Das Regenerationsvermögen des Axolotls

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Das Regenerationsvermögen des Axolotls
Besondere Lernleistung
im Fach Biologie
Das Regenerationsvermögen des Axolotls
von
Claudia Renneberg
Klasse 12
Betreuer: Herr Weissert, Frau Wilhelm
Riesa, 03.03.2008
2
Gliederung
Inhalt
Seite
1 Relevanz der Untersuchungen der Regeneration am Axolotl
3
2
Forschungsobjekt Axolotl
4
2.1
Herkunft und natürlicher Lebensraum
5
2.2
Morphologie
5
2.3
Neotenie
5 2.4
Metamorphose
6 3
Ziele der Tanaka Forschungsgruppe
7 4
Meine experimentellen Untersuchungen
8
4.1
Negativkontrolle und Verbindung des „empty vektor“ mit Noggin
8
4.2
Übertragung der Plasmide in die Zellen des Axolotls
9
4.2.1 Injektionsgemische
9 4.2.2 Injektion
12
4.2.2.1 Herstellung der Injektionsnadeln
12 4.2.2.2 Intramuskuläre Injektion
13
4.2.2.3 Intrathekale Injektion
14
4.2.3 Elektroporation
14
4.3
Überprüfung der Elektroporation am Fluoreszenzmikroskop
15 4.4
Amputation des Axolotlschwanzes
16
5
Ergebnisse meiner experimentellen Untersuchungen
17
5.1
Exemplare mit intrathekal injiziertem pSuper-M2 Plasmid
18
5.2
Exemplare mit intramuskulär injiziertem pSuper-M2 Plasmid
18
5.3
Exemplare mit intrathekal injiziertem pSuper-Noggin-M2 Plasmid
18
5.4
Exemplare mit intramuskulär injiziertem pSuper-Noggin-M2 Plasmid19
5.5
Zusammengefasste Erkenntnisse
20
6
Danksagung
21
7
Quellenverzeichnis
22
8
Literaturverzeichnis
23
9
Selbstständigkeitserklärung
24
10
Anlagenverzeichnis
25 11
Bildnachweis
49
6
7
8
10
13
16
48
3
1 Relevanz der Untersuchungen der Regeneration am Axolotl
Laut der Deutschen Stiftung Organtransplantation (DSO) in Berlin herrscht noch immer ein
Mangel an Spenderorganen in Deutschland. „Rund 12.000 schwer kranke Menschen warteten
vergeblich auf ein lebensrettendes Herz, eine Lunge, eine Leber oder eine
Bauchspeicheldrüse...“ 1, dies ließ die DSO am Tag der Organspende am 2.6.2007 verlauten.2
„Täglich stürben in der Bundesrepublik drei Menschen, weil sie nicht rechtzeitig ein Organ
erhielten.“
Alarmierend ist auch die Wartezeit beispielsweise für eine Niere. Diese beträgt
durchschnittlich sechs Jahre, laut Aussagen der Deutschen Stiftung Organtransplantation.1
Im Hinblick auf diese Missstände gewinnt das Thema Regeneration in der Forschung immer
mehr an Bedeutung. Wären wir Menschen in der Lage, unsere verletzten oder verloren
gegangenen Organe selbstständig neu zu bilden, ohne dabei Verluste in Funktion und
Formung dieser defekten Körperteile zu erleiden, könnte vielen Patienten eine langwierige,
physisch und psychisch schwere Behandlung erspart bleiben und ihr Leben verlängert
werden.
Doch leider wurde diese Fähigkeit in solch einem organumfassenden Maße uns Menschen
der Gegenwart nicht zuteil. Sie ist unter anderem dem mexikanischen Axolotl gegeben.
Um dennoch Vorteile aus dem Themengebiet Regeneration für die medizinische Betreuung
von Patienten zu gewinnen, ist es wichtig zu erfahren, welche Vorgänge im sich
regenerierenden Axolotlkörper ablaufen. Denn nur, wenn der komplette
Regenerationsprozess im Axoltol in seine einzelnen Abläufe aufgelöst und verstanden wird,
können die daraus gewonnenen Erkenntnisse auf sich nicht in diesem großen Maße
neubildenden Organismen - wie den Menschen - übertragen werden.
In diesem Bereich der Grundlagenforschung war ich vom 2.7.2007 bis zum 11.7.2007 im
Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik in Dresden a tätig. Meine
konkrete Aufgabe im Bereich der Aufschlüsselung des Regenerationsprozesses bestand darin,
zu untersuchen, ob ein bestimmtes Protein an der Neubildung des Axolotlschwanzes beteiligt
ist.
4
2 Forschungsobjekt Axolotl
Der Name Axolotl b,c leitet sich aus dem Náhuatl, der Sprache der Azteken, 3 ab und ergibt
sich aus den Worten Atl, der Bezeichnung für Wasser, und dem Namen einer Gottheit,
Xolotl. 4 Der Name des Gottes heißt übersetzt Zwilling und ist der Gott des Blitzes, der
Wächter der Unterwelt, welcher die Sonne täglich in die Erde hinab und wieder empor
geleitet. 5
Aus diesem Zusammenhang lässt sich die Herkunft der Übersetzung des Namens Axolotl mit
„Wassermonster“, „Wasserspiel“ oder „Wasserpuppe“ begründen. Trotz dieser göttlichen
Verbindung landeten diese Tiere oft im Kochtopf und wurden als Grundstoff verschiedener
Heilmittel genutzt, da ihnen heilende Kräfte zugesprochen wurden.
1805 wurden erstmals durch Alexander von Humboldt zwei Exemplare dieser
Querzahnmolche nach Europa gebracht, doch erst 1863 führten französische Forscher eine
größere Gruppe der hier besprochenen Salamanderart ein. 4 Seither hatte Ambystoma
mexicanum einen großen Anklang in der Forschung. Dies beruht zum einen darauf, dass der
Axolotl die Metamorphose in seinem natürlichem Biotop nicht durchführen kann, aber dies
im Labor möglich ist, und zum anderen wird der Grund für das narbenlose
Regenerationsvermögen von kompletten Körperteilen und verletzten Organen untersucht, um
daraus in der Zukunft einen Nutzen für den Menschen zu erschließen. 6
Abgesehen von diesen Fähigkeiten sprechen noch andere Eigenschaften dieser
Schwanzlurche für einen Einsatz in der Forschung. Sie haben eine massive Individuenanzahl,
die pro Laich 100-300 Eier umfasst. Auch ist die Zeit, die bis zum Schlupf der Jungtiere
vergeht, mit drei Tagen relativ kurz. 3 Es besteht auch die Möglichkeit, die Tiere während
ihres Ei-Stadiums auf bestimmte Eigenschaften zu untersuchen, denn die Größe der Eier liegt
bei rund drei Millimetern und sie sind damit gut zu handhaben. Ebenfalls erleichtert das
Auftreten von Teilalbinos den Einsatz und das Erkennen von in den Körper injizierten
Farbstoffen mit dem bloßen Auge. Die Tiere stellen auch keine besonderen Ansprüche an
ihre Unterbringung. Die kleineren, für meine Untersuchungen geeigneten, Exemplare (bis
zirka zwei Zentimeter) bewohnen Trinkbecher, welche 0,2 l Fassungsvermögen haben d und
die größeren Axolotl verweilen zwischen den jeweiligen Untersuchungen in
0,5 l - Kunststoffbecken. Lediglich die Besetzung der adulten, bis 30 cm großen, Zuchttiere
muss im 50 l - Becken mit genügend Sauerstoffzufuhr stattfinden und nimmt somit recht viel
Platz ein.
