(Rattus novergicus) E ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA DO
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(Rattus novergicus) E ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA DO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL Área de Fisiologia e Farmacologia ACOMPANHAMENTO DOS PARÂMETROS FISIOLÓGICOS E SANITÁRIOS DE RATOS (Rattus novergicus) E ASPECTOS DE BIOSSEGURANÇA DO BIOTÉRIO DO DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL DA UFRPE Pesquisador: Prof. Dr. Anísio Francisco Soares – Prof. Adjunto III - CPF: 558.853.814-53 Laboratório de Fisiologia Animal - DMFA/UFRPE (Biólogo) Contato: [email protected] / [email protected] Telefone: (81)33206394-6391 – 99556913 Colaborador: 1) Jaqueline Bianque de Oliveira – Profª Adjunto III – CPF: 801.493.914-04 Laboratório de Parasitologia – Dep. de Biologia/UFRPE (Méd. Veterinária) 2) Maria Raquel Querino de Sousa – Profª Associada II - CPF: 578.224.334-15 Laboratório de Fisiologia Animal - DMFA/UFRPE (Méd. Veterinária) 3) Filipe Guilherme Ramos Costa Neves - CPF: 090.239.394-41 Discente do curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas Recife / março – 2012 2 1 Objetivos 1.1 Gerais Padronizar as condições de sanidade de ratos Wistar albinos (Rattus novergicus albinus) criados no Biotério de criação e experimentação do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da UFRPE, visando à obtenção e manutenção de animais em condições que atendam aos padrões necessários à sua utilização na pesquisa científica. 1.2 Específicos 1.2.1 Nos animais serão necessários: Avaliar parâmetros hematológicos; Realizar análise parasitológica; Vermifugar periodicamente os animais; Acompanhar as condições clínicas; 1.2.2 No ambiente do biotério: Desenvolver um mapa de risco das instalações; Implantar um sistema de controle de temperatura e luminosidade. 2 Introdução (estado da arte) A ciência visa o conhecimento do mundo em que se vive, seu objetivo é buscar as verdades universais, que existem independentemente daquilo que é percebido pelos nossos sentidos (Platão–429-327 a.C.), a fim de que haja uma melhor qualidade de vida dos seres vivos na terra. Para que haja uma evolução contínua das áreas de conhecimento humano, como a medicina e a biologia, a experimentação torna-se imprescindível (CLARK. K., 1977). Há muito tempo, desde a antiguidade, os animais são utilizados na experimentação. Na pré-história o homem já os observava, pois compreendia o coração como um órgão vital, como nas pinturas rupestres da caverna de Niaux, no sul da França, que contêm pinturas de bisão com flechas fincadas em seu coração. A partir do século V a.C., os animais passaram a ser utilizados nos intuitos da ciência. Pode-se citar Hipócrates (460–370 a.C.) que já relacionava alguns órgãos humanos com os de animais, fazendo uso da observação clínica; Alcmêon (500 a.C.) da colônia grega de Croton, através da dissecção de animais, fazia suas anotações. Logo, os animais tornaram-se os melhores modelos para se fazerem investigações anatômicas (PAIXÃO, 2001). Em 400 a.C. vários estudos são apresentados, baseados em animais; o uso destes foi fundamental para que Aristóteles fizesse comparações anatômicas em mais de 50 espécies diferentes, e portanto surgisse a anatomia comparada; o grande filósofo deixa a ideia de que tudo que há na face da terra é para servir aos seres dotados de razão; sendo assim, as plantas serviriam aos animais, e estes aos seres humanos. No século III a.C., na Escola de Alexandria, Herófilo, foi o primeiro a dissecar animais em público; já Erasístrato realizava experimentos com animais vivos, em que fez o 3 corte em uma artéria, elucidando que esta não era preenchida por ar e sim por sangue, quebrando assim paradigmas da ciência preexistente (PAIXÃO, 2001). Como se vê, os animais já eram utilizados há muito tempo, cujo principal objetivo seria o de adquirir conhecimento. É perceptível que a medicina surgiu dessas observações e experimentações feitas nos bichos. Galeno, considerado “o príncipe dos médicos”, realizava, no século II d.C., demonstrações com animais vivos e em público. Após sua morte, as experimentações com animais só voltam a ser descritas no século XV, no qual Versalius (1514 - 1564) publica um livro: “De fabricas Corporis Humani”, onde contém um capítulo tratando dos métodos de experimentação sobre a fisiologia dos animais. Nessa mesma época, podemos citar outros nomes que conduziram experimentos nos