(vhb) e vírus da hepatite c (vhc) - PPGBAIP

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) E
VÍRUS DA HEPATITE C (VHC) COINFECTANDO PORTADORES DO
VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1) NO ESTADO DO
PARÁ
LUCIMAR DI PAULA DOS SANTOS MADEIRA
Belém, Pará
2013
VÍRUS DA HEPATITE C (VHC) COINFECTANDO PORTADORES DO
VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1) NO ESTADO DO
PARÁ
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários,
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará.
Orientadora:
Profa.
Guimarães Ishak
Belém-Pará
2013
Dra.
Marluísa
de
Oliveira
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Madeira, Lucimar di Paula dos Santos, 1984Epidemiologia molecular dos vírus da
hepatite B (VHB) e vírus da hepatite C (VHC)
coinfectando portadores do vírus da imunodeficiência
humana 1 (HV-1) no estado do Pará / Lucimar di Paula
dos Santos Madeira. 2013.
Orientador: Marluísa de Oliveira Guimarães
Ishak.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Pará,
Instituto de Ciências Biológicas, Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, Belém, 2013.
1. AIDS (Doença) Complicações e sequelas. 2. HIV
(Vírus). 3. Vírus da hepatite B. 4. Vírus da hepatite
C. 5. AIDS (Doença) Pará. I. Título.
CDD 22. ed. 616.9792
1
VÍRUS DA HEPATITE C (VHC) COINFECTANDO PORTADORES DO VÍRUS
DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA 1 (HIV-1) NO ESTADO DO PARÁ
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora:
Profa. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak
Laboratório de Virologia, ICB, UFPA
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Ricardo Ishak
Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto
Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado
Laboratório de Virologia, ICB UFPA
Profa. Dra.Rosimar Neris Martins Feitosa
Profa.Dra. Hellen Fuzzi (Suplente)
Núcleo de Medicina Tropical
Belém, 17 de dezembro 2013
2
DEDICATÓRIA
“Dedico este trabalho para Deus meu mentor e que me guiou e iluminou em todas as etapas,
para meus pais Cléa e Anacleto e meu irmão pelo apoio e amor
incondicional em todas as horas,
para meu amor Rafael Sales pelo apoio, carinho e compreensão em
todos os momentos”
3
EPÍGRAFE
“Pouco conhecimento faz com que as pessoas se sintam orgulhosas. Muito conhecimento,
que se sintam humildes”
(Leonardo da Vinci)
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ricardo Ishak e Profa. Dra. Marluísa Ishak , primeiro por permitirem o meu
ingresso no Laboratório de Virologia, por serem meus orientadores desde a iniciação científica
até o doutorado. Obrigada pela oportunidade, confiança, incentivo e pelos ensinamentos, para a
realização deste trabalho. A dedicação, o amor e a competência que vocês tem pelo LabVir,
tornando-os verdadeiros exemplos de profissionais a serem seguidos.
A Profa. Dra. Marluísa Ishak obrigada por acreditar em mim e pela confiança que foi
depositada, tudo o que a senhora me ensinou, eu levo comigo como lições de vida.
A todos os professores do Laboratório de Virologia Prof. Dr. Antonio Vallinoto, Prof. Dr.
Luiz Fernando Machado, Profa. Dra. Vânia Azevedo e Profa. Dra. Rosimar Feitosa, pelas
contribuições durante a realização do trabalho, pelo auxílio com os protocolos de biologia
molecular e pela disponibilidade fornecida toda a vez que alguma dúvida surgia.
A todos os amigos e amigas do Laboratório de Virologia que colaboraram para a
realização deste trabalho. Em especial a Jacqueline, Samara, Felipe, Rogério, Carol, Ethienne,
Ednelza, Renata e Alice pela ajuda e apoio durante o desenvolvimento da Tese e o mais
importante de tudo a amizade de vocês, foi essencial. Agradeço ao enorme auxílio e paciência nas
análises estatísticas fornecido pela MSc. Sandra Lima.
A família, meus pais e meus alicerces Cléa e Anacleto por me incentivarem sempre a
nunca desistir dos meus sonhos e objetivos, obrigada por acreditar em minha capacidade e me
incentivar sempre a buscar o melhor. Vocês são os responsáveis por essa conquista.
Ao meu grupo de amigas desde a época de graduação (G12) Andrea, Daisy, Dafne,
Renata Mendonça, Paloma, Paula, Mayra, Milena, Marcinha, obrigada pelo apoio, amizade e
força de vocês.
Ao meu Rafael, obrigada pelo companheirismo, amizade, apoio e ajuda na parte de edição
de figuras. sem medir esforços.
Ao Prof. Dr. Aldemir Branco pela ajuda, disponibilidade e colaboração que foram
fundamentais para execução da biologia molecular e filogenia do VHC.
À todos os indivíduos doadores de suas amostras que aqui foram testadas, em especial aos
pacientes que fazem o acompanhamento na URE-DIPE.
A CAPES, a UFPA e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários pelo auxílio financeiro e acolhimento durante o desenvolvimento desta tese.
5
SUMÁRIO
Páginas
LISTA DE FIGURAS
8
LISTA DE TABELAS E QUADROS
9
RESUMO
10
ABSTRACT
11
1
INTRODUÇÃO................................................................................
12
1.1
HISTÓRICO DO HIV-1................................................................
12
1.2
BIOLOGIA DO HIV-1..................................................................
12
1.2.1
Replicação do HIV-1....................................................................
15
1.3
EPIDEMIOLOGIA DO HIV-1.....................................................
18
1.3.1
Modos de transmissão...................................................................
18
1.3.2
Prevalência ....................................................................................
19
1.4
HISTÓRICO DO VHB..................................................................
22
1.5
BIOLOGIA DO VHB....................................................................
23
1.5.1
Replicação do VHB.......................................................................
24
1.6
EPIDEMIOLOGIA DO VHB.......................................................
27
1.6.1
Modos de transmissão...................................................................
27
1.6.2
Prevalência ....................................................................................
28
1.6.3
Epidemiologia molecular do VHB ..............................................
30
1.6.4
Coinfecção VHB e HIV-1............................................................
32
1.7
HISTÓRICO DO VHC..................................................................
34
1.8
BIOLOGIA DO VHC....................................................................
34
1.8.1
Replicação do VHC.......................................................................
37
1.9
EPIDEMIOLOGIA DO VHC........................................................
39
1.9.1
Modos de transmissão....................................................................
39
1.9.2
Prevalência......................................................................................
41
1.9.3
Epidemiologia molecular do VHC................................................
45
1.9.4
Coinfecção VHC e HIV-1.............................................................
47
6
1.10
OBJETIVOS....................................................................................
51
1.10.1
Objetivo geral..................................................................................
51
1.10.2
Objetivos específicos.......................................................................
51
2
MATERIAL E MÉTODOS..........................................................
52
2.1
POPULAÇÃO EXAMINADA.......................................................
52
2.2
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS....................................................
52
2.3
ASPECTOS ÉTICOS........................................................................
53
2.4
SOROLOGIA....................................................................................
53
2.4.1
Detecção de Anticorpos e Antígenos do VHB................................
53
2.4.2
Detecção de Anticorpos para o VHC..............................................
53
2.5
QUANTIFICAÇÃO DOS LINFÓCITOS T CD4+ e CD8+.............
53
2.6
QUANTIFICAÇÃO DA CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HIV1..........................................................................................................
2.7
MÉTODOS
PARA
SEQUENCIAMENTO
DO
VHB
54
E
VHC....................................................................................................
54
2.7.1
Extração do DNA..............................................................................
54
2.7.2
Extração do RNA..............................................................................
55
2.7.3
Transcrição Reversa.........................................................................
56
2.7.4
PCR em Tempo Real para a detecção do VHC............................
57
2.7.5
Reação em cadeia mediada pela polimerase para o VHC............
58
2.7.5.1 Eletroforese.......................................................................................
59
2.7.6
Reação em cadeia mediada pela polimerase para o VHB...........
59
2.7.6.1 Eletroforese.......................................................................................
60
2.8
PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DA PCR PARA O VHB.................
60
2.9
SEQUENCIAMENTO.....................................................................
61
2.9.1
Precipitação do DNA sequenciado.................................................
62
2.9.2
Eletroforese do DNA sequenciado..................................................
62
2.10
ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS.........................
62
2.10.1
Análise filogenética VHB..............................................................
62
2.10.2
Análise filogenética VHC...............................................................
63
2.11
ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................
64
7
3
RESULTADOS.................................................................................
65
3.1
CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA...............................................
65
3.1.1
Caracterização
do
perfil
sócio-demográfico
dos
indivíduos
65
portadores do HIV-1.............................................................................
3.1.2
Caracterização dos fatores de risco dos indivíduos portadores do
67
HIV-1......................................................................................................
3.2
MARCADORES
DA
INFECÇÃO
PELOS
VHB
E
VHC........................................................................................................... 70
3.3
MARCADORES MOLECULARES DA INFECÇÃO PELO VHB e
VHC..........................................................................................................
72
3.4
ANÁLISE FILOGENÉTICA..................................................................
76
3.4.1
Análise filogenética para o VHB..........................................................
76
3.4.2
Análise filogenética para o VHC.........................................................
77
3.5
ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO PASSADA E CRÔNICA DOS
VHB E VHC E CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HIV-1 E A
CONTAGEM DE LINFÓCITOS T CD4+ E LINFÓCITOS T CD8+.....
3.6
78
ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO PASSADA E CRÔNICA DOS
VHB E VHC E OS FATORES DE RISCO...........................................
81
4
DISCUSSÃO..........................................................................................
86
5
CONCLUSÕES......................................................................................
95
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................
96
APÊNDICES..................................................................................
125
ANEXO...........................................................................................
128
8
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 1-
Estrutura morfológica do HIV-1....................................................
14
Figura 2-
Organização genômica do HIV-1..................................................
15
Figura 3-
Replicação do HIV-1.....................................................................
17
Figura 4-
Morfologia do VHB......................................................................
24
Figura 5-
Replicação do VHB ......................................................................
26
Figura 6-
Organização genômica do VHB ....................................................
27
Figura 7-
Representação esquemática da morfologia do VHC .....................
35
Figura 8-
Organização genômica do VHC ....................................................
37
Figura 9-
Replicação do VHC .......................................................................
39
Figura 10-
Distribuição da prevalência do VHC no mundo............................. 42
Figura 11-
Distribuição dos marcadores da infecção pelos VHB e VHC em
indivíduos portadores do HIV-1, Belém, Pará...............................
Figura 12-
Amplificação das amostras de plasma para a infecção pelo VHC
pela técnica de PCR em tempo real................................................
Figura 13-
70
73
Amplificação das amostras de massa celular para a infecção pelo
VHC pela técnica de PCR em tempo real....................................... 74
Figura 14-
Produto de visualização da seminested PCR para o VHB............
75
Figura 15-
Produto de visualização da nested PCR para o VHC ....................
75
Figura 16-
Árvore filogenética de Neighbor-Joining construída a partir do
alinhamento 867 pb do gene S
do VHB em indivíduos
infectados pelo HIV-1 no Estado do Pará....................................
Figura 17-
76
Árvore filogenética de máxima verossimilhança construída a
partir do alinhamento 269 pb da 5’ região NTR do VHC em
indivíduos infectados pelo HIV-1 no Estado do Pará.................
Figura 18-
Média dos valores de linfócitos T CD4
+
entre os quatro
subgrupos analisados.....................................................................
Figura 19-
79
Média dos valores de linfócitos T CD8+ entre os quatro
subgrupos analisados......................................................................
Figura 20-
77
80
Média dos valores da razão entre linfócitos T CD4+ e linfócitos
T CD8+ entre os quatro subgrupos analisados................................
81
9
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Páginas
Quadro 1-
Sequência do assay e do controle endógeno ..............................
Quadro 2-
Sequência dos primers utilizados no PCR Convencional para
VHC............................................................................................
Quadro 3-
59
Características sócio-demográficas dos indivíduos portadores do
HIV-1, Belém, Pará...............................................................
Tabela 2-
66
Distribuição dos possíveis fatores de risco na população de
indivíduos portadores do HIV-1, Belém, Pará. ..........................
Tabela 3-
68 e 69
Distribuição dos marcadores sorológicos para infecção pelos VHB
e VHC em portadores do HIV-1, Belém, Pará....................
Tabela 4-
58
Sequência dos primers utilizados para amplificação do gene S do
VHB......................................................................................
Tabela 1-
57
71
Resultado da amplificação de ácido nucléico por meio de reação
de PCR em tempo real, de acordo com a origem do
material.........................................................................................
Tabela 5-
Resultado do Teste-G para análise da associação da carga viral
plasmática
do
HIV-1
entre
os
quatro
subgrupos......................................................................................
Tabela 6 -
Tabela 9 -
82
Resultado da regressão logística simples entre o subgrupo
monoinfectados pelo HIV-1 e infecção passada pelo VHB .......
Tabela 8-
78
monoinfectados pelo HIV-1 e coinfecção HIV-1 e VHB ............
Tabela 7 -
72
83
Resultado final da análise regressão logística múltipla entre o
subgrupo monoinfectados pelo HIV-1 e infecção passada pelo
84
VHB............................................................................................
monoinfectados pelo HIV-1 e coinfecção HIV-1 e VHC ............
85
10
RESUMO
O Vírus da hepatite B (VHB), o Vírus da hepatite C (VHC) e o Vírus da imunodeficiência
humana 1 (HIV-1) compartilham rotas comuns de transmissão, tais como as vias parenteral,
sexual e vertical, mas eles diferem na eficiência pela quais certos tipos de exposição e também
diferem na prevalência nas regiões geográficas. A interação entre o HIV-1 e as infecções pelos
VHB e VHC podem alterar a história natural e a resposta ao tratamento de ambas as doenças e
também podem potencializar a replicação do HIV-1. O presente trabalho teve como objetivos
detectar a prevalência das infecções pelos VHB e VHC e identificar os genótipos circulantes
entre os portadores do HIV-1. Foram utilizadas 410 amostras de portadores do HIV-1
provenientes da Unidade de Referência Especializada em Doenças Infecciosas e Parasitárias
Especiais (URE DIPE), coletadas no período de setembro 2007 a janeiro 2009. Os plasmas foram
submetidos a um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA para detecção de anticorpos (antiHBctotal, anti-HBcIgM, anti-HBs, anti-VHC e anti-HBe) e antígenos (HBsAg e HBeAg). A
identificação dos genótipos foi realizada por reação de sequenciamento, a partir dos produtos
amplificados da reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR), e regiões do gene S e 5’NTR,
para o VHB e VHC, respectivamente, e a construção de
árvores filogenéticas. O grupo
examinado incluiu 61% de indivíduos do sexo masculino, 53,3% solteiros, com renda familiar
entre 1 a 3 salários mínimos (72,7%) e 28,7% com o ensino médio completo. Dentre os
examinados 69,7% declarou ser heterossexual, 1,7% relatou o uso de drogas endovenosa (UDE),
31,5% disse ter tido um parceiro portador de HIV-1 e 14,9 % referiu ter tido mais de um parceiro
por mês. Foram encontrados marcadores para infecção passada ou persistente pelo VHB em
57,2% e em 3,4% pelo VHC. A infecção passada pelo VHB foi encontrada em 48,4% e em 8,8%
coinfecção HIV-1 e VHB; a imunidade vacinal para o VHB foi demonstrada em 9,2% dos
indivíduos. A genotipagem do VHB mostrou que todas as amostras pertenciam ao genótipo A, e
as do VHC foram dos genótipos 1 (75%) e 3 (25%). Não houve associação estatística, entre a
carga viral plasmática do HIV-1 e a contagem dos linfócitos T CD4+ com as coinfecções. Foi
encontrada associação entre a contagem dos linfócitos T CD8 + entre os monoinfectados e os
coinfectados HIV-1 e VHC (p=0,01), assim como entre os coinfectados HIV-1 e VHC e infecção
passada pelo VHB (p=0,004). O uso de drogas endovenosas foi associado com a infecção pelo
VHC e a orientação homossexual foi associada com a infecção crônica pelo VHB. É necessário,
manter-se a vigilância por meio de novos estudos de epidemiologia molecular para conhecer os
genótipos circulantes do VHB e VHC em portadores do HIV-1 no Estado do Pará e as mudanças
dos fatores de risco que acompanham as três infecções.
11
ABSTRACT
The Hepatitis B virus (HBV), the Hepatitis C virus (HCV) and the Human
immunodeficiency virus 1 (HIV-1) share common routes of transmission, such as perinatal,
sexual, infectious blood exposures, and but they differ in the efficiency by which certain types of
exposition and also differ in the prevalence in geographic regions. The interaction between HIV1 and the infections by HBV and HCV may alter the natural history and the response to the
treatment of both diseases and may also enhance the replication of HIV-1. The present work had
as objective to detect the prevalence of HBV and HCV infection and identify the current
genotypes among the HIV-1 infected individuals. Samples of 410 HIV-1 infected individuals
from the Reference Unity Specialized in Infectious and Parasitic Diseases were used, collected in
the period of september 2007 to january 2009. The plasma samples were submitted to an
immunoassay of ELISA type to the detection of antibodies (total anti-HBc, anti-HBcIgM, antiHBeAg, anti-HBs, anti-HCV and anti-HBeAg) and the antigens (HBsAg and HBeAg). The
identification of the genotypes was performed by a sequence reaction, from the amplified
products from polymerase chain reaction (PCR), and the regions of the genes S and 5'NTR for the
HBV and HCV, respectively, and construction of the phylogenetic tree. The examined group
includes 61% of male, 53,3% singles, with family income among 1 to 3 minimum wage (72,8%)
and 28,7% with high school completed. Among the examined 69,7% declared being
heterosexual, 1,7% related the use of intravenous drugs (IDU), 31,5% related have had one HIV1 infected partner and 14,9% referred have had more than one partner per month. Past infection
and persistent infection markers for HBV infection were found in 57,2% and in 3,4% for the
HCV. The past infection by HBV was found in 48,4% and in 8,8% co-infection HIV-1 and HBV;
the vaccine immunity for the HBV was demonstrated in 9,2% of the individuals. The genotyping
of HBV showed that all the samples belong to the A genotype, and the HCV were belonging to
the genotypes 1(75%) and 3(25%). It wasn´t found a significant statistical association between
the HIV-1 plasmatic viral load and the TCD4+ lymphocytes count with the coinfections. It was
found an association between the TCD8+ lymphocytes count among the monoinfected and the
coinfected HIV-1 and HCV (p=0,01), as there was among the coinfected HIV-1 and HCV and
HCV past infection (p=0,004). The usage of intravenous drugs was associated with the infection
by the HCV and the homosexual orientation was associated to the chronic infection by the HBV.
It is necessary to maintain the surveillance by means of novel molecular epidemiology studies to
know the current genotypes of HBV and HCV in HIV-1 infected individuals in the state of Pará
and the shift in the risk factors that accompany the three infections.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO DO HIV-1
O Vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) foi identificado como o agente causador
da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) em 1983 (Barré-Sinoussi et al., 1983; Gallo
et al., 1984; Levy et al., 1984).
A epidemia do HIV-1 teve início em 1980 e se caracterizou por infecções por
Pneumocystis carinii (hoje denominado Pneumocystis jiroveci) (CDC, 1981) em homossexuais
masculinos, em São Francisco, Estados Unidos da América (EUA), e se caracterizou também
pelo diagnóstico de Sarcoma de Kaposi em homossexuais masculinos jovens em Nova York
(EUA), o que sugeriu uma relação adicional da doença com atividades sexuais específicas (CDC,
1981).
A identificação do HIV-1 na década de 1980 explica em parte o aumento da incidência de
infecções incomuns e malignidades raras relatadas entre pacientes infectados (Gallo et al.,1984).
Com a melhora no entendimento da replicação do vírus, surge o conhecimento das células T
CD4+(células alvo do HIV-1). Essas células são responsáveis pela resposta imunológica tipo 1 e
tipo 2 do hospedeiro e estão envolvidas na imunidade celular. Os micro-organismos que causam
infecções são comensais e as infecções foram, por isso nomeadas oportunistas porque elas
ocorrem quando o sistema imunológico do hospedeiro está debilitado (Manavi, 2006).
A combinação de infecções oportunistas e malignidades raras associadas com a
diminuição das células T CD4+ foi denominada Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
e inicialmente era limitada aos homossexuais masculinos, aos hemofílicos, aos receptores de
transfusões sanguíneas e aos usuários de drogas intravenosa (UDI) (Masur et al., 1981).
1.2 BIOLOGIA DO HIV-1
O Vírus da imunodeficiência humana 1(HIV-1) e o Vírus da imunodeficiência humana 2
(HIV-2) fazem parte da família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e do gênero
Lentivirus (ICTV, 2008).
13
A família Retroviridae é caracterizada pela capacidade dos seus membros transcreverem o
seu genoma de RNA para DNA antes de se integrarem ao cromossomo da célula hospedeira. Os
retrovírus contêm três domínios codificantes: gag, que gera o capsídeo viral; pol, que contém
informações para as enzimas transcriptase reversa, integrase e protease, e env, que codifica as
proteínas do envelope (Lewis & Emerman, 1994). A transcriptase reversa é a enzima chave do
ciclo de replicação dos retrovírus, possuindo atividades de DNA polimerase dependente de RNA
e RNase H (Isel et al., 1999).
O HIV-1 é um vírus esférico com simetria icosaédrica e é formado por um envelope ao
qual se ligam espículas que consistem de duas glicoproteínas, a gp120 (superfície) e a gp41
(transmembrana), as mesmas se ligam ao envelope de maneira não-covalente. Abaixo do
envelope lipídico está uma estrutura composta de 2.000 cópias da proteína p17 que também é
conhecida como proteína da matriz, a qual forra a superfície interna do envelope viral (Turner &
Summers, 1999) (Figura 1).
O capsídeo viral tem simetria cônica, é formado pela proteína p24 e está localizado no
centro do vírus. Esse capsídeo envolve as duas cópias do genoma de RNA de fita simples e de
polaridade positiva, o qual é estabilizado como um complexo de nucleoproteína com a proteína
do nucleocapsídeo (p7) e também contém três enzimas virais essenciais: protease, transcriptase
reversa e integrase. A maioria das funções conhecidas da proteína do nucleocapsídeo do HIV-1
envolve interações com ácido nucléico (Turner & Summers, 1999).
