Preparo de meios de cultura para ensaios de degradabilidade in vitro

Preparo de meios de cultura para ensaios de degradabilidade in vitro: uma ideia
luminosa!
Romualdo S. Fukushima1*, Paul J. Weimer2, Daniel A. Kunz3
1
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Pirassununga,
SP, Brasil.
2
U.S. Dairy Forage Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research
Service, and Department of Bacteriology, University of Wisconsin - Madison, Madison,
Wisconsin, United States of America.
3
Department of Biological Sciences, University of North Texas, Denton, Texas, United States
of America.
*
Autor correspondente: [email protected]
Resumo
O meio de cultura para o cultivo de microrganismos estritamente anaeróbios, incluindo-se os
da flora do trato gastrointestinal de animais domésticos, deve ser anaeróbio. Esta condição é
altamente desejável nos ensaios de degradabilidade ruminal. O aminoácido cisteína é um dos
agentes redutores mais empregados para a obtenção da anaerobiose no meio de cultura, por
sua ausência de toxicidade, baixo custo e facilidade de manipulação. Entretanto, a ação da
cisteína é muito lenta (2-3 horas para reduzir o meio de cultura), o que torna inconveniente
quando o meio é necessário com urgência ou em grandes quantidades. O tempo necessário
para completa redução de meio de cultura contendo resazurina (um indicador colorido da
condição redox) foi substancialmente menor quando o meio foi artificialmente iluminado com
uma lâmpada incandescente. A intensidade da luz teve impacto no tempo de redução: tubos
contendo meio de cultura mantidos no escuro nunca atingiram nível desejado de anaerobiose
(avaliado por espectroscopia pela descoloração da resazurina) enquanto que tubos sujeitos à
iluminação ordinária de laboratório foram reduzidos em cerca de 2 horas. Quando os tubos
foram submetidos a alta intensidade luminosa (equivalente a uma lâmpada de 100 watts), a
anaerobiose foi alcançada em menos de 20 minutos. A cisteína continuou a ser elemento
necessário para a descoloração da resazurina. Evidências de que a anaerobiose foi atingida
com sucesso foi a constatação de que cinco cepas de bactérias ruminais, quatro espécies de
Clostridium e uma de Thermoanaerobacter exibiram semelhante crescimento (em termos de
lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo) em meio de cultura reduzido através de
alta iluminação ou em meio reduzido da maneira convencional. Foi demonstrada direta
correlação entre o efeito fotocatalítico e decréscimo no teor de oxigênio dissolvido no meio de
cultura.
Palavras-chave: anaerobiose, cisteína, luz, meio de cultura, resazurina
Introdução
O cenário mais provável para a origem e evolução da vida, aponta para uma atmosfera
ausente
de
oxigênio.
Portanto,
os
primeiros
microrganismos
seriam
anaeróbios
(Wächtershäuser, 2000). Após o aparecimento de O2, vários ambientes anaeróbios foram
preservados, o que permitiu a sobrevivência de microrganismos capazes de utilizarem
substratos através das vias fermentativas e processos de respiração anaeróbia (Huber &
Wächtershäuser, 1998). Nos dias atuais, ecosistemas anaeróbios continuam largamente
distribuídos no mundo e incluem estuários, pântanos, e ambientes controlados pelo homem
(aterros sanitários, tonéis de fermentação – etanol, digestores de resíduos animais) bem como
o trato gastrointestinal do homem e animais domésticos (Hobson, 1988; Hungate, 1950).
Ainda, muitos microrganismos anaeróbios são patógenos, com sérias implicações nas saúdes
humana e animal.
