Loxosceles intermedia - Teses e Dissertações

Transcrição

Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
ANÁLISE BIOINFORMÁTICA
GLÂNDULA
DE
DA
VENENO DA ARANHA – MARROM
DE
Loxosceles intermedia
CONSTRUÇÃO
E
BACULOVÍRUS RECOMBINANTES
DE
TRANSCRITOS
COMO
DE
VETORES
TOXINAS INSETICIDAS
CIBELE
SOARES
DE
CASTRO
ORIENTADORES: IESO DE MIRANDA CASTRO
EVANGUEDES KALAPOTHAKIS
TESE APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO COMO PARTE
INTEGRANTE DOS REQUISITOS PARA A OBTENÇÃO DO
TÍTULO
DE
DOUTOR
EM
CIÊNCIAS.
CONCENTRAÇÃO: BIOLOGIA MOLECULAR.
OURO PRETO
DEZEMBRO 2005
ÁREA
DE
C367a
Castro, Cibele Soares de.
Análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia e construção de baculovírus recombinantes
como vetores de toxinas inseticidas [manuscrito] / Cibele Soares de Castro. –
2005.
xxi, 182f.: il., color; graf., tabs.
Orientador: Prof. Dr. Ieso de Miranda Castro.
Co-orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis.
Área de concentração: Biologia Molecular.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto
de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
1. Biologia molecular - Teses. 2. Baculovirus anticarsia - Teses. 3. Aranha
– Teses. 4. Aracnídeo venenoso - Teses. 5. Inseticidas - Teses. 6. Toxinas –
Teses. I.Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e
Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. II. Título.
CDU: 577.2
Catalogação: [email protected]
iii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Ieso de Miranda Castro, pela oportunidade de trabalho, investimento e
todo auxílio prestado.
Ao meu co-orientador e chefinho do coração, Evanguedes Kalapothakis, com quem trabalho
desde o 5º período da graduação, há mais de cinco anos, e com quem aprendi tudo o que
sei praticamente de trabalho de bancada, cotações, preparação de artigos científicos,
projetos, cursos e - principalmente - como me comportar profissionalmente perante
jornalistas e fotógrafos do EM! Muito obrigada por tudo, chefe!
Ao pessoal do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos da UFOP, Ana
Maria, André, Liz, Luciano, Michele, Totola e Zézé, por toda a ajuda, ânimo, bom humor e
hospitalidade.
Ao pessoal do Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do ICB-UFMG:
- Alessandra, Ana Carolina Campi, Fabíola, Ju, Marluce e Valéria, pelo companheirismo,
pelas brincadeiras, pelas dicas e quebra-galhos.
- Às minhas amigonas, Carolina Campolina, Flávia, Simone e Thaís, por tantos anos de boa
convivência, por tudo o que passamos juntas, por serem do jeito que são e terem me
ensinado, cada uma de sua maneira, coisas tão especiais. Vão ficar saudades, meninas!
- Ao Lorde do nosso laboratório: Gabriel. Sempre prestativo, gentil e com questionamentos
muito inteligentes... O único companheiro da ala masculina do nosso chefe por um bom
tempo.
- E também à nova geração do lab, Ana Luíza, Arthur, Flavinha, Kika e, em especial, ao
Higgor, que têm me ajudado muito nesta etapa final da tese. Boa sorte para vocês!
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFOP e, em especial, aos
Professores Rogélio Lopes Brandão e Elio Hideo Babá.
Ao Professor Carlos Chavéz-Olórtegui e todos os seus alunos.
Ao CNPq pelo apoio financeiro.
E por fim, aos casais: Natasha e Cláudio e Cláudia e Rodrigo, que sempre me receberam
com os braços abertos em suas casas em Porto Alegre, me emprestaram o computador
umas mil vezes para eu escrever e imprimir a tese e que, sem dúvida, farão às vezes da
minha “família” nesta minha nova cidade. Muito obrigada!
iv
"Só sei que nada sei".
SÓCRATES
v
RESUMO
Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de
veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de
toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas
seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de
buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas
em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível,
modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional.
Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade,
trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola.
Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de
uma biblioteca de cDNA das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou
toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho
do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por
biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto
para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes
quantidades.
Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional
e internacional é aquele que utiliza baculovírus no combate a diversas pragas agrícolas. O
sistema baculovírus supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas
químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao
homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o
dos inseticidas químicos.
Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema
de expressão baculovírus - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1
(previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do
baculovírus AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após
infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e
LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus
recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia
inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus
selvagens.
Acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados poderão permitir a
expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso
possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto
aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na
pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
vi
ABSTRACT
In order to get an overview of all Loxosceles intermedia venom gland transcripts, we
performed a clustering analysis of 268 cDNA sequences available in our laboratory. The 136
singlets and 33 consensus sequences generated after alignment, allowed the identification
by database searches of several distinct genes/proteins in the gland. We analyzed these
sequences, classified them in functional categories (biological function) and, whenever
possible, predicted their 3D structure by homology.
Moreover, aiming the production of highly efficient bioinsecticides, our group has
worked with insecticidal toxins. Recently, we located and characterized, by chromatography
of L. intermedia crude venom and screening of its venom gland cDNA library, lethal toxins to
Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): a plague which attacks the Brazilian corn
culture since harvesting to storage. Due to practical limitations to get from the crude venom a
high rate of previously identified neurotoxins, the use of expression systems to study
heterologous genes becomes necessary.
Baculovirus is one of the most studied heterologous systems used worldwide as a
resource for combating pests. They are powerful, versatile and provide advantages
concerning finance, ecology and human health.
In this manner, we subcloned genes of the insecticidal toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1
(previously identified from L. intermedia venom gland) in baculovirus expression vectors. The
construction’s success of the recombinant virus was verified after insects cells infection and
also by PCR. The expression of LiTx1, LiTx2 and LiD1 toxins was verified by RT-PCR, SDSPAGE and Western Blotting. Bioassays with the recombinant virus LiTx1 and LiTx2 in S.
frugiperda larvae showed their insecticidal efficacy, with life-time reduction of this plague
when compared to the wild virus.
We believe recombinant baculovirus herein generated will allow a large scale
expression of L. intermedia toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1. This will conduce to
characterization studies of the action mechanisms of these toxins and also will permit their
use as tools to basic researches in ionic channels and physiologic processes.
vii
SUMÁRIO
PÁGINA
1. INTRODUÇÃO
1
1.1 Análises bioinformáticas
1
1.2 Inseticidas químicos x Bioinseticidas
3
1.3 As aranhas
7
1.3.1 Comentários gerais
7
1.3.2 Composição geral do veneno
8
1.3.3 Toxinas inseticidas
10
1.4 Aranhas do gênero Loxosceles
12
1.4.1 Comentários gerais
12
1.4.2 Composição geral do veneno
16
1.4.3 Toxinas inseticidas
19
1.5 Os baculovírus
20
1.6 Expressão de toxinas em sistema baculovírus
23
2. OBJETIVOS
26
2.1. Geral
26
2.2. Específicos
26
3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
28
4. MATERIAIS
29
4.1. Equipamentos
29
4.2. Programas
30
4.3. Reagentes
30
4.3.1 Antibióticos
30
4.3.2 Meios de cultura
31
4.3.3 Soluções
32
4.3.4 Tampões
34
4.3.5 Outros
35
viii
PÁGINA
4.4. Linhagens celulares
36
4.5. Genótipo das linhagens bacterianas hospedeiras
36
5. MÉTODOS
37
5.1 Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de
38
5.1.1
Obtenção das seqüências
38
5.1.2
Tratamento das seqüências
39
5.1.3
Agrupamento das seqüências
39
5.1.4
Anotação dos uniques
40
5.1.5
Classificação manual dos uniques em categorias funcionais
42
5.1.6
Análises biológicas dos uniques classificados em categorias
44
funcionais
5.1.7
Modelagem molecular dos uniques
44
5.2 Veneno bruto de L. intermedia
44
5.3 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia
45
5.4 Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L.
45
intermedia
5.5 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no
46
+
vetor de transferência pSynXIV VI X3 do sistema de expressão
baculovírus
5.5.1 PCR para amplificação do DNA da região madura de LiTx1 e
46
LiTx2
5.5.2 Purificação do produto de PCR
50
5.5.3 Clonagem do produto de PCR de LiTx1 e LiTx2 no vetor de
51
clonagem pCR®2.1-TOPO®
5.5.4 Transformação de bactérias por eletroporação
53
5.5.5 PCR de colônias
54
5.5.6 Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep)
55
5.5.7 Digestão do vetor pCR®2.1-TOPO® contendo a região madura de
56
LiTx1 ou LiTx2 com EcoR I
5.5.8 Seqüenciamento automático capilar
56
ix
PÁGINA
5.5.9 Purificação dos fragmentos da região madura de LiTx1 e LiTx2

57

obtidos pela digestão do vetor pCR 2.1-TOPO com EcoR I
5.5.10 Digestão do vetor pSynXIV VI+ X3 do sistema de expressão
57
baculovírus com EcoR I
5.5.11 Ligação do fragmento da região madura de LiTx1 ou LiTx2 no
59
vetor pSynXIV VI+ X3
5.5.12 Precipitação do produto de ligação
60
5.5.13 Transformação de bactérias por eletroporação
60
5.5.14 PCR de colônias
60
61
62
5.6 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema
63
baculovírus
5.6.1 Co-transfecção
63
5.6.2 Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes
64
vSynLiTx1 e vSynLiTx2 em culturas celulares
5.6.3 Verificação por RT-PCR da presença de RNAs mensageiros dos
67
vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2 em culturas
celulares
5.6.4 Análise da expressão das partículas virais recombinantes por
69
SDS-PAGE
70
Western Blotting
5.7 Bioensaio com os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2
71
5.8 Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia
71
5.8.1 Ensaio hemolítico
72
5.8.2 SDS-PAGE
72
5.8.3 Western Blotting
73
5.8.4 Seqüenciamento de proteínas
73
5.9 Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de
73
TM
transferência pFastBac 1 do sistema de expressão baculovírus Bacto-Bac
5.9.1 Atividade tóxica do veneno bruto de L. intermedia em linhagens
celulares de inseto
73
x
PÁGINA
5.9.2 PCR para amplificação do DNA da região madura de LiD1
74
5.9.3 Purificação do produto de PCR
76
5.9.4 Clonagem do produto de PCR de LiD1 no vetor de clonagem
76
pGEM®-T Easy
78
5.9.6 Transformação química de bactérias
78
78
5.9.8 Digestão do vetor pGEM®-T Easy contendo a região madura de
79
LiD1 com BamH I
5.9.9 Purificação do fragmento da região madura de LiD1 obtido pela
79
digestão do vetor pGEM-T Easy com BamH I
5.9.10 Digestão do vetor pFastBacTM 1 do sistema de expressão
79
Baculovírus Bac-to-Bac com BamH I
5.9.11 Ligação do fragmento da região madura de LiD1 no vetor
81
pFastBacTM 1
81
5.9.13 Transformação química de bactérias
81
82
5.9.15 Digestão do vetor pFastBacTM 1 contendo a região madura de
82
LiD1 com BamH I
5.9.16 PCR para confirmação da correta orientação do inserto LiD1 no
82
vetor pFastBacTM 1
83
5.10 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema baculovírus
84
5.10.1 Transposição
84
5.10.2 Isolamento do DNA do bacmídeo recombinante
85
5.10.3 Análise do DNA bacmídeo
86
5.10.4 Transfecção de células Sf9 com o DNA bacmídeo recombinante
88
5.10.5 Amplificação do estoque viral
88
5.10.6 Extração de DNA de vírus secretados e não secretados
89
5.10.7 Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes LiD1
89
no sistema baculovírus
5.10.8
Infecção
de
recombinantes
células
de
inseto
com
partículas
virais
89
xi
PÁGINA
90
SDS-PAGE e Western Blotting
6. RESULTADOS
6.1
Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de
91
91
6.1.1
Obtenção das seqüências
91
6.1.2
Tratamento das seqüências
91
6.1.3
Agrupamento das seqüências
91
6.1.4
Anotação dos uniques
91
6.1.5
Classificação dos uniques
93
6.1.6
Análises biológicas dos uniques classificados em categorias
95
funcionais
6.1.7
Modelagem molecular dos uniques
101
104
104
intermedia
105
vetor de transferência pSynXIV VI+ X3 do sistema de expressão
baculovírus
111
baculovírus
116
117
121
transferência pFastBacTM1 do sistema de expressão baculovírus Bacto-Bac
7. DISCUSSÃO
7.1Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de
126
131
131
xii
PÁGINA
136
137
intermedia
138
+
vetor de transferência pSynXIV VI X3 do sistema de expressão
baculovírus
139
baculovírus
141
142
145
TM
transferência pFastBac 1 do sistema de expressão baculovírus Bacto-Bac
146
7.10 Considerações finais
148
8. CONCLUSÕES
151
9. PERSPECTIVAS
153
10. ANEXOS
154
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
157
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA
PÁGINA
1
Crescimento da população humana mundial.
3
2
Larvas de Spodoptera frugiperda em diferentes estágios de
4
desenvolvimento.
3
Danos causados pela lagarta-do-cartucho do milho – S. frugiperda.
4
4
Acidentes loxoscélicos no estado do Paraná no período de 1987 a
13
2000.
5
Aranha Loxosceles intermedia.
14
6
Acidentes loxoscélicos segundo a circunstância da mordida no
14
estado do Paraná no período de 1993 a 2000.
7
Evolução de uma lesão dermonecrótica causada por mordida de
15
aranha Loxosceles.
8
Alinhamento da seqüência de aminoácidos de LiTx1, LiTx2 e LiTx3
20
do veneno da aranha L. intermedia.
9
Ciclo de vida dos nucleopoliedrovírus.
22
10
Sistema de expressão baculovírus.
24
11
Seqüência do oligonucleotídeo iniciador BK reverso da região do
39
MCS do vetor pBK-CMV.
12
Mapa circular e MCS do vetor fagemídeo pBK-CMV.
47
13
Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da toxina LiTx1.
48
14
Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da toxina LiTx2.
49
15
Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores sintetizados a partir da
49
seqüência de nucleotídeos da região madura da toxina LiTx1 de L.
intermedia.
16
50
seqüência de nucleotídeos da região madura da toxina LiTx2 de L.
intermedia.
17
Mapa circular e MCS do vetor pCR2.1-TOPO.
52
18
Clonagem TA com auxílio da enzima topoisomerase I.
53
19
Seqüência de nucleotídeos do iniciador M13-reverso.
56
+
20
Mapa circular do vetor pSynXIV VI .
58
21
MCS e regiões adjacentes do vetor pSynXIV VI+ X3.
59
xiv
PÁGINA
FIGURA
22
Seqüência do oligonucleotídeo iniciador sintetizado a partir da
60
seqüência de nucleotídeos 541 a 559 do vetor pSynXIV VI+ X3.
23
Esquema da PCR esperada para os plasmídeos pSynXIV VI+ X3
61
que contenham a região madura de LiTx1 na orientação correta.
24
Técnicas para subclonagem de DNA em plasmídeo.
62
25
Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da toxina LiD1.
75
26
76
seqüência de nucleotídeos da região madura da toxina LiD1 de L.
intermedia.
27
Mapa circular do vetor pGEM-T Easy.
28
Promotor e sítio múltiplo de clonagem do vetor pGEM-T Easy.
77
TM
77
29
Mapa circular do vetor de expressão pFastBac 1.
80
30
Promotor, região de ligação do iniciador e sítio múltiplo de
80
clonagem do vetor pFastBacTM 1.
31
Seqüência do oligonucleotídeo iniciador sintetizado a partir da
seqüência de nucleotídeos do vetor pFastBac
32
TM
82
1.
Esquema da PCR esperada para os plasmídeos pFastBacTM 1 que
83
contenham a região madura de LiD1 na orientação correta.
33
Geração de baculovírus recombinantes e expressão gênica com o
85

sistema de expressão Bac-to-Bac .
34
Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores pUC/M13.
87
35
Região de transposição.
87
36
Análise da anotação dos uniques da glândula de veneno de L.
92
intermedia.
37
Divisão dos 34 uniques classificados nas principais categorias dos
93
COGs.
38
Divisão dos 51 uniques classificados em categorias funcionais para
94
toxinas.
39
Modelos tridimensionais dos uniques identificados como similares a
102
esfingomielinases.
40
Modelos tridimensionais dos uniques identificados como similares a
103
proteases.
41
Estruturas cristalográficas obtidas por difração de raios-X.
103
xv
PÁGINA
FIGURA
42
Árvore de similaridade UPGMA com as toxinas LiTx1, LiTx2, LiTx3
104
e outras toxinas inseticidas de aranhas com mecanismos de ação
conhecidos.
43
Gel de agarose 1% contendo os produtos das PCRs para
106
amplificação dos DNAs codificantes para as regiões maduras de
LiTx1 e LiTx2, seus controles negativos e também os produtos das
purificações dos fragmentos amplificados, pelo método guanidinaHCl/sílica.
44
Gel de agarose 1% contendo os produtos das PCRs de colônias
106
realizadas com os iniciadores direto e reverso de LiTx1.
45
Gel de agarose 1% contendo os produtos das PCRs de colônias
107
realizadas com os iniciadores direto e reverso de LiTx2.
46
Gel de agarose 0,8% contendo os produtos das digestões dos



108

plasmídeos pCR 2.1-TOPO /LiTx1 e pCR 2.1-TOPO /LiTx2 com
a enzima de restrição EcoR I.
47
Gel de agarose 0,8% contendo os produtos da purificação dos
109
fragmentos que codificam as regiões maduras de LiTx1 e de LiTx2
obtidos pela digestão do vetor pCR2.1-TOPO com EcoR I.
48
Gel de agarose 0,8% contendo os produtos da digestão do vetor
109
+
pSynXIV VI X3 com a enzima de restrição EcoR I.
49
Géis de agarose 1% contendo os produtos das PCRs de colônias
111
realizadas com o iniciador pAcGF2 do vetor pSynXIV VI+ X3 e o
iniciador direto da região madura de LiTx1(gel A) ou de LiTx2 (gel
B).
50
Visualização por microscopia ótica (200x) de células de inseto da
112
linhagem Tn5B infectadas com baculovírus recombinante.
51
Gel de agarose 1% contendo os produtos das PCRs realizadas com
113
os DNAs extraídos do precipitado (Prec) e do sobrenadante (Sobr)
das culturas celulares Tn5B infectadas ou não com os vírus
recombinantes vSynLiTx1 (gel A) ou vSynLiTx2 (gel B).
52
Gel de agarose 1% contendo os produtos das RT-PCRs realizadas
com os RNAs extraídos das culturas celulares Sf9 infectadas ou
não com os vírus recombinantes vSynLiTx1 (gel A) ou vSynLiTx2
(gel B).
114
xvi
PÁGINA
FIGURA
53
Gel SDS-PAGE 15% corado pelo Coomasie Brilliant Blue contendo
115
o precipitado das culturas celulares Tn5B infectadas ou não com os
vírus recombinantes vSynLiTx1 ou vSynLiTx2.
54
Western Blotting realizado com anticorpo anti-toxinas inseticidas em
116
amostras do precipitado (Prec) de culturas celulares Tn5B
infectadas ou não com os vírus recombinantes vSynLiTx1 ou
vSynLiTx2.
55
Bioensaio com os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2 em
117
larvas de S. frugiperda.
56
Ensaio de atividade hemolítica das frações 34 a 41 obtidas por
118
fracionamento em cromatografia de fase reversa em sistema HPLC
do veneno bruto de L. intermedia.
57
Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS), Western blotting
120
(W) das frações 35 a 37 coletadas por fracionamento em sistema
HPLC do veneno bruto de L. intermedia e seqüência parcial de
aminoácidos, obtida por Seqüenciamento de Edman, de seus
principais peptídeos.
58
Gel de agarose 1% contendo o produto da PCR para amplificação
121
do DNA da região madura de LiD1 e seu controle negativo.
59
Gel de agarose 1% contendo o produto da purificação do fragmento
122
amplificado por PCR da região madura de LiD1 pelo método
guanidina-HCl/sílica.
60
Gel de agarose 0,8% contendo os produtos da digestão dos
123
plasmídeos pGEM-T Easy/LiD1 com a enzima de restrição BamH
I.
61
Gel de agarose 0,8% contendo o produto da purificação do
123
fragmento correspondente à seqüência codificante para a região
madura de LiD1 obtido pela digestão do vetor pGEM-T Easy com
BamH I.
62
Gel de agarose 0,8% contendo o produto da digestão do vetor
pFastBac
63
TM
124
1 com a enzima de restrição BamH I.