5
2.1 Herkunft und natürlicher Lebensraum
„Axolotl als endemische Art sind wild lebend ausschließlich noch im südöstlich unweit von
Mexiko City auf vergleichbarer Höhe über dem Meer gelegenen Xochimilcosee zu finden
(FREYTAG 1970; ZUCCHI & GONSCHOREK 1983).“ 7,e
„Dieses Gewässer, welches noch von den Azteken als „Mondsee“ bezeichnet wurde, besteht
heute aus einer Vielzahl von sumpfigen Bereichen und Kanälen, die 20 Meter Breite nicht
überschreiten und Tiefen von einem bis zu zehn Metern aufweisen“ 8
„Das ursprüngliche Seensystem dieser Hochebene ist zwischenzeitlich durch anthropogene,
vom Menschen verursachte, Einflüsse in seiner Ausdehnung stark reduziert. f Lediglich ein
Gebiet von etwa 35 Quadratkilometern ist noch dem unmittelbaren Einzugsgebiet des auch
durch Quellwasser gespeisten, reines Süßwasser enthaltenen Sees zuzuordnen (BRANDON
1989, ZUCCHI & GONSCHOREK 1983); der Rest des ehemals umliegenden Gewässers ist
bereits trockengefallen und gleicht nach der beginnenden Verkarstung zunehmend der semiariden Umgebung.“ 7
2.2 Morphologie
„Die Larven und die neotenen geschlechtsreifen Tiere wirken vom Körperbau her gedrungen,
zeigen breite, relativ stumpf erscheinende Köpfe, kräftige Extremitäten und deutlich
ausgeprägte Rippenfurchen.“ 9 Am hinteren Teil des Kopfes tragen sie beidseitig drei kräftige
Kiemenäste und der seitlich abgeflachte Ruderschwanz ist mit einem, die Wirbelsäule
entlang laufenden, Hautsaum versehen. 9 Die im Vergleich zum Kopf winzig wirkenden, im
Wildtyp gelben Augen, sind am Schädel oben, weit auseinanderstehend, angesetzt. Das Maul
ist sehr breit, leicht unterständig und insgesamt leicht abgerundet.10
2.3 Neotenie
„Die umfassendste heute als gültig angesehene und seit langem gebräuchliche Definition des
Begriffs der Neotenie im Bereich der Wirbeltiere sieht Tiere dann als neoten an, wenn diese
in der Lage sind oder in der Lage zu sein scheinen, sich zu reproduzieren während sie noch
larvale Merkmale zeigen (JUST et al. 1981).“ 11 Speziell auf die Axolotl bezogen bedeutet
dies eine induzierbar-obligatorische Neotenie. „Solche Schwanzlurche kommen in natürlicher
6
Umgebung ihr Leben lang nie zur Metamorphose, haben aber die Sensitivität für das zur
Metamorphose notwendige Schilddrüsenhormon, Thyroxin, nicht grundsätzlich verloren“. 12
Vielmehr ist dieses Dauerlarvenstadium von einer Schilddrüsenunterfunktion abzuleiten, bei
welcher zu wenig Thyroxin gebildet wird, um den Hormonreiz, der zum Auslösen der
Umwandlung nötig ist, im Laufe der Ontogenese (=Individualentwicklung) zu
erreichen. 12
2.4 Metamorphose
„Eine exakte allgemeine Begriffsdefinition für diesen Prozess existiert trotz jahrzehntelanger
Forschung bisher nicht.“ 13
Gut brauchbar sind die von JUST et al. 1981 aufgestellten Kriterien zur Feststellung dieses
Umwandlungsvorgangs. 13
„Damit diese vorliegt, müssen Tiere über ein definierbares Larvenstadium verfügen, welches
klar von dem des Embryos und dem des geschlechtsreifen Tieres abgrenzbar ist.“ 13
Die Veränderung muss sich in dem Zeitraum zwischen Schlupf und Geschlechtsreife
vollziehen und „Strukturen umfassen, die nicht mit der Fortpflanzung im Zusammenhang
stehen. Prozesse, die mit der sexuellen Reifung, der Alterung oder der
Embryonalentwicklung verbunden sind, müssen vom Metamorphosegeschehen trennbar
sein.“ 13
Als Auslöser für eine Metamorphose treten externe Faktoren, wie zum Beispiel die Änderung
von Umweltbedingungen, oder interne Faktoren, wie die Veränderung des Hormonstatus,
welche jedoch der Beeinflussung durch Ersteres unterliegen kann, auf. 13
Insgesamt ist die Metamorphose als eine Umwandlung zu sehen, die mit dem Wechsel des
Lebensraumes einhergeht. Aus den aquatischen, über Kiemen und Haut atmenden Larven
werden lungenatmende, terrestrische Adulttiere. 12
Ein Paradebeispiel für die Verwirklichung dieser Kriterien ist die klassische
Froschentwicklung. „Aus dem sich im Ei früh entwickelnden Embryo entsteht eine
Kaulquappe, die typische larvale Strukturen, wie etwa das Raspelmaul und den
Ruderschwanz, aufweist.“ 13 Die Larven sind an das Wasser gebunden. Den für die Atmung
benötigten Sauerstoff entnehmen sie über Kiemen dem Wasser und die Ernährung erfolgt
vegetarisch, woraus ein relativ langer Darm resultiert. Die adulten Frösche hingegen nehmen
über die Lungen atmosphärischen Sauerstoff auf und verbringen den größeren Teil der Zeit
7
an Land. Sie haben einen relativ kurzen Darm auf Grund ihrer tierischen Kost. Der Schwanz
wird zum Fortbewegen nicht mehr benötigt und fehlt vollkommen. 13 „Strukturell ist das
Larvenstadium eindeutig von Embryo und geschlechtsreifem Tier getrennt, bestimmte
Systeme sind nur larval vorhanden. Kaulquappe und Frosch nutzen unterschiedliche
Lebensräume und unterschiedliche Ressourcen“. 14 Bei Betrachtung der oben genannten
Kriterien findet man diese bei der Froschentwicklung alle erfüllt.
Verglichen damit sind die Verhältnisse beim Axolotl weit weniger deutlich.
Sowohl die Larven als auch die geschlechtsreifen Tiere beanspruchen das Wasser als
Lebensraum für sich, ihre Nahrung ist vergleichbar, sie verändert sich nur relativ zum
Wachstum. Ebenso bei der Grundgestalt beider Entwicklungsstadien, denn „viele
Organsysteme und Verhaltensweisen verändern sich nur wachstumsbedingt, echte
Larvalorgane scheinen zu fehlen“.10 Als einziger auffälliger Unterschied ist die strukturelle
Veränderung durch die Geschlechtstreife adulter Tiere, welche aber als „Kriterium für eine
Metamorphose nicht zugelassen“ ist. 14
So gesehen ist eine vollständige Metamorphose beim frei lebenden Axolotl nicht anzutreffen.
Doch besteht die Möglichkeit, von außen experimentell dem Tier unter anderem das
Schilddrüsenhormon Thyroxin zu verabreichen und den Querzahnmolch somit zur
vollständigen Umwandlung zu einem terrestrischen Axolotl zu bringen. 14
Aus diesen Sachverhalten geht hervor, dass Ambystoma mexicanum „ganz offensichtlich auf
natürlichem Weg nicht zur vollständigen Metamorphose gelangen, obwohl sie sich ebenso
eindeutig fortpflanzen können. Dieser Zusammenhang zeigt deutlich, dass zumindest die
reproduzierenden Organsysteme ( ..., Kloakaldrüsen, Kloakenregion) den Vorgängen
unterliegen müssen, die in den metamorphosierenden Formen erst mit oder nach dem
Landgang stattfinden; ein wichtiger Hinweis auf das als Teilmetamorphose beschriebene
Geschehen“. 15
8
3 Ziele der Tanaka Forschungsgruppe
Die Forschungsgruppe unter der Leitung Elly Tanakas führt Untersuchungen am Axolotl
durch, um Fragen über das Regenerationsvermögen großer Teile des Zentralen
Nervensystems und kompletter Extremitäten dieser Tiere zu klären.
Ein Schwerpunkt ihrer Forschung ist der mit der Regeneration verbundene Wiedereintritt
ausdifferenzierter Zellen in den Zellzyklus und die Fähigkeit der ausdifferenzierten Zellen
des Axolotls, sich bei der Regeneration zu vermehren.