Enquanto que algumas espécies de microrganismos toleram breves exposições ao
oxigênio (anaeróbios facultativos), outras espécies podem ser mortas apenas por breve
exposição. Cultivo destas cepas requerem, portanto, meios de cultura com total ausência de
oxigênio. Preparo de meios para anaeróbios estritos tipicamente envolve extenso
borbulhamento com gás carbônico (CO2) para deslocar o O2 dissolvido e rígido selamento
com rolhas de borracha especiais (Hungate, 1950; Balch & Wolfe, 1976). Além disso, muitas
cepas bacterianas requerem agentes redutores; alguns, como o ditionito de sódio, agem
rapidamente, mas geram produtos tóxicos. Outros, como o sulfito de sódio, precipitam metais
essenciais e são relativamente tóxicos para muitas bactérias ruminais. Sais de titânio (III) são
tidos como atóxicos, mas são caros e de difícil manuseio. O aminoácido cisteína (Cys) é
frequentemente utilizado como agente redutor pelo seu baixo custo, baixa toxicidade e
ausência de efeitos colaterais indesejáveis. Entretanto, a velocidade com que ela reduz o meio
de cultura é muito baixa, várias horas (tipicamente, 2-3 horas). Para auxiliar na detecção da
condição anaeróbia, um indicador colorido, a resazurina (RNO), é usado.
Uma observação empírica que uma técnica de laboratório de microrganismos ruminais
(P. A. Tirabasso) fez ao autor correspondente deste artigo, de que o preparo de meios eram
mais rápidos em dias ensolarados do que em dias nublados, inspirou-nos a examinar os efeitos
da luz no preparo de meios de cultura dependentes de Cys e usando RNO como indicador
(Fukushima et al., 2002; 2003). Muito embora há trabalhos na literatura descrevendo ações da
RNO em algumas situações (Prütz et al., 1996; Rasmussen & Nicolaisen, 1999), não há
nenhuma descrição de ação fotolítica da Cys sobre a RNO em promover anaerobiose e assim,
acelerar a confecção de meios de cultura para microrganismos anaeróbios.
Material e métodos
Os materiais e métodos que foram empregados nos trabalhos de Fukushima et al. (2002;
2003) são descritos a seguir:
Efeito da intensidade luminosa
No experimento que avaliou o efeito da intensidade luminosa, os meios de cultura foram
acondicionados em tubos de vidro e hermeticamente selados com rolhas de borracha próprios
para o cultivo de microrganismos anaeróbios. Foi empregado o meio de cultura proposto por
Scott & Dehority (1965) – 10 mL. Como indicador redox, foi usado RNO na concentração de
2,0 mg/L. Cada tubo foi inoculado com 0,4 mL de uma solução estoque de cloridrato de
cisteína (2,5% m/v). Os meios basais continham ainda minerais e ácidos graxos voláteis, além
de outros nutrientes.
A iluminação dos tubos foi realizada com duas lâmpadas de halogênio (500 W cada),
montadas em um suporte, posicionando as lâmpadas em ângulo de 45° e a 40 cm da bancada,
em um laboratório totalmente desprovido de luz. Os tubos foram iluminados com seis
intensidades de luz (seis tratamentos, quatro tubos cada tratamento); a intensidade luminosa,
controlada através de um reostato e um fotodetector, variou de 0 (escuro), 10, 45, 90, 180 a
360 μE/m2 × s (E = Einstein, unidade de intensidade luminosa). Borbulhamento com CO2 foi
de 90 minutos para todos tubos, antes da exposição luminosa. As leituras de absorbâncias
(540 nm) foram realizadas a cada dois minutos, em um espectrofotômetro.
Efeito do tempo de gaseamento com CO2
No experimento avaliando o efeito do tempo de borbulhamento com gás CO2 no meio de
cultura, os tempos foram de 15, 30, 45, 60, 75 ou 90 minutos. Note-se que o CO2 deve ser
isento de O2, o que é obtido pela passagem forçada do gás CO2 através de uma coluna de
vidro contendo filamentos de cobre arranjados em uma resistência elétrica, sendo então
aquecidos a alta temperatura. Neste experimento, os tubos foram submetidos a duas situações
de exposição de luz: 360 μE/m2 × s (alta intensidade luminosa) ou zero de luz (escuro).
Leituras de absorbância foram registradas a cada dois minutos para os tubos da alta
luminosidade e a cada 30 minutos para os tubos mantidos no escuro.
Monitoramento de oxigênio dissolvido
Objetivando verificar se a redução do meio de cultura contend Cys e RNO, catalizada pela
irradiação luminosa, foi acompanhada pelo concomitante desaparecimento do oxigênio
dissolvido, o teor de oxigênio foi mensurado através de um eletrodo, na presença e ausência
de iluminação.
