Aula06BioqII-Qui_ContExpressaoGenica

Aula de Bioquímica II
Tema:
Controle da Expressão Gênica
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Controle da Expressão Gênica
Todas as células de um contêm as mesmas informações depositadas no genoma
O Gene é expresso quando ele é transcrito em mRNA
Principal ponto de controle
Circuitos regulatórios guiam o desenvolvimento de eucariotos multicelulares e envolvem
diversos tipos de mecanismos regulatórios
A expressão de uma proteína pode ser:
Constitutiva: Constantemente expressa
Induzida: Expressa quando necessária
Controle da Expressão Gênica
Processos que afetam a concentração do produto gênico: pontos potenciais de controle
Gene: É um segmento de DNA que leva à produção
de um transcrito de RNA e inclui regiões que
antecedem e que seguem a região transcrita, bem
como sequências que não são traduzidas (íntrons)
que se intercalam aos segmentos codificadores
individuais (éxons), que são traduzidos.
Inclui elementos reguladores, o promotor e
oterminador da transcrição
A iniciação da transcrição (1) é o principal
mecanismo, pelo menos o mais bem
documentado
regulação sincronizada
O processamento pós-transcricional (2) e a
estabilidade do mRNA (3) são muito
importantes, principalmente em eucariotos
Controle da Expressão Gênica
Em procariotos
A identidade da sequência consenso do
promotor dita a “força” da transcrição pela
frequência do recrutamento da RNApol
Existe modulação adicional por proteínas
Esquema geral simplificado do promotor de genes de eucariotos
Existem elementos regulatórios a milhares de bases a upstream do promotor
Região promotora do gene da PEPcarboxiquinase
Alta complexidade da regulação
deste gene.
Ajuste fino proporcional a
importância do processo
Controle da Expressão Gênica
As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA
Regulação negativa
Dependente de Repressores
- Inibem a expressão gênica por
bloquear o acesso da RNApol ao
promotor
- Dependem da presença do
Efetor (sinal molecular)
Tipo característico em
procariotos
Elementos operador próximos
ao promotor
Controle da Expressão Gênica
As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA
Regulação positiva
Dependente de Ativadores
Induz a expressão Gênica
- Dependem da presença do
Efetor (sinal molecular)
Tipo característico em
eucariotos
A Expressão Gênica é regulada por proteínas
Proteínas específicas reconhecem sequências específicas de DNA
Possuem domínios de interação com DNA e de interação com outras proteínas
- Normalmente dímeros
reconhecer sequências palindrômicas
simétricas
o papel dos Sulcos maior (mais específico) e menor (menos específico) no DNA
Alta especificidade
KA das proteínas
regulatórias pelas
sequências-alvo é 4-6
ordens de grandeza
maior do que para
outras sequências
- Sequências específicas de DNA
superfície específica
para formação de ligações de H
Domínios de Ligação ao DNA
-Formam estruturas autônomas separadas do restante da proteína
- Estruturas capazes de interagir estreita e
especificamente com o DNA-alvo
- Relativamente pequenos (60-90 resíduos)
- projetam-se na superfície das proteínas
- Conectadas ao restante da proteína por
regiões flexíveis
O Domínio Hélice-volta-hélice está presente
em muitas proteínas ligadores de DNA
- Apresentam-se como “dímeros” de forma a
reconhecer a sequência palindrômica no DNA
- Forma um eixo de simetria com DNA
Domínios de Ligação ao DNA
Organização dimérica (exceto o zinc finger)
Reconhecimento por
uma fita beta
Zíper de Leucina
Leu
Hélice-alça-hélice
Resíduos básicos
Interação com o Pi
Zinc Fingers
Homeodomínios
Controle da expressão em Procariotos
Procariotos produzem proteínas relacionadas a processos interdependentes de forma
agrupada
- Mecanismo geral simples para coordenar a regulação de genes inter-relacionados
Sistema óperon: unidade básica de transcrição
- Operador
sequência de DNA próximo ao promotor
mRNA policistrônico:
1 promotor
1 mRNA
várias proteínas traduzidas
- Cada sequência codificadora tem seu próprio motivo Shine-Dalguarno
- Existem exemplos deste sistema em eucariotos
exceção
Controle da expressão em Procariotos
Procariotos induzem a expressão de enzimas conforme a disponibilidade de fonte de
energia
β-galactosidade é uma importante ferramenta
biotecnológica
atua sobre galactosídios alternativos
Controle da expressão em procariotos
A indução da expressão da β-galactosidase
induz a expressão de 2 outras enzimas
- Galactosídeo permease: transporte de lactose pela membrana
- Tiogalactosídeo transacetilase: desintoxicação de outras moléculas transportadas pela
permease
Indução conjunta de enzimas para adaptação a um novo ambiente:
Mecanismo comum de indução.
