Forschung zur Influenza und Influenzaviren am Robert Koch

Forschungs-Sofortprogramm
Influenza (FSI) am
Robert Koch-Institut
Nationales Symposium für
Zoonose-Forschung
07./08. Oktober 2009
Priv.-Doz. Dr. Thorsten Wolff; RKI, FG17
2
Humane Influenza
Pandemien
1918 (H1N1)
1957 (H2N2)
1968 (H3N2)
H5 ?
FSI
SO-Asien
Aviäre Influenza
H5N1
H7N7
Europa
60% Mortalität
NL
Saisonale Epidemien
A/H1N1
A/H3N2
Typ B
1995
1997
2000
2003
2006
3
Forschungs-Sofortprogramm Influenza
H5N1-Vogelgrippe und Pandemiegefahr (2006-09)
Das Forschungsvorhaben dient dazu,
• Defizite in der wissenschaftlichen Erkenntnis abzubauen,
• die Notwendigkeit und Zuverlässigkeit risikominimierender Maßnahmen zu beurteilen,
• die Grundlagen der wissenschaftlichen Politik-Beratung
weiter zu verbessern.
Projektbereiche (RKI):
I.
II.
III.
IV.
Epidemiologie
Schnelldiagnostik
Pathogenese und Tenazität
Impfstoffentwicklung (zusammen mit PEI)
(Sponsoren: BMG, BMELV, BMBF)
4
Projekt II.1: Entwicklung eines Schnelltestes zum
Nachweis von Subtyp-H5-Viren (NRZ)
Einsatz im Schnelltestformat (t = 30 Min.) :
 H5-Spezifität
 hohe Sensitivität dank PolyHRP-Technologie
 Nachweisgrenze des H5-ABICAP® << 1 HA:
deutlich sensitiver als bisherige Schnellteste
Abicap®, Senova GmbH
Optimierte Antikörperpaarung im ELISA:
Fang-/Detektions-mAk: 140/1/D9 – Mix mit 10/1/D6, 157/1/F4
Spezifität: HPAIV H5N1
9/9
H5N2, H5N6
0/2
andere HA-Subtypen (H1-H16)
0/19
Influenza B-Viren
0/2
respiratorische Viren
0/26
Staphylo-/Streptokokken
0/16
Linke, Neubauer et al.
5
Projekt II.2: Schnelle Differenzierung von H5N1
Varianten durch Pyrosequencing (NRZ Influenza)
WHO,
Februar 2008:
1
10 Clades
2.3.2
2.3.4
Molekulare
Marker
2.1
+
2.2
Cladespezifische
Substitution
6
Projekt II.2: H5-Clade/Subclade Differenzierung in
Pyrosequencing (PSQ)-Assays
PCR 1
PCR 2
HA 1
Clade
PSQ 1
Subclade
PSQ 2
Substitution
PSQ 3+4
HA 2
HA-Spaltstelle
PSQ 5
Molekulare Marker +
Clade-spezifische
Substitution
• Kombination von zwei PSQ-Assays ermöglicht spezifische
Differenzierung von 7 H5N1-Subclades inkl. 1, 2.1, 2.2, 2.3
• Erfolgreiche Evaluation in WHO-Ringversuchen
M. Wedde, B. Schweiger et al.
7
Projekt II.2b: Genotypische Resistenzbestimmung (NRZ)
Neuraminidase-Inhibitoren
Adamantan-Derivate
Oseltamivir Tamiflu
Amantadin Symmetrel
Zanamivir Relenza
Rimantadin Flumadine
Resistenz-assoziierte Aminosäuren
PSQ-Assays zur genotypischen Resistenzbestimmung
Neuraminidase:
E119
H1N1: H274Y R292K N294S
H5N1: H274Y
V119
GAGAA
GAGTA
H3N2: E119V R292K N294S
M2 Protein: L26F V27A/D A30T S31N G34E
Duwe & Schweiger, 2008. J Virol Methods
8
% resistente Viren
Projekt II.2b: Zirkulation von Oseltamivir-resistenten
saisonalen A/H1N1 Viren (NRZ)
Mutation: H274Y
100
80
60
40
20
0
Oct Nov Dec Jan Feb Mar Oct Nov Dec Jan Feb Mar
07 07 07 08 08 08 08 08 08 09 09 09
• Zanamivir- und Adamantan-sensitiv
• nicht Therapie-assoziiert
• Symptome und Verlauf der Infektion unverändert
• Mensch zu Mensch Übertragung gezeigt
Duwe et al. 2009, J Clin Virol
9
III.1: Das C-terminale ESEV Motiv des NS1 Proteins ist
keine Virulenzdeterminante des H5N1-Virus (P15)
Stopp
NLS I
dsRNA binding
domain
73
215 225
Reverse Genetik:
Infektion: 5 PFU (10x LD50)
WT (A/Vietnam/1203/04)
-ESEV (aviär) = PDZ Bindungsmotiv
RSKV (human)
Obenauer et al., 2006; Science 311. 1576
„We propose that the introduction of avian NS1
into human cells can potentially disrupt many
cell pathways via binding to PDZ-domain
containing proteins, while the human NS1 does
not. Disruption of these pathways at the cellular
level may well contribute to the higher mortality
rates reported for the recent outbreaks.“
BSL3: Isocage-System
Zielecki, Semmler et al., in preparation
10
Influenzvirus A/H1N1-2009
(seit April 2009)
(„Swine Flu“, „Mexican Flu“)
WHO/ECDC: > 343.298 Fälle,
4432 Opfer
(27.09.09)
11
Das neue Influenzvirus A/H1N1-2009 ist verwandt
mit porzinen Virusstämmen (MMWR, 21. April 09)
Classical
swine
North-American
avian
Human
(H3N2)
Eurasian avianlike swine
• Geringe Nachweisbarkeit
durch Standard-Diagnostik:
- RT-PCR, Antigen-Schnelltest,
Therapierbarkeit ?
