Volume 1 Número 1

Transcrição

Volume 1 Número 1

ISSN 1808-9909
Volume 1, Número 1, 2005
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 1, n. 1, p. 1-52, 2005
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
Para se associar à ABCTP consulte o site: <www.abctp.ufla.br>
PERMUTA
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation deseja fazer permuta com revistas de áreas afins.
ABCTP
Universidade Federal de Lavras - Departamento de Biologia
Setor de Fisiologia Vegetal - Caixa Postal: 3037 - Lavras MG - CEP 37200-000
FICHA CATALOGRÁFICA
Plant Cell Culture & Micropropagation = Cultura de Células &
Micropropagação de Plantas. v. 1, n. 1 (jan./jun. 2005)- .
Lavras : Ed. UFLA, 2005v. il.
Semestral (junho e dezembro).
Publicação Científica da Associação Brasileira de Cultura de Tecidos
de Plantas (ABCTP).
ISSN 1808-9909
1. Cultura de Tecidos de Plantas. I. Associação Brasileira de Cultura
de Tecidos de Plantas. II. Universidade Federal de Lavras. Departamento de Biologia. Setor de Fisiologia Vegetal.
CDD (22ª ed.) 580.72405
INDEXADO por:
AGRIS
AGROBASE
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Secretário Moacir Pasqual UFLA
Secretário Adjunto Antônio Carlos Torres EMBRAPA Hortaliças
Tesoureiro Guilherme Augusto Canella Gomes Benger do Brasil
COMISSÃO EDITORIAL
EDITOR CHEFE
Renato Paiva UFLA
CONSELHO EDITORIAL
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Moacir Pasqual UFLA
Renato Paiva UFLA
BIBLIOGRAFIA
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NOMENCLATURA CIENTÍFICA
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EDITORAÇÃO
Christyane Aparecida Caetano Editora UFLA
Alézia Conceição Modesto Ribeiro Editora UFLA
Luciana Carvalho Costa Editora UFLA
Cristiano Martinotto UFLA
Izonel Custódio de Carvalho Júnior UFLA
SECRETARIA
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Kasumitsu Matsumoto- EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia
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Luiz Antônio Biasi - UFPR
Marcelo Murad Magalhães - UFLA
Terezinha Rangel Câmara - UFRPE
Wagner Campos Otoni - UFV
Produção e renda bruta de rúcula ( Eruca sativa Mill.)...
1
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
Propagação do murici (Byrsonima verbascifolia) por cultivo in vitro de embriões.
Propagation of murici (Byrsonima verbascifolia) through in vitro embryo culture.
Ana Hortência Fonsêca Castro, Amauri Alves de Alvarenga, Renato Paiva, Guilherme Augusto Canella
Gomes...........................................................................................................................................................
1
Polpa de banana e vitaminas do meio MS no cultivo in vitro de orquídea.
Banana s flesh and MS media vitamins on in vitro culture of orchid.
Enoque Fernandes da Silva, Moacir Pasqual, Patrícia Duarte de Oliveira Paiva, Adriano Bortolotti da
Silva, Denismar Alves Nogueira ..................................................................................................................
8
Bioassay for detection of glyphosate or kanamycin resistance in lettuce plants (Lactuca sativa L.).
Bioensaio para a detecção de resistência ao glifosato ou kanamicina em alface (Lactuca sativa L.).
Antonio Carlos Torres, Warley Marcos Nascimento, Sonia Alessandra Vasconcelos de Paiva, Fernando
Antonio Souza de Aragão, Daniel James Cantliffe.......................................................................................
13
Propagação de Coffea arabica c.v. acaiá cerrado por meio do cultivo in vitro de embriões.
Propagation of Coffea arabica c.v. acaiá cerrado through in vitro embryo culture.
Cíntia Guimarães dos Santos, Renato Paiva, Patrícia Duarte de Oliveira Paiva, José Raniere Ferreira de
Santana, André Barretto Pereira....................................................................................................................
19
Desinfestação com paraformaldeído no cultivo in vitro de Limonium platyphyllum Lincz.
Desinfection with paraformaldeyde on in vitro culture of Limonium platyphyllum Lincz.
Claudimar Sidnei Fior, César Gois Prestes, Lia Rosane Rodrigues..............................................................
24
Concentracão de KNO3 e NH4NO3 no crescimento in vitro de plântulas de orquídea.
Concentration of KNO3 and NH4NO3 on in vitro growth of orchid plantlets.
Aparecida Gomes de Araujo, Moacir Pasqual, Vantuil Antônio Rodrigues, Adriano Bortolotti da Silva,
Gustavo Araújo Soares.................................................................................................................................
31
Regulation of somatic embryogenesis in Feijoa sellowiana Berg. and the technology of
synthetic seeds.
Regulação de embriogênese somática em Feijoa sellowiana Berg. e tecnologia de sementes sintéticas.
Lirio Luiz Dal Vesco, Antônio Carlos Torres, Rubens Onofre Nodari, Miguel Pedro Guerra....................
37
Orientação do explante , bap e meio de cultura na multiplicação in vitro dos porta-enxertos de prunus
Okinawa e Mr. S 1/8 .
Explant orientation, bap and culture media on the in vitro multiplication of the Okinawa and Mr. S
1/8 prunus rootstocks.
Anderson da Costa Chaves, Márcia Wulff Schuch, José Carlos Fachinello.................................................
47
Ciênc. agrotec., Lavras, v. 29, n. 4, p. xx-xx, jul./ago., 2005
PROPAGAÇÃO
DO doMURICI
(Byrsonima
POR
Propagação
murici (Byrsonima
verbascifolia)verbascifolia)
por cultivo...
CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES
1
PROPAGATION OF MURICI (Byrsonima verbascifolia) THROUGH
IN VITRO EMBRYO CULTURE
ANA HORTÊNCIA FONSÊCA CASTRO1, AMAURI ALVES DE ALVARENGA2, RENATO PAIVA3,
GUILHERME AUGUSTO CANELLA GOMES4
1
Doutora em Fisiologia Vegetal. Professora Centro Universitário de Lavras (UNILAVRAS) Lavras, MG 37200-000.
Doutor Professor Departamento de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal Universidade Federal de Lavras/UFLA.
3
PhD. Professor Departamento de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal/UFLA.
4
Doutor em Fitotecnia. Pesquisador Kimberlit Agrociências Rodovia Assis Chatoubriant, Km144,5 [email protected]
2
RESUMO
O murici (Byrsonima verbascifolia Rich. ex A. Juss.) é
uma espécie medicinal e frutífera, amplamente distribuída no
cerrado brasileiro, com desenvolvimento lento e baixa porcentagem
de germinação de sementes, em condições naturais. Com esse
trabalho, objetivou-se estabelecer metodologia para a propagação
desta espécie, por meio do cultivo in vitro de embriões. Frutos
foram coletados, desinfestados com NaOCl 2%, por 10 min e
seus embriões obtidos removendo-se o endocarpo e o tegumento.
A seguir foram submetidos a duas condições experimentais: (1),
embriões inoculados em meio MS, acrescido de cinco
concentrações de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g.L-1); (2), embriões
submetidos a quatro concentrações de sais no meio MS (0, 25, 50
e 100%), suplementados com 3% de sacarose. Os meios foram
solidificados com 7 g.L-1 de ágar e o pH foi ajustado para 5,7 ±
0,1. Após inoculação, foram mantidos em sala de crescimento, a
27 ± 1 oC, fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons
fotossinteticamente ativos de 25 µ mol.m-2.s-1. Empregou-se
delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições,
constituídas de dez tubos cada. Pela análise dos resultados,
verificou-se que a utilização de meio MS com 100% de sua
concentração de sais, suplementado com 30 g.L-1 de sacarose,
proporcionou alto percentual germinativo dos embriões e
plântulas com maior acúmulo de massa seca. A aclimatização
dessa espécie foi possível, a partir de plântulas com idade entre
6 a 8 semanas e 3 a 4 pares de folhas desenvolvidas,tornando-se
aptas para o cultivo em casa de vegetação, após 120 dias.
Termos para indexação: Byrsonima verbascifolia, planta
medicinal, Cerrado.
ABSTRACT
The murici (Byrsonima verbascifolia Rich. Ex A. Juss.)
is a medicinal and fruit species, widely distributed in the Brazilian
Cerrado, that presents a slow development and low germination
in natural conditions. The objective of the present work was to
establish a methodology of propagation for this species, through
in vitro cultivation of embryos. The embryos were obtained by
removing the endocarp and seed coat and after that they were
disinfected during 10 minutes with 2% NaOCl. After disinfection,
the embryos were submitted to the following experimental
conditions: (1) inoculated in MS medium, supplemented with
five concentrations of sucrose (0, 15, 30, 45, and 60 g L-1); (2)
inoculated in MS medium with the following salt concentrations
(0, 25, 50, and 100%) and supplemented with 30 g L-1 sucrose.
The medium was solidified with 7 g L-1 agar and the pH was
adjusted to 5.7 ± 0.1. After the inoculation the embryos were
maintained in a growing room, at 27 ± 1 oC, for a 16 hour
photoperiod and irradiance of 25 µ mol.m-2.s-1 It was used a
complete block design, with five replications with 10 testing
tubes each. The results indicated that the MS medium with 100%
salt concentration, supplemented with 30 g.L-1 sucrose increased
the percentage of embryo germination and seedlings dry matter
weight. Seedlings between six and eight weeks of age and 3 to 4
pairs of leaves were acclimatized, and turned capable for
greenhouse cultivation with 120 days of age.
Index terms: Byrsonima verbascifolia, medicinal plant,
Brazilian Cerrado.
INTRODUÇÃO
O cerrado brasileiro constitui-se em uma fonte
natural de recursos biológicos, com inúmeras espécies de
elevado valor medicinal, incluindo o murici (Byrsonima
verbascifolia Rich. ex A. Juss.) (RODRIGUES &
CARVALHO, 2001). Almeida et al. (1998) relatam que
processos patológicos como inflamações e queimaduras
podem ser tratadas mediante a utilização de extratos
obtidos, principalmente, da casca dessa espécie, ricos em
tanino, um princípio ativo adstringente.
A utilização indiscriminada de espécies medicinais
tem ocasionado uma redução considerável na densidade
(Recebido em 29 de julho de 2003 e aprovado em 13 de abril de 2004)
2
CASTRO, A. H. F. et al.
populacional de algumas dessas plantas, em áreas onde
elas ocorrem naturalmente, sendo importante o
desenvolvimento de protocolos que viabilizem a
produção de mudas em escala comercial (NADEEM et
al., 2000). O murici produz frutos do tipo drupa, e sua
propagação se faz por via sexuada, entretanto as sementes
apresentam baixa percentagem de germinação e
desenvolvimento lento das plantas, obtidas em condições
de campo, não ultrapassando 1,5m aos 2 anos de idade
(BARROSO, 1991; LORENZI, 1998). A dificuldade de
propagação é causada, principalmente, pela presença de
um endocarpo esclerificado que envolve o embrião e que
atua como uma barreira mecânica, dificultando a protusão
da radícula e, conseqüentemente, a emergência da plântula
(ALMEIDA et al., 1998).
Atualmente, o cultivo de embriões in vitro tem-se
mostrado como uma alternativa economicamente viável,
para a propagação de várias espécies de interesse
econômico (MALIRO & KWAPATA, 2000; MELO, 2000;
NADEEM et al., 2000; OLIVEIRA, 2001). Segundo Oliveira
(2001), o cultivo de embriões reduz o tempo para a
obtenção de um novo indivíduo, permite boa uniformidade
e alto percentual de germinação, além de evitar a
destruição das plantas matrizes. Outras vantagens são a
multiplicação rápida do material selecionado e a
antecipação da época de plantio.
Um dos aspectos mais importantes da cultura de
embriões é a seleção correta do meio nutritivo, que estimule
o seu desenvolvimento, devendo ser adaptado para cada
espécie (GEORGE, 1996; OLIVEIRA, 2001). Maliro &
Kwapata (2000) relatam que o meio mais freqüentemente
utilizado é o MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), cuja
concentração de nutrientes é, geralmente, elevada e, em
função disso, muitas modificações têm sido estudadas com
o objetivo de reduzir os níveis dos nutrientes, permitindo
assim maior adaptação de cultivos in vitro (SAMARTIN,
1989). De acordo com George (1996), em geral, o
desenvolvimento de embriões maturos in vitro ocorre em
meios nutritivos simples, compostos de sais minerais,
vitaminas e açúcares. A exigência em sacarose é variável
em função do estádio de maturação dos embriões e,
segundo Hu & Ferreira (1990), os embriões excisados
maduros ou quase maduros são autotróficos, ou seja, são
capazes de germinar em meio simples, sem suprimento
adicional de sacarose.
Normalmente, plantas provenientes do cultivo in
vitro necessitam de um período de aclimatização, antes
de serem transferidas para condições de campo. Para
George (1996), esse processo se faz necessário, porque
o ambiente in vitro normalmente afeta a morfogênese
das plantas, que se apresentam mais frágeis pelo fato
de terem sido cultivadas em condições de baixa
irradiância e alta umidade relativa. A transferência de
plântulas, das condições assépticas e heterotróficas,
típica da cultura de tecidos, para o ambiente externo
deve ser realizada de forma gradativa e cuidadosa, para
evitar sua morte (GOMES, 1999).
Neste trabalho, teve-se como objetivo testar o efeito
da sacarose e de concentrações de sais do meio MS no
cultivo de embriões in vitro de murici, bem como a
aclimatização das plântulas obtidas, visando ao
enriquecimento populacional da espécie, por meio da
produção comercial de mudas.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção das sementes e teste de viabilidade:
Frutos maduros de murici foram coletados entre os meses
de janeiro e março de 2001, em área de formação campestre
com fisionomia de Cerrado sensu stricto, localizada no
município de Ijaci, sul do Estado de Minas Gerais. Após o
processamento dos frutos, o endocarpo foi tratado com
solução de Benomyl a 2% e armazenados em sacos
plásticos em câmara fria, a 4 oC, no escuro. Para o teste de
viabilidade, 30 sementes foram submetidas ao teste do
tetrazólio (NADEEM et al., 2000), imediatamente após a
coleta (tempo zero) e após armazenamento por 6 e 12 meses.
O padrão de coloração em diferentes regiões da semente
foi analisado.
Propagação do murici (Byrsonima verbascifolia) por cultivo...
Condução do experimento: Os endocarpos foram
desinfestados com hipoclorito de sódio comercial, a 2%,
por 10 minutos e lavados em água destilada esterelizada. A
seguir, os embriões foram extraídos, removendo-se
cuidadosamente o endocarpo e os tegumentos, com auxílio
de martelo e bisturi, respectivamente.
Embriões excisados foram submetidos a dois
experimentos distintos. No primeiro, foram inoculados em
meio contendo sais minerais MS (MURASHIGE & SKOOG,
1962), suplementado com 0, 15, 30, 45 e 60 g.L-1 de sacarose.
No segundo experimento, os embriões foram inoculados
em meio de cultura, acrescidos de diferentes concentrações
de sais (0, 25, 50 e 100%), suplementados com 30 g.L-1 de
sacarose. Nos dois experimentos, os meios foram
solidificados com 7 g.L-1 de ágar e o pH ajustado para 5,7 ±
0,1, antes da autoclavagem, a 120 oC e 1,5 atm, por 20 min.
Após inoculação, os embriões foram transferidos para a
sala de crescimento com temperatura de 27 1 oC, fotoperíodo
de 16 horas e densidade de fluxo de fótons
fotossinteticamente ativos de 25 µ mol.m-2.s-1.
Após 15 dias de inoculação, avaliaram-se a
porcentagem de oxidação e a contaminação do meio e dos
explantes e, aos 30 dias, a porcentagem de germinação dos
embriões e a massa seca das plântulas formadas. A
germinação foi avaliada adotando-se critérios fisiológicos,
considerando-se germinados todos os embriões com
protusão de radícula.
Para ambos os experimentos empregou-se o
delineamento experimental inteiramente casualizado, e cada
experimento foi constituído de 5 repetições, empregandose para cada parcela experimental, 10 tubos de ensaio, sendo
inoculado um embrião por tubo. A porcentagem de
germinação e a massa seca total foram submetidos ao estudo
de regressão, seguindo modelos matemáticos próprios ao
delineamento inteiramente casualizado e analisados
estatisticamente utilizando-se o Sistema de Análise de
Variância para Dados Balanceados (FERREIRA, 2000).
Aclimatização das plântulas obtidas in vitro: Para
o processo de aclimatização, adotou-se como referência a
3
metodologia proposta por Gomes et al. (2003). Foram
submetidas ao processo de aclimatização, plântulas com 6
a 8 semanas de idade e com 3 a 4 pares de folhas
desenvolvidas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Viabilidade: Pelo teste de viabilidade, verificou-se
que, em média, 85% das sementes recentemente coletadas
eram viáveis e que o armazenamento dessas sementes por
um período de 12 meses não influenciou na sua viabilidade
(p>0,05) (dados não mostrados).
Condições de cultivo: As condições de assepsia e
a remoção dos endocarpos e tegumentos foram
satisfatórias para a obtenção de embriões, como fonte de
explante para o cultivo in vitro. Não se verificou qualquer
indício de escurecimento no explante no meio de cultura,
indicativo do desenvolvimento de processos oxidativos,
comuns no cultivo in vitro de espécies lenhosas.
O percentual de contaminação foi desprezível,
demonstrando não ser necessária a desinfestação direta
da superfície externa da semente e do embrião e indicando
que os embriões se desenvolvem em condições assépticas,
devido à presença do endocarpo esclerificado, desde que
intacto, que atua como uma barreira, dificultando a
penetração de patógenos. Baixos índices de contaminações
in vitro também foram relatados por Andreoli (1986),
utilizando embriões como fonte de explante, já que são
produzidos em ambientes estéreis.
A remoção do tegumento contribuiu para o sucesso
obtido na propagação in vitro dessa espécie. Em ensaios
preliminares, verificou-se que os embriões desprovidos
de tegumento germinaram em 7 dias, apresentando no 12o
dia após a inoculação, plântulas mais desenvolvidas e com
o seu segundo par de folhas em expansão. Embriões com
tegumento germinaram em 12 dias, com o segundo par de
folhas formado somente aos 20 dias após inoculação
(dados não mostrados). Resultados semelhantes foram
descritos por Maliro & Kwapata (2000), em Uapaca
kirkiana Mull. Arg., uma espécie frutífera tropical da África
Germinação (%)
do Sul, onde a remoção do tegumento aumentou a
percentagem de germinação de 55% para 78%, além de
favorecer o desenvolvimento das plântulas formadas.
Efeito da sacarose: As concentrações de sacarose,
adicionadas ao meio de cultura, influenciaram a porcentagem
de germinação e a matéria seca total das plântulas formadas
(Figuras 1 e 2). Maiores porcentagens de germinação foram
observadas quando foram empregadas concentrações de
sacarose inferiores a 60 g.L-1, independentemente da
concentração de sacarose acrescida ao meio (Figura 1).
A partir da concentração 30 g.L-1 houve queda, não
significativa, na porcentagem de germinação, da ordem de
8,9%. Essa redução mostrou-se mais acentuada, da ordem
de aproximadamente 30%, quando a concentração de
sacarose foi elevada de 45 para 60 g.L-1.
Com esses resultados, verificou-se que no murici,
provavelmente, o processo de germinação ocorre devido
às reservas nutricionais dos cotilédones,
independentemente do fornecimento externo de nutrientes,
fato esse concordante com relatos de Melo (2000), para
guarirobeira. Os menores percentuais de germinação foram
observados quando se adicionaram 60 g.L-1 de sacarose
ao meio, possivelmente devido a uma redução do potencial
osmótico do meio de cultura, o que restringe,
consideravelmente, a disponibilidade de água para o
embrião, fundamental no início do processo de germinação.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 76,6 + 1,14x -0,0244x 2
R2 = 0,97
0
15
30
45
60
75
Sacarose (g.L-1)
FIGURA 1 Porcentagem de germinação in vitro de
embriões de murici, submetidos a diferentes concentrações
de sacarose no meio de cultura. UFLA. Lavras, MG, 2001.
0,2
Matéria
Seca
Total
(g)(g)
Matéria
Seca
Total
4
0,15
0,1
y = 0,0151 + 0,0083x - 0,0001x2
R2 = 0,98
0,05
0
0
15
30
45
60
75
-1 -1)
Sacarose(g.L
(g.L
Sacarose
)
FIGURA 2 Matéria seca total de plântulas de murici
submetidas a diferentes concentrações de sacarose no
meio de cultura. UFLA:Lavras, MG, 2001.
Em relação ao crescimento da plântula, tomandose por base a matéria seca total, observou-se um aumento
dessa variável, até a concentração de 30 g.L-1 de sacarose
no meio de cultura, com incrementos de 80% e 70% na
massa seca, quando as concentrações foram aumentadas
de 0 para 15 g.L-1 e de 15 para 30 g.L-1, respectivamente
(Figura 2). A partir desse valor, verificaram-se decréscimos
de 11,76% e 53,33% na matéria seca total, quando as
concentrações aumentaram de 30 para 45 g.L-1 e 45 para 60
g.L -1 , respectivamente. Praticamente não houve
crescimento dos embriões na ausência de sacarose e que
esse foi limitado, quando se empregaram concentrações
de 15 e 60 g.L-1. Por esses resultados, verificou-se a
importância da adição de sacarose em concentrações
equilibradas ao meio de cultivo, de maneira que permita o
processo respiratório e, conseqüentemente, o crescimento
das plântulas, sem interferir, contudo, no potencial
osmótico do meio de cultura.
Resultados semelhantes foram obtidos por Oliveira
(2001), com plântulas de oliveira, oriundas de embriões
cultivados in vitro, em meios com diferentes concentrações
de sacarose. Para Hoffmann (1999), a matéria seca é
constituída, principalmente, de carboidratos insolúveis
presentes na parede celular (celulose, hemicelulose e
lignina), na qual a maior disponibilidade de carboidratos
facilmente assimiláveis, como a sacarose, permite aumento
em sua síntese.
Germinação(%)
(%)
Germinação
Efeito dos níveis de sais do meio MS: Verificou-se
que a matéria seca total foi influenciada pelas diferentes
proporções de sais no meio MS, não sendo observado,
porém, qualquer efeito na porcentagem de germinação dos
embriões (Figuras 3 e 4).
Altos percentuais de germinação foram alcançados,
independentemente dos níveis de sais presentes nos meios
empregados (Figura 3). Apesar de a porcentagem de
germinação em meio completo (100%) não ser significativa
estatisticamente, nota-se que, na prática, a utilização desse
meio pode ser uma alternativa mais vantajosa, quando se
objetiva a produção de mudas em larga escala, pois favorece
a germinação de 10% de embriões a mais que o meio com
metade da concentração dos sais.
Analisando-se a figura 4, verifica-se um acúmulo
linear de massa seca em relação às plântulas formadas,
relacionado à presença de maiores concentrações de sais
no meio. Oliveira (2001) sugere que o meio MS completo
permite à planta uma maior eficiência na utilização da
sacarose presente no meio de cultivo, a qual, por sua vez,
otimiza a absorção dos minerais disponíveis. O acúmulo
de massa seca pelas plântulas foi 79,61% superior em
meio MS completo, em relação àquele apresentado
por plântulas cultivadas em meio com ausência de sais.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
y = 80,382 - 0,1196x + 0,0025x 2
R2 = 0,99
0
25
50
75
100
Sais
Saisdo
domeio
meioMS
MS(%)
(%)
FIGURA 3 Porcentagens de germinação de embriões
cultivados in vitro, sob diferentes concentrações de sais
no meio MS. UFLA. Lavras, MG, 2001.
Matéria
(g)(g)
MatériaSeca
SecaTotal
Total
5
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
y = 0,038 + 0,002x
R2 = 0,99
0,05
0
0
25
50
75
100
Sais
Sais do
do meio
meio MS (%)
(%)
FIGURA 4 Matéria seca total de plântulas de murici
submetidas a diferentes proporções de sais no meio MS.
UFLA. Lavras, MG, 2001.
Comparando-se o acúmulo de matéria seca entre os
diferentes níveis do meio MS, verifica-se que maiores
incrementos de massa seca foram observados entre os
níveis 0% e 25%, responsáveis por um aumento de 54,35%
na massa seca total, ao passo que menores elevações
puderam ser verificadas entre os níveis 50% e 100%, as
quais são da ordem de 26,98% e 38,83%, respectivamente.