animais, como: William Harvey (1578 - 1657), Francis Bacon (1561-1626), René Descartes (1596-1650), Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) e Stephen Hales (1677-1761) (Paixão, 2001). William Harvey, em 1638, analisou a fisiologia da circulação em oitenta espécies diferentes; talvez, essa tenha sido a primeira pesquisa a fazer uso dos animais sistematicamente (RAYMUNDO & GOLDIM, 2007). Charles Darwin, quando, em 1859, publica seu livro: “A Origem das Espécies”, estabelece os pressupostos do vínculo existente entre as diferentes espécies animais num único processo evolutivo, logo a teoria de Darwin possibilitou a extrapolação dos dados obtidos em animais para seres humanos (GOLDIM, 1997). Não obstante, no presente século, a experimentação animal irá contribuir para o avanço da medicina humana e veterinária. Desde o início da utilização de roedores na pesquisa, em 1880, grande importância foi dada ao padrão microbiológico dos murideos. Naquela época, a grande mortalidade dos animais era considerada como parte do trabalho. Logo, foram desenvolvidas melhorias nas instalações para animais, em áreas como sanitização, nutrição e controle ambiental. Em 1960, para diminuir a incidência de patógenos, foi utilizada a cesárea asséptica a fim de evitar a contaminação dos filhotes pela mãe. Em 1985, época que ficou conhecida como a época da “erradicação de viroses murinas”, marcou a redução de viroses em roedores, a partir de testes sorológicos e posterior eliminação dos animais que ainda permaneciam contaminados (MAJEROWICZ, 2008). O combate a patógenos deve ser intenso nas instalações que abrigam os reagentes biológicos da experimentação, já que infecções nos animais interferem, significativamente, nas pesquisas. Segundo o Ministério da saúde, no Brasil, Biossegurança é definida como a “condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal e vegetal, tendo como base, o respeito à vida, os valores éticos e a responsabilidade social; e como objetivos a proteção do indivíduo, da sociedade e do meio ambiente” (SILVA, 2010). Os biotérios são as “instalações capazes de produzir e manter espécies animais destinadas a servir como elementos biológicos, para atender às necessidades dos programas de pesquisa, ensino, produção e controle de qualidade nas áreas biomédicas e tecnológicas segundo a finalidade da instituição” (MAJEROWICZ, 2008). Essas instalações precisam ser capazes de manter uma boa saúde tanto para os animais quanto para os técnicos e pesquisadores; além de promover a segurança no laboratório. 4 Dependendo da finalidade, os biotérios são classificados em três tipos: criação, reprodução e experimentação. Os de criação produzem e mantêm as matrizes das linhagens, com controle rigoroso da saúde dos animais e manutenção das características genéticas. Os biotérios de produção criam grandes quantidades de animais, provenientes dos biotérios de criação, para atender às pesquisas. Já os biotérios de experimentação recebem animais daqueles de produção para o uso nas pesquisas (POLITI et al, 2008). Para que o exercício da profissão dos pesquisadores seja realizado com respeito, honestidade e decência, foi necessário legalizar a experimentação animal, já que vários grupos de defesa dos animais surgiram no século XIX, como a Society for the Preservation of Cruelty to Animals, na Inglaterra e a Sociedade para a Proteção dos Animais, na França. Por volta de 1860, o fisiologista Claude Bernard utilizou o cachorro de sua própria filha para dar aulas aos seus alunos; contraposta a isso sua esposa fundou a primeira associação que defendia os direitos dos animais de laboratório. Em 1876, no Reino Unido, foi criada a primeira lei que regulamenta o uso de animais em pesquisa, respaldando a todos os bichos. Visando esse alto crescimento de ideias relativas à proteção dos animais, em 1975, o zoologista William M.S. Russell e o microbiologista Rex L. Burch estabelecem o princípio dos 3 R’s, objetivando o uso adequado dos animais nas pesquisas, ou seja, a humanização destes (GOLDIM Y RAYMUNDO, 1997). No Brasil, o Decreto Federal nº 24645, de 1934, estabelecia penas para atos cruéis com os animais; foi a primeira manifestação legal, nacionalmente, sobre o bem estar dos animais (POLITI et al, 2008). Com o crescimento do movimento das sociedades protetoras dos animais, houve clima de boicote à experimentação animal por parte desses grupos; assim, a Sociedade Brasileira de Animais de Laboratório (antigo COBEA) postula