14
Figura
1Estrutura
morfológica
do
HIV-1
webs.wichita.edu/mschneegurt/biol103/lecture15/lecture15.html)
(Adaptado
de
http://
O genoma do HIV-1 é composto de duas cópias de RNA de fita simples e polaridade
positiva, e possui aproximadamente 10 kilopares de bases (kb). Quando integrado ao genoma, é
flanqueado por duas sequências longas e repetitivas (LTR), as quais influenciam no nível de
transcrição. Existem três genes estruturais: gag, pol e env, e no mínimo seis genes regulatórios:
tat (transativador); rev (regulador de expressão); vif (fator de infectividade viral); nef (fator
negativo) e vpr e vpu (proteínas virais R e U), respectivamente (Llewelyn, 1994).
O gene env codifica uma poliproteína precursora de uma glicoproteína a gp160, que após
ser clivada forma a gp120 e a gp41 e essas glicoproteínas estão interligadas por interações nãocovalentes (Kuiken et al., 2001).
O gene pol codifica as enzimas virais protease, transcriptase reversa e integrase. Essas
enzimas são produzidas como uma poliproteína precursora Gag-pol, a qual é processada pela
15
protease viral; a precursora Gag-pol é produzida pelo ribossomo da região C-terminal do gene
gag (Kuiken et al., 2001).
O gene gag codifica uma poliproteína precursora de 55 kDA, que é clivada pela protease
em proteínas p17 (proteína da matrix), p24 (proteína do capsídeo), p7 (proteína do
nucleocapsídeo), p6, p2 e p1 (Freed, 1998; Kuiken et al., 2001).
As proteínas Tat e Rev são regulatórias, elas modulam os passos transcricionais e pós
transcricionais da expressão gênica do vírus e são essenciais para a propagação viral. As
proteínas Vif, Nef, Vpr e Vpu são proteínas acessórias, que geralmente não são necessárias para a
propagação viral em culturas de tecido, mas elas têm sido conservadas em diferentes isolados
(Kuiken et al., 2001) (Figura 2).
Figura 2- Organização genômica do HIV-1(Adaptado de: Freed, 1998).
1.2.1Replicação do HIV-1
O HIV-1 penetra na célula hospedeira via uma sequência de eventos envolvendo
moléculas receptoras na superfície da célula do hospedeiro e proteínas do envelope viral (Chan &
Kim, 1998; Pierson et al., 2003).
O processo da infecção pelo HIV-1 se inicia no momento em que a gp120 se liga ao CD4
na superfície da célula hospedeira, o CD4 é o receptor requerido para a ligação do vírus e entrada
na célula alvo. A gp120 interage com um coreceptor de quimiocina existente na superfície do
16
linfócito T CD4+ (Freed, 1998). Existem dois tipos de receptores de quimiocina que são usados
pelo HIV-1, o CCR5 (um receptor beta-quimiocina) e CXCR4 (um receptor alfa-quimiocina),
esses receptores de quimiocinas são utilizados como coreceptores pelo HIV-1 para entrar na
célula hospedeira (Dragic et al., 1996).
Após a interação do HIV-1 com receptores e coreceptores, acontece a reação de fusão da
membrana que ocorre entre a bicamada lipídica do vírus e a membrana plasmática da célula do
hospedeiro; a reação de fusão é induzida pela gp41, liberando assim o core viral para o
citoplasma da célula hospedeira (Freed, 1998).
Após a liberação do core viral no citoplasma, ocorre o processo de desnudamento,
quando, o capsídeo é liberado, enquanto o gene pol codifica as enzimas integrase, protease e
transcriptase reversa; essas enzimas e a proteína Vpr são retidas como parte de complexo de alto
peso molecular e esse complexo de alto peso molecular agora é referido como complexo de préintegração, que é transportado através da membrana nuclear da célula hospedeira (Freed, 1998).
Durante o desnudamento, a transcriptase reversa (RT) é liberada dentro da célula alvo
junto com o RNA viral. A RT direciona a síntese de uma fita de DNA complementar a partir de
uma fita molde de RNA do vírus. Depois disso a RT direciona a síntese de uma segunda fita de
DNA, complementar à fita de DNA sintetizada, durante o processo de transcrição reversa do
RNA viral em que uma cópia de DNA de fita dupla é completada (Freed, 1998; Schwartz & Nair,
1999).
No núcleo, a integração do DNA viral ao cromossomo da célula hospedeira é catalisada
pela enzima integrase. O DNA viral integrado, conhecido como provírus, serve como molde para
a síntese de novas fitas de RNA viral, as quais são transportadas para o citoplasma. As
glicoproteínas do envelope são sintetizadas no retículo endoplasmático e essas glicoproteínas são
transportadas para a membrana plasmática por via secretora. As poliproteínas precursoras Gag e
Gag-pol são sintetizadas e transportadas, por um mecanismo desconhecido, para a membrana
plasmática. Durante ou depois do transporte, o precursor Gag recruta duas cópias de RNA
genômico de fita simples, que interagem com o precursor Gag-pol, e ocorre uma montagem de
17
estruturas visíveis pela microscopia eletrônica como manchas densas forrando a face interna da
membrana plasmática. A montagem da poliproteína precursora Gag induz uma curvatura da
membrana, que conduz o processo de brotamento (Freed, 1998).
Durante o brotamento, as glicoproteínas virais do envelope, são incorporadas às partículas
virais nascentes. O brotamento é completado quando a partícula viral é liberada completamente
da membrana plasmática. Durante ou imediatamente depois do brotamento, a protease viral cliva
a poliproteína precursora Gag-pol e Gag para proteínas completas e infecciosa Gag e pol. A
clivagem da protease leva à condensação do core e geração de um vírus completo e infeccioso, o
qual agora é capaz de iniciar um novo ciclo de infecção (Freed, 1998) (Figura 3).
Figura 3- Replicação do HIV-1 (Adaptado de: Furtado et al., 1999).
18
1.3 EPIDEMIOLOGIA DO HIV-1
1.3.1 Modos de transmissão
A transmissão do HIV-1 pode ocorrer pelo contato com fluidos corpóreos infectados.
Sangue, sêmen, secreção vaginal e leite materno são mais eficientes na transmissão do vírus do
que fluidos pobres em células, tais como saliva, urina e lágrima (Schwartz & Nair, 1999).
A transmissão do HIV-1 pode ocorrer pela via sexual (homossexual e heterossexual),
quando há lesão na pele ou mucosa; por via endovenosa (ou intravenosa) através do
compartilhamento de seringas ou agulhas contaminadas com o vírus; pela exposição ocupacional
em profissionais da área da saúde, ou tratamento com produtos hemoderivados contaminados
(Schwartz & Nair, 1999).
A transmissão parenteral do HIV-1 ocorre em indivíduos que possuem exposição
ocupacional a sangue contaminado. Esses indivíduos, tem o risco de adquirir a infecção pelo
HIV-1, que podem ocorrer por lesões percutâneas, essas lesões geralmente são causadas por
acidentes com agulhas com sangue contaminado. Esse é o mecanismo mais comum de
transmissão ocupacional do HIV-1(Gerberding, 2003).
Estudos prospectivos com pessoas da área da saúde sugerem que o risco médio de
transmissão do HIV-1 é de aproximadamente 0,3 % depois de uma exposição percutânea à
amostra de sangue contaminado pelo HIV-1 é de aproximadamente 0,09 % depois de uma
exposição de membrana mucosa à amostra de sangue contaminado. O baixo título de RNA do
HIV-1 no plasma pode indicar baixo inóculo, mas não exclui a possibilidade de infecção, uma
vez que essa medida não relata as células associadas ao HIV-1 (Gerberding, 2003).
Uma convergência de evidências indiretas sugere que o tratamento do indivíduo exposto à
material contaminado com drogas antirretrovirais logo depois da exposição ocupacional pode
diminuir o risco de infecção pelo HIV-1 (Gerberding, 2003). Em um estudo retrospectivo
realizado pelo CDC em pessoas da área da saúde, o tratamento pós-exposição com zidovudina foi
associado com uma redução de 81% no risco de infecção pelo HIV-1 (Busch et al.,1995).
19
Vários fatores de risco sexual foram identificados para a transmissão sexual do HIV-1. O
mais importante deles é o contato com múltiplos parceiros. A transmissão de homem para mulher
é aproximadamente duas vezes mais eficiente do que a transmissão de mulher para homem. O
risco de transmissão também varia diretamente com o grau da doença. Outro importante fator de
risco inclui a relação sexual anal, o uso concomitante de drogas intravenosas, cocaína e a
presença de outras doenças sexualmente transmissíveis (DST) (Guinan & Hardy, 1987; Padian,
1987).
A transmissão vertical do HIV-1 de mãe para filho relata um número significante de
novos casos de infecção pelo HIV-1 mundialmente e é uma importante rota de transmissão do
HIV-1 em países em desenvolvimento. A transmissão de mãe pra filho pode ocorrer de diferentes
formas: durante a gestação, devido o sangue materno contornar dentro da placenta; no momento
do parto quando a mucosa oral do feto é contaminada com secreção cervical e/ou vaginal
contendo o vírus no momento do parto e durante o aleitamento materno. A taxa de transmissão de
mãe pra filho depende também de fatores que afetam a mãe, como a carga viral plasmática do
HIV-1, infecção com outros patógenos sexualmente transmissíveis e uso de drogas intravenosas
(Khare, 2005).
1.3.2 Prevalência
De acordo com dados da UNAIDS em 2011 existiam cerca de 34 milhões de pessoas
infectadas pelo HIV no mundo todo. Estima-se que 0,8% dos adultos com idade entre 15-49 anos
estejam infectados pelo HIV, embora os níveis da epidemia variam, consideravelmente entre os
países e regiões (UNAIDS, 2012).
A África subsaariana permanece mais severamente afetada, com 1 em 20 adultos (4,9%)
vivendo com HIV e contabilizando 69% das pessoas que vivem com HIV no mundo. Embora a
prevalência da infecção pelo HIV seja quase 25 vezes maior na África subsaariana do que na
Ásia, quase 5 milhões de pessoas juntando, sul, sudeste e leste da Ásia estão vivendo com HIV.
Depois da África subsaariana, as regiões mais afetadas são a do Caribe, Leste Europeu e Ásia
central, onde 1,0% dos adultos estavam vivendo com HIV em 2011 (UNAIDS, 2012).
20
Em 2011, houve uma queda, mundialmente, no número de pessoas recentemente
infectadas pelo HIV. Houve uma redução de 20% de casos de pessoas recentemente infectadas
pelo vírus, essa queda foi observada quando foram comparados com os casos do ano de 2001. O
declínio nítido tem ocorrido desde 2001 no Caribe com queda de 42% e na África Subsaariana
com queda de 25% desses casos (UNAIDS, 2012).
Durante a década passada, as epidemias em vários países mudaram drasticamente. Em 39
países, a incidência da infecção pelo HIV entre adultos declinou mais de 25% no período de 2001
a 2011. Vinte e três países com declínio abrupto na incidência do HIV um deles é a África
subsaariana, onde o número de pessoas que adquiriram a infecção pelo HIV em 2011 (1,8
milhões) foi menor em 25% do que em 2001 (2,4 milhões). Apesar desses ganhos, foi relatado na
região da África subsaariana, que em 2011, cerca de 71% de adultos e crianças foram infectados,
ressaltando a importância da continuidade e fortalecimento das campanhas de prevenção do HIV
na região (UNAIDS, 2012).
Em algumas partes do mundo, a tendência da epidemia da infecção pelo HIV (em crianças
e adultos) são causas de interesse. Desde 2001, o número de pessoas recentemente infectadas
pelo HIV no Oriente médio e Norte da África tem aumentado em mais de 35% (de 27.000 para
37.000). Evidências indicam que a incidência da infecção pelo HIV-1 no Europa Oriental e Ásia
central começou a aumentar no final de 2000 e depois permaneceu relativamente estável com
cerca de 1,4 milhões de casos desde o ano 2009 até 2011 (UNAIDS, 2012).
No ano de 2011, cerca de 1,7 milhões de pessoas morreram de causas relacionada a AIDS,
no mundo todo. Isso representa um declínio de 24% da mortalidade quando comparada com o
ano de 2005 em que ocorreu 2,3 milhões de mortes. O número de pessoas que morreram declinou
em 32% na África subsaariana de 2005 a 2011. A região do Caribe (48%) e Oceania (41%)
experiência significativa de declínio de mortes relacionadas a AIDS entre 2005 e 2011. Declínios
mais discretos ocorreram durante o mesmo período na América Latina (10%), na Ásia (4%), na
Europa central e Ocidental e na América do Norte (1%). Em outras regiões, entretanto, houve
21
experiência significativa aumentada na mortalidade da AIDS, Europa Oriental e Ásia central
(21%) e o Oriente Médio e Norte da África (17%) (UNAIDS, 2012).
A epidemia de HIV-1 na América Central e América do Sul tem mudado pouco nos
últimos anos. O número total de pessoas que vivem com HIV-1 continua crescendo numa
estimativa de 1,1 milhões em 2001 para 1,4 milhões em 2009; isso ocorreu principalmente devido
a disponibilidade da terapia antirretroviral. Cerca de um terço dos indivíduos portadores do HIV1 da América Central e América do Sul, vivem no Brasil, onde os esforços para o diagnóstico,
tratamento e prevenção da infecção pelo HIV-1 têm contido a epidemia. No Brasil, a prevalência
do HIV-1 em adultos é de cerca de 1% (UNAIDS, 2010).
No Brasil, os primeiros casos de AIDS foram identificados no início da década de 1980.
Passados 30 anos, o país tem como característica, uma epidemia estável e concentrada em alguns
subgrupos populacionais em situação de vulnerabilidade. De acordo com o último Boletim
Epidemiológico, foram notificados no SINAN (Sistema de Informações de Agravos de
notificação), declarados no SIM (Sistema de Informação sobre mortalidade) e registrados no
SISCEL/SICLOM (Sistema de controle logístico de medicamentos), cerca de 656.701 casos de
AIDS , acumulados no período de 1980 a junho de 2012, sendo 426.459 no sexo masculino e
230.161 no sexo feminino (Boletim Epidemiológico, 2012).
No Brasil, de 1980 a junho de 2012, foram notificados no SINAN, declarados no SIM e
registrados no SISCEL/SICLOM um total de 656.701 casos de AIDS, sendo 367.540 na Região
Sudeste; 130.942 na Região Sul; 88.830 na Região Nordeste; 37.244 na Região Centro-Oeste; e
32.140 na Região Norte (Boletim Epidemiológico, 2012).
No Brasil no ano 2010, do total de 34.218 casos de AIDS notificados no SINAN,
declarados no SIM e registrados no SISCEL/SICLOM, 14.142 (41,3%) foram notificados na
Região Sudeste; 7.888 (23,1%) na Região Sul; 6.702 (19,6%) na Região Nordeste; 3.274 (9,6%)
na Região Norte; e 2.211 (6,5%) na Região Centro-Oeste (Boletim Epidemiológico, 2012).
22
Na Região Norte o maior número de casos de AIDS está no Estado Pará (12.532); no
Nordeste, na Bahia (19.290); na Região Sudeste, em São Paulo (207.077); na Região Sul, no Rio
Grande do Sul (60.512) e na Região Centro-Oeste o maior número de casos está em Goiás
(12.588) (Boletim Epidemiológico, 2012).
A taxa de prevalência da infecção pelo HIV-1, na população brasileira de 15 a 49 anos,
estima-se estável em 0,6% desde 2004, sendo 0,4% entre as mulheres e 0,8% entre os homens
(Szwarcwald et al., 2008). A razão de sexo vem diminuindo ao longo dos anos. A taxa de
incidência para o ano de 1998 era de 25,0/100.000 habitantes em homens e de 12,6 nas mulheres,
enquanto que em 2010 a incidência em homens é de 22,9/100.000 habitantes e de 13,2 nas
mulheres. A razão entre sexos (masculino e feminino), que era de 40 homens para cada mulher
com AIDS no ano de 1983, chega a 1,7 homens para cada caso em mulheres no ano de 2011
(Boletim Epidemiológico, 2012).
Em 2010, a taxa incidência de casos de AIDS no Brasil foi de 17,9/100.000 habitantes,
indicando uma estabilização ao longo desses últimos 12 anos. Segundo as regiões do país,
observa-se uma taxa de incidência de 28,8/100.000 habitantes na Região Sul; 20,6, na Região
Norte; 17,6, na Região Sudeste; 15,7, na Região Centro-Oeste; e 12,6, na Região Nordeste. Na
região Norte, estão destacados os Estados do Amazonas (30,9), de Roraima (35,7) e do Pará
(19,5) considerados acima da média nacional (Boletim Epidemiológico, 2012).
1.4 HISTÓRICO DO VHB
Na década de 1960 Blumberg conseguiu identificar o antígeno de superfície do Vírus da
hepatite B (VHB), que denominou antígeno Austrália (Blumberg et al.,1965), o qual passou a ser
denominado posteriormente de Antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e a utilização desse
antígeno como marcador da infecção pelo VHB foi um fato que contribuiu, de forma marcante,
para o conhecimento epidemiológico das hepatites (Blumberg, 1995).
Em 1970, Dane conseguiu identificar as partículas do VHB no soro de um paciente (Dane
et al.,1970).
23
1.5 BIOLOGIA DO VHB
O Vírus da hepatite B (VHB) é um vírus de ácido desoxiribonucléico (DNA) e pertence à
família Hepadnaviridae, gênero Orthohepadnavirus, cujos membros são caracterizados por
acentuado tropismo pelos hepatócitos (ICTV, 2008).
O vírus completo do VHB (ou partícula de Dane) é uma partícula esférica de 42 nm de
diâmetro, consistindo de um capsídeo icosaédrico com cerca de 30nm de diâmetro. O vírus
contém o DNA de dupla fita parcialmente circular de cerca de 3,2 kb de comprimento, o qual é
covalentemente ligado a transcriptase reversa viral. O nucleocapsídeo é cercado por uma
bicamada lipídica, na qual se encontram três proteínas do envelope (pequena, média e grande)
que estão ancoradas como proteínas transmembrana fazendo o maior papel na morfogênese e
infectividade do VHB (Bruss, 2007).
Na superfície do envelope VHB existem três antígenos distintos associados com a
infecção: HBsAg (Antígeno de superfície),(grande, médio e pequeno). O HBcAg (antígeno do
core ou capsídeo viral) e o HBeAg (proteína viral solúvel encontrada no soro), que fazem parte
do nucleocapsídeo do VHB. O HBsAg é produzido em excesso durante a infecção pelo VHB e
pode ser rapidamente detectado no soro de pacientes com infecção aguda ou crônica. Os
anticorpos para o HBsAg (anti-HBs) são protetores e sua produção pode ser induzida por vacina.
Anticorpos para o HBcAg (anti-HBc Total) indica exposição passada ao VHB, porém esses
anticorpos não conferem imunidade contra o VHB. A presença do HBeAg no soro representa alta
atividade da infecção, enquanto que os anticorpos para o HBeAg indicam replicação ativa do
VHB (Seow, 1999) (Figura 4).
24
Figura 4- Morfologia do Vírus da hepatite B (Adaptado de http:// www.rit.edu/~japfaa/hbv.jpg).
1.5.1Replicação do VHB
Os eventos iniciais do ciclo de replicação do VHB, incluindo entrada, desnudamento e
distribuição do genoma viral dentro do núcleo da célula hospedeira, não são bem entendidos,
devido à ausência de linhagens de células que sejam suscetíveis à infecção pelos hepadnavírus
(Seeger & Mason, 2000).
O vírus completo contém no interior do capsídeo o genoma que é formado por DNA de
fita dupla, parcialmente circular, mas não fechada covalentemente, de cerca de 3,2 kb de
comprimento (Circular relaxado, ou RC-DNA), o RC-DNA é convertido, dentro do núcleo da
célula hospedeira, em DNA circular fechado covalentemente (ccc DNA) (Beck & Nasssal, 2007).
O cccDNA é o molde para transcrição do RNA mensageiro (RNAm) viral, essa formação
indica que a infecção é completa. A conversão do genoma de DNA incompleto para cccDNA nos
25
hepatócitos é detectada nas primeiras 24 horas após a inoculação do vírus (Seeger & Mason,
2000).
O cccDNA age como molde para a transcrição de todos os RNAm virais, que são
transcritos pela RNA polimerase II, os quais contêm RNA pré-genômico (RNApg) cerca de 3,5
kb de comprimento, e faz a transcrição também de diferentes RNA genômicos codificando todas
as proteínas virais necessárias para o ciclo de replicação do VHB (Beck & Nassal, 2007).
No citoplasma, uma única molécula de RNApg junto com a transcriptase reversa viral é
incorporada em uma montagem do capsídeo. Uma vez que o RNApg é encapsidado, ocorre a
transcrição reversa em um novo DNA genômico (Beck & Nassal, 2007).
Após o término da síntese do DNA genômico viral, ocorre uma ligação do domínio Nterminal do core ao polipeptídio grande do envelope que resulta no brotamento da partícula do
core através da membrana do retículo endoplasmático. A partícula viral é envelopada contendo
todas as três proteínas do envelope, sendo então, transportadas através do retículo
endoplasmático, para dentro do complexo de Golgi. Após sair do complexo de Golgi a partícula
viral é transportada por vesículas para a membrana da célula hospedeira e o processo de
montagem é completado com a secreção do vírus completo e infeccioso, para a corrente
sanguínea (Seeger & Mason, 2000) (Figura 5).
26
Figura 5- Replicação do VHB (Adaptado de http://www.infekt.ch/updown/images/hbv-cycl.gif).
O genoma do VHB tem uma estrutura compacta, uma fita dupla de DNA circular de
aproximadamente 3,2 kb, que codifica quatro sequências de leitura aberta (ORF) sobrepostas:
genes de superfície (S), core (C), polimerase (P) e X, respectivamente. O gene S possui três
diferentes códons de iniciação e, além disso, três regiões gênicas, denominadas pré-S1, pré-S2 e
S, e três produtos do gene, denominado HBsAg grande, médio e pequeno. As proteínas
denominadas de grande e média parecem ser mais imunogênicas do que a pequena e elas têm um
papel importante no ciclo de replicação, adsorção e montagem do vírus e também na imunidade à
infecção. O gene C codifica a proteína do nucleocapsídeo e produz HBcAg e HBeAg. O gene P
codifica a proteína P, a qual serve como função de transcriptase reversa devido à replicação do
VHB requerem moléculas de RNA que funcionam com intermediários para a produção do DNA.
O gene X codifica duas proteínas que servem como transativadores de transcrição, acrescentados
a replicação viral (Huy & Abe, 2004) (Figura 6).
27
Figura 6- Organização genômica do Vírus da hepatite B (Adaptado de: Beck & Nassal, 2007).
1.6 EPIDEMIOLOGIA DO VHB
A transmissão do VHB ocorre pelas rotas parenteral, sexual e vertical. As fontes do VHB
incluem sangue, secreção vaginal e sêmen (Seow, 1999).