Gel de agarose 0,8% contendo os produtos das digestões dos
plasmídeos pFastBacTM 1/LiD1 com a enzima de restrição BamH I.
125
xvii
PÁGINA
FIGURA
64
TM
o iniciador pFastBacpol do vetor pFastBac
125
1 e o iniciador reverso
da região madura de LiD1.
65
Gel de agarose 0,5% contendo DNA bacmídeo isolado.
126
66
Géis de agarose 1% contendo os produtos das PCRs realizadas
127
com os iniciadores direto e reverso de LiD1 em DNAs bacmídeos
isolados.
67
Géis de agarose 1% contendo os produtos das PCRs realizadas
128
com os iniciadores pUC/M13 em DNAs bacmídeos isolados.
68
129
os DNAs extraídos do sobrenadante (Sobr) e do precipitado (Prec)
das culturas celulares Sf9 infectadas com vírus recombinantes
LiD1.
69
Western
Blotting
realizado
com
anticorpo
anti-toxina
dermonecrótica em amostras do sobrenadante (Sobr) e do
precipitado (Prec) de culturas celulares Tn5B infectadas ou não
com os vírus recombinantes LiD1.
130
xviii
LISTA DE TABELAS
TABELA
PÁGINA
1
Toxinas inseticidas de aranhas.
11
2
Distribuição dos acidentes por aranhas, registrados no período
12
de 1990 a 1993, segundo o gênero envolvido e a região do
Brasil.
3
Categorias funcionais dos COGs.
43
4
Categorias funcionais para toxinas.
43
5
Componentes, concentrações e volumes utilizados na PCR para
50
amplificação do DNA da região madura de LiTx1 e LiTx2.
6
Número e porcentagem de genes classificados em cada subcategoria funcional dos COGs.
95
xix
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
TERMOS TÉCNICOS
AcMNPV
Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus
ADP
Adenosina difosfato
AgMNPV
Anticarsia gemmatalis Multiple Nucleopolyhedrovirus
AgorTx
Agelena orientalis toxin
ATP
Adenosina trifosfato
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
BSA
Soro Albumina Bovino
BV
Budded Virus
CMV
Citomegalovírus
COGs
Clusters of Ortologous Groups
CsTx
Cupiennius salei toxin
Da
Dalton
DAB
3,3´- diaminobenzidina
DEPC
Dietil pirocarbonato
DTX
Toxina de Diguetia carnities
EDTA
Ácido Etileno Diaminotetracético
EF
Fator de alongamento
EGFP
Enhanced Green Fluorescent Protein
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMBL
European Molecular Biology Laboratory
ESTs
Expressed Sequence Tags
ET
Etanol, Tris-HCl
ExPASy
Expert Protein Analysis System Proteomics Server
GOA
Gene Ontology Annotation
GV
Granulovirus
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HTML
HyperText Markup Language
HTTP
HyperText Transfer Protocol
HwTx
Huwetoxina
IPTG
Isopropiltio-β-D-galactose
JSTX
Joro Spider Toxin
xx
kb
Kilobase
kDa
Kilodalton
KEGG
Encyclopedia of Genes and Genomes
lacZ
Gene que codifica a β-galactosidase
LB
Luria Bertani
Li
LiD
Toxina Dermonecrótica de Loxosceles intermedia
LiTx
Toxina de Loxosceles intermedia
MCS
Sítio Múltiplo de Clonagem
M-MuLV
Moloney Murine Leukemia Virus
MNPV
Multiple Nucleopolyhedrovirus
mRNA
RNA mensageiro
NCBI
National Center for Biotechnology (Desenvolve sistemas de
informação para biologia molecular)
NE
New England
NIH
National Institute of Health
NMDA
N-methyl-D-aspartate
NPV
Nucleopolyhedrovirus
NR
Banco de dados não redundante de proteínas
NSTX
Nephila Spider Toxin
NT
Banco de dados não redundante de nucleotídeos
occ+
Oclusão positiva no fenótipo do vírus
occ-
Oclusão negativa no fenótipo do vírus
OV
Occluded Virus
PAGE
Polyacrylamide gel electrophoresis
pb
Pares de base
PBS
Phosphate Buffered Saline
PBST
Phosphate Buffered Saline Tween
PCR
Reação em cadeia da polimerase
PDB
Protein Data Bank
pfu
Unidade formadora de placa
PkTx
Phoneutria keyserlingi toxin
PM
Peso molecular
PMSF
Phenilmetilsulfonil fluoride
PrTx
Phoneutria reidyi toxin
PSA
Persulfato de amônia
xxi
PTC
Programmable Thermal Controller
pUC
Plasmid University of California
PVDF
Polyvinylidenedifluoride
RT
Reverse transcriptase
SDS
Sódio Dudecil Sulfato
SfMNPV
Spodoptera frugiperda Multiple Nucleopolyhedrovirus
SMAse
Esfingomielinase
SMS
The Sequence Manipulation Suíte
SP
Swiss-Prot
TAE
Tris, Ácido acético, EDTA
Taq
Thermus aquaticus
TBS
Tris Buffered Saline
TBS gel
Tris Buffered Saline gelatin
TEMED
Tetrametiletilenodiamino
TrEMBL
Translated EMBL
Tris
[2-amino-2-(hidroximetil) propano-1,3-diol, (tris)]
Tris-HCl
TRIS ajustado para pH adequado com HCl
TSR
Template Supression Reagent
UPGMA
Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
VM
Vírus modificado
VS
Vírus selvagem
x-gal
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactose
1
1. INTRODUÇÃO
1.1
ANÁLISES BIOINFORMÁTICAS
Nos últimos anos, termos referentes a ferramentas computacionais para a análise de
dados de biologia molecular, tais como bancos de dados e bioinformática, são cada vez
mais difundidos no meio científico. A grande variedade de seqüências que vem sendo
gerada está diretamente relacionada ao progresso da técnica de seqüenciamento e o estudo
de todo este conjunto de dados já produz e ainda produzirá muitas informações úteis ao
conhecimento genômico (AUBOURG E ROUZÉ, 2001).
Nunca antes na história, a descoberta de proteínas e seus genes correspondentes
em um contexto biológico funcional havia sido gerada sem experimentos tradicionais de
caracterização de proteínas nativas. Há pouco tempo, no entanto, projetos de
caracterização molecular baseados em seqüências encontradas em bancos de dados são
cada vez mais apresentados aos centros de pesquisa.
Embora a classificação de proteínas codificadas por seqüências genômicas seja
essencial para tornar estas seqüências úteis para estudos funcionais (TATUSOV E COLS.,
2001), vale ressaltar que tal caracterização, mesmo com todo o potencial bioinformático,
está longe de ser uma tarefa simples. O número de erros potenciais presentes na predição
de funções específicas é maior do que o usualmente concebido (DEVOS E VALENCIA,
2001).
Os diversos bancos de dados existentes (criados para disponibilizar, de modo rápido
e fácil, dados de biologia molecular gerados em todo o mundo) vêm crescendo
exponencialmente ano a ano (WHELLER E COLS., 2002). Aqueles que contém dados
experimentais depositados sem grandes verificações de procedência, ou seja, sem a análise
de compatibilidade com dados publicados anteriormente são chamados de bancos de dados
primários. Dentre os quais, podemos citar o GenBank (BENSON E COLS., 2002) e o Protein
Data Bank (PDB). Já aqueles que contém dados depositados após uma verificação
cuidadosa e interpretativa dos mesmos são conhecidos como bancos curados, como é o
caso do SWISS-PROT (ROUZÉ E COLS, 1999; APWEILER, R., 2001; BAXEVANIS E
OUELLETTE, 2001).
O processo de alinhamento, ou seja, a comparação de duas seqüências de
nucleotídeos ou de aminoácidos para a verificação do grau de identidade entre elas, permite
a determinação de similaridade entre essas seqüências. O BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) é o principal programa utilizado para o alinhamento local de seqüências em
biologia molecular. Este programa possibilita a exploração de toda a informação contida em
2
bases de dados de DNA e proteínas, possibilitando também, a identificação de relações
entre seqüências que apresentam apenas regiões isoladas de similaridade (ROUZÉ E
COLS., 1999). Os resultados do BLAST são apresentados com dois valores, o valor do
escore (score bits) e o valor E (e-value). O valor do escore depende do tamanho da
seqüência alinhada, do número de similaridades/diferenças/falhas, e da matriz de
comparação da seqüência utilizada, e é normalizado através de variáveis estatísticas. O
valor E representa o número de alinhamentos com escores iguais ou melhores do que seria
de se esperar que ocorressem ao acaso em uma base de dados (SANTOS, 2002;
WHEELER E COLS., 2002).
A partir do alinhamento, pode-se transferir informação funcional de proteínas já
caracterizadas experimentalmente para seus homólogos pouco estudados, caso a
similaridade encontrada seja considerada relevante. Essa hipótese formulada, entretanto,
serve apenas como um direcionamento para posteriores pesquisas funcionais (testes
experimentais de confirmação) e não como uma verdade absoluta. Esse processo de
classificar, através de análises computacionais, as seqüências genômicas de acordo com
suas relações de homologia, fazendo a ligação da seqüência à biologia do organismo, é
chamado de anotação gênica (STEIN, 2001).
A anotação gênica pode ser dividida em três categorias. A primeira categoria é a
anotação de nucleotídeos que é realizada quando informações sobre o genoma de algum
organismo estão disponíveis. Nesta categoria, procura-se o posicionamento cromossômico
de cada parte da seqüência de busca, de forma a localizar fisicamente genes, RNAs ou
elementos repetitivos.
A segunda categoria é anotação de proteínas, que é realizada quando existem
informações sobre os genes de algum organismo (obtidos por seqüenciamento genômico ou
de cDNA). Nela, procura-se montar um catálogo das proteínas e genes presentes nos
organismos, nomeá-los e associá-los a possíveis funções através de buscas por homologia.
Já a terceira e última categoria é a anotação de processos biológicos, que procura
identificar vias e processos nos quais diferentes produtos gênicos interagem (interações e
relações de genes e proteínas) (STEIN, 2001).
Neste trabalho, estudamos o transcriptoma da glândula de veneno da aranha
marrom Loxosceles intermedia. Como será comentado adiante, os acidentes causados no
Brasil por aranhas deste gênero são um problema médico considerável. Assim, estudos de
caracterização molecular do veneno desta aranha podem gerar informações úteis quanto
aos seus componentes (possível atividade bioquímica e/ou função celular, estrutura,
significado funcional, origem evolutiva). Além disso, considerando-se o amplo espectro de
possibilidades de uso desses componentes, principalmente das toxinas, esperamos
3
identificar genes que possam ser utilizados em estudos biológicos e que apresentem
potencial biotecnológico, em especial, para o desenvolvimento de bioinseticidas.
1.2
INSETICIDAS QUÍMICOS X BIOINSETICIDAS
Estima-se que, todos os anos, 40% da produção agrícola mundial seja perdida, do
plantio ao armazenamento, por ataque de insetos ou fungos. Atualmente, o emprego de
pesticidas para o combate às pragas consome, somente no Brasil, cerca de US$ 2,5
bilhões, o que significa grande aporte financeiro destinado à área (PERES, 2001).
Embora eficazes, de fácil acesso aos produtores e responsáveis por uma
produtividade agrícola compatível com o intenso crescimento da população humana nas
últimas décadas (FIG.1 - CLARK, 1997), os pesticidas químicos apresentam uma série de
inconvenientes. Quando utilizados incorretamente podem favorecer o desenvolvimento de
populações de pragas resistentes, como vem acontecendo com a lagarta-do-cartucho do
milho - Spodoptera frugiperda (FIG.2 - CRUZ, 1995), inseto que chegou a causar até 34% de
redução na produção dessa cultura no Brasil (FIG.3 - CRUZ E COLS., 1997). Esse
fenômeno de resistência, muitas vezes, exige um número maior de aplicações e o aumento
nas concentrações dos pesticidas, tornando os agricultores cada vez mais dependentes de
novos insumos químicos desenvolvidos por indústrias especializadas que tiram proveito do
ciclo vicioso de alto custo econômico que se instala (COUTINHO, 1996). Além disso, em
geral, os agrotóxicos são pouco específicos, podendo eliminar animais benéficos às
plantações como, por exemplo, insetos polinizadores e inimigos naturais de populaçõespeste.
FIGURA 1. Crescimento da população humana mundial. Os dados observados no gráfico,
a partir do ano de 1999, referem-se a projeções estatísticas.
FONTE - Modificado de BBC ONLINE NETWORK, UK, Setembro de 1999.
4
FIGURA
2.
Larvas
de
Spodoptera
frugiperda
em
diferentes
estágios
de
desenvolvimento.
FONTE - CRUZ, 1995.
A)
B)
FIGURA 3. Danos causados pela lagarta-do-cartucho do milho – S. frugiperda. Em A,
visualizamos danos foliares causados pela lagarta S. frugiperda à lavoura do milho e, em B,
danos à espiga e ao cartucho do milho, propriamente dito.
FONTE - CRUZ E COLS., 1997.
5
O uso dos pesticidas também pode causar danos ao meio ambiente e ao próprio
homem. A degradação e desertificação dos solos, a contaminação e a salinização das
águas, a redução da biodiversidade e os desequilíbrios ecológicos nos agrossistemas são
algumas das conseqüências ambientais observadas por Coutinho (1996). Problemas que
envolvem a saúde humana, como o risco de desenvolver câncer pela exposição aos
inseticidas (MCDUFFIE E COLS., 2001), a síndrome tóxica gerada por envenenamento com
agrotóxicos organofosforados (RUSSELL E OVERSTREET, 1987; SINGH E SHARMA,
2000; RAY E RICHARDS, 2001) e a presença de resíduos nos alimentos tratados com
insumos químicos (CABRAS E CONTE, 2001) são igualmente importantes, podendo afetar
a comercialização dos produtos agrícolas no Brasil e no exterior (BERTOLINI E CORREA,
1994). Deste modo, levando-se em conta a insustentabilidade de tais sistemas de produção
agrícola (COUTINHO, 1996), os biopesticidas mostram-se uma alternativa interessante para
a redução de perdas na agricultura, tanto em relação à diminuição dos custos de produção
quanto à conservação da natureza e da saúde humana (PERES, 2001).
O termo biopesticidas refere-se a organismos usados como agentes para o controle
biológico de pragas (CORY, 2000). Sua utilização oferece inúmeras vantagens em relação
ao uso de agrotóxicos, pois além de serem específicos, os agentes de biocontrole são
capazes de se multiplicar a partir de indivíduos da população, atuando no meio ambiente por
um longo período (ALVES, 1998). Dentre os biopesticidas, os bioinseticidas são agentes
usados para o combate a insetos-praga, podendo ser representados por diversos
microrganismos causadores de doenças em insetos, em especial: fungos, bactérias e vírus
(CORY, 2000).
As doenças mais freqüentemente encontradas em populações de insetos são
causadas por fungos. A espécie Metarhizium anisopliae, por exemplo, destaca-se como
agente para a contenção de cigarrinhas da cana-de-açúcar no nordeste brasileiro, enquanto
a espécie, Colletotrichum gloeosporioides, atua na redução da infestação de pomares da
região de Limeira-SP pela praga Orthezia praelonga (CESNIK E COLS., 1996). Vários
outros exemplos de fungos são usados em programas de biocontrole no País, sendo as
espécies dos gêneros Metarhizium, Beauveria e Nomuraea as mais bem sucedidas
(AZEVEDO, 1998).
Entre as bactérias, aquelas pertencentes ao gênero Bacillus são reconhecidamente
importantes no controle de coleópteros, lepdópteros, culicídeos e simulídeos-praga. No
Brasil, tratamentos de sucesso têm sido obtidos com a pulverização de produtos à base de
Bacillus thuringiensis numa área de aproximadamente 150.000 hectares (HABIB E
ANDRADE, 1998).
6
Em relação aos vírus, sobressai-se o grupo dos baculovírus que, encontrados em
mais de 500 espécies de insetos (MARTIGNONI E IWAI, 1986), possuem espectro
relativamente estreito de hospedeiros e são considerados seguros ao ambiente e ao homem
(HOOVER E COLS., 1996; FUXA, 2004).
Tentativas para o controle de populações de insetos praga com estes vírus são
feitas, no mínimo, desde 1890 (HUBER, 1986). Somente em nosso País, mais de um milhão
e meio de hectares de soja (10% das plantações) são tratados com o baculovírus Anticarsia
gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), para o controle da lagarta da soja.
Esse programa vem gerando uma redução de, aproximadamente, 1.500.000 litros de
inseticidas químicos, o que reflete na economia de cerca de 10 milhões de dólares por ano e
também em benefícios ambientais (MOSCARDI E DE SOUZA, 2002). Outros dois projetos
dignos
de
citação
referem-se
ao
uso
do
baculovírus
S.
frugiperda
Multiple
Nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) para o combate à lagarta-do-cartucho do milho, que na
forma de pó-molhável, tem como perspectiva o tratamento anual de 20000 hectares de
milho (CRUZ, 2000) e ao uso do baculovírus Erinnyis ello granulovirus para o controle do
mandarová-da-mandioca (SCHMITT, 1985).
Além dos organismos biopesticidas, muitos compostos encontrados em plantas e
animais possuem atividade contra pragas. Entretanto, o estudo e utilização dessas
substâncias para o controle de organismos patogênicos de plantações encontram-se ainda
nos seus primeiros passos. Entre os trabalhos realizados com compostos vegetais podemos
citar Jennings e cols. (2001), que descrevem um potente efeito inibitório de peptídeos
extraídos da planta africana Oldenlandia affinis sobre o crescimento e desenvolvimento de
larvas da espécie Lepdoptera Helicoverpa punctigera; e Cespedes e cols. (2001), que
testam substâncias obtidas da planta Maytenus spp., família Celastraceae, no controle da
lagarta S. frugiperda. Já em relação aos compostos com potencial inseticida extraídos de
animais, destacam-se as neurotoxinas isoladas, purificadas e caracterizadas a partir do
veneno de aranhas e escorpiões (SKINNER E COLS., 1992; GORDON E COLS., 1996;
PENAFORTE E COLS., 2000; WUDAYAGIRI E COLS., 2001).
No item a seguir, discutiremos mais detalhadamente as aranhas. Esses organismos,
como se sabe, possuem veneno altamente especializado na tarefa de imobilizar e/ou matar
suas presas que, na maioria das vezes, são insetos (BRISTOWE, 1958; BREENE E COLS.,
1988; MITTER E COLS., 1988). Desse modo, são considerados fontes de excelência para a
pesquisa de novas substâncias de controle a insetos-praga.
7
1.3
AS ARANHAS
1.3.1 COMENTÁRIOS GERAIS
As aranhas são predadores generalistas e terrestres, pertencentes ao filo dos
artrópodes. Este filo se divide em três subfilos, Trilobita, Mandibulata e Chelicerata, sendo
este último dividido em várias classes, dentre as quais destacam-se a dos aracnídeos e a
dos insetos. A classe dos aracnídeos (Arachnida) possui duas ordens de interesse
biotecnológico: a das aranhas e a dos escorpiões (BONALDO, 1997). A ordem das aranhas
(Araneae) é a sétima em diversidade global de espécies descritas, perdendo apenas para as
cinco maiores ordens de insetos (Coleoptera, Hymenoptera, Lepdoptera, Diptera e
Hemiptera) e para a ordem Acari entre os aracnídeos (PARKER, 1982).
Até 1991, mais de 40.000 espécies de aranhas haviam sido descritas (PLATNICK,
1993). Contudo, uma estimativa da diversidade total de espécies desses aracnídeos é
bastante difícil, visto que a fauna de áreas como a América Latina, África e região do
Pacífico são pouco conhecidas e que uma mesma espécie pode receber diferentes nomes
em diferentes países (CODDINGTON E LEVI, 1991).
As aranhas, em geral, vivem em buracos, sob madeiras, pedras, restos de
construção, em troncos de árvores, depósitos e casas, têm o corpo dividido em cefalotórax e
abdômen, possuem quatro pares de patas, são cobertas por um exoesqueleto de quitina e
apresentam duas glândulas de veneno localizadas no cefalotórax. Essas glândulas
comunicam-se com o exterior através de dois ductos que levam ao aparelho inoculador de
peçonha, também denominado quelíceras. Apesar de muitas aranhas produzirem
substâncias tóxicas, a grande maioria não causa danos ao homem, pois apresentam
aparelho bucal muito delicado e/ou veneno ativo somente contra insetos (ANDRADE FILHO,
1997).
No Brasil, a maior incidência de acidentes provocados por aranhas ocorre entre os
meses de outubro a abril, período de clima mais quente e chuvoso, em que as vítimas estão
mais expostas e as aranhas podem ser desalojadas por inundações.