Das Gesamtziel dieser Forschungen ist es, den Mechanismus, der den ganzen
Regenerationsprozess steuert, mit seiner Flexibilität und seinen nahezu unbegrenzten
Erneuerungen zu verstehen.
4 Meine experimentellen Untersuchungen
In meinen im Folgendem beschriebenen Experimenten untersuchte ich den Einfluss des
Signalproteins BMP4 auf das Regenerationsvermögen des Axolotls.
Das BMP4 gehört zu den Bone Morphogenetic proteins - morphogenetische
Knochenproteine - die grundlegende Ereignisse in der frühen embryonalen Entwicklung und
in der Organogenese kontrollieren. Die BMP-Proteine sind eine Gruppe einander ähnlicher
Signalproteine, die in den Zellen produziert werden und von diesen dann ausgeschleust
werden, um benachbarte Zellen zu beeinflussen. 16
Die von den signalgebenden Zellen ausgeschütteten BMPs gelangen über Diffusion zu den
benachbarten Zellen und binden sich dort an die Membranrezeptoren, welche dieses Signal
durch die Zellmembran hindurch in das Zellinnere weiterleiten. In einer Signalkaskade, bei
der die Signale über Enzyme und sekundäre Botenstoffe über eine oder mehrere Ebenen bis
hin in den Zellkern weitergeleitet werden, werden sie verstärkt. 17
Im Zellkern angelangt, kann dieses Signal eine Veränderung der Genaktivität hervorrufen,
„was letztendlich dazu führt, dass die Empfängerzelle ihre Proteinzusammensetzung und
damit ihre Eigenschaften verändert“.16 Doch reagiert je nach Zustand der Zelle, je nach Dauer
und Stärke des Signals die Empfängerzelle unterschiedlich auf das Signal. Auch spielt der
Typ des BMPs dabei eine entscheidende Rolle.
Doch können diese Signalproteine auch durch andere Proteine abgefangen und unwirksam
gemacht werden. Solch ein Inhibitor, der sich an das BMP4 heftet und somit dessen
9
räumliche Struktur so verändert, dass es von der Empfängerzelle nicht mehr erkannt wird, ist
zum Beispiel das Noggin. 16
Mit Hilfe dieses Hemmstoffes konnte ich sehen, ob die Regeneration des von mir
amputierten Axolotlschwanzes vom BMP4 abhängig ist. Beim Einsatz des Noggins müsste,
wenn man davon ausgeht, dass das BMP4 für die Regeneration eine wichtige Rolle spielt, der
Schwanz sich nicht neu ausbilden beziehungsweise in irgendeiner Form nicht komplett
regeneriert sein.
4.1 Negativkontrolle und die Verbindung des „empty vektor“ mit Noggin
Eine Negativkontrolle wurde in diesen Experimenten mit eingebracht, um zu sicher zu gehen,
dass die Elektroporation oder die Injektion an sich keine Wirkung auf die Regeneration hat.
Somit habe ich in diesen Experimenten bei der Hälfte der mir zur Verfügung stehenden
Axolotlexemplaren anstelle der DNA des pSuper-Noggin-M2, die pSuper-M2 DNA injiziert.
Dieses pSuper-M2 ist ein sogenannter „empty vektor“, das heißt, dieses Protein hat keinerlei
Funktionen im Axolotlorganismus.
Diese Gegebenheit, um einen „stummen“ Noggin-DNA-Träger zu finden, ausnutzend,
„schnitten“ die Forscher das präparierte Plasmid - ein aus Bakterien gewonnener
ringförmiger Träger von genetischen Informationen, welches das pSuper-M2 Protein
synthetisiert - auf und klonten die für die Noggin-Synthese zuständigen Basensequenzen
hinein.
Somit kann der Inhibitor Noggin über das nun entstandene pSuper-Noggin-M2 Plasmid in den
Zellen des Axolotls in Verbindung mit dem BMP4 seine hemmende Wirkung auf die
Regeneration freisetzen.
Sowohl der Inhibitor pSuper-Noggin-M2, als auch die Negativkontrolle pSuper-M2 wird von
den Zellen selbst gebildet, doch dazu muss, wie im vorhergegangenen Text schon einmal
angesprochen, die genetische Information für diese Proteine in den Zellen des Axolotls
vorhanden sein. Dazu bedient man sich mit von Bakterien stammenden Plasmiden, denen
- wie oben beschrieben - der einen Hälfte die genetische Information des Noggins
hinzugefügt wird.
10
4.2 Übertragung der Plasmide in die Zellen des Axolotls
Um die DNA dieser beiden Proteine in die Zellen des Axolotls zu übertragen, bedarf es dreier
wichtiger Schritte: Die Vorbereitung des „Impfstoffes“, die Injektion und die
Elektroporation.
4.2.1 Injektionsgemische
Für die Axolotl bereitete ich zwei verschiedene Injektionsstoffe vor.
Die Grundsubstanz der einen Mixtur bestand aus dem pSuper-Noggin-M2 Plasmid und die
andere bekam das pSuper-M2 Plasmid als Ausgangspunkt.
Beiden fügte ich den Farbstoff „fast green“ hinzu, der die Injektionsstelle mit einem für das
bloße Auge blau erscheinende Farbe markiert.
Auch mischte ich jeweils einen fluoreszierenden Farbstoff den zu injizierenden Stoffen unter.
Dieses GFP-T2A-Cherry Reporterplasmid geht bei der Elektroporation mit dem
pSuper-Noggin-M2 beziehungsweise mit dem pSuper-M2 Plasmid in die Zellen über und
markiert somit bei der Belichtung im red- beziehungsweise green-Channel, am
Fluoreszenzmikroskop, die Zellen, welche die Plasmide beinhalten.
Unter Vorgaben einzuhaltender Maßstäbe für die einzelnen Bestandteile dieser Gemische,
fügte ich alle Einzelteile im Mikroliterbereich zusammen.
Für das erste Stoffgemisch erhielt ich folgende Richtlinien:
Es sollte in 20μl (= 0,02ml) eine Konzentration der Stoffe pSuper-Noggin-M2 und
GFP-T2A-Cherry von jeweils 0,5 mg*ml-1 vorhanden sein und des weiteren sollte sich 1μl
des Farbstoffes „fast green“ in diesem Injektionsstoff befinden.
Aus diesen Angaben ergibt sich, dass von jedem Einzelbestandteil 0,01mg dem Ganzen
hinzugefügt werden muss, denn:
ρ = m/V  m= ρ*V = 0,5 mg*ml-1 * 0,02ml = 0,01mg .
Von dem im Labor bereitgestellten Einzelbestandteilen waren 1,9mg*ml-1 vom
pSuper-Noggin-M2 vorhanden und davon müssen ≈5,26 μl in das Endgemisch zugeführt
werden. Dies ergibt sich aus folgender Berechnung:
ρ = m/V  V = m/ρ = 0,01mg / 1,9mg*ml-1 ≈ 0,00526 ml ≈ 5,26 μl .
Von dem zweiten Bestandteil der p-Super-Noggin-M2 Plasmid-Mixtur, dem Reporterplasmid
11
GFP-T2A-Cherry, waren im Labor 0,78mg*ml-1 vorhanden. Aus dieser Menge mussten, um
die Konzentration von 0,5mg*ml-1 in dem Endgemisch zweier Bestandteile zu erhalten,
diesem ≈12,82 μl vom GFP-T2A-Cherry Plasmid zugesetzt werden. Dieses Ergebnis erhielt
ich, als ich die gegebenen Faktoren in die nachstehende Gleichung einsetzte:
ρ = m/V  V = m/ρ = 0,01mg / 0,78mg*ml-1 ≈ 0,01282 ml ≈ 12,82 μl
Mit Hilfe der errechneten Maße konnte ich die Menge des PBS’s, einem
Salz-Wasser-Gemisch, bestimmen, welches als Füllstoff dient. Das PBS wird der Summe der
Einzelbestandteile des Injektionsstoffes beigefügt, sodass das Gesamtvolumen des
Injektionsstoffes 20 μl betrug.