O VHB é transmitido pela exposição da membrana mucosa e percutânea ao sangue
contaminado e fluidos corpóreos que tenham sangue (Alter, 2003). A exposição percutânea que
tem resultado na transmissão do VHB inclui transfusão de sangue ou hemoderivados, uso de
drogas injetáveis e lesões causadas por acidentes de agulha e seringa entre os profissionais da
área da saúde. Além disso, a epidemia ocasional do VHB tem sido associada com acupuntura e
tatuagens (Alter, 2006).
A exposição sexual e perinatal ao VHB também são eficientes modos de transmissão e a
propagação do VHB de pessoa a pessoa, que pode ocorrer entre contactantes familiares de uma
pessoa cronicamente infectada, essa propagação ocorre provavelmente pelo contato com fluidos
28
corpóreos contendo sangue, por meio de uma pele ou membrana de mucosas não intactas (Alter,
2006).
A transmissão do VHB via transfusão de sangue ou transplante de órgãos tem sido
praticamente eliminada em países que testam os seus doadores e produtos derivados de plasma
para HBsAg (Busch et al., 2003).
A transmissão do VHB para neonatos pode ser prevenida pela vacinação e profilaxia com
a imunoglobulina para hepatite B. Apesar da vacinação, a infecção pelo VHB ainda ocorre em
cerca de 10-15% das crianças nascidas, as quais tornam-se portadoras crônicas (Seow, 1999).
1.6.2 Prevalência
No mundo, estima-se que mais de 2 bilhões de pessoas foram infectadas pelo VHB.
Dessas infectadas, aproximadamente, 360 milhões são HBsAg positivo, ou seja são cronicamente
infectadas, carregam o vírus e com risco de desenvolver doença e morte por cirrose e carcinoma
hepatocelular (WHO, 2009).
A infecção pelo VHB é considerada alta onde a prevalência do HBsAg é superior a 7% ou
a população evidencia infecção passada (Anti- HBc IgG positivo) em taxa superior a 60%. São
considerados locais de endemicidade intermediária, aqueles onde a prevalência de infecção se
situa entre 20 e 60% (Anti-HBc IgG positivo) e o HBsAg presente entre 2 e 7% da população. As
áreas com HBsAg < 2,0% são definidas como de baixa prevalência (CDC, 1991).
A endemicidade da infecção é alta naquelas partes do mundo onde a maioria das infecções
ocorre durante o período perinatal ou no início da infância (por exemplo, no Sudeste da Ásia e na
África subsaariana). No mínimo, 8% da população dessas áreas estão infectadas cronicamente e
70-90% tem evidência sorológica de infecção passada pelo VHB (Alter, 2006).
Em áreas do mundo com uma endemicidade intermediária da infecção pelo VHB (por
exemplo, no Leste europeu, no Oriente médio e na Rússia), existem padrões mistos de
transmissão: adulta, no início da infância, e durante toda a infância. A prevalência da infecção
29
crônica varia de 1 a 7% da população e evidências sorológicas de infecção passada variam de 10
a 60% (Alter, 2006).
Nas partes mais desenvolvidas do mundo (por exemplo, na Europa Ocidental, na Austrália
e nos Estados Unidos da América), a endemicidade da infecção pelo VHB é baixa e a maioria das
infecções ocorre entre a população adulta de alto risco, que inclui usuários de drogas injetáveis,
pessoas com múltiplos parceiros e homens que fazem sexo com homens (MSM). A prevalência
da infecção crônica é menor que 1% e a taxa de infecção total é de 5-7% (Alter, 2006).
No Brasil, de acordo com dados do Boletim Epidemiológico de Hepatites Virais do
Ministério da saúde, em relação aos casos confirmados de infecção pelo VHB, no período de
1999 a 2011, foram notificados 120.343 casos. A Região Sudeste concentra 36,3% dos casos
seguida pela Região Sul, com 31,6% das notificações. A partir de 1999 observa-se aumento
gradual da taxa de detecção de casos de infecção pelo VHB, atingindo 6,5 casos por 100.000
habitantes em 2005 e mantendo-se estável com algumas oscilações entre 2005 e 2010 em torno
de 6,9 casos por 100.000 habitantes. Em 2010, entre as regiões, a Região Sul apresentou a maior
taxa de detecção de 14,3 casos, seguida da Região Norte com 11,0 casos, enquanto a Região
Nordeste apresenta a menor taxa de detecção entre as regiões com 2,5 casos (Boletim
Epidemiológico Hepatites Virais, 2012).
No período de 1999 a 2011, observa-se que a maioria dos casos notificados de infecção
pelo VHB ocorrem em indivíduos do sexo masculino com 65.209 casos (54,2%) e no sexo
feminino foram notificados 55.110 casos (45,8%). A razão dos sexos (Masculino: Feminino) ao
longo dos anos reduziu de 1,9 em 1999 para 1,2 em 2010. Em 2010, a taxa de detecção por
100.000 habitantes entre homens foi de 7,6, enquanto entre mulheres foi de 6,2 (Boletim
Em relação a distribuição por faixa etária, em 2010, observou-se a maior taxa de detecção
ocorreu na faixa etária de 35 a 39 anos, sendo de 11,4 casos por 100.000 habitantes, seguida pelas
faixas de 40 a 44 anos com 11,3, de 45 a 49 anos com 11,3 e de 30 a 34 anos foi 10,8 casos.
Ainda em 2010, observou-se que a taxa de detecção de casos de hepatites B foi maior no sexo
30
feminino entre os 15 e os 29 anos de idade, e maior no sexo masculino em menores de 10 e após
os 30 anos (Boletim Epidemiológico Hepatites Virais, 2012).
No Brasil em 2010, com relação à taxa de detecção segundo Estado, constatou-se que o
Estado Acre é o que apresentou a maior taxa de detecção por 100.000 habitantes com 56,8 de
casos, seguido do Estado de Rondônia com 22,1 casos, enquanto o Estado do Piauí apresentou a
menor taxa de detecção com 1,0 casos (Boletim Epidemiológico Hepatites Virais, 2012).
1.6.3 Epidemiologia molecular do VHB
O Vírus da hepatite B é classificado em dez genótipos denominados de A à J, baseado em
uma divergência intergrupo de 8% (Okamoto et al., 1988; Norder et al., 1992; Stuyver et al.,
2000; Arauz-Ruiz et al., 2002; Olinger et al., 2008; Tatematsu et al.,2009).
A variação dos genótipos do VHB é refletida na sequência parcial do genoma do VHB,
por exemplo no gene S ou pré-S. Como resultado, é possível fazer a genotipagem do VHB sem
determinar a sequência completa do genoma do vírus. Como a sequência do gene S é mais
conservada que a da região pré-S, a análise do gene S é muito mais apropriada para genotipagem
(Mahtab et al., 2008).
A prevalência dos genótipos específicos varia geograficamente. O genótipo A é mais
prevalente na América do Norte, Europa, África do Sul e Índia; os genótipos B e C são
prevalentes na Ásia; O genótipo C é encontrado principalmente no extremo oriente da Ásia,
incluindo no Japão, Coréia, China (regiões do norte e central), e no Vietnam (Tran et al., 2003),
bem como nas ilhas do Pacífico. O genótipo D é prevalente na Europa (área do mediterrâneo),
oriente médio, extremo oriente, Índia e África do Sul; o genótipo E é prevalente na parte leste da
África, o genótipo F é prevalente nas Américas Sul e Central e Alasca, e genótipo G é prevalente
na Europa, México e EUA. O genótipo H foi relatado na América Central, EUA e Japão (ArauzRuiz et al., 2002; Kato et al., 2004; Ohnuma et al., 2005). O genótipo I foi encontrado em Laos,
Sudeste da Ásia (Olinger et al.,2008) e o genótipo J foi encontrado em um paciente Japonês de
88 anos com carcinoma hepatocelular e que viveu em Bornéu (ilha localizada na Ásia) durante a
segunda guerra mundial (Tatematsu et al.,2009).
31
Os genótipos A, B, C, D e F já foram descritos no Brasil (Sitnik et al., 2004). No Brasil,
os genótipos A, D e F são os mais prevalentes, e uma distribuição similar desses genótipos tem
sido observada tanto em indivíduos infectados pelo HIV-1 quanto não infectados pelo HIV1(Moraes et al., 1996, Araújo et al., 2004).
A severidade da doença tem sido influenciada por fatores virais (incluindo o genótipo),
hospedeiro e meio ambiente (Liu & Kao, 2006; Girlanda et al., 2004). A incidência do
hepatocarcinoma celular é influenciada por genótipo do VHB, níveis de DNA do VHB, sexo,
idade, mutações na região pré-core A1896 e core T1762/A1764 (Liu et al.,2006).
Além disso, certos genótipos estão correlacionados com a severidade da doença do fígado.
O genótipo C do VHB foi encontrado ter uma relação causal com o carcinoma hepatocelular
(Huy & Abe, 2004).
O genótipo D é também conhecido por ser frequentemente associado com mutantes précore, o qual aumenta o risco de evolução para cirrose e carcinoma hepatocelular (Bahri, 2006).
Os genótipos também influenciam na taxa de soroconversão do HBeAg, padrões de
mutação nas região do pré-core e promotora do core, e a severidade da doença hepática. A
heterogeneidade na manifestação da doença e respostas ao tratamento antiviral entre os
indivíduos portadores crônicos do VHB em diferentes partes do mundo pode também ser
atribuída em parte aos genótipos do VHB. A maior parte das informações é baseada em estudos
em indivíduos asiáticos portadores crônicos para hepatite B (Mahtab et al., 2008).
Os EUA e o Food and Drug Administration (FDA) aprovaram seis drogas para o
tratamento da infecção pelo VHB, denominadas de interferon alfa (IFN-α), IFN- α pegilado,
Lamivudina (LAM), adenofovir (ADV), entecavir e telbivudina (Valsamakis, 2007).
O genótipo C está associado com o desenvolvimento rápido de fibrose, alta taxa de
desenvolvimento de HCC, recorrência e metástase comparado ao genótipo B. O genótipo D pode
32
estar associado com doença hepática mais severa comparado aos genótipos A e F e está ligado a
altas taxas de mortalidade. Embora os genótipos do VHB não influenciem significantemente a
resposta a terapia antiviral nucleotídica, a capacidade de resposta ao IFN é afetada claramente
pelo genótipo. Indivíduos HBeAg positivo infectados com o genótipo B respondem melhor
comparado o genótipo C, e genótipo A responde melhor que o genótipo D, especialmente durante
a terapia de curto prazo. O genótipo A também responde bem ao IFN pegilado (Guirgis et
al.,2010).
1.6.4 Coinfecção VHB e HIV-1
A infecção pelo HIV-1 parece influenciar a história natural das infecções pelas hepatites
virais. A interação entre o HIV-1 e as infecções com as hepatites virais pode alterar a história
natural e a resposta ao tratamento de ambas as doenças e também podem potencializar a
replicação do HIV-1. A coinfecção do HIV-1 com o VHB é conhecida por resultar em alta carga
viral do VHB e grande danos ao fígado (Carron & Thyagarajan, 1998).
A presença do VHB no portador do HIV-1 reveste-se de importância clínica, na medida
que a ocorrência de tal coinfecção parece favorecer um pior prognóstico para o paciente, bem
como interferir nos resultados da terapêutica aplicada (Souza et al., 2004).
A progressão, relativamente rápida, de doenças hepáticas relacionadas ao VHB, tem sido
descrita em indivíduos infectados pelo HIV-1 (Thio et al., 2002). Indivíduos coinfectados HIV1/VHB, especialmente aqueles com baixo número de linfócitos T CD4+, possuem maior risco de
mortalidade associada à doença hepática, principalmente se estiverem fazendo uso da HAART
(Terapia antirretroviral altamente ativa) (Thio et al., 2002).
Entre as 40 milhões de pessoas estimadas infectadas pelo HIV-1, uma estimativa de 2-4
milhões estão cronicamente infectadas pelo VHB; vários fatores influenciam as estimativas
dessas coinfecções, incluindo diferenças geográficas na prevalência da infecção crônica pela
idade, a eficiência da exposição que relatam para a maioria das transmissões e a prevalência de
pessoas de alto risco para adquirir a infecção pelo VHB (Alter, 2006).
33
O VHB e o HIV-1 compartilham rotas comuns de transmissão, tais como parenteral,
sexual e vertical, mas eles diferem na eficiência pela quais certos tipos de exposição e também
diferem na prevalência nas regiões geográficas (Alter, 2006).
A África subsaariana relata a maioria dos casos de infecção pelo HIV-1 no mundo (65%),
sendo que a transmissão heterossexual que é responsável pela maior parte dessas infecções e tem
uma alta prevalência de infecção crônica pelo VHB por causa dos padrões de transmissão
perinatal e no início da infância (Alter, 2006).
As infecções pelo VHB adquiridas na faixa etária jovem são mais prováveis de progredir
para infecção crônica, resultando em alta prevalência de infecção crônica pelo VHB entre a
população em geral de adolescentes e adultos, com alto risco para adquirir o HIV por transmissão
sexual (Alter, 2006).
Diferente do que acontece em países desenvolvidos, onde uma pequena proporção de
infecção pelo VHB mundialmente são relatadas, pois a infecções são adquiridas por adultos
ocorrem por transmissão sexual (e uso de drogas injetáveis), essas vias de transmissão que são
responsáveis pelos casos de coinfecção pelo HIV-1 e VHB nos países desenvolvidos (Alter,
2006).
Na Espanha, em estudo conduzido em indivíduos coinfectados HIV-1/VHB, os genótipos
A e D do VHB foram encontrados em torno de 43,5% cada. Outros genótipos como o genótipo
G, F, E e um misto dos genótipos A/F e A/E, foram encontrados em menor percentagem
(próximo de 10%). O genótipo A foi a variante predominante em pessoas infectadas através de
relações sexuais, principalmente, em homens homossexuais, enquanto que o genótipo D foi mais
prevalente entre usuários de drogas intravenosas (Ramos et al., 2007).
Na Europa, em indivíduos coinfectados HIV-1/VHB a distribuição dos genótipos do VHB
foi a seguinte A (72,9%), D (17,1%), G (1,8%), E (1,2%), F (1,2%) e C (0,6%); os outros 5,9%
foram coinfectados com múltiplos genótipos do VHB (5 A/D, 3A/G, 1 A/D/G) (Soriano et al.,
2010).
34
Na França, em uma população de coinfectados HIV-1/VHB, a análise do genoma do VHB
mostrou que as cepas do genótipo A predominaram e que o genótipo G estava presente em 25
indivíduos (12,1% de todos os genótipos). O genótipo G do VHB é um determinante de fibrose
hepática em indivíduos coinfectados HIV-1/VHB e a genotipagem do VHB pode ser considerada
como uma parte de direcionamento de indivíduos com múltiplos fatores de risco para progressão
rápida de fibrose hepática (Lacombe et al., 2006).
No Brasil, a informação em relação à coinfecção HIV-1/VHB passou a ser coletada em
2007. A presença dessa coinfecção no período de 2007 a 2010 foi de 5,4% (Boletim
Em 2010, a prevalência da coinfecção HIV-1/VHB foi de 5,5%. Em relação às faixas
etárias, as maiores taxas de detecção dessa coinfecção foram observadas na faixa etária entre 40 e
44 anos de idade com 1,14 casos e entre 35 a 39 anos com 0,94 casos (Boletim Epidemiológico
Hepatites Virais, 2012).
No Brasil, em uma população de coinfectados HIV-1/VHB do Estado de São Paulo, a
distribuição dos genótipos do VHB foi: A (12,75%), G (2,13%), D (1,6%) e F (1,6%). Os dados
da sequência de dois indivíduos infectados com o genótipo G sugeriram fortemente coinfecção
com o genótipo A. O genótipo G é raramente visto no Brasil, mas foi observado no grupo de
indivíduos do estudo (Silva et al., 2010).
1.7 HISTÓRICO DO VHC
Em 1989, Choo e seus colaboradores, tiveram êxito por meio de técnicas de biologia
molecular, em realizar a clonagem do genoma de um dos tipos de vírus associados a 80-90% dos
quadros de hepatite não-A, não-B, e que recebeu, posteriormente, a denominação de Vírus da
hepatite C (VHC) (Choo et al., 1989).
1.8 BIOLOGIA DO VHC
O Vírus da hepatite C (VHC) é um vírus com genoma de ácido ribonucléico (RNA),
pertencente a família Flaviviridae, gênero Hepacivirus (ICTV, 2008).
35
A estrutura do VHC não é visualizada e permanece ainda a ser elucidada. Estima-se que
as partículas do VHC possuem entre 40-70 nm de diâmetro (Watika et al.,2005). A proteína do
core e as glicoproteínas do envelope E1 e E2 são os principais componentes do vírus. E1 e E2
estão provavelmente ancorados no envelope lipídico que é derivado da membrana da célula
hospedeira, o qual envolve o nucleocapsídeo que é composto de múltiplas cópias da proteína do
core e o RNA genômico (André et al., 2005).
O VHC circula em várias formas no hospedeiro infectado e pode estar associado com
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL), e
também circula como vírus livres (André et al., 2005).
Figura
7-
Representação
esquemática
da
morfologia
do
VHC
(Adaptado
de:www.medars.it/galleris/virus)
O genoma do VHC é formado por RNA de fita simples e polaridade positiva; possui
tamanho de aproximadamente 9,6 Kb que codifica uma sequência de leitura aberta (ORF) que é
flanqueada por regiões não codificantes denominadas de 5’ e 3’ (NTR) (Choo et al., 1991). Essa
ORF codifica uma poliproteína de aproximadamente 3.000 aminoácidos que é processada pelas
proteases virais e celulares em no mínimo 10 proteínas (Grakoui et al., 1993; Hijikata et al.,1993;
McLauchlan et al., 2002) (Figura 8).
36
A região 5’ NTR é altamente conservada entre os diferentes isolados do VHC e contém
regiões ditas de entrada interna ribosomal (IRES- internal ribosome entry) que permitem a
tradução do genoma de RNA na ausência da estrutura Cap 7-metilguanosina. A poliproteína
resultante é clivada em dez diferentes produtos que são as: proteína do core (C), glicoproteínas do
envelope E1 e E2, p7, e as proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B
(Moradpour et al., 2007).
As proteínas p7 e NS2 estão primariamente envolvidas na montagem do VHC sendo que
p7 acaba participando da estrutura viral (Jones et al., 2007; Steinmann, et al., 2007; Jirasko et al.,
2008). NS2 forma uma cisteína-protease dimérica mediando a clivagem na junção NS2-NS3
(Lorenz et al., 2006). NS3 contém no domínio N-terminal uma protease do tipo serina que é
ativada pela interação estável com NS4A. O domínio C terminal de NS3 contém atividades de
helicase e NTPase provavelmente requerida para a replicação do RNA. NS4B pode desencadear a
formação de estrutura vesicular membranosa designada de tecido membranoso que poderia servir
com o suporte para a montagem do complexo de replicação viral. NS5A é uma fosfoproteína de
ligação de RNA que tem um papel importante para a replicação do RNA, mas tem também
função na montagem do vírus. NS5B possui uma atividade de RNA polimerase dependente de
RNA (Tellinghuisen et al., 2007; Tellinghuisen et al., 2008; Appel et al., 2008; Masaki et al.,
2008).
Muitas se não todas as proteínas do VHC são multifuncionais e contribuem para a
replicação viral e patogênese em vários aspectos. Por exemplo, a protease NS3/NS4A cliva tanto
a poliproteína viral e as moléculas necessárias para indução de uma resposta do interferon
(Meylan et al., 2005; Li et al., 2005). A proteína do core inibe a proteína de transferência de
triglicerídeos microssomal, a qual é requerida a formação de lipoproteínas de muito baixa
densidade (VLDL) e a inibição desta enzima pode contribuir para a esteatose hepática
(Perlemuter et al.,2002). NS5A regula a replicação de RNA e a montagem provavelmente via
ligação de múltiplos fatores da célula do hospedeiro, tais interações provavelmente também
contribuem para a patogênese viral (Tellinghuisen et al., 2002).
37
Proteínas estruturais
5’ NTR C
E1
E2
Proteínas não estruturais
p7 NS2 NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B
3’ NTR
Figura 8- Organização genômica do VHC (Adaptado de Grakoui et al., 1993).
1.8.1Replicação do VHC
O VHC usa várias proteínas do hospedeiro para entrar na célula alvo, o hepatócito
humano, mas a infecção de células B, células dendríticas e outros tipos de células têm sido
reportados; o conjunto mínimo de fatores de absorção de células específica inclui CD81 (Pileri et
al., 1998), receptor scavenger classe B tipo 1 (SCARB1) (Scarselli et al., 2002) e moléculas da
junção estrita Claudin-1(CLDN1) (Evans et al., 2007) e Occludin (OCLN) (Liu et al., 2009;
Ploss et al., 2009).
A internalização do VHC na célula é feita por endocitose com passagem através de um
compartimento endossomal de baixo pH (Blanchard et al., 2006). Após essa internalização, as
membranas celulares e virais são provavelmente fundidas no compartimento ácido e ocorre o
desnudamento em que o genoma do vírus é liberado para o citoplasma e se dá o início da
tradução que ocorre através da formação de um complexo binário entre a IRES (Local de entrada
interna ribossomal) e a subunidade 40S ribossomal. A tradução da ORF do VHC produz uma
poliproteína que é clivada por proteases virais e celulares no retículo endoplasmático rugoso e
assim originando as proteínas estruturais e não estruturais (Moradpour et al., 2007).
Durante o processamento da poliproteína, as proteínas do VHC são vistas estarem
associadas com uma “membranous web” que se desenvolve dentro do citoplasma e inclui uma
vesícula de dupla membrana contendo proteínas não estruturais (NS3, NS4A, NS4B, N5A e
NS5B), membranas do retículo endoplasmático, partículas lipídicas e tem sido mostrado ser o
lugar de síntese ativa de RNA em células abrigando os replicons de RNA do VHC (Alvisi et
al.,2011; Egger et al.,2002; Gosert et al.,2003; Moradpour et al., 2003). As proteínas estruturais,
C e E2 estão também presentes. Interações múltiplas entre as proteínas não estruturais virais e
várias membranas da célula hospedeira provavelmente guiam a montagem deste complexo e
38
regulam essa atividade. NS4B tem um papel central induzindo essa estrutura e interage
especificamente com lipídeos detergente-resistente (Elazar et al.,2004, Gao et al., 2004).