Modelo do óperon: Explica a regulação paralela de diferentes proteínas
-Formado por:
- um gene regulador: codifica uma proteína repressora
- uma sequência operadora: alvo da proteína repressora
- genes estruturais: produtos da expressão do óperon
operon Lac
Conjunto de genes envolvidos na regulação e expressão das proteínas envolvidas no
metabolismo de Lactose.
P: sequência promotor
lacI: gene proteína repressora
O: operadores: sítio de ligação da proteína repressora
lacZ: gene da β-galactosidade
lacY: gene da permease
lacA: gene da tio-transacetilase
lacZ, lacY e lacA formam um mRNA policistrônico ou
poligênico
Proteína repressora Lac
Permanece fortemente ligado à sequência operadora na ausência de Lactose
- KA 1x106 vezes maior pela sequência operadora do que por outra sequência
Impede a transcrição por impedir que a RNApol desenrole o DNA localmente
Estrutura tetramérica
Cada monômero possui um domínio hélice-voltahélice que reconhece a sequência operadora
- Ocasiona a formação do loop de DNA
Proteína repressora Lac
O ligante da Proteína repressora Lac é um produto secundário da β-galactosidase
1,6-alolactose: INDUTOR
- A lactose não interage com a Proteína repressora Lac
α-D-galactopiranosil-(1
4)-D-glicopiranose
Indutores
α-D-galactopiranosil-(1
6)-D-glicopiranose
Óperon Lac
1) Na ausência de Lactose, não existe 1,6-alolactose e portanto a Proteína repressora Lac
permanece ligada à sequência operadora impedindo a transcrição do DNA
2) Na presença de Lactose, parte desta é convertida a 1,6-alolactose que se liga à Proteína
Repressora Lac e reduz a afinidade desta pela sequência operadora. Com a saída da
Proteína repressora Lac da sequência operadora os genes estruturais podem ser transcritos
na forma de um mRNA policistrônico ou poligênico
Mesmo na ausência de lactose, existe transcrição basal dos genes estruturais
lacI
mRNA
Repressor lacI ligado ao
operador bloqueia a
transcrição dos genes
lacZ, lacY e lacA
lacI
mRNA
lac mRNA (policistrônico)
Permease
β-galactosidase
Transacetilase
Controle da Expressão Gênica em procariotos
Comutação de reguladores
Ativação da expressão gênica por AMPc
AMPc (coativador)
indução conjunta de enzimas catabólicas
[Glicose] alta
[AMPc]
baixa e lactose ausente
[Glicose] baixa
[AMPc]
alto e lactose ausente
AMPc liga-se à cAMP
receptor Protein – CRP
CRP liga-se ao operador do
operon Lac a -51 do Promotor
e “recruta” a RNApol
Atuam em vários óperons
Regulons: rede de
óperons com reguladores
comuns
[Glicose] alta
[AMPc]
baixo e lactose presente
Ativação fraca
[Glicose] baixa
[AMPc]
alto e lactose presente
Ativação forte
Efeito coordenado entre
repressor/ativador
Controle da Expressão Gênica em procariotos
Em procariotos, muitos óperons funcionam de forma análoga ao óperon Lac
Ex: óperon Pur
Controla o metabolismo de Purinas
A proteína Repressor Pur liga-se à sequência operadora na presença de um ligante:
co-repressor
O genoma de E. coli contêm mais de 20
sequências operadora para a proteína
repressora Pur
Regulon
Permite a regulação paralela de todos
os passos metabólicos da síntese de
purinas
Controle da Expressão Gênica em procariotos
A estratégia dos atenuadores
- Comum nos óperons para síntese aminoácidos
Atenuação do óperon trp
- Ocorre na síntese do mRNA
O óperon trp controla a síntese de
- Formação de grampos de mRNA auto complementares
Triptofano
Altos níveis de Trp reprime o óperon
- Ligação do Trp a proteína repressora induz
ligação ao operador
Se a [Trp] ↑ síntese rápido do peptídeo líder
Formação alça 3-4
fim da transcrição
Se a [Trp] ↓ síntese lenta do peptídeo líder
Formação alça 2-3
transcrição continua
Controle da Expressão Gênica em procariotos