Crescimento microbiano
Nos meios de cultura experimentais, foram cultivados microrganismos tipicamente da flora
ruminal (Lachnospira multipara, Prevotella ruminicola, Ruminococcus flavefaciens,
Selenomonas ruminantium e Streptococcus bovis), bactérias do grupo Clostridium
(Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum e Clostridium perfringens) e uma bactéria
encontrada em sedimentos de gêisers (Thermoanaerobacter saccharolyticum). O meio de
cultura para o cultivo de bactérias ruminais foi um meio celulolítico (Weimer et al., 1984);
para o experimento com o grupo de bactérias dos gêneros Clostridium e Thermoanaerobacter,
foi empregado o meio de cultura proposto por Scott & Dehority (1965).
Duas condições experimentais foram testadas: após a adição de todos reagentes,
incluindo Cys, os tubos foram expostos a alta intensidade luminosa (370-380 μE/m2 × s) ou
baixa intensidade luminosa, cerca de 10 μE/m2 × s, que foi o valor detectado na bancada de
um laboratório convencional com lâmpadas fluorescents no teto. Após o tratamento luminoso,
um inóculo microbiano de 0,3 mL, proveniente de uma cultura estoque, foi injetado em cada
tubo, aquecido a 39°C. Os conteúdos dos tubos foram misturados por inversão antes das
leituras de absorbância a 540 nm. Os parâmetros relativos ao desenvolvimento microbiano,
lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo foram calculados a partir dos valores de
absorbância.
Resultados e Discussão
Efeito da intensidade luminosa
A luz teve substancial efeito na redução dos meios de cultura (Fig. 1). Nas duas maiores
intensidades (360 e 180 μE/m2 × s) virtualmente total redução ocorreu em menos de 20
minutos. Para fins de comparação, uma lâmpada incandescente de 100 W irá produzir uma
intensidade luminosa de cerca de 370 μE/m2 × s, medido a 11 cm da fonte luminosa. Os tubos
mantidos no escuro ou aqueles que receberam 10 μE/m2 × s (que é a típica iluminação de um
laboratório convencional), nunca alcançaram redução durante o periodo de avaliação,
constatação que comprova a observação rotineira de que os tubos só alcançam o necessário
grau de anaerobiose após 2-3 horas de gaseamento com CO2. Rasmussen & Nicolaisen
(1999) observaram insignificante aumento nos níveis de RNO reduzido nos meios de cultura
de células de mamíferos mantidos durante dois dias no escuro.
Figura 1. Efeito da intensidade da luz (μE/m2 × s) no tempo da
redução fotocatalítica da resazurina pela cisteína.
O tempo necessário para totalmente reduzir a RNO foi diretamente proporcional à
intensidade da luz (Fig. 2). Em outras palavras, até o limite testado, quanto maior foi a
intensidade luminosa, mais rápida foi a reação fotocatalítica.
3
Y = 2.42 – 0.533X R2 = 0.968
2
Log T
1
0
0
1
2
3
Log I
Figura 2. Efeito da intensidade da luz no tempo necessário para totalmente
reduzir a resazurina.
Não houve diferenças quanto ao tipo de luz empregada para reduzir a RNO. Tanto a
lâmpada incandescente como a fluorescente, na intensidade de 10 μE/m2 × s, tiveram o
mesmo comportamento (Fig. 3). Desta maneira, a hipótese de influência do calor irradiado da
lâmpada incandescente é infundada. Entretanto, a presença do agente catalílico Cys foi
essencial, para ambos tipos de lâmpadas. A redução do meio é resultante da doação de
elétrons que ocorre quando da união covalente de duas moléculas de Cys para formar a
cistina. Entretanto, o papel mediado pela luz e o mecanismo pela qual ela acelera a redução da
Figura 3. Influências do tipo de lâmpada e presença do agente redutor
cisteína.
RNO pela Cys, ainda é desconhecido.