A replicação do VHC pode ocorrer nesses locais citados e começa com a síntese de uma
fita de RNA complementar negativa a partir do RNA genômico, o qual irá servir para a formação
de mRNA (Lemon et al., 2005), depois o RNA genômico de polaridade positiva é produzido a
partir de uma fita molde de RNA de polaridade negativa, ambos os passos são catalisados pela
NS5B RNA polimerase dependente de RNA. As progênies de fitas de RNA de polaridade
positiva são transcritas em nível de 5 a 10 vezes mais do que a fita de RNA de polaridade
negativa. A proteína recombinante NS5B demonstra atividade RNA polimerase dependente de
RNA in vitro, entretanto, parece carecer de fidelidade e especificidade estrita, os quais são
componentes essenciais para a síntese de RNA viral (Suzuki et al., 2007).
Pouco é conhecido a respeito das etapas tardias do ciclo de vida viral: empacotamento,
montagem e liberação da partícula do VHC. NS2 e possivelmente outras proteínas não
estruturais, estão envolvidas nesse processo. Os vírus provavelmente são formados por
brotamento dentro do retículo endoplasmático, ou compartimento derivado do retículo
endoplasmático, e a saída do vírus ocorre através da via secretória. Uma possível ligação entre o
metabolismo lipoprotéico e montagem viral e liberação tem sido proposta (André et al.,2005)
(Figura 9).
39
Figura 9- Replicação do VHC (Adaptado de Ploss & Rice, 2009).
1.9 EPIDEMIOLOGIA DO VHC
A transfusão sanguínea (antes de 1992), o uso de drogas injetáveis e injeções terapêuticas
não seguras, têm sido consideradas as mais importantes rotas de transmissão do VHC; entretanto,
existem diferenças geográficas na extensão de que esses fatores de risco têm contribuído para a
transmissão do VHC (Alter, 2006).
Os fatores de riscos associados com a aquisição da infecção pelo VHC incluem transfusão
de sangue e hemoderivados, transplante de órgãos sólidos de doadores infectados, uso de drogas
endovenosas ilícitas, injeções terapêuticas não seguras, exposição ocupacional ao sangue
(primariamente agulhas e seringas contaminadas), crianças nascidas de mães infectadas, sexo
com parceiro infectado e sexo com múltiplos parceiros (Alter, 2002).
40
A principal rota de transmissão do VHC é parenteral, logo 90% dos usuários de drogas
intravenosa são de alto risco de contrair a infecção pelo VHC assim como os indivíduos que
requerem múltiplas transfusões de sangue e produtos hemoderivados (hemofílicos) ou os que se
submetem a cirurgias (Kiyosawa et al.,1991; Khokhar et al., 2004).
A introdução da rotina triagem de sangue doado teve virtualmente a transmissão do VHC
eliminada por transfusão sanguínea (Donahue et al.,1992). Os métodos de triagem anti-VHC no
final de 1980 e início de 1990, bem como a introdução recente de testes de RNA VHC
melhoraram significantemente a segurança dos hemoderivados (Esteban et al., 2008).
O uso de drogas ilícitas injetáveis é considerado a principal fonte de infecção do VHC na
maioria dos países desenvolvidos (Estados Unidos e Europa ocidental) e
também está se
tornando a maior fonte de infecção em países de economias em transição e em desenvolvimento,
sendo que o uso de drogas ilícitas injetáveis tem sido responsável por 40% dos casos de
infecção pelo VHC (Wasley & Alter, 2000).
A transmissão sexual do VHC envolve uma variedade ampla da questão que poderia ser
considerada. Entre essas questões está o numero de parceiros sexuais (Clarke & Kulasegaram,
2006). Os números reportados da transmissão sexual do VHC variam consideravelmente e ficam
entre 0 e 27%. Entretanto, a maioria dos estudos menciona taxas que variam entre 0 e 3%
(Nakashima et al., 1995; Dienstag, 1997; Tanaka et al., 1997; Rosenberg,1999; Zylberberg et al.,
1999; Gross, 2001; Gunn et al., 2001; Marincovich et al.,2003; Tahan et al., 2005; Minola et al.,
2006; Memon & Memon, 2007).
Outra questão a respeito da transmissão sexual do VHC é a presença do vírus em
secreções, saliva (Fabris et al., 1999; Ferreiro et al., 2005), sêmen (Cassuto et al., 2002,
Nyamathi et al., 2002) e sangue de menstruação (Silverman et al., 1994). Tem sido proposto se a
via da transmissão sexual do VHC ocorre mais de homem para mulher ou de mulher para
homem. O VHC pode ser isolado do sêmen e da secreção vaginal, entretanto, existe um grande
potencial para a transmissão de homem para mulher. Certamente, o trauma na mucosa durante a
41
relação sexual aumenta o risco de transmissão viral, assim como os altos níveis de viremia e PCR
positivo para o sêmen (Terrault, 2002).
A transmissão sexual do VHC acontece, embora com eficiência muito mais baixa do que
em outros vírus como o VHB ou HIV. Além disso, fatores como coinfecção com HIV e uma
associação com doenças sexualmente transmissíveis, e também o tipo de atividade sexual pode
aumentar a eficiência da transmissão do VHC por via sexual (Cavalheiro, 2007).
Quase 5% das infecções pelo VHC são causadas por lesão com seringa e agulha
(Kiyosawa et al.,1991). De 3% a 5% dos bebês adquirem VHC das mães infectadas pela
transmissão perinatal (Papanastasiou et al., 1997).
O risco de transmissão perinatal do VHC é muito baixa, embora exista evidência
indicando que o risco é aumentado pela alta carga viral materna ou se a mãe está coinfectada com
HIV. O risco para criança de amamentação é insignificante e a transmissão não sexual
intrafamiliar é muito rara (Stoszek et al., 2006).
O VHC está presente na saliva, no leite, mas a transferência da infecção do VHC através
do aleitamento materno não tem sido reportada (Ogasawara et al.,1993; Ohto et al.,1994).
1.9.2 Prevalência
Os dados disponíveis sugerem que a prevalência da infecção pelo VHC é
aproximadamente de 2,2 a 3% mundialmente (130-170 milhões de pessoas). Enquanto que a
prevalência em regiões diferentes ou países têm sofrido algumas mudanças desde a primeira
estimativa feito pelo OMS em 1997, o mapa ainda é similar, com alta prevalência de infecção
pelo VHC encontrada na região africana e mediterrâneo oriental (WHO, 2000; Shepard et
al.,2005) (Figura 10).
42
Figura 10- Distribuição da prevalência do VHC no mundo (Adaptado de: Lavanchy, 2008).
A prevalência da infecção pelo VHC apresenta diferenças geográficas que podem ser
descritas baseadas nas prevalências regionais como alta (prevalência > 3%), moderada
(prevalência 2-2,9%), baixa (prevalência 1,0-1,9%) e muito baixa (prevalência < 1,0%) (Wasley
& Alter, 2000).
Altas prevalências da infecção tem sido relatada no Norte da África (particularmente no
Egito); prevalências moderadas têm sido encontradas no leste europeu e na maior parte da Ásia;
baixas prevalências foram descritas na parte ocidental da Europa, América do Norte e Sul, e
Austrália e prevalências muito baixas, na parte norte da Europa e no Reino Unido (Alter, 2006).
A incidência do VHC é alta em regiões subdesenvolvidas ou em desenvolvimento,
chegando cerca de 4 a 6% em algumas comunidades africanas e no Oriente Médio (Shepard et
al., 2005). A doença hepática causada pelo VHC é predominantemente crônica nas Américas
com prevalência estimada em 1,5% (WHO, 2009; Brandão et al., 2001).
De acordo com a OMS, a prevalência do VHC na Europa é estimada ser
aproximadamente 1% (Esteban et al., 2008). Comparada com outras áreas geográficas do mundo
é relativamente baixa (Sy & Jamal, 2006). Dados disponíveis da Europa indicam uma ampla
43
variação na prevalência do VHC entre os países variando de 0,1 a 6%. As menores prevalências
do VHC (<0,5%) estimadas são de países escandinavos, Áustria e países baixos e a maior (>3%)
da Bulgária, Grécia, Itália e Romênia (Esteban et al., 2008).
Na América do Norte a prevalência do VHC está em cerca de 1% (Sherman et al.,2007;
Sy & Jamal, 2006). Na África do Norte e Países árabes a prevalência do VHC foi entre 1,4% e
2,1% em certos países como Líbia, Tunísia e Arábia Saudita, apesar da prevalência ter sido alta
no Egito chegou até 19,3% (Daw et al., 2002; Pybus et al., 2003).
Depois da erradicação de infecções relacionadas a transfusão, o uso de drogas intravenosa
é considerado com a principal causa de transmissão do VHC na maioria dos países europeus, com
taxas de prevalência entre usuários de drogas intravenosa (UDI) variando de 15% a 90% (Esteban
et al., 2008).
É estimado que a infecção crônica pelo VHC seja responsável por aproximadamente
250.000 a 350.000 mortes por ano, principalmente, relacionadas com descompensação hepática
por cirrose, estágio final da doença hepática e carcinoma hepatocelular (Chevaliez & Pawlotksy,
2007).
Aproximadamente 15-25% das infecções pelo VHC progridem para doença hepática
grave, a qual pode levar mais de 30 anos para se desenvolver (Alter & Seeff, 2000; Lauer &
Walker, 2001).
Em muitos países, as taxas de transmissão diminuíram substancialmente com a introdução
da rotina de triagem sanguínea em 1991. Entretanto, devido a progressão lenta da doença, muitos
pacientes infectados anteriormente a 1990, contaminados via hemoderivados ainda estão no risco
de progredir para doença severa hepática no futuro (WHO,1999; WHO, 2001; Wong, 2006).
No Brasil, é estimado que 1,38% da população esteja infectada pelo VHC e constatou-se
que a endemicidade da infecção pelo VHC é baixa, diferente dos parâmetros da OMS, que
44
considera o país como de intermediária endemicidade (Boletim Epidemiológico Hepatites Virais,
2011).
No Brasil, de acordo com dados do Boletim Epidemiológico de Hepatites Virais do
Ministério da Saúde, no período de 1999 a 2011, foram confirmados 82.041 casos de hepatite C,
a maioria dos casos concentram-se nas regiões sudeste (67,3%) e sul (22,3%). Sendo que 49.291
casos (60,1%) no sexo masculino e 32.734 (39,9%) no sexo feminino. A razão de sexos
(masculino: feminino) nesse período diminuiu, passando de 2,0 casos em homens para cada caso
em mulheres em 1999 para 1,4 em 2010. Neste mesmo ano, a taxa de detecção foi de 6,4 entre
homens, enquanto entre mulheres foi de 4,5 (Boletim Epidemiológico Hepatites Virais, 2012).
Quanto à taxa de detecção de casos de hepatite C em 2010, observou-se que o Estado do
Acre apresentou a maior taxa com 18,1 casos por 100.000 mil habitante, seguido do Rio Grande
do Sul (12,1), São Paulo (12,1), Santa Catarina (9,3), Rio de Janeiro (5,8), Paraná (5,4) e Distrito
Federal (5,4), todos com taxa de detecção igual ou superior à nacional para esse ano (5,4). Nos
Estados de Tocantins (0,1), Roraima (0,2) e Pernambuco (0,2) nesses Estados foram observadas
as menores taxas de detecção (Boletim Epidemiológico Hepatites Virais, 2012).
Com relação à distribuição por faixa etária, em 2010 observou-se a maior taxa de detecção
por 100.000 habitantes na faixa etária de 55 a 59 anos com 15,8 casos, seguida pela faixa etária
de 50 a 54 anos (15,3), de 45 a 49 anos (13,9), de 40 a 44 anos (10,4) e de mais de 60 anos (9,2),
totalizando 7.749 casos entre pessoas com mais de 40 anos, o que representa 75,1% dos casos
para esse ano. Entre o grupo de 40 a 59 anos de idade, observam-se taxas de detecção maiores em
homens do que em mulheres, enquanto depois dos 60 anos a taxa de detecção é maior em
mulheres (Boletim Epidemiológico Hepatites Virais, 2012).
A prevalência do VHC no Brasil sugere taxas que variam de 1 a 1,5%, nas regiões sul e
norte, comparável com o que é observado na Europa (Silva et al.,1995).
45
A circulação do VHC foi identificada na Amazônia Brasileira. O vírus na região apresenta
importante impacto epidemiológico, e a prevalência do VHC varia até 5,5% em algumas
populações (Paraná et al.,2008).
No Sul da Amazônia Brasileira, revelou-se que a prevalência da infecção pelo VHC na
população em geral foi de 2,4% (Souto et al., 1999). Já em Monte Negro (Estado de Rondônia)
mostrou que a prevalência do VHC encontrada na população em geral foi de 0,38% (Khouri et
al., 2005).
Em Rio Branco (Estado do Acre) a prevalência da infecção pelo VHC na população em
geral foi de 4,2%, porém, nesse estudo não houve a realização do teste confirmatório para a
infecção pelo VHC (Tavares et al., 2004).
1.9.3 Epidemiologia Molecular
Baseado no grau da homologia das sequências, o VHC é classificado em um sistema
proposto por Simmonds, o qual consiste de seis genótipos maiores e 11 subtipos (1a-c, 2a-c, 3a,
3b, 4a, 5a, e 6a) e posteriormente foram propostos, mais cinco genótipos e 12 subtipos (6b, 7a-d,
8a, 8b, 9a-c, 10a e 11a) (Simmonds et al., 1993; Takada et al., 1993).
O VHC mostra uma variação substancial da sequência nucleotídica por todo o seu
genoma, sendo que cada genótipo contem subtipos proximamente relacionados (Simmonds,
1997; Simmonds et al.,2005). Os genótipos diferem entre si cerca de 31% a 33% a nível
nucleotídico, enquanto que entre os subtipos essas diferenças variam de 20% a 25% (Simmonds,
et al., 2005).
Estudos epidemiológicos tem mostrado diferenças acentuadas na distribuição dos
genótipos por região geográfica e entre grupos de pacientes. Os genótipos 1, 2 e 3 estão
amplamente distribuídos por todo EUA, Europa, Austrália e Leste da Ásia (Japão, Taiwan,
Tailândia e China) onde as distribuições geográficas de outros genótipos são mais restritas
(McOmish et al., 1994; Nousbaum et al., 1995; Kao et al., 1995;Simmonds, 1997; Yu et
al.,2001; Lee et al., 2006).
46
O genótipo 4 está amplamente limitado no Oriente Médio, no Egito e na África Central.
Os genótipos 5 e 6 são encontrados predominantemente na África do Sul e Sudeste da Ásia,
respectivamente (McOmish et al., 1994; Simmonds, 1997; Agha et al., 2004).
Os genótipos 1a, 3/3a e 4 são comumente encontrados em infecções relacionadas a UDI
enquanto que os genótipos 1b e 2 estão ligados a transfusão de sangue ou transmissão nosocomial
(Esteban et al.,2008). O genótipo 4 tem sido associado com tatuagem (Mathei et al., 2005). Como
a transfusão segura os sorotipos associados com transfusões sanguíneas estão começando a ser
substituídos por outros sorotipos especialmente aqueles relacionados ao uso de drogas injetáveis
(Esteban et al., 2008).
No Brasil, a distribuição geral dos genótipos do VHC na população brasileira é similar ao
que é encontrado na Europa ocidental e EUA, com uma frequência geralmente alta dos genótipos
1 e 3 (Schreier et al., 1996).
A epidemiologia molecular do VHC no Norte do Brasil é similar ao que se é conhecido no
restante do país, com predomínio do genótipo 1 seguido dos genótipos 3 e 2. O conhecimento da
distribuição dos genótipos no norte do Brasil é baseado em cepas do VHC encontradas no Estado
Acre, Amazonas e no Pará, em que o genótipo 1 foi encontrado em 78%, 64% e 93%,
respectivamente (Busek & Oliveira, 2003; Campiotto et al., 2005, Paraná et al., 2007; OliveiraFilho et al., 2010).
Em uma comunidade ribeirinha da Ilha do Pacuí, no Estado do Pará, a prevalência antiVHC foi de 8,8% (16/181), destes 62,5% tinham RNA viral (10/16) e todos apresentaram o
genótipo 1 do VHC (Oliveira et al., 2011).
Os genótipos do VHC devem ser sistematicamente determinados antes do tratamento,
uma vez que de acordo com o genótipo infectante é determinada a indicação, a duração do
tratamento, a dose de ribavirina e o procedimento de monitoramento virológico (Hadziyannis et
al., 2004).Os genótipos diferentes são relevantes para epidemiologia, desenvolvimento de vacinas
e direcionamento da infecção crônica pela VHC (Liew et al., 2004).
47
A importância da detecção dos genótipos tem sido reforçada por conta da eficácia da
terapia baseada no interferon, a qual é diferente para cada genótipo. Mais especificamente, a taxa
de resposta da terapia de interferon alfa é mais baixa no genótipo 1b do que nos outros genótipos.
Em contraste, os genótipos 2 e 3 têm mostrado uma taxa de resposta que é de duas a três vezes
maior do que do genótipo 1(Liang et al., 2000).
1.9.4 Coinfecção VHC e HIV-1
A presença do HIV-1 altera a história natural da infecção pelo VHC. Depois de adquirir o
VHC, a infecção tem uma tendência para cronicidade em mais de 90% entre os indivíduos HIV-1
devido a falta de resposta de linfócito T CD4+ contra o VHC (Danta et al., 2008; Danta &
Dusheiko, 2008).Uma vez que a infecção crônica pelo VHC é estabelecida, a progressão da
fibrose é muito mais rápida, resultando em alta frequência de cirrose e complicações quando
comparada em infectados apenas pelo VHC (Benhamou et al.,1999; Graham et al., 2001).
O VHC e o HIV-1 compartilham vias de transmissão em comum, mas a eficiência da
transmissão de cada vírus é diferente. O VHC é mais eficientemente transmitido através da
exposição a sangue ou hemoderivados contaminados, particularmente uso de drogas injetáveis
(UDI). As taxas de transmissão vertical e perinatal são relativamente baixas (3-6%), embora
esteja duas vezes aumentada quando as mães estão infectadas pelo HIV-1 (Thomas et al., 1998;
Mast et al., 2005). A transmissão sexual do VHC não é de forma eficiente e os riscos
relacionados a tipos diferentes de atividade sexual é desconhecido. Entretanto, existe evidência
de VHC transmitido sexualmente em homens que fazem sexos com homens (HSH) (Van de Laar
et al., 2007). A infecção pelo VHC adquirida pela via sexual tem sido associada com doenças
sexualmente transmissíveis e relação sexual anal com traumas (Danta et al., 2007).
Para a infecção pelo VHC, a distribuição geográfica da prevalência e o modo primário de
transmissão relativa para o HIV-1 são muito diferentes daquelas para o VHB. A prevalência da
infecção crônica pelo VHC é estimada ser moderada (2-2,9%) na maior parte da África
Subsaariana e baixa (< 2,0%) na Europa e outras regiões desenvolvidas (Alter, 2006).
48
Aproximadamente 4 a 5 milhões de pessoas estão coinfectadas com o HIV-1 e o VHC.
Nos EUA e Europa Ocidental, entre pessoas infectadas pelo HIV-1, a prevalência do VHC é de
72% a 95% entre usuários de drogas injetáveis (UDI), 1% a 12% em homens que fazem sexo
com homens (HSH) e 9% a 27% em heterossexuais (Alter, 2006).
Estudos recentes encontraram altos níveis de ativação de células T em coinfectados VHC
e HIV-1, comparado aos indivíduos monoinfectados pelo HIV-1 mesmo seguindo a HAART
(Kovacs et al., 2008; Gonzalez et al., 2009; Kovacs et al., 2010). A ativação imune crônica pode
levar para disfunção imune e produção de citocinas, causando aumento da replicação do HIV-1 e
VHC e baixa contagem de células T (Kovacs et al., 2008).
A coinfecção pode aumentar a ativação imune, levando a apoptose de linfócitos T CD4+
em indivíduos HIV não tratados e mais rápido para a progressão da imunodeficiência severa
(Korner et al., 2009). Entretanto, o impacto da infecção pelo VHC na recuperação dos linfócitos
T CD4+ seguindo HAART tem sido contraditório; pois tem sido relatado pobre resposta dos
linfócitos T CD4+ em coinfectados quando comparado com indivíduos monoinfectados (Potter et
al., 2010) e
enquanto que outros não observam pobre reposta dos linfócitos T CD4+ em
indivíduos coinfectados quando comparado com monoinfectados (Yacisin et al., 2008; Al-Harthi
et al., 2006; Korner et al., 2009, Peter et al., 2009).
Apesar da redução de morbidade e mortalidade em indivíduos infectados pelo HIV-1 na
era HAART, as mortes associadas ao fígado agora representam uma causa principal de mortes
nesta população, primariamente devido a coinfecção com o VHC, doenças que incluem fibrose,
cirrose e doença hepática no estágio final. A progressão para a cirrose é três vezes mais alta em
coinfectados do que em indivíduos monoinfectados, e aproximadamente 33% progridem para a
cirrose em menos de 20 anos (Operskalski & Kovacs, 2011).
Tem sido relatado que infecção com certos ou múltiplos genótipos do VHC é um
obstáculo no tratamento por HAART, enquanto que outros argumentam que não existe influência
do genótipo do VHC na progressão da doença (Van Asten & Prins, 2004).
49
A distribuição dos genótipos do VHC em indivíduos infectados pelo HIV reflete a rota de
transmissão. O genótipo 1b é relatado em 66% das infecções VHC pós-tranfusionais, enquanto os
genótipos 1a e 3a são mais comuns em usuários drogas endovenosa (Albeldawi et al., 2010).
No sul da China, em uma província chamada Liuzhou, uma população de coinfectados
HIV-1/VHC, e verificou-se que teve o predomínio do subtipo 6a, seguido pelo outros subtipos:
3b, 3a, 1a e 1b, alguns genótipos do VHC tem distribuição restrita e genótipo 6 é um deles, que é
encontrado no Sul da Ásia no Vietnam e Tailândia (Tan et al., 2008).
Na Europa, em uma população de coinfectados HIV-1/VHC que era constituída apenas de
usuário de drogas injetáveis, provenientes de sete países europeus (Áustria, Itália, Holanda,
Escócia, Espanha, França e Suíça), os subtipos mais prevalentes foram o 1a e 3a, mas a
porcentagem do genótipo 4 foi também relativamente alta, variando de 7% no norte da Europa e
24% no sul da Europa e o genótipo 4 consistiu-se principalmente do subtipo 4d (Van Asten et al.,
2004).