Provavelmente, o número real de acidentes com aranhas é bem maior do que o
relatado, visto que muitas vítimas não chegam a procurar atendimento médico e poucas são
as estatísticas disponíveis a esse respeito. Entre os casos notificados, a maioria envolve
indivíduos com mais de 18 anos e ocorre durante o dia, sendo os pés e as mãos os locais
mais afetados (LUCAS, 1988). Entre os anos de 1993 e 2000, no Serviço de Toxicologia do
Hospital João XXIII de Belo Horizonte, foram atendidos 972 casos de araneísmo, não tendo
nenhum deles resultado em óbito.
8
As aranhas do continente Americano mais importantes do ponto de vista médico são
responsáveis por muitos casos de envenenamento severo e algumas mortes (ESCOUBAS E
COLS., 2000). Todas pertencem à subordem Araneomorphae, que se caracteriza por
apresentar ferrões inoculadores de veneno em posição horizontal e é representada pelos
gêneros Phoneutria, Loxosceles, Latrodectus e Lycosa (SOERENSEN, 1996).
No sudeste do Brasil, os acidentes com as aranhas popularmente conhecidas como
“armadeiras” (Phoneutria sp.), “aranhas de jardim” ou “tarântulas” (Lycosa sp.) são
freqüentes, enquanto os acidentes com as “caranguejeiras” (Mygalomorphae sp.), a “viúvanegra” (Latrodectus sp.) e a “aranha marrom” (Loxosceles sp.) são mais raros (LUCAS,
1992).
A profilaxia dos acidentes por aracnídeos consiste em manter jardins, quintais e
terrenos baldios próximos às residências limpos, sem acúmulo de folhagem e entulhos;
vedar as soleiras das portas e janelas e observar cuidadosamente roupas e sapatos antes
de usá-los.
O tratamento correto para esses acidentes depende do diagnóstico rápido e preciso
do aracnídeo envolvido e a adoção de medidas terapêuticas adequadas, entre as quais,
destaca-se a administração de soro heterólogo específico, principalmente nos acidentes
latrodéctico e loxoscélico (RODRIGUES E COLS., 1986).
1.3.2 COMPOSIÇÃO GERAL DO VENENO
Os venenos das aranhas são misturas complexas de peptídeos neurotóxicos,
proteínas e moléculas orgânicas de baixo peso molecular, que auxiliam esses organismos
na captura e digestão de suas presas e/ou na defesa contra seus predadores. Embora se
saiba da eficiência e da ação extremamente sensível e seletiva desses venenos sobre
receptores e canais celulares, muito ainda há para se descobrir sobre as interações e
funções de seus componentes químicos (ESCOUBAS E COLS., 2000).
O veneno das aranhas contém íons e sais, ácidos nucléicos, glicose, aminoácidos
livres, aminas biogênicas e neurotransmissores como o glutamato, o aspartato, a dopamina
e a serotonina (WELSH E BATTY, 1963). No entanto, a função dessas substâncias na
constituição desse importante material biológico permanece desconhecida. Supõe-se que,
talvez, possam estar relacionados com a facilitação da ação de neurotoxinas ou que possam
ser produtos de degradação de outros constituintes do veneno (ESCOUBAS E COLS.,
2000).
Um outro grupo importante de componentes químicos encontrados no veneno de
aranhas é o das acilpoliaminas ou poliaminas amidadas. As acilpoliaminas apresentam uma
9
estrutura química constituída de uma cadeia de poliamina e um grupo final acil aromático.
Esses componentes são compostos orgânicos neurotóxicos que atuam como antagonistas
de diferentes subtipos de receptores ionotrópicos de glutamato (PARKS E COLS., 1991),
bloqueando o poro dos canais iônicos associados a eles (DONEVAN E ROGAWSKI, 1996).
As acilpoliaminas também agem em canais de cálcio (McCORMICK E COLS., 1993) e, além
disso, parecem possuir uma forte atividade inseticida, sendo responsáveis pela rápida
paralisia de insetos observada durante a predação. Este fenômeno é mediado por um
bloqueio rápido e reversível das junções neuromusculares dos insetos, onde o glutamato é o
principal neurotransmissor (OSBORNE, 1996). Em algumas espécies, as acilpoliaminas são
o principal componente do veneno.
Somando-se aos antagonistas dos receptores de glutamato, uma outra classe de
toxinas que afetam a transmissão glutamatérgica foi descrita por Mafra e cols. (1999): a
família PhTx4. Essa família, isolada do veneno da aranha armadeira Phoneutria nigriventer,
mostrou inibir de maneira dose-dependente a captação de glutamato em sinaptossomas de
ratos. Posteriormente, a toxina inseticida Tx4(5-5) da mesma família foi descrita como um
inibidor reversível de correntes geradas pela ação de receptores de glutamato do tipo Nmethyl-D-aspartate (NMDA) em neurônios de ratos (FIGUEIREDO E COLS., 2001).
Assim como as toxinas da família PhTx4, a grande maioria das toxinas identificadas
até o momento é composta por polipeptídeos de peso molecular entre 3 e 8 kDa.
Juntamente com as poliaminas, esses peptídeos parecem ser bastante importantes no
arsenal tóxico das aranhas, podendo ser específicos para vertebrados ou insetos. Seus
alvos principais são os vários canais iônicos presentes nas membranas celulares. Algumas
dessas toxinas, como a Tx3-3 e a Tx3-4 da aranha P. nigriventer (GUATIMOSIM E COLS.,
1997; MIRANDA E COLS., 1998), podem bloquear a liberação de neurotransmissores,
afetando a exocitose de vesículas pré-sinápticas e induzindo modificações anormais na
transmissão sináptica, o que gera um quadro de paralisia flácida na vítima (JACKSON E
PARKS, 1989; JUNIOR E COLS., 1991; GOMEZ E COLS., 1995; PRADO E COLS., 1996).
Já outras toxinas ativam canais de sódio em membranas de fibras nervosas e musculares
(FONTANA
E
VITAL
BRAZIL,
1985),
provocando
despolarização
excessiva
e,
conseqüentemente, levando à paralisia excitatória. Um exemplo recentemente obtido dessa
última ação seria a toxina Tx2-6, mais um componente da peçonha da aranha P. nigriventer,
que - através de caracterização eletrofisiológica - demonstrou retardar a rápida inativação de
canais de sódio de fibras musculares de rã (MATAVEL E COLS., 2002).
As proteínas dos venenos de aranhas incluem também toxinas de alto peso
molecular. As latrotoxinas encontradas na peçonha da viúva negra - gênero Latrodectus apresentam massa molecular de até 110 kDa (GRISHIN, 1998) e atuam seletivamente na
maioria das terminações nervosas de vertebrados e invertebrados, promovendo liberação de
10
neurotransmissores, depleção de vesículas sinápticas e inexcitabilidade da membrana
(GORIO E MAURO, 1979; TZENG E SIEKEVITZ, 1979; MALLART E HAIMAN, 1985), o que
leva a uma rápida paralisia da vítima.
Enzimas,
dentre
as
quais
podemos
citar:
proteases,
hialuronidases,
esfingomielinases, fosfolipases e isomerases (SCHANBACHER E COLS., 1973), também
estão presentes. As esfingomielinases propiciam ação hemolítica que pode causar anemia,
insuficiência renal aguda, entre outras conseqüências. As hialuronidases, encontradas nas
Loxosceles, podem facilitar a ação de outros componentes do veneno, permitindo a
penetração nos tecidos e compartimentos celulares. No entanto, a função das demais
enzimas permanece pouco elucidada.
A grande diversidade de toxinas presentes nos venenos de aranhas resulta numa
grande diversidade farmacológica que permite ligações precisas e seletivas a múltiplos
receptores celulares (RASH E HODGSON, 2002). Em se tratando de predadores, toda essa
farmacopéia representa enorme vantagem adaptativa, que proporciona a captura de
diversas presas.
Para nós, pesquisadores, os venenos das aranhas são uma fonte incrivelmente rica
e diversa de novas ferramentas moleculares para a exploração da fisiologia, farmacologia e
estrutura de canais iônicos e células excitáveis, levando a um melhor entendimento de
interações ligante-receptor e ao desenvolvimento de novas estratégias nas áreas da saúde
e da agricultura (GOMEZ E COLS., 2002).
1.3.3 TOXINAS INSETICIDAS
A seletividade de diversas toxinas de aranha a insetos abre caminho para o
desenvolvimento potencial e promissor de diferentes estratégias de combate a pragas
agrícolas, em especial, através da utilização de bioinseticidas geneticamente modificados.
Durante as últimas décadas, grande número de peptídeos inseticidas de aranhas tem
sido identificado, purificado, caracterizado e clonado por diversos autores (CORZO E
COLS., 2000; PENAFORTE E COLS., 2000; FIGUEIREDO E COLS., 2001; CORZO E
COLS., 2002). As curtatoxinas I, II e III de Hololena curta (LEUNG E COLS., 1989;
STAPLETON E COLS., 1990; QUISTAD E COLS., 1991), as µ-agatoxinas I e IV de
Agelenopsis aperta (SKINNER E COLS., 1989), as toxinas DTX9.2, 10 e 11 de Diguetia
carnities (KRAPCHO E COLS., 1995; BLOOMQUIST E COLS., 1996) e a toxina Tx4(6-1) de
P. nigriventer (FIGUEIREDO E COLS., 1995) atuam especificamente em canais de sódio de
insetos (DE LIMA E COLS., 2002). As plectoxinas V e XI de Plectreurys tristis (QUISTAD E
SKINNER, 1994; LEISY E COLS., 1996), as ω-atracotoxinas de Hadronyche spp.
11
(FLETCHER E COLS., 1997; WANG E COLS., 1999) e as ω-agatoxinas IA, IIA e IIIA de
Agelenopsis aperta (ADAMS E COLS., 1990; VENEMA E COLS., 1992) bloqueiam
especificamente canais de cálcio de insetos (MORI E COLS., 1996). Já a toxina JSTX de
Nephila clavata (KAWAI E COLS., 1982), a NSTX de Nephila maculata (ARAMAKI E COLS.,
1986) e várias argitoxinas de diversas aranhas do gênero Argiope (USHERWOOD E COLS.,
1984; GRISHIN E COLS., 1986) bloqueiam receptores de glutamato em insetos. No entanto,
diversas outras toxinas inseticidas já relatadas ainda não tiveram seus sítios de ação
determinados, dentre as quais podemos citar: as apototoxinas I a IX de Aptostichus
schlingeri (SKINNER E COLS., 1992) e as toxinas de Segestria sp. (LIPKIN E COLS., 2002)
(TAB.1).
TABELA 1. Toxinas inseticidas de aranhas.
TOXINA
ARANHA
ATIVIDADE
REFERÊNCIA
Apototoxina I a IX
Aptostichus schlingeri
Indeterminada
SKINNER E COLS., 1992
Argitoxinas
Gênero Argiope
Bloqueia receptores de glutamato
µ-agatoxina I e IV
Agelenopsis aperta
Ativa canais de Na+
ω-agatoxina IA, IIA e IIIA Agelenopsis aperta
Bloqueia canais de Ca2+
ω-atracotoxinas
Hadronyche spp.
Curtatoxina I, II e III
Hololena curta
Ativa canais de Na+
USHERWOOD E COLS., 1984
GRISHIN E COLS., 1986
SKINNER E COLS., 1989
ADAMS E COLS., 1990
VENEMA E COLS., 1992
FLETCHER E COLS., 1997
WANG E COLS., 1999
LEUNG E COLS., 1989
STAPLETON E COLS., 1990
QUISTAD E COLS., 1991
KRAPCHO E COLS., 1995
DTX9.2, 10 e 11
Diguetia carnities
Ativa canais de Na+
JSTX
Nephila clavata
KAWAI E COLS., 1982
NSTX
Nephila maculata
ARAMAKI E COLS., 1986
Plectoxina V e XI
Plectreurys tristis
Toxinas de Segestria
Segestria sp.
Indeterminada
LIPKIN E COLS., 2002
Tx4(6-1)
Phoneutria nigriventer
Atua em canais de Na+
DE LIMA E COLS., 2002
BLOOMQUIST E COLS., 1996
QUISTAD E SKINNER, 1994
LEISY E COLS., 1996
A relação entre a estrutura primária dessas toxinas e sua especificidade a insetos
ainda não foi descoberta. A massa molecular descrita para as diversas toxinas inseticidas já
estudadas varia de 3300 a 27000 Da e as determinantes moleculares de sua especificidade
também continuam desconhecidas.
12
1.4
ARANHAS DO GÊNERO LOXOSCELES
1.4.1 COMENTÁRIOS GERAIS
O gênero Loxosceles (HEINECKEN E LOWE, 1835) - mundialmente distribuído - foi
primeiramente reconhecido como causador de acidentes de importância médica no Brasil
por Rosenfeld e cols. (1957) e é representado, no País, por várias espécies, presentes da
Amazônia ao Rio Grande do Sul: L. adelaida, L. amazônica, L. anomala, L. gaucho, L.
hirsuta, L. intermedia, L. laeta e L. similis (MELLO-LEITÃO, 1917, GERTSCH, 1967,
GERTSCH E ENNICK, 1983). Esses aracnídeos apresentam de 8 a 15 mm de corpo, suas
patas medem de 8 a 30 mm e vivem de 3 a 7 anos, podendo sobreviver dias e, até mesmo,
meses sem comida e água (FUTRELL, 1992). Entre as aranhas brasileiras, as pertencentes
a esse gênero possuem o veneno mais tóxico ao homem (SEZERINO E COLS., 1998),
sendo responsáveis por, aproximadamente, 36,6% dos acidentes com aracnídeos
registrados pelo Ministério da Saúde no período de 1990 a 1993. Na região Sul do País o
número de acidentes envolvendo aranhas Loxosceles é bem maior que nas demais regiões
(TAB.2). Somente no estado do Paraná, por exemplo, mais de 2000 casos de acidentes
loxoscélicos foram relatados desde o ano de 1993 até 2000 (FIG.4). Em 2003, este número
saltou para 3.637 e em 2004, dados da Coordenação de Vigilância Epidemiológica do
Centro de Epidemiologia da Secretaria Municipal dae Saúde de Curitiba apontam para cerca
de 3.741 casos somente nesta cidade. Este rápido crescimento na incidência dos acidentes
loxoscélicos deve-se, em parte, ao fato das aranhas deste gênero terem adquirido hábitos
domiciliares, uma vez que seu habitat de origem vem sendo continuamente desmatado.
TABELA 2. Distribuição dos acidentes por aranhas, registrados no período de 1990 a
1993, segundo o gênero envolvido e a região do Brasil. As regiões do país aparecem em
siglas: N - Norte, NE - Nordeste, SE - Sudeste, S - Sul e CO - Centro-Oeste.
FONTE: Modificado de MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2001.
ARANHA
(GÊNERO)
PHONEUTRIA
LOXOSCELES
LATRODECTUS
OUTRO
NÃO INFORMADO
TOTAL (N° / %)
N
NE
1
1
0
15
35
52 / 0,3
6
15
58
88
400
567 / 3,2
REGIÃO DO PAÍS
SE
2885
267
0
277
2561
5990 / 33,7
S
CO
TOTAL
(N° / %)
1912
6224
13
645
2205
10999 / 61,8
5
5
0
44
123
177 / 1
4809 / 27
6512 / 36,6
71 / 0,4
1069 / 6
5324 / 30
17785 / 100
13
FIGURA 4. Acidentes loxoscélicos no estado do Paraná no período de 1987 a 2000.
FONTE: Modificado de SESA/CENTRO DE SAÚDE AMBIENTAL, 2003.
A Loxosceles intermedia (FIG.5), assim como as demais aranhas de seu gênero, é
popularmente conhecida como aranha marrom e pertence à ordem Araneae, subordem
Araneomorphae, grupo Labdognatha e à família Sicariidae (CAMPOLINA E COLS., 2001). É
de pequeno porte, com 1 a 3 cm de corpo e patas finas e compridas. Apresenta coloração
que varia do marrom claro ao escuro e seis olhos dispostos em três pares. Faz teias
irregulares que lembram chumaços de algodão e tem hábitos sedentários e noturnos. Não é
agressiva ao homem e morde apenas quando comprimida contra o corpo - na maioria dos
casos - quando a vítima está dormindo (FIG.6). Seu habitat natural são as frestas e cascas
soltas de árvores, folhas secas e cavidades do solo e de pedras, tendo adaptado-se, no
entanto, aos domicílios, onde abrigam-se em sapatos, roupas ou atrás de móveis
(BÜCHERL, 1969).
14
FIGURA 5. Aranha Loxosceles intermedia.
FONTE: http://images.google.com.br/images?hl=pt-BR&lr=&ie=ISO-8859-1&q=Loxosceles
FIGURA 6. Acidentes loxoscélicos segundo a circunstância da mordida no estado do
Paraná no período de 1993 a 2000. n = 3009.
FONTE: Modificado de SESA/CENTRO DE SAÚDE AMBIENTAL/DV ZOONOSES E
INTOXICAÇÕES, 2003.
A histologia e citologia ultraestrutural das glândulas de veneno da aranha marrom foi
descrita por Dos Santos e cols. (2001). Usando diferentes técnicas de microscopia, esses
autores observaram que as glândulas de veneno de L. intermedia, seguindo a arquitetura
geral das glândulas de veneno das aranhas, apresentam duas camadas de fibras
musculares estriadas, uma externa e outra interna, em contato com uma matriz extracelular
constituída por uma membrana basal e uma matriz fibrilar de colágeno que separa a região
muscular da região epitelial das glândulas. As células musculares desse importante órgão
mostraram ser multinucleadas, conter núcleo localizado perifericamente e possuir em seu
citoplasma, entre outras estruturas, retículo sarcoplasmático bem desenvolvido. Já as
15
células epiteliais mostraram conter citosol extremamente rico em retículo endoplasmático
rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi, membranas interdigitantes e vesículas secretórias
que acumulam o veneno de ação proteolítica, hemolítica e coagulante desta aranha
(LUCAS, 1988).
Com relação aos acidentes humanos, a vítima apresenta-se assintomática nas
primeiras oito a doze horas após a mordida da aranha. Depois desse período, começa a se
queixar de dor e queimação de caráter progressivo. Em seguida, instala-se halo eritematoso
em volta do ponto de inoculação que já apresenta certo grau de isquemia. Essa área
isquêmica aumenta, formando o que se denomina “placa marmórea”. Associado a esse
quadro, denominado cutâneo-puro ou dermonecrótico, após 36 a 48 horas, surgem bolhas e
equimoses que podem evoluir para necrose (FIG.7). Infecções bacterianas secundárias são
complicações freqüentes nos casos graves (CARDOSO E COLS., 1988; MONTEIRO E
COLS., 2002). A ausência de lesão após dois a três dias desde a mordida, usualmente
indica que a necrose não irá ocorrer (SAMS E COLS., 2001)
FIGURA 7. Evolução de uma lesão dermonecrótica causada por mordida de aranha
Loxosceles. Local da mordida e evidenciação da lesão necrótica (RIBEIRO E COLS.,
1993).
Existe também, embora pouco freqüente (3 - 16% dos casos), a forma cutâneovisceral ou sistêmica, onde uma hemólise intensa causa anemia e icterícia. Esse quadro
pode ser acompanhado de febre, mal-estar e coagulação intravascular disseminada. A
insuficiência renal por deposição de cilindros de hemoglobina resultantes de hemólise é um
grave fator complicador, sendo a principal causa de óbitos, principalmente em crianças,
idosos e indivíduos debilitados (CARDOSO, 1992).
O tratamento indicado nos acidentes com Loxosceles é bastante controverso,
podendo incluir terapias não específicas, como a administração de corticoesteróides tópicos,
anti-histamínicos, antibióticos e analgésicos (MONTEIRO E COLS., 2002). Em casos mais
graves, outros procedimentos, como a excisão cirúrgica da lesão necrótica, transfusão de
sangue e hemodiálise podem ser usados (RIBEIRO E COLS., 1993). A importância da
administração de soroterapia específica também tem sido confirmada por vários
pesquisadores (BARBARO E COLS., 1996b; BRAZ E COLS., 1999, GUILHERME E COLS.,
16
2001). Estudos mostram que a imunoterapia para o tratamento do loxoscelismo é eficaz na
neutralização da ação do veneno até 36 horas após o incidente. Desse modo, a utilização
do soro antiveneno pode diminuir os danos causados pelo envenenamento por Loxosceles
(diminuição do tamanho da lesão necrótica e limitação dos efeitos sistêmicos) mesmo que
muitas vítimas não procurem atendimento médico rapidamente devido ao fato de
subestimarem o acidente, dada à ausência de dor local no momento da mordida e ao
aspecto frágil da aranha (Boletim Ecológico de Curitiba, 1996). Vale destacar também que o
uso da soroterapia é indicado principalmente para lesões cutâneas e necrose extensas ou
nos quadros sistêmicos, uma vez que sua administração envolve o risco de reações
alérgicas (HORGAN E COLS., 2004).
