ANÁLISE METAGENÔMICA DA COMUNIDADE DE BACTÉRIAS

Transcrição

I CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA AGROPECUÁRIA,
AGRÍCOLA E AMBIENTAL (CBMAAA)
09 a 12 de maio de 2016 - Centro de Convenções da UNESP,
Câmpus de Jaboticabal, SP
ANÁLISE
METAGENÔMICA
BACTÉRIAS
NITRIFICANTES
DA
COMUNIDADE
EM
DOIS
SOLOS
DE
SOB
DIFERENTES TIPOS DE MANEJO
Metagenomic analysis of bacterial community related to nitrification
on two soils under different management systems.
Rafael Correia da Silva (1)
Anderson Souza (2)
Ana Paula Fleitas Sachelaride (3)
Elaine Costa Souza (4)
Rodrigo Matheus Pereira(5)
Resumo
Em razão do aumento da produtividade agrícola brasileira dos últimos anos, a necessidade da
compreensão de técnicas de sustentabilidade do campo torna-se essencial. Com isso, o
presente trabalho teve por escopo elucidar o perfil taxonômico dos micro-organismos
relacionados ao ciclo do nitrogênio presentes no solo em sistema de plantio direto em
comparação à mata nativa local através da análise metagenômica usando WGS, WholeGenome Shotgun – uma técnica que permite a análise direta da comunidade local de bactérias
sem a necessidade de cultivo. Identificamos 21 espécies relacionadas ao ciclo de nitrogênio,
distribuídas em 5 gêneros, sendo que esses micro-organismos apresentaram diferença
estatística significante em proporções entre as sequências identificadas. O solo sob mata
nativa apresentou uma proporção de sequências maior para bactérias relativas à nitrificação de
leguminosas, enquanto o solo sob sistema de plantio direto revelou uma quantidade maior de
sequências relativas à nitrificação de plantas não-leguminosas.
Palavras-chave: Biodecomposição, ciclo do nitrogênio, Ecologia de micro-organismos,
NGS.
1
Graduando em Biotecnologia pela Universidade Federal da Grande Dourados.e-mail: [email protected]
3
4
Doutora em Melhoramento Genético de Plantas Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias pela Universidade Estadual Paulista Júlio de
Mesquita Filho. e-mail: [email protected].
5
Doutor em Microbiologia Agropecuária pela Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Docente da Faculdade de Ciências
Biológicas e Ambientais (FCBA) da UFGD. e-mail: [email protected].
2
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Abstract
Due to increased productivity growth in Brazil’s agriculture in the latest years, the need to
comprehend sustainability techniques becomes latent. With that, the present work’s main goal
was to elucidate a taxonomic profile from soil microorganisms of a no-tillage system soil and
to compare it with the taxonomic profile from a soil extracted from the local flora – this was
accomplished by Whole-Genome Shotgun analysis, a metagenomic technique that allows
direct analysis of the local bacterial community without cultivating those bacteria. We were
able to identify 21 species of bacteria related to nitrogen cycle, spread among five genera.
These bacteria showed significant statistical difference from one soil to the other in
proportions between identified sequences. The native forest soil showed a higher amount of
sequences related to nitrification in leguminous plants, and the no-till soil showed a higher
amount of proportions related to nitrification in non-leguminous plants.
Keywords: Biodecomposition, microbial ecology, NGS, nitrogen cycle.
1. Introdução
Nos últimos 15 anos, a produção brasileira de grãos tem sido cada vez mais
significativa, apesar da área plantada se manter quase constante, pode-se dizer que há uma
tendência na busca pela produtividade, isto é, uma maior produção de grãos, sem
necessariamente um aumento na área cultivada. (CONAB, 2016).
Essa busca por uma produtividade maior depende, quase sempre, de maquinário
pesado para semear, plantar, colher e remover resíduos – o que leva a ocorrência nãointencional de uma queda na qualidade do solo através do deterioramento da estrutura dos
agregados ali presente, como queda na fertilidade, erosão e biodiversidade (CHÁVEZROMERO et al., 2016).