Im Fall der pSuper-Noggin-M2 Plasmid-Mixtur musste dieser Mischung 0,92 μl des
PBS-Füllstoffes untergemischt werden, damit sich, wie oben erwähnt, das Gesamtvolumen
auf 20 μl belief.
VPBS = 20 μl – ( V pSuper-Noggin-M2 Plasmid + V GFP-T2A-Cherry Plasmid + 1 μl fastgreen )
= 20 μl – ( 5,26 μl + 12,82 μl + 1 μl ) = 0,92 μl
Bei der Herstellung des zweiten Injektionsstoffes, mit dem pSuper-M2 Plasmid als Basis,
wurde mir wieder die Anweisung gegeben, sowohl eine Konzentration der Einzelbestandteile
pSuper-M2 und GFP-T2A-Cherry von 0,5 mg*ml-1 in einem Gesamtvolumen des
Injektionsstoffes von 20 μl zu erreichen, als auch einen μl des Farbstoffes „fast green“ in das
Gemisch einzubinden.
Wie schon im vorausgegangenen Mischungsplan angegeben, musste von jedem
Einzelbestandteil, sprich von dem pSuper-M2 und dem GFP-T2A-Cherry Plasmiden, jeweils
0,01mg dem Injektionsstoff beigemischt werden, damit die Konzentration der beiden
Plasmide bei 0,5 mg*ml-1 lag.
Der mir zur Verfügung stehende Vorrat an pSuper-M2 Plasmiden betrug 2,35 mg*ml-1.
Aus der Rechnung:
ρ = m/V  V = m/ρ = 0,01mg / 2,35 mg*ml-1 ≈ 0,004255 ml ≈ 4,26 μl
ließ sich die benötigte Menge an pSuper-M2 Plasmiden herleiten, um das erforderliche
Gewicht von 0,01 mg und damit die Konzentration von 0,5 mg*ml-1 in dem
Injektionsgemisch zu erreichen.
Der nächste Bestandteil der pSuper-M2-Mixtur ist das GFP-T2A-Cherry Reporterplasmid.
Von diesem wurden wie in der oben bereits beschriebenen Anfertigung des
pSuper-Noggin-M2-Injektionsgemisches ≈12,82 μl benötigt, um die erwünschte
0,5mg*ml-1-Konzentration in dem Endgemisch zu erlangen.
12
Bedenkt man wieder die 20 μl, welche des fertige Injektionsgemisch bilden musste, erkennt
man, dass wieder ein bestimmter Wert an Salzwasser, dem PBS, dem Gemisch hinzugefügt
werden musste.
Um diesen Wert zu erhalten, addierte ich erneut alle Volumen der Einzelbestandteile mit
Einbezug des „fast green“ mit seinem einen Mikroliter (μl) und subtrahierte den erhaltenen
Betrag von dem Gesamtvolumen, den 20 μl, und erhielt somit die Menge des PBS, mit dem
ich den Injektionsstoff auffüllte und ihn damit für die Injektion in die Axolotl fertig stellte.
VPBS
= 20 μl – ( V pSuper-M2 Plasmid + V GFP-T2A-Cherry Plasmid + 1 μl fastgreen )
= 20 μl – ( 4,26 μl + 12,82 μl + 1 μl ) = 1,92 μl
Alle die zu vermischenden Einzelbestandteile des Injektionsstoffes im Mikroliterbereich maß
ich mit einer Mikroliterpipette ab.
Mit dieser Kolbenhubpipette konnte ich auf zwei Dezimalstellen hinter dem Komma genau
das benötigte Volumen in die Pipette aufnehmen, um eine exakte Dosierung vorzunehmen.
Damit eine Verunreinigung beziehungsweise eine Vermischung der Injektionsbestandteile
untereinander nicht stattfinden konnte, verwendete ich bei jeder neuen Flüssigkeitsaufnahme
mit der Pipette eine neue Kunststoffpipettenspitze. j
4.2.2 Injektion
Unter einer Injektion versteht man „... das Einspritzen von (sterilen) Flüssigkeiten mit einer
Injektionsspritze und einer Injektionsnadel (Kanüle) in den Körper.“ 18
Speziell auf meine Experimente bezogen heißt dies, dass ich fünf Exemplaren meiner
insgesamt 20 Axolotl das Impfstoffgemisch mit dem pSuper-M2 Plasmid als Grundlage in die
Schwanzmuskeln injizierte und weiteren fünf Tieren den selben Injektionsstoff in das
Rückenmark, in Höhe der Mitte des Schwanzes.
Auch der andere Injektionsstoff, welcher auf dem pSuper-Noggin-M2 Plasmid basiert,
wurde in zehn Exemplare gegeben. Wieder wurde die Injektion an zwei verschiedenen
Stellen verabreicht: fünf Exemplare bekamen die pSuper-Noggin-M2 Plasmide in die
Muskelfasern der Schwanzregion geimpft und die restlichen fünf Axolotl bekamen die
Injektionsmischung in das Rückenmark.
13
4.2.2.1 Herstellung der Injektionsnadeln
Bevor ich dies mit Hilfe eines Injektionsmikroskops g durchführen konnte, musste ich die
Injektionsnadeln herstellen. Dafür standen mir ca. 12 Zentimeter lange Glasröhrchen zur
Verfügung, die einen ungefähren Durchmesser von einem Millimeter hatten. Diese spannte
ich einzeln an beiden Enden in eine Apparatur ein, welche die Mitte des Glasröhrchen
erhitzte und die Enden des Glasstückes auseinander zog. Der durch die starke punktuelle
Erwärmung verflüssigte mittlere Abschnitt verjüngte sich durch die gleichmäßig von beiden
Seiten angreifende Zugkraft soweit, dass sich das eine Glasröhrchen in zwei sehr dünne,
geschlossene Spitzen teilte.
Um aus diesen gläsernen Nadeln durchgängige Kanülen herzustellen, musste ich die
Glasröhrchen in eine Halterung am Injektionsmikroskop bringen. h
Unter einer 11-fachen Vergrößerung der Nadelspitze entfernte ich mit Hilfe einer Pinzette
den vorderen Teil der Glasröhrchen, sodass einsetzbare Injektionsnadeln entstanden.
In jeweils eine dieser Kanülen füllte ich die vorbereiteten Injektionsgemische mit einer
manuellen Mikroliterpipette. j
4.2.2.2 Intramuskuläre Injektion
Bei zehn Axolotl führte ich eine intramuskuläre Injektion durch. Dieses Einbringen der
Injektionsstoffe in die Muskelzellen des Schwanzes führte ich an einem Injektionsmikroskop
aus, nachdem ich kurz vor der eigentlichen Injektion den jeweiligen Axolotl aus seinem
Becher in ein Bad mit Narkosemittel ließ. Immer wenn sich der schlafende Axolotl auch nach
einer Berührung nicht mehr sichtlich bewegte, verlagerte ich das Tier auf eine Platte und
steckte es mit Nadeln an der Unterlage fest. Da die Tiere austrocknen konnten, mussten sie in
einer kleinen Wasserlache auf der Platte liegen. Diese Platte schob ich daraufhin unter das
Objektiv des Mikroskops und vergrößerte den Abschnitt 11-fach, den ich für die geeignetste
Injektionsstelle ausgewählt hatte. Die Position der bereits mit einem Injektionsstoff
präparierten und in eine Halterung am Mikroskop angebrachten Injektionsnadel konnte ich
nun mit Hilfe von Stellrädern so verändern, dass die Nadelspitze im Ausschnitt der
Injektionsstelle zu sehen war.
Nun konnte ich die Injektionsnadelspitze in den Axolotlkörper, genauer gesagt in den Bereich
der Muskelzellen, eindringen lassen. War die Kanüle genau platziert, betätigte ich ein
Fußpedal, welches das Einschießen des in der Nadel befindlichen Gemisches bewirkte. Auch
14
bei jedem weiteren Bedienen des Pedals wurde eine kleine Menge des Injektionsstoffes über
Druckluft in den Axolotlkörper freigelassen.