Existem quatro antivenenos comerciais contra Loxosceles (HORGAN E COLS.,
2004): 1) o antiveneno aracnídeo do Instituto Butantan (São Paulo, Brasil) específico para
uma mistura de venenos que incluem as aranhas L. gaucho e Phoneutria nigriventer e os
escorpiões Tityus serrulatus e T. bahiensis; 2) o antiveneno monovalente L. intermediaespecífico e o polivalente L. intermedia, L. laeta e L. gaucho do Centro de Produção e
Pesquisa em Imunobiológicos (Paraná, Brasil); 3) o antiveneno dos Institutos Nacionais de
Saúde (Lima, Peru) e 4) o antiveneno contra as aranhas Loxosceles e Latrodectus do
Instituto Bioclon (México). No Brasil, a taxa de utilização de antivenenos para mordidas de
Loxosceles varia de 11,9% (Paraná) a 70% (São Paulo) (BARBARO & CARDOSO, 2003).
Com o objetivo de prover um meio racional para medir a eficácia da soroterapia
específica e estabelecer uma melhor relação entre a severidade dos sintomas clínicos e a
quantidade de veneno circulante no soro de pacientes envenenados, Chávez-Olórtegui e
cols. (1998) desenvolveram um Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tipo
sanduíche, para detectar antígenos do veneno da aranha L. intermedia. Esse método, após
padronização, poderá ser de grande valia no diagnóstico de envenenamentos por essa
aranha, sendo uma ferramenta promissora para o uso clínico e epidemiológico. Até o
momento não há nenhum teste diagnóstico de custo e tempo aceitáveis para confirmar os
casos de envenenamento (HORGAN E COLS, 2004).
1.4.2 COMPOSIÇÃO GERAL DO VENENO
O veneno da Loxosceles é um líquido claro, viscoso e consistente, produzido por
glândulas apócrinas. Caracterizações bioquímicas e funcionais de seus componentes ativos
têm sido realizadas, a fim de auxiliar o desenvolvimento de tratamentos mais efetivos contra
os muitos casos de envenenamento relatados.
17
Em 1995, Tambourgi e cols. isolaram do veneno de L. intermedia uma fração
chamada F35, cuja principal proteína apresentava massa molecular de 32 kDa. Essa
proteína demonstrou incorporar-se à superfície celular de eritrócitos humanos levando à
hemólise dos mesmos. Essa descoberta explica a hemólise observada in vivo nos casos de
envenenamento por Loxosceles. Em 2000, o mesmo grupo de pesquisadores acrescentou
que,
na
verdade,
a
hemólise
dos
eritrócitos
seria
conseqüência
da
atividade
esfingomielinase das toxinas do veneno de L. intermedia. Essas toxinas induziriam a
ativação de uma metaloproteinase endógena, levando à clivagem de glicoforinas: fatores
importantes na proteção de eritrócitos contra a ação do complemento. Além disso, essas
mesmas toxinas também estariam envolvidas na desestruturação da membrana plasmática
dos eritrócitos, levando à exposição de fosfatidilserinas: lipídeos normalmente expressos na
membrana interna dessas células e capazes de ativar o sistema complemento quando
expostos (TAMBOURGI E COLS., 2002). Somando-se a isso, a F35 mostrou-se ainda capaz
de induzir a lesão dermonecrótica característica dos acidentes por Loxosceles, reproduzindo
as ações locais e sistêmicas do veneno total (TAMBOURGI E COLS., 1998a).
Em 1998, Feitosa e cols. relataram a descoberta de duas outras proteínas no veneno
de L. intermedia. Ambas foram caracterizadas como metaloproteinases e apresentaram
ação proteolítica sobre moléculas da matriz extracelular. Uma delas demonstrou ser uma
enzima gelatinolítica de 32-35 kDa, cuja atividade parece estar envolvida com a ação
dermonecrótica do veneno. Já a outra, com peso molecular de 20-28 kDa, demonstrou
degradar fibronectina e fibrinogênio, estando provavelmente relacionada aos problemas de
coagulação intravascular e de agregação de plaquetas característicos do loxoscelismo.
Essas duas proteínas foram também posteriormente identificadas por Silveira e cols. (2002)
e, segundo Veiga e cols. (1999), são N-glicosiladas, sendo a atividade dermonecrótica da
enzima gelatinolítica dependente dessa glicosilação. Vale destacar que essa enzima
gelatinolítica de 32-35 kDa foi também detectada na peçonha da aranha L. laeta (SILVEIRA
E COLS., 2002).
Também em 1998, a fração F35 foi separada em três picos chamados P1, P2 e P3
(TAMBOURGI E COLS. b). Os picos P1 e P2 mostraram ser proteínas puras com ação
hidrolítica sobre esfingomielina - uma classe de esfingolipídeos presentes na membrana
plasmática de células animais - e capazes de induzir, mesmo que isoladamente, todos os
efeitos observados in vivo com o veneno total de Loxosceles, inclusive hemólise dependente
de complemento. Já o pico P3 mostrou ser formado por duas proteínas altamente
homólogas, porém, completamente inativas para os ensaios realizados. Embora os
mecanismos que levem à lesão dermonecrótica ainda não sejam claramente conhecidos, os
autores do trabalho sugerem que a ceramida, gerada in vivo pela hidrólise da esfingomielina
e conhecida como um mediador de apoptose, esteja envolvida na indução dessa lesão. Em
18
2002, Van den Berg e cols. demonstraram que a toxina P1, assim como o veneno bruto de
L. intermedia, pode induzir a liberação de moléculas transmembrana, como o complexo
principal de histocompatibilidade I (MHC I), de células nucleadas através da ativação de
uma metaloproteinase, tornando-as, ao contrário do esperado, mais resistentes à lise
mediada por complemento.
Veiga e cols., em 2000, identificaram duas serina-proteases com atividade
gelatinolítica e de alto peso molecular (85 e 95 kDa) no veneno de L. intermedia. Essas duas
proteínas, assim como as outras citadas, também parecem estar envolvidas nos danos
causados pelo veneno.
É importante notar que os efeitos produzidos pelo veneno de L. intermedia, ou pela
F35, podem variar quanto a sua severidade e que dependem de vários fatores, como a
susceptibilidade individual (TAMBOURGI E COLS., 1998a), local da mordida, quantidade
injetada na vítima (SEZERINO E COLS., 1998) e as diferentes composições intraespecíficas
do veneno. Gonçalves de Andrade e cols. (1999), por exemplo, mostram que a toxina F35
aparece em sua forma completamente ativa somente no veneno de aranhas já no terceiro
estágio de desenvolvimento e que daí em diante sua atividade aumenta até que o aracnídeo
torne-se adulto. Outros estudos mostram que as fêmeas de L. intermedia produzem uma
maior quantidade de veneno do que os machos e que, além disso, apresentam atividade
dermonecrótica e hemolítica mais potentes, o que pode ser explicado pela maior presença
de F35 em seus venenos (OLIVEIRA E COLS., 1999, 2005).
Há
três
anos,
Kalapothakis
e
cols.
(2002)
descreveram
a
identificação,
caracterização molecular e expressão de uma nova proteína (LiD1) de aproximadamente 31
kDa pertencente à família das toxinas dermonecróticas de L. intermedia. Essa proteína foi
fortemente reconhecida por anticorpos anti-dermonecróticos e foi também capaz de gerar
anticorpos reativos contra proteínas dermonecróticas nativas. De modo similar, a clonagem
molecular e expressão funcional de outro fator dermonecrótico, desta vez - da aranha L.
laeta - foi realizada por Pedrosa e cols. (2002). O uso da toxina recombinante, gerada no
trabalho de Kalapothakis e cols. (2002), como imunógeno para o desenvolvimento de antivenenos de uso clínico ou como uma vacina para proteção contra o veneno de L. intermedia
é discutido por Araújo e cols. (2003).
Recentemente, uma caracterização molecular preliminar da peçonha da aranha L.
intermedia foi realizada pela Dra. Fernanda Laborne Valle Salles, pertencente ao nosso
grupo de pesquisa. Através da geração de 127 Etiquetas de Seqüências Expressas (ESTs)
a partir de clones da biblioteca de cDNA da glândula de veneno dessa aranha, cerca de 86
clones foram identificados como codificadores de proteínas similares a proteínas
depositadas no GenBank, destacando-se, entre eles, 14 clones similares a toxinas e
proteínas de venenos (SALLES, 2002).
19
Finalmente, Murakami e cols. (2005) relataram a primeira estrutura cristalográfica de
uma toxina da família das esfingomielinases D das aranhas Loxosceles. Esta toxina
enovela-se como um (α/β)8 barril - também denominado TIM barril - e apresenta sítio
catalítico conservado, ao qual o substrato se liga e é estabilizado por um íon Mg2+. Através
de dicroísmo circular e de análise de seqüências de diversas esfingomielinases de
Loxosceles, De Andrade e cols. (2005) e Binford e cols. (2005), respectivamente, também
indicaram que estas proteínas enovelam-se em uma estrutura TIM barril; sendo que os
últimos autores acrescentaram ainda, que, as mesmas seriam derivadas da família das
proteínas glicerofosforil diester fosfodiesterases (GDPD).
1.4.3
TOXINAS INSETICIDAS
Devido ao seu forte apelo na área médica, o veneno da aranha Loxosceles vem
sendo, de certa forma, negligenciado quanto ao seu efeito em insetos. Existem
pouquíssimos estudos a este respeito descritos na literatura, sendo a maioria antiga
(décadas de 60 e 70) e referentes ao veneno de L. reclusa.
Em 1968, Norment e Smith demonstraram que o veneno dessa aranha apresenta
atividade hemolítica contra hemócitos do grilo Acheta domesticus, causando também
necrose e morte nesse inseto. No ano seguinte, Norment e Vinson relataram a ação lítica e
patológica do veneno ou de produtos do veneno sobre o tecido adiposo e muscular da larva
do tabaco Heliothis virescens, fornecendo, além disso, evidências de sua ação proteolítica
na hemolinfa. Após um grande período sem publicações sobre o assunto, Eskafi e Norment
(1976) retomaram o assunto através do estudo das mudanças morfológicas de células e
tecidos de larvas de Musca domestica e Heliothis virescens mordidas por L. reclusa. Essas
mudanças morfológicas incluíram, entre outras, a lise de células epiteliais do intestino,
membrana peritrófica, células musculares, epiderme e de proteínas de células adiposas. A
atividade de proteases, lipases, esterases e da enzima fosfatase alcalina também foram
avaliadas, mostrando-se bastante fortes nas larvas envenenadas. Ainda nesse trabalho,
amostras de hemolinfa coletadas dos insetos testados apresentaram lise, coagulação e
alteração da morfologia dos hemócitos. Em 1980, Foil e cols. estabeleceram, por meio de
injeções em espécimes adultos de Musca domestica, a toxicidade de diferentes frações
obtidas por filtração em gel do veneno de L. reclusa. Como havia sido previamente
reportado por Foil e cols. (1979), o resultado desse método de cromatografia para o veneno
de L. reclusa é a obtenção de três picos principais, sendo os picos 1 e 2 letais para moscas
domésticas. O pico 1, que contém componentes de maior peso molecular, apresentou ação
inseticida mais lenta que o pico 2, que contém os componentes de baixo peso molecular.
20
Vale destacar que este pico já havia sido caracterizado, por técnicas de eletrofisiologia em
nervos de barata, como neuroativo em insetos no trabalho de 1979. Desde então, com
exceção de nosso recente trabalho (CASTRO, 2003), que identificou três toxinas com ação
inseticida em larvas de S. frugiperda (LiTx1, LiTx2 e LiTx3 – FIG.8) a partir de testes
biológicos com picos protéicos obtidos pelo fracionamento do veneno de L. intermedia,
nenhuma outra informação relevante foi acrescentada formalmente ao conhecimento de
toxinas inseticidas de aranhas do gênero Loxosceles. Essas toxinas apresentam massa
molecular de aproximadamente 7 kDa e pertencem a um grande grupo de componentes dos
venenos de Loxosceles que, de acordo com Barbaro e cols. (1996a) e também Binford e
cols., (2003), encontram-se abaixo de < 8 kDa.
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(./n022004l.pfb)
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/Courier-Bold
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1455770
/Courier-Bold
/Font
/Courier-Bold
26
2. OBJETIVOS
2.1
GERAL
Parte 1
Ampliar o banco de dados de toxinas através de análises bioinformáticas de
transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia.
Parte 2
Construir baculovírus recombinantes, através da inserção de toxinas inseticidas do
veneno de L. intermedia no DNA viral desses organismos.
2.2
ESPECÍFICOS
Parte 1
1) Seqüenciar cerca de 800 clones selecionados por varredura da biblioteca de cDNA
da aranha L. intermedia (CASTRO, 2003).
2) Tratar as seqüências obtidas para torná-las livres de regiões contaminantes como
vetores, sítios de restrição e sítios de poli A 3’.
3) Realizar o agrupamento qualitativo das seqüências tratadas.
4) Realizar a anotação gênica das seqüências agrupadas, ou seja, identificá-las de
acordo com suas relações de homologia através de análise computacionais.
5) Classificar as seqüências agrupadas em categorias funcionais, analisá-las quanto a
sua função biológica e, quando possível, modelá-las para a verificação de suas
prováveis estruturas tridimensionais.
27
Parte 2
1) Caracterizar o veneno bruto da aranha L. intermedia quanto a sua atividade
inseticida (Dose Letal 50 - DL 50) em larvas de interesse agrícola.
2) Determinar possíveis funções específicas para as toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e
LiTx3 previamente identificadas por nosso grupo.
3) Caracterizar o grupo das frações 35 a 40 previamente obtidas por nosso grupo
através de um único passo de fracionamento em coluna de fase reversa em sistema
HPLC do veneno bruto da aranha marrom L. intermedia.
4) Identificar toxinas presentes no grupo das frações 35 a 40 previamente obtidas por
nosso grupo.
5) Subclonar a região madura das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia em
vetores de transferência do sistema de expressão baculovírus.
6) Produzir vírus recombinantes carreadores das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L.
intermedia em sistema baculovírus.
7) Expressar as toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia em células de insetos,
usando para isso DNAs virais do sistema baculovírus derivados do vírus AcMNPV.
8) Realizar - com os baculovírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 - testes de toxicidade em
larvas do inseto praga: lagarta-do-cartucho do milho Spodoptera frugiperda
(Lepdoptera: Noctuidae), para a avaliação da patogenicidade desses vírus
geneticamente modificados.
28
3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
Parte 1
A facilidade de isolamento de mRNAs de organismos eucariotos e sua transcrição
reversa de mRNA para cDNA tornam possível a análise qualitativa e quantitativa, em larga
escala, dos diferentes genes transcritos em uma espécie ou tecido. A combinação de
técnicas de biologia molecular e de ferramentas bioinformáticas permitem, portanto, a
avaliação da expressão gênica de qualquer amostra biológica de interesse. Neste trabalho,
análises bioinformáticas dos transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom
Loxosceles intermedia permitirão a caracterização dos principais componentes expressos
neste órgão, ampliará o nosso conhecimento sobre o potencial biotecnológico dos
componentes do veneno e fornecerá novas informações sobre a composição do veneno
desta aranha.
Parte 2
Neste início de século, o futuro do sistema de produção agrícola é uma das
importantes questões a serem discutidas pela humanidade. O crescimento em ritmo
acelerado da população mundial, as grandes perdas agrícolas por ataque de pragas e o
aumento das áreas inadequadas para cultivo são apenas alguns dos desafios para a
produção de alimentos nas próximas décadas. Desse modo, a descoberta e o
desenvolvimento contínuo de novas tecnologias que auxiliem no aumento da produtividade
agrícola, sem trazer danos ao meio ambiente, são necessários e relevantes para toda a
sociedade. O trabalho aqui realizado é uma etapa importante para o uso de toxinas
recombinantes do veneno de L. intermedia como bioinseticidas úteis no controle de
diferentes pragas.
37
5. MÉTODOS
Inicialmente, é importante salientar que o trabalho descrito nesta tese segue a
mesma linha de pesquisa da dissertação: “Fracionamento e caracterização do veneno bruto
da aranha marrom Loxosceles intermedia: identificação de novas toxinas inseticidas”
(CASTRO, 2003).
Resumidamente, durante o mestrado, três novas toxinas inseticidas, denominadas
LiTx1, LiTx2 e LiTx3, foram identificadas a partir do veneno bruto da aranha marrom L.
intermedia através de cromatografia de fase reversa em sistema HPLC e espectrometria de
massa. Todas as frações obtidas pelo fracionamento do veneno foram investigadas quanto
à presença de antígenos de toxinas dermonecróticas, sua capacidade de produzir lesões em
coelhos após injeção intradérmica e quanto a sua toxicidade a insetos. As frações que
continham as toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 não apresentaram qualquer evidência de possuir
atividade dermonecrótica e foram letais para larvas de Spodoptera frugiperda em um
período de, no máximo, 48 horas após a injeção das frações. Clones das três toxinas em
questão foram então isolados por varredura da biblioteca de cDNA das glândulas de veneno
da aranha L. intermédia através de uma PCR de colônias com iniciadores que flanqueiam as
extremidades do sítio múltiplo de clonagem do vetor pBK-CMV. A análise das seqüências de
nucleotídeos desses clones revelou que todas as toxinas possuem peptídeo sinal
hidrofóbico, propeptídeo rico em resíduos de glutamato, peptídeo maduro e provável
peptídeo C-terminal. O alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas dessas toxinas
com aquelas de outras toxinas inseticidas de aranhas indicou que suas estruturas espaciais
seguem o padrão geral de enovelamento das proteínas dos venenos de artrópodes. Um
outro dado importante revelado foi a similaridade da toxina LiTx1 com as curtatoxinas II e III
e a µ-agatoxina III, toxinas inseticidas conhecidas por causar paralisia irreversível em
insetos lepdópteros pela liberação maciça de neurotransmissores (mediada por receptores
de glutamato) das vesículas pré-sinápticas nas junções neuromusculares.
Diante
dos
resultados
obtidos
na
dissertação
(acima
citados)
buscou-se
primeiramente nesta tese, a caracterização molecular de todos os clones selecionados
durante a varredura da biblioteca de cDNA das glândulas de veneno de L. intermedia. Em
seguida, visando avançar no desenvolvimento de novas estratégias de combate a pragas
agrícolas, partiu-se para a clonagem e a expressão no sistema de expressão baculovirus de
duas das toxinas identificadas anteriormente (LiTx1 e LiTx2). Além disso, ao longo do
processo de pesquisa, decidiu-se buscar toxinas com maior potencial inseticida que as
toxinas LiTx1, LiTx2 (como será melhor compreendido no item 5.8). Desta maneira, a
identificação, clonagem e expressão de uma nova toxina inseticida do veneno de L.
intermedia (LiD1) foi também realizada.
38
Parte 1
5.1
ANÁLISES
BIOINFORMÁTICAS DE TRANSCRITOS DA GLÂNDULA DE
VENENO DE Loxosceles
intermedia
Os procedimentos aqui realizados foram baseados na Monografia de Bacharelado de
Santos (2002).
5.1.1
OBTENÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
Foram seqüenciados 800 clones do vetor fagemídeo pBK-CMV selecionados pela
varredura da biblioteca de cDNA da aranha L. intermedia (contendo fragmentos clonados de
DNA - CASTRO, 2003).
A reação de seqüenciamento ocorreu pela adição, em poços de placas de PCR, de:
DNA molde (plasmídeos pBK-CMV contendo fragmentos clonados de 200 ng
DNA)
Iniciador BK reverso (FIG.11)
Pré-mix de seqüenciamento do kit DYEnamic
5 pmol
TM
ET dye terminator 4 µl
MegaBACETM (Amersham Biosciences).
Água deionizada estéril
q.s.p. 10 µl
Os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão da reação de seqüenciamento
foram realizados no termociclador PTC-100 (MJ Research). O programa utilizado está
descrito a seguir:
1 - 95°C por 20 segundos
2 - 55°C por 15 segundos
3 - 60°C por 1 minuto e 20 segundos
4 - A partir do passo 1, o ciclo foi repetido 29 vezes
Após a reação de seqüenciamento, as amostras foram precipitadas pela adição de 1
µl de acetato de amônio e 30 µl de etanol 96% ao conteúdo dos poços das placas de PCR.
