Ciência em Animais de Laboratório

02/10/2012
Ciência em Animais de
Laboratório
Status genético de animais de laboratório
Marcel Frajblat
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Fatores que afetam o animal (e seu bembemestar) e podem afetar o resultado de um
experimento
Limpeza
Transporte
Sexo
Procedimentos Caixa Bioterista
Nutrição
experimentais
Temperatura
Umidade
Água
Genética
Iluminação
Ruído
Ar
Eutanásia
Contenção
Inseticidas
Desinfetantes
Idade feromônio
População em caixa
Troca de caixa
Anestesia
Adaptado Baker et al, 1969
Maravalha
Amônia
Delineamento
Analgesia
Patógenos
experimental
FATORES MICROBIOLÓGICOS
Controle Genético
BALB, C57BL/6 ou C57BL/10?
DBA ou CBA?
Nude ou Scid?
Heterogênico ou isogênico?
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ORIGEM DOS CAMUNDONGOS DE
LABORATÓRIO
Linhagens geneticamente
definidas e indefinidas
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Camundongos heterogênicos
Estoques outbred
• Geneticamente indefinidos
• Fáceis de obter, mais baratos
• Altos índices reprodutivos
• Precisam ser utilizados em maior número devido à
variabilidade genética
• Apesar de aparentemente uniforme, apresentam
variabilidade genética.
ROTATIVO
Famílias ou grupos de 25 - 30 casais
Para colônia de animais heterozigotos
MACHO
FÊMEA
NOVA FAMÍLIA
FAMÍLIA A X
FAMÍLIA B =
FAMÍLIA E
FAMÍLIA B X
FAMÍLIA C =
FAMÍLIA A
FAMÍLIA C X
FAMÍLIA D =
FAMÍLIA B
FAMÍLIA D X
FAMÍLIA E =
FAMÍLIA C
FAMÍLIA E X
FAMÍLIA A =
FAMÍLIA D
POPULAÇÕES GENETICAMENTE
DEFINIDAS
Linhagens isogênicas
Linhagens congênicas
Speed congênicas
Linhagens geneticamente modificadas
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LINHAGENS ISOGÊNICAS
99,98% de isogenicidade
Pelo menos vinte cruzamentos sucessivos 20 no
mínimo.
Depois dos cruzamentos as linhagens são
testadas geneticamente e descritas.
Sistema de acasalamento restringe a
variabilidade genética.
Baixas taxas reprodutivas: natalidade e
produtividade
Mais sensíveis a fatores ambientais.
Maior custo comparado ao outbred.
Camundongos isogênicos_Inbred
• Considerações:
• Sistema de acasalamento restringe a variabilidade genética.
• Capacidade reprodutiva diminuída, índice de natalidade e de
produtividade comparativamente baixo.
• Altamente sensíveis a fatores ambientais, a produção é
bem sucedida em áreas com infraestrutura para SPF.
• O background genético pode ser verificado (microsatélites)
• Animal produzido tem alto custo.
LINHAGENS ISOGÊNICAS
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Características fenotípicas de
linhagens isogênicas
Redução na variabilidade e aumento na frequência de
uma característica
Aprendizado em camundongos:
Diferenças na genética do animal
Diferenças entre linhagens na resposta
ao Dietilbestrol (DES)
% tumores mamários
80
Control
DES
60
40
20
0
SD
ACI
Rat strain
Shellabarger et al J.Nat.Can.Inst. 61:1505, 1978. Results averaged over 4 irradiation levels
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Vinte e dois Prêmios Nobel desde1960 para trabalhos
com linhagens isogênicas
Dr Michael Festing, http://www.isogenic.info
Cell mediated immunity
Immunological tolerance
H2 restriction, immune responses
Medawar, Burnet, Doherty, Zinkanagel
Benacerraf (G.pigs)
Genetics
Snell
Humoral immunity/antibodies
T-cell receptor
Tonegawa, Jerne
monoclonal antibodies
BALB/c mice
Kohler and Millstein
C.C. Little, DBA, 1909
Inbred Strains and derivatives
Jackson Laboratory
ES cells & “knockouts”
Evans, Capecchi, Smithies
Cancer
mmTV
Transmissable
encephalopathacies/prions
Pruisner
Smell
Axel & Buck
Retroviruses, Oncogenes & growth factors
Cohen, Levi-montalcini, Varmus, Bishop, Baltimore, Temin
Camundongos geneticamente modificados
transgênicos - recombinantes
Alteração do genoma.
Inserção de um novo gene que não pertence
a espécie.
Alteração (mutação) de um gene da espécie.