Uma das técnicas agrícolas que busca promover uma maior sustentabilidade é o
sistema de plantio direto, sendo esse, aquele que ocorre a semeadura direta entre os resíduos
do cultivo anterior, permitindo assim, relações benéficas ao equilíbrio químico, físico e
biológico. Além disso, os micro-organismos desse sistema possuem maior capacidade de
degradação de compostos aromáticos, o que se relaciona à sua habilidade degradadora de
agroquímicos (CAROLINI et al., 2015).
A compreensão do impacto das técnicas agrícolas como o plantio direto é necessária
para dimensionar a alteração na diversidade de bactérias, pois essas têm papel fundamental na
relação entre o solo e as plantas durante o cultivo, uma vez que, estimulam o crescimento das
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mesmas, protegendo-as de fitopatógenos e da degradação de compostos tóxicos, como metais
pesados e xenobióticos (AHEMAD; KIBRET, 2014).
A fixação biológica de nitrogênio é um processo fundamental nos ciclos globais desse
elemento, tendo a contribuição de bactérias especificas que auxiliam a mesma, e em especial
as do gênero Rhizobium. (LIU et al., 2014).
A relação entre o ciclo do nitrogênio e a prática de plantio direto também está ligada a
variações em populações de ervas daninhas. Essa prática promove uma intensificação da
biodisponibilidade de N e, com isso, uma correlação direta entre a biodisponibilidade de
nitrogênio e a competitividade entre o cultivar e a planta daninha – que possui uma vantagem
intensa em sistemas de plantio direto, tornando-se muito difícil o cultivo orgânico (isto é, livre
de métodos químicos de manejo de plantas daninhas) nesse sistema. (MIRSKY et al., 2012;
HALDE; BAMFORD; ENTZ, 2015).
Tendo em vista a necessidade de compreensão desse impacto no solo causado pelo
método de plantio direto, a proposta do presente trabalho foi elucidar e documentar a
diversidade taxonômica de bactérias relacionadas ao ciclo do nitrogênio através da técnica
metagenômica, utilizando dois solos, na qual, um apresenta histórico de cultivo em plantio
direto, e outro de mata nativa local, e assim, categorizar o perfil dos micro-organismos
presentes nos dois ambientes.
2. Material e Métodos
Dois solos foram amostrados da Embrapa Agropecuária Oeste, localizada em
Dourados, Mato Grosso do Sul. O primeiro solo, está em sistema de manejo de plantio direto
(solo PD, S22º27’9410’’, W54º81’2593’’) que foi instaurado desde 1995 com diferentes
sequências de cultura. O segundo solo foi retirado da Mata Nativa local (solo MN,
S22º28’2231’’,W54º81’4571’’) que se consiste em uma floresta semidecidual.
Os solos
foram retirados a até 10 cm de profundidade. Retiraram-se 10 amostras simples de cada uma
das regiões – Mata Nativa (MN) e Plantio Direto (PD), que foram compostas em uma única
amostra de solo representativa de cada localização.
O DNA total foi extraído com o DNA Spin Kit (MoBio Laboratories, EUA) de acordo
com as instruções do fabricante. O controle de qualidade do DNA e a quantificação foi
realizada por espectrofotometria NanoDrop® (ThermoScientific) e por fluorometria em
Qubit® (Invitrogen) de acordo com as especificações dos fabricantes.
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O DNA foi sequenciado utilizando a metodologia Ilumina® HiScanSQ. O primeiro
controle de qualidade do sequenciamento foi realizado com o software FastQC. As
sequências muito curtas ou de baixa qualidade foram removidas utilizando o software PrinSeq
(SCHMIEDER; EDWARDS, 2011). A montagem das sequências inéditas (de novo Assembly)
foi realizada com o algoritmo IDBA-UD (PENG et al., 2012), e a localização das ORFs (open
reading frames) foi realizada com o software FragGeneScan (RHO; TANG; YE, 2010).