A placa foi deixada à temperatura ambiente por 20 min, período após o qual, foi centrifugada
por 45 min a 4000 r.p.m. O sobrenadante foi descartado e a placa batida levemente em
39
papel absorvente. 100 µl de etanol 70% foram, então, acrescentados lentamente pela
parede de cada poço, sendo a placa centrifugada por 10 min a 4000 r.p.m. Novamente, o
sobrenadante foi descartado e a placa batida levemente em papel absorvente. Em seguida,
a placa foi coberta por papel alumínio e deixada à temperatura ambiente por 10 min. O
precipitado resultante foi ressuspendido em 10 µl de tampão de amostra para injeção no
MegaBACETM (loading solution), estando pronto para seqüenciamento no aparelho
MegaBaceTM 1 1000 (Amersham Biosciences).
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STACK:
/Subrs
-dictionary/Private
(./n022004l.pfb)
/NimbusMonL-Bold
/Courier-Bold
-mark/Courier-Bold
766828
/Courier-Bold
/Font
/Courier-Bold
131
7. DISCUSSÃO
Parte 1
7.1 A NÁLISES
BIOINFORMÁTICAS DE TRANSCRITOS DA GLÂNDULA
DE VENENO DE
A caracterização molecular de proteínas de glândulas de veneno é utilizada em
muitos trabalhos com o propósito de facilitar as etapas de identificação, caracterização e
purificação necessárias ao estudo e utilização dos componentes aí presentes. Desta forma,
clones de cDNA codificando várias proteínas e, em especial, toxinas, têm sido selecionados
e avaliados, possibilitando a obtenção de informações significativas sobre suas estruturas e
funções. Podemos citar, por exemplo, o estudo de transcriptomas das glândulas de veneno
de aracnídeos, como da aranha Lasiodora sp (SILVESTRE, 2005), da aranha armadeira
Phoneutria nigriventer (KALAPOTHAKIS E COLS., 1998a, b; PENAFORTE E COLS., 2000)
e da viúva negra Latrodectus mactans, da qual foi isolado o cDNA da alfa-latroinsectotoxina
(alfa-LIT), uma neurotoxina pré-sináptica específica para insetos (KIYATKIN E COLS.,
1993).
A estratégia utilizada em todos estes trabalhos e - inclusive nesta tese - envolve a
seleção aleatória de clones de cDNA e o seqüenciamento automatizado, de uma ou ambas
as extremidades de seus insertos. As seqüências geradas por este procedimento são
denominadas ESTs (Expressed Sequence Tags) e são caracterizadas por serem curtas
(aproximadamente 400 a 600 bases) e relativamente imprecisas (cerca de 2% de margem
de erro) (ADAMS E COLS., 1991). Vale ressaltar, no entanto, que, embora um pouco
imprecisas, estas seqüências constituem um valioso recurso para a descoberta de novos
genes pois, como ficou demonstrado, são derivadas de uma metodologia eficaz e de baixo
custo.
Em 1992 uma base de dados denominada dbEST (agrupada na divisão EST do
GenBank) foi criada para servir como um banco de dados para ESTs (BOGUSKI E COLS.,
1993). Esta divisão domina os acessos ao GenBank, respondendo por aproximadamente
dois terços de todas as submissões. Inúmeros projetos em grande escala têm sido
realizados para diversos organismos de interesse biotecnológico, sendo responsáveis por
cerca de 80.000 submissões de seqüências de insertos de cDNA até agosto de 2002
(BENSON E COLS., 2002).
132
Neste trabalho, dos 800 clones de cDNA da glândula de veneno da aranha
Loxosceles intermedia seqüenciados, somente 457 (~57%) apresentaram seqüências de
boa qualidade, ou seja, maiores do que 150 nucleotídeos e com menos de 4% de
ambigüidade (N ou X). Uma hipótese para explicar esse baixo rendimento refere-se a
problemas de armazenamento dos clones analisados, o que inclui congelamentos e
descongelamentos sucessivos por desligamento do freezer -80ºC, o que diminui
significativamente a viabilidade das bactérias armazenadas e implica também em uma baixa
qualidade do DNA nelas contido e, conseqüentemente, das seqüências geradas. Vale dizer
ainda que destes 457 clones de boa qualidade, 189 (~41%) tratavam-se do vetor pBK-CMV
sem inserto, os quais foram descartados de nosso estudo. Infelizmente, esse resultado nos
mostra que a eficiência na seleção dos clones que continham inserto de cDNA (através da
varredura da biblioteca da glândula de veneno de L. intermedia por PCR de colônias com
iniciadores que flanqueiam as extremidades do sítio múltiplo de clonagem do vetor pBKCMV) foi baixa. Isso pode ter ocorrido devido às condições poucos estringentes da reação
de PCR mencionada, o que teria acarretado no aparecimento de bandas inespecíficas de
amplificação e, conseqüentemente, na falsa seleção dos clones. De qualquer maneira, a
partir dos 268 clones restantes para nosso estudo, todos os resultados já apresentados
nesta tese foram obtidos e agora iremos discuti-los.
Os referidos 268 clones de boa qualidade e contendo insertos de cDNA foram
alinhados através dos programas MULTALIN e BLAST TWO SEQUENCES. Dentre eles,
cerca de 50%, quando comparados entre si, não apresentaram seqüências idênticas ou
similares o suficiente para que fossem reunidos em um só, sendo chamados de singlets. Já
os outros 50% dos clones foram reunidos em 33 diferentes agrupamentos ou consensos.
De acordo com Liang e cols. (2000), o número de singlets fornece-nos uma
estimativa do número de transcritos raros representados nos dados estudados. Para evitar
super-estimativas, Liang recomenda que o trabalho de agrupamento seja, de certo modo,
tolerante com erros de seqüenciamento a fim de não produzir um número excessivo de
singlets. Em nosso trabalho, entretanto, optamos por utilizar parâmetros pouco tolerantes
com discrepâncias nas seqüências, o que acarretou no resultado acima citado (cerca de
50% de singlets).
Toda a seqüência resultante do agrupamento, seja consenso ou singlet, foi chamada
de unique, sendo o processo de anotação dos mesmos realizado prioritariamente a nível de
proteínas. Como verificamos na FIG.36, dos 169 uniques analisados, 83, ou seja, 49,1% não
apresentaram similaridade significativa com nenhum gene ou proteína depositados nos
bancos de dados utilizados. Este resultado é inferior ao apresentado por Silvestre (2005)
que, em análise de 1947 uniques de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da
aranha Lasiodora sp., verificou que cerca de 70% dos mesmos não apresentaram
133
similaridade com proteínas ou genes de bancos de dados. Em outro trabalho (SANTOS E
COLS., 1999), onde analisou-se transcritos de bibliotecas de cercária de Schistosoma
mansoni, não se encontrou similaridade para 57, 6% das seqüências estudadas.
Como constatamos a partir dos dados citados no parágrafo acima, esses valores de
não similaridade, descritos na literatura, são bastante variáveis e comparações entre eles
devem levar em conta os valores de corte utilizados no BLAST. Este fato torna as
comparações um processo difícil e, mesmo observando essa variável (valor de corte), a
comparação mantém-se arriscada, pois o número de seqüências depositadas nos bancos
de dados aumenta a cada dia, o que influencia diretamente os valores de corte. Deste
modo, uma análise BLAST realizada hoje com o valor de corte para e-value de 0.001 pode
ser bastante diferente da mesma análise a ser realizada daqui a alguns meses ou anos.
É importante verificar também que existem poucos organismos evolutivamente
próximos à L. intermedia que apresentam grande número de seqüências disponíveis nos
bancos de dados; o que pode justificar, parcialmente, a alta porcentagem de seqüências
sem similaridade. Em agosto deste ano, por exemplo, em busca no sistema de acesso à
seqüências
de
DNA
e
proteínas
Entrez
(The
Life
Science
Search
Engine
-
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi), somente 23 seqüências de nucleotídeos e
41 seqüências de aminoácidos haviam sido depositadas no GenBank, SwissProt, PIR, PRF,
PDB, entre outros, para a família Sicariidae, à qual as aranhas Loxosceles pertencem.
Acreditamos que a inclusão de novas seqüências de L. intermedia nos bancos de dados, a
partir deste trabalho e de outros, possa permitir uma melhor identificação dos transcritos
sem similaridade significativa nas futuras buscas por homologia de organismos
relacionados.
Retornando ao processo de anotação (FIG.36), verificamos que dentre os uniques
que apresentaram similaridade com genes ou proteínas depositados em bancos de dados,
16% destacam-se como sendo da própria L. intermedia (esfingomielinase P1, P2, LiD1 e
toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3). Esse fato, bastante previsível, supera em mais de 50% o
segundo destaque, que se refere aos uniques similares a genes ou proteínas de outros
organismos quaisquer (7,7%).
Ainda com relação aos uniques similares à seqüências depositadas em bancos de
dados, 40% foram classificados nas principais categorias funcionais celulares dos COGs
(FIG.37). Esse dado é significativamente inferior à média de 60 a 80% relatada por Tatusov e
cols. (2001) para proteínas anotadas de novos genomas. No entanto, como a glândula de
veneno de L. intermedia é um órgão bastante especializado e responsável, primeiramente,
pela produção de componentes tóxicos para o ataque e a defesa dessa aranha, a menor
porcentagem observada não nos surpreende, sendo até mesmo esperada. Como sabemos,
muitas funções biológicas não são compartilhadas pelos organismos. De acordo com
134
Aubourg e Rouzé (2001), por exemplo, mais de 60% dos genes anotados do vegetal
Arabidopsis são planta-específicos, não podendo ser agrupados com genes de organismos
animais.
Neste ponto também, vale alertar que neste trabalho a classificação dos uniques
obtidos nas principais categorias dos COGs refere-se apenas à questão de homologia
isofuncional. Nenhum estudo de biologia evolutiva foi realizado a fim de determinar se estes
produtos gênicos eram ortólogos ou parálogos: termos que se referem à divergência de
seqüências associada, respectivamente, à especiação ou à duplicação gênica, e que não
têm implicações funcionais implícitas ou explícitas (JENSEN, 2001). Mesmo que este
trabalho tivesse sido realizado, sabemos que a questão da ortologia (compartilhar ancestral
comum) é pertinente somente para um número limitado de genes (AUBOURG E ROUZÉ,
2001).
Quanto à distribuição dos uniques nas principais categorias dos COGs, nossos
resultados (FIG.37) estão de acordo com aqueles apresentados por Silvestre (2005) em sua
tese. Essa autora, recentemente nos mostrou que transcritos da glândula de veneno de
Lasiodora sp. classificados em categorias funcionais dos COGs apresentaram, como em
nosso trabalho, uma maior proporção de seqüências na categoria de processos celulares,
um número intermediário na categoria de processamento e armazenamento de informações
e uma menor proporção na categoria de metabolismo.
Adicionalmente, para que tivéssemos uma visão geral do transcriptoma da glândula
de veneno da aranha marrom L. intermedia, os 40% dos uniques classificados nas principais
categorias dos COGs foram ainda detalhadamente subdivididos e contabilizados na TABELA
6. No que se refere aos resultados aí apresentados, gostaríamos de destacar a grande
porcentagem de uniques similares a genes ou proteínas das subcategorias “Tradução,
estrutura ribossomal e biogênese” (26,5%) e “Mobilidade celular e secreção “ (11,8%).
Na subcategoria “Tradução, estrutura ribossomal e biogênese”, fora um unique
similar a um fator de alongamento da tradução, todos os oito demais uniques identificados
foram similares a proteínas ribossomais. De acordo com Nelson e Cox (2000), estima-se
que organismos eucarióticos possuem, aproximadamente, oitenta diferentes proteínas
ribossomais, o que sugere que neste trabalho identificamos apenas 10% das proteínas
ribossomais de L. intermedia. No entanto, considerando-se que somente um órgão, ou seja,
a glândula de veneno deste organismo, foi estudado, podemos dizer que o resultado obtido
está dentro do esperado.
Já na subcategoria “Mobilidade celular e secreção”, três uniques foram identificados
como similares a troponinas e um à tropomiosina, proteínas indispensáveis ao processo de
contração muscular. Vale então lembrar que, como observado por Dos Santos e cols.
(2001), a glândula de veneno de L. intermedia é rica em fibras musculares, responsáveis
135
pela contração desse importante órgão e, conseqüentemente, pela expulsão do veneno
acumulado em suas vesículas secretórias, o que justifica plenamente a identificação desses
clones em nosso estudo.
Além da classificação de 40% dos uniques nas principais categorias dos COGs, 60%
foram classificados em categorias funcionais exclusivas para toxinas (FIG.38). Dentre eles,
22% destacam-se como uniques similares a toxinas hemolíticas e dermonecróticas
(esfingomielinase de L. boneti, de L. laeta, P1 e P2 de L. intermedia, LiD1 e proteína
dermonecrótica de L. similis). Novamente, como mencionado na INTRODUÇÃO desta tese,
ressaltamos que a ação tóxica do veneno desta aranha está justamente relacionada à estas
atividades, o que torna este resultado bastante esperado.
Outro dado interessante observado nas FIGS. 37 E 38, refere-se ao fato de que
grande parte dos uniques anotados (cerca de 47,5%) não têm sua função bem
caracterizada. Nesta questão verificamos a grande utilidade da genômica funcional e das
metodologias tradicionais para a caracterização funcional dos genes em seus processos
biológicos. De acordo com Stein (2001), dos 1.709 genes de H. influenzae, 5.600 de
levedura, 13.000 de mosca, 19.000 de verme, 24.000 de grãos de mostarda e 30.000 de
humano, apenas uma pequena fração corresponde a proteínas conhecidas e bem
caracterizadas. Somando-se a isto, de acordo como o mesmo autor, mais da metade das
proteínas preditas em eucariotos pertence a novas famílias protéicas, o que destaca o
quanto ainda temos a aprender e a realizar na pesquisa básica.
Finalmente, no que se refere à modelagem molecular dos uniques, o mesmo espaço
desconhecido aparece: de todos os clones analisados, somente vinte tiveram seus modelos
sugeridos por homologia.
A elucidação experimental da estrutura tridimensional de proteínas é um processo
lento e tecnicamente desafiador (SCHWEDE E COLS., 2000). Assim, poucas são as
proteínas cujas estruturas foram elucidadas. Isto é exemplificado pelo fato de que enquanto
o banco de dados SWISS-PROT / TrEML possuí mais de 230.000 seqüências, o PDB
possui menos de 10.000 cadeias protéicas de diferentes seqüências. Á medida que este
número for aumentado, a estrutura espacial das proteínas será cada vez mais utilizada na
anotação funcional. Na verdade, as comparações convencionais de seqüências são
limitantes para a identificação de proteínas homólogas e o estudo de estruturas 3D permite
o aumento da sensibilidade, uma vez que a estrutura protéica é muito mais conservada que
a seqüência primária (BRENNER, 1998). Além disso, de acordo com Schwede e cols.
(2000), menos de 5% dos modelos gerados pelo SWISS-MODEL são inapropriados devido
a erros introduzidos por algoritmos de alinhamento de seqüências. Deste modo, acreditamos
que os modelos obtidos para os uniques similares a esfingomielinases (FIG.39) e a
proteases (FIG.40) são bastante acurados. Suas partes mais confiáveis são aquelas
136
compartilhadas com seus moldes de modelamento [as estruturas cristalográficas obtidas por
difração de raios-X das moléculas: esfingomielinase I de L. laeta (cadeia A) (MURAKAMI E
COLS., 2005) e zinco endoprotease da bactéria Streptomyces caespitosus (cadeia A)
(KURISU E COLS., 2000) (FIG.41)] e os loops não conservados são as principais fontes de
imperfeições do modelo. Através da simples comparação visual podemos perceber também
a grande semelhança entre os uniques modelados e as estruturas cristalográficas usadas
como referência.
A fim de que os mecanismos de ação das proteínas aqui identificadas sejam
analisados, experimentos com proteínas recombinantes e/ou nativas isoladas do veneno
total de L. intermedia devem ser posteriormente realizados. A análise sistemática das
seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos das toxinas da glândula de veneno desta
aranha também será extremamente importante, pois as informações geradas serão dados
fundamentais para a elucidação dos mecanismos moleculares evolutivos responsáveis pela
grande diversidade de toxinas presentes não só em L. intermedia, mas também em outras
aranhas e artrópodes. Frente a tudo isso, é muito importante destacar que toda esta parte
do trabalho não poderia ser sido realizada sem os recursos proporcionados pela
bioinformática. Esperamos, desta forma, ter contribuído para o aumento do conhecimento
científico sobre a biologia da glândula de veneno da aranha-marrom L. intermedia.
Parte 2
7.2
ATIVIDADE INSETICIDA DO VENENO BRUTO DE L. intermedia
Diversos organismos vivos e, em especial, várias espécimes de artrópodes como
escorpiões e aranhas desenvolveram, ao longo do processo evolutivo, toxinas cujos alvos
fazem parte de vias metabólicas importantes ou essenciais de seus predadores e/ou presas.
Essas toxinas são inseticidas naturais presentes nos venenos desses animais e muitas
delas têm sido purificadas e caracterizadas química e funcionalmente (CORZO E COLS.,
2002; QUISTAD E COLS., 1991; FIGUEIREDO E COLS., 1995, 2001).
Neste trabalho, nós investigamos a letalidade do veneno bruto de Loxosceles
intermedia para insetos-praga altamente destrutivos que atacam raízes, caules e folhas de
um amplo espectro de plantações de vegetais, frutas e cereais: as larvas Agrotis ipsilon
(milho, tabaco, tomate, etc), Anticarsia gemmatalis (soja), Diatraea saccharalis (cana-deaçúcar), Spodoptera cosmioides (soja, maçã, feijão, etc) e S. frugiperda (milho). A dose letal
50 (DL50) encontrada para essas larvas foi de 1.80 ± 0.30, 0.15 ± 0.035, 1.39 ± 0.34, 1.92 ±
0.71 e 0.90 ± 0.11 µg.g-1, respectivamente. Esses valores aproximam-se dos parâmetros de
137
toxicidade previamente descritos para os venenos de Paracoelotes luctuosos, Agelenopsis
aperta e Hololena curta (0.44 - 1.26 µg.g-1, em larvas do tabaco S. litura - CORZO E COLS.,
2000), algumas das aranhas cuja atividade inseticida de seus venenos vêm sendo bastante
estudada nos últimos tempos. Embora diferenças quanto às espécies de insetos e às
metodologias utilizadas tornem as comparações difíceis, sugerimos que o veneno de L.
intermedia possui toxicidade similar ao dos venenos citados e que, entre as larvas usadas,
as lagartas A. gemmatalis e S. cosmioides são - consecutivamente - as mais sensíveis e as
mais resistentes ao veneno testado.
7.3
ANÁLISE
DE SIMILARIDADE DAS TOXINAS
LITX1, LITX2
E
LITX3
DE
L. intermedia
Com relação à busca de peptídeos inseticidas, recentemente nosso grupo isolou três
toxinas do veneno de L. intermedia com ação letal para larvas de S. frugiperda. As
seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos dessas toxinas foram obtidas e analisadas,
sendo as mesmas denominadas: LiTx1, LiTx2 e LiTx3 (CASTRO, 2003).
Para determinar as possíveis funções específicas dessas toxinas, nós consideramos
a similaridade entre suas seqüências e a de outras toxinas inseticidas de aranhas como um
indicador de supostos meios de ação para os peptídeos descritos. Na árvore de similaridade
construída, a toxina LiTx3 agrupou-se com os grupos mais internos formados por toxinas
reconhecidamente ou aparentemente ativas em canais de Na+ (CORZO E COLS., 2000;
GRISHIN, 1999; ADAMS E COLS., 1989). Essa toxina foi também intimamente relacionada
à δ-paluIT3: uma toxina inseto-específica isolada do veneno da aranha P. luctuosos
(CORZO E COLS., 2000). Por sua vez, as toxinas LiTx1 e LiTx2 ficaram em uma posição
intermediária entre o grupo das toxinas que atuam em canais de Na+ e todas as ω toxinas,
as quais atuam em canais de Ca2+ (WANG E COLS., 1999; ADAMS E COLS., 1990). Uma
fraca indicação de proximidade entre as toxinas LiTx1, LiTx2 e as toxinas ativas em canais
de Na+ foi observada. No entanto, o suporte estatístico não foi suficientemente significativo
para maiores conclusões (valores de bootstrap inferiores a 50%).
Para ilustrar a ação de toxinas em canais de sódio - possível mecanismo de ação
das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 - podemos citar a toxina AaIT do escorpião Androctonus
australis Hector, a Aga-IV da aranha A. aperta e a AsII da anêmona Anemonia sulcata.