Durch den für das bloße Auge blau wirkenden Farbstoff „fast green“ war es mir möglich die
Injektionsstelle und den genauen Ort der injizierten Plasmide auch mehrere Stunden nach
vollendeter Injektion für weitere Untersuchungen wiederzufinden.
Auffallend dabei war die kleine kreisförmige bläuliche Färbung um die Einspritzstelle,
welche die Größe des Ausbreitungsbereiches des eingespritzten Stoffes markierte.
Nach erfolgter Injektion befreite ich die Molche von ihrer Unterlage, indem ich die Nadeln
aus ihrem Flossensaum herauszog und ging mit den noch schlafenden Tieren zur
Elektroporation über.
4.2.2.3 Intrathekale Injektion
Das Einspritzen von Impfstoffen in das Rückenmark oder in das Gehirn wird als intrathekale
Injektion bezeichnet und verläuft exakt wie die intramuskuläre Injektion ab. 19 Nur mit dem
Unterschied, dass als ideale Injektionsstelle ein Abschnitt des durch den ganzen
Axolotlkörper laufendes Rückenmarks ausgesucht wird. Auch ist die farbliche Markierung
durch das „fast green“ nicht auf einen Hof um die Einspritzstelle beschränkt, sondern das
gesamte Rückenmark erhält eine bläuliche Färbung, wobei die leichte beim Einstechen
entstandene Verletzung eine intensivere Färbung für mehrere Stunden beibehält.
4.2.3 Elektroporation
Mit der Elektroporation wird der Transfer der sich im Zellzwischenraum befindlichen
injizierten Plasmide in die Zellen beabsichtigt.
Durch diese Methode werden die Zellmembranen über ein elektrisches Feld für wenige
Millisekunden permeabel gemacht, sodass die großen Plasmide in die Zellen eingeschleust
und zum Zellkern transportiert werden können. 20
Für den Elektroporator, i dem Gerät, welches das elektrische Feld erzeugt, bekam ich
bestimmte Anweisungen, auf welche Parameter ich dieses Gerät einzustellen habe. k
Mit einer Gleichspannung von 15 V brachte ich zwei Elektrodenplatten ober- und unterhalb
der Injektionsstelle am Axolotl in Position. Dabei war es wichtig, darauf zu achten, dass die
15
zwei Elektroden über das Wasser, welches den noch schlafenden Axolotl umgab, miteinander
verbunden waren. Doch durften die Elektrodenplatten den Körper des Axolotls nicht
berühren.
Wurden dann die 15 V Spannung angelegt, bildeten sich um und zwischen den Elektroden
Blasen, und der Axolotl begann zu zucken, da durch die elektrischen Impulse die Muskeln
zum Kontrahieren und Erschlaffen gebracht wurden.
Nach einer Wartezeit von 19 Stunden überprüfte ich am Fluoreszenzmikroskop, l ob die
Elekrtoporation erfolgreich war.
4.3 Überprüfung der Elektroporation am Fluoreszenzmikroskop
Das in dem Injektionsgemisch enthaltene GFP-T2A-Cherry Reporterplasmid diente als
fluoreszierender Farbstoff, welcher mit den anderen Plasmiden bei der Elektroporation in die
Zellen überging. Die nach den genetischen Informationen des Plasmids synthetisierten
Proteine markierten bei Belichtung im red- beziehungsweise green-Channel des
Fluoreszenzmikroskops somit die Zellen, welche die pSuper-M2 beziehungsweise die pSuperNoggin-M2 Plasmide enthalten.
Bei diesem Vorgang werden die Zellen um die Elektroporationsstelle eine bestimmte Zeit mit
einem Laserlicht bestrahlt. m Dieses Licht umfasst im red-Channel eine Wellenlänge von
490 bis 575 nm, und erscheint somit grün. Im green-Channel beträgt die Wellenlänge des
Laserlichtes 420 bis 490 nm und ist somit als blaues Licht für uns sichtbar. 21
Während der kurzzeitigen Belichtung wird das „Farbprotein“ angeregt und emittiert in einer
höheren Wellenlänge. Dies führt dazu, dass im red-Channel das abgestrahlte Licht im
Fluoreszenzmikroskop rot erscheint und eine Wellenlänge von 650 bis 750 nm besitzt.
Im green-Channel dagegen fluoresziert das „Farbprotein“ grün und weist eine Wellenlänge
von 490 bis 575 nm vor. 21
Bei der Belichtung meiner 20 Axolotlexemplare in dem Fluoreszenzmikroskop, 19 Stunden
nach der Elektroporation, war das GFP-T2A-Cherry Reporterplasmid in keiner Zelle im
red- beziehungsweise green-Channel zu sehen. Folglich wurden auch die pSuper-Noggin-M2
und die pSuper-M2 Plasmide nicht in die Zellen elektroporiert. Nur bei zwei Axolotl war ein
geringes Leuchten sichtbar.
Dies ließ mich zu dem Schluss kommen, dass die Elektroporation vielleicht auf Grund einer
zu niedrigen Spannung misslungen war und ich nun mit 20 neuen Exemplaren die Injektion,
16
Elektroporation und die Überprüfung der Plasmidübertragung am Fluoreszenzmikroskop in
gleicher Weise wiederholte.
Für die intrathekale und intramuskuläre Injektion nahm ich die von mir schon einmal
vorbereiteten Injektionsgemische mit dem pSuper-M2 und dem pSuper-Noggin-M2 Plasmiden
als Grundlage, denen ich jeweils einen weiteren Mikroliter des Farbstoffes „fastgreen“
hinzufügte, um die Gesamtmenge der Injektionsstoffe zu erhöhen, damit ich die weiteren 20
Exemplare mit genügend Impfstoff versorgen konnte.
Für eine erfolgreichere Elektroporation erhöhte ich die Spannung am Elektroporator auf
30 V, was dementsprechend stärkere Zuckungen der Schwanzmuskeln und eine vermehrte
Bläschenbildung hervorrief. n
Bei der darauffolgenden Überprüfung der Elektroporation am Fluoreszenzmikroskop im redbeziehungsweise green-Channel waren bei elf Exemplaren rote beziehungsweise grüne
Farben zu erkennen, was daraus schließen ließ, dass die Elektroporation erfolgreich war und
das GFP-T2A-Cherry Reporterplasmid zusammen mit den pSuper-M2 beziehungsweise dem
pSuper-Noggin-M2 Plasmid in den Zellen der Axolotlkörper vorhanden war.
4.4 Amputation des Axolotlschwanzes
Die Amputation führte ich an einem Fluoreszenzmikroskop durch, unter welches ich die in
Anästhetikum gebadeten Axolotl legte und die Zellen mit dem fluoreszierenden
„Farbprotein“ suchte. Hatte ich die erwähnten Zellen ausfindig gemacht, schnitt ich mit
einem Skalpell den dahinter befindlichen Teil des Schwanzes ab. Dabei versuchte ich die
plasmidhaltigen Zellen geringfügig zu verletzen, um sicher zu gehen, dass diese speziellen
Zellen an der Regeneration des Schwanzteiles beteiligt sind.
17
5 Ergebnisse meiner experimentellen Untersuchungen
In denen von mir zusammengesetzten Einzelbildern aus dem Fluoreszenzmikroskop konnte
ich die in den letzten acht Tagen nach der Amputation abgelaufene Regeneration des
Axolotlschwanzes bildlich festhalten.
Zu diesem Zweck arbeitete ich mit dem Fluoreszenzmikroskop verbundenen
Computerprogramm MetaVue, wodurch ich simultane Bilder des narkotisierten Axolotls auf
dem Computerbildschirm erhielt und diese als momentane Einzelbilder abspeichern konnte. o
Somit war es mir möglich, Aussagen über die Wirkung des BMP4 Proteins auf die
Regeneration im Axolotlorganismus zu treffen. Hierbei verglich ich die fotografischen
Aufnahmen der Exemplare, welche mit dem BMP4 hemmenden Plasmidbestandteil
pSuper-Noggin-M2 geimpft wurden, mit denen, welche den bloßen „empty vektor“, das
pSuper-M2 Plasmid, in den Zellen trugen.
