Ginkgo biloba - Martin Bauer Group

Ginkgo biloba –
Importantes parâmetros de controle de qualidade
na escolha do extrato de Ginkgo biloba
O Ginkgo biloba
Os extratos de Ginkgo biloba foram introduzidos na medicina em 1965, através das
pesquisas do médico-farmacêutico alemão
Willmar Schwabe. A folha de Ginkgo contém muitos ingredientes ativos, incluindo
flavonóides, diterpenos, ginkgolideos,
sesquiterpenos entre outros (Banov e
colaboradores, 1999; WHO, 1999). Os flavonóides aparecem na forma glicosilada,
sendo as agliconas mais comuns o
kaempferol, a quercetina e a isorhamnetina. Entre os biflavonóides encontra-se a
amentoflavona, a bilobetina, a ginkgetina
e a isoginkgetina. Dentre os demais compostos se destacam os diterpenos (ginkgolídeos A, B, C, J, K, L e M) e os sesquiterpenos (bilobalídeos) (Singh et al.,
2008). De acordo com a composição química, a literatura preconiza que o extrato
padronizado EGB761 deve conter um teor
mínimo de 24% de flavonóides glicosilados e 6% de terpenóides. Entretanto, a
concentração dos ácidos ginkgólicos
(alquilfenóis) não deve ser superior a cinco partes por milhão (5 ppm), devido à
sua toxicidade (Blumenthal, 2000). Dentre
as partes utilizadas do Ginkgo biloba
encontramos os grãos de pólen, sementes, frutos, troncos e folhas, esta última
das quais têm se extraído a maioria dos
princípios ativos de ação terapêutica e de
onde baseiam-se a grande maioria dos
estudos farmacológicos. A Farmacopéia
Chinesa recomenda o emprego de Ginkgo
biloba para o tratamento de coração e
pulmões. Estudo recentes comprovaram a
sua atuação em situações de alteração de
fluxo sanguíneo e na arterosclerose cerebral. (Banov e colaboradores, 1999;
WHO, 1999).
As ações farmacológicas de G. biloba L.
encontram-se bem descritas cientificamente e consistem na diminuição da
hipóxia no tecido cerebral, inibição do
desenvolvimento de edema cerebral
pós-traumático e induzido por toxina,
redução do edema da retina e lesões
celulares na mesma, inibição da diminuição da quantidade de receptores relacionada à idade e comum entre os receptores colínicos muscarínicos e adrenérgicos α2, melhora a captação de colina
no hipocampo, aumenta a memória e
a capacidade de aprendizagem, ajuda
na compensação de distúrbios do equilíbrio, melhora o fluxo sanguíneo na
região da microcirculação, melhora as
propriedades reológicas do sangue,
remove radicais livres derivados do
oxigênio, exerce antagonismo ao fator
de agregação das plaquetas (PAF) e
efeito neuroprotetor (Blumenthal, 2000;
Cupp, 2000).
Ginkgo biloba L. é indicado em doenças
cerebrais orgânicas, como por exemplo,
a falha de memória, dificuldades de concentração, depressão, vertigem, zumbido
e dor de cabeça, melhora na distância
que o paciente consegue andar sem sentir dor causada pela doença arterial
periférica oclusiva (claudicação intermitente), vertigem ou zumbido de origem
vascular ou complexa (Mckenna et al.,
2001).
As toxicidades aguda e crônica dos extratos de Ginkgo biloba são muito baixas;
a DL 50 em camundongos foi 7725 mg/Kg
de peso corporal após administração via
oral e 1100 mg/Kg de peso corporal após
aplicação intravenosa.
Pesquisas com o extrato não mostraram
efeitos mutagênicos, carcinogênicos ou
teratogênicos (Rister 1994).
Aspectos regulatórios
Uma pesquisa de Carvalho et al. em
2008 determinou um panorama dos
medicamentos fitoterápicos registrados
pela ANVISA no Brasil. Encontraram 432
fitoterápicos simples e 80 compostos
registrados, dentre estes, até a data do
estudo, a espécie vegetal com maior
número de derivados registrados era o
Ginkgo (Ginkgo biloba), com 33 respectivamente. (Carvalho 2008)
A Anvisa buscou estabelecer a padronização de marcadores químicos para diversas plantas e limite diário para seu uso,
sendo assim por meio da Instrução Normativa nº 5, de 11 de dezembro de 2008
(Brasil, 2008), publicou em sua lista de
fitoterápicos de registro simplificado a
padronização para o extrato de Ginkgo
biloba: “Extrato a 22-27% ginkgoflavonóides (Quercetina, Kaempferol, Isorhamnetina), 5 a 7% de terpenolactonas (Bilobalídeo, Ginkgolídeos A,B,C,J)”. Estes
números são baseados em ensaios da
literatura mundial, principalmente nas
farmacopéias Européia e Americana
(EP 6.1; USP 32).
