente no descalonamento no
tratamento de bacteremias causadas por bactérias Gram positivas e na
adequação precoce no tratamento de bacteremias por bacilos Gram
negativas multiresistentes em pacientes tranplantados de órgãos
sólidos;
127
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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148
ABSTRACT
9. ABSTRACT
Solid organ transplanted patients are at high risk for blood stream infection. The
institution of appropriate antimicrobial therapy guided by a rapid and accurate
microbiological diagnosis of blood stream infections is related to a successful outcome.
The aim of this study was the detection of Gram-positive and Gram-negative bacteria
from automated blood cultures (Bactec®, Becton Dickinson) with the use of the
multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) and detection of antimicrobial
resistance genes. Methods:
A total of 185 blood cultures, 126 positive and 59
negative, were obtained of 117 patients submitted to solid organ transplant at two
transplant centers in the city of São Paulo, Brazil, Hospital São Paulo and Hospital do
Rim e Hipertensão. DNA from the blood cultures was extracted by phenol chloroform
method (Brazol®, LGC, Brazil). The detection of bacterial DNA was performed using
universal primers of 16S rRNA gene. The differentiation between Gram-positive and
Gram-negative bacteria was done by hybridization with Gram-specific probes by
multiplex real-time TaqMan. The resistance genes: blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, blaKPC,
blaSPM, blaVIM, blaIMP, vanA, vanB and mecA were detected using specific primers by
real-time SYBR Green. The adequacy of antimicrobial treatment was evaluated by
reviewing the records of patients. Results: Fifty nine samples were positive for Grampositive and sixty seven samples were positive for Gram-negative. All samples (100%)
were concordant between blood culture and PCR. Thirty two samples were positive for
mecA gene, five for blaCTX-M gene, one for blaKPC gene, one for blaSHV gene and one for
blaTEM. Eighty eight were negative for all genes. The detection of antimicrobial
resistance genes could
enhance
the appropriateness of
antibiotic
therapy,
particularly in descalation the treatment of bacteremia caused by Gram positive and
early adequacy in the treatment of Gram negative bacteremia of solid organ
transplanted patients. Conclusion: The in house multiplex PCR for Grampositive/Gram-negative bacteria and detection of antimicrobial resistance genes by
Real Time PCR could be useful for rapid diagnosis of bloodstream infection in patients
undergoing solid organ transplant.
149
ANEXOS
ANEXOS
150
ANEXOS
10. ANEXOS
ANEXO 1. Dados referentes aos 117 pacientes e 185 hemoculturas
incluídas no estudo.
Dados do Paciente
Nº Hemo Nº Paciente Idade
Sexo
1
1
47
M
2
2
67
M
3
2
67
M
4
3
35
M
5
4
36
M
6
5
18
F
7
5
18
F
8
6
43
M
9
7
65
F
10
8
14
F
11
9
55
F
12
10
22
M
13
10
22
M
14
11
32
M
15
11
33
M
16
11
32
M
17
11
32
M
18
12
65
M
19
13
68
M
20
14
52
M
21
15
59
M
22
16
27
M
23
17
63
M
24
18
60
M
25
18
60
M
26
19
59
M
27
20
59
M
28
21
35
F
29
21
35
F
30
22
46
M
31
22
46
M
32
23
31
F
33
24
37
M
34
25
39
M
35
26
50
F
36
27
35
F
37
28
28
F
38
29
49
F
39
29
49
F
40
30
41
M
41
30
41
M
42
31
46
F
43
32
56
M
44
33
45
M
45
33
45
M
46
33
45
M
47
34
25
M
48
35
62
F
49
35
62
F
50
35
62
F
51
36
49
F
52
37
53
M
53
37
53
M
54
38
46
M
55
39
2
M
56
39
2
M
57
40
62
M
58
40
62
M
59
40
62
M
CC
HRH
HSP
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
Método Fenotipico
Bactec/Phoenix
E.coli
M. morganii
M. morganii
NEGATIVO
NEGATIVO
S.aureus
S.aureus
NEGATIVO
E.coli
A.baumannii
S.aureus
S.epidermidis
S.haemolyticus
NEGATIVO
NEGATIVO
SCN
E.coli
E.coli
P.aeruginosa
E.coli
NEGATIVO
NEGATIVO
SCN
NEGATIVO
NEGATIVO
Salmonella spp.
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
S.epidermidis
E.coli
S.haemolyticus
E.coli
NEGATIVO
S.epidermidis
E.coli
E.coli
E.coli
S.epidermidis
S.epidermidis
S.haemolyticus
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.pneumoniae
S.capitis
E.faecim
E.faecim
E.faecim
Enterobacter spp.