Em função dos resultados, plântulas de murici são
exigentes em termos de nutrientes para o seu
desenvolvimento e, aumento na produção de massa seca,
pode ser observado mesmo quando com o tratamento
utilizado, são disponibilizadas baixas concentrações de
sais, desde que a concentração de sacarose no meio seja
favorável para absorção desses nutrientes. Embora o murici
seja uma espécie exigente em termos nutricionais, em vários
trabalhos relata-se que esse comportamento varia de
espécie para espécie. Em estudos realizados, a partir do
cultivo in vitro de oliveira, verificaram-se efeitos lineares
significativos sobre a massa seca das plântulas produzidas,
em decorrência da variação na concentração de sais do
meio MS (OLIVEIRA, 2001). Por outro lado, Paiva (1998)
relata que o desenvolvimento de plântulas de estrelícia,
obtidas a partir do cultivo de embriões in vitro, não foi
influenciado pelas diferentes condições do meio MS
empregado, mas sim pelos diferentes estádios de
desenvolvimento dos embriões.
6
Aclimatização das plântulas obtidas a partir do
cultivo de embriões in vitro: Pelos estudos, observou-se
que 30 dias após o início do processo de aclimatização, as
plântulas de murici apresentavam o seu número inicial de
folhas duplicado e sistema radicular desenvolvido. Aos 60
dias de aclimatização, observou-se que as folhas
apresentavam-se brilhantes, recobertas por ceras
epicuticulares e com o aparato fotossintético funcional,
observações essas coincidentes com a remoção do último
sombrite (dados não mostrados). Segundo Pattnaik et al.
ANDREOLI, C. Cultura de embrião. In: SIMPÓSIO DE
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS, 1., 1985, Brasília,
DF. Anais... Brasília, DF: ABCTP/EMBRAPA, 1986. p.
25-28.
(1996), essas características são fundamentais para a
FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar
para Windows versão 4.0. In: REUNIÃO ANUAL DA
REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE
INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, São
Carlos. Anais... São Carlos: UFSCar/SIB, 2000. p. 255258.
sobrevivência da plântula no ambiente ex vitro. O período
de 15 dias, para que as plantas passem para uma condição
autotrófica, também é sugerido por Ziv (1995). A porcentagem
de sobrevivência das plântulas após o transplantio para as
sacolas plásticas foi de 90%. Porcentagens de sobrevivência
semelhantes também foram observadas por Pattnaik et al.
(1996), durante a aclimatização de plântulas de Morus acidosa
Griff. e Morus australis Poir.. Em moreira (Maclura tinctoria
D. Don ex Stend.), Gomes (1999) verificou uma porcentagem
de 97% de sobrevivência das plântulas e Deshpande et al.
(1998) obtiveram 100% de sobrevivência após aclimatização
de Ficus religiosa L.
CONCLUSÕES
O armazenamento das sementes por 12 meses não
afetou sua viabilidade.
O uso de meio MS com 100% de sua concentração
de sais, suplementado com 30 g.L -1 de sacarose,
proporcionou alto percentual germinativo dos embriões e
plântulas com maior acúmulo de massa seca.
A aclimatização dessa espécie é possível, a partir
de plântulas com seis a oito semanas de idade e com três a
BARROSO, G. M. Sistemática de angiospermas do Brasil.
Viçosa: UFV, 1991. v. 2, 377 p.
DESHPANDE, S. R.; JOSEKUTTY, P. C.
PRATHAPASENAN. Plant regeneration from axillary
buds of a mature tree of Ficus religiosa. Plant Cell
Reports, New York, v. 17, n. 6/7, p. 571-573, Apr. 1998.
GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture: part
1: the technology. 2. ed. Edington: Exegetics, 1996. 1574 p.
GOMES, G. A. C. Propagação in vitro de moreira
(Maclura tinctoria). 1999. 97 p. Dissertação (Mestrado
em Fisiologia Vegetal) Universidade Federal de Lavras,
Lavras, 1999.
GOMES, G. A. C.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. de O.;
SANTIAGO, E. J. A. Plant regeneration from callus cultures
of Maclura tinctoria, an endangered wood species. In Vitro
Celular & Developmental Biology-Plant, Wallingford, v.
39, n. 3, p. 293-295, July 2003.
HOFFMANN, A. Enraizamento e aclimatação de mudas
micropropagadas de porta-enxertos de macieira
marubakaido e M-26 . 1999. 240 p. Tese (Doutorado
em Agronomia) Universidade Federal de Lavras, Lavras,
1999.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
HU, C. Y.; FERREIRA, A. G. Cultura de embriões. In:
TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.).
Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas.
Brasília: EMBRAPA/CNPH-ABCTP, 1990. p. 71-86.
ALMEIDA, S. P. de; PROENÇA, C. E. B.; SANO, S. M.;
RIBEIRO, J. F. Cerrado: espécies vegetais úteis. Planaltina:
EMBRAPA-CPAC, 1998. 464 p.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação
e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. 2. ed. Nova
Odessa: Plantarum, 1998. v. 2, 352 p.
quatro pares de folhas desenvolvidas.
MALIRO, M. F. A.; KWAPATA, M. B. Apomitic embryo
development and survival in Uapaca kirkiana under in
vitro and in vivo seed germination. Scientia Horticulturae,
Amsterdam, v. 83, n. 2, p. 139-147, Feb. 2000.
MELO, B. de. Cultivo de embrião in vitro da guarirobeira
[Syagrus oleracea (Mart.) Becc.]. 2000. 117 p. Tese
(Doutorado em Agronomia) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 2000.
7
PAIVA, P. D. de O. Estabelecimento in vitro de estrelícia
(Strelitzia reginae Ait.) e controle da oxidação com
identificação dos compostos liberados no meio de cultura.
1998. 85 f. Tese (Doutorado em Agronomia) - Universidade
Federal de Lavras, Lavras, 1998.
PATTNAIK, S. R.; SAHOO, Y.; CHAND, P. K.
Micropropagation of a fruit tree, Morus australis. Plant
Cell Reports, New York, v. 15, n. 3/4, p. 841-845, Dec.
1996.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid
growth and biossays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473497, 1962.
RODRIGUES, V. E. G.; CARVALHO, D. A. de. Plantas
medicinais no domínio dos cerrados. Lavras: UFLA, 2001.
180 p.
NADEEM, M.; PALNI, L. M. S.; PUROHIT, A. N.; PANDEY,
H.; NANDI, S. K. Propagation and conservation of
Podophyllum hexandrum Royle: an important medicinal
herb. Biological Conservation, Oxford, v. 92, n. 1, p. 121129, Jan. 2000.
SAMARTIN, A. A comparative study of effects of nutrient
media and cultural conditions on shoot multiplication of
in vitro cultures of Camellia japonica explants. Journal
of Horticultural Science, Ashford, v. 64, n. 1, p. 73-79, Jan.
1989.
OLIVEIRA, A. F. Enraizamento de estacas semilenhosas e
cultura de embriões in vitro de oliveira (Olea europaea
L.). 2001. 122 p. Tese (Doutorado em Agronomia) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2001.
ZIV, M. In vitro acclimatization. In: AITKEN-CHRISTIE, J.;
KOZAI, T.; SMITH, M. L. A. (Eds.). Automation and
environmental control in plant tissue culture. Dordrecht:
Kluwer Academic, 1995. p. 49
8 POLPA
DE BANANA E VITAMINAS
MEIO MS NO CULTIVO
SILVA, E. F. da etDO
al.
IN VITRO DE ORQUÍDEA1
BANANA S FLESH AND MS MEDIA VITAMINS ON IN VITRO CULTURE
OF ORCHID
ENOQUE FERNANDES DA SILVA2, MOACIR PASQUAL3, PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA4,
ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA5, DENISMAR ALVES NOGUEIRA6
1
Parte da Dissertação de Mestrado de Enoque Fernandes da Silva, 2003 Universidade Federal de Lavras/UFLA.
Professor da Escola Agrotécnica Federal de Colorado do Oeste - RO.
3
Professor do Departamento de Agricultura da UFLA Caixa Postal 3037 37.200-000 Lavras, MG.
4
Professora do Departamento de Agricultura da UFLA.
5
Doutorando do Curso de Fitotecnia da UFLA.
6
Doutorando do Curso de Estatística e Experimentação Agropecuária DEX/UFLA.
2
RESUMO
Os gêneros Cattleya, Laelia e Brassavola, de ocorrência
natural no Brasil, são muito procurados no mundo inteiro como
plantas ornamentais, criando a necessidade de se desenvolverem
técnicas de propagação para atender ao mercado e contribuir com
a reposição de espécies ameaçadas de extinção, além de valor
comercial. Objetivou-se otimizar um protocolo de
micropropagação no estádio de subcultivo da orquídea
(Brassocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber Glow), oriunda
da germinação in vitro. Plântulas com tamanho médio de 1-1,5
cm foram inoculadas em meio de cultura com concentrações de
polpa madura de banana cv. nanica (0, 25, 50, 75 e 100 g L-1)
combinadas com concentrações de vitaminas do meio MS (0%,
50%, 100% e 200 %) incorporadas ao meio Knudson. Após três
meses de cultivo, verificou-se que as vitaminas do meio MS não
promoveram efeito significativo. A polpa de banana na
concentração de 75g L-1 promoveu a formação de maior número
de brotos e na concentração de 100 g L-1, maior comprimento
médio do sistema radicular e maior peso da matéria fresca da
plântula.
Termos para indexação: Cattleya, Laelia, Brassavola,
micropropagação, meio de cultura, Orquidaceae.
ABSTRACT
The genera Cattleya, Laelia and Brassavola occur
naturally in Brazil and are world wide used as ornamental plants
which creates a demand for the development of propagations
techniques that will attend the market needs and also contribute
to the replacement of endangered species. The main purpose of
this work was to optimize the micropropagation protocol for
the orchid (Brassiocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber Glow)
obtained from in vitro germination. Plantlets with average size of
1-1.5cm were inoculated in Knudson culture medium containing
different concentrations (0, 25, 50, 75 and 100 g L-1) of ripe
banana s (Musa chinensis cv. nanica) flesh in combination with
different concentrations of the MS media vitamins (0%, 50%,
100% and 200%). After three months of cultivation, no differences
were observed with the use of MS medium vitamins. While the
use of 75 g L-1 banana flesh promoted the formation of the highest
number of shoots, the highest root average length and dry matter
weight were observed with the use of 100 g L-1.
Index terms: Cattleya; Laelia; Brassavola; micropropagation;
culture media, Orquidaceae.
INTRODUÇÃO
As orquídeas são conhecidas não só pela sua
importância ornamental, mas também industrial, em função
da extração de essência de baunilha do gênero Vanilla
(JOLY, 1977). Ocorrem em quase todas as regiões da Terra,
com exceção dos pólos e desertos (SUTTLEWORTH,
1997), sendo mais freqüentes e exuberantes nos trópicos
(HOEHNE, 1942). Entre esses se localiza o Brasil, portador
de um invejável banco de germoplasma dessas plantas,
tornando-se também responsável pela sua preservação.
O elevado número de espécies e híbridos tropicais
possibilita variadas formas e cores de flores, exploradas
comercialmente em todo mundo. Os gêneros Cattleya, Laelia
e Brassavola, de ocorrência natural no Brasil (PAULA &
SILVA, 2001), são bastante populares e atingem altos preços
no mercado interno e externo, procurados por colecionadores,
orquidófilos, decoradores de ambiente e cidadãos comuns.
Essa atração exercida pelas orquídeas motiva também
freqüentes coletas de mudas pelos denominados mateiros,
visando à comercialização, constituindo ainda hoje, uma
(Recebido em 08 de julho de 2003 e aprovado em 28 de abril de 2004)
Polpa de banana e vitaminas do meio...
ameaça de extinção para algumas espécies.
A exótica beleza das orquídeas tropicais atraiu a
coleta predatória entre os séculos XVI e XX.
(ALZUGARAY & ALZUGARAY, 1993). No século XX
surgiu a consciência ecológica de se preservar a
biodiversidade do planeta, sem abrir mão do direito de
usufruir da beleza exibida pela natureza. Para equacionar
essa dicotomia de interesses, buscaram-se novas técnicas
que atendessem eficazmente a demanda por orquídeas.
Foi nesse contexto que o professor Lewis Knudson, em
1922, criou o cultivo assimbiótico, no qual, quase 100%
das sementes de orquídeas germinam, sobrevivem e
crescem rapidamente (CAMPOS, 2000), em comparação
com o método natural em que 2% a 3 % das sementes
germinam por simbiose com os fungos Micorriza, além de
apresentarem desenvolvimento lento. Assim, a
micropropagação de orquídea poderá atender aos desejos
de estética e beleza do homem, salvaguardando, ao mesmo
tempo, a biodiversidade do planeta.
A micropropagação baseia-se na totipotencialidade
das células e deve ser entendida como reprodução
assexuada. Entretanto, também é usada como artifício para
germinar sementes de difícil propagação pelos métodos
convencionais (PASQUAL et al., 1998) como é o caso
das orquídeas.
O crescimento e a morfogenia de plântulas
micropropagadas podem ser melhorados com a adição de
vitaminas ao meio de cultura. Nos vegetais, essas
substâncias são requeridas pelas células como
catalisadores metabólicos (GEORGE, 1993).
A adição de compostos orgânicos complexos, como
a polpa de banana, pode suplementar o teor de vitaminas,
aminoácidos e reguladores de crescimento ao meio de
cultura (GEORGE, 1993).
Os aditivos orgânicos complexos são preparações
obtidas de produtos naturais, de composição indefinida,
mas que atendem ao propósito de enriquecimento do meio
de cultura. Os aditivos orgânicos complexos podem ser
adicionados ao meio visando à melhor resposta no padrão
9
de crescimento (TORRES et al., 2001).
Alguns cultivadores homogeneízam a polpa da
banana com seus meios, tornando-os mais escuros,
enquanto outros simplesmente submergem fatias de
banana nos frascos contendo o meio. A polpa de banana
pode ser preparada a partir de frutos verdes ou maduros,
promovendo diferentes efeitos no cultivo in vitro,
dependendo da cultivar e da quantidade de polpa utilizada
(TORRES et al., 2001). Com relação à polpa de fruto verde, é
provável que durante autoclavagem já ocorra adsorção do
tanino existente pelo carvão ativado incorporado ao meio.
Os fatores que mais freqüentemente determinam o
sucesso da cultura de tecidos vegetais são a origem do
explante e o meio nutritivo onde são cultivados (PASQUAL
et al., 1997). Vários meios de cultura têm sido testados e
um meio específico é identificado pela composição de sais
minerais, enquanto as vitaminas, os reguladores de
crescimento e outros suplementos orgânicos variam na
concentração. A escolha do meio depende da espécie em
questão e do propósito da cultura (meristema,
organogênese, embriogênese somática, cultivo ou
subcultivo de explantes, etc.). No cultivo e subcultivo de
plântulas do gênero Cattleya, George et al. (1997) sugerem
o meio Knudson ou Reinert e Mohr. Segundo Arditti &
Ernst (1993), o meio de propagação para Cattleya, Laelia,
Laeliocattleya e Brassocattleya pode ser o mesmo.
Villalobos et al. (1994) sugerem o meio Vacin & Went para
Cattleya, Encyclia e Oncidium, suplementado com 25%
de água de coco.
Objetivou-se neste trabalho, testar variações no meio
de cultura in vitro para o estádio de subcultivo da orquídea
Brassiocattleya Pastoral x Laeliocattleya Amber Glow.
MATERIAL E MÉTODOS
Plântulas do híbrido intergenérico de orquídea
Brassiocattleya Pastoral X Laeliocattleya Amber Glow,
com 1-1,5cm, foram submetidas à uniformização em meio
Knudson (GEORGE et al., 1987) durante três meses. Após
esse período, em cada frasco de 250 mL contendo
10
SILVA, E. F. da et al.
aproximadamente 50 mL de meio, foram colocadas quatro
Não houve efeito significativo nas variáveis
avaliadas para as concentrações de vitamina do meio MS
como suplemento ao meio Knudson.
As concentrações de polpa de banana
incorporadas ao meio Knudson influenciaram o
desenvolvimento da orquídea BC Pastoral x LC Amber
Glow de maneira significativa. Observa-se na Figura 1 que
o maior número de brotos ocorreu quando se adicionaram
75 g L-1 de polpa de banana ao meio de cultura.
Um aumento na concentração de polpa de banana
correspondeu a um aumento no comprimento médio do sistema
radicular (Figura 2) e a matéria fresca da plântula (Figura 3).
Número
deBrotos
Brotos
Número de
2
1,5
1
y = 1,5051
0,5
- 0,0233x + 0,001094x2 - 0,000008778x3
2
R = 0,92
0
0
25
50
-1
Polpa de banana (g L )
75
100
-1
FIGURA 1 Número de brotos em plântulas de orquídea
Brassiocattleya Pastoral X Laeliocattleya Amber Glow
cultivadas em meio Knudson suplementado com diferentes
concentrações de polpa de banana.
Comp.
Médio
do Sist.
Radicular
(cm)
Comp.
Médio
do Sist.
Radicular
(cm)
plântulas, sob condições assépticas em câmara de fluxo
laminar. O meio foi solidificado com 4% de ágar, o pH
ajustado para 5,8, antes do processo de autoclavagem a
1210C, 1 atm, por 20 minutos. No meio de cultura foram
acrescidas as combinações 0, 25, 50, 75 e 100 g.L-1 de polpa
de banana nanica madura e 0%, 50%, 100% e 200 % de
vitaminas do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
em relação à composição original, num fatorial 5X4. A
polpa de banana foi liquidificada e peneirada antes de ser
adicionada ao meio de cultura. Todos os tratamentos foram
efetuados antes do processo de autoclavagem. Utilizouse o delineamento experimental inteiramente casualizado
com 4 plântulas por parcela e 4 repetições, totalizando 16
plântulas por tratamento. O experimento foi conduzido
em sala de crescimento com temperatura de 26 ± 10C e
fotoperíodo de 16 horas de luz, com intensidade
luminosa de 35 µ mol m-2 s-1. A avaliação do experimento
foi efetivada três meses após a instalação, analisandose as variáveis número de brotos, número de folhas,
altura da plântula, número de raízes, comprimento médio
do sistema radicular e matéria fresca da plântula. A análise
estatística do experimento foi feita utilizando o sistema
SAS INSTITUTE (2003). Os dados foram analisados por
meio de regressão polinomial.
2,5
7
6
5
4
3
2
y = 2,1854 + 0,036615x
2
R = 0,99
1
0
0
25
50
-1
75
100
Polpa de banana (g L-1)
FIGURA 2 Comprimento médio do sistema radicular em
plântulas de orquídea Brassiocattleya Pastoral X
Laeliocattleya Amber Glow cultivadas em meio Knudson
suplementado com diferentes concentrações de polpa de
banana.
Para concentrações de polpa de banana até 75 g L-1,
o número de brotos aumentou de 1,4 (tratamento sem as
vitaminas da polpa de banana) para 2,2 por explante,
sendo esse o intervalo em que se obteve o maior ganho
para número de brotos, provavelmente porque as
concentrações de reguladores de crescimento ou outros
elementos existentes na composição da polpa de
banana estimularam a multiplicação in vitro da plântula.
Polpa de banana e vitaminas do meio...
Peso
(g)
PesoMatéria
MatériaFresca
Frescada
daPlântula
Plântula(g)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
Y = 0,393486 + 0,008686x
2
R = 0,88
0,4
0,2
0
0
25
50
75
100
-1
Polpa
banana (g(g
LL
) -1)
Polpa
dedebanana
FIGURA 3 Matéria fresca em plântulas de orquídea
Brassiocattleya Pastoral X Laeliocattleya Amber Glow
cultivadas em meio Knudson suplementado com diferentes
concentrações de polpa de banana.
11
principalmente por aumento no comprimento médio do
sistema radicular. George (1993) afirma que a polpa de
banana pode suplementar e promover o aumento da
matéria fresca da plântula. É provável que em
concentrações superiores ao intervalo estudado, poderia
acarretar maior o crescimento da parte aérea da plântula,
dentro de certos limites. Várias questões ainda devem ser
respondidas em relação ao acréscimo de polpa de banana
ao meio de cultura, a utilização de diferentes cultivares de
banana ou graus de amadurecimento para seu emprego,
demandando maiores pesquisas.
CONCLUSÃO
O emprego da polpa de banana nanica madura ao
meio de cultura é viável para a multiplicação e crescimento
-1
Após a concentração de 75 g L , observa-se um efeito
negativo da polpa de banana, que passou a inibir a formação
de brotos. George (1993) sugere que a adição de compostos
orgânicos complexos como polpa de banana pode
suplementar o teor de vitaminas, aminoácidos e reguladores
de crescimento do meio de cultura. É provável que a riqueza
em nutrientes, aminoácidos, vitaminas e reguladores de
crescimento, naturalmente existentes na polpa de banana,
tenham uma absorção preferencial em relação às vitaminas
do meio MS.
Arditti & Ernst (1993) confirmaram que a adição de
polpa de banana aumenta o número de brotos no cultivo
de plântula de orquídea in vitro. Torres et al. (2001) afirmam
que a adição de polpa de banana promove diferentes efeitos
no cultivo in vitro, tais como espessamento do sistema
radicular, desenvolvimento da parte aérea, emissão de
brotos adventícios.
Como a influência no comprimento médio do sistema
radicular foi direta, pode-se inferir que o efeito estimulante
da polpa de banana no crescimento das raízes continuaria
para concentrações superiores a 100 g.L-1.
As concentrações de polpa de banana
incorporadas ao meio Knudson influenciaram
significativamente a matéria fresca da plântula,
in vitro da orquídea BC Pastoral x LC Amber Glow.
AGRADECIMENTOS
À Escola Agrotécnica Federal de Colorado do Oeste
Rondônia, pela liberação para o mestrado. À UFLA,
especialmente ao Departamento de Agricultura, pela
oportunidade de realização do mestrado. À CAPES, pela
concessão da bolsa.
ALZUGARAY, D.; ALZUGARAY, C. (Eds.). Como
cultivar orquídeas. Rio de Janeiro: Três Livros e
Fascículos, 1983. 34 p.
ARDITTI, J.; ERNST, R. Micropropagation of orchids.
New York: J. Wiley, 1993. 682 p.
CAMPOS, D. M. Orquídeas: manual prático de reprodução.
Rio de Janeiro: Expressão e Cultura, 2000. 128 p.
GEORGE, E. F. (Ed.). Plant propagation by tissue
culture: the technology. 2. ed. Edington: Exegetics,
1993. pt. 1, 574 p.
GEORGE, E. F.; PUTTOCK, D. J. M.; GEORGE, H. J. Plant
culture media: formulations and uses. England: Exegetics,
1987. v. 1, 567 p.
12
SILVA, E. F. da et al.
HOEHNE, F. C. Flora brasílica: orchidaceas. São Paulo:
Secretaria de Agricultura, Indústria e Comércio de São
Paulo, [1942]. v. 12.
PAULA, C. C. de; SILVA, H. M. P. da. Cultivo prático de
orquídeas. 2. ed. Viçosa: UFV, 2001. 63 p.
SAS INSTITUTE. User s guide: version 8.1. Cary, 2003.
JOLY, A. B. Introdução à taxonomia vegetal. 4. ed. São Paulo:
Nacional, 1977. 730 p.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962.
PASQUAL, M.; HOFFMANN, A.; RAMOS, J. D. Cultura
de tecidos vegetais: tecnologia e aplicações: introdução:
fundamentos básicos. Lavras: UFLA/FAEPE, 1998. 159 p.
PASQUAL, M.; RAMOS, J. D.; HOFFMANN, A.; CARVALHO,
G. R. Cultura de tecidos vegetais: tecnologia e aplicações:
meios de cultura. Lavras: UFLA/FAEPE, 1997. 127 p.
SUTTLEWORTH, F. S. Orquídeas: guia dos orquidófilos.
7. ed. Rio de Janeiro: Expressão e Cultura, 1997. 158 p.
TORRES, A. C.; BARBOSA, N. V. dos R.; WILLADINO,
L.; GUERRA, M. P.; FERREIRA, C. F.; PAIVA, S. A. V.
de. Meio e condições de incubação para cultura de
tecidos de plantas. Brasília: EMBRAPA-CNPH, 2001.
(Circular técnica).
VILLALOBOS, A. L.; MUÑOZ, J. M.; SOSA-MOSS, C.
Cultivo de tejidos de orquideas: Cattleya, Encyclia,
Oncidium y Stanhopea. Revista Chapingo. Serie
Horticultura, Chapingo, v. 1, n. 1, p. 58-62, 1994.
BIOASSAY FOR DETECTION
GLYPHOSATE
Bioassay for detectionOF
of glyphosate
or kanamycin... OR KANAMYCIN
13
RESISTANCE IN LETTUCE PLANTS (Lactuca sativa L.)
BIOENSAIO PARA A DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AO GLIFOSATO OU
KANAMICINA EM ALFACE (Lactuca sativa L.)