Outros mecanismos, inclui-se a autoindução em biofilmes: quorum sensing
Feedback de tradução de óperons de
proteínas ribossomais
- Visa regular a concentração das
proteínas ribossomais e rRNA
A proteína ribossomal inibe a
tradução de seu próprio mRNA
A medida que o respectivo
rRNA é sintetizado, a proteína
ribossomal dissocia-se de seu
mRNA e liga ao rRNA
- Maior afinidade pelo rRNA
Controle da tradução
Resposta estringente
- Depende da disponibilidade de aminoácidos
- Ausência de aminoácidos
- Recrutamento do fator estringente
- Síntese de ppGpp
- Inibição da RNApol
Controle da Expressão Gênica em procariotos
Papel de pequenos RNAs
sRNA
Alguns mRNAs bacterianos são regulados por sRNA em cis ou em trans
trans: outro sRNA
regula a tradução de
um dado mRNA
Indução
Função dependente da
proteína Hfq
facilita
formação de duplex
RNA-RNA
cis: parte do próprio
mRNA regula a própria
tradução
- Riboswitches: Aptâmeros
naturais de RNA
dependentes de ligantes
- Ligantes identificados:
TPP, cobalamina, FMN, Lys,
Gly, purinas e adoMet (Sadenosilmetionina).
Repressão
Mecanismo de
splicing em
eucariotos
Controle da Expressão Gênica em procariotos
Controle por recombinação
Recombinação regula a expressão de diferentes proteínas do flagelo (FljB e FliC) a cada
1000 gerações
Mecanismo de escape do sistema imune
Sistema óperon
- Recombinase Hin inverte posição do promotor (e gene para a hin) para a FljB
- Sem expressão da proteína repressora FljA
expressão da FliC
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos
O tamanho do genoma
Diversidade Celular
- Impõem mais complexidade para atingir especificidade.
Transcrição e tradução NÃO são processos acoplados.
Os genes de uma mesma via não estão organizados em óperons.
- Existem somente algumas exceções
Transcrição basal não observada
transcrição está inativa para a maioria dos genes
- Regulação positiva
- Regulação negativa
requer Ativadores sempre
necessitaria de grande número de repressores presentes na célula
em quantidade
há poucos exemplos em eucariotos
Papeis dos ativadores ou fatores de transcrição
1) Montagem do complexo de transcrição basal com os TFII
2) Outras proteínas regulatórias específicas se unem a este complexo basal
- Ligam-se à sequências “Enhancer” - Potenciadores
São proteínas modulares e multiméricas
– Domínio de Ligação ao DNA e Domínio Ativador
Remodelamento da Cromatina
O DNA de eucariotos se apresenta ligado à proteínas formando os Nucleossomos
- As regiões do DNA que estão sendo transcritas estão menos compactadas
- Heterocromatina
fortemente condensada: não disponível para transcrição
- Eucromatina
Parcialmente disponível para a transcrição
A regulação negativa em eucariotos seria redundante com os nucleossomos
Remodelamento da Cromatina
A acetilação das histonas contribuem para a ativação da transcrição
- Histonas acetilases (HAT) acetilam a Lys da cauda N-Terminal das Histonas
1) Reduz a afinidade da Histona pelo DNA
afrouxa o nucleossoma
2) Recrutamento de outros componentes da maquinaria de transcrição
3) Iniciação da remodelagem da cromatina
Reversão executada
por
Histonas
desacetilases
repressão da
transcrição por
compactação da
cromatina
Remodelamento da Cromatina
Em levedura, os genes necessários para o metabolismo de galactose são ativados pela
proteína GAL4.
- Reconhece a sequência: 5’-CGG(N)11CCG-3’
4.000 pontos no DNA de levedura
- Somente 10 deles são identificados pela GAL4
99,75% estão bloqueados
Regiões do DNA que estão mais ou menos compactadas são
tecidos específicas
Existem proteínas remodeladoras do DNA tecido específicas
que regulam os conjuntos de genes que deverão ser
transcritos e os que devem ser “silenciados”.