Qualidade da matéria-prima,
adulterações, métodos de detecção
O Ginkgo biloba é um dos mais famosos
fitoterápicos do mercado mundial, seu
processo de produção é extremamente
complexo e custoso, o que torna este
extrato alvo comum de adulteração. A
padronização atual determinada mundialmente e pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária na IN 5 (Brasil 2008,
USP 32, EP 6.1) é: Extrato a 22-27%
ginkgoflavonóides (Quercetina, Kaempferol, Isorhamnetina), 5-7% de terpenolactonas (Bilobalídeo, Ginkgolídeos A,B,C,J).
Entretanto, testes de produtos comerciais
vendidos em farmácias realizados por
laboratórios independentes revelam adulteração no extrato de Ginkgo biloba por
glicosídeos flavonóicos de outras origens.
Em 1999 o laboratório independente americano, ConsumerLab testou o conteúdo
de glicosídeos flavonóicos em 32 amostras
de medicamentos tendo como base de
comparação o extrato padronizado 24/6
de Ginkgo biloba. 75% das amostras
passaram no teste. Embora este resultado
seja satisfatório, em 2003 este mesmo
teste foi realizado e o resultado foi que
apenas 25% das amostras passaram
(Myers 2008), o que demonstra uma queda na qualidade da matéria-prima utilizada na produção destes medicamentos
nos EUA.
A presença característica de terpeno lacto-nas (Bilobalídeo e Ginkgolídeos A, B, C
e J) fornece evidências de que o extrato é
originário da planta Ginkgo biloba. As fo-
lhas de Ginkgo biloba possuem naturalmente mais terpenolactonas que glicosídeos flavonóicos, portanto atingir os 6%
de terpenolactonas raramente é um problema.
Por outro lado, para atingir 24% de flavonóides uma quantidade maior de folhas
se faz necessária (Myers, 2008).
A quantificação de glicosídeos flavonóicos
(quercetina, kaempferol e isorhamnetina)
não exclui necessariamente a possibilidade
de adulteração dos extratos de ginkgo
por agliconas isoladas (ex. quercetina,
kaempferol e isorhamnetina), flavonóides
glicosilados isolados (ex. hiperosídeo,
rutina) ou outro material vegetal contendo
flavonóides e flavonóides glicosilados
(Sloley 2003). Essa adulteração é de baixo
custo e pode facilmente contornar os testes
realizados no controle de qualidade.
Segundo métodos farmacopéicos (USP 32,
EP 6.1), a determinação quantitativa desse
extrato é feita por hidrólise ácida, sendo a
quantificação reduzida à 3 agliconas. A
mutiplicação do resultado pelo fator de
2.5 permite calcular o teor total de glicosídeos flavônicos. Caso o controle de qualidade não seja minucioso, isso abre precedente para um produtor inescrupuloso
que, constatando que seu extrato não tem
o teor necessário de glicosídeos flavonóicos, fica tentado à incluir flavonóides provenientes de outras fontes. Um exemplo
de adulteração foi a encontrada por Sloley
et al., que em seu estudo encontrou uma
das amostras com uma alta concentração
de Rutina (indicando adulteração) e outra
mais grave ainda, sem a presença de
Ginkgolideos B e C (que indica sequer a
presença da planta Ginkgo biloba) (Sloley
2003).
Como forma de exemplificação, na Figura 1
observamos o cromatograma de um
genuíno extrato 24% de flavonóides com
todos os seus glicosídeos flavonóicos. Já a
Figura 2 mostra o resultado somente das
Ginkgo agliconas, ou seja, um extrato
genuíno de Ginkgo biloba 24% após hidrólise ácida.
Os glicosídeos flavonóicos podem ser separados dos terpenos durante a produção, o
que facilita o produtor desonesto a simplesmente controlar os terpenos a 6%,
enquanto adiciona glicosídeos em forma
de rutina (que contém 98% de quercetina
e é encontrada em abundância no trigo
sarraceno), e/ou kaempferol (proveniente
da planta chinesa Fructus Sophorae) ou
ainda de outra forma barata de quercetina
(Myers 2008; Patterson 2009).
Fig. 1: Cromatograma de CLAE – Ginkgoflavonóides – Extrato genuíno
Fig
24% Glicosídeos flavonóicos (Fonte Finzelberg GmbH).
Fig. 2: Cromatograma de CLAE – Ginkgo Agliconas – Extrato genuíno
24% Glicosídeos flavonóico (Fonte Finzelberg GmbH).