No Sul da China na província de Yunnan, que é o epicentro da epidemia do HIV-1 e
centro de tráfico de drogas para outras partes do mundo, seis localidades dessa província foi
realizada a genotipagem e quanto à distribuição dos genótipos do VHC nos coinfectados HIV1/VHC e observou-se a presença dos genótipos 1a (1,25%), 1b (20%), 3a (23,75%), 3b (30%), 6a
(5%), 6n (11,25%) e 8,75% do novo subtipo 6u (Xia et al.,2008). O subtipo 1b do VHC é
predominante na China seguido pelo 2a (Lu et al., 2005), porém, no estudo de Yunnan o subtipo
2a não foi encontrado, e a distribuição dos genótipos do VHC mostram um padrão único de
distribuição, que é similar nos países do sudeste da Ásia, mas distinto da população em geral da
China. Rotas do tráfico de drogas e a alta prevalência da infecção pelo HIV-1 pode ter
contribuído para este padrão de distribuição dos genótipos do VHC (Xia et al., 2008).
Em algumas regiões do Brasil, dados da infecção pelo VHC em indivíduos portadores do
HIV não estão ainda disponíveis. Na região Sudeste do país tem sido reportado que prevalência
da coinfecção HIV/VHC varie entre 10% a 50% (Mendes Correa & Barone, 2005; Mendes
Correa et al., 2001; Mussi et al., 2007; Pavan et al., 2003; Treitinger et al., 1999).
50
De acordo com dados do Boletim Epidemiológico das Hepatites Virais, a coinfecção
VHC e HIV-1 foi referida em 11,4% do total de casos confirmados entre os anos de 2007 e 2010.
Essa proporção é quase duas vezes maior que a da coinfecção do HIV com o VHB (Boletim
No Brasil, no Estado do Porto Alegre foi realizado um estudo em coinfectados HIV1/VHC e observou-se que a distribuição dos genótipos do VHC foi: genótipo 1 (81,5%), genótipo
2 (1,7%) e o genótipo 3 (16,2%), os outros genótipos 4, 5 e 6 não foram encontrados. A
coinfecção pelo VHC é frequente entre indivíduos com HIV no Estado de Porto Alegre e é
particularmente alta a infecção pelo genótipo 1 (Wolff et al., 2010).
No Brasil, no Estado de Recife, um estudo foi feito em coinfectados HIV-1/VHC e
verificou-se que os genótipos do VHC identificados foram 1b (45%), 3 (33%) e 1ª (22%) e a
transfusão de sangue foi um fator de risco para a aquisição do VHC (Carvalho et al., 2009).
51
1.10 OBJETIVOS
1.10.1 Objetivo Geral
Descrever a soroprevalência e epidemiologia molecular do VHB e do VHC em
portadores do HIV-1, procedentes de Belém, Estado do Pará.
1.10.2 Objetivos Específicos
1. Descrever as características sócio-demográficas da população de portadores do HIV-1 e/ou
com AIDS;
2. Descrever a soroprevalência das infecções pelos VHB e VHC na população de portadores do
HIV-1e/ou com AIDS;
3. Descrever o impacto das coinfecções virais na carga viral plasmática do HIV-1 e no número de
linfócitos T CD4+ e T CD8+
4. Buscar associações entre as informações epidemiológicas que possam ser caracterizadas como
fatores de risco para a aquisição dos VHB e VHC entre os portadores do HIV-1;
5. Descrever os genótipos do VHB e do VHC circulantes em portadores do HIV-1 e/ou com
AIDS;
52
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 POPULAÇÃO EXAMINADA
As amostras foram coletadas obedecendo aos cálculos de amostragem usando o programa
BioEstat versão 5.0 (Ayres et al., 2007), usando-se o cálculo para o tamanho amostral para
proporções (uma amostra), com poder de teste de 0,90 e nível alfa de 0,01. Os índices de
prevalência esperados para as coinfecções listadas no presente trabalho foram estimadas a partir
de resultados preliminares existente entre o grupo e a população da cidade de Belém como
referência, onde no grupo examinado a prevalência sempre foi maior do que na população em
geral (teste unilateral); foram considerados os números a seguir: VHC (1% vs. 0,1%; n= 499),
VHB (20% vs. 5%; n=47). Como resultado a estimativa amostral foi de, aproximadamente 500
indivíduos portadores do HIV-1 para que se possa satisfazer estatisticamente a todos os agentes,
mas apenas 410 foram incluídas no trabalho. E os critérios de inclusão utilizados foram os
seguintes: idade acima de 18 anos, residir no Estado do Pará, Homem ou mulher, ter assinado o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e respondido ao questionário epidemiológico.
As 410 amostras de indivíduos portadores do HIV-1 que foram trabalhadas já se
encontravam armazenadas no Laboratório de Virologia da UFPA e tendo sido coletadas no
período de setembro de 2007 a janeiro de 2009, provenientes da Unidade de Referência
Especializada em Doenças Infecciosas e Parasitárias Especiais (URE-DIPE), unidade
subordinada à Secretaria Executiva de Saúde Pública do Estado do Pará (SESPA), da cidade de
Belém. Todos os participantes do estudo responderam a um questionário com informações
demográficas e sócio-culturais (Apêndice 1).
2.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE
Cada amostra de sangue foi coletada por meio de um sistema de colheita a vácuo, em dois
tubos de 5 mL, contendo EDTA como anticoagulante e em seguida, transportadas ao Laboratório
de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, para posterior
separação das frações de plasma e células do sangue por centrifugação à 4.000 rotações por
minuto (rpm), durante 10 minutos. Em seguida as amostras foram armazenadas e congeladas à 20ºC até o momento do uso.
53
2.3 ASPECTOS ÉTICOS
O presente projeto, fez parte de uma projeto maior intitulado “Avaliação clínicoepidemiológico de fatores de natureza viral e de cunho infeccioso (co-infecções virais e
bacterianas), que influenciam o curso da progressão da doença no indivíduo infectado pelo Vírus
da Imunodeficiência Humana tipo 1” que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital Universitário João de Barros Barreto, protocolo nº 2092/05, em obediência às resoluções
nº 196/96 e 347/2005 do Conselho Nacional de Saúde, as quais tratam das diretrizes e normas
regulamentares da pesquisa envolvendo seres humanos (Anexo 1).
Todos os indivíduos foram orientados acerca dos objetivos do trabalho e após a leitura e
explicações das finalidades do referido trabalho, os que concordaram em participar, assinaram
um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 2).
2.4 SOROLOGIA
2.4.1 Detecção de Anticorpos e Antígenos do VHB
A presença da infecção pelo VHB foi investigada utilizando-se um ensaio
imunoenzimático do tipo ELISA (Diasorin S.p.A, Saluggia, Italia), no qual os plasmas foram
testados para a detecção dos seguintes marcadores sorológicos: HBsAg, HBeAg, anti-HBc total,
anti-HBc IgM, anti-HBs e anti-HBe, de acordo com as especificações do fabricante.
2.4.2 Detecção de Anticorpos para o VHC
A presença da infecção pelo VHC foi investigada utilizando-se um ensaio
imunoenzimático do tipo ELISA (Diasorin S.p.A, Saluggia, Italia) para a detecção de anticorpos
totais (IgG e IgM) de acordo com as especificações do fabricante.
2.5 QUANTIFICAÇÃO DOS LINFÓCITOS T CD4+ e T CD8+
As amostras de sangue dos indivíduos portadores do HIV-1 foram submetidas a contagem
de linfócitos T CD4+ e T CD8+ por meio da Citometria de Fluxo (FacsCalibur, Becton &
Dickinson, USA) usando o kit BD Trucount TM Tubes e BD multitest de acordo com o protocolo
padrão recomendado pelo fabricante (Becton Dickinson, USA) e utilizado na Rede Nacional de
54
quantificação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ do Programa Nacional de DST AIDS e Hepatites
Virais do Ministério da Saúde.
2.6 QUANTIFICAÇÃO DA CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HIV-1
A carga viral plasmática do HIV-1 nos indivíduos portadores do vírus foi determinada
pelo método de branched DNA (bDNA), utilizando o kit Versant® HIV-1 RNA 3.0 Assay bDNA
(Bayer Corporation, Massachusetts, USA), através do equipamento de leitura System 340 bDNA
Analyzer (Siemens, Deerfield, USA), seguindo a metodologia padrão da Rede nacional de carga
viral do Programa Nacional de DST AIDS e Hepatites Virais do Ministério da Saúde.
2.7 MÉTODOS PARA O SEQUENCIAMENTO DO VHB E VHC
2.7.1Extração do DNA
A Extração de DNA viral a partir do plasma, apenas das amostras positivas na sorologia
para o marcador de persistência HBsAg e foi realizada no Laboratório de Virologia do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, através do método de fenol-clorofórmio
tratado com proteinase K de acordo com Niel et al.,(1994) com adaptações, seguindo as etapas de
lise celular, precipitação de proteínas, precipitação e hidratação do DNA.
Na etapa de lise celular acrescentou-se 250 μL de plasma tratado com 20 μL de
proteinase K, em seguida acrescentou-se 80 μL de solução de lise de leucócitos. Agitou-se ao
vortex até o precipitado ser dissolvido completamente. Prosseguiu-se com a incubação em banhomaria (37ºC) por 4 horas.
Para a precipitação de proteínas, ao material incubado adicionou-se 200 μL de Solução de
Proteínas. Agitou-se no vortex e, em seguida, incubou-se, novamente, em banho maria a (55ºC).
Após 30 minutos de incubação, o material foi centrifugado (14.000 rpm) durante 10 minutos. A
fase aquosa foi, então, transferida para um tubo de 2 mL, estéril, no qual foram adicionados 500
μL de fenol-clorofórmio. Agitou-se por inversão durante 10 minutos e, em seguida, centrifugouse (14.000 rpm) por 10 minutos. O sobrenadante foi, então, transferido para outro tubo, onde
foram acrescentados 1,5 mL de isopropanol gelado.
Após a visualização da turvação, centrifugou-se (14.000 rpm) os tubos por 10 minutos.
Acrescentou-se 200 μL de etanol a 70% a fim de lavar a parede do tubo. O etanol foi desprezado
55
e, o tubo, colocado para secar durante tempo suficiente para que ocorresse a evaporação completa
do mesmo. A reação foi finalizada com a adição de 30 μL de água estéril, para a hidratação do
DNA obtido.
2.7.2 Extração do RNA
Para a conservação do RNA no plasma e nos leucócitos do sangue periférico das amostras
que apresentarem reatividade no ELISA para o anti-VHC, foi acrescentado aos 300 µL de plasma
das amostras, aproximadamente 1.500 mL RNAlater® Tissue Collection, de acordo com
protocolo do fabricante (Applied Biosystems, USA).
A extração de RNA a partir do plasma e de leucócitos do sangue periférico foi realizada
no Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará,
usando-se o EXTRAzol-Kit Extração de RNA de amostras celulares e não celulares
(Nanogen,S.p.A, Italy), seguindo as instruções do fabricante com as etapas de: lise das amostras,
solução de proteínas, precipitação do RNA com etanol e lavagem do precipitado de RNA e
diluição do mesmo em água ultrapura.
As amostras de plasma não requeriram pré-tratamento, e foram extraídas diretamente.
Enquanto que as amostras de sangue total seguiram o seguinte pré-tratamento: Em um microtubo
de centrifuga de 2mL foi transferido 1 mL de sangue total e em seguida foi centrifugado a
temperatura ambiente por 1 minuto a 14.000 rpm. Depois o sobrenadante foi removido com o
auxílio de uma pipeta de transferência descartável. Foi diluído o precipitado celular contido no
fundo do microtubo em solução fisiológica esterilizada, obtendo-se um volume final de 2 mL. Os
passos anteriores foram repetidos. O precipitado celular contido no microtubo em solução
fisiológica esterilizada, foi diluído obtendo-se um volume final de 200 µL que foi utilizado
posteriormente na extração do RNA. Após esse pré-tratamento procedeu-se a extração de RNA.
Na etapa de lise celular e precipitação de proteínas foram transferidos 800 µL do reagente
extrazol em um microtubo de centrifugação de 1,5 mL; Adicionados 200 µL da amostra no
microtubo de 1,5 mL contendo o reagente extrazol. Foi homogeneizado no vortex imediatamente
por 15 segundos. Depois foi centrifugado a temperatura ambiente por 5 segundos a 14.000 rpm.
Foram transferidos 100 µL de clorofórmio para o microtubo de 1,5 mL e agitado imediatamente
por 15 segundos. O microtubo foi deixado no gelo por 15 minutos. Centrifugado por 15 minutos
56
a 12.000 a 14.000 rpm. Durante a centrifugação, foram transferidos 500 µL de etanol absoluto
para um microtubo de precipitação de 1,5 mL (fornecido pelo fabricante).
Na etapa de precipitação do RNA com etanol foram transferidos 500 µL do sobrenadante
para o microtubo de precipitação contendo o etanol absoluto, com cuidado para coletar a fase
orgânica abaixo ou proteínas e DNA presente na interfase e agitado imediatamente por inversão
10 vezes. Foi centrifugado o microtubo de precipitação a temperatura ambiente por 10 minutos a
14.000 rpm para coletar o RNA presente no precipitado ou na parede do tubo. O sobrenadante foi
removido.
Na etapa de lavagem do precipitado de RNA, foi transferido 1 ml do reagente de lavagem
para o microtubo de precipitação que continha o RNA e invertido por inversão 10 vezes.
Centrifugado o microtubo de precipitação a temperatura ambiente por 1 minuto a 12.000 a 14.000
rpm. O sobrenadante foi removido utilizando uma pipeta de largo volume, tomando cuidado para
não drenar com a ponteira o precipitado de RNA, que agora era visível no fundo do microtubo ou
na parede do mesmo. O sobrenadante foi descartado. Centrifugado o microtubo de precipitação
por 5 segundos a 14000 rpm. O sobrenadante foi removido complemente com uma pipeta de
pequeno volume, tomando cuidado de não drenar o pellet com a ponteira. O sobrenadante foi
descartado. O microtubo de precipitação foi deixado secando por 5 minutos dentro da capela de
fluxo laminar.
Na etapa diluição do RNA, primeiro o volume de água ultra-pura foi adicionado de acordo
com o tipo de amostras quando as amostra não celulares (RNA viral) foram adicionados 10 µL de
água ultrapura e no caso de tratando-se de amostras celulares (RNA total) foi adicionado 20 µL a
50 µL de água ultrapura. O precipitado foi dissolvido adicionado-se água ultra pura no mesmo
lado da dobradiça do tubo. O precipitado de RNA foi deixado hidratando por 5 minutos a
temperatura ambiente. Depois foi agitado vigorosamente o microtubo em vortex para dissolver o
precipitado. Finalmente foi centrifugado a temperatura ambiente por 5 segundos para que o RNA
ficasse todo no fundo do microtubo.
2.7.3 Transcrição Reversa
A transcrição reversa foi realizada a partir de RNA extraído de plasma e dos leucócitos e
esse RNA foi convertido em DNA complementar (cDNA). Esse processo foi realizado utilizando
57
o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (sem inibidor), de acordo com o protocolo
fornecido pelo fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Para a reação de cDNA foi preparado um mix com um volume final de 20 L, contendo
4,2 L de H2O, 2,0 L de buffer, 2,0 L de Random Primers, 0,8 L de dNTPs mix (100mM), 1
L de enzima transcriptase reversa (RT), fornecidos pelo kit e, 10 L de RNA extraído.
Posteriormente, a mistura foi colocada em um termociclador e foram submetidas às ciclagens de
25°C a 10 minutos, 37°C a 120 minutos e 85°C a 5 minutos.
2.7.4 PCR em Tempo Real para a detecção do VHC
As moléculas de cDNA foram submetidas a PCR em tempo real pelo método TaqMan®.
O ensaio de detecção foi executado utilizando o kit TaqMan® Universal PCR MasterMix
(Applied Biosystems). As sequências do assay e do controle endógeno que foram utilizados estão
descritos no quadro 1.
Quadro 1- Sequências do assay e do controle endógeno utilizados no ensaio de amplificação por
PCR em tempo real para VHC.
VHC
Primer forward
HCV_NCR5-C93F – GCTCAATGCCTGGAGATTTGG
Primer reverse
HCV_NCR5-C93R – CTTTCGCGACCCAACACTAC
Sonda
HCV_NCR5–FAM -TCGGCTAGCAGTCTCG-TAMRA
Albumina(Controle endógeno)
Primer forward
GCTCAACTCCCTATTGCTATCACA
Primer reverse
GGGCATGACAGGTTTTGCAATATTA
Sonda
FAM-TTGTGGGCTGTAATCAT–TAMRA
O protocolo utilizado na PCR em tempo real para a amplificação do cDNA foi o seguinte:
● Master mix universal
12,5L
● Assay
0,75L
● Água
8,75 L
●cDNA
3,0 L
25,0 L
58
Para a reação utilizou-se o termociclador Step One plus (Applied Biosystems)
obedecendo as seguintes temperaturas durante a ciclagem: 50º C por 2 minutos, 95°C a 10
minutos, 95° C durante 15 segundos e 60°C por 1 minuto sendo que essas duas últimas
temperaturas foram repetidas 45 vezes.
2.7.5 Reação em cadeia mediada pela polimerase para VHC
As amostras positivas no PCR em tempo real (VHC) foram submetidas à
amplificações de ensaios de nested PCR (Oliveira-Filho et al., 2010), com o objetivo da
amplificação de uma região 269 pares de base da região 5’ NTR do VHC, para uso posterior na
reação de sequenciamento As sequências dos primers que foram utilizados encontram-se
descritos no quadro 2 (Oliveira-Filho et al., 2010).
Quadro 2- Sequência dos primers utilizados no PCR convencional para VHC.
VHC
Forward externo
EAP1 5’ACACTCCGCCATGAATCACTCCC 3’
Reverse externo
EAP2 5’TGCACGGTCTACGAGACCT 3’
Forward interno
Reverse interno
IAP1 5’GGAACTACTGTCTTCACGCAGAAA 3’
IAP2 5’ACTCGCAAGCACCCTATCA3’
O protocolo utilizado no nested PCR para a amplificação do DNA foi o seguinte:
● Água
36,8L
● Tampão10X
5,0 L
● MgCl2 (50mM)
2,0L
● Primer Forward (10,0 pmol/L)
1,0L
● Primer Reverse (10,0 pmol/L)
1,0 L
● dNTPs(10mM)
1,0L
● Taq DNA polimerase
0,2 L
● cDNA
3,0 L
50,0 L
Após o preparo da reação os tubos contendo a mistura foram colocados em um
termociclador e realizados a ciclagem de 95oC por 2 minutos; 60oC 1 minuto; 40 ciclos de 72 oC
por 30 segundos, 94oC por 30 segundos, 60oC por 30 segundos e o último ciclo foi de 72oC por 5
59
minutos. As temperaturas seguem a realização das etapas de desnaturação, hibridização dos
primers e extensão. Esse protocolo foi utilizado para as duas reações.
2.7.5.1 Eletroforese
Os produtos da amplificação do nested PCR foram visualizados após eletroforese (100
V/60 minutos) em gel de agarose de 1,5%, em tampão TAE 1x (TAE 50x estoque – TrisBase 1,6
M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água deionizada), após a corrida o gel foi
corado com brometo de etídio para posterior visualização no transiluminador com luz
ultravioleta.
2.7.6 Reação em cadeia mediada pela polimerase para VHB
Os DNAs das amostras positivas na sorologia para o marcador de persistência HBsAg,
foram utilizados no ensaio por seminested PCR (Niel et al.,1994; Gomes et al.,1996) com o
objetivo de amplificar uma região de 867 pares de bases para que, posteriormente, esse produto
da reação de seminested PCR fosse utilizado na reação de sequenciamento. As sequência dos
primers utilizados encontram-se descritas no quadro 3 (Niel et al., 1994; Gomes et al., 1996).
Quadro 3– Sequências de primers utilizados para amplificação do gene S do VHB.
Primers
Posição no gene S
Sequência dos primers
PS2
124-143-RI
PS2- 5` GGTCCCCAGTCCTCGAGGAG 3`
S2
819-841-RE
S2-5` GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA 3`
PS1
2826-2845-FE
PS1- 5` CATATTCTTGGGAACAAGA 3`
PS4
3199-3218-FI
PS4-5` CATCCTCAGGCCATGCAGTG 3`
O protocolo utilizado no seminested PCR para a amplificação do DNA foi o seguinte:
● Água
29,5L
● Tampão 10X
5,0 L
● MgCl2 (50mM)
2,0L
● Primer Forward (10,0 pmol/L)
0,5 L
60
● Primer Reverse (10,0 pmol/L)
0,5 L
● dNTP (1,25mM)
6,0L
● Taq DNA polimerase
0,5L
● DNA
6,0 L
50,0 L
Após o preparo da reação os tubos contendo a mistura foram colocados em um
termociclador e realizados 1 ciclo de 94° C por 3 minutos, em seguida 35 ciclos de 30 segundos a
95ºC, 30 segundos a 52ºC e 1 minuto a 72ºC e 7 minutos a 72°C. As temperaturas seguiam a
realização das etapas de desnaturação, hibridização dos primers e extensão. Esse protocolo foi
utilizado para as duas reações.
2.7.6.1 Eletroforese
Os produtos da amplificação foram visualizados após eletroforese (100 V/60
minutos) em gel de agarose a 2%, em tampão TAE 1x (TAE 50x estoque – TrisBase 1,6 M,
Acetato de sódio 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água deionizada), após a corrida o gel foi
corado com brometo de etídio para posterior visualização no transiluminador com luz
ultravioleta.
2.8 PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DA PCR PARA O VHB
As reações de purificação dos produtos da PCR do gene S (VHB) objetivaram a
otimização do processo de sequenciamento dos produtos de amplificação. O processo de
purificação seguiu o protocolo da QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Inc., USA)
descrito abaixo:
1. Foram adicionados 5 volumes da solução de ligação ao DNA a 1 volume do produto da PCR
e ocorreu a homogeneização por pipetagem;
2. Colocou-se uma coluna QIAquick em um tubo de 2 mL e adicionou-se a mistura acima;
3. Centrifugou-se por 60 segundos a 13.000 rpm;
4. O conteúdo líquido do tubo coletor foi desprezado e retornou-se a coluna QIAquick ao mesmo
tubo;
61
5. Procedeu-se a lavagem da coluna, adicionando-se 750 L de tampão de lavagem à coluna
QIAquick e o tubo foi centrifugado por 60 segundos a 13.000 rpm;
6. Desprezou-se o tampão de lavagem do tubo coletor. O tubo foi centrifugado por mais 60
segundos a 13.000 rpm;
7. A coluna QIAquick foi colocada em um novo tubo coletor tipo eppendorf (1,5 mL);
8. Para eluir o produto do PCR, adicionou-se 35 L do tampão de eluição no centro da coluna
QIAquick, o tubo foi incubado por 15 minutos à temperatura ambiente e em seguida, foi
centrifugado por dois minutos a 13.000 rpm.