Zur Unterscheidung der einzelnen Tiere trug eine Beschriftung der Becher, in denen sich die
Axolotl befanden, bei. Dabei nahm ich drei verschiedene, mit Bindestrichen abgetrennte
Ziffernkombinationen zu Hilfe.
Die erste Gruppe stand für den Injektionsort. Hierbei gab es zwei Unterteilungen:
„SC“ als Abkürzung des englischen Begriffs „spinal cord“ markierte die Becher, in welchen
sich die Axolotl mit einer erhaltenen intrathekalen Injektion befanden.
„M“ hingegen - eine Kurzbezeichnung für den englischen Begriff „muscle“ - bezeichnete die
Becher der Axolotl, welche den Impfstoff in die Muskeln gespritzt bekamen.
Die damit entstandene Zweiteilung der Axolotlzahl wurde durch die nächste Bezifferung
weiter spezialisiert.
Die Abkürzel „N“ beziehungsweise „M2“ richteten sich nach der Art des
Injektionsgemisches, welches die Tiere erhielten. „N“ markierte hierbei die Becher, in
welchen sich Exemplare mit dem pSuper-Noggin-M2 Plasmid in ihren Zellen befanden,
die Tiere in den „M2“-Behältern enthielten die pSuper-M2 Plasmide in ihren Zellen.
Römische Ziffern von I bis V gaben die Nummer des einzelnen Axolotls an und
gewährleisteten mit den anderen beiden Abkürzungen eine eindeutige Kombination (z.B. SCN-III), um einer Verwechslung der 20 Exemplare vorzubeugen.
18
5.1 Exemplare mit intrathekal injiziertem pSuper-M2 Plasmid
Sowohl nach fünf als auch nach acht Tagen entsprach der regenerierte Abschnitt des
Schwanzes dem geradlinigen Verlauf des restlichen Körpers. Bei beiden Exemplaren p betrug
die Länge des gesamten regenerierten Bereiches nach acht Tagen durchschnittlich
3200 μm, wobei das Rückenmark des Exemplars SC-M2-ΙV zirka 250 μm kürzer war als vom
Exemplar SC-M2-V. q
Dies ist darauf zurückzuführen, dass ich bei der Amputation keine einheitlichen Maße
eingehalten hatte, jede Amputation verschieden schwere Wunden hinterlassen hatte und die
Regeneration von Tier zu Tier unterschiedlich schnell ablief.
Auffallend ist zudem, dass die fluoreszierenden Proteine aus den präparierten
Rückenmarkszellen vereinzelt im Rückenmark des neugeschaffenen Schwanzabschnittes
wiederzufinden waren.
5. 2 Exemplare mit intramuskulär injiziertem pSuper-M2 Plasmid
Auch bei diesen zwei Axolotl wies der regenerierte Teil des Rückenmarks ein gerades
Wachstum auf, was einen regenerierten Schwanzbereich von durchschnittlich 2900 μm
umfasste. q Doch nur bei einem Exemplar, bei M-M2-IV, waren fluoreszierende Farben in
Teilen vom neugebildeten Rückenmark und nebenliegende Muskelzellen zu finden.
Dass diese Fluoreszenz nicht in den neugebildeten Zellen des Exemplars M-M2-V zu sehen
war, liegt wahrscheinlich daran, dass ich die plasmidhaltigen Zellen bei der Amputation des
Schwanzstückes nicht verletzt hatte und damit eine Beteiligung dieser Zelle an der
Wiederherstellung des entfernten Körperteils unwahrscheinlich geworden war. r
5.3 Exemplare mit intrathekal injiziertem pSuper-Noggin-M2 Plasmid
Jedes der fünf Axolotl aus dieser Versuchsreihe wies eine erfolgreiche Elektroporation auf. s
Außerdem war zu erkennen, dass drei dieser Molche ein nach oben gekrümmtes etwa
2000 μm langes Rückenmark regenerierten. q Überdies zeigten diese Exemplare eine
Deformation der Schwanzspitze.
19
Zum einen schloss diese Missbildung eine Überlappung des Flossensaums ein (SC-N-II und
SC-N-V) ein, zum anderen wurde ein Stück Flossensaum ringförmig abgeschnürt, wie es bei
dem Axolotl SC-N-I der Fall war.
Der gesamte neugebildete Schwanzteil der fünf Axolotl hatte eine durchschnittliche Länge
von 2500 μm und war mit fluoreszierenden Proteinen, q die aus dem injiziertem und in die
Zellen hinein elektroporierten GFP-T2A-Cherry Plasmid synthetisiert worden, durchsetzt.
Die zwei übrigen Tiere (SC-N-III und SC-N-IV) hatten dagegen ein ungefähr ebenso langes
Rückenmark mit leichten Krümmungen aufgebaut, was jedoch zum größtem Teil dem
geraden Verlauf des „alten“ Rückenmarks entsprach.
5.4 Exemplare mit intramuskulär injiziertem pSuper-Noggin-M2 Plasmid
Bei diesen beiden Exemplaren betrug die durchschnittliche Länge des gesamten regenerierten
Schwanzstückes 2800 μm. q Ebenso war bei einem Axolotl eine Abschnürung des
Flossensaums in einer Ringform zu sehen. t
Auf Grund der schlechten Qualität der Bilder war es schwierig, weitere exakte Aussagen über
die abgelaufene Regeneration zu treffen. Die unscharfen Abschnitte - vor allem bei dem
Axolotl M-N-II - ließen nicht erkennen, ob die sichtbaren Farben auf fluoreszierende, auf
Grundlage des GFP-T2A-Cherry Plasmid synthetisierte Proteine basierten oder durch mir
unbekannte Fremdpartikel hervorgerufen wurden.
Es wäre sogar zu bedenken, ob aus den Bildern dieser beiden Exemplare deutliche Aussagen
über die Regeneration des Axolotlschwanzes getroffen werden können. Das Fehlen von
fluoreszierenden „Farbproteinen“ im nicht amputierten Bereich lässt sich darauf
zurückführen, dass ich bei der Amputation die Zellen, welche die injizierten Plasmide
beinhalteten, mit dem restlichen Schwanzteil unbeabsichtigt entfernt hatte.
Somit waren diese Zellen nicht an der Wiederherstellung des Schwanzes beteiligt und es
konnten keine Informationen für die Synthese von den fluoreszierenden „Frabproteinen“ bei
der für die Regeneration notwendige Teilung weitergegeben werden.
20
5.5 Zusammengefasste Erkenntnisse
Aus dem Ergebnis der Untersuchungen der Bilder lassen sich Aussagen über den
vorhandenen Einfluss des BMP4 Proteins auf das Regenerationsvermögen des Axoltols im
Bereich des Schwanzes ableiten.
Dieses Protein trägt zum Wiederaufbau von verlorenen Schwanzstücken bei, da aus den
Mikroskopaufnahmen hervorgeht, dass bei einer Hemmung des BMP4 Proteins durch den
Inhibitor Noggin die Schwanzregeneration negativ beeinflusst wird.
Diese unvorteilhafte Beeinflussung lässt sich im Vergleich zu der abgelaufenen Regeneration
der vier Exemplare erklären, welche den „empty vektor“ - der keinerlei Einfluss auf den
Axolotlorganismus hat - in die Zellen injiziert bekamen.
So war der neugebildete Schwanzabschnitt der mit dem Noggin Plasmid injizierten
Exemplare durchschnittlich um 300 μm kürzer und wies bei vier von sieben Exemplaren eine
Hautwucherung beziehungsweise eine Missbildung des Flossensaums auf, was bei den
BMP4-ungehemmten Axolotl nicht vorkam.
Die Hemmung des BMP4 Proteins rief ein von dem geradlinigen Rückenmarksverlauf
abweichendes Wachstum des regenerierten Rückenmarks bei sämtlichen sieben Exemplaren
hervor.