os 12 artigos sobre os Princípios Éticos na Experimentação Animal, visando à proteção dos profissionais e a utilização de métodos adequados na experimentação. Em 1995, o sanitarista e deputado federal Sérgio Arouca, propôs a lei nº 11794; aprovada, em 2008, no governo do presidente Luiz Inácio Lula da Silva, que a sancionou. Essa lei regulamenta a utilização dos animais no ensino e na pesquisa científica em todo o território nacional (SILVA, 2010). A lei Arouca, como ficou conhecida, estabelece, também, a criação do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (Concea), e a implantação, nas intituições filiadas ao Concea, das Comissões de Ética no Uso dos Animais (CEUA) (POLITI et al, 2008). Cabe ao Concea, credenciar e licenciar a atividade das CEUAs, que devem cumprir o que está previsto na lei nº 11794; como por exemplo, examinar os protocolos experimentais dos pesquisadores e docentes, além de manter o cadastro destes e de seus protocolos. Cumpre às comissões de ética, examinar os procedimentos dos docentes e pesquisadores quanto aos tratos com os animais na pesquisa e no ensino. A Universidade Federal Rural de Pernambuco instituiu sua comissão de ética no uso de animais - CEUA em setembro de 2007, porém já existiam comissões de ética no uso de animais em departamentos como o de Morfologia e Fisiologia Animal – DMFA/UFRPE e Medicina Veterinária – DMV/UFRPE; Isso demonstra a preocupação da universidade em regulamentar o uso de animais em suas atividades didáticas e de pesquisas. 5 O Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal mantém, desde o início da década de noventa, um biotério de criação e experimentação, que foi criado devido a demanda dos professores para realização das aulas práticas para os cursos de Bacharelado e Licenciatura em Ciências Biológicas, Medicina Veterinária e Zootecnia e ultimamente Educação Física. Posteriormente com a capacitação dos docentes nos mestrados, doutorados e pós-doutorado, além da incorporação de novos professores, a demanda aumentou ainda mais, tornando o biotério um elemento essencial para a produção científica dos docentes que fazem o DMFA. Nos últimos anos o DMFA aprova na Capes 2 programas de pósgraduação, o Biociência Animal e Ciência Animal Tropical, ambos com mestrado e doutorado e conceito 4. Em 2004 foi aprovado no Edital FINEP, reforma estrutural do biotério no valor de R$ (70.000,00) setenta mil reais pela FINEP/2004, o que permitiu manter o biotério cadastrado na rede nacional de biotérios. Em 2010 a FINEP aprova proposta institucional da UFRPE para construção das instalações de um biotério central no valor de R$ (900.000,00) novecentos mil reais. No biotério de criação e experimentação animal, do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal são criados ratos Wistar albinos (Rattus novergicus) convencionais, mantidos sob características ambientais viáveis à espécie, nele existe uma recepção, uma sala de criação e outra de experimentação além de área de limpeza e manutenção. É sabido que a criação e experimentação de animais, que não têm padronização, acarretam danos tanto para os técnicos e pesquisadores, quanto para as pesquisas, dificultando a reprodutibilidade dos resultados, item tão importante na estatística e publicação dos mesmos (MOLINARO, 2008). Neste sentido foi desenvolvido o conceito de Boas Práticas de Laboratório, nos Estados Unidos, nos anos de 1970; Joel Majerowicz (MAJEROWICZ, 2008), em seu livro Boas Práticas de Biotérios e Biossegurança, dedica um capítulo para abordar procedimentos operacionais padrão em biotérios. Baseado no exposto anteriormente é que justificamos a necessidade de realização deste projeto, que visa à melhoria da sanidade e de padrões fisiológicos dos animais criados no biotério de criação e experimentação do DMFA/UFRPE; bem como a elaboração de um mapa de riscos, essencial para a biossegurança no biotério, que ocasionará a padronização dos procedimentos realizados. 3 Metodologia 3.2 Local do experimento Este projeto será realizado no biotério de criação e experimentação e no laboratório de fisiologia animal do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal – DMFA/UFRPE e no Laboratório de Parasitologia do Departamento de Biologia/UFRPE, para tanto o protocolo experimental foi submetido a Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFRPE, sob número 23082.006276/2012-86 em 09/04/2012. 