9. Após a eluição, o material purificado foi armazenado à –20°C, até o momento do uso.
2.9 SEQUENCIAMENTO NUCLEOTÍDICO
O DNA amplificado foi submetido ao sequenciamento automático utilizando a síntese
bioquímica da cadeia de DNA através do método de Sanger et al. (1977) pelo kit da ABI
PRISMTM 310 BigDye Terminator v3.1 Matrix Standards (Applied Biosystems). As fitas de DNA
foram sequenciadas em ambas as direções, usando-se o equipamento de sequenciamento
automático ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). A técnica foi realizada de
acordo com o protocolo que se segue:
1. Para cada reação, misturou-se os seguintes reagentes em um tubo:
● Terminator Ready Reaction Mix (Big Dye)
1,0L
● Buffer [5X]
1,0 L
● DNA(Produto amplificado)
1,0L
● Iniciadores (10,0 pmol/L)
1,0 L
● H2O deionizada
6,0 L
10,0 L
O Terminator Ready Reaction Mix é composto de A-Dye Terminator, G-Dye
Terminator, C-Dye Terminator, T-Dye Terminator, dGTP, dATP, dCTP, dTTP, Tris-HCl pH 9,0,
MgCl2, Pirofosfato Termo-estável e AmpliTaq DNA Polimerase, Fs.
2. Foram adicionados os tubos contendo a mistura no termociclador. Para as amostras
amplificadas no PCR convencional para VHB utilizou-se 35 ciclos de 94°C 10 segundos, 52°C
cinco segundos, 60°C quatro minutos e para as amostras amplificadas no PCR convencional para
62
VHC realizou-se 35 ciclos de 10 segundos a 94ºC, 5 segundos a 60ºC e 4 minutos a 60ºC. Ao
final do processo, a mistura foi resfriada a 4ºC.
2.9.1 Precipitação do produto sequenciado
1. Adicionou-se 40 L de isopropanol a 65% aos 10 L da solução anteriormente sequenciada;
2. Homogeneizou-se em agitador mecânico (vórtex);
3. Foi deixado em temperatura ambiente, não expondo à luz, por 15 minutos;
4. Centrifugou-se por 25 minutos a 14.000 rpm;
5. Foi desprezado o sobrenadante;
6. Adicionou-se 300 L de etanol a 60%;
7. Centrifugou-se a 14.000 rpm por 5 minutos;
8. Foi desprezado o sobrenadante;
9. Secou-se na estufa a 37ºC.
2.9.2 Eletroforese do produto sequenciado
O sistema de eletroforese utilizou o sequenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems). A corrida foi realizada seguindo o protocolo do fabricante em um capilar
de 61cm, nas seguintes condições: voltagem de corrida 12,2 kV, corrente 3-5µA, temperatura
50ºC e tempo de corrida de 2 horas e 45 minutos considerando o maior fragmento (867 pares de
bases).
2.10 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS
2.10.1 Análise filogenética para o VHB
Todas as sequências nucleotídicas obtidas no estudo foram alinhadas e editadas com
auxílio do programa Bioedit (Hall, 1999).
Após o alinhamento, a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA-4 –
Molecular Evolutionary Genetics Analysis versão 4.0 (Tamura et al., 2007), usando o modelo de
Kimura 2-parâmetros e o método de Agrupamento de Vizinhos (Neighbor-Joining) (Saitou &
Nei, 1987). Para testar a robustez topológica da árvore foi realizado o teste não-paramétrico de
bootstrap, empregando 1.000 réplicas.
63
As sequências nucleotídicas obtidas no National Center of Biotechnology Information
(NCBI) foram adicionadas ao alinhamento e utilizadas para a construção da árvore filogenética
de distinção dos genótipos do VHB e as sequências utilizadas foram as seguintes: (Genótipo A:
A1 - M57663, A2 - J02201; Genótipo B: M54923; Genótipo C: D23681; Genótipo D: X65257;
Genótipo E: X75664; Genótipo F1: AY090459, AB116552, AY090461, AY090458, AY090456,
Genótipo F2: AY264397; Genótipo G: AF160501; Genótipo H: AY090457 e o Genótipo VHB
de primatas não humanos AF046996).
2.10.2 Análise filogenética para o VHC
As sequências nucleotídicas obtidas foram editadas e alinhadas utilizando o programa
BioEdit (Hall, 1999). O alinhamento final foi submetido ao programa DnaSP versão 5.10
(Librado & Rozas, 2009) para identificar sequências nucleotídicas idênticas, e ao programa
Modelgenerator (Keane et al., 2006) para selecionar, de acordo com o critério de informação de
Akaike corrigido, o melhor modelo para construção da árvore filogenética, esse procedimento
após o alinhamento foi realizado, pois a região 5’ NTR do VHC é uma região extremamente
conservada.
Esses parâmetros evolutivos foram utilizados pelo programa PHYML versão 2.4.4
(Guindon & Gascuel, 2003) para construir árvores filogenéticas, de acordo com o método de
máxima verossimilhança. Para testar a robustez topológica da árvore foi realizado o teste nãoparamétrico de bootstrap, empregando 1.000 réplicas. A árvore filogenética final foi obtida
empregando o consenso da maioria através do aplicativo consense do PHYML e, posteriormente,
editada empregando os recursos gráficos contidos no programa FigTree (Rambaut, 2011).
As sequências nucleotídicas obtidas no National Center of Biotechnology Information
(NCBI) foram adicionadas ao alinhamento e utilizadas para a construção da árvore filogenética
de distinção dos genótipos do VHC e as sequências utilizadas foram as seguintes: (Genótipo 1:
U45476, AJ132997, M62321; Genótipo 2: D49757, D49754, AB030907, D10077, D49745,
AB031663, D00944, AF169003, D50409, D49755, AY746460; Genótipo 3: D17763, D28917,
D37840, D49374, D49747, D49753; Genótipo 4: D45193; Genótipo 5: D50466; Genótipo 6:
D88476, D88473, D88475).
64
2.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As informações coletadas fazem parte de um banco de dados que utilizou o programa
Acess, da plataforma Windows, a partir do qual foram construídas tabelas e figuras. As
frequências foram calculadas como razões matemáticas simples e expressas sob a forma de
porcentagem.
Para a realização da análise estatística foi utilizado o programa BioEstat versão 5.0 (Ayres
et al., 2007) para auxiliar na análise da diferença entre os valores da contagem de linfócitos T
CD4+ e T CD8+dos infectados e não infectados pelos VHB e VHC, foi utilizado o teste de MannWhitney, utilizando o valor de p bilateral com nível de significância de 5% (p< 0,05).
Para verificar a diferença carga viral plasmática do HIV-1 dos infectados e não infectados
pelo VHB e VHC, foi utilizado o teste G com nível de significância de 5% (p< 0,05).
Para verificar a associação entre as informações epidemiológicas tais como: uso de drogas
endovenosas e não endovenosas, transfusões sanguíneas, Tipos de parceiros, presença de
múltiplos parceiros, não uso de preservativo nas relações sexuais, sexo com profissionais do
sexo, sexo do tipo anal, história de DST, parceiros de outros Estados e de outros países e que
foram consideradas como possíveis fatores de risco e a presença dos respectivos marcadores
sorológicos para o VHB e VHC foi utilizado primeiro o teste de regressão logística simples, em
seguida as variáveis que apresentaram o valor de p< 0,20 foram para regressão logística múltipla
em que o nível de significância foi de p< 0,05.
65
3. RESULTADOS
3.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
3.1.1 Caracterização do perfil sócio-demográfico dos indivíduos portadores do HIV-1
A análise dos questionários epidemiológicos, foi realizada em 410 indivíduos. Observouse que a maioria foi composta por indivíduos do sexo masculino (61%), a média de idade foi de
39 anos e a faixa etária predominante foi de 30 a 40 anos com 33,2% (Tabela 1).
A grande maioria referiu ser paraense (82,5%), e os demais (17,5%) responderam ser de
outros Estados, que incluíram o Maranhão, Piauí, São Paulo, Minas Gerais, Goiás, Amapá, Ceará,
Espirito Santo, Rio Grande do Norte, Bahia, Tocantins e Rondônia. Grande parte (48,8%)
respondeu residir no município de Belém e os demais (17,7%) em outros municípios da Região
Metropolitana de Belém (R.M.B) que é formada por Ananindeua, Marituba, Benevides, Santa
Isabel e Santa Bárbara (Tabela 1).
Houve o predomínio de indivíduos solteiros (53,2%), com renda familiar entre 1 a 3
salários mínimos (72,7%). Quanto a escolaridade, observou-se que 28,7% dos indivíduos
declararam que possuíam o ensino médio completo e 27,7% responderam que possuíam o ensino
fundamental incompleto (Tabela 1).
66
Tabela 1- Características sócio-demográficas dos indivíduos portadores do HIV-1, Belém, Pará.
Características
sócio demográficas
Sexo
Faixa etária
Naturalidade
Município
de residência
Estado civil
Escolaridade
Renda familiar
Número
Percentual
Masculino
Feminino
18-30 anos
30-40 anos
40-50 anos
50-60 anos
> 60 anos
250
160
86
136
122
51
13
61%
39%
21%
33,2%
29,8%
12,4%
3,2%
Paraense
Outros Estados
Sem informação*
Belém
Outros municípios
da R.M.B.
Outros municípios
do Estado do Pará
Sem informação*
Solteiro(a)
Casado(a)
Divorciado(a)
Viúvo(a)
Sem informação*
Analfabeto
Alfabetizado
E.F completo
E.F incompleto
E. M.completo
E. M. incompleto
E. S. completo
E. S. incompleto
Sem informação*
< 1 salário mínimo
1-3 salários mínimos
4-6 salários mínimos
> 6 salários mínimos
Sem informação*
336
71
3
198
72
82,5%
17,5%
136
33,5%
*Não foram considerados para o cálculo estatístico.
4
211
125
34
26
14
12
12
47
112
116
61
28
16
6
51
286
38
18
17
48,8%
17,7%
53,2%
31,6%
8,6%
6,6%
3%
3%
11,6%
27,7%
28,7%
15,1%
6,9%
4%
13%
72,7%
9,7%
4,6%
67
3.1.2 Caracterização dos fatores de risco dos indivíduos portadores do HIV-1
Em referência aos fatores de risco avaliados, 18,1% dos indivíduos relataram ter recebido
sangue ou hemoderivados e 1,7% relataram o uso de drogas endovenosas. A maioria (50,5%)
relatou uso de drogas não endovenosas e as mais citadas foram o álcool, o cigarro, a maconha e a
cocaína (Tabela 2).
A grande maioria (69,7%) respondeu ser heterossexual e 34,5% relataram sempre fazer o
uso de preservativo em relações sexuais. Quanto a história de DST a maior parte (60%) referiu
não ter tido (Tabela 2).
A relação sexual do tipo anal foi negada por 38,5% dos entrevistados e 7,5 % não
quiseram comentar, porém 19,2% referem sempre manter relações por meio de sexo anal. A
maioria (75,7%) informou não manter relações sexuais com profissionais do sexo (Tabela 2).
A
existência de parceiro portador do HIV-1 foi relatado por 31,5% dos indivíduos, e 8,3% dos
indivíduos entrevistados relataram ter vários tipo de parceiro como: parceiro transfundido,
promíscuo, homossexual, heterossexual e bissexual. Em relação ao número de parceiros por
semana a grande maioria (78,2%) referiu ter um único parceiro (Tabela 2).
Cerca de 34,1% dos entrevistados referiu ter parceiros de outros Estados que incluíram o
Estado de Alagoas, Amapá, Goiás, Ceará, Sergipe, Rio de Janeiro, Amazonas, Bahia, Maranhão,
Acre, Piauí, Recife, Pernambuco e Rio Grande do Norte (Tabela 2).
Apenas 9,5% dos indivíduos informaram que já tiveram parceiros de outros países que
incluíram o Japão, Suriname, Itália, França, Alemanha, EUA, Inglaterra, Argentina, Portugal,
China, Cuba, Chile e Venezuela (Tabela 2).
68
Tabela 2- Distribuição dos possíveis fatores de risco na população de indivíduos portadores do
HIV-1, Belém, Pará.
Fatores de risco
Número
Percentual
Transfusão de sangue
Uso de drogas
UDE
UDNE
Orientação sexual
Uso de preservativo
História de DST
Sexo anal
Sim
74
18,1%
Não
336
81,9%
Sim
7
1,7%
Não
403
98,3%
Sim
207
50,5%
Não
203
49,5%
Heterossexual
281
69,7%
Homossexual
80
19,8%
Bissexual
42
10,4%
Sem informação*
7
Sim
132
34,5%
Não
122
31,8%
Às vezes
129
33,7%
Sem informação*
27
Sim
164
40%
Não
246
60%
Sempre
Nunca
Às vezes
Não quis comentar
Não se aplica
Sem informação*
72
144
116
28
14
36
19,2%
38,5%
31%
7,5%
3,7%
69
Tabela 2- Distribuição dos possíveis fatores de risco na população de indivíduos portadores do
HIV-1, Belém, Pará (Continuação).
Fatores de risco
Número
Percentual
Sexo com profissionais do Sim
sexo
Não
Não sabem
Não souberam responder*
84
271
3
52
23,5%
75,7%
0,84%
Tipos de parceiros
Parceiro HIV
129
31,5%
Parceiro UDE
52
12,7%
Parceiro UDNE
107
26,1%
Parceiro
c/
múltiplos 88
21,5%
parceiros
Outros tipos de parceiros**
34
8,3%
Nenhum
30
8,9%
1
262
78,2%
2-19
50
14,9%
Sem informação*
75
Parceiros
Sim
129
34,1%
de outros Estados
Não
247
65,3%
2
0,53%
Sem informação*
32
Parceiros
Sim
35
9,5%
de outros países
Não
330
89,9%
2
0,54%
Sem informação*
43
Parceiros por semana
*Não foram considerados para o cálculo estatístico; ** Parceiro transfundido, promíscuo,
homossexual, heterossexual e bissexual. UDE= usuário de drogas endovenosas, UDNE= usuários
de drogas não endovenosas.
70
3.2 MARCADORES DA INFECÇÃO PELOS VHB E VHC
Foram encontrados marcadores para a infecção passada ou persistente pelo VHB em
57,2% dos indivíduos examinados e em 3,4% pelo VHC (Figura 11 e Tabela 3). Somente três
indivíduos (0,8%) mostraram marcadores para os três agentes, desses apenas 1 indivíduo
apresentou infecção persistente para o VHC (Tabela 3).
A infecção passada pelo VHB foi encontrada em 48,4% (180/372) e 8,8% (33/372)
mostraram a coinfecção entre o VHB e o HIV-1(Figura 11). Dentre os portadores do VHB 15,2%
(5/33) mostraram também a presença do HBeAg (Tabela 3).
A imunidade vacinal para o VHB foi demostrada em 9,2% (38/410), sendo que destes
apenas 30 referiram já terem sido vacinados contra o VHB no ato da entrevista (Figura 11 e
Tabela 3).
Infecção passada pelo
VHB
48,40%
Coinfecção HIV e VHB
96,60%
8,80%
9,20%
42,70%
3,40%
Imunidade vacinal
Suscetiveis a infecção pelo
VHB
Coinfecção HIV e VHC
Suscetiveis a infecção pelo
VHC
Figura 11-Distribuição dos perfis da infecção pelos VHB e VHC em indivíduos portadores do
HIV-1, Belém, Pará.
Em relação a infecção pelo VHB, os indivíduos com anti-HBc total positivo e anti-HBs
positivo e/ou negativo foram interpretados como infecção passada pelo VHB. A imunidade
vacinal foi interpretada como a positividade apenas para o anti-HBs. A infecção crônica foi
observada em 33 (8,8%) dos indivíduos sendo caracterizada pela presença de HBsAg e anti-HBc
total, HBeAg positivo e/ou negativo, anti-HBe positivo e/ou negativo e anti-HBs negativo. A
infecção pelo VHC (anticorpos totais) foi verificada em 3,4% (14/410) dos indivíduos (Tabela 3).
71
Tabela 3- Distribuição dos marcadores sorológicos para infecção pelo VHB e VHC em
portadores do HIV-1, Belém, Pará.
Anti-
Anti-
HBcTotal
HBc
HBsAg
Anti-
HBeAg
HBs
Anti-
Anti-
HBe
VHC
T
Interpretação
IgM
+
-
-
+
NR
NR
-
94
Infecção passada pelo
+
-
-
-
NR
NR
-
83
VHB
+
-
-
+
NR
NR
+
1
Infecção passada pelos
+
-
-
-
NR
NR
+
1
VHB e VHC
Infecção passada pelos
+
-
-
-
NR
NR
+
1**
VHB e VHC e Infecção
persistente pelo VHC
+
-
+
-
-
+
-
13
Infecção crônica pelo
+
-
+
-
+
-
-
5
VHB
+
-
+
-
-
-
-
12
+
-
+
-
-
+
+
2
Infecção crônica pelo
+
-
+
-
-
-
+
1**
VHB e infecção passada
e crônica pelo VHC
-
-
NR
+
NR
NR
-
37
Imunidade vacinal ao
VHB
-
-
NR
+
NR
NR
+
1
Imunidade vacinal ao
VHB e Infecção pelo
VHC
-
-
NR
-
NR
NR
+
6
Infecção pelo VHC
+
1**
Infecção
persistente
pelo VHC
-
NR
NR
-
NR
NR
159
Suscetíveis à infecção
pelo VHB
-
396
Suscetíveis à infecção
pelo VHC
* Não realizados=NR;**Amplificação do RNA viral do VHC, T=Total.
72
3.3 MARCADORES MOLECULARES DA INFECÇÃO PELOS VHB e VHC
A persistência do VHC foi evidenciada em 21,4% (3/14) dos indivíduos com anti-VHC
(Figura 12). A busca de ácido nucléico entre cinco indivíduos sem anticorpos, mas com história
clínica pregressa de hepatite C mostrou também a presença do RNA viral em um dos indivíduos.
Foi realizada a reação de PCR em tempo real em busca de ácido nucléico a partir de
plasma e de massa celular dos indivíduos positivos na sorologia para o VHC, para verificar se
existia diferença na amplificação (Tabela 4 e Figura 12 e 13). Somente a partir do plasma, se
obteve positividade em todas as amostras como observado na Tabela 4.
Tabela 4- Resultado da amplificação de ácido nucléico do VHC por meio de reação de PCR em
tempo real, de acordo com a origem do material.
Sorologia
AMOSTRAS
ANTI-VHC
Origem do material amplificado
PLASMA
MASSA CELULAR
19960
+
+
+
20002
+
+
+
18754
+
+
-
17612
-
+
+
73
Figura 12- Amplificação das amostras de plasma para a infecção pelo VHC pela reação de PCR
em tempo real.
74
Figura 13- Amplificação das amostras de massa celular para a infecção pelo VHC pela reação de
PCR em tempo real.
A infecção persistente pelo VHB foi confirmada em 32 amostras positivas para o HBsAg
(Uma amostra não foi incluída, pois o plasma havia se esgotado). Dessas, 59,37% (19/32)
amplificaram a região do gene S constituída, de 867 pares de bases, conforme observado na foto
do produto de amplificação (Figura 14).
75
867 pb
Peso Molecular
100 pares de bases
Controle Positivo
Amostra 20978
Controle Negativo
Figura 14- Produto de visualização da seminested PCR para o VHB.
As quatro amostras de plasma que amplificaram na PCR em tempo real para o VHC,
foram submetidas a nested PCR para a região 5’ NTR e confirmaram a infecção pelo VHC após a
amplificação de uma região de 269 pares de bases como observado na Figura 15.
269 pb
Peso Molecular*
Controle Positivo
Controle Positivo
Amostra19960
Amostra 20002
Controle Negativo
Figura 15- Produto de visualização da nested PCR para o VHC.* Peso molecular de 100 pb
76
3.4 ANÁLISE FILOGENÉTICA
3.4.1 Análise Filogenética do VHB
Um total de onze sequências nucleotídicas obtidas no trabalho do gene S do VHB foram
utilizadas para a construção da árvore filogenética de VHB circulante em indivíduos infectados
pelo HIV-1, que indicou a ocorrência do genótipo A em 100% das amostras como observado na
Figura 16.
C
V
Figura 16: Árvore filogenética enraizada usando o método de Neighbor-Joining construída a partir
do alinhamento de 867 pb do gene S do VHB detectado em indivíduos infectados pelo HIV-1 no
Estado do Pará. A robustez topológica da árvore foi avaliada por 1.000 réplicas de bootstrap
(valores de bootstrap ≤ 50 não foram incluídos). Os números das amostras obtidas neste estudo
estão destacados com asteristico(*) na árvore filogenética. Como grupo externo (outgroup) foi
usada a linhagem AF046996 do VHB infectante de primatas não humanos.
77
3.4.2 Análise Filogenética do VHC
Quatro sequências nucleotídicas da região 5’ NTR do VHC foram usadas para a
genotipagem. Apesar de elevada taxa de similaridade, nenhuma das sequências nucleotídicas
eram idênticas. Baseado no programa Modelgenerator, o modelo evolutivo mais adequado para a
matriz de dados foi o Tamura-Nei ajustados pelos parâmetros de frequências nucleotídicas (A=
0,22661, C= 0,27740, G= 0,27110, T= 0,22489), proporções de sítios invariáveis (0,546) e taxa
de distribuição gama (0,423). As frequências de bases, taxas de transição/transversão para purinas
(3,920) e taxa de transição/transversão para pirimidinas (4,842) foram estimadas pelo programa
PHYML durante análise filogenética. A árvore filogenética de VHC circulante em indivíduos
infectados pelo HIV-1 indicou ocorrência do genótipo 1 em 75% (3/4), seguido pelo genótipo 3
em 25% (1/4) dos indivíduos, como observado na Figura 17.
Figura 17: Árvore filogenética não enraizada usando o método de máxima verossimilhança construída a
partir do alinhamento de 269 pb da 5’ NTR do VHC detectado em indivíduos infectados pelo HIV-1 no
Estado do Pará. A robustez topológica da árvore foi avaliada por 1.000 réplicas de bootstrap (valores de
bootstrap ≤ 60 não foram incluídos). Os números das amostras obtidas neste estudo estão destacados de
vermelho na árvore filogenética.