ANTONIO CARLOS TORRES1, WARLEY MARCOS NASCIMENTO1,
SONIA ALESSANDRA VASCONCELOS DE PAIVA2,
FERNANDO ANTONIO SOUZA DE ARAGÃO3, DANIEL JAMES CANTLIFFE4
1
PhD, Embrapa Hortaliças P. O. Box 218 Brasília, DF 70.359-970 Brazil.
Bolsista CNPq, Embrapa Hortaliças P. O. Box 218 Brasília, DF 70.359-970 Brazil.
3
MS, Embrapa Hortaliças P. O. Box 218 Brasília, DF 70.359-970 Brazil.
4
PhD, Horticultural Sciences Department University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences
Box 110690 Gainesville, FL 32611-0690 USA.
2
ABSTRACT
Transgenic plants of lettuce South Bay (Lactuca sativa
L.) (tolerant to herbicide glyphosate and to kanamycin) were
produced by using Agrobacterium tumefaciens (Erwin F. Smith and
CO Towsend) mediated transformation A biotest was developed
using aseptically grown seedlings in medium with glyphosate or
kanamycin. Root diferentiation and growth (both tap roots and
secondary roots) were observed in the transgenic seedlings while, in
the non-transgenic seedlings they were inhibited. This assay provided
an effective and inexpensive biotest for large scale detection of
putative transgenic lettuce tolerant to either glyphosate or kanamycin
in an early stage of plant development in segregating population. In
addition, this biotest can be used in germplasm screening toward
discover of glyphosate tolerance genes in plants.
Index terms: Lactuca sativa, biotest, transgenic selection, GMO,
transgenic test.
RESUMO
Plantas transgênicas de alface South Bay (Lactuca
sativa L.) (tolerantes ao herbicida glifosato e canamicina) foram
produzidas usando transformação genética mediada por
Agrobacterium tumefaciens (Erwin F Smith and CO Towsend).
Um bioteste foi desenvolvido usando plântulas germinadas em
condições assépticas em meio contendo glifosato ou canamicina.
A diferenciação e crescimento das raízes (primárias e
secundárias) foram observadas em plântulas transgênicas, ao
passo que nas plântulas não transgênicas esses processos foram
inibidos. Esse teste fornece um efetivo e econômico bioensaio
para detecção, em larga escala, de populações segregantes de
plantas potencialmente transgênicas de alface tolerantes ao
glifosato e canamicina nos estádios iniciais do desenvolvimento
da planta. Em adição, esse bioensaio pode ser empregado na
avaliação de germoplasma visando à prospecção de genes de
tolerância ao herbicida glifosato em plantas.
Termos para indexação: Lactura sativa, bioteste, seleção
transgênica, OGM, teste transgênico.
P.O.
INTRODUCTION
Glyphosate is a systemic and non-selective
herbicide used to control weeds in several crop plants.
Glyphosate interferes with aromatic acid biosynthesis by
inhibiting the activity of 5-enolpyruvylshikimate-3phosphate synthase (EPSPS), a key enzyme of the
shikimate pathway (AMRHEIN et al., 1980; BRADSHAW
et al., 1997; FRANZ et al., 1996; JOHN, 1997; SINGH &
SHANER, 1998). Kanamycin is an aminoglycoside antibiotic
produced by Streptomyces kanamyceticus (WINDHOLZ
et al., 1983) and interferes with protein synthesis by binding
to the 30S ribosomal subunit, which causes misreading of
genetic code (ELLSWORTH et al., 1998). Glyphosate and
kanamycin are generally used as selectable markers in
genetically modified organisms (GMO). The identification
of transgenes is necessary in breeding programs and in
selection of homozygous lines. In general, GMO
identification tests are performed by DNA analysis. In this
article we described an effective and inexpensive biotest
useful for detection of putative transgenic lettuce seedlings
expressing resistant to either glyphosate or kanamycin.
MATERIALS AND METHODS
Transgenic plants of lettuce (Lactuca sativa L.)
South Bay (tolerant to herbicide glyphosate and
kanamycin) were produced by using Agrobacterium
(Recebido em 15 de julho de 2003 e aprovado em 10 de maio de 2004)
14
TORRES, A. C. et al.
tumefaciens mediated transformation (TORRES et al.,
1999). Transgenic and the correspondent non
transgenic seeds of South Bay lettuce were
disinfested by immerging in 0.5 % sodium hypochlorite
solution, for 20 min. The seeds were then rinsed with
autoclaved distilled water and aseptically germinated
in medium containing MS salts (MURASHIGE &
SKOOG, 1962), 0.2% Phytagel and glyphosate (0; 50;
100 or 200µ M) (Assay 1). For kanamycin tolerance, the
seeds were germinated in medium containing 0; 50 or
100 mg.l-1 of this antibiotic (Assay 2). Kanamycin was
cold-sterilized by membrane filtration before added to
autoclaved media during cooling process. Glyphosate
media were autoclaved. The pH of all media was
adjusted to 5.7. The cultures were grown at 27°C, 16hour photoperiod at a light intensity of 62 µ mol.m-2.s-1.
Seed germination, tap root length and number of
secondary roots were evaluated at 13 days. The
experiment was arranged as a randomized complete
design in a fatorial (4x2 for glyphosate and 3x2 for
kanamycin) with ten replications per treatment. The
media were dispensed into 25x150 mm test tubes at the
rate of 20 ml per tube. Each replication consisted of a
single test-tube with two seeds in each. The tubes were
capped with natural kaputs (polypropylene closures).
The percent of seed germination was recorded. A t
test was performed initially to compare transgenic and
non-transgenic seedlings for the different parameters.
Regression analysis was also performed to evaluate
genotypes at different concentrations of glyphosate and
kanamycin. It was considered significant P values bellow
0.05. Data analysis were performed using MSTATC guide
for personal computers (Version 2.10, Michigan State
University, MI).
RESULTS AND DISCUSSION
Germination as well as all parameters evaluated
were not significantly different between transgenic
and non-transgenic seedlings growing in MS salts
medium free of either glyphosate or kanamycin (Table 1).
Th us tran sfo rma tion did n ot a dve rse ly a ffe ct
germination and root development. Germination was
not affected in both transgenic and non-transgenic
s e e d s a t d if f e r e n t g lyp h o s a te a nd k a n a myc in
concentrations (Table 2). For transgenic seeds, root
growth and development was also not affected by
glyphosate and kanamycin. However, glyphosate and
kanamycin affected root growth and development in
non-transgenic seeds (P < 0.0001 for all) (Table 2).
T h e g lyp h o s a te a n d k a n a my c in e f f e c ts o n
germination and root development are discussed
separately.
TABLE 1 Average of germination (Germ), tap root length (TRL) and number of secondary roots (NSR) between two
seed lots of transgenic and non-transgenic lettuce South Bay incubated in MS salt medium.
Genotype
Assay 1
Assay 2
Germ (%)
TRL (mm)
NSR
Germ (%)
TRL (mm)
NSR
Transgenic
85.00
46.75
7.50
85.00
32.00
7.61
Non-transgenic
91.25
47.60
7.55
85.67
37.50
8.75
P value*
0.38
0.83
0.94
0.71
0.13
0.39
* P values from t test.
Bioassay for detection of glyphosate or kanamycin...
15
TABLE 2 P values from analysis of variance for testing regression significance between two seed lots of transgenic
and non-transgenic lettuce South Bay incubated in MS salt medium.
Assay 1
Assay 2
Genotype
Germ
TRL
NSR
Germ
TRL
NSR
Transgenic
0.497
0.172
0.416
0.267
0.281
0.332
Non-transgenic
0.182
<0.001
<0.001
0.146
<0.001
<0.001
Germ: germination; TRL: tap root length; NSR: number of secondary roots.
y = -0.04x + 44.23
40
30
20
Transgenic
10
y = -0.18x + 33.82
Non-transgenic
0
0
50
100
150
FIGURE 2 Regression analysis for tap root growth in
13-day-old lettuce seedlings (transgenic and nontransgenic) growing in media containing MS salts and
glyphosate.
8
50
25
y = -0.01x + 6.96
Number of secondary roots
y = -0.03x + 88.00
75
200
Glyphosate concentration (µM)
y = 0.07x + 85.00
100
Germination (%)
50
Tap root length (mm)
Effect of ghyphosate on germination and in root
growth: Germination was normal and no significant differences
were observed in different glyphosate concentrations in both
genotypes (Table 2, Figure 1). These results are in agreement
with those of Nascimento et al. (2000) and Torres et al.
(2003),where the percent of germination of transgenic and
non-transgenic Glycine max (L.) Merril seeds were not
affected by glyphosate up 200 µ M.
Measurements of tap root length and the number of
secondary root formed were employed to evaluate root
development. These parameters estimate the ability of the
root system to develop in a particular substrate and can
show how root growth might affects meristematic activity
(LYNCH, 1995). Regression analysis for tap root growth
and number of secondary root (Table 2; Figures 2, 3) showed
interaction between glyphosate concentration and genotype.
6
4
2
Transgenic
Transgenic
y = -0.03x + 5.59
Non-transgenic
Non-transgenic
0
0
0
50
100
150
200
0
50
100
150
200
FIGURE 1 Percent of seed germination of lettuce
(transgenic and non-transgenic) incubated in media
containing MS salts and glyphosate.
FIGURE 3 Number of secondary roots in 13-day-old
lettuce seedlings (transgenic and non-transgenic) growing
in media containing MS salts and glyphosate.
16
In non-transgenic seedlings glyphosate inhibited root
growth and the final length of tap roots decreased in
glyphosate concentration ranging from 50 to 200 µ M
(Figure 2). Inhibited secondary root formation was
observed in medium with glyphosate (Figure 3). At
30 days secondary root development was poor
(Figure 4 A).
Glyphosate has been reported to inhibit root
growth in Glycine max seedlings (NASCIMENTO et
al., 2000; TORRES et al., 2003). Also Torres et al. (1999),
showed repression of morphogenetic events in lettuce
explants by glyphosate using in vitro leaf disc assay.
These authors observed an inhibition of callus growth
in non-transgenic Lactuca sativa leaf discs in
glyphosate medium. In contrast, leaf discs from
transgenic plants grew on glyphosate medium up to
800µ M. As evident in Figure 4 B, transgenic seedlings
grew normally in medium containing glyphosate up to
200 µ M.
A
Effect of Kanamycin on germination and in root
growth: Similar to the addition of glyphosate,
germination of transgenic and non-transgenic seeds was
not affected by an exogenous supply of kanamycin
(Table 2, Figure 5). After 13 days kanamycin inhibited
tap root growth (Figure 6) and secondary root
formation (Figure 7) of non-transgenic seedlings.
Kanamycin has been used as selective marker for
transformant selection of several plant species (JIN et
al., 2000; KO et al., 1998; TORRES et al., 1993, 2000).
Kanamycin has been established as having an
inhibitory effect in morphogenetic processes on in vitro
culture of susceptible explants. At 30 days, tap root
growth and secondary root development was poor in
non-transgenic seedlings (Figure 8 A). In contrast,
transgenic seedlings grew normally in medium with
kanamycin; both, the length of tap root and secondary
root formation were not inhibited in medium with
kanamycin up to 100 mg.l-1 (Figure 8 B).
B
FIGURE 4 Non-transgenic (A) and transgenic (B) seedlings of lettuce, 30 days old, growing in media containing MS
salts, 0.2 % Phytagel and glyphosate 0, 50, 100, 200 M (from left to right).
Bioassay for detection of glyphosate or kanamycin...
100
y = -0.10x + 100.00
35
y = 0.15x + 77.50
28
17
y = 0.04x + 30.06
Tap root length (mm)
Gemination (%)
75
50
Transgenic
25
Non-transgenic
21
14
Non-transgenic
7
Transgenic
y = -0.28x + 32.42
0
0
50
100
Kanamicin concentration (mg.l-1)
0
0
50
100
Kanamycin concentration (mg.l-1)
FIGURE 5 Percent of seed germination of lettuce
(transgenic and non-transgenic) incubated in media
containing MS salts and kanamycin.
FIGURE 6 Tap root growth of lettuce seedlings
(transgenic and non-transgenic) growing in media
containing MS salts and kanamycin
8
Number of secondary roots
y = -0.01x + 7.91
6
4
2
Transgenic
Non-transgenic
y = -0.09x + 7.29
0
0
50
Kanamycin concentration (mg.l-1)
100
FIGURE 7 Number of secondary roots of lettuce seedlings (transgenic and non-transgenic) growing in media
containing MS salts and kanamycin.
A
B
FIGURE 8 Non-transgenic (A) and transgenic (B) seedlings of lettuce, 30 days old growing in media containing MS
salts, 0.2 % Phytagel and kanamycin 0, 50 and 100 mg.l-1 (from left to right).
18
CONCLUSIONS
The in vitro biotest described here based in root
growth is a rapid effective, inexpensive procedure for
selection of putative transformed seedlings of lettuce in
relation to glyphosate and/or kanamycin tolerance.
LYNCH, J. Root architecture and plant productivity. Plant
Physiology, Washington, v. 109, p. 7-13, 1995.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for
rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiology Plant, Minneapolis, v. 15, p. 473497, 1962.
ACKNOWLEDGMENTS
REFERENCES
NASCIMENTO, W. M.; TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.;
PAIVA, S. A. V. Bioensaio para detecção de plantas
transgênicas de soja tolerantes ao herbicida glifosato. In:
SEMINÁRIO PANAMERICANO DE SEMILLAS, 17., 2000,
Punta de Este, Uruguay. Resumos... Punta de Este: INIA,
2000. p. 102.
AMRHEIN, N.; DEUS, B.; GEHRKE, P.; STEINRUCKEN,
H. C. The site of inhibition of the shikimate pathway by
glyphosate. Plant Physiology, Washington, v. 65, p. 830834, 1980.
SINGH, B. K.; SHANER, D. L. Rapid determination of
glyphosate injury to plants and identification of
glyphosate-resistant plants. Weed Technology, Champaign,
v. 12, p. 527-530, 1998.
BRADSHAW, L. D.; PADGETTE, S. R.; KIMBALL, S. L.;
WELLS, B. H. Perspectives on glyphosate resistance.
Weed Technology, Champaign, v. 11, p. 189-198, 1997.
TORRES, A. C.; CANTLIFFE, D. J.; LAUGHNER, B.;
BIENIEK, M.; NAGATA, R.; FERL, R. J. Stable
transformation of lettuce cultivar South Bay from cotyledon
explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,
Dordrecht, v. 34, p. 279-285, 1993.
The authors thank the Brazilian Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) for the scholarships.
ELLSWORTH, A. J.; WITT, D. M.; DUGDALE, D. C.;
OLIVER, L. M. Mosby s 1998 medical drug reference.
Saint Louis: Mosby, 1998. 994 p.
FRANZ, J. E.; MAO, M. K.; SIKORSKI, J. A. Glyphosate: a
unique global herbicide. Washington: American Chemical
Society, 1996. (Monograph, 189).
JIN, R. G.; LIU, Y. B.; TABASHNICK, B. E.; BORTHAKUR,
D. Development of transgenic cabbage (Brassica oleracea
var. capitata) for insect resistance by Agrobacterium
tumefaciens mediated transformation. In Vitro Cellular
Developmental Biology Plant, Wallingford, v. 36, p. 231237, 2000.
JOHN, M. E. Cotton crop improvement through genetic
engineering. Critical Review Biotechnology, [S.l.], v. 17, p.
185-208, 1997.
KO, K.; BROWN, S. K.; NORELLI, J. L.; ALDWINCKLE,
H. S. Alteration of npt II and gus expression following
micropropagation of transgenic M.7 apple rootstock line.
Journal of the American Society for Horticultural
Science, Alexandria, v. 123, p. 11-18, 1998.
TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.; ROMANO, E.;
KATTONY, M. C.; NASCIMENTO, A. S. Transformação
genética da batata cultivar Achat via Agrobacterium
tumefaciens. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 18, n. 1,
p. 41-45, mar. 2000.
TORRES, A. C.; NAGATA, R.; FERL, R. J.; BEWICK, T.
A.; CANTLIFFE, D. J. In vitro assay selection of
glyphosate resistance in lettuce. Journal of the American
Society for Horticultural Science, Alexandria, v. 124, n. 1,
p. 86-89, 1999.
TORRES, A. C.; NASCIMENTO, W. M.; PAIVA, S.
A. V.; ARAGÃO, F. A. S. Bioassay for detection of
transgenic soybean seeds tolerant to glyphosate.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 38,
p. 1053-1057, 2003.
WINDHOLZ, M.; BUDAVARI, S.; BLUMETTI, R. F.;
OTTERBEIN, E. S. (Eds.). The merck index an
encyclopedia of chemicals, drugs, and biologicals. 10.
ed. Rahway: Merck, 1983.
PROPAGAÇÃO DE
Coffea
arabica
ACAIÁ
Propagação
de Coffea
arabicaC.V.
c. v. acaiá
cerrado... CERRADO POR
MEIO DO CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES1
19
PROPAGATION OF Coffea arabica c.v. ACAIÁ CERRADO THROUGH
IN VITRO EMBRYO CULTURE
CÍNTIA GUIMARÃES DOS SANTOS2, RENATO PAIVA3, PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA4,
JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA5, ANDRÉ BARRETTO PEREIRA6
1
Parte da Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras/UFLA, pela primeira autora, para obtenção do grau de
Mestre em Fisiologia Vegetal.
2
Mestrado em Fisiologia Vegetal Departamento de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal/UFLA Caixa Postal 3037 37.200-000
Lavras, MG [email protected]
3
Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia/UFLA.
4
Professor Adjunto, Drª, Departamento de Agricultura /UFLA.
5
Professor, Dr., Universidade Estadual de Feira de Santana /UEFS.
6
Pesquisador, Dr, CEPLAC.
RESUMO
Objetivou-se neste trabalho o desenvolvimento de um
protocolo para obtenção in vitro de plântulas de Coffea arabica
L. c.v. Acaiá Cerrado, a partir de embriões zigóticos. Os embriões
foram extraídos de frutos coletados no estádio verde-cana e
inoculados em meio MS solidificado com 7 g L-1 de ágar, pH 5,8;
suplementado com 30 g L-1 de sacarose e diferentes concentrações
de BAP (0; 3; 6; 9 e 12 mg L-1). Para o enraizamento das brotações
obtidas, essas foram inoculadas em meio MS acrescido de AIB
(0; 2; 4; e 6 mg L-1). Para aclimatização e enraizamento ex vitro,
plântulas e brotações, respectivamente, obtidas a partir da
germinação in vitro de embriões foram transferidas para caixa de
gerbox, contendo vermiculita umedecida, e mantidas sob
temperatura constante em sombrite 70%, 50% e 30%,
respectivamente, os quais foram trocados em intervalos de sete
dias. Os sacos plásticos foram gradualmente abertos para redução
da umidade. O uso de 12 mg L-1 BAP proporcionou maior
comprimento das brotações obtidas in vitro. A aplicação de 4 e 6
mg L -1 AIB promoveu 100% de enraizamento in vitro de brotações.
O maior número de raízes/brotação (3) foi obtido na presença de
6 mg L -1 de AIB. O enraizamento ex vitro de brotações não se
apresentou como uma alternativa viável de propagação nas
condições deste trabalho. Foi verificado 80% de sobrevivência
das plântulas após a aclimatização.
Termos para indexação: Micropropagação, cultura de
embriões, enraizamento, aclimatização, cafeeiro, Coffea arabica.
ABSTRACT
The objective of the present work was to develop a
protocol for the in vitro propagation of Coffea arabica L. c.v.
Acaiá Cerrado from zygotic embryos. Embryos were collected
from fruits in the green sugarcane developmental stage and
inoculated in MS medium solidified with 7 mg L-1 agar, pH 5.8,
supplemented with 30 mg l-1 sucrose and different concentrations
of BAP (0, 3, 6, 9, and 12 mg L-1). For roof induction, the obtained
shoots were inoculated in MS medium containing the following
concentrations of IBA (0, 2, 4, and 6 mg L-1). For acclimatization
and ex vitro rooting, plantlets and shoots were transferred to
portable trays containing moistened vermiculite, and maintained
under constant humidity under 70, 50 and 30% mesh screen,
respectively, in intervals of 7 days each. The use of 12 mg L -1
BAP provided larger shoot length. The application of 4 or 6 mg
L -1 IBA promoted 100% of shoots rooting. The largest number
of roots/shoot (3) was obtained in the presence of 9 mg L-1 IBA.
Ex vitro shoot rooting showed not to be a viable alternative of
propagation. The use of 70, 50 and 30% mesh screen,
respectively, for a period of 7 days each promoted 80% of plantlet
survival during acclimatization.
Index terms: Micropropagation, embryo culture, rooting,
acclimatization, coffee plant, Coffea arabica.
INTRODUÇÃO
A forma mais utilizada de propagação do cafeeiro
(Coffea arabica L.) é por meio de sementes. No entanto, a
perda do poder germinativo das sementes dessa espécie
dificulta seu armazenamento e, conseqüentemente, a
preservação de estoques genéticos por longos períodos.
Diante do exposto, torna-se relevante a busca de
alternativas de propagação que propiciem a produção de
mudas. A cultura in vitro de embriões, por exemplo,
possibilita o crescimento e o desenvolvimento do embrião
zigótico, independentemente da sua idade, tamanho e
estádio de desenvolvimento (HU & FERREIRA, 1998).
(Recebido em 07 de julho de 2003 e aprovado em 14 de maio de 2004)
20
SANTOS, C. G. dos et al.
As brotações oriundas da germinação in vitro de
embriões podem ser utilizadas como explante, e a formação
de raízes adventícias nessas brotações permite o posterior
transplantio das plântulas para condições ex vitro.
Teve-se como objetivo neste trabalho a obtenção
de plântulas de Coffea arabica c.v. Acaiá Cerrado por meio
da germinação in vitro de embriões zigóticos e a
aclimatização das plântulas produzidas.
MATERIAL E MÉTODOS
Efeito da citocinina BAP no desenvolvimento de
brotações em embriões cultivados in vitro: Frutos no
estádio verde-cana , coletados de plantas adultas de
Coffea arabica c.v. Acaiá Cerrado cultivados no campo
experimental do setor de Cafeicultura da Universidade
Federal de Lavras foram utilizados como fonte de embriões.
Após a coleta, os frutos foram desinfestados em câmara
de fluxo laminar por meio da imersão em hipoclorito de
sódio (2% i.a.) durante 30 min e em seguida lavados em
água destilada e autoclavada. Os frutos foram transferidos
para placas de Petri esterilizadas, contendo papel de filtro,
as quais sofreram cortes para a excisão dos embriões. Após
excisados, os embriões foram imersos em solução de ácido
ascórbico (300 mg L-1) por 5 min e, em seguida, inoculados
em tubos de ensaio contendo 15 ml de meio MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), acrescido de 30 mg l-1 de
sacarose, solidificado com 0,7% de ágar e suplementado com
diferentes concentrações de BAP (0; 3; 6; 9 e 12 mg L-1). O pH
do meio foi ajustado em 5,8 e o meio de cultura foi
autoclavado a 121ºC por 15 minutos. Logo após a
inoculação, os embriões foram transferidos para sala de
crescimento a 27 ± 2ºC e mantidos na intensidade luminosa
de 13 µ mol s-1 m-2 durante 30 dias, quando se avaliaram o
comprimento das brotações e o número de folhas formadas.
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado com 10 repetições por
tratamento, sendo cada repetição constituída por três
embriões. As análises estatísticas foram realizadas através
de regressão polinomial.
Efeito da auxina AIB no enraizamento in vitro das
brotações obtidas da germinação in vitro de embriões:
Brotações, oriundas da cultura de embriões (90 dias de
cultivo in vitro), foram inoculadas em meio MS
suplementado com 30 mg L-1 de sacarose, 0,65% ágar e
acrescido de diferentes concentrações de AIB (0, 2, 4 e 6
mg L-1). O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8 e o
meio foi autoclavado por 20 minutos a 120ºC. Inoculouse, em câmara de fluxo laminar, uma brotação em cada
tubo. Posteriormente, as brotações foram mantidas em
sala de crescimento, a 25±1ºC, fotoperíodo de 16 h e
intensidade luminosa de 13 µ mol.s-1m-2, durante 30 dias,
quando foram avaliados a porcentagem de enraizamento,
o número médio de raízes por brotação e o comprimento
médio das raízes.
O delineamento estatístico foi o inteiramente
casualizado, com 10 repetições por tratamento, e cada
repetição, composta por uma brotação. A análise estatística
foi realizada por regressão polinomial.