NEGATIVO
NEGATIVO
P.aeruginosa
SCN
NEGATIVO
NEGATIVO
SCN
SCN
Órgão Trans
RIM
CORAÇÃO
CORAÇÃO
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
FIGADO
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
Dados do TX
Tipo Doador
Data TX
Tempo TX
FALECIDO
23/02/2009
140
FALECIDO
27/08/1990
7300
FALECIDO
27/08/1990
7300
FALECIDO
18/03/2009
150
FALECIDO
23/10/2006
675
FALECIDO
30/12/2008
0
FALECIDO
30/12/2008
1
FALECIDO
10/04/2004
1825
FALECIDO
06/06/2009
82
FALECIDO
22/12/2009
8
FALECIDO
03/10/2005
25
VIVO
08/12/2008
30
VIVO
08/12/2008
30
FALECIDO
22/12/2006
820
FALECIDO
22/02/2009
60
FALECIDO
22/12/2006
23
FALECIDO
22/12/2006
790
VIVO
23/11/2009
16
FALECIDO
11/06/2005
1365
FALECIDO
04/02/2009
150
FALECIDO
08/02/2004
1945
FALECIDO
29/09/2009
120
FALECIDO
28/06/2009
10
FALECIDO
03/10/2007
730
FALECIDO
03/10/2007
790
VIVO
14/09/2008
210
FALECIDO
27/10/2009
60
VIVO
30/01/2009
60
VIVO
30/01/2009
30
VIVO
22/08/2009
150
VIVO
22/08/2005
10
VIVO
18/02/2009
75
FALECIDO
15/02/2009
14
VIVO
03/07/1996
4859
FALECIDO
24/04/2009
7
FALECIDO
02/01/2009
75
FALECIDO
13/11/2008
365
FALECIDO
24/10/2009
20
FALECIDO
24/10/2009
60
VIVO
17/08/2008
13
VIVO
17/08/2008
13
FALECIDO
07/11/2009
4
FALECIDO
12/04/2009
1
VIVO
11/05/2004
1
VIVO
11/05/2004
1
VIVO
11/05/2004
0
VIVO
16/08/2009
6
FALECIDO
28/07/2009
1
FALECIDO
28/07/2009
1
FALECIDO
28/07/2009
1
FALECIDO
28/08/2009
10
FALECIDO
06/03/2006
1305
FALECIDO
06/03/2006
1305
VIVO
18/06/2009
190
FALECIDO
22/05/2009
8
FALECIDO
22/05/2009
9
FALECIDO
02/03/2009
30
FALECIDO
02/03/2009
31
FALECIDO
02/03/2009
32
151
ANEXOS
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
40
41
42
42
43
43
43
44
45
46
46
47
47
47
48
49
50
51
51
52
53
53
54
55
56
56
56
57
58
59
60
60
61
62
63
64
64
64
64
64
64
64
64
64
64
65
65
65
65
66
67
68
69
70
70
71
72
73
74
75
76
62
67
47
47
11
11
11
32
37
40
40
59
59
59
36
23
45
54
54
20
37
37
47
67
55
55
55
60
60
52
50
50
54
59
24
43
43
43
43
43
43
43
43
43
43
62
62
62
62
47
33
3
32
55
55
35
40
55
62
40
40
M
M
M
M
M
M
M
F
M
M
M
M
M
M
F
M
M
M
M
M
M
M
M
F
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
F
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
F
M
F
M
M
M
M
M
M
M
M
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HSP
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HRH
A.baumannii
S.pneumoniae
NEGATIVO
K.pneumoniae
Ac. Spp/ S. haemo.
NEGATIVO
S. warneri
B.cepacia
SCN
S.aureus
S.aureus
NEGATIVO
NEGATIVO
E.aerogenes
K.pneumoniae
SCN
S.aureus
E.coli
E.coli
NEGATIVO
NEGATIVO
P.mirabilis
Listeria spp.
C.jeikeiun
L. monocytogens
Listeria spp.
Listeria spp.
K.pneumoniae
S.aureus
NEGATIVO
S.equorum
S.epidermidis
S.aureus
NEGATIVO
S.aureus
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
NEGATIVO
NEGATIVO
E.faecalis
Enterobacter spp.
S.aureus
E.coli
A.baumannii
NEGATIVO
E. cloacae
E. cloacae
NEGATIVO
NEGATIVO
K.pneumoniae
N. meningitides
NEGATIVO
S.epidermidis
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
FIGADO
FIGADO
FIGADO
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/FIGADO
RIM
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47
0
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1
12
12
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20
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210
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4
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12
25
25
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0
0
1
2
10
11
11
19
19
32
32
44
44
31
39
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65
1
4
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8
33
5
60
60
60
1305
13
1901
240
1
152
ANEXOS
121
122
123
124
125
126
127
128
129
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131
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77
77
78
79
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81
81
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88
88
88
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90
90
91
92
92
92
93
93
94
95
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97
97
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99
99
99
100
101
102
102
103
104
104
105
106
106
106
106
107
107
108
108
109
110
110
110
111
112
113
41
41
30
18
44
49
49
49
38
42
52
53
57
46
46
46
51
51
51
51
58
58
58
21
70
70
70
39
39
56
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42
20
40
40
40
52
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38
67
46
46
57
64
64
64
64
57
57
32
32
54
17
17
17
55
31
74
M
M
M
M
M
M
M
M
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M
F
F
F
F
F
F
M
M
M
M
M
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F
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M
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F
M
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M
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M
M
M
M
M
M
M
M
M
F
F
F
F
F
F
M
F
M
HSP
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HSP
HSP
HSP
HSP
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
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HRH
HRH
HRH
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HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
HRH
K.pneumoniae
K.pneumoniae
SCN
NEGATIVO
S.epidermidis
S.epidermidis
P.aeruginosa
P.aeruginosa
NEGATIVO
SCN
NEGATIVO
NEGATIVO
Enterobacter SPP.