Observe-se que a intensidade de luz testada foi de 10 μE/m2 × s, o que explica que
redução total não foi alcançada nas duas horas que durou o experimento. Rasmussen &
Nicolaisen (1999) observaram que a redução da RNO em meio de cultura de células
mamíferas foi significativamente aumentada pela exposição à luz fluorescente, 8 horas por
dia, portanto estes autores recomendaram que tais meios de cultura sejam minimamente
expostos à luz. Foi demonstrado que a RNO catalizou eficientemente a fotoxidação de outros
agentes redutores, tais como NADH, GSH, e dopamina (Prütz et al., 1996). Polímeros
produzidos ao aquecer aminoácidos em um meio marinho modificado catalizaram a reação
entre desidrogenação do NADH e redução da RNO, e esta reação foi também acelerada pela
luz (Okihana, 1982).
Efeito do tempo de borbulhamento
O borbulhamento do meio de cultura com CO2 é feito objetivando o deslocamento do O2
dissolvido, e a concentração de CO2 dissolvido é dependente do tempo de gaseificação, até
alcançar um plateau de saturação. Quando os tubos foram mantidos no escuro, o tempo de
borbulhamento não teve influência na redução da RNO pela Cys (Fig. 4, painel superior) e
nunca alcançaram redução, mesmo após 20 horas de monitoramento. Entretanto, sob alta
intensidade luminosa, a redução da RNO foi mais rápida (10 min) nos tubos gaseificados por
75 min do que naqueles borbulhados por 45 ou 15 min (20 e 30 min, respectivamente) (Fig. 4,
painel inferior).
Figura 4. Efeito do tempo de gaseificação com CO2 no tempo de redução dos
meios de cultura. Painel superior: tubos mantidos no escuro; painel inferior:
tubos que foram expostos à luz.
Sumarizando, houve efeito positivo do tempo de borbulhamento de CO2 na redução
do meio. Entretanto, o tempo menor de borbulhamento, 15 minutos, foi rapidamente
compensado no tempo de estabelecimento da anaerobiose, de apenas 20 minutos. Estabelecese nesta observação não apenas a vantagem do tempo como também economia no consumo
do gás CO2.
Prütz et al. (1996) observaram que com a iluminação de uma solução saturada de N2,
a RNO foi eficazmente descolorida, com concomitante aumento de sua forma oxidada e perda
de NADH. Estes autores também reportaram que adição de O2 ao tampão causou drástica
queda na reação fotocatalítica, particularmente nas taxas de redução da RNO.
Monitoramento do desaparecimento de O2
Objetivando estabelecer se a aceleração da redução do meio de cultura catalizada pela
exposição a alta intensidade luminosa, na presença de Cys e RNO, era acompanhada pela
concomitante queda no teor de O2 dissolvido, foi conduzido um ensaio onde o efeito da luz
no consumo de O2 foi avaliado através de um eletrodo. O raciocínio simples implicava que
poderia ocorrer redução no meio de cultura e o teor de O2 dissolvido mudar pouco, fato que
inviabilizaria o crescimento de microrganismos anaeróbios. Na Fig. 5 pode-se visualizar que
inicialmente a luz não teve efeito na redução, provavelmente porque o meio de cultura fora
previamente saturado com ar comprimido, portanto, o meio estava com alta concentração de
O2 dissolvido. Destaque-se que esta fora uma situação artificial, objetivando apenas avaliar
uma situação extrema, que não seria o rotineiro em um laboratório. Esta constatação,
entretanto, enfatiza a importância de parcial redução do meio, que é facilmente obtida com
apenas 15 min de borbulhamento com CO2 (Fig. 4). Após parcial redução ser atingida, o
consumo de O2 foi fortemente influenciado pela luz, de tal maneira que são visíveis os efeitos
de “luz acesa” e “luz apagada” (Fig. 5). Esta observação encontra respaldo na resposta
redutora à iluminação (Fig. 1). Em outras palavras, de fato ocorre redução no teor de O2
dissolvido quando o meio de cultura é iluminado.
Figura 5. Efeito da incidência da luz no consumo
de O2 dissolvido no meio de cultura.