78
3.5 ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO PASSADA E CRÔNICA DOS VHB E VHC E
CARGA VIRAL PLASMÁTICA DO HIV-1 E A CONTAGEM DE LINFÓCITOS T CD4+ E
LINFÓCITOS T CD8+
O grupo estudado foi dividido em quatro subgrupos, quais sejam: (1) constituído de
indivíduos monoinfectados pelo HIV-1, (2) indivíduos coinfectados HIV-1 e VHB, (3)
Portadores do HIV-1 com infecção passada pelo VHB e (4) indivíduos coinfectados HIV-1 e
VHC.
A mediana geral dos valores de carga viral plasmática do HIV-1 foi de 91 cópias por ml e
a mediana dos subgrupos foram as seguintes: (1) 54 cópias por mL, (2) 123 cópias por mL, (3)
157,5 cópias por mL e (4) 328 cópias por mL, respectivamente. Foi usada medianda, em vez de
média, pois os existem valores de carga viral plasmática do HIV-1 menores que 50 cópias por
mL, logo a mediana nos forneceu o valor central de cada subgrupo.
A distribuição dos valores e o resultado do Teste-G mostrou que não houve diferença
estatisticamente significante (p> 0,05) entre os subgrupos de uma única vez (Tabela 5).
Tabela 5- Resultado do Teste-G para análise da associação da carga viral plasmática do HIV-1
entre os quatro grupos.
Carga
viral
(1)
(2)
(3)
(4)
plasmática do
N
N
N
N
< 50
75
13
68
5
50-10.000
59
14
41
4
> 10.000
39
5
57
5
Valor de p
HIV-1
(Cópias/mL)
p=0,09
(1) Monoinfectados pelo HIV-1, (2) Coinfectados HIV-1 e VHB, (3) Portadores do HIV-1 com
Infecção passada pelo VHB e (4) Coinfectados HIV-1 e VHC.
A média geral de linfócitos T CD4+ foi de 414 células/mL de sangue. A média de
linfócitos T CD4+ dos subgrupos foram as seguintes: (1) 454 células/mL de sangue, (2) 440
células/mL de sangue, (3) 406 células/mL de sangue e (4) 365 células/mL de sangue. Após o
teste de Mann-Whitney, foi verificada diferença estatisticamente significante apenas entre o
subgrupo (1) e (3) p=0,048, entre os outros subgrupos não houve diferença estatisticamente
79
significante, subgrupo (1) e (2) p=0,66, (1) e (4) p=0,18, (2) e (4) p=0,48, (3) e (4) p=0,52
(Figura 18).
Figura 18- Média dos valores de linfócitos T CD4+ entre os quatro subgrupos analisados.
A média geral de linfócitos T CD8+ foi de 948 células/mL de sangue. A média de
linfócitos T CD8+ por subgrupos foram as seguintes: (1) 892 células/mL de sangue, (2) 861
células/mL de sangue, (3)1006 células/mL de sangue e (4) 759 células/mL de sangue. Antes da
realização do teste de Mann-Whitney, foram retirados outlier (Subgrupo 1 e 2) e foi verificada
diferença estatisticamente significante entre os subgrupos (3) e (4) p=0,004 e subgrupo (1) e (4)
80
p=0,01, entre os outros subgrupos não houve diferença estatisticamente significante, subgrupo
(1) e (2) p=0,95, (1) e (3) p=0,06, (2) e (4) p=0,07 (Figura 19).
Figura 19- Média dos valores de linfócitos T CD8+ entre os quatro subgrupos analisados.
Foi realizado o teste de Mann-Whitney para os valores da razão entre o linfócito T CD4 + e
linfócito T CD8+ nos quatro subgrupos e foi verificada diferença estatisticamente significante
apenas entre os subgrupos (1) e (3) p=0,004, entre os outros subgrupos não foi observada
diferença estatisticamente significante, subgrupo (1) e (2) p=0,21, (1) e (4) p=0,86, (2) e (3)
p=0,65, (2) e (4) p=0,44, (3) e (4) p=0,30 (Figura 20).
81
Figura 20- Média dos valores da razão entre linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ entre os
quatro subgrupos analisados.
3.6 ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO PASSADA E CRÔNICA DOS VHB E VHC E OS
FATORES DE RISCO
O resultado da regressão logística simples das variáveis dos subgrupos (1) e (2) encontrase descrito na Tabela 6.
Após a regressão logística múltipla foi observado que os indivíduos homossexuais tem
chances de 3,2 vezes de adquirir a infecção crônica pelo VHB (Homossexual p= 0,0162 Odds
ratio 3,2449 I.C 95% 1,24-8,47).
O resultado da regressão logística simples das variáveis dos subgrupos (1) e (3) encontrase descrito na Tabela 7.
82
Tabela 6-Resultado da regressão logística simples entre os subgrupos (1) e (2).
Variável
(1)
N
(2)
N
Uso de preservativo
Sim
Não
Às vezes
Sexo anal
Sempre
Nunca
Às vezes
História de DST
Sim
Não
Transfusão de sangue Sim
Não
Uso
de
drogas Sim
UDE
Não
UDNE
Sim
Não
38
40
49
20
64
43
53
74
20
107
1
126
58
69
7
7
9
8
8
7
11
12
7
16
0
23
12
11
8
99
20
35
92
10
117
47
15
32
Parceiros
de outros Estados
Parceiros
De outros países
Tipos de parceiros
Orientação sexual
Nenhum
1
2-19
Sim
Não
Sim
Não
Parceiro HIV
Parceiro UDE
Parceiro UDNE
Parceiro
c/
múltiplos
parceiros
Heterossexual
Homossexual
Bissexual
Sexo
com Sim
profissionais do sexo Não
P
OR
IC 95%
0,9606
0,9196
0,9604
0,0364*
0,1726*
0,7488
0,5872
1,0247
0,9516
1,0233
2,8533
0,5250
0,8547
1,2799
0,39-2,69
0,36-2,49
0,41-2,54
1,07-7,62
0,21-1,33
0,33-2,23
0,53-3,12
0,0780*
2,4868
0,90-6,85
-
-
-
0,5194
1,3397
0,55-3,26
0
20
3
9
14
3
20
6
2
8
0,2990
0,7409
0,2655
1,9728
0,8025
1,6896
0,55-7,11
0,22-2,96
0,67-4,25
0,3402
1,9667
0,49-7,90
0,3169
0,3081
0,3416
0,6008
1,800
1,5833
0,22-1,63
0,58-5,57
0,61-4,08
29
5
0,9081
0,9387
0,32-2,75
92
21
14
12
9
2
0,0571*
0,0162*
0,7399
0,4150
3,2449
0,7687
0,17-1,03
1,24-8,47
0,16-3,63
29
98
6
17
0,7346
1,1927
0,43-3,30
* Foram as variáveis usadas para a regressão logística múltipla, (1) Monoinfectados pelo HIV-1 e
(2) Coinfectados HIV-1 e VHB.
83
Tabela 7-Resultado da regressão logística simples entre os subgrupos (1) e (3).
Variável
(1)
N
(3)
N
Uso de preservativo
Sim
Não
Às vezes
Sexo anal
Sempre
Nunca
Às vezes
História de DST
Sim
Não
Transfusão de sangue Sim
Não
Uso
de
drogas Sim
UDE
Não
UDNE
Sim
Não
38
40
49
20
64
43
53
74
20
207
1
126
58
69
42
32
29
24
53
26
48
55
24
79
4
99
62
41
8
99
20
35
92
10
117
47
15
32
Parceiros
de outros Estados
Parceiros
De outros países
Tipos de parceiros
Orientação sexual
Nenhum
1
2-19
Sim
Não
Sim
Não
Parceiro HIV
Parceiro UDE
Parceiro UDNE
Parceiro
c/
múltiplos
parceiros
Heterossexual
Homossexual
Bissexual
Sexo
com Sim
P
OR
IC 95%
0,0866*
0,9445
0,0978*
0,1497*
0,8727
0,1574*
0,4594
1,6126
0,9803
0,6238
1,6253
1,0434
0,6596
1,2185
0,93-2,79
0,56-1,72
0,36-1,02
0,84-3,15
0,62-1,75
0,37-1,17
0,72-2,06
0,1090*
1,7268
0,89-3,37
0,1484*
5,0909
0,56-46,27
0,0214*
1,857
1,10-3,15
15
67
21
37
66
11
92
27
15
22
0,0430*
0,0436*
0,3616
0,1748*
2,5355
0,5507
1,3701
1,4736
1,03-6,24
0,31-0,98
0,70-2,70
0,84-2,58
0,3393
1,5676
0,62-3,94
0,0826*
0,5384
0,3899
0,6047
1,2727
0,7603
0,34-1,07
0,59-2,74
0,41-1,42
29
25
0,7982
1,0831
0,59-2,00
92
21
14
66
27
10
0,1748*
0,0745*
0,7458*
0,6786
1,7932
0,8679
0,39-1,19
0,94-3,41
0,37-2,04
29
98
32
71
0,1608*
1,5231
0,85-2,74
* Foram as variáveis usadas para a regressão logística múltipla; (1) Monoinfectados pelo HIV-1 e
(3) Portadores do HIV-1 com Infecção passada pelo VHB.
84
Nos subgrupos (1) e (3) foi observado que os indivíduos que fazem uso de drogas UDNE
tem probabilidade de 1,84 vezes de adquirir infecção passada pelo VHB e os indivíduos que não
possuem nenhum parceiro por semana tem 2,5 vezes de adquirir a infecção passada pelo VHB
(Tabela 8).
Tabela 8- Resultado final da Regressão logística múltipla dos subgrupos (1) e (3).
Variável
Uso
de
Nenhum
drogas Sim
(1)
(3)
N
N
8
15
58
62
P
OR
IC 95%
0,0481
2,5060
1,01-6,23
0,0240
1,8454
1,08-3,14
UDNE
(1) Monoinfectados pelo HIV-1 e (3) Portadores do HIV-1 com infecção passada pelo VHB.
O resultado da regressão simples realizada nas variáveis nos subgrupos (1) e (4),
encontra-se descrito na Tabela 9.
Após a regressão logística múltipla, os subgrupos (1) e (4) apenas a variável uso de drogas
endovenosas (UDE) apresentou o resultado de p < 0,05 e foi observado que os indivíduos que são
usuários de drogas endovenosa tem probabilidade 30,33 vezes de adquirir a infecção pelo VHC
(p= 0,0258, odds ratio= 30,333 e com Intervalo de confiança 95%= 1,51 a 609,87).
85
Tabela 9- Resultado da regressão logística simples entre os subgrupos (1) e (4).
Variável
(1)
N
(4)
N
P
OR
IC 95%
Uso de preservativo
Sim
Não
Às vezes
38
40
49
4
6
2
0,6104
0,1520*
0,0911*
1,3514
2,2564
0,2653
0,42-4,30
0,74-6,87
0,06-1,24
Sexo anal
Sempre
Nunca
Às vezes
20
64
43
0
8
5
0,6324
0,4657
1,3125
1,5179
0,43-4,00
0,49-4,66
História de DST
Sim
Não
53
74
3
10
0,1531*
0,3808
0,10-1,43
1,5502
0,40-6,08
Transfusão
sangue
de Sim
Não
20
207
3
11
0,5295
Uso
de
UDE
UDNE
drogas Sim
Não
Sim
Não
1
126
58
69
2
12
7
7
0,0158*
21,000
1,77-248,88
0,7154
1,2281
0,41-3,71
por Nenhum
1
2-19
8
99
20
0
8
2
0,3457
0,8290
2,1064
0,8413
0,45-9,91
0,18-4,404
Parceiros
de outros Estados
Sim
Não
35
92
7
6
0,0247*
3,6471
1,18-11,28
Parceiros
De outros países
Sim
Não
10
117
3
10
0,0840*
3,5758
0,84-15,17
Tipos de parceiros
Parceiro HIV
Parceiro UDE
Parceiro UDNE
Parceiro
c/
múltiplos
parceiros
Heterossexual
Homossexual
Bissexual
47
15
32
5
4
5
0,9242
0,0935*
0,3996
0,9456
2,9867
1,6493
0,30-2,99
0,83-10,73
0,51-5,28
29
5
0,2910
1,8774
0,58-6,04
92
21
14
11
0
3
0,625
0,26
29
98
4
9
0,6314
Parceiros
semana
Orientação sexual
Sexo
com Sim
1,3949
2,2013
1,3517
0,37 - 5,30
0,55 -8,86
0,39-4,63
* Foram as variáveis usadas para a regressão logística múltipla, (1) Monoinfectados pelo HIV-1 e
(4) Coinfectados HIV-1 e VHC.
86
4. DISCUSSÃO
As características sócio-demográficas dos portadores do HIV-1 mostraram o predomínio
de indivíduos do sexo masculino, com a média de idade de 39 anos, renda familiar baixa e com
pouca escolaridade.
O grupo foi semelhante ao descrito por Victoria et al. (2010) em portadores do HIV-1 no
Estado do Amazonas, apesar de referirem maior escolaridade e renda abaixo de um salário
mínimo.
As duas situações acompanham a tendência dos casos de AIDS no Brasil com
predominância ainda do sexo masculino e razão de 1,7 homem para cada mulher (Boletim
epidemiológico, 2012). As duas situações também acompanham a tendência da faixa etária dos
casos de AIDS no Brasil com predomínio de 35 a 39 anos (Boletim epidemiológico, 2011).
No Brasil, os indivíduos diagnosticados com AIDS até 1982 mostravam a tendência de
apresentarem alto nível educacional (nível superior ou médio). Uma inversão nessa tendência já
era observada em 1985, o percentual deste grupo considerado de alto nível educacional diminuiu,
enquanto os casos de analfabetos ou que cursaram os primeiros quatro anos do ensino
fundamental aumentavam. Já em 2000, nos casos com escolaridade informada a grande parte
eram analfabetos ou haviam completado o ensino fundamental, e apenas uma pequena parcela
apresentavam mais de 11 anos de escolaridade ou curso superior (Brito et al., 2000).
A pouca escolaridade mostrada no presente estudo acompanha essa tendência inversa de
escolaridade (Brito et al., 2000; Boletim epidemiológico, 2011).
O nível educacional expressa diferenças entre os indivíduos no acesso a informação,
perspectivas e possibilidades de se beneficiar com novos conhecimentos. Esse nível está
diretamente ligado ao nível socioeconômico da população e os indicadores mais importantes para
mensurar o nível socioeconômico associado à saúde são o nível educacional, a renda e a
ocupação (Pottes et al., 2007).
Os fatores de risco no presente trabalho mostraram um baixo percentual de usuário de
drogas endovenosas e de múltiplos parceiros, a grande maioria declarou ser heterossexual,
usuário de drogas não endovenosa, não ter tido história de DST e não ter relações com
profissionais do sexo.
O grupo foi semelhante em alguns aspectos ao encontrado por Victoria et al. (2010) em
que a maioria relatou ser heterossexuais, não ter histórico de DST, ter parceiro HIV-1, apesar de
87
referirem maior percentual de uso de drogas endovenosa e a grande maioria possuiu mais de dois
parceiros nos últimos seis meses.
As duas situações acompanham a tendência da epidemia de casos de AIDS que é o
decréscimo de casos em homossexuais e UDE, e consequentemente, aumento de casos entre
heterossexuais e mulheres, mas quando as taxas de incidência de AIDS são comparadas, o risco
de aquisição da infecção pelo HIV-1, ainda é maior entre os homossexuais e UDE (Barbosa
Junior et al., 2009).
Os homossexuais, UDE e mulheres profissionais podem representar uma ligação, para a
transmissão do HIV-1 entre o grupo de menor incidência como os heterossexuais e suas parceiras
fixas. A transmissão por contato heterossexual é uma característica da epidemia atual de AIDS,
contribuindo assim para o aumento do número de casos em mulheres (Brito et al., 2000; Barbosa
Junior et al., 2009).
A infecção pelo HIV-1 é detectada mais tardiamente nas mulheres, durante a gravidez ou
após a morte ou adoecimento de companheiros. O tempo entre a exposição e a notificação pode
prejudicar a qualidade da informação sobre a forma de infecção, o que pode ser agravado em
áreas pobres, sem serviços de saúde ou acesso à informação (Diniz & Villela, 1999; Vermelho,
1999).
A diminuição de casos de AIDS em homossexuais pode estar relacionado com a mudança
de comportamento com adoção de práticas sexuais mais seguras, levando a redução da
participação desse grupo nos casos de AIDS (Brito et al., 2000).
O decréscimo de casos de AIDS em UDE pode estar relacionado também com a política
de redução de danos adotada no Brasil, com aumento de práticas de uso seguro de drogas, à
mudança no perfil de uso de drogas no país e com a migração do uso de drogas endovenosas para
outras formas de uso das drogas (Caiaffa et al., 2006; Fonseca et al., 2007).
No presente estudo, foi encontrado um baixo percentual do fator de risco múltiplos
parceiros. Existe uma associação entre a infecção pelo HIV-1 e o número de parceiros sexuais.
Quanto maior a quantidade de parceiros sexuais, menor é a frequência de uso de preservativo, por
isso a presença de múltiplos parceiros é considerada um fator de risco (Aispindwall et al.,1991;
Gerrard & Warner, 1994; Szwarcwald et al., 2000).
A prevalência encontrada da persistência da infecção crônica pelo VHB em portadores do
HIV-1 foi semelhante em continentes da Ásia, da África, da América Central e Sul, América do
88
Norte incluindo países como Argentina, Itália, China, EUA, Etiópia, Tailândia e Tanzânia
variando de 3% a 11,4% (Quarleri et al., 2007; Kim et al., 2012; Khamduang et al., 2012; Coffin
et al., 2013; Chen et al., 2013; Wondimeneh et al., 2013; Antonucci et al., 2013; Thio et al.,
2013; Rebbani et al., 2013; Franzeck et al., 2013; Rusine et al., 2013).
O resultado do presente estudo acompanha a tendência de variação da prevalência do
VHB indicando regiões de baixa endemicidade e valores entre 5 a 10% (Konopnicki et al., 2005;
Hoffman et al., 2009; Sprandling et al., 2010). A maioria das infecções nesses países ocorre
devido a comportamento sexual de alto de risco para a transmissão do vírus como múltiplos
parceiros, heterossexuais com comportamento de alto risco, orientação homossexual e em menor
proporção em usuários de drogas endovenosas, semelhante ao encontrado no grupo estudado. Ao
contrário do que ocorre com países de alta endemicidade que apresentam o predomínio da
transmissão perinatal ou no início da infância (Alter, 2006).
A prevalência encontrada da persistência da infecção crônica pelo VHB em portadores do
HIV-1 foi semelhante ao descrito em diversos Estados como no Pará, no Mato Grosso, em Porto
Alegre, no Espírito Santo e em São Paulo, variando de 1,6% a 8,5% (Pavan et al., 2003; Monteiro
et al., 2004; Souza et al., 2004; Pereira et al., 2006; Tovo et al., 2006; Zago et al., 2007;
Portelinha et al., 2009; Silva et al., 2010; Mendes-Corrêa et al., 2000, 2010, 2011; Boletim
Epidemiológico Hepatites virais, 2012) e acompanha a tendência da prevalência da infecção
crônica pelo VHB que é maior em portadores do HIV-1 do que na população em geral, devido o
VHB e o HIV-1 compartilharem rotas comuns de transmissão (Alter, 2006).
A prevalência encontrada da infecção passada pelo VHB foi semelhante ao descrito no
Estado de São Paulo, do Pará e na África variando entre 42,9% a 45,1%. Foi maior do que
usualmente encontrado nos Estados de São Paulo, do Mato Grosso, em Porto Alegre e na
Argentina variando de 12,1% a 39,7% (Pavan et al., 2003; Monteiro et al., 2004; Rusine et al.,
2013; Mendes-Corrêa et al., 2000; Souza et al., 2004; Pereira et al., 2006; Tovo et al., 2006;
Quarleri et al., 2007). Essa variação da prevalência da infecção passada indica que a população
entrou em contato com VHB por comportamento sexual de alto risco ou transmissão parenteral.
A presença do marcador sorológico anti-HBc é mais frequentemente detectada em portadores do
HIV-1 do que na população em geral (Gandhi et al., 2003).
A imunidade vacinal para o VHB encontrada em portadores do HIV-1, foi abaixo do
encontrado em portadores nos Estados de São Paulo, do Pará, do Mato Grosso e de Porto Alegre
89
variando de 18,2% a 35,3%. A imunidade vacinal foi semelhante ao descrito no Estado de São
Paulo (Pavan et al., 2003; Monteiro et al., 2004; Souza et al., 2004; Pereira et al., 2006; Tovo et
al., 2006).
No presente estudo, a baixa prevalência da imunidade vacinal pode estar mostrando, uma
baixa taxa de resposta para a vacina, pois a média de linfócitos T CD4 + encontrada foi menor que
500 células por ml de sangue. A resposta da vacina para hepatite B está relacionada com a
contagem de linfócitos T CD4+, quanto maior a contagem desses linfócitos (acima de 500
células) maior é a taxa de resposta (Mannnucci et al.,1989; Loke et al.,1990; Tayal et al.,1994;
Wong et al.,1996; Rey et al., 2000; Welch & Morse, 2002).
Um outro fator que pode estar relacionado, com a baixa prevalência da imunidade vacinal
encontrada é que os portadores do HIV-1 podem não estar tomando as doses da vacina
recomendada para imunocomprometidos, já que não foi exigido o cartão de vacinação no ato da
entrevista para verificar o número de doses recebidas. O aumento do número de doses da vacina
da hepatite B de três para seis, aumenta a taxa de resposta da vacina de 55 a 95% em portadores
do HIV-1(Rey et al., 2000).
Desde 2006 a vacinação para o VHB tem sido recomendada para todos os portadores do
HIV-1, com marcadores sorológicos negativos para hepatite B, sendo uma estratégia utilizada
para diminuir a incidência da infecção pelo VHB em portadores do HIV-1 (CDC, 2006).
A genotipagem do VHB encontrada foi semelhante ao descrito nos continentes da Ásia,
da África, da América do Sul e Central, da América do Norte incluindo os países Argentina,
EUA, França, África do Sul em que se verificou alta prevalência do genótipo A, seguido do
genótipo D, E, F e G em menores prevalências (Quarleri et al., 2007; Kim et al., 2012; Makondo
et al., 2012; Coffin et al., 2013 ; Thibault et al., 2013; Lacombe et al., 2013; Thio et al., 2013).
A genotipagem do VHB encontrada diferiu do descrito na Tailândia, Marrocos e China,
onde a circulação dos genótipos B, C e D do VHB predominaram (Khamduang et al., 2012;
Rebbani et al., 2013; Chen et al., 2013).