Doch können aus den Aufnahmen nicht nur die Erkenntnis des positiven Einflusses des
BMP4 auf die Schwanzregeneration beim Axolotl abgeleitet werden, sondern sie lassen auch
weitere Vermutungen über den Wiedereinstieg ausdifferenzierter Zellen in den Zellzyklus
aufkommen. u
Aus den Bildern lässt sich entnehmen, dass ausdifferenzierte Zellen, also Dauergewebszellen
wie Muskel- und Nervenzellen, die sich zum Beispiel in unserem menschlichen Körper nicht
mehr teilen können, sich im Axolotlorganismus vermehren und somit zur Regeneration
beitragen.
Einen Beleg für diesen Gedanken liefern die fluoreszierenden Farbproteine, welche sich
sowohl in den Zellen befinden, in welche sie elektroporiert wurden, als auch in den
neugebildeten Zellen des Schwanzes.
Die genetische Information des GFP-T2A-Cherry Reporterplasmid muss bei der Zellteilung
der ausdifferenzierten Zellen in die Zellen des regenerierten Abschnittes weitergegeben
worden sein, denn in der Betrachtung am Fluoreszenzmikroskop sind an beiden Stellen, den
„alten“ und den neu gebildeten Zellen, synthetisierte fluoreszierende „Farbproteine“ zu
finden.
21
6 Danksagung
Die zu meinen Untersuchungen notwendigen Experimente überwachte während meines
Aufenthaltes am Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik
Herr Philipp Weissert, ein angehender Doktor der Biologie. Mit sehr viel Ausdauer und
Verständnis wies er mich in den Umgang mit den Geräten ein und stand mir bei jeder Frage
und bei jedem Problem zur Seite.
An dieser Stelle spreche ich ihm einen besonderen Dank aus, da er für mich sehr viel Zeit
und Geduld aufbrachte und durch seine Arbeit meine Begeisterung für die Biologie
intensivierte und das Studium der Biologie mein erstrebenswertes Hauptziel wurde.
Dank auch meiner Biologielehrerin, Frau Wilhelm. Sie half mir auftretende Fragen zu klären,
stellte mir Fachliteratur für meine Recherchen zur Verfügung und überwachte meine
schriftlichen Ausführungen.
Ebenfalls Dank Herrn Pamsch, der das gesamte Praktikum organisierte und Frau Elly Tanaka
und ihrem Team. Sie ermöglichten mir einen Einblick in ihre Forschungen und integrierten
mich vollständig in ihr angenehmes Arbeitsklima.
22
7 Quellenverzeichnis
1 http://www.dradio.de/aktuell/631390/
2 http://www.organspende-und-transplantation.de/tag_der_organspende.htm
3 www.wikipedia.org/wiki/Azteken
4 http://www.axolotl-online.de/body_index.html
5 http://de.wikipedia.org/wiki/G%C3%B6tter_der_Azteken
6 Wistuba, Joachim: Axoltol. Natur und Tier – Verlag 2000, S. 58
7 ebd. S. 47
8 ebd. S. 48
9 ebd. S. 49
10 ebd. S. 50
11 ebd. S. 56
12 ebd. S. 58
13 ebd. S. 59
14 ebd. S. 60
15 ebd. S. 63
16 www.wikipedia.org/wiki/Bone_morphogenetic_protein
17 www.wikipedia.org/wiki/signalkaskade
18 Weiß, Dr. Joachim: Meyers Taschenlexikon Band 1. B.I.-Taschenbuchverlag 1999,
S. 1594
19 http://de.wikipedia.org/wiki/Intrathekal
20 http://de.wikipedia.org/wiki/Elektroporation
21 http://de.wikipedia.org/wiki/Licht#Physiologie
23
8 Literaturverzeichnis
Bayrhuber, Horst/ Kull, Ulrich: Linder Biologie. Hannover:
Schroedel Verlag GmbH 21 1998
Brehme, Siegfried/ Meincke, Irmtraut: Wissensspeicher Biologie. Berlin:
Volk-und-Wissen-Verlag 1 2005
Hafner, Lutz/ Hoff, Peter: Genetik. Hannover: Schroedel Schulbuchverlag 2000
Libbert, Eike: Allgemeine Biologie. Jena: VEB Gustav Fischer Verlag 5 1986
Probst, Wilfried/ Schuchardt, Petra: Abiturwissen Biologie. Mannheim:
Dudenverlag 2004
Weber, Wilhelm/Sieve, Bernhard: Entwicklungsbiologie. Hannover:
Schroedel Verlag 2002
Weber, Wilhelm/ Scharf, Karl-Heinz: Fortpflanzung und Entwicklung. Hannover:
Schroedel Schulbuchverlag 1993
Weiß, Joachim: Meyers Taschenlexikon in 10 Bänden. Augsburg:
Weltbild-Verlag 1999
Wistuba, Joachim: Axolotl. Münster: Natur-und-Tiere-Verlag 1 2000
Wolpert, Lewis: Principles of Development. New York: Oxford University 2 2002
24
9 Selbstständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe
verfasst und keine anderen Hilfsmittel als angegeben verwendet habe. Insbesondere
versichere ich, dass ich alle wörtlichen und sinngemäßen Übernahmen aus anderen Werken
als solche kenntlich gemacht habe.
Riesa, 03.03.2008
25
10 Anlagenverzeichnis
a Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik Dresden, S. 3
b Axolotl wildfarben, S. 4
c Axolotl leukistisch, S. 4
26
d Eines meiner untersuchten Axolotl in seinem Trinkbecher, mit Futter, S. 4
e Lage des Xochimilcosees in Mexico, S. 5
27
f Rückgang des Xochimilcosees und Expansion der Stadt Mexico City, S. 5
28
29
g Injektionsmikroskop, S. 13
mit h Injektionsnadelhalterung am Injektionsmikroskop, S. 13
i Elektroporator, S. 14
i
h
j manuelle Mikroliterpipette mit aufgesetzter Kunststoff Pipettenspitze, S. 12 f.