• Symptomatik/Infektiösität ?
• Eindämmungs-Strategie ?
Influenza A (H1N1)
(Neumann et al., 2009)
12
Real-time PCR zum Nachweis von A/H1N1v
Bestellung von Primer/Sonden
27. April 2009
Assay-Evaluierung im NRZ
Assay übermittelt an
Gesundheitsämter
30. April 2009
Assay auf der RKI-Hompage
1. Ma 2009
13
Situation in Deutschland: 21.283 gemeldete Fälle
(02.10.2009)
Ende April
Eindämmung/Verzögerung
September
Schutz vulnerabler Gruppen
RKI: Epid. Wochenbericht, 02.10.09
14
I.3: Modellierung: Rasche Detektion, Isolation und
Therapie verzögern den epidemischen Peak (Abt. 3)
d81
d136
Modell-Annahmen für Deutschland (R0 = 1.58)
- Zwei importierte Fälle / Tag
- Reduktion der Transmission liegt bei 75% für die ersten 1.000 Fälle und
bei 50% für den 1001. - 10.000ten Fall
An der Heiden et al.; Plos One, in revision
15
I.2 Shedding-Studie: Symptomatik/ Infektiösität bei
A/H1N1v ? (Abt. 3)
•
•
•
•
Bei Übermittlung eines neuen Falls:
 Kontaktaufnahme von RKI mit Land,
Gesundheitsamt und Familie
Aussendung eines Feldteams
Tägliche Beprobung des Haushalts-Index (N =
36) und aller Haushaltskontakte (N=83)
Tägliche Befragung des Haushalts-Index und
der Haushaltskontakte:
• Symptomatik
• Medikation
(Abt. 3; U. Buchholz & Kollegen)
16
I.2 Shedding-Studie: Evidenz für Empfehlungen
•
RKI-Empfehlung (18.08.2009): „Alle Erkrankte bleiben bis einen Tag nach
Abklingen des Fiebers zuhause“:
– Relatives Risiko, dass ein laborbestätigter Patient Virus ausscheidet,
wenn er fieberfrei ist: 0.56 (p=0.006)
 Fieberfreiheit ist mit fehlender Ausscheidung assoziiert
Tage
RNA
copies
symptom
score
Nachweisgrenze
MW(ohne Null)*PR
Symptomscore - MW
RKI shedding investigation group, Emerg. Infec. Disease, in revision
17
Projekt I.4: Das Informationspaket „Wir gegen Viren“
Medien mit ausführlichen Informationen zum persönlichen Infektionsschutz
Kampagnen-Logo
www.wir-gegen-viren.de
Webseite
Broschüre 9 Tipps
Faltblatt 9 Tipps
Poster 9 Tipps
Medien zum Schwerpunktthema Händewaschen
TV-Spot Händewaschen
Aufkleberaktion Händewaschen
G. Meilicke, C. Bartels et al., IBBS
18
Nationales Symposium zur Influenzaforschung
Berlin, 22.-24. November 2009
INFLUENZA
• FSI-Abschlussveranstaltung
• Treffen des FluResearchNets
Information/Anmeldung:
www.zoonosen.net
19
Das FSI bedankt sich bei den Sponsoren für die
Unterstützung !
20
II.2b: Resistenzen bei neuen A/H1N1v Viren ?
• RT-PCR mit anschließender PSQ-Analyse etabliert
Neuraminidase
274
Stand: 01. Okt. 2009
• 326/326 NAI sensitiv
• 115/115 Amantadin-resistent
M2 Protein
26, 27, 30, 31, 34
294 292
Duwe, Schweiger et al.
21
Humane Influenza
Pandemien
1918 (H1N1)
1957 (H2N2)
1968 (H3N2)
H1N1v
Aviäre Influenza
H5N1
H7N7
SO-Asien
Europa
NL, B, D
Saisonale Epidemien
A/H1N1
A/H3N2
Typ B
1995 1997
2000
2003
2005
2009 2010
22
II.1 Entwicklung eines Schnelltestes zum
Nachweis von Subtyp-H5-Viren (NRZ)
Ziel:
Etablierung eines Antigen-Capture-Assays zum
laborunabhängigen Nachweis von H5-Asia Viren
Methodik:
Generierung H5-spezifischer mAbs
Resultate:
7 mAbs hochspezifisch für Subtyp H5-Viren
2 mAbs neutralisieren H5N1 Viren
1 mAb zeigt spezifisches Färbemuster im IFT
23
II.3 Nachweis und Differenzierung
von Influenza Viren mittels BioChip
Influenza BioChip
100%
1
0
3
5
19
1
19
0
1
3
78
2
80%
60%
83
Influenza BioChip
6
76
84
65
40%
21
60
10
20%
0%
AM
H1
N1
H3
N2
H2
H5
H7
H9
BM
84
89
89
79
79
6
22
12
3
78
positive
negative
Sensitivität des BioChips im Vergleich zur
Real-time PCR
eBioChip
• mobiles flexibles System für Diagnostik und
Differenzierung
• vergleichbare Sensitivität mit real-time PCR
24
Projekt: II.2 Schnelldiagnostik und Differenzierung
von H5N1 Varianten (NRZ Influenza)
2.2
1 + 2.3
0+3-9
2.1