Todas elas atuam em canais neuronais e causam efeitos excitatórios pré-sinápticos. A
toxina AaIT, após injeção em larvas de inseto, induz uma fase transitória curta de contração
seguida por uma paralisia flácida prolongada. Este mecanismo de ação envolve a
despolarização da membrana axonal e mudanças na amplitude e cinética da corrente de
138
sódio, o que gera o encurvamento dorsal da larva, o aumento de sua irritabilidade e a
redução de seu hábito alimentar (BONNING E HAMMOCK, 1996; GERSHBURG E COLS.,
1998; ZLOTKIN E COLS., 2000). Acreditamos que a expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e
LiTx3 em sistema baculovírus possibilitará, em um futuro próximo, a realização de trabalhos
que apontem ações semelhantes às acima relatadas.
7.4
SUBCLONAGEM
intermedia
DO
DNA
DAS TOXINAS
LITX1
E
LITX2
NO VETOR DE TRANSFERÊNCIA PSYNXIV
DE
VI+ X3
L.
DO
SISTEMA DE EXPRESSÃO BACULOVÍRUS
Um dos problemas associados à exploração da diversidade bioquímica dos venenos
de artrópodes é a disponibilidade limitada desse importante material biológico. Sua obtenção
em quantidade suficiente para a realização de ensaios biológicos é um processo bastante
difícil. Normalmente, para o gênero Loxosceles, necessita-se de um grande número de
espécimes, pois o volume total de veneno por aranha é mínimo: cerca de 4 µl, contendo de
30 a 100 µg de proteínas (SAMS E COLS., 2001). Além disso, a purificação dos
componentes destes venenos é uma técnica muitas vezes demorada e de baixo rendimento.
No presente trabalho, por exemplo, a pequena quantidade das proteínas purificadas LiTx1,
LiTx2 e LiTx3 não nos permitiu a realização de ensaios eletrofisiológicos para a sua melhor
caracterização funcional.
Com os avanços da ciência, técnicas como a do DNA recombinante possibilitaram a
clonagem dos genes responsáveis pela produção destas toxinas e, a partir daí, sua
expressão em outros organismos. Desta forma, uma vez sugeridos os possíveis alvos de
ação das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3, partimos para a produção recombinante dessas
toxinas através da subclonagem de seus DNAs no vetor de transferência pSynXIV VI+ X3 do
sistema de expressão baculovírus. Este trabalho de clonagem e expressão - vale destacar foi dividido com a então estudante de mestrado Flávia Galindo Silvestre, ficando a mesma
responsável pela continuidade da pesquisa com a toxina LiTx3.
Em nossa metodologia, a passagem inicial das toxinas LiTx1 e LiTx2 pelo vetor
pCR2.1-TOPO foi realizada simplesmente como um meio de aumentar a eficiência da
digestão pela enzima EcoR I dos sítios de restrição inseridos nas extremidades destas
toxinas através da técnica de PCR. Já a escolha do vetor pSynXIV VI+ X3 derivado do
baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) deveu-se ao
fato desses baculovírus possuírem seu genoma completamente seqüenciado (AYRES E
COLS., 1994), apresentarem um espectro de hospedeiros um pouco menos restrito do que
139
os demais baculovírus (sendo capazes de infectar mais de vinte e cinco espécies de insetos
– ADAMS E McCLINTOCK, 1991), apresentarem uma grande variedade de vírus parentais
disponíveis para uso e - principalmente - serem facilmente propagados em linhagens
celulares prolíficas como as derivadas das larvas S. frugiperda, Trichoplusia ni, Mamestra
brassicae e Estigmene acrea (WICKHAM E COLS., 1995).
O baixo número de clones recombinantes selecionados após a PCR de colônias
realizada com um iniciador da toxina (LiTx1 ou LiTx2) e outro do vetor (pSynXIV VI+ X3) - 1
clone pSynXIV VI+ X3/LiTx1 e 2 clones pSynXIV VI+ X3/LiTx2 - pode ter como causa uma
série de fatores, dentre os quais podemos citar: 1) a não desfosforilação do vetor pSynXIV
VI+ X3 após sua linearização, o que pode ter permitido a sua recircularização e,
conseqüentemente, evitado a ligação dos insertos das toxinas LiTx1 e LiTx2; 2) a utilização
de somente um sítio de restrição para a clonagem, o que possibilita a inserção invertida dos
insertos das toxinas LiTx1 e LiTx2 no vetor pSynXIV VI+ X3 e 3) a viabilidade das bactérias
eletrocompetentes utilizadas.
Apesar do pequeno rendimento observado, todos os clones seqüenciados mostraram
seqüências de nucleotídeos corretas e códons de iniciação e de terminação na posição
desejada, o que demonstra que a subclonagem do DNA da região madura de LiTx1 e LiTx2
no vetor pSynXIV VI+ X3 foi realizada com sucesso.
7.5
PRODUÇÃO
DE VÍRUS RECOMBINANTES
LITX1
E
LITX2
EM SISTEMA
BACULOVÍRUS
O sistema de expressão escolhido foi o sistema eucarioto baculovírus: um sistema
capaz de realizar modificações pós-traducionais e que, aumenta consideravelmente as
chances de produção de proteínas recombinantes fiéis às proteínas nativas, inclusive
quanto à sua conformação, e, portanto, provavelmente ativas.
A expressão de toxinas de artrópodes biologicamente ativas neste sistema já foi
realizada por diversos autores (HERRMANN E COLS., 1995; ZLOTKIN E COLS., 2000;
BURDEN E COLS., 2000; ELAZAR E COLS., 2001). Volynski e cols. (1999), para
exemplificar, expressaram a α-latrotoxina do veneno da viúva negra em sistema baculovírus,
sendo a proteína recombinante idêntica à nativa quanto à massa molecular, ligação a
receptores, registros eletrofisiológicos e toxicidade em camundongos.
Neste trabalho, as linhagens celulares de insetos utilizadas para a expressão ou
propagação dos vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2 foram, predominantemente, as
Sf9 de S. frugiperda e as Tn5B de T. ni. As células Sf9 são as mais utilizadas nos estudos
realizados com o sistema baculovírus (cerca de 95%) e são também facilmente manipuladas
140
em laboratório. Já as células Tn5B apresentam capacidade de expressão muitas vezes
maior do que células Sf9 (WICKHAM E COLS., 1992, 1993, 1995; SILVESTRE, 2003). Além
dessas características, ambas são linhagens recomendadas para a propagação de
baculovírus do tipo AcMNPV e dobram de população, em média, a cada 21 horas. Essas
células são também bastante versáteis, adaptando-se a vários parâmetros de crescimento
celular e apresentando níveis de expressão superiores ao de outras linhagens utilizadas
para baculovírus diversos (WICKHAM E COLS., 1995).
Várias propriedades das linhagens celulares influenciam a produção de proteínas
recombinantes: sua adaptabilidade ao meio de cultura e suplementos utilizados, seu tempo
de proliferação, sua susceptibilidade à infecção e também sua capacidade de suportar a
manipulação laboratorial (WICKHAM E COLS., 1995). Frente a estas informações, podemos
dizer que o sucesso obtido na expressão das proteínas recombinantes LiTx1 e LiTx2 no
sistema baculovírus está diretamente relacionado à escolha das linhagens celulares Sf9 e
Tn5B para a realização dos procedimentos citados.
A verificação da presença dos vírus e das toxinas recombinantes LiTx1 e LiTx2 nas
culturas celulares foi comprovada pela visualização de corpos poliédricos nas células
infectadas com os baculovírus geneticamente modificados e também pelos resultados
observados nas técnicas de PCR, RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting.
A observação das bandas de expressão das toxinas recombinantes LiTx1 e LiTx2
(7,4 e 7,9 kDa, respectivamente) deu-se em 72 hs após a infecção, o que está de acordo
com a cinética de expressão tardia característica do promotor híbrido forte PsynXIV. Como já
relatado, é neste período que as proteínas responsáveis pela oclusão das partículas virais
são geradas (BLISSARD E ROHRMANN, 1990). Vale esclarecer também, que o uso
exclusivo do precipitado celular das culturas infectadas com os vírus recombinantes
vSynLiTx1 ou vSynLiTx2 para análise da expressão das toxinas LiTx1 e LiTx2, através do
gel SDS-PAGE 15% e da técnica de Western Blotting, deve-se ao fato de nossas
construções terem sido realizadas sem a inserção do peptídeo sinal secretor das toxinas ou
do baculovírus, o que impede que as mesmas sejam enviadas para o meio de manutenção
das culturas celulares. A escolha de construções sem peptídeo sinal ocorreu para que
vislumbrássemos o nível de expressão dessas toxinas dentro das células, uma vez que
trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório e que utilizaram construções distintas e
que continham o peptídeo sinal de toxinas de aranhas ou o peptídeo sinal da proteína
gp67A do baculovírus AcMNPV mostraram um baixo nível de proteínas detectáveis nos
precipitados e também nos sobrenadantes celulares das culturas infectadas com os vírus
recombinantes (CARDOSO, 2002). Resultados semelhantes foram verificados em estudos
realizados por Eshaghi e cols. (2004), onde o uso do peptídeo sinal ou seqüência líder
reduziu o nível de expressão da proteína recombinante de interesse.
141
O reconhecimento das toxinas recombinantes LiTx1 e LiTx2 pelos anticorpos antitoxinas inseticidas, na técnica de Western Blotting, deixou claro também a capacidade
dessas células de inseto expressarem e processarem as referidas toxinas.
7.6 BIOENSAIO COM OS VÍRUS RECOMBINANTES VSYNLITX1 E VSYNLITX2
Com relação ao bioensaio realizado com os vírus recombinantes vSynLiTx1 e
vSynLiTx2, observamos que o vírus vSynLiTx1 apresentou uma ação letal baixa às larvas
quando administrado via subcuticular e ação nula quando administrado via dieta alimentar.
Neste último caso, assim como o meio de manutenção TC100 e o vírus selvagem AcMNPV utilizados como controles - o vírus vSynLiTx1 não causou a morte de nenhuma das larvas
testadas durante o tempo observado. Já o vírus vSynLiTx2 foi letal a todas as dez larvas
testadas quando administrado via injeção subcuticular e apresentou ação letal mediana
quando administrado via dieta alimentar. Desta forma, neste trabalho nós podemos
identificar o vírus vSynLiTx2 e a via de administração do tipo injeção subcuticular como
sendo mais eficazes em promover ação letal às larvas de S. frugiperda. No entanto, vale
destacar que a ação letal deste vírus, mesmo sendo administrado via injeção subcuticular,
apresentou-se num tempo demasiadamente longo, matando as larvas num tempo mínimo
de 4 dias e máximo de 6 dias. O que, de qualquer maneira, ainda supera a ação letal do
vírus selvagem AcMNPV, que - nestas mesmas condições - só foi capaz de matar 3 larvas
no 7° dia após a injeção.
Estes resultados são semelhantes aos obtidos por Silvestre (2003) para o vírus
recombinante vSynLiTx3 e indicam uma maior eficiência inseticida dos baculovírus
recombinantes quando comparados ao vírus selvagem. Resultados similares também foram
apresentados por Szolajska e cols. (2004) que observaram uma redução no tempo médio de
sobrevida de larvas S. frugiperda infectadas por baculovírus recombinantes (que produziam
uma neurotoxina de formiga) em 25 horas quando comparado com vírus não modificados.
De acordo com os mesmos autores, este ganho de tempo é considerável se lembrarmos
que o período de alimentação das larvas S. frugiperda estende-se por mais de 10 dias; o
que - na infecção com o baculovírus selvagem - é diminuído para 7 dias e com o baculovírus
recombinante, para 5 a 6 dias.
Ao nosso ver, no entanto, a eficácia inseticida relativamente baixa aqui encontrada
para os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2 pode ser explicada por uma série de
fatores. Primeiro, pelo fato de que lagartas do gênero Spodoptera, embora susceptíveis ao
baculovírus AcMNPV, sejam 1000 vezes mais resistentes à esta infecção quando
comparadas à lagartas da espécie T.ni, por exemplo. De acordo com Clem E Clarke (2002),
lagartas Spodoptera após cinco dias de infecção com o vírus AcMNPV - período médio de
142
morte por infecção com baculovírus selvagens - apresentam somente 50% de hemócitos
infectados, o que corrobora a menor susceptibilidade deste gênero à infecção por vírus do
tipo AcMNPV. Prikhod´ko e cols. (1998), de forma semelhante, também mostraram que a
eficiência inseticida dos baculovírus é hospedeiro-dependente. Em seu trabalho, lagartas S.
frugiperda foram mais susceptíveis a um dos baculovírus recombinante por eles construídos
(contendo a toxina inseticida µ-Aga-IV da aranha Agelenopsis aperta) do que lagartas T. ni.
Segundo, pelo fato de que, como acontece com muitos patógenos de insetos, muitos
hospedeiros dos baculovírus desenvolvem a chamada imunidade de maturação aos
MNPVs, o que significa que a concentração letal média de NPVs por S. frugiperda aumenta
de acordo com a idade da larvas. Enquanto para larvas do 1° instar essa concentração é de
1 a 16 corpos de oclusão, para larvas do 4° instar é de 20000 (FUXA, 2004). Uma vez que
as larvas utilizadas em nossos bioensaios pertenciam ao 3° e 4° instar, este fenômeno
também deve ser considerado. E finalmente, por existirem ainda, relatos de que muitas
vezes os vírus deixam gradativamente de ser infectivos ao seu hospedeiro após passagens
consecutivas por culturas celulares (CORY & BISHOP, 1995). Este, teoricamente, não seria
o caso dos vírus vSynLiTx1 e vSynLiTx2, uma vez que foram pouco manipulados. No
entanto, é importante estar atento a esta questão ao se iniciar um programa de amplificação
destes vírus in vivo, e de injeção direta em larvas.
Devido a dificuldades diversas com relação à obtenção de diferentes espécies de
larvas em diferentes estágios de maturidade, disponibilidade de espaço físico e adequação
de condições ambientais controladas, a realização de novos bioensaios não foi possível.
Desta maneira, experimentos futuros que utilizem espécies de lagartas e estágios de
desenvolvimento mais susceptíveis poderão gerar resultados mais informativos sobre a
eficácia inseticida dos vírus recombinantes aqui produzidos.
7.7
IDENTIFICAÇÃO
DE NOVAS TOXINAS INSETICIDAS DO VENENO DE
L.
intermedia
Como comentado nos itens 5.8 e 6.7 desta tese, perante os resultados acima
discutidos para os vírus recombinantes vSynLiTx1 e vSynLiTx2, a caracterização e
identificação de novas toxinas inseticidas no veneno de L. intermedia foi realizada dentro do
grupo das frações 35 a 40 previamente obtidas por nosso grupo e caracterizadas como
possuidoras de atividade dermonecrótica e também de ação inseticida (CASTRO, 2003).
Inicialmente, a fim de verificar se o grupo das frações 35 a 40 de L. intermedia
poderia induzir hemólise complemento-dependente, cada uma delas foi incubada com
eritrócitos humanos (VIDE ITEM 5.8.1). A atividade hemolítica das frações 35 a 38 foi
143
evidente e seu forte efeito nos eritrócitos utilizados é compatível com aquele encontrado
para proteínas de ação dermonecrótica pertencentes ao veneno de L. intermedia
(TAMBOURGI E COLS., 1995; 1998b; 2000). Este resultado reforça a caracterização destas
frações como frações dermonecróticas e sugere que mais de um componente do veneno
esteja envolvido aos danos causados aos eritrócitos, como também observado por Cunha e
cols. (2003) e Guilherme e cols. (2001).
Outro procedimento realizado a fim de melhor caracterizarmos as frações 35 a 40
obtidas por fracionamento do veneno de L. intermedia foi a eletroforese. Esse ensaio tem
por objetivo determinar o peso molecular aparente das proteínas contidas em uma mistura
e/ou o grau de pureza das frações. Em todas as frações testadas, verificamos bandas de,
aproximadamente, 31 a 35 kDa na eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. Esse valor
corresponde ao peso esperado para toxinas da família dermonecrótica das aranhas do
gênero Loxosceles (BARBARO E COLS., 1992, 1994, 1996a e b; FEITOSA E COLS., 1998;
TAMBOURGI E COLS., 1998a e b; GUILHERME E COLS., 2001; KALAPOTHAKIS E
COLS., 2002), o que sustenta o resultado acima apresentado. Vale destacar ainda que os
componentes dermonecróticos dos venenos de diferentes aranhas Loxosceles são distintos,
embora homólogos, o que caracteriza as chamadas isoformas (CUNHA E COLS., 2003). De
acordo com Machado e cols. (2005) cerca de onze possíveis isoformas de loxnecroginas
(proteínas dermonecróticas da aranha L. gaucho) de, aproximadamente, 30-32 kDa foram
detectadas por espectrometria de massa. Tal número de isoformas para uma única atividade
tóxica pode ser devido a uma adaptação evolutiva para que as aranhas obtenham o máximo
sucesso tanto em matar suas presas quanto em defender-se de predadores (MACHADO E
COLS., 2005).
Em nosso trabalho, outras bandas, de peso molecular aparente entre 10 e 50 kDa,
foram também observadas no gel de poliacrilamida, o que indica que nenhuma das frações
35 a 40 estava pura.
No método de Western Blotting, novamente bandas de, aproximadamente, 31 a 35
kDa foram fortemente detectadas por reatividade com anticorpos anti-toxina-dermonecrótica
conjugados à peroxidase (F I G .57), o que sugere - mais uma vez - a presença de diferentes
proteínas dermonecróticas nestas frações. Outras bandas, desta vez, de peso molecular
aparente entre 7.6 e 132 kDa também foram observadas nas mesmas frações devido à
reações cruzadas. De acordo com Barbaro e cols. (1994, 2005), as toxinas de 32-35 kDa
são os componentes mais imunogênicos dos venenos das aranhas Loxosceles e,
conseqüentemente, os que apresentam maior reatividade cruzada, o que justifica o fato
relatado.
As frações 39 e 40, que não apresentaram atividade hemolítica significativa, foram
também reconhecidas no Western. Uma possibilidade a ser sugerida é a de que estas
144
frações contenham isoformas inativas de esfingomielinases. Ramos-Cerrilo e cols. (2004),
por exemplo, mostraram que de três isoformas de L. boneti, duas apresentaram atividade
esfingomielinásica e dermonecrótica e outra, apesar de bastante similar às demais, não
apresentou qualquer atividade. Pretel e cols. (2005) e Tambourgi e cols, 1998b também
identificaram esfingomielinases inativas para as aranhas L. adelaida e L. intermedia,
respectivamente. Desta maneira, esses estudos validam nossa hipótese de isoformas
inativas.
Com relação ao seqüenciamento de proteínas realizado para alguns dos peptídeos
das frações 35, 36 e 37, como esperado, identificamos toxinas dermonecróticas já descritas
na literatura: a proteína dermonecrótica LiD1 (KALAPOTHAKIS E COLS., 2002) e a
esfingomielinase SMAse P2 (TAMBOURGI E COLS., 1998b), ambas da aranha L.
intermedia. Corroborando esta descoberta, anteriormente havíamos sugerido que a
atividade inseticida do grupo das frações 35 a 40 não era decorrente da ação de proteínas
neurotóxicas, mas sim da ação de proteínas relacionadas ao efeito dermonecrótico do
veneno, uma vez que a morte rápida das larvas de S. frugiperda injetadas com essas
frações caracterizava-se pela decomposição quase imediata das mesmas (CASTRO, 2003).
Como as aranhas são organismos predadores quase que exclusivamente de insetos
(aproximadamente 37000 espécies descritas até o ano de 2000), não é de se estranhar que
os venenos de aranhas possuam enzimas relacionadas à atividade inseticida. Eskafi E
Norment (1976), entre outros estudos (NORMENT E SMITH, 1968; NORMENT E VINSON,
1969), mostraram que mudanças morfológicas como a lise de células epiteliais do intestino,
da membrana peritrófica, de células musculares, da epiderme e de proteínas de células
adiposas eram evidentes em larvas de Musca domestica e Heliothis virescens mordidas por
Loxosceles reclusa e que enzimas como proteases, lipases e esterases eram bastante
ativas nestas larvas.
Considerando-se então que as proteínas identificadas (LiD1 e SMAse P2) são
provenientes das frações que anteriormente demonstraram possuir ação inseticida cerca de
80 vezes mais eficiente que a das frações do grupo das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3
(CASTRO, 2003) e que a proteína LiD1, além disso, foi identificada e caracterizada por
nosso grupo, decidiu-se pela produção recombinante desta última através do sistema de
expressão baculovírus.