Produção de Animais
Geneticamente Modificados
IMPORTÂNCIA DA ESCOLHA DO MODELO DE ESTUDO
E NOVAS TECNOLOGIAS
Produção de
novas linhagens
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Fundo genético – Background
Importância
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Fundo genético – Background
Importância
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Efeito do fundo genético
Background
Linhagens Congênicas
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Linhagens Congênicas
Considerações gerais
Observação genética
Poder da observação deve ser sempre feito quando
se trabalha com animais. Procura por mutantes.
Quando trabalhar com um mutante, nunca observar
somente um órgão.
Fazer necropsia total.
Tem características que podem pertencer a qualquer
linhagem e algumas que podem caracterizar uma
linhagem específica.
Uma grande variação em uma linhagem isogênica
pode indicar algum tipo de erro analítico ou
contaminação.
Considerações genética
Fenótipos resultam de uma interação complexa entre
o genoma e fatores ambientais que devem ser
controlados ou pelo menos mencionados nos
resultados.
Cada linhagem tem sua característica e deve ser
conhecida por quem a usa.
Fundo genético não deve ser um problema para o
pesquisador mas sim uma forma eficiente de otimizar
o camundongo como modelo animal.
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Como Selecionar a linhagem
apropriada
Literatura
Dicas do Mouse Phenome Project
Selecionar linhagens isogênicas geneticamente
diferentes (ramos diferentes da árvore)
Controle genético de animais
de laboratório
Marcadores bioquímicos
Marcadores inmunológicos
Teste de cor da pelagem
Tipificação de DNA – microsatélites
Enxertos de pele
Testes morfológicos
Comportamento reprodutivo/características
da linhagem
Tipificación de DNA - genotipagem
Marcadores bioquímicos
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Genética da pelagem
Testes de cor de pelagem
Ao cruzar camundongos DBA/2 com camundongos albinos, será possível
identificar genes ocultos nos albinos observando os F1. No caso da
linhagem AKR o F1 deverá ser negro e no caso do BALB/c, o F1 deverá
ser Canela
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DNA - Microsatélites
Métodos que controlam várias
características de forma simultânea
Enxertos de pele
Testes morfológicos
Comportamento reprodutivo/características
da linhagem
Tipificación de DNA
Transplante de pele entre
linhagens
Técnica simples,eficiente mas
restrita nos resultados
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TESTES
MORFOLÓGICOS
As mandíbulas de camundongos variam tanto em formato
quanto em tamanho
A análise das onze medidas propostas permitem a
discriminação de linhagens isogênicas
Esse método era utilizado concomitantemente com métodos
bioquímicos ou imunológicos
Características da linhagem
Controle reprodutivo
C57bl/6 com taxa
de natalidade de 9
Agressividade
SJL
X
AKR
Observação de patologias comuns
Por exemplo:
AKR = leucemias T
129 = teratocarcinomas de testículo
NZB = anemia hemolítica auto inmune
NOD = diabetes tipo I
Genotipagem
PCR (polymerase
chain reaction):
técnica de eleição ,
resultados mais
específicos,
segurança para
manutenção de
transgênicos e KOs
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Métodos de prevenção de
contaminação genética
Conscientização dos técnicos envolvidos.
Monitoramento genético constante.
Criopreservação de gametas e embriões.
[email protected]
NUTRIÇÃO
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Influência da concentração de fósforo na incidência de
nefrocalcinosis em ratos
Fósforo, g/kg
Conteúdo de cálcio nos
rins, % de MS
2
4
6
8
0,04
1,6
1,8
5,6
Efeito do Cádmio da dieta na pressão sanguínea de
ratos
Cádmio mg/kg
Pressão sanguínea mm/Hg
0
1
110 ± 3
129 ± 4
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Ad libitum vs. Alimentação controlada
Aspectos científicos e práticos e de bem
estar.
longevidade
Peso corporal
Ad libitum
80%
60%
40%
Consumo hipotético de ratos alimentados ad
libitum ou controlados
Controle
Tratamento
20
18
21
22
15
13
14
16
Controle
Consumo reduzido
15
13
14
16
19
17
Média
19,5
14
15
Média
14,5
14
15
Média
14,5
Ad libitum Ad libitum
Efeito da deficiência do zinco na
concentração de triglicérides plasmáticos em
ratos
Ração
Regime
Controle
Ad libitum
Deficiente
em Zinco
Ad libitum
Triglicerideos Consumo
no plasma
alimentar
mmol/l
mmol
/l
g/dia
1,12
19,5
0,65
14,5
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Efeito da deficiência do zinco na
concentração de triglicérides plasmáticos em
ratos
Ração
Regime
Controle
Ad libitum
Consumo
alimentar
g/dia
19,5
Triglicerídeos
no plasma
mmol/l
1,12
Deficiente
em Zinco
Ad libitum
14,5
0,65
Controle
Consumo
reduzido
14,5
0,55
A diminuição dos triglicérides não foi devido a
deficiência do zinco mas sim a diminuição no
consumo alimentar.
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