Crescimento microbiano
Enquanto que os experimentos anteriores estabeleceram claramente a efetividade da luz na
redução da RNO, na presença de Cys, e concomitante desaparecimento do O2 dissolvido no
meio, ainda era necessário provar que microrganismos anaeróbios poderiam crescer tão bem
em meio exposto à alta radiação luminosa como no meio preparado de maneira convencional.
Portanto, em um experimento (Fukushima et al., 2002) cinco cepas de bactérias ruminais
foram cultivadas em meio reduzido a alta (360 μE/m2 × s) ou baixa intensidade luminosa
(laboratório convencional - 10 μE/m2 × s). Em um outro experimento (Fukushima et al.,
2003) três cepas de Clostridium e uma de Thermoanaerobacter foram testados.
Para todas as cepas ensaiadas, não houve diferenças significativas entre as duas
intensidades de luz em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo (Tab.
1). Os dados indicam que os benefícios advindos de iluminar o meio de cultura com uma
lâmpada para acelerar o seu preparo não comprometem a utilidade do meio. Este mesmo
procedimento pode ser generalizado e empregado em outras situações onde há cultivo de
microrganismos anaeróbios (ou anaeróbios facultativos) fermentadores, tais como ensaios de
degrabilidade ruminal, estudos em saneamento básico, produção de etanol de primeira
geração, cervejarias, indústrias vinícolas, etc., onde se deseja processos fermentativos mais
rápidos e otimização dos processos industriais.
Tabela 1. Crescimento de bactérias anaeróbias em meios de cultura preparados de maneira
convencional (Baixa intensidade luminosa) ou alta intensidade luminosa (Alta)
Lag time
Bactéria
Baixa
Taxa de crescimento Crescimento máximo
(h-1)
(OD540)
Alta
Baixa
Alta
Baixa
Alta
Lachnospira multipara
3.25±0.47
3,04±0,47 0,49±0,06 0,46±0,06 1,18±0,05 1,17±0,03
Prevotella ruminicola
0,08±0,03
0,25±0,3 0,56±0,02 0,56±0,03 1,41±0,01 1,42±0,03
Ruminococcus flavefaciens
1,76±0,93
0,93±0,72 0,27±0,01 0,27±0,01 0,7±0,04 0,79±0,06
Selenomonas ruminantium
1,22±0,24
1,09±0,06 0,61±0,01 0,61±0,03 1,19±0,03 1,21±0,04
Streptococcus bovis
1,57±0,18
1,33±0,16 1,23±0,03 1,23±0,03 1,41±0,04 1,37±0,03
Clostridium butyricum
3,3±0,5
3,0±1,2
0,49±0,06 0,46±0,06 1,18±0,05 1,17±0,03
Clostridium pasteurianum
0,08±0,03
0,25±0,3 0,56±0,02 0,56±0,03 1,41±0,01 1,42±0,03
Clostridium perfringens
1,76±0,93
0,93±0,72 0,27±0,01
Thermoanaerobacter
saccharolyticum
1,22±0,24
1,09±0,06 0,61±0,01 0,61±0,03 1,19±0,03 1,21±0,04
0,27±0
0,7±0,04 0,79±0,06
Conclusões
Intensa iluminação (por exemplo, com uma ordinária lâmpada de 100 W) de meio de cultura
para microrganismos anaeróbios contendo Cys como agente redutor e RNO como indicador
redox conduz a rápida obtenção da anaerobiose. Ao lado do tempo economizado (2-3 horas
pelo método convencional versus 20-25 minutos usando a lâmpada), outras vantagens
incluem redução do tempo de gaseificação do meio de cultura com CO2 e eliminação da
purga de O2 contido no gás CO2 pela passagem forçada de CO2 através de filamentos de
cobre superaquecidos. Esta aceleração no preparo do meio de cultura não resulta na formação
de compostos inibitórios, pois o crescimento (medido em termos de lag time, taxa de
crescimento e crescimento máximo) de bactérias estritamente anaeróbias foi o mesmo do
obtido com o meio de cultura preparado de maneira convencional, sob baixa intensidade
luminosa. Desta forma, nós sugerimos a utilização desta simples técnica, que em nada afeta a
rotina do laboratório, para acelerar o preparo de meios de cultura para bactérias anaeróbias.
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