Aclimatização e enraizamento ex vitro: As
plântulas para aclimatização e as brotações para o
enraizamento in vitro obtidas da germinação in vitro
de embriões, após 90 dias de cultivo foram transferidas
para caixa tipo gerbox contendo vermiculita. Após a
transferência, as plântulas e as brotações foram
envolvidas por sacos plásticos transparentes e
mantidas em sala de crescimento sob temperatura
controlada de 25±1ºC e sob sombrite 70% (14 µ mol.s-1.m-2)
por 7 dias. Para proporcionar um aumento gradual da
intensidade luminosa, esse sombrite foi substituído
por sombrite 50% (25 µ mol.s -1.m-2) e, posteriormente,
para 30% (75 µ mol.s-1.m-2) e, sem sombrite, em intervalos
de 7 dias. Durante esse período, a cobertura plástica
foi parcialmente aberta para redução gradual da
umidade. Após 7 dias das plântulas sem sombrite
(total de 35 dias), a cobertura plástica e o sombrite
foram retirados, quando, então, foram avaliados o
percentual de plântulas aclimatizadas e brotações
enraizadas.
Propagação de Coffea arabica c. v. acaiá cerrado...
21
Efeito da citocinina BAP no desenvolvimento de
brotações em embriões cultivados in vitro:Na presença de
concentrações de BAP inferiores a 9 mg L-1 o comprimento
médio das brotações de Coffea arabica c.v. Acaiá Cerrado
foi de 1,1cm, semelhante ao controle (Figura 1).
Vários autores atribuem o sucesso da cultura de
embriões à formação adequada da parte aérea cujo
comprimento deve ser igual ou superior a um centímetro
(COLONNA, 1972; KRASNYANSKI et al., 1992;
RAGHURAMULU, 1989; SONDAHL et al., 1984). Neste
estudo, a utilização de 12 mg L-1 de BAP proporcionou a
formação de brotações com comprimento médio de 1,2 cm.
Por esses resultados, verifica-se que o uso de BAP
promove o crescimento de brotações in vitro, cujo tamanho
favorece a sobrevivência da plântula.
Pelo número de folhas por brotação, não se
observou diferença significativa entre os tratamentos, 30
dias após a inoculação dos embriões no meio de cultura,
sendo de duas folhas/brotação.
Efeito da auxina AIB no enraizamento in vitro das
brotações obtidas da germinação in vitro de embriões: Na
Comprimento brotações (cm)
ausência de AIB, não foi observado enraizamento das
brotações (Figura 2).
BAP (mg L-1)
FIGURA 1 Comprimento médio de brotações de Coffea
arabica c.v. Acaiá Cerrado, após 30 dias do cultivo in
vitro de embriões zigóticos, inoculados em diferentes
concentrações de BAP.
Enraizamento (%)
AIB (mg L-1)
FIGURA 2 Percentual de enraizamento de brotação de
Coffea arabica c.v. Acaiá Cerrado, após 30 dias do cultivo
in vitro de brotações, em função da concentração de AIB.
No entanto, o uso de 2 mg L-1 de AIB, proporcionou
83% de enraizamento. Os tratamentos com 4 ou 6 mg L-1 de
AIB proporcionaram 100% de enraizamento. Esse resultado
está de acordo com George (1996). Segundo esse autor, o
uso de auxina em algumas espécies acelera
consideravelmente o processo de enraizamento e, além
disso, pode causar aumento no número de raízes formadas.
O tratamento com auxinas em plântulas cultivadas
in vitro de Coffea arabica c.v. Acaiá Cerrado favorece o
número de raízes formadas (Figura 3).
Observou-se um aumento no número de raízes com
o aumento na concentração de AIB. O uso de 6 mg L-1
proporcionou um aumento de 95% no número de raízes
formadas, em relação ao controle. Entretanto, George (1996)
relata que concentrações elevadas podem também induzir
a formação de calos. Neste trabalho, não se verificou a
formação de calos nas brotações da cultivar Acaiá Cerrado
inoculadas em meio de cultura acrescido de AIB.
Na presença de AIB, independentemente das
concentrações adicionadas ao meio de cultura, não se
observaram diferenças significativas no comprimento de
raízes, cuja média foi de 0,36 cm. Esses resultados foram
semelhantes ao relatado por Harbage et al. (1993), em que
a presença de auxina, principalmente em altas
concentrações, favoreceu o crescimento in vitro de raízes
de macieira (Malus domestica Baumg.).
Número de raízes
22
SANTOS, C. G. dos et al.
Y = 0,1667 + 0,5417X
R2 = 0,95
AIB (mg L-1)
FIGURA 3 Número de raízes em brotação de Coffea
arabica c.v. Acaiá Cerrado, após 30 dias do cultivo in
vitro de brotações, em função da concentração de AIB.
Aclimatização e enraizamento ex vitro: As
plântulas obtidas in vitro apresentaram 80% de
sobrevivência após a aclimatização. O controle
ambiental, mediante o uso de sombrite 70%, 50%, 30%,
respectivamente, por período de sete dias cada, a
manutenção da temperatura e redução gradual da
umidade no local de aclimatização, favoreceram o
crescimento e o desenvolvimento das plântulas. Esses
resultados estão de acordo com o proposto por
Brassard et al. (1996) e Dunstan & Turner (1984), os
quais afirmam que o sucesso da aclimatização é
O maior número de raízes/brotação (3) foi obtido na
presença de 6 mg. L-1 de AIB.
O enraizamento ex vitro de brotações não se
apresentou como uma alternativa viável de propagação
nas condições experimentados neste trabalho.
Verificaram-se 80% de sobrevivência das plântulas
após a aclimatização.
BRASSARD, N.; BRISSETTE, L.; LORD, D.; LALIBETÉ,
S. Elongation, rooting and acclimatization of
micropropagated shoots from mature material of hybrid
lard. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Dordrechet, v.
44, p. 37-44, 1996.
COLONNA, J. P. Contribution a letude de la culture in
vitro d embryos de cafeiers: Action de la cafeina. Thé Café,
Cação, Paris, v. 16, p. 193-203, 1972.
DUNSTAN, D. I.; TURNER, K. E. The acclimatization of
micropropagated plants. In: VASIL, I. K. (Ed.). Cell culture
and somatic cell genetics of plants-laboratory procedures
and their applications. Orlando: Academic, 1984. v. 1, p.
123-129.
atribuído à superação dos problemas decorridos do
processo de enraizamento (in vitro ou ex vitro) que
variam com a espécie estudada e ainda ao controle das
GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture:
the technology. 2. ed. Edington: Exegetics, 1996.
361 p.
condições de temperatura e umidade a que as plântulas
são inicialmente submetidas.
Com relação ao enraizamento ex vitro,
observou-se apenas 30% de enraizamento em
brotações oriundas da cultura de embriões após 90
dias de cultivo in vitro. Pelos resultados obtidos,
verifica-se que o enraizamento ex vitro, nas condições
deste trabalho, não foi uma alternativa viável para sua
propagação em escala comercial.
HARBAGE, J. F.; STIMART, D. P.; EVERT, R. F. Anatomy
of adventitious root formation in microcuttings of Malus
dosmestica Borkh. Gala . Journal of the American Society
for Horticultural Science, Alexandria, v. 118, n. 5, p. 680688, 1993.
CONCLUSÕES
HU, C. Y.; FERREIRA, A. G. Cultura de embriões. In:
CENTRO BRASILEIRO ARGENTINO DE
BIOTECNOLOGIA. Cultura de tecidos e transformação
genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/
EMBRAPA-CNPH, 1998. v. 1, p. 261-297.
O uso de 12 mg L-1 BAP proporcionou maior
comprimento das brotações obtidas
A aplicação de 4 e 6 mg L-1 AIB promoveu 100% de
enraizamento in vitro de brotações.
KRASNYANSKI, S.; POLGÁR, Z.; NÉMETH, G.;
MENENZEL, L. Plant regeneration for callus and protoplast
of Helianthus giganteus L. Plant Cell Reports, Berlin, v.
11, p. 7-10, 1992.
Propagação de Coffea arabica c. v. acaiá cerrado...
growth and bioassays with tobacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-479, 1962.
RAGHURAMULU, Y. Anther and endosperm culture of Coffee.
Journal of Research, Cambridge, v. 19, n. 2, p. 71-81, 1989.
23
SONDAHL, M. R.; NAKAMURA, T.; MEDINA FILHO,
H. P.; CARVALHO, A.; FAZUOLI, L. C.; COSTA, W. R.
Coffee. In: AMMYRATO; MCMILLEN (Eds.).
Handbook of plant cell culture. New York: P.V., 1984.
p. 564-590.
24
DESINFESTAÇÃO COM PARAFORMALDEÍDO
NO CULTIVO
FIOR, C. S. et al.
IN VITRO DE Limonium platyphyllum Lincz.
DESINFECTION WITH PARAFORMALDEYDE ON IN VITRO CULTURE OF
Limonium platyphyllum Lincz.
CLAUDIMAR SIDNEI FIOR1, CÉSAR GOIS PRESTES2, LIA ROSANE RODRIGUES3
1
Engenheiro Agrônomo, Laboratório de Cultura de Tecidos Jardim Botânico Fundação Zoobotânica do Rio Grande do Sul
90690-000 Porto Alegre, RS [email protected]
2
Acadêmico do Curso de Agronomia e bolsista do Departamento de Horticultura e Silvicultura Faculdade de Agronomia
Universidade Federal do Rio Grande do Sul/UFRGS.
3
Doutora em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular do Departamento de Genética
Instituto de Biociências/UFRGS.
RESUMO
O paraformaldeído (H-CHO)n (PF) é um polímero sólido
do formaldeído, empregado para esterilização de ambientes e
instrumentos cirúrgicos. Neste trabalho, a desinfestação de tecidos
de Limonium platyphyllum Lincz. com PF foi testada como
alternativa à técnica mais comum que emprega etanol 70% e
NaOCl, procedimento padrão (PP) na maioria dos laboratórios.
O trabalho foi executado em quatro etapas nas quais foram
avaliados: 1. o potencial do PF como agente de desinfestação
para discos foliares; 2. a desinfestação de segmentos nodais da
inflorescência com PF e seu efeito sobre a regeneração, calogênese
e hiperhidratação; 3. os efeitos do tempo de exposição dos tecidos
ao PF (2, 8, 14 e 20h) sobre a contaminação e a oxidação; 4. a
desinfestação com PF sobre a regeneração de brotações vegetativas
e reprodutivas em explantes nodais da inflorescência, sob
concentrações crescentes de 6-benziladenina (BA) no meio de
indução. Utilizou-se meio MS (30g de sacarose e 8g L-1 de ágar)
com concentrações e tipos de fitorreguladores variáveis conforme
o explante. Pelos resultados, verificou-se não haver diferença
entre a desinfestação com PF e o PP no que se refere à
contaminação fúngica e bacteriana. A calogênese nos discos foliares
não diferiu entre os procedimentos de desinfestação. A oxidação
dos explantes aumentou em exposição 8h ao PF. Foi possível
regenerar lotes comerciais homogêneos de plantas a partir de
explantes desinfestados com PF.
Termos para indexação: Micropropagação, desinfestação,
formaldeído, paraformaldeído, Limonium platyphyllum.
ABSTRACT
Paraformaldehyde (H-CHO) n (PF) is a solid
formaldehyde polymer used to disinfect surgical rooms and
instruments. In this study, Limonium platyphyllum Lincz explants
were disinfected with PF tablets, as an alternative to the pattern
technique (PT) of surface sterilizing, commonly used in plant
tissue culture laboratories. A four-step research work was
performed to analyze: 1. PF disinfectant effect in leaf discs; 2.
Callogenesis, shoot morphogenesis and hyperhydricity under
PF surface sterilizing in inflorescence stems; 3. Contamination and
oxidation with regard to the time of PF exposure (2, 8, 14 and 20h);
and 4. PF effect in vegetative or reproductive shoot formation
from inflorescence stems, under increasing BA concentration.
concentration.
MS
L-1-1 agar was used.
MS culture
culture media
media with
with30g
30gsucrose
sucrose and
and 8g
8g L
Growth regulator types and concentrations varied according to
the explant type. Fungal and bacterial contamination from
inflorescence stems, and callogenesis from leaf discs were not
different in the two procedures. Explant oxidation increased in
PF exposure greater than 8 h. Homogeneous commercial plantlets
were regenerated from explants disinfected in PF.
Index terms: Micropropagation, surface sterilizing, aseptic
technique, formaldehyde, paraformaldehyde, Limonium
platyphyllum.
INTRODUÇÃO
Limonium platyphyllum Lincz. (Plumbaginaceae) é
uma planta ornamental cultivada como flor de corte, muito
empregada em composições de arranjos e buquês, seca ou
desidratada. A produção de lotes homogêneos de mudas
dessa espécie requer propagação clonal in vitro. Para tanto,
um protocolo foi desenvolvido no Laboratório de
Biotecnologia em Horticultura da Faculdade de Agronomia
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) (FIOR
et al., 2000). Nesse caso, a desinfestação dos tecidos é feita
por imersão em soluções de etanol 70% e NaOCl 1% i. a.
A desinfestação dos tecidos vegetais é essencial,
pois uma das principais fontes de contaminação dos
cultivos é o próprio explante. Diversas substâncias com
ação germicida podem ser utilizadas para a desinfestação,
(Recebido em 05 de abril de 2004 e aprovado em 14 de junho de 2004)
Desinfestação com paraformaldeído no cultivo in vitro...
como o cloreto de mercúrio, o peróxido de hidrogênio, o
mertiolate, o nitrato de prata e o etanol, bem como
compostos à base de cloro, como o hipoclorito de sódio
(NaOCl) e de cálcio (LEIFERT et al., 1994). Alguns produtos
oferecem resultados superiores para finalidades específicas
(ALASRI et al., 1992, 1993; ALLERBERGER & DIERICH,
1988; BEST et al., 1990; BROWN et al., 1996; FAYER et al.,
1996; SAGRIPANTI & BONIFACINO, 1997). Porém, é
necessário estudar agentes de desinfestação para diminuir
os custos e o impacto ambiental do laboratório de cultivo
vegetal in vitro.
O Paraformaldeído (H-CHO)n (PF) é um polímero
sólido do formaldeído (FA) comercializado em drágeas que
o liberam em forma gasosa. O gás (H-CHO) é incolor,
cáustico para pele e mucosas e possui um odor
característico, mesmo em mínimas concentrações. À
temperatura ambiente, a liberação do PF é menor,
requerendo níveis térmicos elevados para ampliar o efeito
esterilizante (GRAZIANO et al., 1989).
Com o objetivo de buscar alternativas eficientes
para a desinfestação de tecidos vegetais e reduzir o descarte
de soluções potencialmente poluentes nos mananciais
hídricos, como os compostos à base de hipoclorito, foi
realizado este estudo.
MATERIAL E MÉTODOS
Os trabalhos foram executados no Laboratório de
Biotecnologia em Horticultura da Faculdade de Agronomia
da UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil. Os tecidos vegetais
foram coletados de matrizes mantidas em casa de
vegetação, adubadas mensalmente e tratadas com produtos
fitossanitários em caráter preventivo. Após a coleta, os
tecidos foram lavados e escovados com detergente
concentrado, mantidos sob água corrente durante cinco
minutos, secos ao ar e submetidos aos tratamentos.
A desinfestação com PF foi realizada à temperatura
ambiente (~ 26ºC), mantendo-se os tecidos em frasco de
vidro de 150 mL, lacrados, com duas drágeas de 500 mg de
PF 99,9% procedente da empresa Rioquímica.
25
O procedimento padrão de desinfestação (PP)
constituiu-se de imersão, sob agitação, em etanol 70% por
1min e em NaOCl 1% i.a. (+ 4 gotas de detergente
concentrado L-1) por 10min, seguida de triplo enxagüe em
água deionizada e autoclavada em câmara de fluxo estéril.
Depois de submetidos aos tratamentos, os tecidos
foram cortados e estabelecidos em meio básico MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), 30 g de sacarose e 0,8 g
de ágar L-1, com variações nos tipos e concentrações de
fitorreguladores conforme o explante utilizado em cada
experimento.
Os explantes foram mantidos sob condições
controladas (25±2oC e fotoperíodo 16h com 43±1µ mol m-1 s-1).
Os dados foram analisados em números absolutos,
porém os resultados estão expressos em porcentagem para
facilitar a compreensão.
Experimento 1: Discos de tecido foliar de idade
mediana com =6mm foram empregados como explantes,
considerando a maior predisposição das folhas de L.
platyphyllum à contaminação, proporcionalmente à idade
do tecido. Os tratamentos foram: a. sem desinfestação; b.
PP; c. PF por 1h; d. PF por 4h; e. PF por 8h. Os explantes
foram estabelecidos em tubos de ensaio contendo 5 mL do
meio básico acrescido de 5 mg L-1 de 2,4-D (um explante
por tubo) em delineamento completamente casualizado
com 16 repetições por tratamento (cada quatro tubos
constituindo uma parcela). Ao 15o dia de cultivo, procedeuse à avaliação das variáveis: número de explantes com
fungos, com bactérias e com calos e número de explantes
vivos. Os resultados foram submetidos ao teste de
normalidade e à análise da variância (ANOVA) paramétrica
(Tukey 5%).
Experimento 2: Segmentos nodais da inflorescência
imatura (explantes empregados no protocolo para
micropropagação) foram submetidos aos tratamentos: a.
sem desinfestação (controle); b. PP; c. PF por 1h45min. Os
explantes foram estabelecidos em frascos snap cap de
volume 150 mL, contendo 20 mL do meio básico, acrescido
de 0,5 mg L-1 de ANA + 2,5 mg L-1 de BA (4 explantes por
26
FIOR, C. S. et al.
frasco). O delineamento experimental foi o completamente
casualizado com 10 repetições por tratamento. Ao 28o dia
de cultivo, procedeu-se à avaliação das variáveis: número
de explantes com fungos, com bactérias e com calos;
número e comprimento das brotações vegetativas; e
número de explantes hiperhidratados. Os resultados foram
submetidos ao teste de normalidade e à ANOVA paramétrica
e não paramétrica ( Tukey e Duncan 5%)
Experimento 3: O efeito do tempo de exposição ao
PF sobre a contaminação e a oxidação de segmentos nodais
da inflorescência foi testado em delineamento
completamente casualizado, com 10 repetições por
tratamento. Os tratamentos foram: a. PP; b. PF por 2h; c. PF
por 8h; d. PF por 14h; e. PF por 20 h. Os explantes foram
estabelecidos em placas de petri ( =9 cm), contendo 20
mL do meio básico, acrescido de 4 mg L-1 de AIB + 0,3 mg L-1
de BA (5 explantes por placa). Ao 18o dia de cultivo,
procedeu-se à avaliação das variáveis: número de explantes
com fungos e com bactérias e número de explantes
oxidados. Os resultados foram submetidos à análise de
regressão e correlação, ao teste de normalidade e à ANOVA
não paramétrica (Tukey 5%).
Experimento 4: Para esclarecer se a desinfestação
com PF afeta o potencial morfogenético ou altera os
índices de multiplicação dos explantes, foi comparada a
resposta organogenética de segmentos nodais da
inflorescência sob concentrações crescentes de BA no
meio de indução, após desinfestação com PF e após o
PP. O delineamento completamente casualizado em
fatorial incluiu os tratamentos: desinfestação (PP e PF
por 1h45min) e concentrações de BA (0,05, 0,45, 0,85,
1,25, 1,65 e 2,05 mg L1). Os explantes foram cultivados
em frascos snap cap de 150 mL, contendo 20 mL do
meio básico, cada um com 5 explantes, totalizando 11
repetições por tratamento. Ao 28 o dia de cultivo,
procedeu-se à avaliação das variáveis: número de
explantes com fungos e com bactérias; número de
brotações vegetativas e reprodutivas. Os resultados
foram submetidos à análise de regressão e correlação,
ao teste de normalidade, à ANOVA paramétrica e não
paramétrica (Duncan 5%).
Experimento 1: Uma vez estabelecidos em meio com
2,4-D, os discos foliares de L. platyphyllum que não se
contaminaram deram origem a calos ou permaneceram
inalterados. No tratamento controle (apenas lavagem com
escovação em água corrente), 94% dos explantes
apresentaram contaminação com fungos, bactérias ou
ambos (Figura 1). Nesse tratamento, 88% dos explantes
apresentaram contaminação fúngica e 44% bacteriana
(Tabela 1). Entretanto, a incidência de contaminação por
bactérias pode ter sido subestimada pela dificuldade de
avaliação visual das colônias bacterianas com o rápido
avanço das colônias fúngicas. O percentual de explantes
contaminados por fungos não diferiu significativamente
entre os tratamentos controle, PP e PF 1h (Tabela 1).
O aumento do tempo de exposição ao PF reduziu a
contaminação fúngica e bacteriana (Tabela 1), mas aumentou
a proporção de explantes não responsivos (Figura 1)
O potencial calogênico dos tecidos não diferiu
significativamente após 1, 4 e 8 horas de exposição ao PF,
e 50%, 44% e 44% dos explantes formaram calos,
respectivamente, não havendo diferença estatística entre
os tratamentos (d.n.m).
FIGURA 1 Porcentagem de discos foliares de L.
platyphyllum contaminados, sem crescimento e com
formação de calo, nos tratamentos de desinfestação (PP:
etanol 70% + NaOCl 1% i.a., PF/xh: paraformaldeído com x
horas de exposição).
27
TABELA 1 Porcentagem de discos foliares de L. platyphyllum contaminados in vitro, no 15o dia de cultivo.
Desinfestação
Com fungos
Com bactérias
Controle
88 C
44 ab
PP
50 Bc
63 b
PF 1h
50 Bc
31 ab
PF 4h
31 Ab
25 ab
PF 8h
6 A
6 a
CV%
21
28
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente (Tukey 5%).
Pelos resultados, observa-se que a ação do PF é
dependente do tempo de exposição, confirmando observações
para outros materiais (ALASRI et al., 1992, 1993).
Experimento 2: Os segmentos nodais do eixo da
inflorescência imatura são utilizados como explantes no
protocolo comercial de micropropagação L.
platyphyllum (FIOR et al., 2000). Apesar de constituírem
uma estrutura reprodutiva, esses tecidos são
estabelecidos em meios de indução visando à formação
de brotações vegetativas por meio de organogênese
direta. Entretanto, o desenvolvimento de brotações
reprodutivas pode ocorrer, de acordo com as condições
de cultivo, principalmente a concentração de BA. Esses
tecidos são mais jovens e tenros que os foliares, por
isso, foi testado um período de exposição
comparativamente curto: 1h45min.
Após quatro semanas, todos os explantes do
tratamento controle apresentaram contaminação. Não
houve diferença significativa entre PP e PF para todas as
variáveis testadas (Tabela 2), indicando que o PF pode
substituir o PP na desinfestação desse tipo de tecido. O
índice de hiperhidratação não diferiu entre os tratamentos,
sendo a média de 4% (d.n.m.).
Considerando que o PF tem efeito comprovadamente
mutagênico, seu emprego pode ser mais adequado para
explantes nodais do que para discos foliares, uma vez
que as células meristemáticas que formarão as
brotações vegetativas, estão protegidas pelos tecidos
da epiderme e pelos primórdios foliares. No caso de
discos foliares, as células de calo são expostas mais
diretamente ao PF.
Experimento 3: Considerando que o tempo de
exposição determinou o efeito do PF e que a resposta dos
segmentos nodais da inflorescência não diferiu entre os
dois procedimentos, os explantes foram expostos ao PF
por períodos de até 20h, a fim de constataram-se prováveis
efeitos fitotóxicos da exposição prolongada.
Neste experimento, os explantes sobreviveram
aos períodos crescentes de exposição ao PF, mas a
incidência de oxidação aumentou com o tempo de
exposição. Comparados os tempos de exposição de 14h
e 20h (Figura 2), observa-se que o percentual de
explantes oxidados aumentou de 14% para 42%. Dentre
as prováveis causas dessa oxidação estão o efeito
prejudicial do prolongado tempo de exposição ao PF e a
desidratação do tecido.
28
FIOR, C. S. et al.
TABELA 2 Resposta de segmentos nodais da inflorescência de L. platyphyllum, ao 28º dia de cultivo, após diferentes
procedimentos de desinfestação.
Tratamento
Brotações
Contaminação (%)
Calos
vegetativas
Fungos
Bactérias
(%)
Nº/expl.
Compr(mm)
Controle
32,5 B
70,0 B
-
-
-
PP
2,5 A
25,0 A
59,4 A
2,5 A
17,5 a
PF por 1h45
2,5 A
22,5 A
35,0 A
2,4 A
13,5 a
15
23
CV%
29
2
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente (Tukey 5%).
A ANOVA não paramétrica não apontou diferença
entre todos os tratamentos quanto ao número de explantes
contaminados com fungos (Pr>F= 0,290) e com bactérias
(Pr>F= 0,07).
Experimento 4: A ANOVA não paramétrica não
detectou diferença significativa nos procedimentos de
desinfestação, sobre os índices de contaminação
(Pr>F= 0,2112).
Aos 28 dias de cultivo, o número médio de
FIGURA 2 Percentuais de oxidação, contaminações
fúngicas e bacterianas em segmentos nodais da
inflorescência de L. platyphyllum submetidos a períodos
crescentes de exposição ao paraformaldeído (cont. fúng.