30
k Daten zur Elektroporation, S. 14
Set up
Voltage
Pulse Length
Pulses
Interval
Polarity
l Fluoreszenzmikroskop, S. 15
15 V
50 ms
5
100 ms
unipolar
31
m Dauer der Belichtung plasmidhaltigen Zellen, S. 15
4.7.2007, am Tag der Elektroporation
Anregung der Fluoreszenz
in ms:
Exemplar:
RFP
GFP
32
SC-N-Ι
1000
2000
SC-N-ΙΙ
1000
4000
SC-N-ΙΙΙ
700
10000
SC-N-ΙV
2000
3000
SC-N-V
4000
4000
SC-M2-Ι
/
/
SC-M2-ΙΙ
/
/
SC-M2-ΙΙΙ
/
/
SC-M2-ΙV
3000
8000
SC-M2-V
250
2000
M-N-Ι
2000
8000
M-N-ΙΙ
3000
10000
M-N-ΙΙΙ
/
/
M-N-ΙV
/
/
M-N-V
/
/
M-M2-Ι
/
/
M-M2-ΙΙ
/
/
M-M2-ΙΙΙ
/
/
M-M2-ΙV
800
3000
M-M2-V
2000
1500
/… Exemplare, bei welchen ich keine Fluoreszenz im red- beziehungsweise green-Channel
feststellen konnte und damit für die weiteren Untersuchungen ausschieden
5.7.2007, ein Tag nach der Elektroporation
Anregung der Fluoreszenz
in ms:
RFP
GFP
1000
2000
Exemplar:
SC-N-Ι
33
SC-N-ΙΙ
1000
4000
SC-N-ΙΙΙ
2500
10000
SC-N-ΙV
550
2500
SC-N-V
2000
10000
SC-M2-Ι
/
/
SC-M2-ΙΙ
/
/
SC-M2-ΙΙΙ
/
/
SC-M2-ΙV
1000
3000
SC-M2-V
450
3000
M-N-Ι
1000
3000
M-N-ΙΙ
1000
5000
M-N-ΙΙΙ
/
/
M-N-ΙV
/
/
M-N-V
/
/
M-M2-Ι
/
/
M-M2-ΙΙ
/
/
M-M2-ΙΙΙ
/
/
M-M2-ΙV
500
1500
M-M2-V
700
3000
/… Exemplare, bei welchen ich keine Fluoreszenz im red- beziehungsweise green-Channel
feststellen konnte und damit für die weiteren Untersuchungen ausschieden
6.7.2007, zwei Tage nach der Elektroporation
Anregung der Fluoreszenz
in ms:
RFP
GFP
1000
6000
Exemplar:
SC-N-Ι
34
SC-N-ΙΙ
1000
5000
SC-N-ΙΙΙ
900
5000
SC-N-ΙV
400
2000
SC-N-V
2000
8000
SC-M2-Ι
/
/
SC-M2-ΙΙ
/
/
SC-M2-ΙΙΙ
/
/
SC-M2-ΙV
300
6000
SC-M2-V
150
2000
M-N-Ι
250
1500
M-N-ΙΙ
2500
8000
M-N-ΙΙΙ
/
/
M-N-ΙV
/
/
M-N-V
/
/
M-M2-Ι
/
/
M-M2-ΙΙ
/
/
M-M2-ΙΙΙ
/
/
M-M2-ΙV
250
1000
M-M2-V
1000
5000
/… Exemplare, bei welchen ich keine Fluoreszenz im red- beziehungsweise green-Channel
feststellen konnte und damit für die weiteren Untersuchungen ausschieden
9.7.2007, fünf Tage nach der Elektroporation
Anregung der Fluoreszenz
in ms:
RFP
GFP
Exemplar:
a,
b,
c,
d,
a,
b,
c,
d,
35
SC-N-Ι
300
500
1000
1000 2000 5000
SC-N-ΙΙ
1000 1000 900
SC-N-ΙΙΙ
200
2000 2000
1000 8000 6000
SC-N-ΙV
800
1250 300
2000 4000 8000
SC-N-V
2000 2000 2000
900
3000 5000 4000 4000
5000 4000 6000
SC-M2-Ι
/
/
SC-M2-ΙΙ
/
/
SC-M2-ΙΙΙ
/
/
SC-M2-ΙV
250
200
300
SC-M2-V
100
1500 1500 1000
250
M-N-Ι
100
2000
1000 5000
M-N-ΙΙ
2000 1000
5000 4000
M-N-ΙΙΙ
/
/
M-N-ΙV
/
/
M-N-V
2000 1500 1000
4000 5000 8000
/
/
M-M2-Ι
/
/
M-M2-ΙΙ
/
/
M-M2-ΙΙΙ
/
/
M-M2-ΙV
200
500
150
M-M2-V
1000 4000 4000
800
600
300
4000 5000 8000
/… Exemplare, bei welchen ich keine Fluoreszenz im red- beziehungsweise green-Channel
feststellen konnte und damit für die weiteren Untersuchungen ausschieden
11.7.2007, sieben Tage nach der Elektroporation
Anregung der Fluoreszenz
in ms:
RFP
GFP
Exemplar:
a,
b,
c,
d,
a,
b,
c,
d,
36
SC-N-Ι
400
400
500
1300 1300 2000
SC-N-ΙΙ
600
900
1000 2500
3000 3000 4000 8000
SC-N-ΙΙΙ
600
2500 4000 2500
SC-N-ΙV
1000 2000 2200 500
5000 6000 6000 1500
SC-N-V
2000 1000 1500
800
500
8000 10000 12000
6000 6200
SC-M2-Ι
/
/
SC-M2-ΙΙ
/
/
SC-M2-ΙΙΙ
/
/
SC-M2-ΙV
300
300
800
500
2000 2000 1000 1000
SC-M2-V
250
1000 2000
1000 3000 5500
M-N-Ι
100
800
2000
1000 3500 6000
M-N-ΙΙ
1800 3000 1000
8000 10000 8000
M-N-ΙΙΙ
/
/
M-N-ΙV
/
/
M-N-V
/
/
M-M2-Ι
/
/
M-M2-ΙΙ
/
/
M-M2-ΙΙΙ
/
/
M-M2-ΙV
500
800
800
M-M2-V
1000 2000 3500
800
1500 1500
6000 8000 12000
/… Exemplare, bei welchen ich keine Fluoreszenz im red- beziehungsweise green-Channel
feststellen konnte und damit für die weiteren Untersuchungen ausschieden
n Daten zur zweiten Elektroporation, S. 16
Set up
Voltage
30 V
Pulse Length
50 ms
Pulses
5
Interval
100 ms
Polarity
unipolar
37
o Einstellungen am Fluoreszenzmikroskop für das Programm MetaVue, S. 17
Oberes DIC = 0
Unteres DIC = 30
p Exemplare mit intrathekal injiziertem pSuper-M2 Plasmid, S. 18
Exemplar SC-M2-IV, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
38
amputation plane
Exemplar SC-M2-IV, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
39
Exemplar SC-M2-V, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar SC-M2-V, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
40
q Länge der regenerierten Bereiche, S. 18 ff.
gerundete Länge des regenerierten
Schwanzteils in μm:
nach 5 Tagen
nach 8 Tagen
Exemplar:
SC-N-Ι
SC-N-ΙΙ
SC-N-ΙΙΙ
SC-N-ΙV
SC-N-V
SC-M2-Ι
SC-M2-ΙΙ
SC-M2-ΙΙΙ
SC-M2-ΙV
SC-M2-V
M-N-Ι
M-N-ΙΙ
M-N-ΙΙΙ
M-N-ΙV
M-N-V
M-M2-Ι
M-M2-ΙΙ
M-M2-ΙΙΙ
M-M2-ΙV
M-M2-V
Rückenmark Schwanz
Rückenmark Schwanz
1167
1167
1250
1667
1300
2000
2000
2125
2000
1500
1667
2083
1833
1917
2200
/
/
/
2400
2750
2875
2500
2250
/
/
/
1875
1250
3000
2000
2250
2500
3250
3125
1143
1000
1786
1571
1800
2500
2200
3500
/
/
/
/
/
/
/
/
/
1143
800
/
/
/
1714
2000
/... aus der Untersuchung entfallene Exemplare
1700
2750
2300
3500
41
r Exemplare mit intramuskulär injiziertem pSuper-M2 Plasmid, S. 18
Exemplar M-M2-IV, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar M-M2-IV, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
42
Exemplar M-M2-V, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar M-M2-V, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
43
s Exemplare mit intrathekal injiziertem pSuper-Noggin-M2 Plasmid, S. 18
Exemplar SC-N-I, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar SC-N-I, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
44
a.p.
Exemplar SC-N-II, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
45
Exemplar SC-N-II, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar SC-N-III, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
46
a.p.
Exemplar SC-N-III, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar SC-N-IV, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
47
a.p.
Exemplar SC-N-IV, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
48
Exemplar SC-N-V, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
Exemplar SC-N-V, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
49
t Exemplare mit intramuskulär injiziertem pSuper-Noggin-M2 Plasmid, S. 19
Exemplar M-N-I, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
M-N-I, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
50
a.p.
Exemplar M-N-II, regenerierter Schwanzteil fünf Tage nach der Amputation
a.p.
51
M-N-II, regenerierter Schwanzteil acht Tage nach der Amputation
a.p.
u Vereinfachte Darstellung des Zellzyklus, S. 20
52
53
11 Bildnachweis
a http://www.mpi-cbg.de/research/building.html
b http://www.ambystoma.de/index.html
c http://de.wikipedia.org/wiki/Axolotl
d Foto: Renneberg, Claudia
e Wistuba, Joachim: Axoltol. Natur und Tier – Verlag 2000, S. 7
f ebd. S. 6
g Foto: Renneberg, Claudia
h ebd.
i ebd.
j http://de.wikipedia.org/wiki/Pipette
p Foto: Renneberg, Claudia. Fluoreszenzmikroskop, Programm: MetaVue
r ebd.
s ebd.
t ebd.
u Modell: Renneberg, Claudia