A genotipagem do VHB encontrada no presente estudo, acompanha a tendência em vários
países do mundo, onde genótipo A apresenta alta prevalência. Os genótipos A, D, E, F e G são
encontrados em áreas de baixa endemicidade, onde a transmissão horizontal é a principal rota de
transmissão (Kidd-Ljunggren et al.,2002). Os genótipos B e C são mais prevalentes em áreas de
90
alta endemicidade para o VHB, onde a transmissão vertical tem papel importante na transmissão
do vírus (Huy & Abe, 2004).
A genotipagem do VHB encontrada foi semelhante ao descrito nos Estados de Rio de
Janeiro e em São Paulo onde foi encontrada alta prevalência do genótipo A, seguida dos
genótipos D, G e F (Sucupira et al., 2006; Mendes-Corrêa et al., 2010, 2011; Silva et al., 2010).
No Brasil, a identificação dos genótipos no VHB pode ser uma reflexão de um caráter
migratório intenso e altamente miscigenado da população brasileira (Mello et al., 2007).
A genotipagem do VHB encontrada no presente estudo, acompanha a tendência descrita
no Brasil, onde a maior prevalência é do genótipo A. O genótipo A circulante na América
Latina, não está exclusivamente associado com o fluxo europeu. A migração africana massiva e
forçada durante os tempos coloniais (do século XVI ao século XIX) foi o maior contribuinte para
a circulação dos genótipos do VHB encontrados no Brasil, principalmente do genótipo A que é
observado em um grande número de brasileiros portadores do VHB (Araújo et al., 2004; Campos
et al., 2005; Mello et al., 2007).
A prevalência encontrada da infecção pelo VHC em portadores do HIV-1 diferiu foi
menor, do usualmente descrito em Nova York, França, China e Itália variando entre 24,3% a
50,2%. A Itália e China são países que apresentam altas taxas de usuários de drogas endovenosas
e o grupo estudado apresentou um baixo percentual de UDE quando comparado com os países
acima, justificando a baixa prevalência da infecção pelo VHC encontrada (Kim et al., 2008;
Larsen et al., 2008; Chen et al., 2013; Antonucci et al., 2013).
A prevalência encontrada da infecção pelo VHC em portadores do HIV-1 foi semelhante
do descrito na Etiópia, África e Tanzânia variando entre 3,7% a 5,7% (Wondimeneh et al., 2013;
Rebbani et al., 2013; Franzeck et al., 2013; Rusine et al., 2013).
A prevalência encontrada da infecção pelo VHC em portadores do HIV-1, foi semelhante
ao descrito nos Estados do Mato Grosso, Pernambuco, Amazonas e Piauí variando entre 4,1% a
10,2% (Mussi et al., 2007; Carvalho et al., 2009; Victoria et al., 2010; Oliveira-Filho et al.,
2012).
A prevalência encontrada da infecção pelo VHC em portadores do HIV-1, foi abaixo do
descrito nos Estados de São Paulo e Porto Alegre variando entre 11,4% a 53,8%. Santos é uma
cidade, que possui intensa prostituição e alta prevalência de usuários de drogas endovenosa, por
isso a alta prevalência da infecção pelo VHC. O grupo estudado apresentou um baixo percentual
91
de UDE quando comparado com os Estados acima, justificando a baixa prevalência da infecção
pelo VHC encontrada (Mendes-Corrêa et al., 2000; Pavan et al., 2003; Segurado et al., 2004;
Tovo et al., 2006; Portelinha et al., 2009; Wolff et al.,2010; Boletim Epidemiológico Hepatites
virais, 2011).
Essas diferenças de prevalência entre várias regiões do Brasil pode ser consequência de
um grande número de usuários de drogas endovenosas incluídos nos estudos das regiões Sul e
Sudeste. As regiões que são mais industrializadas e urbanizadas, o acesso a drogas ilícitas pode
ser mais fácil do que nas regiões menos industrializadas e urbanizadas (Mussi et al., 2007).
Os portadores do HIV-1 apresentam comportamento de alto risco, para a transmissão de
doenças sexualmente transmissíveis e frequentemente possuem parceiros infectados pelo VHC.
Esses indivíduos, mesmo sem fatores de exposição parenteral podem ter associação com infecção
pelo VHC maior que a população em geral (Mendes-Corrêa & Barone, 2005).
O resultado da amplificação de ácido nucléico para o VHC encontrado em nosso estudo
diferiu do encontrado na literatura, em que a maioria das amostras apresentam persistência viral
para o VHC (teste PCR RNA positivo) e o restante das infecções pelo VHC sofrem eliminação
espontânea, resultando em teste sorológico positivo anti-VHC e um teste PCR RNA negativo
(Rao et al., 2012).
O baixo percentual da amplificação de ácido nucleico para o VHC, pode ser justificado
pelo fato de que algumas amostras sofreram eliminação espontânea que ocorre em 15 a 30%
depois de uma infecção aguda (Alter & Seef, 2000; Rao et al.,2012).
Um outro fator que pode justificar é que existem alguns casos em que os níveis de
anticorpos são altos e o RNA do vírus não é detectado (RNA negativo) e para isso, os ensaios
sorológicos são realizados em paralelo ao teste de Amplificação de ácido nucleico (NAT), e essa
situação que existe anticorpo para o VHC, mas o RNA viral é negativo, chama-se de infecção
presumptive resolved que ocorre em doadores de sangue infectados pelo VHC (Busch et al.,
2000; Selvarajah & Busch, 2012).
A prevalência da genotipagem do VHC encontrada foi semelhante ao descrito na Áustria,
Itália, Holanda, Escócia, Espanha, França, Suíça, Israel, Argentina e Marrocos. Esses países
apresentam alta prevalência do genótipo 1, seguido do genótipo 3 (Rubio et al., 2001; Van Asten
et al., 2004; Soriano et al., 2008; Rebbani et al., 2013).
92
A prevalência da genotipagem do VHC encontrada foi semelhante ao descrito nos Estados
da Bahia, Mato Grosso, São Paulo, Recife e Piauí onde houve o predomínio do genótipo 1
seguido do genótipo 3 (Braga et al., 2006; Mussi et al., 2007; Portelinha et al., 2009; Carvalho et
al., 2009; Oliveira-Filho et al., 2012).
A genotipagem do VHC encontrada no presente estudo, acompanha a tendência descrita
no mundo e no Brasil de alta prevalência do genótipo 1 seguido do genótipo 3. Os genótipos do
VHC (1, 2 e 3) estão amplamente distribuídos em todo o mundo. O restante dos genótipos,
apresentam distribuição mais restrita, como o genótipo 4 no Oriente Médio e África, genótipo 5
na África do Sul e o genótipo 6 no sudeste da Ásia (Kuiken et al., 2008).
A prevalência dos genótipos está associada com a rota de transmissão da infecção, os
genótipos 1 e 3 do VHC tem sido associados com a transmissão do VHC em usuários de drogas
endovenosas (Van Asten et al., 2004; Mussi et al., 2007).
Não houve diferença na contagem de linfócitos T CD4 + entre os monoinfectados pelo
HIV-1, coinfectados HIV-1/VHB e HIV-1/VHC. A média de linfócito T CD4+ encontrada no
presente estudo foi semelhante entre os subgrupos. O VHB e o VHC não estão influenciando no
curso da infecção pelo HIV-1. Semelhante ao encontrado nos EUA, Etiópia, África e Tanzânia
(Kim et al., 2012; Wondimeneh et al., 2013; Rebbani et al., 2013; Franzeck et al., 2013; Rusine
et al., 2013).
Diferindo do encontrado nos continentes da Ásia, África, América Central e Sul e
América do Norte, em que os coinfectados HIV-1 e VHB apresentaram menor contagem de
linfócitos T CD4+ do que os monoinfectados pelo HIV-1. Um mecanismo sugerido para essa
associação, seria que a persistência da infecção crônica pelo VHB pode levar ao aumento da
apoptose dos linfócitos T CD4+, diminuindo assim o número desses linfócitos T (Thio et
al.,2013).
A associação encontrada entre a contagem de linfócitos T CD4 + e a infecção passada pelo
VHB, difere do descrito na África (Rusine et al., 2013).
Não foi encontrada diferença na carga viral plasmática do HIV-1 entre os monoinfectados
pelo HIV-1 e coinfectados HIV-1 e VHB, semelhante ao descrito nos continentes da Ásia, África,
América Central e Sul e América do Norte. Apesar de diferir, do descrito na África (Kim et al.,
2012; Thio et al., 2013; Rebbani et al., 2013).
93
Não houve associação encontrada na contagem de linfócitos T CD4 + e carga viral
plasmática do HIV-1 entre o grupo monoinfectado pelo HIV-1, coinfectado HIV-1 e VHB e
coinfectado HIV-1 e VHC, logo, o VHB e o VHC também não estão interferindo no curso natural
da infecção pelo HIV-1. Semelhante ao descrito nos Estados do Mato Grosso, Piauí e Espírito
Santo (Mussi et al., 2007; Zago et al., 2007; Oliveira-Filho et al., 2012).
Houve associação entre a contagem de linfócitos T CD8+ dos subgrupos monoinfectado
pelo HIV-1 e coinfectado HIV-1 e VHC, infecção passada pelo VHB e HIV-1 e coinfectado
HIV-1 e VHC, mas esse resultado não pode ser comparado, pois na literatura não foram
encontradas referências a respeito dessa associação.
O VHB e o VHC são vírus hepatotrópicos e não causam efeito citopático. Os linfócitos T
citotóxico (CTL) possuem papel importante na erradicação viral (Gruener et al.,2001) e na
patogênese das hepatites virais (Zinkernagel et al.,1986; Sewell et al.,2000; Xibing et al.,2011).
Uma resposta CTL pode facilitar a completa eliminação viral. Porém, quando a resposta CTL
específica não consegue erradicar o vírus, contribui para uma infecção persistente (Maini et
al.,1999; Fuller et al.,2004).
Uma possível explicação, para essa associação encontrada da contagem dos linfócitos T
CD8+ entre o subgrupo monoinfectado pelo HIV e coinfectado HIV e VHC , é que esse
linfócitos
dos coinfectados, podem estar apresentando alta expressão dos receptores PD-1
(programmed death receptor 1) e Fas receptor de apoptose (CD95), ambos ligados a apoptose
que pode estar ocorrendo nesse linfócitos T CD8+ (Dianzani et al., 2003; Watanabe et al., 2010).
A associação encontrada entre a coinfecção HIV-1 e VHB e o fator de risco orientação
homossexual foi semelhante ao descrito nos EUA e no Estado do Pará, apesar de diferir do
descrito no Estado do Espírito Santo (Monteiro et al., 2004; Zago et al., 2007; Kim et al.,2008).
Existem vários fatores que estão associados à maior transmissão da infecção crônica pelo
VHB entre homossexuais masculinos. A promiscuidade sexual geralmente presente entre eles, os
coloca em risco acentuado em contato com o VHB, e as características de uma relação sexual do
tipo anal, onde microtraumatismos na mucosa peniana e retal favorecem a transmissão do vírus
através do contato com o sangue (Alter, 2006; Kim et al.,2008).
Apesar da associação evidenciada entre o comportamento heterossexual e o uso de drogas
endovenosa com a coinfecção HIV-1 e VHB (Kim et al.,2008), da infecção passada pelo VHB e
múltiplos parceiros, uso de preservativo e história de DST (Pereira et al., 2006; Zago et al.,
94
2007), no presente trabalho nenhuma dessas variáveis mostrou associação estatisticamente
significante.
A associação encontrada entre a coinfecção HIV-1 e VHC e o fator de risco uso de droga
endovenosa, foi semelhante ao descrito nos EUA e no Estado do Mato Grosso. Apesar de diferir
do encontrado no Estado de Pernambuco (Mussi et al., 2007; Kim et al., 2008; Carvalho et al.,
2009).
Apesar da associação evidenciada entre a transfusão de sangue e a coinfecção HIV-1 e
VHC (Mussi et al., 2007; Carvalho et al., 2009), no presente trabalho essa variável não mostrou
associação estatisticamente significante.
No presente estudo foi demonstrado que o uso de drogas endovenosas aumenta a
probabilidade de transmissão do VHC, comprovando que a via parenteral é o principal modo de
transmissão do VHC. Os portadores do HIV-1 configuram um grupo de alto risco para as
coinfecções VHB e VHC quando comparado com a população em geral, pois os três vírus
compartilham rotas similares de transmissão (Alter, 2006).
O presente estudo foi importante para conhecer caracterização sócio demográfica, fatores
de riscos, prevalência das coinfecções HIV-1 e VHB e HIV-1 e VHC e os genótipos circulantes
dos VHB e VHC, são informações pouco conhecidas e relatadas, em portadores do HIV-1 do
Estado do Pará.
Ressaltou-se que a prevalência da coinfecção HIV-1 e VHB é semelhante ao descrito na
literatura, a coinfecção HIV-1 e VHC foi baixa quando comparada a outro estudo com alto
percentual de uso de drogas endovenosa.
O conhecimento da distribuição dos genótipos é importante para auxiliar na escolha do
tratamento antiviral e o prognóstico do indivíduo. Alguns genótipos do VHB como o B e C estão
relacionados com o desenvolvimento de carcinoma hepático e os genótipos do VHC são
importantes que sejam determinados antes da escolha do tratamento, pois em cada genótipo a
eficácia da terapia baseada no interferon é diferente.
Faz-se necessário, mais estudos epidemiológicos para realizar a caracterização sócio
demográfica e os fatores de riscos em portadores do HIV-1 no Estado do Pará.
Faz-se necessário também, mais estudos de epidemiologia molecular para conhecer os
genótipos circulantes do VHB e VHC em portadores do HIV-1 no Estado do Pará.
95
5. CONCLUSÕES
1. As características sócio demográficas, mostraram o predomínio de indivíduos do sexo
masculino, renda familiar baixa e com pouca escolaridade.
2. Quanto aos fatores de risco mostraram um baixo percentual de usuário de drogas endovenosas
e de múltiplos parceiros, a grande maioria declarou ser heterossexual, usuário de drogas não
endovenosa, não ter tido história de DST e não ter relações com prostituta.
3. A prevalência da infecção crônica pelo VHB em portadores do HIV-1 foi maior do que a
descrita na população em geral, enquanto que a prevalência da infecção pelo VHC foi baixa.
4. Foi encontrado, um baixo percentual de persistência do VHC.
5. Observou-se o predomínio do genótipo A do VHB e os genótipos 1 e 3 do VHC.
6. O uso de droga endovenosa foi o principal fator de risco do VHC.
7. A infecção crônica pelo VHB, foi mais prevalente entre homossexuais.
8. A prevalência de imunidade vacinal contra o VHB, ficou muito abaixo do encontrado no país,
já que os portadores do HIV-1 fazem parte dos grupos de riscos que precisam ser vacinados
contra hepatite B.
9. A contagem dos linfócitos T CD8+ foi associado com a coinfecção HIV-1 e VHC e a infecção
passada pelo VHB.
10. As contagens de linfócitos T CD4+ e de carga viral plasmática do HIV-1, indicam que o VHB
e o VHC não estão interferindo no curso da infecção pelo HIV-1.
96
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125
APÊNDICE 1
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
LABORATÓRIO DE VIROLOGIA
PROJETO: HIV-UREDIPE
QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO
1. Prontuário n°:
Protocolo n°:
Data da coleta de dados:
2. Nome do Paciente:
3. Data da coleta de amostra - 1ª coleta:
2ª coleta:
3ª coleta:
Dados epidemiológicos
4. Sexo
A.Masculino
B. Feminino
5. Data de nascimento: ___ / ____/ ____
Idade
anos
6. Estado Civil: A. Casado
B. Solteiro
C. Separado
D. Viúvo
7. Naturalidade:
8. Bairro:
9. Município:
11. CEP:
10. Município de residência anterior (se reside há menos de 05 anos no endereço atual):
11. Data da última sorologia negativa: ____/____/______ Data da primeira sorologia positiva:
12. Idade da 1ª relação sexual:
13. Escolaridade
A. Não alfabetizado
B. Alfabetizado
C. 1° grau incompleto
D. 1° grau completo
E. 2° grau incompleto
F. 2° grau completo
G. 3º grau incompleto
H. 3º grau completo
14. Renda familiar (salários): a) < 1
b) 1-3
c) 4-6
d) 7-10
e) > 10
15. Categoria de exposição:
A. Homossexual
E. Usuário de droga não-EV? 1. Álcool 2. Cigarro 3.Maconha 4. Outra
B. Bissexual
F. Hemofílico
C. Heterossexual
G. Transfusão de sangue (após 1980) Local:
D. Usuários de
H. Outros, quais ____________
drogas EV
16. Uso de droga endovenosa alguma vez
A. Sim, mas não quer comentar
B. Sim
C. Não
D. Não quer comentar
17. Há quanto tempo faz uso de drogas endovenosas _______ Anos
Parou? Sim
Não
_________ Ano do último uso.
18. Como você costumava fazer uso de seringa e agulha (antes do diagnóstico de HIV)
A. sempre sozinho B. dividia com uma pessoa fixa
C. dividia com mais de uma pessoa
19. Você já fez uso de drogas injetáveis com seringas ou agulhas compartilhadas com:
A) pessoas que são de, ou, normalmente viajam para outros estados?
1. Sim
2. Não
3. Não sabe
Se sim, quais estados: ____________
B) pessoas que são de, ou, normalmente viajam para outros países?
1. Sim
2. Não
3. Não sabe
Se sim, de onde: ________________
Comportamento sexual
126
1.
2.
3.
4.
Com homens
Com mulheres
Com homens e mulheres
com parceiro(a) usuário de drogas nãoinjetáveis
5. com parceiro(a) usuário de drogas EV
21. Seleção de Parceiros
- Antes do HIV:
Fixo
Não Fixo
- Depois do HIV:
Fixo
Não Fixo
23. Parceiro(s) de (ou em) outro(s) estado(s)?
1. Sim
2. Não
3. Não sabe
24. Parceiro(s) de (ou em) outro(s) país(es)?
1. Sim
2. Não
3. Não sabe
25. Sexo anal:
Ativo
Passivo
26. Sexo com prostituta(o)
27. Uso de preservativo:
Antes do HIV?
Depois do HIV?
1. Sempre
1. Sempre
6.
7.
8.
9.
10.
Quantos por semana? _______
Quantos por semana? _______
Se sim, quais Estados: _______________
Se sim, quais países: ________________
Nunca
Não se aplica
1.Sim
2. Não
3. Não sabe
2. Nunca
2. Nunca
com múltiplos(a) parceiros(a)
com parceiro(a) transfundido
com parceiro hemofílico
com parceiro(a) portador de HIV
com parceiro(a) portador de
SIDA/AIDS
3. Às vezes
3. Às vezes
29. Preservativo na última relação sexual?
1.Sim
2. Não
30. Preservativo em relação sexual eventual?
1.Sim
2. Não
31. História de DST:
Sim
Não
Freqüência:
01
01 a 05
Mais de 05
Quais lembra: _________________________________________________________
Diagnóstico Clínico:
Sim
Não
Diagnóstico Laboratorial:
Sim
Não
32. Foi vacinado contra hepatite B?
1.Sim
2. Não
33. Já teve hepatite? 1.Sim
2. Não
Qual? 1.HAV 2.HBV 3.HCV 4. Não sabe
Diagnóstico Clínico:
Sim
Não
Diagnóstico Laboratorial:
Sim
Não
3. Não sabe
34. Uso de antiretroviral: 1. Não
2. Sim
Quais:______________________________________________________________
Data de início da terapia:
Alguma vez abandonou o tratamento?
a) Sim
Quantas vezes? ________
b) Não
Último uso (medicamento):
__________________
__________________
__________________
__________________
Hora da coleta: ________________
Hora: __________________
__________
__________
__________
__________
127
APÊNDICE 2
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Estou sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa sobre “Avaliação clínico-epidemiológica de fatores de
natureza viral e de cunho infeccioso (co-infecções virais e bacterianas ) que influenciam o curso da doença
em indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana do tipo 1” que está sendo desenvolvida
pelo Laboratório de Virologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará.
Para que eu decida em participar ou não da pesquisa me foram prestadas as seguintes informações:
 O título do projeto é: “Avaliação clínico-epidemiológica de fatores de natureza viral e de cunho infeccioso
(co-infecções virais e bacterianas) que influenciam o curso da doença em indivíduos infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana do tipo 1”.
 O pesquisador responsável é o Prof. Dr. Ricardo Ishak, Biomédico, Professor Titular da Universidade
Federal do Pará.
 O objetivo da pesquisa é aumentar o conhecimento vigente acerca da infecção pelo HIV, monitorando o
aparecimento de novas cepas circulantes na região e correlacionando com os quadros clínicos, com as
co-infecções por vírus e bactérias e com marcadores genéticos do hospedeiro.
 Durante a pesquisa o paciente deverá responder a um questionário, depois será submetido a uma coleta
de sangue para exame de laboratório.
 Essa pesquisa não oferece riscos, porque as práticas são de uso rotineiro. Uma pequena quantidade de
sangue (5mL) será coletada para a detecção de co-infecções, marcadores genéticos do vírus e do
hospedeiro.
 Serão utilizados materiais esterilizados descartáveis, como agulhas e seringas, não oferecendo risco
para a pessoa.
 Ninguém é obrigado a participar da pesquisa, assim como qualquer pessoa poderá deixar a pesquisa no
momento que quiser, pois não haverá prejuízo pessoal por esta causa.
 Esta pesquisa não oferece qualquer possibilidade de ajuda financeira aos voluntários que participaram.
 O grande benefício desta pesquisa para todos os que participam, ou não, é possibilitar um melhor
entendimento sobre os subtipos do HIV-1 circulantes em nossa região, as possíveis associações com
marcadores genéticos de resistência e o impacto das co-infecções na progressão para SIDA/AIDS.
 A participação na pesquisa é sigilosa, isto significa que, somente os pesquisadores ficarão sabendo de
sua participação. Os dados utilizados na pesquisa terão uso exclusivo neste trabalho, sem a
identificação individual do participante.
_______________________________
Assinatura do Pesquisador responsável
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente esclarecido (a) acerca
do conteúdo da mesma, assim como seus riscos e benefícios. Declaro ainda que, por minha livre vontade,
aceito participar da pesquisa cooperando com a coleta de material para exame.
Belém, ____/_____/______
___________________________________
Assinatura da participante
Prontuário: ______________
Protocolo:
Universidade Federal do Pará, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Patologia, Laboratório de
Virologia, Fone/fax: (91) 32017587/ e-mail: [email protected]
128
ANEXO 1

(vhb) e vírus da hepatite c (vhc) - PPGBAIP

Transcrição

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