= -0,07x2 + 1,43x + 7,32, r2 = 0,99; Oxidação = 0,13x2 - 0,59x
+ 2,17, r2 = 0,95; cont. bact = -0,4x + 8,4 r2 = 0,9).
A ANOVA não paramétrica (d.n.m.) detectou
diferença significativa no número de explantes oxidados
somente naqueles tratamentos em que a exposição foi maior
ou igual a oito horas, não havendo, portanto, diferença
entre os tratamentos com PP e PF, em até duas horas. O
coeficiente de correlação entre o número de explantes
oxidados e o tempo de exposição ao PF foi significativo
(0,4648). Nesses resultados, confirma-se a observação de
Braithwaite et al. (1994), que apontaram efeitos fitotóxicos
na utilização de FA em tubérculos de batata.
brotações vegetativas por explante foi de 0,8 no material
desinfestado com PP e 1,3 no material desinfestado com
PF. O maior número de brotações por explante foi obtido
nos meios contendo 1,25, 1,65, e 2,05 mg de BA L-1, esse
número foi de, respectivamente, 1,0, 2,5, e 1,4 em PP e para
2,0, 2,0 e 4,3 em PF.
A ANOVA não detectou diferença significativa entre
os tratamentos de desinfestação quanto ao número de
brotações reprodutivas por explante (Pr>F= 0,3268). Apenas
a concentração de BA teve efeito significativo sobre a
formação dessas brotações indesejáveis (Pr>F= 0,0001).
Confirmando os resultados de Fior et al. (2000), o
número de brotações vegetativas formadas por explante
aumentou com a concentração de BA (Pr>F= 0,0001), com
respostas
significativamente
superiores
nas
concentrações mais elevadas (1,25, 1,65, 2,05 mg L-1).
29
Apesar de o aumento ocorrer tanto em explantes
desinfestados com PF como em PP, o número de brotações
vegetativas foi significativamente maior no tratamento com
PF (Pr>F= 0,0291), de acordo com a ANOVA não
paramétrica. Porém, os testes realizados não são suficientes
para associar essa resposta a algum efeito benéfico do PF
sobre a organogênese.
Não houve interação significativa entre a
desinfestação e as concentrações de BA na análise do
número de brotações vegetativas (Pr>F=0,3302) e
reprodutivas (Pr>F=0,1004), confirmando que o emprego
do PF não interferiu na resposta a essa citocinina.
As brotações vegetativas obtidas dos experimentos
2, 3 e 4 foram subcultivadas, aclimatizadas e acompanhadas
até o florescimento sem que qualquer alteração fenotípica
tenha sido observada.
Se a exposição ao gás (formaldeido) não for direta, a
probabilidade de ocorrer variação nos lotes de plantas
devido ao efeito mutagênico do PF pode ser mínima.
Segmentos nodais de gipsofila e sementes de orquídeas já
foram desinfestados com PF apresentando bons resultados
(dados não publicados).
As drágeas de PF têm baixo preço, podem ser
reaproveitadas, são de manipulação fácil e segura e
substituem com vantagens as soluções de desinfestação,
principalmente na produção de plantas in vitro em escala
comercial. Porém, o emprego rotineiro do PF no laboratório
de cultivo in vitro requer adaptações estruturais que
reduzam a exposição ocupacional humana a níveis mínimos,
de preferência bem inferiores aos níveis estabelecidos pelo
Ministério da Saúde e pela Occupational Safety & Heath
Administration (0,5 a 2,0 ppm) (GRAZIANO et al., 1989).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
AGRADECIMENTO
Há inúmeros registros sobre o FA e o PF na literatura
acerca do emprego industrial e do uso como integrante de
fixadores. Contudo, seu emprego no cultivo de tecidos
vegetais não é mencionado.
Pelos resultados, verifica-se que o PF pode ser
empregado como agente de desinfestação em protocolos
de micropropagação, como alternativa aos procedimentos
Os autores agradecem ao CNPq (Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico),
pelo suporte financeiro.
que requerem imersão. Para a desinfestação de segmentos
nodais da inflorescência de L. platyphyllum, foi suficiente
a exposição dos tecidos a duas drágeas de 500mg de PF
99,9% por 2h, à temperatura ambiente, dentro de um frasco
de vidro lacrado de 150 mL.
Apesar de não terem ocorrido alterações fenotípicas
nas mudas produzidas nesses experimentos, é
recomendável que o tecido ou as células que sofrerão
morfogênese in vitro não sejam expostos diretamente ao
ALASRI, A.; ROQUES, C.; MICHEL, G.; CABASSUD, C.;
APTEL, P. Bactericidal properties of peracetic acid and
hydrogen peroxide, alone and in combination and
comparison with chlorine and formaldehyde against
bacterial water strains. Canadian Journal of Microbiology,
Otawa, v. 38, n. 7, p. 635-642, 1992.
ALASRI, A.; VALVERDE, M.; ROQUES, C.; MICHEL, G.;
CABASSUD, C.; APTEL, P. Sporicidal properties of peracetic
acid and hydrogen peroxide, alone and in combination and
comparison with chlorine and formaldehyde for ultrafiltration
membrane desinfection. Canadian Journal of Microbiology,
Otawa, v. 39 n. 1, p. 52-60, 1993.
gás devido ao seu comprovado efeito mutagênico. Seu
emprego é ideal para tecidos e órgãos dos quais o explante
será excisado, como: os ápices caulinares dos quais será
extraído o meristema; frutos dos quais serão removidas as
sementes; sementes das quais o embrião será isolado, etc.
ALLERBERGER, F.; DIERICH, M. P. Effects of disinfectans
on bacterial metabolism evaluated by microcalorimetric
investigations. Zentralblatt fuer Bakteriologie,
Mikrobiologie und Hygiene - 1B, Stuttgard, v. 187, n. 2, p.
166-179, 1988.
30
FIOR, C. S. et al.
BEST, M.; KENNEDY, M. E.; COATES, F. Efficacy of a
variety of disinfetants agains Listeria spp. Applied and
Environmental Microbiology, Baltimore, v. 56, n. 2, p. 377380, 1990.
BRAITHWAITE, M.; FALLOON, R. E.; GENETI, R. A.;
WALLACE, A. R.; FLATCHER, J. D.; BRAAM, W. F.
Control of powdery scabe of potatoes with chemical seed
tubers treatments. New Zealand Journal of Crop and
Horticultural Science, Wellington, v. 22, n. 2, p. 121-128,
1994.
BROWN, S. M. A.; McDONALD, V.; DENTON, H.;
COOMBS, G. H. The use of a new viabitity assay to
determine the susceptibility of Cryptosporidium and
Eimeria sporozoites to respitatory inhibitors and extremes
of pH. FEMS Microbiology Letter, Delft, v. 142, n. 2/3, p.
203-208, 1996.
FAYER, R.; GRACZYK, T. K.; CRANFIELD, M. R.; TROUT,
J. M. Gaseous disinfection of Cryptosporidium parvum
oocysts. Applied and Environmental Microbiology,
Baltimore, v. 62, n. 10, p. 3908-3909, 1996.
FIOR, C. S.; RODRIGUES, L. R.; KÄMPF, A. N. Propagação
in vitro de Limonium latifolium Kuntze (Plumbaginaceae).
Ciência Rural, Santa Maria, v. 30, n. 4, p. 575-580, 2000.
GRAZIANO, K. U.; CIANCIARULLO, T. I.; GONTIJOFILHO, P. P. Avaliação da atividade esterilizante do
paraformaldeído. Revista Brasileira de Enfermagem,
Brasília, v. 42, n. 1/4, p. 79-89, 1989.
LEIFERT, C.; MORRIS, C. E.; WAITES, W. M. Ecology of
microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and
fiel-grown plants: reasons for contamination problemas In
Vitro. Critical Reviews in Plant Science, Knoxville, v. 13,
n. 2, p. 139-183, 1994.
Physiologia Plantarum, Köpenhagen, v. 15, p. 473-497, 1962.
SAGRIPANTI, J. L.; BONIFACINO, A. Effects of salt and
serum on the sporicidal activity of liquid disinfectants.
Journal of AOAC International, Gaithersburg, v. 80, n. 6,
p. 1198-1207, 1997.
CONCENTRAÇÃO
DEde KNO
KNO
ENONH
NO3 NO
CRESCIMENTO
Concentração
e NH
no crescimento
in vitro...
3
3
3 4
4
IN VITRO DE PLÂNTULAS DE ORQUÍDEA1
31
CONCENTRATION OF KNO3 AND NH4NO3 ON IN VITRO GROWTH
OF ORCHID PLANTLETS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO2, MOACIR PASQUAL3, VANTUIL ANTÔNIO RODRIGUES4,
ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA2, GUSTAVO ARAÚJO SOARES5
1
Parte da dissertação apresentada pelo primeiro autor à Universidade Federal de Lavras/UFLA.
Engenheiro Agrônomo, Pós- Graduação em Fitotecnia/UFLA Caixa Postal 3037 37.200-000 Lavras, MG.
3
Engenheiro Agrônomo Dr., Professor Departamento de Agricultura/UFLA [email protected]
4
Biólogo, Laboratorista Laboratório Cultura de Tecidos Vegetais DAG/ UFLA.
5
Biólogo, Bolsista FAPEMIG/ UFLA.
2
RESUMO
Objetivou-se testar diferentes concentrações KNO3 e
NH4NO3 adicionadas ao meio Knudson (KC), na multiplicação
in vitro de orquídea. Plântulas oriundas de sementes germinadas
in vitro, com aproximadamente 1,5 ± 0,5 cm de comprimento,
foram inoculadas em frascos com capacidade para 250 cm3
contendo 50 mL de meio de cultura. Os tratamentos consistiram
de diferentes concentrações KNO3 e NH4NO3 (0, 25, 50, 75 e
100 % da formulação 330 mg L-1 de NH4NO3 e 380 mg L-1 de
KNO3) adicionadas ao meio de cultura Knudson e diferentes
espécies de orquídea (Cattleya nobilior x Cattleya nobilior;
Cattleya leopoldii; Laelia purpurata Cárnea e Laelia crispa). O
meio foi acrescido de 0,1 mg L-1 de ANA, 3 mg L-1 de GA3, 25 g
L-1 de sacarose, 2 g L-1 de carvão ativado, solidificado com 6 g L1
de ágar e pH ajustado para 5,8 ± 0,1, antes da autoclavagem a
121ºC e 1 atm por 20 minutos. Posteriormente à inoculação, os
explantes foram transferidos para a sala de crescimento a 25 ±
2ºC, fotoperíodo de 16 horas e 32 µmol m-2 s-1 de irradiância. O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente
casualizado, com 5 repetições de 10 plântulas cada. Após 90
dias, observou-se que melhores resultados para proliferação de
brotos e raízes são obtidos com o meio KC acrescido de 50 % da
formulação de KNO3 e NH4NO3, para as espécies C. nobilor x C.
nobilor e C. leopoldii, exceto para o comprimento de plântulas e
massa fresca, as quais se mostraram melhor em meio KC acrescido
de 100 % da formulação de KNO3 e NH4NO3. Para as espécies L.
purpurata Cárnea e L. crispa, a adição de de KNO3 e NH4NO3
ao meio KC não influenciou o seu crescimento.
Termos para indexação: Cattleya nobilior x Cattleya nobilior,
Cattleya leopoldii, Laelia purpurata Cárnea , Laelia crispa, nitrato.
ABSTRACT
The objective of this work was to test different
concentrations of KNO3 and NH4NO3 on Knudson medium (KC),
during in vitro multiplication of orchids. Plantlets obtained from
seeds germinated in vitro, with approximately 1.5 ± 0.5 cm of
length, were inoculated in flasks with 250 cm3 capacity containing
50 mL of culture medium. The treatments consisted of different
concentrations of KNO3 and NH4NO3 (0, 25, 50, 75 and 100%
of the formulation 330 mg L-1 NH4NO3 and 380 mg L-1 KNO3)
and different species of orchid (Cattleya nobilior x Cattleya
nobilior; Cattleya leopoldii; Laelia purpurata Cárnea and Laelia
crispa).The medium was supplemented with of 0.1 mg L-1 NAA,
3 mg L-1 GA3, 25 g L-1 sucrose, 2 g L-1 activated charcoal, solidified
with 6g L-1 agar and pH adjusted to 5.8 ± 0,1, before the autoclavage
at 121ºC and 1 atm for 20 minutes. After inoculation, the explants
were transferred to a growth room at 25ºC ± 2ºC, with a 16 hour
photoperiod and 32 µ M m-2 s-1 irradiation. The experimental
design used was entirely randomized, with 5 replications of 10
plantlets each. After 90 days, higher shoot and root proliferation
were observed using KC medium supplemented with 50% of the
KNO3 and NH4NO3 formulation, for the species C. nobilor x C.
nobilor and C. leopoldii, except for the plantlet length and matter
fresh, which were higher in KC medium supplemented with 100%
of the formulation of KNO3 and NH4NO3. For the species L.
purpurata Cárnea and L. crispa, the addition of KNO3 and
NH4NO3 to KC medium had no influence on their growth.
Index terms: Cattleya nobilior x Cattleya nobilior, Cattleya
leopoldii, Laelia purpurata Cárnea , Laelia crispa, nitrate.
INTRODUÇÃO
A família Orchidaceae é considerada a mais
numerosa de todo o reino vegetal, com mais de 800 gêneros,
35.000 espécies e uma infinidade de híbridos (SCHULTES
& PEASE, 1963; SHEEHAN, 1983). Em razão do elevado
número de espécies e híbridos, é possibilitada a ocorrência
de grande variabilidade de formas, tamanhos e cores de
folhas e flores, o que torna essas plantas importantes
economicamente e faz com que sejam produzidas em todo
o mundo (SINGH, 1992).
(Recebido em 05 de abril de 2004 e aprovado em 21 de junho de 2004)
32
ARAUJO, A. G. de et al.
Alguns gêneros com elevado valor econômico
como Cattleya, Laelia, Miltonia e Oncidium são nativos
do Brasil (SILVA, 1986) e são apreciados nos mercados
brasileiro e internacional, evidenciando a potencialidade
do país no cultivo de orquídeas.
Sua propagação pode ocorrer tanto
vegetativamente quanto por meio de sementes, as quais,
embora produzidas em grande quantidade, não possuem
endosperma funcional, sendo incapazes de germinar na
natureza. Dessa forma, torna-se necessária a associação
simbiótica da orquídea com fungos micorrízicos
(SAVINA, 1974; SHEEHAN, 1983).
A hibridação natural entre gêneros e/ou espécies
é freqüentemente baixa e, similarmente ao que ocorre com
a propagação sexuada, uma baixa taxa de multiplicação é
obtida mediante métodos convencionais como divisão
de bulbos, brotações e keikis (estruturas de
propagação), não atendendo às necessidades comerciais.
Assim, a propagação vegetativa de orquídeas é um
processo muito lento exigindo, às vezes, dez anos para
se obter um novo clone (PIERIK, 1987).
Nesse contexto, a cultura de tecidos é uma
metodologia que proporciona a produção de plantas
uniformes e sadias, velocidade superior de crescimento
em relação aos métodos convencionais de propagação,
maior produção em menor tempo e espaço físico e, ainda, a
obtenção de plantas livres de vírus e outros patógenos
(CRÓCOMO, 1986).
Knudson (1922) desenvolveu um método de cultura
não simbiótico mostrando que as sementes podem germinar
em meio de cultura contendo apenas sacarose.
Posteriormente, em 1946, o mesmo autor aperfeiçoou esse
meio de cultura sendo, atualmente, o mais utilizado
comercialmente na germinação e desenvolvimento de
orquídeas (ARDITTI & ERNST, 1992). Entretanto, não há
uma formulação padrão, para o meio Knudson, que
possibilite maior sucesso na micropropagação de todas as
espécies ou variedades.
Os meios de cultura geralmente são compostos de
uma fonte de carboidratos, macro e micronutrientes e outras
substâncias orgânicas. Embora o meio de cultura Knudson
seja o mais comumente utilizado para a propagação de
orquídeas, torna-se necessário determinar a concentração
ótima de nutrientes para cada variedade.
O nitrogênio é um dos principais elementos
essenciais e ativos, sendo absorvido, principalmente,
na forma de nitrato (NO3-) e amônio (NH4+). Por ser
constituinte de várias biomoléculas essenciais como:
aminoácidos, ácidos nucléicos, proteínas, enzimas e
outros, sua absorção se dá em diversos processos
metabólicos da planta. (MAGALHÃES & WILCOX,
1987; SAKUTA, 1987).
O efeito dessas diferentes formas inorgânicas sobre
o crescimento e desenvolvimento em cultura de tecidos é
marcante: o nitrato, como única fonte de nitrogênio,
sustenta uma boa taxa de crescimento em muitas espécies,
sendo, também, a melhor forma de nitrogênio para algumas
culturas, tais como cenoura, roseira e várias outras
espécies. No entanto, há espécies que não crescem bem
com nitrato no meio, por exemplo, calos de arroz, o que
significa que esse tecido é incapaz de utilizar o nitrato
(CALDAS et al., 1998).
A maior dificuldade no processo de micropropagação
de orquídeas está relacionada ao tempo necessário para a
produção de mudas a partir de espécies híbridas
selecionadas e a utilização de meio de cultura adequado
para cada espécie. Assim, objetivou-se testar diferentes
fontes de nitrogênio adicionadas ao meio de cultura
Knudson
Knudson C
C no desenvolvimento in vitro de plântulas de
orquídea de quatro espécies Cattleya nobilior x Cattleya
nobilior , Cattleya leopoldii Lem., Laelia purpurata Lindl
& Paxton Cárnea e Laelia crispa Rchb. f..
MATERIAL E MÉTODOS
Plântulas oriundas de sementes germinadas in
vitro, com aproximadamente 1,5 ± 0,5 cm de comprimento,
foram inoculadas em frascos com capacidade para 250 cm3
contendo 50 mL de meio de cultura. Os tratamentos
Concentração de KNO3 e NH4NO3 no crescimento in vitro...
-1
(0, 25, 50, 75 e 100 % da formulação 330 mg L de NH4NO3
e 380 mg L-1 de KNO3) adicionadas ao meio de cultura
Knudson (1946) e diferentes espécies nativas de orquídea
(Cattleya nobilior x Cattleya nobilior, Cattleya leopoldii,
Laelia purpurata Cárnea e Laelia crispa). O meio foi
acrescido de 0,1 mg L-1 de ANA, 3 mg L-1 de GA3, 25 g L-1 de
sacarose, 2 g L-1 de carvão ativado, solidificado com 6 g L-1
de ágar e pH ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da autoclavagem
a 121ºC e 1 atm, por 20 minutos.
Posteriormente à inoculação, os explantes foram
transferidos para a sala de crescimento a 25 ±2ºC,
fotoperíodo de 16 horas e 32 µmol m-2 s-1 de irradiância.
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4x5, com 5
repetições de 10 plântulas cada, sendo os dados comparados
por
2000).
por meio
meiodo
doprograma
programaSisvar
Sisvar(FERREIRA,
(FERREIRA,
2000).
O experimento foi avaliado após 90 dias da instalação,
considerando-se: número de folhas, número de raízes, número
de brotos, comprimento da parte aérea e massa fresca de plântulas.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Número de folhas: De acordo com a análise de
variância, não houve interação entre os fatores estudados.
Houve significância apenas para o fator espécie.
Analisando-se a Tabela 1, verificou-se que a espécie
C. nobilior x C. nobilior obteve o maior número de folhas
(12,59). As espécies C. Leopoldii e L. crispa obtiveram
resultados intermediários, ao passo que a espécie L.
purpurata Cárnea obteve média inferior às demais (6,56).
Esse comportamento está de acordo com
Suttleworth et al. (1994), que afirmam que as Cattleyas
apresentam um desenvolvimento bem maior que as Laelias.
de amônio utilizada no meio MS; o número de folhas foi de
7,00, na presença de BAP. Na ausência de BAP, as diferentes
concentrações de nitrato de amônio não foram significativas,
apresentando em média 6,08 folhas.
Número de brotos: Para a variável número de brotos
em plântulas de orquídea, verifica-se que houve interação entre
as concentrações de KNO3 e NH4NO3 e as espécies Cattleya
nobilior x Cattleya nobilior e Cattleya leopoldii (Figura 1).
TABELA 1 Número médio de folhas em plântulas de
orquídea de diferentes espécies cultivadas sob diferentes
concentrações de KNO3 e NH4NO3 em meio de cultura
Knudson (KC). UFLA, Lavras MG, 2003.
Espécies
Número
médio
de
folhas
C. nobilior x C. nobilior
12,59 a
C. leopoldii
11,14 b
L. crispa
10,37 b
L. purpurata Cárnea
6,56 c
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si,
estatisticamente, pelo teste de Scott-Knott em nível de
5% de probabilidade.
Número de brotos
consistiram de diferentes concentrações KNO3 e NH4NO3
33
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
25
50
75
100
KNO3 e NH4NO3 (%)
C. nobilior
C. leopoldii
Sato et al. (2001), estudando a influência da
concentração de nitrato de amônio com e sem BAP na
Y
Y
= 2,0086 + 0,0356 x - 0,0003 x2
= 1,54 + 0,0178 x - 0,0002 x2
C. leopoldii
C. nobilior
R2 = 0,85
R2 = 0,76
micropropagação da mandioca (Manihot esculenat Crantz.),
verificou que o número de folhas cresceu com o aumento da
concentração de NH4NO3, e na concentração de 41,20 mM L-1
de NH4+, que equivale ao dobro da concentração de nitrato
FIGURA 01 Efeito de concentrações de KNO3 e NH4NO3
em meio de cultura Knudson (KC) no número de brotos
em plântulas de orquídeas C. nobilior x C. nobilior e C.
leopoldii. UFLA, Lavras-MG, 2003.
quais, pelo teste F, somente a espécie Cattleya nobilior x
Cattleya nobilior apresentou significância (Figura 3).
Maior número de raízes (7,48) foi verificado com 50% da
concentração de KNO3 e NH4NO3.
A adição de KNO3 e NH4NO3 ao meio Knudson C
favoreceu o aumento no número de raízes, provavelmente,
porque o meio Knudson é considerado um meio pobre em
sais e apresenta como fontes de nitrogênio, o nitrato de
cálcio e o sulfato de amônio em quantidades inferiores aos
meios MS e WPM.
5
Comprimento da
daparte
parte
Comprimento
aérea (cm)
(cm)
aérea
Nas duas espécies, o maior número de brotos (3,06 e
1,95, respectivamente), foram observados nas concentrações
de 59,33 e 44,5% de KNO3 e NH4NO3, respectivamente. Essa
redução pode ter sido causada por toxidez na medida em que
se acrescentou o nitrato de potássio e o nitrato de amônio.
Pode-se observar que dentro do mesmo genêro têmse comportamentos distintos. Provavelmente a Cattleya
leopoldii requer um meio de cultura mais rico em sais minerais
para se desenvolver melhor.
Poddar et al. (1997) estudaram altas concentrações
de nitrato de amônio, como substituto ao ácido naftaleno
acético (ANA) em Eleusine coracana (L.) Gaertn. e
observaram que concentrações de duas a seis vezes
maiores que a utilizada no meio MS, podem favorecer a
regeneração de brotos na ausência do regulador de
crescimento. Já em altas concentrações de nitrato de
amônio e do ANA, o meio de cultura tornou-se tóxico
para a espécie estudada.
De acordo com o mesmo autor, o nitrato pode
funcionar como um regulador de crescimento, estimulando
brotações. Dessa forma, nas espécies de orquídea Cattleya
nobilior x Cattleya nobilior e Cattleya leopoldii, o nitrato
estimulou crescimento até um certo ponto (59,33 e 44,5 %,
respectivamente), tornando-se tóxico a partir desse ponto,
com o aumento das concentrações.
Comprimento da parte aérea: Verificou-se que
houve interação entre espécie e concentrações de KNO3 e
NH4NO3. Entretanto, por meio do teste F apenas a espécie
C. leopoldii apresentou resultado significativo.
Incrementos nas concentrações de KNO 3 e
NH4NO3, adicionadas ao meio Knudson C, proporcionaram
aumento no comprimento das plântulas de Cattleya
leopoldii de forma linear (Figura 2). Dessa forma, maior
comprimento de plântulas (3,8 cm) foi observado com 100%
de KNO3 e NH4NO3. Quando se utilizaram 50% de KNO3 e
NH4NO3 observaram-se plântulas com 3,4 cm e na ausência
de sais obtiveram-se plântulas com 3,1 cm.