O DNA é metilado por Metilases específicas no C5 da C
- 70% das 5’-CG-3’ estão metiladas
- A metila projeta-se para o sulco maior bloqueando interações
- As 5’-CG-3’ próximas ao 5’ dos genes ativos são
hipometiladas
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos
As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA
Envolve interação, direta ou indireta, de
ativadores/repressores e a RNApol em eucariotos
Requerimento de:
- elementos potenciadores (enhancers) a longa
distância do promotor
- Regulador de arquitetura para dobrar o DNA
(alças ou looping)
- Coativador aumenta a taxa de
recrutamento/ativação da RNApol
Repressor pode atuar bloqueando a ação do
coativador
Controle combinatório
- Depende do subconjunto de proteínas produzidas
naquele tipo celular
- Heteroligômeros e heterocomplexos
Controle da Expressão Gênica em Eucariotos
Controle combinatório
Dependendo do conjunto de proteínas
diferentes efeitos
Número reduzido de proteínas reguladoras
maior especificidade
reconhecem sequências assimétricas
Ex: 2 famílias de reguladores com 3 membros cada
Formam Homodímeros e heterodímeros
36 possíveis combinações
Acentuadores ou potenciadores
- sequências específicas “acima” do promotor que funcionam como pontos de ligação
específicos para proteínas ativadoras ou repressoras.
- Podem estar a milhares de pares de base à 5’ do promotor
- Dependem da presença das proteínas ligadoras específicas
- Podem ajudar a expor o DNA para RNApol II
- Podem ajudar a montagem do complexo basal de
transcrição
Acentuador da creatina
quinase regulando a expressão
da β-galactosidade
Regulação gênica em eucariotos
Requer ação combinada de diversos agentes
UAS: upstream activator sequences: Sequências ativadoras a montante
Pode ser a jusante também
Reguladores da arquitetura: proteínas HMG
Remodelamento da cromatina
Coativadores: Ativadores ou repressores
interação com o Mediador
Fatores basais de transcrição
Regulação gênica positiva em eucariotos
Coreografia da ativação da transcrição
Eventos em cascata
variável para diferentes genes
Processo dependente de moléculas efetoras e reversível
Expressão gênica regulada por hormônios
Receptores Nucleares
Os receptores para hormônios estereoidais atuam induzindo a transcrição
- Proteínas modulares
domínio de ligação ao DNA e domínio de ligação ao hormônio
Ex: Estrogênio e testosterona
~ 50 membros no genoma humano
Atuam como dímeros
reconhecem
elementos simétricos
Agonistas
Antagonistas
Expressão gênica regulada por hormônios
Receptores Nucleares
Os Receptores de hormônios nucleares regulam a transcrição por recrutar Co-ativatores ou
mediadores para o complexo de transcrição
Expressão gênica regulada por hormônios
Ação hormônios esteroides, tireoidianos e retinoide
- Livre transito pela membrana plasmática
Presença de sequências HRE: elementos de resposta hormonal específicos
Regulação por repressão da Tradução
Transcrição e tradução são processos desacoplados
citoplasma
edição do mRNA e transporte para o
Envolve o armazenamento de mRNAs inativos no citoplasma
1) Fatores de iniciação da tradução são sujeitos a fosforilação
inibe
2) Proteínas repressoras ligam-se à região 3’ não traduzida (3’UTR - untranslated region)
- Bloqueia a iniciação da tradução
3) Sítio de ação da regulação gênica regulada por RNA
Silenciamento gênico
O papel do microRNA – miRNA
Produção transitória
60% dos genes humanos
chamados como pequenos RNAs temporais (stRNA)
Eucariotos superiores (nematódeos, mosca, plantas e mamíferos)
Fazem parte de noncoding RNA (ncRNA)
incluem snRNA, tRNA, rRNA, snoRNA
- Mamíferos codificam mais ncRNA do que mRNA
- O miRNA interage com o mRNA na 3’UTR
degradação ou inibição da tradução
- Controla o desenvolvimento do organismo
- Controle de infecções virais em plantas
Possuem ~70 nt auto-complementares
RNA-RNA
grampos
duplex
Clivagem pela endonuclease DICER ou DROSHA
Interação do fragmento com o mRNA alvo em
duplex RNA-RNA
inibição da tradução ou
degradação
- Base da técnica de RNA de interferência (siRNA)
- Aplicação no controle de infecções virais