Substância adulterante
Porcentagem de glicosídeos flavonóicos simulados no produto final
1% quercetina
2.5%
1% kaempferol
2.5%
1% rutina
1.24%
Quantidade de flavonóides provenientes de outras fontes adicionados a extratos
adulterados de Ginkgo biloba versus o teor de glicosídeos flavonóicos que estes
simulam no produto final.
O aspecto mais preocupante desta adulteração é que não há estudos que comprovem a eficácia e segurança no extrato
modificado, já que este não é mais fiel
aos extratos utilizados nos testes clínicos
e toxicológicos do Ginkgo biloba.
Embora a adição de rutina ou outros
adulterantes seja contornada facilmente,
uma observação minuciosa nos resultados
da identificação por Cromatografia em
Camada e da quantificação de flavonóides
dão indicativos da falsificação.
Fig. 3:
Cromatograma da análise de Ginkgo Glicosídeos Flavonóicos por Cromatografia em camada delgada de amostras
comerciais de Ginkgo biloba (Fonte Finzelberg GmbH).
Amostra 1 Adulteração por Rutina; Amostra 2 Extrato Genuino; Amostra 3 Adulteração por Rutina e Quercetina;
Amostra 4 Substâncias de Referência; Amostra 5 Adulteração com Quercetina; Amostra 6 Adulteração com Rutina
e Kaempferol.
Obs.: Fotografado sob luz UV 365 nm
A cromatografia em camada delgada com
leitura sob luz UV é um procedimento
simples descrito na Farmacopéia Européia
(EP 6.1) muito utilizado na identificação de
material vegetal. Observe na Figura 3 um
exemplo de como é fácil identificar uma
adulteração de material.
As amostras que sofreram adição inescrupulosa de material possuem a coloração
respectiva ao aditivo mais acentuada que
a amostra genuína, como podemos observar nas amostras 1, 3, 5 e 6.
AMOSTRA 1: Adulteração Rutina
AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Quercetina
AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Kaempferol
Fig 4:
Fig.
Cromatogramas de CLAE – Ginkgo Glicosídeos FlaCro
vonóicos – Extratos Adulterados (Fonte Finzelberg
von
GmbH). Comparação do extrato adulterado com o
Gm
extrato genuíno (Fonte Finzelberg GmbH).
Entretanto, o teste mais comumente utilizado na indústria para análise de extrato
vegetal é a CLAE (Cromatografia líquida
de alta eficiência). Comparando os resultados das Figuras 4 e 5 notamos que a
análise minuciosa de todos os glicosídeos
flavonóicos (Figura 4) mostra com clareza
a adulteração dos flavonóides específicos.
Já a análise das ginkgo agliconas (Figura 5)
deve ser cuidadosamente observada. Note
que no caso de adulteração a proporção
entre os componentes é discrepante.
Observe também que os picos referentes a
quercetina e kaempferol são muito parecidos quando não iguais, e o pico da isorhamnetina é cerca de 1/5 destes. Muitos
fatores podem influenciar a razão entre os
picos analisados (mudança geográfica,
clima, safra, processamento, etc.) entretanto, estudos realizados com amostras
provenientes da Alemanha, França, EUA e
China, juntamente com a literatura já
publicada possibilitaram a American Herbal Pharmacopeia a sugerir uma proporção de 4:4:1 a 6:5:1 de Quercetina, Kaempferol e Isorhamnetina respectivamente
(Myers 2008).
AMOSTRA 1: Adulteração Rutina
AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Quercetina
AMOSTRA 2: Adulteração Rutina + Kaempferol
Fig. 5:
Cromatogramas de CLAE – Ginkgo Agliconas –
Comparação do extrato adulterado com o extrato
genuíno (Fonte Finzelberg GmbH).
Extrato Finzelberg
Finzelberg apresenta seu extrato de Ginkgo Biloba com 2 especificações diferentes,
um contempla todos os parâmetros exigidos pela Farmacopéia Européia e o outro
os parâmetros da Farmacopéia Americana.
A tabela ao lado apresenta um resumo de
ambos. Para maiores informações entre
em contato com nosso escritório no Brasil:
MB Brasil.
Farmacopéia Americana (USP)
Farmacopéia Européia (EP)
Identificação por CCD
de Flavonóides
Confere com padrão
Confere com padrão
Ensaio Glicosídeos
Flavonóicos (%)
22,0 - 27,0
22,0 - 27,0
Ensaio Terpenolactonas (%)
5,4 - 7
5-7
Ensaio Bilobalídeo (%)
min 2,6
2,6 - 3,2
Ensaio Ginkgolídeos A, B, C (%)
min 2,8
2,8 - 3,4
Ensaio Ácidos Ginkgolicos (%)
max 5ppm
max 5ppm
Quadro comparativo entre as diferentes especificações dos extratos de Ginkgo biloba apresentados pela Finzelberg
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