Número de raízes: Houve interação entre
concentrações de KNO3 e NH4NO3 e espécies, dentre os
4
3
2
1
0
0
25
50
75
100
KNO
e eNH
NO 3 (%)
3
4 NO
KNO
NH
3
4
3 (%)
Y
C. leopoldii
= 3,078 + 0,007 x
R2 = 0,69
FIGURA 2 Comprimento da parte aérea em plântulas de
C .leopoldii cultivadas em diferentes concentrações de
KNO3 e NH4NO3 em meio de cultura Knudson (KC). UFLA,
Lavras - MG, 2003.
Número
Númerode
deraízes
raízes
34
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
25
50
75
100
KNO
(%)
KNO3 3eeNH
NH4NO
4NO33 (%)
Y
C. nobilior
= 3,6794 + 0,1116 x - 0,0009 x2
R2 = 0,90
em meio de cultura Knudson (KC) no número de raízes de
plântulas de Cattleya nobilior x Cattleya nobilior. UFLA,
Lavras - MG, 2003.
Sato et al. (2001), observou que nos tratamentos
com BAP, não houve formação de raízes,
independentemente da concentração do nitrato de amônio
utilizada; em estudos com mandioca, apenas houve indução
de pequenas brotações. Na ausência do regulador, pôdese observar uma tendência de aumento na massa seca das
raízes, em razão das concentrações crescentes de amônio,
ou seja, maior incremento de biomassa radicular.
Massa fresca de plântulas: De acordo com o resumo
da análise de variância observa-se que a interação entre
os fatores espécie e concentração de KNO3 e NH4NO3 foi
significativa. Pode-se notar que houve significância pelo
teste F entre concentrações de KNO3 e NH4NO3 e a espécie
Cattleya nobilior x Cattleya nobilior (Figura 4). O
incremento das concentrações de KNO 3 e NH 4NO 3
adicionadas ao meio Knudson C, promoveram aumento na
massa fresca das plântulas de forma linear, obtendo-se
maior massa fresca de plântulas (0,551 g) com a utilização
de 100% de KNO3 e NH4NO3.
Silva et al. (2001), estudando fontes de nitrogênio
no desenvolvimento in vitro do porta-enxerto Trifoliata ,
concluíram que melhores resultados são obtidos com 75%
da fonte KNO3 associada com altas concentrações de
NH4NO3 para altura e massa das brotações dos explantes.
Segundo Sakuta (1987), altas concentrações de
amônio (NH4+) e nitrato (NO3-) podem ser críticas no
processo de morfogênese e crescimento dos explantes.
Provavelmente, esses resultados podem estar relacionados
com a própria função metabólica do nitrogênio como
constituinte de aminoácidos, enzimas e proteínas.
O nitrogênio suplementado ao meio de cultura,
tanto na forma de nitrato de amônio como na forma de
nitrato de potássio, são citados como benéficos nos
processos de desenvolvimento dos explantes
(GAMBORG, 1984).
De acordo com George & Sherrington (1984), o
desenvolvimento e morfogênese em cultura de tecidos são
acentuadamente influenciados pela disponibilidade de
nitrogênio e pela forma como ele é fornecido.
Massa
Massa Fresca
Fresca de
de plântulas
plântulas
(g)
(g)
Concentração de KNO3 e NH4NO3 no crescimento in vitro...
35
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
25
50
75
100
KNO
KNO33eeNH
NH44NO
NO33 (%)
Y
C. nobilior
= 0,4161 + 0,0015 x
R2 = 0,81
em meio de cultura Knudson (KC) na massa fresca em
plântulas de Cattleya nobilior x Cattleya nobilior. UFLA,
Lavras - MG, 2003.
CONCLUSÕES
Melhores resultados para a proliferação in vitro de
brotos e raízes de C. nobilior x C. nobilior e C. leopoldii
são obtidos com o meio Knudson (KC) acrescido de 50 %
da formulação de KNO3 (190 mg L-1) e NH4NO3 (165 mg L-1);
já para o comprimento e massa fresca de plântulas, melhor
o acréscimo de 100 % da formulação de KNO3 (380 mg L-1)
e NH4NO3 (330 mg L-1) em meio KC. Para as espécies L.
purpurata Cárnea e L. crispa, a adição de de KNO3 e
NH4NO3 ao meio KC não influenciou o seu crescimento.
ARDITTI, J.; ERNST, R. Micropropagation of orchids. New
York: J. Wiley, 1992. 682 p.
CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E.
Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.;
BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformações
genéticas de plantas. Brasília: EMBRAPA/CNPH, 1998.
p. 87-132.
CRÓCOMO, O. J. Plant biotechnology in the
agriculture and development in Brazil. In: SIMPÓSIO
ANUAL DA ACADEMIA DE CIÊNCIA DE SÃO
PAULO, 11., 1986, São Paulo, SP. Anais... São Paulo:
[s.n.], 1986. p. 53-71.
36
FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar
para Windows versão 4.0. In: REUNIÃO ANUAL DA
REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE
INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, São Carlos.
Anais... São Carlos: UFSCar, 2000. p. 255-258.
GAMBORG, O. L. Plant cell cultures: nutrition and media.
In: VASIL, I. K. (Ed.). Cell culture genetics of plants.
Orlando: Academic, 1984. v. 1, p. 18-26.
GEORGE, E. F.; SHERRINGTON, P. D. Plant propagation
by tissue culture: handbook and directory of commercial
laboratories. Eversley: Exegetics, 1984. 593 p.
KNUDSON, L. Nonsymbiotic germination of orchid seeds.
Botanical Gazette, Chicago, v. 73, p. 1-25, 1922.
KNUDSON, L. A new nutrient solution for the germination
of orchid seed. American Orchid Society Bulletim, West
Palm Beach, v. 14, p. 214- 217, 1946.
MAGALHÃES, J. R.; WILCOX, G. E. Interação entre formas
de nitrogênio e reguladores de crescimento. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 6, n. 22, p. 576-585,
1987.
PIERIK, R. L. M. In vitro culture of higher plants. Boston:
Martinus Nijhoff, 1987. 344 p.
PODDAR, K.; VISHNOI, R. K.; KOTHARI, S. L. Plant
regeneration from embryogenic callus of finger millet
Eleusine coracana (L.) Gaertn. on higher concentrations
of NH4N03 as a replacement of NAA in the medium. Plant
Science, Clare, v. 129, p. 101-106, Oct. 1997.
SAKUTA, M. Effects of sucrose source on betacyanin
acculation and growth in suspension cultures of
Phytolacea americana. Physiology Plantarum,
Copenhagen, v. 71, p. 459-463, 1987.
SATO, A. Y.; MARIA, J.; SEDIYAMA, T.; BORÉM, A.;
CECON, P. R.; JUNQUEIRA, C. S. Micropropagação da
mandioca: influência da concentração de amônio com e sem
BAP. Revista Ceres, Viçosa, v. 48, n. 278. p. 405-413, 2001.
SAVINA, G. I. Fertilization in orchids. In: LINSKENS, H. F.
(Ed.). Fertilization in higher plants. New York: American
Elsevier, 1974. p. 197-204.
SCHULTES, R. E.; PEASE, A. S. Generic names of orchids,
their origin and meaning. New York: Academic, 1963. 331 p.
SHEEHAN, T. J. Recent advances in botany propagation
and physiology of orchids. Horticultural Reviews, New
York, v. 5, p. 279-315, 1983.
SILVA, A. B.; PIO, R.; RAMOS, J. D.; MENDONÇA, W.;
PASQUAL, M.; CALEGARI, M. Influência das fontes de
nitrogênio NH4NO3 e KNO3 no desenvolvimento in vitro
do porta-enxerto Trifoliata . Revista Científica Rural,
Bagé, v. 6, n. 2, p. 147-152, 2001.
SILVA, W. O cultivo de orquídeas no Brasil. São Paulo:
Nobel, 1986. 96 p.
SINGH, F. Micropropagation of orchids Spathogloottis
plicata and Epidendrum radicans. In: BAJAJ, Y. P. S.
Biotechnology in agriculture and forestry: high-tech and
micropropagation. London: Springer-Verlag, 1992. p. 223-245.
SUTTLEWORTH, F. S.; ZIM, H. S.; DILLON, G. W.
Orquídeas. In: HUBER, G.; SOUZA, F. B. (Eds.). Guia dos
orquidófilos. Tradução de Joaquim Gonzalez de Lema Filho.
5. ed. Rio de Janeiro: Expressão e Cultura, 1994. 158 p.
REGULATION
OF
SOMATIC
IN
Regulation of
somatic
embryogenesis EMBRYOGENESIS
in Feijoa sellowiana...
Feijoa sellowiana Berg. AND THE TECHNOLOGY
OF SYNTHETIC SEEDS
37
REGULAÇÃO DE EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM Feijoa sellowiana Berg.
E TECNOLOGIA DE SEMENTES SINTÉTICAS
LIRIO LUIZ DAL VESCO1, ANTÔNIO CARLOS TORRES2, RUBENS ONOFRE NODARI3,
MIGUEL PEDRO GUERRA3
1
Engenheiro Agrônomo, MSc Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal (LFDGV) FIT/CCA/UFSC
Caixa Postal 476 88034-001 Itacorubi, Florianópolis, SC Brazil.
2
PhD, Embrapa Hortaliças P.O Box 218 Brasília, DF 70359-970 Brazil.
3
Professor Departamento de Fitotecnia-CCA/UFSC Caixa Postal 476 88034-001 Florianópolis,SC Brazil [email protected]
ABSTRACT
The objective of the present work was to elucidate some
control points of somatic embryogenesis regulation and production
of synthetic seeds of Feijoa sellowiana Berg., a native Myrtaceae
from south of Brazil. For this purpose it was studied three basal
salt formulations supplemented with 2.4-D, the developmental
stages of explants, the effect of pre-exposure of seeds at low
temperature, the histogenesis of embryogenic cultures, the factors
affecting the conversion of somatic embryos to plants as well as
improvements in the technology of synthetic seeds. The LPm
basal salt formulation enhanced the embryogenic induction rates.
High percentages of embryogenic induction were observed in
explants excised from mature seeds. Pre-exposure of seeds for 12
months to 4°C increase the percentage of embryogenic induction
and somatic embryo production. The basal LPm medium
supplemented with BAP (0.5 µ M) plus GA3 (0.1 µ M) enhanced
the conversion of somatic embryos to plantlets. Synthetic seeds
with reconstituted artificial endosperm composed of ½LPm salts,
Morel vitamins, CH (500 mg/l), Kin (0.5 µ M), and GA 3
(0.05 µM) and further immersed in KNO3 (200 mM) showed the
highest percentages of capsule self-breaking and conversion to
plantlets. Histological studies showed a direct and asynchronous
origin of the somatic embryos after two weeks in culture.
Index terms: Salt formulation, histology, somatic
embryogenesis, synthetic seeds, Feijoa sellowiana.
básico LPm aumentou a porcentagem de indução da embriogênese
somática. Altas porcentagens de indução embriogênica foram
observadas em explantes excisados de sementes maduras. Préexposição das sementes por 12 meses a 4°C, aumentou a
porcentagem de culturas embriogênicas e a produção de embriões
somáticos. O meio básico LPm suplementado com BAP
(0,5 µ M) mais GA3 (0,1 µ M) aumentou a conversão de embriões
em plantas. Sementes sintéticas com endosperma artificial
composto por ½ dos sais LPm, vitaminas de Morel, CH (500
mg/l), kin (0,5µ M) e GA3 (0,05 µ M) e adicional imersão em
KNO3 (200 mM) resultaram em alta porcentagem de ruptura das
cápsulas e conversão em plantas. Em estudos histológicos, foi
revelada a origem direta e não sincronizada dos embriões somáticos
após duas semanas em cultura.
Termos para indexação: formulação salina, histologia,
embriogênese somática, sementes sintéticas, Feijoa sellowiana.
INTRODUCTION
Feijoa sellowiana Berg (Myrtaceae) is a native fruit
species of southern part of Brazil and northern Uruguay.
Recently, Brazil started the domestication of this species.
Initial results revealed expressive variability for many
morphological features of the plant mainly those related to
RESUMO
No presente trabalho buscou-se elucidar pontos de
controle da regulação da embriogênese somática e a produção de
sementes sintéticas em Feijoa sellowiana Berg., uma mirtácea
nativa do Sul do Brasil. Foram avaliadas três formulações salinas
suplementadas com 2,4-D, diferentes estádios de desenvolvimento
do explante, o efeito da manutenção de explante em baixa
temperatura, a histologia das culturas embriogênicas e os fatores
que afetam a conversão de embriões somáticos, bem como o
melhoramento da tecnologia de sementes sintéticas. O meio salino
the size and fruit shape (NODARI et al., 1997).
One of the limiting factors in the breeding program
F. sellowiana is the difficulty of this species to respond to
the conventional methods of vegetative propagation.
Assexual methods of propagation may be necessary to
the fixation and capture of genetic gains. Among
micropropagation approaches somatic embryogenesis has
(Recebido em 11 de agosto de 2003 e aprovado em 26 de junho de 2004)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v.1, n. 1, p. 37-46, 2005
38
DAL VESCO, L. L. et al.
been promising and the easiness and repeatability of
inducing and controlling this morphogenetic route in vitro
makes this species a model system for the somatic
embryogenesis of woody plants (GUERRA et al., 2001).
Structural studies of F. sellowiana somatic
embryogenesis were performed by Canhoto et al. (1996) and
Canhoto & Cruz (1996). The effect of different sources and
levels of nitrogen in the induction and development of
somatic embryos was studied by Dal Vesco & Guerra (2001),
and the differentiated response of genotypes and auxins
shocks, together with the obtention of synthetic seeds were
all subjects studied beforehand (GUERRA et al., 2001).
In this report we evaulated the inductive capacity
and the process of developing somatic embryogenesis
of F. sellowiana zygote embryos collected in different
developmental stages in response to different salt
formulation. Also, it was studied the effect of low
temperature in the inductive response along with the
effect of different cytokinins and GA3 in the conversion
of somatic embryos. Finally the use of artificial
endosperm and KNO3 were evaluated associated to the
technology of synthetic seeds.
MATERIAL AND METHODS
The zygotic embryos of accession 101 were excised
from 11 to 15, and 17 to 19 weeks after anthesis from
immature and mature fruits, respectively. The desinfestation
procedure, inoculation and culture conditions were the
same as described by Dal Vesco & Guerra (2001). The basal
medium was supplemented with Gln L-glutamine (4 mM),
Morel s vitamins (MOREL & WETMORE, 1951), sucrose
(30 g/l), Phytagel ® (2 g/l).
Salt formulation: Immatures zygotic embryos were
inoculated on three salt formulations - MS (MURASHIGE
& SKOOG, 1962), LPm (ARNOLD & ERIKSSON, 1981) and
WPM (LLOYD & MCCOWN, 1980) were employed in
combination with two levels of 2,4-D - 2,4dichlorophenoxyacetic acid (10 and 20 µ M). The experiment
was arranged as randomized complete block design in a
factorial 3x2, with six treatments. Each experimental unit
consisted of 10 explants with four replicates.
Effect of developmental stage: Zygotic embryos
excised from fruits at 11; 13; 15; 17 and 19 weeks after
anthesis were inoculated on LPm culture medium
supplemented with 20 µ M of 2,4-D. The experiment design
was randomized complete block with five treatments. Each
experimental unit consisted of 20 explants with four
replicates.
Effect of low temperature storage of explants:
Zygotic embryos excised from mature fruits were stored
at 4°C for periods of 0; 4; 8; 12; 16 and 20 weeks following
inoculation on LPm culture medium supplemented with
20µ M 2,4-D. The experiment was arranged as a
randomized complete block design with six treatments.
Each experimental unit consisted of 20 explants with
four replicates.
Conversion: Somatic embryos at early to late
torpedo stage of development were inoculated on basal
LPm medium. It was evaluated different types and levels
of cytokinins associated to GA 3 in two assays. The
cultures were illuminated 16 h per day with 40 µ mol.m-2.s-1 of
light at 27 ± 2º C. The two experiments were arranged as
a randomized complete block design in a factorial 3x2.
Each experimental unit consisted of 50 explants with
three replicates.
In the first assay it was evaluated the effect of
six treatments BAP 6-benzylaminopurine (0 and
0.5 µ M), Kin (0.5µ M), 2-iP N6-(2-isopentyl) adenine
(0.5µ M) combined with GA 3 gibberellic acid (0 and
0.1µ M). In the second assay three levels of BAP (0.25;
0.5 and 1.0µ M) combined with two levels of GA3, (0.1
and 0.5µ M) were tested.
Synthetic seeds: Somatic embryos pre-germinated
in basal LPm medium supplemented with BAP and GA3
were encapsulated in a solution of sodium alginate 1%
(Carlo Erba® ) complexed (droplet hardening) with CaCl2
(100 mM). To this solution it was added different nutrient
supplement in order to reconstitute an artificial endosperm.
Regulation of somatic embryogenesis in Feijoa sellowiana...
The synthetic seed was stored at 4ºC for two weeks.
The experiment was arranged in a complety
randomized block design, in a factorial 4x2. Four artificial
endosperm: AE1= GA3 (0.05 µ M) + Kin Kinetin (0.5µ M);
AE2= GA3 (0.05µ M) + Kin (0.5µ M) + CH - Casein
Hydrolisate (500 mg/l); AE3= ½ LP salts + GA3 (0.05 µ M) +
Kin (0.5µ M) + CH (500 mg/l) + Morel vitamins; AE4= ½
LPm salts + CH (500 mg/l) + Morel vitamins, combined or
not with 200 mM KNO3 during 30 min. Each experimental
unit consisted of 10 capsules with five replicates.
Histology: Selected samples were fixed in
glutaraldehyde (2,5%) and phosphate buffers 0.1 M (pH
6.8), embedded in paraffin and sectionated 8-10 microns
thick. The sections were stained with safranin and fast
green (JOHANSEN, 1940).
Statistical analysis: When necessary original data
were transformed to arcsin (x+0.5)0.5 or (x+0.5)0.5 and
submitted to analysis of variance and mean separation
was tested using SNK Student-Newman-Kuels; at the
0.05 level, using Statgraphicsâ version 7.0 software. Some
39
data were submitted to the regression analysis according
to Compton (1994).
RESULTS AND DISCUSSION
The combination of 2,4-D with the three salt
formulations resulted in high frequency of somatic
embryogenesis (Table 1). After five weeks in culture more
than 95% of induced somatic embryos were in globular,
heart, and initial torpedo stages of development (Fig. 1astages g, h, and t). However high percent of somatic
embryo induction was obtained between eight and ten
weeks in culture when more than 90% of the embryos
reached cotyledonar and early cotyledonar stages of
development (Fig. 1a-stages pct and ct).Apparently,
somatic embryogenesis observed in the present work
followed a pattern of development similar to the zygotic
embryogenesis in vivo for dicots (MERKLE et al., 1995) or
the basic stages of embryo development in angiosperms
species (ARNOLD et al., 2002).
TABLE 1 Effect of different salt formulations and 2,4-D levels in the number and percentage of viable of somatic
embryos (SE) per immature zygotic embryos explant over time in culture (weeks). Mean of four replicates.
40
FIGURE 1 (a) Somatic embryos of Feijoa sellowiana in different developmental stages: globular (g); heart (h); early
torpedo (et): torpedo (t); pre-cotyledonary (pct) and cotyledonary-stage (ct) (bar 1.1mm); (b) induction of embryogenic
cultures from the cotyledonary region of the zygotic embryo (arrow; bar 1.8mm); (c) direct initiation of proembryogenic
cell clumps on the cotyledonary adaxial surface after two weeks in culture (bar: 100mm); (d, e) globular stage somatic
embryo after four weeks in culture. Note asymmetrical periclinal (pr) and anticlinal (an) cell divisions (arrow; Bar:
50mm); (f) heart stage somatic embryos after 5 weeks in culture (bar 100mm); (g) Asynchronous development of
somatic embryos after 10 weeks in culture (bar 100mm); Conversion of somatic embryos to plantlets: (h) radicle
emission after one weeks on germination culture medium (bar 2.6mm) and; (i) open cotyledons after two weeks in
culture (bar 1.8mm); (j) self-breaking of synthetic seed with KNO3 treatment (bar 1.3mm) and; (k) Aspect of synthetic
seed showing the emission of radicle outside of the capsule in the H2O treatment (arrow; bar 2.6mm). (l) Plantlets
growing in soil after 10 weeks in nebulization chamber (bar 3.1cm).
The induction and development of somatic
embryos of F. sellowiana were enhanced when mature
zygotic embryos were used (DAL VESCO & GUERRA,
2001; GUERRA et al., 2001). However, high frequencies of
embryogenic cultures were observed with the use of
immature zygotic embryos in Larix leptolepsis Hort. ex
Endl. (KIM et al., 1999), Araucaria angustifolia (Bertol.)
Kuntze. (GUERRA et al., 2000) and Cocos nucifera L.
(FERNANDO & GAMAGE, 2000).
Pre-treatment of seeds: Beneficial effects were
obtained by pre-incubating the seeds at 4°C for 12 months
(Fig. 3). Longer exposures of explants, up to 20 months, to
the low temperature significantly reduced the number of
somatic embryos produced from the explant (21.6).
Muralidharan & Mascarenhas (1995) also induced the
formation of somatic embryos starting with mature seeds
of E. citriodora Hook stored at 4°C for 2 years.
100
Pe rce ntage
Numbe
of SE
Percentage
andand
Number
ofrSE
The salt LPm formulation resulted in the highest
number of somatic embryos per explant. The values obtained
for this characteristic were statistically different (P<0.05)
when compared to those obtained with the salt formulations
WPM and MS (Table 1). An increase in somatic
embryogenesis induction using LPm salt formulation was
also observed in conifers P. glauca engelmannii (CARRIER
et al., 1997), Araucaria angustifolia (ASTARITA &
GUERRA, 2000) and in F. sellowiana (DAL VESCO &
GUERRA, 2001; GUERRA et al., 2001).
The level of 10µ M of 2,4-D resulted in statistically
higher value (P<0.05) of induced embryos as compared
to the value obtained with 20 µM, in the period of 10-20
weeks after inoculation (Table 1). The highest but not
statistically siginificant value for number of SE per
explant was obtained after 15 weeks in culture in
response to the level of 20 µ M 2,4-D. No statistical
difference was observed between the interaction of salt
formulation and 2,4-D levels.
It has been suggested that the salt constituents of
the culture medium can partly correct the unbalancement
of growth regulators used in plant tissue culture (PREECE,
1995). The use WPM salt formulation supplemented with
2,4-D resulted in the improvement of somatic embryo
production in Carica pubescens Solms. (JORDAN &
VELOZO, 1996).
Explant Developmental Stage: The percentage of
induction and the number of viable somatic embryos
increased significantly (P<0.01) in relation to the
developmental stage of zygotic embryos employed as
explants (Fig. 2). Zygotic embryos excised from fruits
collected 19 weeks after the anthesis resulted in 80.8% of
embryogenetic induction and 47.0 somatic embryos/
explant. Zygotic embryos collected from fruits starting on
the 17th week after anthesis revealed values, significantly
(p<0.05) to the percentage and the number of viable somatic
embryos. The use of mature zygotic embryos resulted in a
more precocious production of somatic embryos when
compared to immature (Fig.2).
41
% SE 10 wk
% SE 15 wk
No. SE 10 wk
No. SE 15 wk
86,2 a
90,6 a
80
80,8 a
60,8 b
60
47 a
44,2 c
40
30,8 b
31,1 ab
30,6 b
10,9 b
11
41,4 a
20,4 b
10,4 b
18,4 ab
7,5 b
9,1 b
0
44,4 a
47,5 a
36,9 c
20
78,8 a
13
15
17
19
We e ks afte r anthe s is
FIGURE 2 Effect of the time in culture (wk=weeks) in the
percentage (%) a and numberb of viable somatic embryos
(SE) per explant cultured on LPm basal medium
supplemented with 2,4-D (20 M) and Gln (4 mM). Mean
of four replicates. The regression equations are: Y(% SE 10
= -57.6 + 7.42x r2 = 0.904, p=0.015; Y(% SE 15 wk)= -45.01 +
wk)
7.25x r2 = 0.90, p=0.014; Y(No.SE 10 wk)= -58.845 + 5.635x, r2
=0.883, p=0.018; Y(No. SE 15 wk) = -226.73 + 31.98x 0.989x2 r2
=0.591, p=0.40. Values followed by different letters are
significantly different at the 5% level, using SNK test. a CV(%)
in 10 wk = 9.3 and 15 wk = 14.6 b CV(%) in 10 wk = 21.5 y and
15 wk = 27.4; y data transformed for analysis using (x + 0.5)0.5
42
% of SE
Number of SE
Percentage
and Number
of SE
Percentage
and Number
of SE
100
80.8 a
79.4 a
80 a
80 a
80
60
78.8 a
73.1 a
59.6 a
47 ab
40
49.8 a
54.2 a
39.4 b
20
21.6 c
0
0
4
8
12
16
20
Timeofofstorage
storage(month)
(month)
Time
FIGURE 3 Percentagea and numberb of viable somatic
embryos (SE) per explant cultured on LPm basal medium
supplemented with 2,4-D (20 M) and Gln (4 mM) as a
function of time of storage (month) of ZE (4ºC), after 10
weeks in culture. Mean of four replicates. The regression
equations are: Y(% SE) = 79.84 + 0.327x 0.03x2 r2 = 0.814, pvalue=0.079; Y(No.SE ) = 45.14 + 3.02x 0.21x2, r2 =0.877, pvalue =0.043. Values followed by different letters are
significantly different at the 5% level, using SNK test.
a
CV(%) in 10 wk = 8.0; b CV(%) in 10 wk = 6.6 y;
transformed for analysis using (x + 0.5)0.5
y
data
Histology: Morphological observations revealed
that the initiation of somatic embryogenesis occurred mainly
from the cotyledonary tissues of the explant (Fig 1b).