A utilização de enzimas e não somente de toxinas neurotóxicas como ferramentas no
combate a pragas vem sendo, há algum tempo, também descrita. Hammock e cols. (1990),
por exemplo, inseriram o gene da esterase do hormônio juvenil no genoma do baculovírus
Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), a fim de que as larvas
infectadas por esses vírus tivessem sua capacidade alimentar diminuída. Desse modo, a
145
utilização da proteína LiD1 na construção de bioinseticidas geneticamente modificados pode
ser bastante promissora.
7.8
SUBCLONAGEM DO DNA DA TOXINA LID1 DE L. intermedia NO VETOR
DE
TRANSFERÊNCIA
TM
PFASTBAC
1
DO
SISTEMA
DE
EXPRESSÃO

BACULOVÍRUS BAC-TO-BAC
A proteína dermonecrótica 1 de L. intermedia - a LiD1 - é expressa na glândula de
veneno desta aranha e pertence à família das proteínas dermonecróticas, cujos membros
são encontrados em várias aranhas do gênero Loxosceles. Esta proteína foi caracterizada
por seqüenciamento de DNA (KALAPOTHAKIS E COLS., 2002) a partir de uma biblioteca
de cDNA da glândula de veneno de L. intermedia. A seqüência de aminoácidos deduzida a
partir do clone então obtido revelou uma proteína madura de aproximadamente 31 kDa e
com um pI de 7.37. O seqüenciamento completo do cDNA também revelou a existência de
uma região codificadora para um peptídeo sinal, um pró-peptídeo e também uma região 3’
não traduzida de 218 nucleotídeos. A proteína LiD1, além disso, foi expressa em fusão com
a proteína beta-galactosidase em sistema bacteriano, o que resultou na proteína
recombinante recLiD1. Esta proteína recombinante apresentou propriedades imunológicas
importantes, sendo fortemente reconhecida por anticorpos anti-toxinas dermonecróticas e
sendo também capaz de gerar anticorpos reativos contra proteínas dermonecróticas nativas
isoladas do veneno de L. intermedia.
Como a principal ação do veneno das aranhas Loxosceles é a formação de uma
lesão dermonecrótica em suas vítimas (BARBARO, 1996a) e como grande parte dos seus
componentes são justamente as esfingomielinases com atividade dermonecrótica
(BARBARO E COLS., 2005; ARAÚJO E COLS., 2003; FEITOSA E COLS., 1998;
KALAPOTHAKIS E COLS., 2002; PEDROSA E COLS., 2002; SILVEIRA E COLS., 2002;
TAMBOURGI E COLS., 1995, 1998a e b, 2000, 2002; VEIGA E COLS., 1999, 2000),
julgamos que para a expressão da proteína dermonecrótica LiD1 em células de inseto, tais
culturas deveriam mostrar-se - primeiramente - resistentes ao veneno bruto de L. intermedia.
Nos ensaios realizados com este veneno nas linhagens celulares Tn5B e Sf9 nenhuma
modificação significativa na morfologia e crescimento dessas células foi observada.
Domingos e cols. (2003), de maneira semelhante, observaram que o veneno de L. gaucho,
apesar de induzir modificações morfológicas significativas em macrófagos de ratos em
cultura, não alterou a proliferação ou taxa metabólica das células Tn5B e Sf9. Somando-se a
este relato, Veiga e cols. (2001) também apresentaram resultados similares utilizando, no
entanto, veneno de L. intermedia em células endoteliais de coelho.
146
Verificada a resistência das células Tn5B e Sf9 ao veneno de L. intermedia, partiu-se
então para a subclonagem da proteína LiD1 no vetor de transferência pFastBacTM 1.
Novamente em nossa metodologia (do mesmo modo como realizado para as toxinas LiTx1 e
LiTx2), a passagem inicial da toxina LiD1 pelo vetor pGEM  -T Easy teve como único
objetivo o aumento da eficiência da digestão pela enzima BamH I dos sítios de restrição
inseridos nas extremidades desta toxina através da técnica de PCR. Já a troca do vetor
pSynXIV VI+ X3 pelo vetor pFastBacTM 1, do sistema de expressão Bac-to-Bac, deveu-se ao
fato desse novo sistema possuir algumas vantagens em relação ao sistema utilizado para as
toxinas LiTx1 e LiTx2, o que será discutido no próximo item desta tese. Neste ponto, é
importante destacar que o vetor pFastBacTM 1 também é derivado do baculovírus AcMNPV,
o que faz com que este apresente as mesmas vantagens já citadas para o vetor pSynXIV
VI+ X3 (VIDE ITEM 7.4).
O baixo número de clones recombinantes selecionados após a PCR realizada com
um iniciador da toxina (LiD1) e outro do vetor (pFastBacpol) - somente 2 clones - pode ter
como causa os mesmos fatores discutidos para os clones obtidos na subclonagem das
toxinas LiTx1 e LiTx2 no vetor pSynXIV VI+ X3 (VIDE ITEM 7.4). Mais uma vez, no entanto,
apesar do pequeno rendimento observado, os clones seqüenciados mostraram seqüências
de nucleotídeos corretas e códons de iniciação e de terminação na posição desejada, o que
demonstra que a subclonagem do DNA da região madura de LiD1 no vetor pFastBacTM 1 foi
realizada com sucesso.
7.9
PRODUÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTES LID1 EM SISTEMA BACULOVÍRUS
O sistema Bac-to-Bac utiliza transposição sítio específica em bactérias E. coli (VIDE
ITEM
5.9.10) e permite, assim, a rápida geração de baculovírus recombinantes. Com este
sistema é possível isolar os DNAs bacmídeos recombinantes de colônias selecionadas
DH10BacTM do DNA viral não-recombinante parental (como o DNA vSynVI- gal), o que
elimina a necessidade de múltiplas rodadas de purificação pela técnica de diluição seriada
dos clones recombinantes. Além disso, este sistema produz altos títulos virais já na
transfecção inicial e as células transfectadas podem ser rapidamente analisadas quanto à
expressão da proteína recombinante. Estas propriedades reduzem o tempo de identificação
e de purificação dos vírus recombinantes de 4 a 6 semanas (período médio da metodologia
convencional) para 7 a 10 dias (ANDERSON E COLS., 1995). Em nosso laboratório,
adicionalmente, a expressão da toxina Tx3-6 da aranha Phoneutria nigriventer, ativa em
canais de cálcio, foi realizada com sucesso no mesmo sistema (CARDOSO, 2002). Desta
forma, todos estes aspectos motivaram nossa opção pela utilização do sistema Bac-to-Bac
para expressão da proteína LiD1 no presente trabalho.
147
Novamente, as linhagens celulares de inseto utilizadas para a análise do vírus
recombinante foram as Sf9 e as Tn5B (VIDE ITEM 7.5). Aqui, vale ressaltar a importância da
manutenção das condições ótimas de temperatura, pH e osmolaridade dessas culturas
celulares. De acordo com De Andrade e cols. (2005), por exemplo - que realizaram um
estudo com o objetivo de analisar a relação estrutura-função das esfingomielinases - as
estruturas secundárias destas proteínas são afetadas pela acidificação ou alcalinização do
meio de cultivo, não preservando sua estrutura em pH altamente ácido ou alcalino. Essas
mudanças conformacionais são irreversíveis. Os mesmos autores, além disso, mostraram
que altas temperaturas também promovem o desenovelamento dessas proteínas (80°C), o
que - conseqüentemente - altera sua atividade tanto dermonecrótica quanto hemolítica.
A verificação da presença dos vírus e da toxina recombinante LiD1 nas culturas
celulares foi comprovada pelos resultados observados nas técnicas de PCR, SDS-PAGE e
Western Blotting.
A observação da banda de expressão da toxina recombinante LiD1, de
aproximadamente 31 kDa, deu-se após 72 hs de infecção das culturas celulares, o que está
de acordo com a cinética de expressão tardia de proteínas que se encontram sob o controle
do promotor da poliedrina do vírus AcMNPV presente no vetor pFastBacTM 1 (O’REILLY E
COLS., 1992). Mais uma vez, verificou-se a presença da banda de expressão
exclusivamente no precipitado celular da cultura infectada com o vírus recombinante. Isto,
devido ao fato de que nossa construção não foi realizada com nenhum peptídeo sinal
secretor. Os motivos para a ausência deste peptídeo sinal em nossas construções já foram
discutidos. No entanto, um outro problema relacionado à utilização de peptídeos sinais
secretores - ainda não comentado - refere-se à questão das proteases inerentes ao sistema
de expressão baculovírus (IKONOMOU E COLS., 2003). Essas proteases podem ser
produzidas pelas células de inseto após a infecção por baculovírus - como uma resposta
ao estresse sofrido, podem ser geradas a partir do próprio DNA viral durante o ciclo de
infecção ou podem também ser liberadas após lise celular. No caso da produção de
proteínas não secretadas, como foi feito para as toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1, estaríamos
protegendo-as parcialmente desta questão. O problema da proteólise pode ser exacerbado
em meios de manutenção livres de soro, como o Sf900II utilizado para a linhagem Sf9. De
acordo com Ikonomou e cols. (2002), proteases são continuamente secretadas para estes
meios de manutenção durante o crescimento das células de inseto. Estratégias para
contornar este problema incluem uma grande preocupação com as condições de
manutenção e armazenamento das culturas celulares: nível de oxigênio dissolvido (CRUZ E
COLS., 1999), pH (IKONOMOU E COLS., 2002; GOTOH E COLS., 2001a), etc. Outra
prática, comumente realizada, é a adição de inibidores de protease (EDTA, PMSF, etc) nos
sobrenadantes das culturas celulares infectadas com baculovírus (GOTOH E COLS., 2001a;
148
2001b; GROSCH E HASILIK, 1998). Uma vez superado o problema da proteólise, não
devemos eliminar a perspectiva de realizarmos construções que utilizem o peptídeo sinal.
Como sabemos, muitas SMases selvagens são expressas como zimogênios, ou seja, como
proteínas inativas que precisam ter seus peptídeos sinais clivados para se tornarem ativas.
Isto pode ser um mecanismo de controle temporal e circunstancial para a ativação de
atividades potencialmente tecido-destrutivas (BINFORD E COLS., 2005). O entendimento da
função do peptídeo sinal na qualidade da proteína expressa é fundamental para sua futura
produção em larga-escala.
Com relação à análise da expressão de LiD1 pela técnica de Western Blotting,
acrescentamos ainda que, apesar das reações cruzadas observadas, o reconhecimento
pelos anticorpos anti-toxina dermonecrótica da banda diferencial de 31 kDa correspondente à toxina LiD1 - foi claramente percebido no precipitado celular da cultura
infectada com o vírus recombinante. Fato que deixa claro a capacidade das células Tn5B
expressarem e processarem a referida toxina.
Finalmente, bioensaios com o baculovírus recombinante LiD1 deverão ser realizados
em larvas de S. frugiperda e em lagartas da soja, Anticarsia gemmatalis através de trabalho
em colaboração com o doutor em entomologia Flávio Moscardi do Laboratório de Patologia
de Insetos da Embrapa - Centro Nacional de Pesquisa de Soja, Londrina, Paraná. A cultura
da soja, como sabemos, tem grande importância econômica no Brasil. Nosso país é,
atualmente, o segundo maior produtor mundial, perdendo somente para os Estados Unidos
(Dados da produção mundial 2004 - FAO/FAOSTAT), o que faz com que pesquisas nesta
área sejam de grande interesse.
7.10 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A pesquisa continuada na busca e identificação de toxinas com atividade letal para
insetos-praga e também no melhoramento do sistema de expressão baculovírus justificamse pelo seu grande potencial. Nas últimas décadas, vários pesquisadores têm demonstrado
a potenciação da ação natural destes vírus através da inserção de toxinas exógenas em seu
genoma (HUGHES E COLS., 1997; GRISHIN E COLS., 1999; BURDEN E COLS., 2000;
ZLOTKIN E COLS., 2000). Diversos pedidos internacionais de patentes existem nesta área.
Para exemplificar: a patente PI9305782-2 descreve uma família de peptídeos inseticidas da
aranha Tegenaria agrestis (JOHNSON E COLS., 1998) expressa em baculovírus; a patente
CA2005658 refere-se a uma toxina inseticida do escorpião Leiurus quinquestriat us
hebraeus (EITAN E COLS., 1990), também funcionalmente expressa em sistema
baculovírus; já a patente US4879236 expedida em 1989 para Smith e Summers descreve a
149
geração de um vetor de expressão do sistema baculovírus e a metodologia de produção de
toxinas inseticidas recombinantes para o combate de pragas de importância agrícola.
No presente trabalho, três novos baculovírus recombinantes foram gerados: os
baculovírus vSynLiTx1, vSynLiTx2 e Bac-to-BacLiD1. Os baculovírus, como já comentado,
possuem uma gama de hospedeiros bastante restrita e a habilidade de penetrar nos tecidos
internos dos insetos-alvo através da alimentação (HOOVER E COLS., 1996), sendo,
portanto, considerados os vetores ideais para a administração de toxinas inseticidas em
pragas agrícolas (GERSHBURG E COLS., 1998). Acreditamos que o uso criterioso dos
baculovírus geneticamente modificados apresentar-se-á, em seu devido tempo, como uma
ferramenta de valioso auxílio para o controle de insetos-praga, possibilitando vantagens
semelhantes aos dos inseticidas químicos, mas sem - no entanto - causar danos ao meio
ambiente e aos seres humanos.
É claro que para sua aplicação comercial no campo como um produto bioinseticida
diversas questões de biosegurança devem ser primeiramente avaliadas (RIBEIRO E COLS.,
1998). Existiriam efeitos desses vírus em espécies não-alvo? Qual a possibilidade de que
ocorram eventos de recombinação genética envolvendo o gene heterólogo inserido, uma
vez que este é um importante mecanismo para aumentar a diversidade genotípica de
populações virais e que pode acontecer entre genótipos de baculovírus que infectam uma
mesma larva? (DE SOUZA E COLS., 2002) Qual a persistência desses vírus no meio
ambiente? Há transmissão vertical ou transmissão horizontal dos vírus?
Muitas destas perguntas estão sendo submetidas à pesquisa por vários grupos da
Europa, Estados Unidos e também, Brasil. Estudos com diversos baculovírus (CpGv,
LdMNPV, AcMNPV) geneticamente modificados propostos como uma alternativa biológica
para o controle de insetos-praga, como a lagarta Cydia pomonella (que ataca principalmente
maçã, pêra, marmelo e noz européia) e as lagartas Lymantria dispar e A. gemmatalis (que
atacam a soja), estão sendo testados (MILLER, 1995; HOOVER E COLS., 1996). Heinz e
cols. (1995), por exemplo, mostraram que nenhum efeito adverso foi detectado em dois
predadores generalistas da larva Heliothis virescens - inseto-alvo do baculovírus
recombinante AcMNPV que expressava a neurotoxina inseticida AaIT do escorpião A.
australis Hector - após os mesmos terem alimentado-se da larva lepdóptera previamente
infectada. O mesmo aconteceu com a abelha Apis mellifera quando injetada com
baculovírus
AcMNPV
recombinantes
ou
não.
O
comportamento,
fecundidade
e
desenvolvimento de colônias de vespas Polistes metricus alimentadas com baculovírus
recombinantes também não foram influenciados (McNITT E COLS., 1995).
Ainda quanto à possibilidade de efeitos em espécies não-alvo, de modo geral, é bem
estabelecido que os baculovírus não são infectivos para vertebrados ou plantas e - mesmo
entre os insetos - seu espectro de hospedeiros é limitado à ordem de onde foi isolado. Desta
150
maneira, as únicas espécies em risco quanto à liberação dos baculovírus recombinantes
seriam outros lepidópteros não-alvo (CORY, 2000). Os AcMNPV, especificamente, podem
infectar mais de 13 subfamílias. No entanto, apenas uma pequena porção de espécies
pertencentes a estas subfamílias são altamente susceptíveis ao AcMNPV (BISHOP E
COLS., 1995). Além disso, o espectro de hospedeiros avaliados em condições de
laboratório é comumente muito mais amplo do que o aparente espectro ecológico
encontrado em campo e, também, outros fatores como o comportamento desses
hospedeiros e a presença de outros patógenos competitivos, reduzem a probabilidade de
infecção de espécies não-alvo (CORY, 2000).
Com relação à questão da transmissão vertical, Fuxa e cols. (2002) testaram
diferentes baculovírus - recombinantes ou não - em larvas de T. ni. As larvas infectadas por
estes vírus e que sobreviveram foram mantidas até a idade adulta e, então, acasaladas,
sendo a segunda geração de insetos investigada quanto à presença de infecção viral.
Verificou-se que os baculovírus não recombinantes foram transmitidos à prole das larvas
numa taxa ≤ 15.4%. Já os baculovírus recombinantes, que expressavam a toxina acima
referida - AaIT, foram transmitidos para somente 1 dos 7258 insetos da nova geração. Deste
modo, a transmissão vertical dos vírus recombinantes é bastante improvável de ser mantida
em organismos não infectados diretamente.
Outra
característica
dos
baculovírus
recombinantes
que
os
tornam
bons
bioinseticidas é que estes vírus, ao contrário dos vírus selvagens (FUXA, 2004), não são
persistentes no ecossistema. O aumento na velocidade do tempo de morte, causado pelas
proteínas heterólogas expressas nos baculovírus modificados, limita sua tendência de
reciclagem no ambiente. Isso ocorre porque menos poliedros são produzidos quando
comparado à produção do vírus selvagem, ou seja, há uma menor progênie viral em larvas
infectadas com os vírus recombinantes do que em larvas infectadas com os vírus selvagens.
Portanto, tanto a produtividade quanto a transmissão são bastante reduzidas nos
baculovírus que expressam toxinas inseto-específicas (CORY, 2000; INCEOGLU E COLS.,
2001). Mesmo assim, para melhorar ainda mais a questão de segurança, as tecnologias
baseadas em baculovírus podem ainda contar com a deleção de fatores de infectividade, o
que bloqueia a transmissão destes vírus na natureza (GUTIERREZ E COLS., 2005).
Por fim, acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados permitirão a
expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso
possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto
aos seus mecanismos de ação, permitirá a análise do significado funcional das diferentes
composições de aminoácidos observadas e também a sua utilização como ferramentas na
pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
91
6. RESULTADOS
Parte 1
6.1
ANÁLISES
BIOINFORMÁTICAS DE TRANSCRITOS DA GLÂNDULA DE
VENENO DE Loxosceles
6.1.1
intermedia
OBTENÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
Dos 800 clones seqüenciados, somente 457 apresentaram seqüências de boa
qualidade, ou seja, maiores do que 150 nucleotídeos e com menos de 4% de ambigüidade
(N ou X), as quais foram utilizadas em nosso estudo.
6.1.2
TRATAMENTO DAS SEQÜÊNCIAS
Dos 457 clones de boa qualidade, 189 tratavam-se do vetor pBK-CMV sem inserto,
os quais foram descartados de nosso estudo.
6.1.3
AGRUPAMENTO DAS SEQÜÊNCIAS
Dos 268 clones restantes para nosso estudo, 136 (50,75%) não continham
seqüências que, quando comparadas entre si, fossem idênticas ou apresentassem regiões
similares o suficiente para que fossem reunidas em uma só, sendo chamadas de singlets.
Já os outros 132 (49,25%) clones foram reunidos em 33 diferentes agrupamentos ou
consensos.
6.1.4
ANOTAÇÃO DOS UNIQUES
Dos 169 uniques analisados, 83 (49,1%) não apresentaram similaridade significativa
com nenhum gene ou proteína depositados nos bancos de dados utilizados. Dos 86 uniques
que apresentaram similaridade, 11 (6,5%) apresentaram similaridade com proteínas de
diversos organismos, 27 (16%) apresentaram similaridade com genes/proteínas de L.
intermedia, 5 (3%) apresentaram similaridade com genes/proteínas de aranhas do gênero
92
Loxosceles, 1 (0,6%) apresentou similaridade com genes/proteínas de aranhas do grupo
Haplogynae, 11 (6,5%) apresentaram similaridade com genes/proteínas de aranhas da
subordem Araneomorphae, 7 (4,1%) apresentaram similaridade com genes/proteínas de
aracnídeos da ordem Araneae, 2 (1,2%) apresentaram similaridade com genes/proteínas de
artrópodes da classe Arachnida, 6 (3,6%) apresentaram similaridade com genes/proteínas
de organismos do filo Arthropoda, 2 (1,2%) apresentaram similaridade com genes/ proteínas
de organismos venenosos, não pertencentes ao filo Arthropoda, 13 (7,7%) apresentaram
similaridade com genes/proteínas de outros organismos quaisquer e 1 (0,6%) apresentou
similaridade com o DNA do bacteriófago lambda, o que representa uma contaminação.