3.3 Animais Será utilizado todo o plantel do Biotério de Criação e Experimentação do DMFA/UFRPE, por se tratar de um projeto que visa a padronização do mesmo que atualmente conta com 500 animais. 6 3.4 Análise parasitológica dos animais Para a realização desta etapa serão seguidos protocolos já consolidados na literatura, preconizados por (Willis, 1921 e Graham, 1941) com modificações. A coleta das fezes será feita em três dias alternados com diferença de dois dias e com os animais em jejum de 12 horas; As amostras fecais serão processadas através da técnica de concentração por sedimentação, depois de confeccionadas três lâminas coradas com lugol para cada animal; A observação das lâminas será feita em microscópio óptico, a fim de com a identificação seja possível analisar qualitativamente os helmintos e protozoários. 3.5 Análise hematológica 3.5.1 Coleta de sangue Será realizada através da punção da veia caudal lateral com uso de cateter (24G). O sangue será acondicionado em tubo com anticoagulante (heparina sódica), homogeneizado e mantido à temperatura ambiente. 3.5.2 Obtenção do plasma O sangue será centrifugado a uma velocidade de 3000rpm por 10 minutos, em seguida acondicionado a -20oC até a realização da análise. 3.5.3 Contagem dos eritrócitos e leucócitos Alíquotas do sangue total em tubos heparinizados serão utilizadas; para eritrócitos será realizada um diluição de 1:400 em solução de Hayen e contados em câmara de Neubauer; para os leucócitos a amostra de sangue será diluída em solução de Turk na proporção de 1:20, em seguida será realizada a contagem em câmara de Neubauer. 3.5.4 Morfometria das hemácias Para morfometria das hemácias serão utilizadas lâminas mensuradas 100 células por lâmina por meio de régua milimetrada. sendo 3.5.5 Contagem diferencial dos leucócitos Serão utilizados estiraços sanguíneos em lâminas, coradas pelo método de coloração rápida e contados 100 leucócitos em cada. 3.5.6 Verificação da presença de hematoparasitos Serão realizadas observações em lâminas com estiraço sanguíneo, fixadas e coradas com May-Grunwald-Giemsa. 7 3.6 Melhoria da sanidade dos animais O plantel será submetido a um programa de vermifugação trimestral, sendo a primeira antes do exame parasitológico, dentro das peculiaridades e especificidades dos diversos grupos de pesquisas presentes no local durante o desenvolvimento deste projeto. Antes e após a vermifugação, os animais serão analisados quanto às características da pelagem, consumo de alimento/24 horas, características das fezes, e comportamental. No biotério será implantado um equipamento de controle dos ciclos claro/escuro de 12 horas, contribuindo com o fotoperíodo dos animais. 3.7 Elaboração de um mapa de risco A partir da planta do biotério e dos procedimentos operacionais realizados, os riscos serão classificados de acordo com a classificação dos riscos ambientais. A identificação e gravidade dos riscos serão feitas de acordo com a identificação dos materiais, equipamentos, instalações, ritmo de trabalho, dentre outros. Para a identificação dos procedimentos será adquirida informações sobre: Número de trabalhadores e seu expediente; Instrumentos e materiais de trabalho; Atividades exercidas; O ambiente. Após a classificação, será comprovada a eficácia de medidas preventivas existentes no biotério para um posterior aperfeiçoamento. Como exemplo, as medidas serão: Medidas de proteção coletiva; Medidas de organização do trabalho; Medidas de proteção individual; Medidas de higiene e conforto. Por fim, será elaborado o mapa de riscos do biotério de criação e experimentação animal do DMFA/UFRPE, de acordo com a classificação de riscos ambientais que será fixado em locais apropriados para a visualização dos usuários destas instalações. 4 Metas e fases do desenvolvimento do projeto com cronograma 4.1 Metas No biotério do DMFA/UFRPE: Caracterização do perfil parasitológico e hematológico em ratos Wistar albinos(Rattus novergicus albinus); Melhoria na sanidade dos animais; Melhoria quanto à biossegurança de técnicos e pesquisadores. 