Histological and anatomical analysis showed the formation
of pro-embryogenic cell clumps arising directly from the
epidermic and subepidermic layers of the cotyledonary
tissues after two weeks in culture (Fig. 1c). The progression
to globular and heart stages occurred after three and four
weeks in culture, respectively (Fig. 1d,e,f). After 10 weeks
in culture it was observed an intense and asynchronic
production of somatic embryos (Fig. 1g).
The results here obtained in morpho-histologycal
analysis are in agreements with those described in Feijoa
(CANHOTO et al., 1996; CANHOTO & CRUZ, 1996). In
Theobroma cacao L. somatic embryos were originated from
meristematic cells from floral tissues (ALEMANNO et al., 1996).
In Lycopodiella inundata (L.) Holub. embryogenic cells arose
by anticlinal or oblique divisions (ATMANE et al., 2000).
Conversion: Effect of cytokinins and GA3 - High
percentage of somatic embryos conversion in plants
(P<0.01) were observed in response to culture medium LPm
supplemented with 0.5 µM BAP (Table 2). The addition of
0.1µ M GA3 alone or in combination with 0.5 µ M BAP also
resulted in high percent of conversion. The emission of
the radicle in somatic embryos was observed after one
week in culture (Fig. 1h) and the opening of the cotyledons
occurred in 2 weeks (Fig. 1i).
TABLE 2 Effect of BAP, Kin e 2-iP plus GA3 supplemented to the LPm basal medium in the percentage (%) conversion of
somatic embryos in plantlets, open cotyledons and emission of roots, after two weeks in culture. Mean of four replicates.
Values within columns - factor cytocinin (capital letter) and line - factor GA3 (lower case) with different letters indicating
significant differences according to the SNK test (p=0.05). In the absence of letters, there were no significant differences
among treatment means. CV (%) = Coefficient of variation
Effect of BAP and GA3: BAP (0.25µ M) resulted in
the highest percent of conversion of somatic embryos to
plants with the opening of cotyledons and emission of
roots (Table 3). The percentage of conversion and
germination decreased with increasing BAP level.
Nevertheless, the percentage of somatic embryos with
radicle emission increased (P<0.01). The addition of BAP
(0.5µ M) plus GA3 (0.1µ M) resulted in high percentage of
conversion of somatic embryos to plants.
The conversion of F. sellowiana somatic embryos
to plants occurred in MS culture medium supplemented
with GA3 and BAP (CANHOTO & CRUZ, 1996). The
conversion to plantlets was also obtained with the use of
half-strength MS medium containing NAA and BAP in
Pennisetum glaucum (LAMBÉ et al., 1999).
Synthetic seeds: Somatic embryos pre-germinated
(Fig. 1h) when encapsulated in alginate solution containing
artificial endosperm followed by stimulation for the opening
of the capsule, resulted in the production of plants.
The largest percentage of conversion (P<0.01) in
plants (51.2%) was obtained using artificial endosperm
with subsequent immersion in KNO3 (200 mM) as treatment
43
for the softening of the capsule (Table 4). The treatment
with KNO3 resulted in significant percent (P<0.01) of
capsule opening. It has been suggested that K + ion
partially substitute for Ca++ ion in the synthetic seed
(ONISHI et al., 1994), and consequently establishes the
conditions for the initial development of plants after 2
weeks in culture (Fig. 1j). In the treatment with H2O the
capsules kept their firm consistence resulting in the
emission of the somatic embryos radicle to the outside of
the capsule (Fig. 1k). In Eucaliptus sp the emission of
somatic embryos radicles. to the outer part of the capsule
was also observed even when KNO 3 was not used
(MURALIDHARAN & MASCARENHAS, 1995). The
composition of the artificial endosperm includes the salt
nutrients, carbon sources and various sources of starch
(MCKERSIE & BOWLEY, 1992).
For the commercial application of the synthetic
seed technology the germination rates should be compatible
with those obtained with natural seeds. For this it is
necessary that the synthetic seed include all the
coadjuvants necessary to nourish a plant (MCKERSIE &
BOWLEY, 1992).
TABLE 3 Effect of BAP in combination with GA3 supplemented to the LPm basal medium in the percentage (%) conversion
of somatic embryos in plantlets, open cotyledons and emission of roots, after two weeks in culture. Mean of four replicates.
Values within columns (capital letter) and line (lower case) with the same letter are not significantly different
according to the SNK test (p=0.05). In the absence of letters, there were no significant differences among treatment
means. CV (%) = Coefficient of variation
44
TABLE 4 Effect of the composition of artificial endosperm (AE) and treatment of opening capsules on the percentage
(%) of conversion of SE, after two weeks in culture room. Mean of five replicate.
Values within columns (capital letter), line and interaction among factors: Artificial endosperm x opening capsule (lower
case) with different letters indicating significant differences according to the SNK test (p=0.05). In the absence of
letters, there were no significant differences among treatment means.
1
= AE 1 = Sodium Alginate (1%) + GA3 (0.05 M) + Kin (0.5 M); AE 2 = Sodium Alginate (1%) + GA3 (0.05 M) + Kin
(0.5 M) + Casein Hydrolizate (500 mg/l); AE 3 = Sodium Alginate (1%) + GA3 (0.05 M) + Kin (0.5 M) + Casein
Hydrolisate (500 mg/l) + ½ LPm + Morel Vitamins; AE 4 = Sodium Alginate (1%) + Casein Hydrolizate (500 mg/l) + ½ LPm
+ Morel Vitamins; 2 Data transformed for analysis by arcsin (x + 0.5)0.5; CV (%) = Coefficient of variation .
In the present study the plants resulted from the
direct conversion of the somatic embryos and the germination
of the synthetic seeds were acclimatized with success in a
controlled environment. After 5 weeks the plants were
transferred to a nebulization tunnel with intermittent
irrigation being acclimatized successfully (Fig. 1 l).
CONCLUSIONS
In conclusion the results of the present work show
advances in the modulation of somatic embryogenesis and
synthetic seed technology in F. sellowiana. The advances in
the application of these techniques depend on the identification
and elucidation of control points, and some of them were
adequately addressed in this work. The in vitro morphogenetic
responses of this species are consistent with the features
required for the establishment of a model-reference to somatic
embryogenesis in woody perennials, most of them considered
recalcitrant to this morphogenic route.
REFERENCES
ALEMANNO, L.; BERTHOULY, M.; MICHAUXFERRIERE, N. A. Histology of somatic embryogenesis from
floral tissues cocoa. Plant Cell, Tissue Organ Culture,
Dordrecht, v. 46, p. 187-194, 1996.
ARNOLD, S. von; ERIKSSON, T. In vitro studies of
adventitious shoot formation in Pinus contorta. Canadian
Journal Botany, Ottawa, v. 59, p. 870-874, 1981.
ARNOLD S. von; SABALA, I.; BOZHKOV, P.; DYACHOK,
J.; FILONOVA, L. Developmental pathways of somatic
embryogenesis. Plant Cell Tissue and Organ Culture,
Rehovot, v. 69, p. 233-249, 2002.
ASTARITA, L. V.; GUERRA, M. P. Conditioning of the
culture medium by suspension cells and formation of
somatic proembryo in Araucaria angustifolia (Coniferae).
In vitro Cellular & Developmental Biology, Wallingford,
v. 36, p. 194-200, 2000.
ATMANE, N.; BLERVACQ, A. S.; MICHAUX-FERRIERE,
N.; VASSEUR, J. Histological analysis of indirect somatic
embryogenesis in the marsh clubmoss Lycopodiella
inundata (L.) Holub (Pteridophytes). Plant Science,
Shannon, v. 156, p. 159-167, 2000.
CANHOTO, J. M.; CRUZ, G. S. Histodifferentiation of
somatic embryos in cotyledons of pineapple guava (Feijoa
sellowiana Berg). Protoplasma, New York, v. 191, p. 34-45,
1996.
CANHOTO, J. M.; MESQUITA, J. F.; CRUZ, G. S.
Ultrastructural changes in cotyledons of pineapple guava
(Myrtaceae) during somatic embryogenesis. Annals of
Botany, London, v. 78, p. 513-521, 1996.
CARRIER, D. J.; CUNNIGHAM, J. E.; TAYLOR, D. C.;
DUNSTAN, D. I. Sucrose requirements and lipid utilization
during germination of interior spruce (Picea glauca
engelmannii complex) somatic embryos. Plant Cell Rep.,
[S.l.], v. 16, p. 550-554, 1997.
COMPTON, M. Statistical methods suitable for the analysis
of plant tissue culture data. Plant Cell, Tissue Organ
Culture, Dordrecht, v. 37, p. 217-242, 1994.
DAL VESCO, L. L.; GUERRA, M. P. The effectiveness of
nitrogen sources in Feijoa (Feijoa sellowiana Berg)
somatic embryogenesis. Plant Cell, Tissue Organ
Culture, Dordrecht, v. 64, p. 19-25, 2001.
FERNANDO, S. C.; GAMAGE, C. K. A. Abscisic acid
induced somatic embryogenesis in immature embryo
explants of cocunut (Cocos nucifera L.). Plant Science,
Shannon, v. 151, p. 193-198, 2000.
GUERRA, M. P.; DAL VESCO, L. L.; DUCROQUET, J. P. H.
J.; NODARI, R. O.; REIS, M. S. Somatic embryogenesis in
Feijoa sellowiana: genotype response, auxinic shock and
synthetic seeds. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal,
Londrina, v. 13, n. 2, p. 117-128, 2001.
GUERRA, M. P.; SILVEIRA, V.; SANTOS, A. L. W.;
ASTARITA, L. V.; NODARI, R. O. Somatic embryogenesis
in Araucaria angustifolia (Bert) O.Ktze. In: JAIN, S. M.;
GUPTA, P. K.; NEWTON, R. J. (Eds.). Somatic
embryogenesis in woody plants. Dordrecht: Kluwer
Academic, 2000. v. 6, p. 457-478.
45
JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. New York:
McGraw-Hill Book, 1940. 523 p.
JORDAN, M.; VELOZO, J. Improvement of somatic
embryogenesis in highland-papaya cell suspensions.
Plant Cell, Tissue Organ Culture, Dordrecht, v. 44, p.
189-194, 1996.
KIM, Y. W.; YOUN, Y.; NOH, E. R.; KIM, J. C. Somatic
embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic
embryos of Japanese larch (Larix leptolepis). Plant Cell,
Tissue Organ Culture, Dordrecht, v. 55, p. 95-101, 1999.
LAMBÉ, P.; MUTAMBEL, H. S. N.; DELTOUR, R.;
DINANT, M. Somatic embryogenesis in pearl millet
(Pennisetum glaucum): strategies to reduce genotype
limitation and to maintain long-term totipotency, Plant Cell,
Tissue Organ Culture, Dordrecht, v. 55, p. 23-29, 1999.
LLOYD, G.; MCCOWN, B. Commercially-flasible
micropropagation of mountain laurel, kalmia latifolia, by
use of shoot-tip culture. Comb. Proc. Intl. Plant Prop. Soc.,
[S.l.], v. 30, p. 421-427, 1980.
MCKERSIE, B. D.; BOWLEY, S. R. Synthetic seeds of
alfalfa. In: REDENBAUGH, K. (Ed.). Synseeds: applications
of synthetic seeds to crop improvement. Boca Raton: CRC,
1992. p. 231-255.
MERKLE, S. A.; PARROTT, W. A.; FLINN, B. S.
Morphogenic aspects of somatic embryogenesis. In:
THORPE, T. A. In vitro embryogenesis in plants.
Dordrecht: Kluwer Academic, 1995. p. 155-203.
MOREL, G. M.; WETMORE, R. H. Tissue culture of
monocotyledons. American Journal of Botany, Columbus,
v. 38, p. 138-140, 1951.
MURALIDHARAN, E. M.; MASCARENHAS, A. F.
Somatic embryogenesis in Eucalyptus. In: JAIN, S. M.;
GUPTA, P. K.; NEWTON, R. J. Somatic embryogenesis in
woody plants: angiosperm. Dordrecht: Kluwer Academic,
1995. v. 2, p. 23-40.
Physiologia Plantarum, Copenhagem, v. 15, p. 473-497,
1962.
46
NODARI, R. O.; GUERRA, M. P.; MELER, K.;
DUCROQUET, J. P. Genetic variability of Feijoa sellowiana
germplasm. Acta Horticulturae, The Hague, v. 452, p. 4146, 1997.
ONISHI, N.; SAKAMOTO, Y.; HIROSAWA, T. Synthetic
seeds as an application of mass production of somatic
embryos. Plant Cell, Tissue Organ Culture, Dordrecht,
v. 39, p. 137-145, 1994.
PREECE, J. E. Can nutrient salts partially substitute for
plant growth regulators? Plant, Tissue Culture and
Biotechnology, Rehovot, v. 1, n. 1, p. 26-37, 1995.
ORIENTAÇÃO DO Orientação
EXPLANTE,
E deMEIO
do explante,BAP
bap e meio
cultura... DE CULTURA NA 47
MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DOS PORTA-ENXERTOS DE
PRUNUS OKINAWA E MR. S 1/8
EXPLANT ORIENTATION, BAP AND CULTURE MEDIA ON THE IN VITRO
MULTIPLICATION OF THE OKINAWA AND MR. S 1/8 PRUNUS ROOTSTOCKS
ANDERSON DA COSTA CHAVES1, MÁRCIA WULFF SCHUCH2, JOSÉ CARLOS FACHINELLO3
1
Engenheiro Agrônomo, Aluno do PPGA Área de Concentração em Fruticultura de Clima Temperado FAEM/UFPel
Campus Universitário Caixa Postal 354 96.010-900 Pelotas, RS [email protected]
2
Engenheira Agrônoma, Drª, Professora Adjunto do Departamento de Fitotecnia FAEM/UFPel Pelotas, RS.
3
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular Departamento de Fitotecnia FAEM-UFPel Pelotas-RS.
RESUMO
Na multiplicação in vitro, além de se determinar qual o
melhor meio e concentração de citocinina, é necessário também
estudar alternativas a fim de melhorar os protocolos e otimizar
resultados. Neste trabalho, teve-se como objetivo avaliar a melhor
concentração de BAP (6-benzilaminopurina), meio de cultura e
orientação do explante para a multiplicação in vitro de Prunus
sp. Segmentos nodais com 1cm de comprimento dos portaenxertos Okinawa e Mr. S 1/8, que estavam sendo cultivados em
meio MS, sem reguladores de crescimento, foram inoculados nos
meios de cultura MS e WPM, contendo as concentrações de: 0,0;
0,3 ou 0,6 mg. L-1 de BAP, em duas orientações dos explantes
(horizontal e vertical), nos meios de cultura. Aos 35 dias de
cultivo, foram avaliados o número e tamanho de brotações e o
número de gemas. Observou-se que a orientação horizontal
proporcionou o maior número de brotações para a cultivar Mr. S
1/8. O maior número de gemas foi obtido na concentração de 0,6
mg. L-1 de BAP para as duas cultivares, enquanto o maior
comprimento de brotações foi observado no tratamento
testemunha.
Termos para indexação: Micropropagação, citocinina, MS,
WPM, Prunus.
ABSTRACT
During the process of in vitro multiplication, in addition
to determine the adequate culture medium and cytokinin
concentrations, it is also necessary to study alternatives in
order to improve the protocols and to optimize the results. In
this work, the objective was to determine the best concentration
of BAP (6-benzylaminopurine), culture medium and explant
orientation for the in vitro multiplication of Prunus sp. Nodal
segments with approximate 1cm length of the rootstocks
Okinawa and Mr. S 1/8 that had being cultivated in culture
medium without growth regulator were inoculated in MS and
WPM containing 0.0; 0.3 or 0.6 mg L-1 BAP, in two different
explant orientations (horizontal and vertical). It was observed
that the horizontal orientation provided the largest shoot number
for the cv. Mr S 1/8. The largest number of buds was obtained
in the concentration of 0.6 mg L-1 BAP for both rootstocks and
largest shoots were observed in the absence of BAP.
Index terms: Micropropagation; cytokinin, MS, WPM, Prunus.
INTRODUÇÃO
As frutas de caroço ocupam posição de destaque
entre as frutíferas de clima temperado nos países do Cone
Sul, destacando-se o Brasil, Argentina e Chile (NAKASU
et al., 1997). Nesse contexto, a produção dessas frutas
surge como uma boa fonte de renda para muitos produtores
rurais. A ausência de cultivares porta-enxertos adaptados
a diferentes condições edafoclimáticas do Brasil tem sido
um dos maiores problemas no aumento da produtividade
dos pomares de fruteiras de caroço. Na Região Sul do país,
as cultivares mais utilizadas como porta-enxerto são
Aldrighi e Capdeboscq, devido à facilidade de obtenção
de sementes, à facilidade de germinação, e à boa
compatibilidade com a maioria das cultivares de
pessegueiro, nectarineira e ameixeira (CHALFUN &
HOFFMANN, 1997). No entanto, ambas são classificadas
como suscetíveis ao fitonematóide Meloidogyne incognita
(Kofoid & White) Chitwood (MAUCH, 1991); além disso,
a propagação desses porta-enxertos é feita por sementes,
apresentando como inconveniente a mistura de cultivares
e o risco de segregação genética, o que pode provocar a
desuniformidade das plantas no pomar. Em vista disso,
muitos estudos estão sendo realizados com o objetivo de
(Recebido em 28 de julho de 2003 e aprovado em 06 de julho de 2004)
48
CHAVES, A. da C. et al.
testar novas cultivares de porta-enxertos para fruteiras de
caroço, buscando características de interesse como
resistência a doenças e pragas, resistência à condição de
estresse hídrico, adaptação às condições de solo e clima
(SCZEPANSKI, 2001). Entre os porta-enxertos em fase de
estudos estão as cultivares Okinawa, consideradas
resistentes aos nematóides das galhas e os híbridos Mr. S
1/8 e Mr. S 2/5. Esses porta-enxertos representam
alternativas para o produtor de frutas de caroço do Sul do
Brasil devido a algumas características de interesse como
resistência a nematóides e asfixia radicular.
Por meio da propagação in vitro, é possível
propagar espécies de difícil multiplicação pelos métodos
clássicos e ainda obter mudas sadias, livres de vírus e
outros patógenos, produzindo assim, material de alta
qualidade genética e sanitária. Na multiplicação in vitro,
destacam-se os pontos referentes às concentrações de
citocinina e o tipo de meio básico usado. As citocininas
têm a capacidade de estimular a divisão celular em cultura
de tecidos, além de aumentar o volume das células, sendo
também responsáveis pela superação da dominância das
gemas, resultando no aumento da taxa de multiplicação
(HU & WANG, 1983). O BAP tem sido muito eficaz para
promover a multiplicação e parece ser a citocinina por
excelência para multiplicação das partes aéreas e
indução de gemas adventícias além de possuir um menor
custo quando comparado com outros. Também de acordo
com Zimmerman (1988), as necessidades das cultivares
dentro de uma mesma espécie são diferentes, havendo
necessidade de modificação do meio e concentrações
de citocinina. Ainda durante essa etapa, alguns
tratamentos podem ser dados aos explantes para
estimular maior proliferação (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998), como a orientação do explante
quando é colocado no meio de cultura.
Objetivou-se neste trabalho induzir a multiplicação
de Prunus sp., cultivares Okinawa e Mr. S 1/8 em dois
meios básicos concentrações de BAP e duas orientações
dos explantes no meio de cultura.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de
Cultura de Tecidos de Plantas, do Departamento de
Botânica, Instituto de Biologia da Universidade Federal
de Pelotas, RS. Foram avaliadas as cultivares Okinawa e
Mr. S 1/8 nos meios de cultura MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962) e WPM (LLOYD & McCOWN, 1980), e as
concentrações de 0,0; 0,3 ou 0,6 mg.L-1 de BAP, em duas
orientações dos explantes (horizontal e vertical), nos meios
de cultura. Os explantes utilizados foram segmentos nodais
com 1,0cm de comprimento, oriundos de plântulas que
estavam sendo cultivadas em meio MS sem reguladores
de crescimento. Para isso, foram utilizados frascos com 30
ml de meio de cultura com o pH ajustado para 5,8 e adição
de ágar, na concentração de 6 g.L-1, e posteriormente
autoclavado a 121 0C e 1,5 atm por 15 minutos. Utilizou-se
o delineamento experimental em blocos casualizados, com
quatro repetições de cinco frascos com quatro explantes.
Constituiu-se um fatorial 2x2x3x2, sendo os fatores portaenxerto (Okinawa e Mr. S 1/8), meio básico (MS e WPM),
concentração de BAP (0,0; 0,3 e 0,6 mg.L-1) e orientação
do explante (horizontal e vertical). Aos 35 dias de cultivo,
analisaram-se as variáveis: número de gemas e de
brotações (transformadas segundo raiz quadrada de x+1
e raiz quadrada de x+0,5; respectivamente), e comprimento
das brotações. A análise estatística dos dados foi feita
mediante análise da variação e decomposição da variação
para os fatores porta-enxerto, meio e orientação do
explante, pela comparação de médias por meio do teste
de Duncan ( = 0,05), e concentração de BAP, pela análise
de regressão polinomial. O nível mínimo de significância
adotado em todos os testes foi de 5%. As análises
estatísticas foram executadas utilizando-se o programa
SANEST - Sistema de Análise Estatística para
Microcomputadores (ZONTA et al., 1984).
Para a cultivar Mr. S 1/8 observou-se um crescimento
no número de brotações, à medida que se aumentou a
Orientação do explante, bap e meio de cultura...
Na cultivar Mr. S 1/8 o número de brotações foi
2,5
Número
dedebrotações
Número
brotações
concentração de BAP, atingindo o maior valor (2,93
brotações/explante) na concentração de 0,6 mg.L -1, e
o menor no tratamento testemunha (1,22 brotações/
explante), sendo significativamente superior à cultivar
Okinawa nas concentrações de 0,3 e 0,6 mg.L-1 de BAP
(Figura 1). Para a cultivar Okinawa, a concentração
de 0,6 mg.L -1 proporcionou o maior número de
brotações (1,55 brotações/explante). Em função
d e s s a s r e s p o s t a s s u g e r e - s e q u e a má x ima
multiplicação varia com a combinação entre a
concentração dos reguladores exógenos e a sua
interação com os níveis endógenos. Igualmente
Reisch (1986) concluiu que a taxa de multiplicação em
culturas de Vitis é controlada em parte pela interação
genótipo x citocinina.
2
49
aA
bA
aB
1,5
aB
Horiz
ont a l
Horizontal
1
Ve
rt ic a l
Vertical
0,5
0
Mr. S 1/8
Okinawa
Cultivares
Cultivares
FIGURA 2 Número de brotações em segmentos nodais
das cultivares Okinawa e Mr. S 1/8, nas orientações
horizontal e vertical aos 35 dias de cultivo in vitro. Valores
seguidos por letras distintas, minúsculas dentro de
orientação do explante e maiúsculas entre cultivares
diferem significativamente pelo teste de Duncan a 5%.
FAEM/UFPEL, Pelotas RS, 2003.
maior quando colocados na orientação horizontal (2,43
brotações /explante), quando comparado ao obtido para
orientação vertical, que apresentou 1,62 brotações/
explante (Figura 2).
aA
Número
dede
brotações
Número
brotações
3
aB
2
bA
aC
aB
bB
Okinawa
Okinawa
Mr.
Mr.SS1/8
1/8
1
0
0
0,3
0,6
-1
)-1
BAP
BAP(mg.L
(mg.L )
FIGURA 1 Número de brotações em segmentos nodais
das cultivares Okinawa e Mr. S 1/8, nas concentrações de
0,0; 0,3 e 0,6 mg.L-1 de BAP, aos 35 dias de cultivo in vitro.
Valores seguidos por letras distintas, minúsculas dentro
de cultivar e maiúsculas entre concentrações de BAP
FAEM/UFPEL, Pelotas RS, 2003.