As ORFs foram submetidas ao servidor MG-RAST (MEYER et al., 2008) para
anotação, gerando-se um total de 54230 sequências na amostra de mata nativa (MN), e 69164
sequências para a amostra de plantio direto (PD). O perfil anotado do MG-RAST foi delineado
para o domínio Bacteria e exportado para o software STAMP (PARKS et al., 2014), para a
realização do cálculo de diferença entre proporções de sequências, através de um teste-G com
correção de Yates. Desses resultados, foram filtrados apenas os gêneros e espécies com
relação ao ciclo do nitrogênio.
3. Resultados e Discussão
Figura 01. Gráfico de barras de erro estendido para diferença entre proporções de gêneros de bactérias
encontradas no solo de Mata Nativa (azul) e Plantio Direto (laranja). Os p-values corrigidos podem ser
encontrados ao lado.
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Figura 02. Gráfico de barras de erro estendido para diferença entre proporções de espécies de bactérias
encontradas no solo de Mata Nativa (azul) e Plantio Direto (laranja). Os p-values corrigidos podem ser
encontrados ao lado.
Dos micro-organismos relacionados ao ciclo de nitrogênio e fixação desse elemento, a
importância da relação das bactérias do gênero Rhizobium é inestimável – a produção de
legumes possui uma relação multiplicativa que depende da estirpe de Rhizobium que nodula
(ou seja, provoca a formação de nódulos) o legume, sendo que essa é uma bactéria
amplamente aplicada na tecnologia de inoculantes (RONNER et al., 2016).
Um dos gêneros de interesse (e presente em ambos os solos) é o Bradyrhizobium, que
realiza associação com a planta da soja, provendo nutrientes e um ambiente protetor para o
desenvolvimento
da
região
rizosférica
(BARTHELEMY-DELAUX
et
al.,
2014),
especialmente algumas estirpes das espécies Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium
diazoefficiens (LIU et al., 2014).
As bactérias do gênero Azorhizobium também já foram atestadas para sua capacidade
de nodulação (CICCOLELLA et al., 2010), sendo utilizadas ainda, inclusive, na determinação
dos mecanismos de consolidação da simbiose entre o micro-organismo e a região rizosférica
(WAKAO et al., 2015).
Quanto às bactérias dos gêneros Sinorhizobium e Mesorhizobium, são utilizadas em
diferentes estirpes como co-inoculantes, tendo assim também um papel no ciclo do nitrogênio.
(GERDING et al., 2014). Os Mesorhizobium possuem alta diversidade genética e metabólica,
e possuem alto potencial para melhoramento biotecnológico (NASR ESFAHANI et al., 2014).
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Por sua vez, os Sinorhizobium são simbiontes fixadores de nitrogênios de vários
legumes, caracterizados pela secreção de quantidades consideráveis de riboflavinas, que
possuem papel na cadeia transportadora de elétrons – um mecanismo fundamental ao
metabolismo das plantas (YURGEL et al., 2014).
O gênero Frankia está relacionado a associações simbiontes com plantas actinorrízicas
– são plantas que, apesar de não serem leguminosas, possuem um ancestral comum com as
Fabaceae (legumes) e realizam nodulações rizosféricas em associação a micro-organismos
pertencentes à esse gênero, formando nódulos (SANTI; BOGUSZ; FRANCHE, 2013).
4. Conclusões
Com a identificação das bactérias associadas à fixação de nitrogênio nos dois solos,
pode-se afirmar que apesar dos diferentes tipos de manejo do solo, apresentou pequena
diferença. Foi possível identificar diferença estatisticamente significativa entre 21 espécies
relacionadas ao ciclo de nitrogênio, distribuídas em 5 gêneros.
O solo da floresta nativa apresentou quantidade de sequências um pouco maior para
bactérias que realizam simbiose com leguminosas, enquanto o solo sob sistema de plantio
direto apresentou uma maior proporção de bactérias associadas à nodulação em nãoleguminosas.
5. Agradecimentos/ Apoio financeiro
Agradecemos a Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e
Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul (FUNDECT), à Embrapa-CPAO pela
disponibilidade no fornecimento dos solos e prestatividade em nos atender e orientar, e por
fim, nosso agradecimento também à UNESP-Jaboticabal pela assistência quanto ao
sequenciamento de nossas amostras.
Referências
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promoting rhizobacteria: Current perspective. Journal of King Saud
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