NEGATIVO
NEGATIVO
S.maltophilia
S.aureus
S.aureus
S.aureus
S.maltophilia
NEGATIVO
K.pneumoniae
K.oxytoca
NEGATIVO
NEGATIVO
E.durans
K.pneumoniae
NEGATIVO
NEGATIVO
S.epidermidis
NEGATIVO
S.aureus
NEGATIVO
K.pneumoniae
E.coli
NEGATIVO
E.coli
K.pneumoniae
NEGATIVO
E.aerogenes
NEGATIVO
NEGATIVO
E.coli
K.pneumoniae
K.pneumoniae
E.coli
NEGATIVO
S.epidermidis
S.epidermidis
S.epidermidis
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
S.epidermidis
S.epidermidis
L. adecarboxylata
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
RIM/PANC
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM/PANC
RIM/PANC
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
RIM
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FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
VIVO
FALECIDO
FALECIDO
VIVO
FALECIDO
FALECIDO
VIVO
FALECIDO
VIVO
VIVO
VIVO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
VIVO
VIVO
VIVO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
FALECIDO
VIVO
FALECIDO
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FALECIDO
FALECIDO
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VIVO
VIVO
VIVO
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VIVO
VIVO
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VIVO
VIVO
VIVO
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VIVO
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15
15
0
120
0
20
41
41
1460
9
60
90
137
665
730
730
15
0
0
730
60
1640
1640
34
30
28
48
120
120
33
8
12
34
32
1215
280
131
216
14
11
11
15
2430
16
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1030
1975
0
3
0
46
47
790
46
74
15
30
40
77
60
30
182
183
184
185
114
115
116
117
51
42
72
17
F
M
M
M
HRH
HRH
HRH
HRH
NEGATIVO
P.aeruginosa
Salmonella spp.
P.aeruginosa
RIM
RIM
RIM
RIM
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VIVO
VIVO
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740
36
2125
300
CC=Centro de Custo; HSP= Hospital São Paulo; HRH= Hospital do Rim e
Hipertensão; TX= Transplante; Rim/Panc= Transplante de Rim e Pâncreas
153
ANEXOS
ANEXO 2. Drogas Testadas para os respectivos Painéis do Sistema
automatizado Phoenix.
154
ANEXOS
155
ANEXOS
ANEXO 3. Apresentação no 50 th ICAAC 2010.
Real-time Polymerase Chain Reaction for Detection of Bacterial Pathogens and
Antimicrobial Resistance Genes in Blood Cultures of Solid Organ Transplanted Patients.
Talita Trevizani Rocchetti1,2, Liana Carballo Menezes1,2, Luiz Roberto Chirotto Filho1,2, Karen De
Castro Bauab1,2, Luis Fernando Aranha Camargo2, Antonio Carlos Campos Pignatari1,2.
1. Special Clinical Microbiology Laboratory (LEMC), Federal University of São Paulo/UNIFESP
2. Division of Infectious Diseases, Federal University of São Paulo/UNIFESP
Solid organ transplanted patients are at high risk for blood stream infection. The institution of
appropriate antimicrobial therapy guided by a rapid and accurate microbiological diagnosis of
blood stream infections is related to a successful outcome. The aim of this study was the
detection of Gram-positive and Gram-negative bacteria from automated blood cultures
®
(Bactec , Becton Dickinson) with the use of the multiplex real-time polymerase chain reaction
(PCR) and detection of antimicrobial resistance genes. Methods: A total of 154 blood cultures,
113 positive and 41 negative, were obtained of 109 patients submitted to solid organ transplant
at two transplant centers in the city of São Paulo, Brazil, Hospital São Paulo and Hospital do
Rim e Hipertensão. DNA from the blood cultures was extracted by phenol chloroform method
®
(Brazol , LGC, Brazil). The detection of bacterial DNA was performed using universal primers of
16S rRNA gene. The differentiation between Gram-positive and Gram-negative bacteria was
done by hybridization with Gram-specific probes by multiplex real-time TaqMan. The resistance
genes: blaSHV, blaTEM, blaCTX, blaKPC and mecA were detected using specific primers by real-time
SYBR Green. Results: Fifty four samples were positive for Gram-positive and fifty nine samples
were positive for Gram-negative. All samples (100%) were concordant between blood culture
and PCR. Forty six samples were positive for mecA gene, seven for blaCTX gene, eight for blaKPC
gene and fifty three were negative for all genes. Conclusion: The results of this study suggest
that multiplex PCR for Gram-positive/Gram-negative bacteria and detection of antimicrobial
resistance genes by Real Time PCR could be useful for rapid diagnosis of bloodstream infection
in patients undergoing solid organ transplant.
156

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