Resultado semelhante foi obtido por Erig &
Schuch (2002), que obtiveram com o porta-enxerto de
macieira Marubakaido 5,81 brotações por explante, na
orientação horizontal, e 3,78 brotações por explante,
na vertical. O maior número de brotações obtido com a
orientação horizontal do explante deve-se
principalmente à quebra da dominância apical.
Conforme Salisbury & Ross (1992), o transporte das
auxinas nas plantas é polar e, nesse sentido, a
orientação horizontal pode ter inibido a translocação
da auxina, ocasionando maior número de brotações nos
segmentos nodais. A cultivar Mr. S 1/8 foi superior em
número de brotações em função da orientação do
explante, quando comparada com a cultivar Okinawa,
que apresentou 1,26 e 1,18 brotações/explante para
orientação horizontal e vertical, respectivamente, sem
diferença entre si.
O maior tamanho de brotações para as duas
cultivares, foi obtido na ausência de BAP (Figura 3), 13,75
mm e 10,80 mm para as cultivares Mr. S 1/8 e Okinawa,
respectivamente. Verifica-se que os tratamentos acrescidos
de BAP influenciaram negativamente o tamanho das
50
brotações para as cultivares estudadas. Isso está de
vitro do porta-enxerto Mirabolano, obteve melhores
respostas em meio MS na ausência desse regulador.
Segundo Grattapaglia & Machado (1998), muitas vezes,
concentrações crescentes de citocininas inibem o
alongamento das brotações. Analisando conjuntamente
(mm)
diferentes concentrações de BAP na multiplicação in
16
Tamanho
Tamanho das
das
brotações
brotações(mm)
acordo com Sczepanski (2001) que, comparando
12
aA
bA
aB
aB
bB
aB
8
Hor
iz ont a l
Horizontal
4
VeVertical
rt ic a l
0
0
0,3
0,6
-1-1
BAP(mg.L
(mg.L ))
BAP
as variáveis número e tamanho de brotações, pode-se
concluir que, para determinadas cultivares,
concentrações elevadas de BAP aumentam a taxa de
proliferação, no entanto, o tamanho das brotações tende
a ser pequeno. Neste trabalho as concentrações de (0,3
e 0,6 mg.L -1 de BAP), apresentaram valores muito
próximos para as cultivares estudadas não apresentando
FIGURA 4 Tamanho de brotações em segmentos nodais,
para orientação vertical e horizontal, nas concentrações
de 0,0; 0,3 e 0,6 mg.L-1 de BAP, aos 35 dias de cultivo in
vitro. Valores seguidos por letras distintas, minúsculas
dentro de orientação do explante e maiúsculas entre
concentrações de BAP diferem significativamente pelo
teste de Duncan a 5%. FAEM/UFPEL, Pelotas-RS, 2003.
diferença significativa entre si.
Analisando-se a interação orientação do
explante x BAP, verifica-se que o maior tamanho das
brotações foi obtido no tratamento testemunha (0 mg.L 1),
13,90 mm para orientação vertical e 10,65 mm para
horizontal (Figura 4).
Tamanho
Tamanho
das das
brotações
brotações (mm)
(mm)
16
12
aA
bA
aB aB
aB
aB
8
Okina
wa
Okinawa
Mr
. S 1/
Mr.
S 81/8
4
0
0
0,3
0,6
BAP
BAP(mg.L
(mg.L-1-1) )
FIGURA 3 Tamanho de brotações em segmentos nodais
das cultivares Okinawa e Mr. S 1/8, nas concentrações de
0,0; 0,3 e 0,6 mg.L-1 de BAP, aos 35 dias de cultivo in vitro.
Valores seguidos por letras distintas, minúsculas dentro
de cultivar e maiúsculas entre concentrações de BAP
FAEM/UFPEL, Pelotas-RS, 2003.
No tratamento testemunha e na concentração de
0,6 mg.L -1, a orientação vertical apresentou maior
tamanho de brotações que a horizontal. Isso também foi
observado por Chevreau & Lebray (1993), que obtiveram
maior tamanho de brotações de pereira, cv. Passe
Crassane, com os explantes colocados na orientação
vertical. Para a concentração de 0,3 mg.L-1, embora essa
tenha apresentado maior comprimento de brotações na
orientação vertical, não foi verificada diferença
significativa para orientação do explante.
Para a variável número de gemas, o maior valor foi
obtido em meio WPM (16,93 gemas), enquanto o meio
MS proporcionou uma média de 15,25 gemas (Figura 5).
Trabalhando com Prunus mume Siebold & Zucc.,
Harada & Murai (1996), observaram que o meio WPM
possibilitou melhores respostas quando comparado com
o meio MS. Esses resultados devem-se principalmente
à menor concentração de sais do meio WPM,
enfatizando que meios ricos em sais, como o MS,
dificultam a proliferação de gemas. Segundo Preece
(1995), a diminuição de sais e reguladores de crescimento
nos meios de cultura é uma tendência mundial, e muitas
pesquisas estão sendo realizadas com essa finalidade.
Orientação do explante, bap e meio de cultura...
gemas
Númerodedegemas
Número
a
b
18
15
12
9
6
3
0
a
20
Númerode
de gemas
Número
gemas
O número de gemas apresentou crescimento
progressivo com o aumento das concentrações de BAP,
atingindo o maior valor (19,55 gemas) na concentração de
0,6 mg.L 1, e o menor (13,43 gemas), no tratamento
testemunha (Figura 6). Foi verificado que esses resultados
são devidos ao encurtamento dos entrenós proporcionado
pelo aumento das concentrações de BAP. Segundo (LANE,
1979; LESHEN et al., 1998), esse sintoma pode ser
problemático, pois afeta o alongamento e torna-se um fator
limitante na fase de enraizamento. Vários autores obtiveram
resultados semelhantes como Matias (1995), que,
trabalhando com as cultivares Flordaprince e Diamante,
observou tendência no aumento do número de gemas com
o aumento da concentração de BAP. Igualmente Silveira
(2000), utilizando o meio MS reduzido a ¾ da concentração
dos sais, obteve aumento no número de gemas com o
incremento de concentrações de BAP para a cultivar Mr. S
2/5; porém, para as cultivares Marianna, Mirabolano e GF
677, esse comportamento não foi verificado. Como se pode
observar, existe uma série de trabalhos testando diversas
cultivares em diferentes concentrações de reguladores de
crescimento, indicando que para cada cultivar existe uma
situação diferenciada de respostas.
51
b
c
15
10
5
0
0
0,3
0,6
-1-1
BAP(mg.L
(mg.L ))
BAP
FIGURA 6 Número de gemas em segmentos nodais nas
concentrações de 0,0; 0,3 e 0,6 mg.L-1 de BAP, aos 35 dias
de cultivo in vitro. Valores seguidos por letras distintas
FAEM/UFPEL, Pelotas-RS, 2003.
CONCLUSÕES
Com a concentração de 0,6 mg.L -1 de BAP,
proporcionou-se maior número de brotações e de gemas
para as cultivares estudadas, e com a orientação
horizontal, aumentou-se o número de brotações para a
cultivar Mr. S 1/8.
O maior tamanho de brotações foi obtido no
tratamento testemunha (0 mg.L-1 de BAP).
CHALFUN, N. N. J.; HOFFMANN, A. Propagação do
pessegueiro e da ameixeira. Informe Agropecuário, Belo
Horizonte, v. 18, n. 189, p. 23-29, 1997.
WPM
MS
Meios de
Meios
de cultura
cultura
FIGURA 5 Número de gemas em segmentos nodais para
os meios de cultura WPM e MS aos 35 dias de cultivo in
vitro. Valores seguidos por letras distintas diferem
significativamente pelo teste de Duncan a 5%. FAEM/
UFPEL, Pelotas-RS, 2003.
CHEVREAU, E.; LEBLAY, C. The effect of mother plant
pretreat-ment and explant choice on regeneration from in
vitro pear leaves. Acta Horticulturae, The Hague, v. 336,
p. 236-268, 1993.
ERIG, A. C.; SCHUCH, M. W. Multiplicação in vitro do
porta-enxerto de macieira cv. Marubakaido: efeito da
orientação do explante no meio de cultura. Revista
Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 24, n. 2, p. 293295, 2002.
52
GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A.
Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.;
BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação
genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPACNPH, 1998. v. 1, p. 183-260.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-497,
1962.
HARADA, H.; MURAI, Y. Micropropagation of Prunus
mume. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht,
v. 8, p. 265-267, 1996.
NAKASU, B. H.; RASEIRA, M. C. B.; CASTRO, L. A. S.
Frutas de caroço: pêssego, nectarina e ameixa no Brasil.
Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 18, n. 189, p. 813, 1997.
HU, C. P.; WANG, P. J. Meristem, shoot tip and bud culture.
In: EVANS, D. A. et al. Handbook of plant cell cultures.
New York: MacMmillian, 1983. v. 1, p. 177-227.
PREECE, J. E. Can nutrient salts partially substitute for
plant growth regulators Plant. Tissue Culture and
Biotechnology, Rehovot, v. 1, n. 1, p. 26-37, 1995.
LANE, W. D. Regeneration of pear plants fron shoot
meristem tips. Plant Science Letters, Limerick, v. 16, p.
183-260, 1979.
REISCH, B. I. Influence of genotype and cytokinins on in
vitro shoot proliferation of grapes. HortSciense,
Alexandria, v. 111, p. 138-141, 1986.
LESHEN, B.; WERKER, E.; SHALEV, D. P. The effect of
cytokinins on vitrification in melon and carnation. Annals
of Botany, London, v. 62, p. 271-276, 1988.
SALISBURY, F. B.; ROSS, C. W. Plant physiology. California:
Wadsworth, 1992. 682 p.
LLOYD, G.; MCCOWN, B. Commercially-feasible
micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by
use of shoot-tip culture. Combined Proceedings
International Plant Propagators Society, [S.l.], v. 30, p.
421-427, 1980.
MAUCH, C. H. Comportamento de pessegueiros [Prunus
persica (L.) Batsch.] e de ameixeira [Prunus cersasifera
(Ehre)] em relação a Meloidogyne incognita (Kofoid &
White 1919). 1991. 64 f. Dissertação (Mestrado em
Agronomia - Fitossanidade) Faculdade de Agronomia
Eliseu Maciel, Pelotas, 1991.
MATIAS, A. C. Estabelecimento e multiplicação in vitro
de pessegueiro (Prunus persica L. Batsch.) cultivares
Flordaprince e Diamante. 1995. 84 f. Dissertação (Mestrado
em Agronomia - Fruticultura de Clima Temperado)
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Pelotas, 1995.
SCZEPANSKI, P. H. G. Propagação in vitro de porta-enxerto
de Ameixeira Mirabolano (Prunus cerasifera Ehrh). 2001.
52 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia - Fruticultura
de Clima temperado) Faculdade de Agronomia Eliseu
Maciel, Pelotas, 2001.
SILVEIRA, C. A. P. Multiplicação in vitro de portaenxertos do gênero Prunus sp. 2000. 62 f. Dissertação
(Mestrado em Agronomia - Fruticultura de Clima
temperado) Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel,
Pelotras, 2000.
ZIMMERMAN, R. H. Cultivo de tejidos. In: MOORE, J.
N.; JANICK, J. Métodos genotécnicos en frutales. Mexico:
AGT, 1988. p. 167-182.
ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST - Sistema de
análise estatísticas para microcomputadores. Pelotas:
UFPel, 1984. 75 p.
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS E COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
1. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos e comunicações
serão de inteira responsabilidade do(s) autor(es).
2. A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada
semestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras
(Editora UFLA), publica artigos científicos e comunicações
científicas da área de cultura de tecidos de plantas, elaborados
por membros da comunidade científica nacional e internacional.
Não é cobrada taxa para publicação de trabalhos. É condição
fundamental que os artigos/comunicações submetidos à apreciação
da revista Plant Cell Culture & Micropropagation não foram
e nem serão publicados simultaneamente em outro lugar. Com a
aceitação do artigo para publicação, os editores adquirem amplos
e exclusivos direitos sobre o artigo para todas as línguas e países.
A publicação de artigos/comunicações dependerá da observância
das Normas Editoriais, dos pareceres do Corpo Editorial e da
Comissão ad hoc. Todos os pareceres têm caráter sigiloso e
imparcial, e tanto os autores quanto os membros do Corpo
Editorial e/ou Comissão ad hoc não obtêm informações
identificadoras entre si.
3. Os artigos e comunicações submetidos para publicação deverão
ser apresentados em meio magnético (disquete 3½ ) ou CDR,
utilizando-se o processador de texto Microsoft Word for
Windows (version 98, 2000, XP ou 2003), ser escrito em língua
portuguesa, inglesa ou espanhola e usar somente nomenclaturas
oficiais e abreviaturas consagradas, não empregando abreviaturas
no título do artigo. Juntamente com o disquete (ou CDR), deverão
ser enviadas 4 (QUATRO) vias, sendo uma original e as demais
cópias omitindo os autores e a chamada de rodapé da primeira
página (para serem enviadas aos consultores científicos),
impressas em papel branco, tipo A4 (21cm x 29,7cm), ou em
formulário contínuo em uma só face, espaço duplo entre linhas,
fonte: Times New Roman, tamanho: 12, observada uma margem
de 3 cm para o lado esquerdo e de 2 cm para o direito, 2,5 cm para
margem superior e inferior, 2,5 cm para o cabeçalho e 2,5 cm
para o rodapé. Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas
e junto do mesmo deverá ser encaminhado ofício dirigido ao Editor
Chefe da revista, solicitando a publicação do artigo. Esse ofício
deverá ser assinado por todos os autores, constar o endereço
completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão, exclusão
ou alteração na ordem dos autores, deverá ser notificada mediante
ofício assinado por todos os autores (inclusive do autor excluído).
4. O artigo científico deverá conter os seguintes tópicos: a)
TÍTULO, suficientemente claro, conciso e completo, evitando
palavras supérfluas. Recomenda-se começar pelo termo que
represente o aspecto mais importante do trabalho, com os demais
termos em ordem decrescente de importância. b) TÍTULO EM
INGLÊS; c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no máximo 6 (seis),
em letras maiúsculas, um após o outro, centralizados, e no rodapé
da primeira página , deverão vir a formação acadêmica e a
Instituição onde trabalham; d) RESUMO (de acordo com
NBR6028 da ABNT). O resumo não deve ultrapassar a 250
(duzentos e cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos. Após
o Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXAÇÃO
(palavras-chave), diferentes daqueles constantes do título e
separados por vírgula. Os termos para indexação devem estar
descritos na forma maiúscula e minúscula, serem expressões que
identifiquem o conteúdo do artigo, ser indicadas entre 3 e 5, e se
possível, extraídas do vocabulário Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da revista
Plant Cell Culture & Micropropagation para evitar o uso
de vários sinônimos como termos de indexação). Se não forem
encontrados descritores disponíveis para cobrirem a temática do
artigo, poderão ser indicados termos ou expressões de uso
conhecido; e) ABSTRACT, incluindo, em seguida, INDEX
TERMS; f) INTRODUÇÃO (incluindo a revisão de literatura);
g) MATERIAL E MÉTODOS; h) RESULTADOS E
DISCUSSÃO (podendo conter tabelas e figuras); i)
CONCLUSÕES; e j) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
5. A comunicação deverá conter os seguintes tópicos: a) TÍTULO,
suficientemente claro, conciso e completo, evitando palavras
supérfluas. Recomenda-se começar pelo termo que represente o
aspecto mais importante do trabalho, com os demais termos em
ordem decrescente de importância. Deve ser apresentada a versão
do título para o idioma inglês; b) TÍTULO EM INGLÊS; c)
NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no máximo 6 (seis), em letras
maiúsculas, um após o outro, centralizados, e no rodapé da
primeira página, deverão vir a formação acadêmica e a Instituição
onde trabalham; d) RESUMO (de acordo com NBR6028 da
ABNT). O resumo não deve ultrapassar a 250 (duzentos
cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos. Após o Resumo
devem-se incluir TERMOS PARA INDEXAÇÃO (palavraschave), diferentes daqueles constantes do título e separados por
vírgula. Os termos para indexação devem estar descritos na forma
maiúscula e minúscula, serem expressões que identifiquem o
conteúdo do artigo, ser indicadas entre 3 e 5; e); ABSTRACT,
incluindo, em seguida, INDEX TERMS; f) TEXTO [sem
subdivisão, porém com introdução, material e métodos, resultados
e discussão e conclusão subtendidos (podendo conter tabelas ou
figuras)] e g) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
6. AGRADECIMENTOS: ao fim do texto e, antes das Referências
Bibliográficas, poderão vir os agradecimentos a pessoas ou
instituições. O estilo, também aqui, deve ser sóbrio e claro,
indicando as razões pelas quais se fazem os agradecimentos.
7. TABELAS E QUADROS: deverão ser inseridos após citação
dos mesmos dentro do próprio texto.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002 da
ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento científico
(fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não deve
ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de publicação
(cidade), a ser descrito no lugar adequado para cada tipo de
documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
EXEMPLIFICAÇÃO (TIPOS MAIS COMUNS):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas Gerais.
Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 74-80, jan./
mar. 2000.
LIVRO:
a) Livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and procedures of
statistics. New York: McGraw-Hill Book, l960. 481 p.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras,
Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) - Universidade
Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: A folha é composta de duas páginas: anverso e verso. Alguns
trabalhos, como teses e dissertações são impressos apenas no anverso
e, neste caso, indica-se f. (ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de madeira
em floresta densa de terra firme da Amazônia brasileira. In:
CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6., 1990, Campos do
Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento (monografia no
todo e em parte, trabalho apresentado em evento, artigo de
periódico, artigo de jornal, etc.), acrescidas de informações sobre
o endereço eletrônico apresentado entre braquetes (< >),
precedido da expressão Disponível em: e da data de acesso
ao documento, precedida da expressão Acesso em: .
Nota: Não se recomenda referenciar material eletrônico de curta
duração nas redes (ABNT, NBR6023/2000, p. 4). Segundo
padrões internacionais, a divisão de endereço eletrônico, no fim
da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
b) Parte de livro com autoria específica:
a) Livro no todo
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos da
automação sobre a organização da produção de trabalho. In:
SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) Parte de livro
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em confinamento.
In: ______. Confinamento de bovino de corte. 2. ed. São Paulo:
Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível em:
<http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO
C
O N G R E S S O ABIPTI,
A B I P T I , 2000,
2 0 0 0 ,Fortaleza.
F o r t a l e z a .Gestão
Gestão de
institutosdedepesquisa
pesquisa
tecnológica.
Fortaleza:
institutos
tecnológica.
Fortaleza:
Nutec,Nutec,
2000.
2 0 0 0 . Di sp
o n<http://www.abipti.org.br>.
í v e l e m: < h t t p : / / w ww.Acesso
a b i p t iem:
. o rg01. bdez.
r>.
Disponível
em:
Acesso em: 01 dez. 2000.
2000.
d) Tese
SI LVA, E . M. Ar bi t r a r i e da de do si g n o : a l í n g u a
brasileira de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação
(Mestrado em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua)
- Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, São
Paulo, 1997. Disponível em: <http://www.terra.com.br/
virtualbooks/ freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em:
28 nov. 2000.
9.CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
9.1 Gráficos, Figuras e/ou Fotografias deverão ser apresentadas
em preto e branco, nítidas e com contraste, escaneadas, inseridas
no texto após a citação das mesmas e também em um arquivo à
parte, salvas em extensão tiff com resolução de 300 dpi;
9.2 Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa Page
Maker, sem perda de suas formas originais.
10. O Editor Chefe notificará o autor do recebimento do original
e, posteriormente, o informará sobre sua publicação. Os artigos
que necessitarem de modificações serão devolvidos ao autor para
a devida revisão.
11. Os artigos não aprovados serão devolvidos.
Artigo de periódico (acesso online):
12. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um conceito
contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife, v. 10, n. 1,
2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
13. O não-cumprimento dessas normas implicará na devolução
do artigo ao autor.
14. Os casos omissos serão resolvidos pela Comissão Editorial
15. O artigo deverá ser enviado para:
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTOR-DATA)
(conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al., 1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma obra
deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
Lavras MG
CEP 37200-000
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1. Concepts and affirmations included in articles and
communications are of the entire responsibility of the authors.
2. Plant Cell Culture & Micropropagation , a semestral journal
edited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavras,
publishes scientific articles and communications in the area of
plant tissue culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. There are no page charges for
publication. Submission of a manuscript implies that it is neither
under consideration for publication elsewhere nor has appeared
previously in part or in whole. On acceptance for publication,
authors assign to the Editors full copyright of the manuscript in
all languages and countries. Publications will depend on editorial
rules and on the review of experts and ad hoc commission.
Reviewer and editorial opinions will be anonymously
communicated to authors.
3. The articles and communication submitted for publication
must be presented in magnetically (3.5") diskette) or CDR, using
the program Microsoft Word for Windows (version 98, 2000,
XP or 2003), written in Portuguese, English or Spanish, using
only conventional nomenclature. At the time of submission,
authors are required to submit together with the diskette or CDR,
4 (four) hard copies, one original and three copies without the
name(s) of the author(s) as well as the footnote on the first page
(to be used by the reviewers), printed on A4 white paper (21 cm
x 29.7cm) or on continuous form, typewritten only on one side,
double spaced using font Times New Roman, size 12, with a 3
cm margin on the left hand side and 2.0 cm margin on the right
hand side, 2.5 cm upper and lower margin, 2.5 cm for the heading
and 2.,5 cm for the footnote. The manuscript must present a
maximum of 14 pages. At the time of submission, a cover letter
must be sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed by all
authors and also contain the full address, telephone number and
e-mail of the authors. Any inclusion, exclusion or alteration in
the authors order must be notified and signed by all authors
including the one excluded.
4. Each manuscript must be organized in: a) TITLE sufficiently
clear; conspicuous and complete, without superfluous words. It
is recommended to initiate with the term that represent the most
important aspect, with other terms in decreasing of importance;
b) TITLE in Portuguese; c) FULL NAME(s) OF THE
AUTHOR(s), maximum of 6 (six), in capital letters, one after the
other in the center of the page, with the footnote of the first page
containing their professional qualification or academic training
and their work institution. d) ABSTRACT written continuously
without paragraph. It must not exceed 250 words. Index terms
must be enclosed after the abstract using terms different from
those used in the title and separated by comma. The index terms
(3 to 5) must be described in capital and small letters, and express
the content of the article; e) ABSTRACT and INDEX TERMS
in Portuguese; f) INTRODUCTION (including literature
review); g) MATERIAL AND METHODS; h) RESULTS AND
DISCUSSION (it may include tables and figures); i)
CONCLUSIONS and j) REFERENCES.
5. Communication must have the following topics: a) TITLE,
sufficiently clear, conspicuous and complete, without superfluous
words. It is recommended to initiate with the term that represent
the most important aspect, with other terms in decreasing of
importance; The PORTUGUESE version of the title has to be
presented; b) TITLE in Portuguese; c) FULL NAME(s) OF
THE AUTHOR(s), maximum of 6 (six), in capital letters, one
after the other in the center of the page with the footnote of the
first page containing their professional qualification or academic
training and their work institution; d) ABSTRACT written
continuously without paragraph. It must not exceed 250 words.
Index terms must be enclosed after the abstract using terms
different from those used in the title and separated by comma.
The index terms (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article; e) ABSTRACT
and INDEX TERMS in Portuguese, f) TEXT (with no division
but must include introduction, material and methods, results and
discussion and conclusion (it may include tables and figures) and
g) REFERENCES.
6. ACKNOWLEDGEMENTS: Acknowledgements to people
or institutions might be included at the end of the text prior
References. The written style must be serious and clear, indicating
the reasons of the acknowledgements made.
7. TABLES AND FIGURES: must be included right after their
citation in the text.
8. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct citation
in the text are of the entire responsibility of the author(s). Some
important orientations: all authors of the scientific document
must be presented (source); the journal must be cited using its
full name; all references must present the name of the city where
the journal was published; all references must be cited
alphabetically.
9. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS OR
FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
9.1. Graphs, Figures and/or photographs must be presented in
black and white, clear and with contrast, scanned, inserted in the
text after their citation and also in a separate file (on the same diskette
as the article) saved in extension tiff with resolution of 300 dpi.
11. Manuscripts not approved will be returned to the author.
12. Articles will be published according to the order of receipt
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13. If any of these rules are not attended the manuscript will be
returned to the author.
14. Manuscripts should be sent to the following address:
9.2. Symbols and Chemical Formula must be presented using
a word processor that permits a format for Page Maker.
10. The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP)
will inform the author the receipt of the original manuscript and
eventually it will also send information regarding its publication.
Manuscripts that require modifications will be returned to the
author for the respective revision and corrections.
ABCTP
Universidade Federal de Lavras
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Brazil

Volume 1 Número 1

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