coloração de gram - DBM - Universidade Federal da Paraíba

Universidade Federal da Paraíba – UFPB
Centro de Ciências Exatas e da Natureza – CCEN
Departamento de Biologia Molecular – DBM
Laboratório de Genética de Microrganismos – LGM
IX Semana de Biologia da UFPB
Mini-curso
COLORAÇÃO DE GRAM
www.dbm.ufpb.br/microbio
Coloração de Gram
A
coloração
de
Gram
foi
desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é
um dos procedimentos de coloração mais
úteis, pois classifica as bactérias em dois
grandes grupos: gram-positivas e gramnegativas.
Neste
procedimento,
um
esfregaço fixado pelo calor é recoberto com
um corante básico púrpura, usualmente a
violeta de genciana. Uma vez que a
coloração púrpura impregna todas as
células, é denominada coloração primaria.
Após um curto tempo, o corante púrpura é
lavado e o esfregaço é recoberto com iodo,
um mordente. Quando o iodo é lavado,
ambas as bactérias gram-positivas e gramnegativas aparecem em cor violeta escuro.
A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou
uma solução de álcool-acetona. Esta
solução é um agente descolorante, que
remove o púrpura das células de algumas
espécies, mas não de outras. O álcool é
lavado e a lâmina é então corada com
safranina, um corante básico vermelho. O
esfregaço pé lavado novamente, seco em
papel e examinado microscopicamente
(Fig. 1, 2 e Anexo).
A parede celular bacteriana é
composta de uma rede macromolecular
denominada peptideoglicana, que está
presente isoladamente ou em combinação
com outras substancias. A peptideoglicana
consiste de um dissacarídeo repetitivo
unido por polipeptídeos para formar uma
rede que circunda e protege a célula. A
porção dissacarídica é composta por
monossacarídeos
denominados
Nacetilglicosamina (NAG) e ácido Nacetilmurâmico (NAM) (Fig.3).
Figura 1 – Coloração de Gram: Bacillus cereus (+) e
Escherichia coli (-).
Figura 3 - Moléculas que formam a peptideoglicana.
Na maioria das bactérias grampositivas (Fig. 4), a parede celular consiste
de muitas camadas de peptideoglicana,
formando uma estrutura rígida. Além disso,
contém ácidos teicóicos, que consistem
primariamente de um álcool e fosfato.
As paredes celulares das bactérias
gram-negativas (Fig. 5) consistem de uma
ou algumas camadas de peptideoglicana e
uma membrana externa. A peptideoglicana
está ligada a lipoproteínas na membrana
externa e está no espaço periplasmático,
um espaço entre a membrana externa e a
membrana plasmática. As paredes gramnegativas não possuem ácidos teicóicos,
mas sim de lipopolissacarídeos (LPS) e
fosfolipídios.
Figura 4 - Parede celular gram-positiva.
Figura 5 - Parede celular gram-negativa.
Referências:
Figura 2 – Coloração
de Gram mista:
Streptococcus sp
(+). e E. coli (-).
- Grupo de Ciências Biológicas do IST. Coloração de
células pelo método de Gram. Disponível em:
http://www.eescola.pt/site/topico.asp?topico=306&ordem=3&ca
nal=5
- TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.
Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2003.
Anexo - Procedimento
1- Cobrir o esfregaço da cultura em estudo
(previamente fixado à lâmina de vidro) com uma
solução de Violeta de cristal (VC). Deixar atuar
durante 1 minuto.
Nota: após este passo, todas as células ficam
coradas com o violeta de cristal (corante primário).
2- Escorrer o corante e lavar com água. Secar com
papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação
com reagente de Lugol e deixar atuar durante 1
minuto.
3- Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e
secar.
Nota: o iodo da solução de Lugol forma um
complexo insolúvel com o corante primário. O
complexo violeta de cristal - iodo (VC-I) tem uma
cor mais intensa (violeta escuro) do que o VC livre
e é mais difícil de remover das células.
4- Diferenciar pelo álcool a 90°, deixando cair a
solução de álcool gota a gota sobre a preparação
até que não saia mais corante.
Nota: este é o passo de diferenciação entre
bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As
primeiras perdem o complexo VC-I e as últimas
retêm-no. As células de bactérias Gram-positivas
ficam, então, coradas de violeta-escuro e as Gramnegativas ficam incolores.
5- Lavar com água, escorrer e secar com papel de
filtro.
6- Tornar a corar a preparação, durante 5 minutos,
com uma solução de safranina.
Nota: as células incolores de bactérias Gramnegativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do
contra-corante safranina).
7- Escorrer o corante, lavar com água e secar com
papel de filtro.