8 4.2 Cronograma ATIVIDADES 2012 2013 A S O N D J F M A M J J Revisão e atualização bibliográfica Conscientização dos usuários e autorização para incluir seus animais na pesquisa Coleta e processamento das amostras fecais para exame parasitológico Análise dos dados e tratamento estatístico do exame parasitológico Vermifugação do plantel Implantação do sistema de controle do fotoperíodo Coleta de sangue para análise hematológica e de hematoparasitas Vermifugação do plantel Identificação dos procedimentos operacionais e validação das medidas preventivas Elaboração e implantação do mapa de riscos do ambiente Análise qualitativa da implantação de uma mapa de riscos no biotério Vermifugação do plantel Redação do relatório parcial ATIVIDADES Revisão e atualização bibliográfica Coleta e processamento das amostras fecais para exame parasitológico Análise dos dados e tratamento estatístico do exame parasitológico Vermifugação do plantel Coleta de sangue para análise hematológica e de hematoparasitas Vermifugação do plantel Redação do relatório parcial Redação do relatório final e publicação 2013 2014 A S O N D J F M A M J J 9 5 Relevância e impacto do projeto no desenvolvimento científico e tecnológico de Pernambuco O projeto permitirá o treinamento de recursos humanos, respaldados na prática, em nível de graduação, mestrado e doutorado; disponibilizando, no mundo do trabalho, profissionais mais qualificados. O presente trabalho definirá um melhor padrão de qualidade nos animais oriundos do biotério do DMFA/UFRPE, visando garantir a confiabilidade dos resultados das pesquisas cujos conhecimentos adquiridos serão validados e publicados em periódicos de renome Nacional e Internacional. 6 Possível contribuição ao desenvolvimento econômico e social de Pernambuco O uso de animais, com padrão de qualidade comprovadamente reconhecida, proporcionará seu uso em testes de toxicidade e fabricação de vacinas eficazes na elucidação e tratamento de doenças, respectivamente; dando margem à cura e/ou controle de epidemias no País, e em particular no Estado de Pernambuco. 7 Descrição de apoio financeiro e/ou institucional que assegure a viabilidade de execução do projeto Nas dependências do DMFA/UFRPE está localizado o biotério, onde abriga os ratos que serão utilizados nesse projeto, e apresenta uma recepção, uma sala de criação e outra de experimentação. O departamento possui ainda o laboratório de Fisiologia Animal, que possui os equipamentos que serão utilizados no protocolo experimental aqui proposto, como: centrífuga refrigerada, centrífuga de bancada, centrífuga para micro-hematócrito, câmara de fluxo laminar, capela de exaustão, destilador de água, agitador magnético e placa de agitação. 8 Bibliografia 1. Cardoso, C. V. P.; Leis referentes à experimentação Animal no Brasil – Situação Atual [Disponível em www.cobea.org.br, acesso em 28/03/2012] 2. Clarck, S. R. L., 1997. Animals and their Moral Standing. London: Routledge. 3. Goldim J. R., Raymundo M. M.; Pesquisa em Saúde e os Direitos dos Animais; 2 ed., Porto Alegre: HCPA, 1997. 4. GRAHAM, C.F. A device for the diagnosis of Enterobius infection; Am. J. Trop. Med., v.21, p.159-161, 1941. 5. Majerowicz, J.; Boas práticas em biotérios e biossegurança; Rio de Janeiro: Interciência. 2008 10 6. Molinaro, E. M.; Majerowicz, J.; Valle S.; Biossegurança em Biotérios; Rio de Janeiro: Interciência. 2008 7. Paixão, R. L.; Schramm, F. R. ; Experimentação Animal: Razões e emoções para uma ética; Rio de Janeiro. 2001 8. Politi, F. A. S.; Pietro, R. C. L. R.; Salgado, H.R.N.; Caracterização de biotérios, legislação e padrões de biossegurança; revista de ciências farmacêuticas básica e aplicada; v. 29, n.1, p. 17-2. 2008 9. Raymundo, M. M.; Goldim, J. R.; O uso de animais em pesquisas científicas; UFRGS. 2007 10. Scaini, C. J. ; Teixeira, M. F.; Traversi, M. do C.; Rheingantz, M. G. T.; Signorini, V. M.; Helmintos de Ratos Wistar de Diferentes Faixas Etárias Criados em Biotério Convencional; Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.70, n.3, p.265268, jul./set., 2003 11. Silva, N. E. R. e; Importância do Ensino da Disciplina de Bioterismo e Biossegurança nos Cursos de Licenciatura e Bacharelado em Ciências Biológicas: Indicadores Relevantes; Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife. 2010 12. WILLIS , H.H.; A simple levitation method for the detectation of hookworm ova; Med. J. Aust., v.2, p.375-376, 1921. 13. Zanetti, C. R.; A História da Experimentação Animal; Universidade Federal de Santa Catarina [Disponível em: http://www.lia.ufsc.br/Etica_Animais, acesso em 28/03/2012] 14. http://cienciaecultura.bvs.br/pdf/cic/v61n1/a04v61n1.pdf 29/03/2012 15. www.mct.gov.br/index.php/content/view/311266.html 29/03/2012 acesso acesso em em 16. http://www1.pucminas.br/imagedb/documento/DOC_DSC_NOME_ARQUI2 0081104143622.pdf acesso em 05/04/2012 ___________________________ Prof. Dr. Anísio Francisco Soares
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