Estes resultados podem ser visualizados na FIGURA 36.
FIGURA 36. Resultado obtido na análise da anotação dos uniques da glândula de
veneno de L. intermedia.
93
6.1.5
CLASSIFICAÇÃO DOS UNIQUES
Dos 85 uniques anotados no item acima (o unique que representava uma
contaminação com o DNA do bacteriófago lambda não foi incluído), 34 (40%) foram
classificados nas principais categorias dos COGs e 51 (60%) em categorias funcionais para
toxinas. Para verificarmos a divisão dos uniques em cada uma das categorias dos COGs e
das toxinas, gráficos distintos contendo o resultado destas classificações seguem abaixo
(FIGS.37 E 38):
FIGURA 37. Divisão dos 34 uniques classificados nas principais categorias dos COGs.
As principais categorias dos COGs são: processamento e armazenamento de informações,
metabolismo, processos celulares e genes pobremente caracterizados.
94
FIGURA 38. Divisão dos 51 uniques classificados em categorias funcionais para
toxinas. As categorias funcionais para toxinas são: antagonistas de canais de cálcio,
bloqueadoras de canais de sódio, desintegrinas, toxinas hemolíticas e dermonecróticas,
inibidoras de canais de potássio, inibidoras de canais de sódio de insetos, predição geral de
função e função desconhecida.
A divisão detalhada dos 34 uniques da glândula de veneno de L. intermedia
classificados nas categorias funcionais dos COGs pode ser visualizada na TABELA a seguir:
95
TABELA 6. Número e porcentagem de genes classificados em cada sub-categoria
funcional dos COGs.
N° GENES
% GENES
Tradução, estrutura ribossomal e biogênese
Transcrição
SUB-CATEGORIA FUNCIONAL DOS COGS
9
-
26,5
-
Replicação, recombinação e reparo do DNA
1
2,9
Divisão celular e particionamento cromossômico
Modificação pós-traducional, turnover de proteínas e chaperones
Biogênese do envelope celular, membrana externa
Mobilidade celular e secreção
Metabolismo e transporte de íons inorgânicos
Mecanismos de transdução de sinais
3
4
1
1
8,8
11,8
2,9
2,9
Produção e conservação de energia
Metabolismo e transporte de carboidratos
Metabolismo e transporte de aminoácidos
Metabolismo e transporte de nucleotídeos
Metabolismo de coenzimas
Metabolismo de lipídeos
Biossíntese, catabolismo e transporte de metabólitos secundários
2
1*
1*
-
5,9
2,9*
2,9*
-
Somente predição de função geral
Função desconhecida
7
3
20,6
8,8
Vale destacar que, devido à artificialidade dos grupos de classificação, o unique
similar à enzima enolase foi incluído em mais de uma categoria funcional (*), participando
das vias de metabolismo e transporte de carboidratos e também de aminoácidos. Além
disso, dois outros uniques (5,9%) similares ao fator de coagulação XII não foram incluídos
em nenhuma categoria funcional celular, pois pertenceriam à categoria de cascatas de
coagulação e complemento do sistema imune, não representada no COGs.
6.1.6
ANÁLISES
BIOLÓGICAS
DOS
UNIQUES
CLASSIFICADOS
EM
CATEGORIAS FUNCIONAIS
SUB-CATEGORIAS FUNCIONAIS DOS COGS
J - Tradução, estrutura ribossomal e biogênese.
Oito uniques
similares
a proteínas
ribossomais foram
identificados,
cinco
representando componentes da subunidade menor do ribossomo e três da subunidade
maior.
Também nesta sub-categoria, um unique similar a um fator eucariótico de
alongamento da tradução foi identificado, o EF-2. Este fator pertence à família de enzimas
envolvidas na síntese eucariótica de proteínas. Na fase de alongamento, ele atua na
96
hidrólise de GTP e, além disso, catalisa a translocação de moléculas de peptidil-tRNA do
sítio-A para o sítio-P do ribossomo.
L - Replicação, recombinação e reparo do DNA.
Nesta categoria, um unique similar às proteínas histonas 2A e1B foi identificado.
Estas proteínas, como se sabe, pertencem a uma família de proteínas carregadas
positivamente e que se ligam fortemente ao DNA, empacotando-o e organizando-o em
unidades estruturais denominadas nucleossomos.
O - Modificação pós-traducional, turnover de proteínas e chaperones.
Um unique similar a uma chaperonina foi identificado. Ele representa a subunidade
theta ou proteína 1 do complexo T eucariótico, cuja função de chaperone molecular consiste
em auxiliar o enovelamento de proteínas através da hidrólise de ATP. Esta mesma proteína
também desempenha um conhecido papel, in vitro, no enovelamento de actina e tubulina:
proteínas relacionadas ao citoesqueleto celular.
Dois outros uniques foram identificados como similares à enzima miosinase I. Aqui,
tivemos a necessidade de incluir estes uniques - de forma adaptada - à classe de turnover
de proteínas, uma vez que a miosinase I participa da degradação da proteína muscular
miosina e novamente devido à artificialidade dos grupos de classificação.
N - Mobilidade celular e secreção.
Três uniques foram identificados como similar a troponinas. Cada um deles
representando uma das três subunidades de um complexo para regular a contração
muscular induzida por cálcio: a subunidade ligante de cálcio (TnC), a inibitória (TnI) e a de
ligação a tropomiosina (TnT).
Um unique foi identificado como similar a tropomiosina. Esta proteína pertence à
família de proteínas presentes em células musculares e que participa de interações entre o
complexo troponina-actina, para regular o processo de contração muscular.
P - Metabolismo e transporte de íons inorgânicos.
Um unique foi identificado como similar à proteína transferrina, cuja função é a
ligação e o transporte de ferro, participando de seu metabolismo.
97
T - Mecanismos de transdução de sinais.
Um unique foi identificado como similar ao precursor da enzima serino protease nude
I da mosca da fruta Drosophila melanogaster. Esta proteína é um componente da via de
sinalização extracelular que estabiliza a via dorso-ventral do embrião. Ela, juntamente com
as proteínas pipe e windbeute l, ativam a cascata de proteases dentro do compartimento
extra-embrionário, o que induz a polaridade dorso-ventral do embrião de Drosophila (HONG
& HASHIMOTO, 1995).
C - Produção e conservação de energia.
Nesta sub-categoria, um unique foi identificado como similar a proteína ADP/ATP
translocase 1. Esta enzima é uma proteína integral da membrana mitocondrial, cuja função é
catalisar a troca de ADP e ATP através da membrana interna desta organela.
Outro unique foi identificado como similar à subunidade III do citocromo C oxidase.
Os carreadores de elétrons da cadeia respiratória são organizados em complexos
embebidos na membrana interna mitocondrial. O complexo IV, também conhecido como
citocromo C oxidase, é um desses complexos, sendo responsável pelo transporte de
elétrons do citocromo c para o oxigênio molecular. Sabe-se que a subunidade III deste
complexo é essencial para seu funcionamento, embora os mecanismos aí envolvidos ainda
não sejam bem compreendidos.
G e E - Metabolismo e transporte de carboidratos e de aminácidos.
Um unique foi identificado como similar a proteína enolase. Essa enzima participa
tanto da glicólise quanto da gliconeogênese, vias de metabolismo de carboidratos. Além
disso, também participa da via de biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano no
metabolismo de aminoácidos.
R - Somente predição de função geral
Foram incluídos nesta sub-categoria, todos os uniques que não puderam ser
incluídos nas demais sub-categorias funcionais dos COGs. É importante notar que, embora
neste sistema de classificação eles tenham sido incluídos na classe “Pobremente
caracterizados”, muitos possuem função bioquímica e molecular plenamente caracterizada.
Deste modo, seis uniques foram identificados como similares a proteases,
proteinases ou peptidases. Essas proteínas pertencem ao mesmo grupo de enzimas e
98
catalisam a hidrólise de ligações peptídicas covalentes. No caso das serino proteases este
mecanismo é baseado no ataque nucleofílico da ligação peptídica alvo por uma serina. Já
as metaloproteinases ou metaloendopeptidases são proteínas que contém um metal
específico (zinco, por exemplo) permanente associado a suas cadeias de aminoácidos e só
assim exercem sua função biológica.
Um outro unique foi identificado como similar a uma suposta proteína salivar do
ácaro Ixodes scapularis.
S - Função desconhecida
Por motivos óbvios, a análise biológica dos três uniques classificados nesta subcategoria não foi realizada.
CATEGORIAS FUNCIONAIS PARA TOXINAS
1 - Antagonistas de canais de cálcio.
Um unique foi identificado como similar ao precursor da conotoxina 10 do molusco
Conus capitaneus. Essa toxina pertence à família das omega-conotoxinas que atuam em
membranas pré-sinápticas, ligando-se a canais de cálcio sensíveis à voltagem e, desta
maneira, bloqueando-os (KAUFERSTEIN E COLS., 2005).
Um unique foi identificado como similar a neurotoxina PrTx18C2 da aranha brasileira
Phoneutria reidyi. Essa toxina pertence à família das omega-agatoxinas: antagonista de
canais de cálcio sensíveis à voltagem. A PrTx18C2 também causa rápida paralisia flácida
seguida de morte em, aproximadamente, 10 a 30 min, quando injetada em camundongos
(5µg/animal) (RICHARDSON E COLS., 2004).
Outro unique foi identificado como similar ao precursor da neurotoxina Tx3-1 da
aranha brasileira P. nigriventer. Essa toxina foi caracterizada como antagonista de canais de
cálcio do tipo L e também causa paralisia nos membros posteriores e diminuição gradual do
movimento e da agressividade de camundongos (5µg/animal) (CORDEIRO E COLS., 1993).
E mais um unique foi identificado como similar ao precursor da omega-agatoxina 4B
da aranha Agelenopsis aperta, uma toxina antagonista de canais de cálcio tipo P sensíveis à
voltagem que paralisa sua presa através do bloqueio pré-sináptico da transmissão
neuromuscular em insetos (ADAMS E COLS., 1993).
99
2 - Bloqueadoras de canais de sódio.
Um unique foi identificado como similar ao precursor da neurotoxina Tx2-6 da aranha
brasileira P. nigriventer. Essa toxina bloqueia canais de sódio, causa coceira, lacrimação,
hipersalivação, suor e agitação em camundongos. Tudo isso, seguido de paralisia de seus
membros tanto anteriores quanto posteriores e morte a uma dose de 0,79 mg/animal. É
também letal a larvas e adultos de mosca doméstica (CORDEIRO E COLS., 1992).
3 - Desintegrinas.
Um unique foi identificado como similar a uma desintegrina da serpente Sistrurus
miliarius barbouri, também conhecida como inibidor da ativação da agregação plaquetária.
Essa proteína inibe a interação do fibrinogênio com receptores plaquetários expressos no
complexo glicoprotéico IIb-IIIa, pois se liga a eles pela superfície das plaquetas e, assim,
impede a agregação plaquetária induzida por ADP, trombina, fator de ativação plaquetária e
colágeno (SCARBOROUGH E COLS., 1991).
4 - Hemolíticas e dermonecróticas.
Onze uniques foram identificados como similares a esfingomielinases (SMAses) ou
proteínas dermonecróticas de aranhas do gênero Loxosceles, o que inclui: dois uniques
para a proteína 3 e um para a proteína 1, ambas similares a SMAses de L. boneti (RAMOSCERRILLO E COLS., 2004), um unique para a SMAse I de L. laeta (PEDROSA E COLS.,
2002), dois uniques para a SMAse P1 e um para a SMAse P2 de L. intermedia
(TAMBOURGI E COLS., 1998b), três uniques para a proteína dermonecrótica 1 (LiD1) da
mesma aranha (KALAPOTHAKIS E COLS., 2002) e um unique para a proteína
dermonecrótica de L. similis (SILVESTRE E COLS., 2005). Estas proteínas apresentam
atividade fosfodiesterase D sobre esfingomielina, hidrolisando estas moléculas em ceramida
fosfato e colina. Além disso, as SMAses, em geral, também induzem hemólise complemento
dependente e causam dermonecrose.
5 - Inibidoras de canais de potássio.
Um unique foi identificado como similar a heteroscodratoxina 1 (HmTx1) da tarântula
Heteroscodra maculata. Essa toxina inibe canais de potássio (Kv2.1, Kv2.2, Kv4.1, Kv4.2 e
Kv4.3) e, além disso, induz convulsões, espasmos, tremores e morte em camundongos
injetados intracérebroventricularmente (ICV) (ESCOUBAS E COLS., 2002).
100
6 - Inibidoras de canais de sódio em insetos.
Um unique foi identificado como similar a toxina ACTx-Hi:OB4219 da aranha
migalomorfa Hadronyche infensa. Essa toxina pertence à família das mu-agatoxinas, inibe
canais de sódio de insetos (por similaridade) e apresenta duas formas devido à
isomerização cis-trans no resíduo Pro-30 (ROSENGREN E COLS., 2002).
Dois uniques foram identificados como similares a neurotoxina Magi 3 da aranha
migalomorfa Macrothele gigas. Essa toxina contém cinco ligações dissulfeto, inibe canais de
sódio de insetos, causa paralisia temporária em larvas de lepdópteros quando injetados com
10,3 nmol/g e não é tóxica a camundongos quando injetada intracranialmente a 20 pmol/g
(CORZO E COLS., 2003).
7 - Somente predição de função geral.
Foram incluídos nesta categoria, todos os uniques que não puderam ser incluídos
nas demais categorias funcionais para toxinas. Todas possuem ação conhecida, no entanto,
os mecanismos responsáveis por estas atividades permanecem desconhecidos.
Desta maneira, um unique foi identificado como similar ao alergeno 5 do veneno da
vespa Vespula squamosa, um antígeno que causa reação alérgica em humanos
(HOFFMAN, 1993).
Dois uniques foram identificados como similares ao precursor da huwenlectina I da
aranha migalomorfa Ornithoctonus huwena. Essa proteína pertence à família da
huwentoxina I. Além disso, é capaz de aglutinar eritrócitos humanos e de camundongos e
apresenta toxicidade bastante baixa para mamíferos e insetos (LIANG E PAN, 1995).
Outro, como similar ao precursor da huwentoxina III (HwTx-III) também da aranha O.
huwena. Esta toxina não aglutina eritrócitos, paralisa de modo reversível baratas e pode
aumentar a contração muscular produzida pela estimulação de seus nervos. Sua dose
tóxica para gafanhotos é de 192,95 ± 120,84 mg/kg (HUANG E COLS., 2003).
Um unique foi identificado como similar à LiTx1, dois à LiTx2 e dezoito à LiTx3, todas
toxinas inseticidas da aranha marrom L. intermedia, altamente letais para a lagarta-docartucho do milho S. frugiperda (CASTRO, 2003).
Um unique foi identificado como similar à neurotoxina PkTx1A da aranha P.
keyserlingi. Esta é uma neurotoxina letal que causa paralisia e morte em camundongos
dentro de 4 a 6 min após injeção intracerebroventricular em doses de 1,5 ug por
camundongo (RICHARDSON E COLS., 2004).
Um unique foi identificado como similar a plectoxina VI da aranha Plectreurys tristis.
Esta proteína é caracterizada como uma potente toxina que paralisa e/ou mata presas como
101
a larva lepdóptera H. virescens, a larva da beterraba S. exigua e a larva do tabaco M. sexta
(QUISTAD E SKINNER, 1994).
Um unique foi identificado como similar à toxina CsTx 9 da aranha Cupiennius salei.
Esta toxina causa paralisia em drosófilas e apresenta LD50 de 3,12 pmol/mg neste inseto
(SCHALLE E COLS., 2001).
8 - Função desconhecida.
Os uniques identificados como similares à proteína LIM 1 de Apis mellifera e à
estrutura semelhante a toxina AgorTx-B7b da aranha Agelena orientalis (KOZLOV E COLS.,
2004) não apresentam função descrita.
6.1.7
MODELAGEM MOLECULAR DOS UNIQUES
Vinte uniques puderam ser modelados através de homologia. Os arquivos PDB
projetados pelo programa SWISS-MODEL foram visualizados através do programa Deep
View / Swiss-Pdb Viewer (http://www.expasy.org/spdbv/). Este programa nos permitiu
apresentar os modelos tridimensionais dos uniques em questão em estruturas sólidas de fita
e bastão, com suas α-hélices coloridas em vermelho, folhas-β em azul e outras estruturas
em amarelo. Manuais e tutoriais podem ser encontrados na página de download do
programa (http://www.expasy.org/spdbv/).
Embora alguns uniques tenham apresentado similaridade < 0,001 com seqüências do
banco de dados PDB, seus modelos tridimensionais não foram gerados pelo servidor. Este
fato ocorreu devido ao não preenchimento dos seguintes critérios: 1) valor P de busca do
BLAST: < 0,00001, 2) nível global de identidade de seqüência: > 25%, 3) comprimento
mínimo do modelo projetado: 25 aa.
Deve-se ressaltar ainda que, como nossa área de concentração refere-se à biologia
molecular de toxinas de aranhas, apresentaremos aqui somente os modelos obtidos para os
uniques similares a esfingomielinases (proteína 3 de L. boneti, SMAse I de L. laeta, proteína
dermonecrótica de L. similis e LiD1, SMAse P1 e SMAse P2 de L. intermedia - FIG.39) e a
proteases (blástula protease 10 do ouriço-do-mar Paracentrotus lividus - LEPAGE E COLS.,
1992 - e um representante das zinco metaloproteinases: astacina 37 - SUZUKI E COLS.,
2004 - FIG.40), proteínas que como já vimos (item 1.4.2) são importantes componentes do
veneno das aranhas Loxosceles. Os modelos dos demais uniques (similares a ADP/ATP
translocase 1, alergeno 5 do veneno da vespa Vespula squamosa, chaperonina, citocromo,
enolase, fator de coagulação, proteína LIM 1, miosinase, proteínas ribossomais L18 e L37 e
zinco metaloproteases astacina 6 e 39) estão disponíveis caso solicitado.
102
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
FIGURA 39. Modelos tridimensionais dos uniques identificados como similares a
esfingomielinases: (A) - Proteína 3 de L. boneti, (B) - SMAse I de L. laeta, (C) - proteína
dermonecrótica de L. similis, (D) - LiD1, (E) - SMAse P1 e (F) - SMAse P2, as três
últimas de L. intermedia. Os modelos estão apresentados em estruturas sólidas de fita e
bastão com suas α-hélices coloridas em vermelho, folhas-β em azul e outras estruturas em
amarelo.
103
(A)
(B)
FIGURA 40. Modelos tridimensionais dos uniques identificados como similares a
proteases: (A) - Blástula protease 10 do ouriço-do-mar Paracentrotus lividus e (B) zinco metaloproteinase astacina 37. Os modelos estão apresentados em estruturas
sólidas de fita e bastão com suas α-hélices coloridas em vermelho, folhas-β em azul e
outras estruturas em amarelo.
A título de comparação, são apresentadas a seguir (FIG.41), as estruturas
cristalográficas obtidas por difração de raios-X das moléculas: esfingomielinase I de L. laeta
(cadeia A) (MURAKAMI E COLS., 2005) e zinco endoprotease da bactéria Streptomyces
caespitosus (cadeia A) (KURISU E COLS., 2000).
(A)
(B)
FIGURA 41. Estruturas cristalográficas obtidas por difração de raios-X: (A) Esfingomielinase I de L. laeta (cadeia A) (MURAKAMI E COLS., 2005) e (B) - zinco
endoprotease da bactéria S. caespitosus (cadeia A) (KURISU E COLS., 2000). Os
modelos estão apresentados em estruturas sólidas de fita e bastão com suas α-hélices
coloridas em vermelho, folhas-β em azul e outras estruturas em amarelo.
104
Parte 2
6.2
ATIVIDADE INSETICIDA DO VENENO BRUTO DE L. intermedia
A DL50 observada para as larvas de Agrotis ipsilon, Anticarsia gemmatalis, Diatraea
saccharalis, Spodoptera cosmioides e S. frugiperda foi de 1.80 ± 0.30 µg.g-1, 0.15 ± 0.035
µg.g-1, 1.39 ± 0.34 µg.g-1, 1.92 ± 0.71 µg.g-1 e 0.90 ± 0.11 µg.g-1, respectivamente.
6.3
ANÁLISE DE SIMILARIDADE DAS TOXINAS LITX1, LITX2 E LITX3 DE
L. intermedia
FIG. 42. Árvore de similaridade UPGMA com as toxinas LiTx1, LiTx2, LiTx3 e outras
toxinas inseticidas de aranhas com mecanismos de ação conhecidos. Os números
colocados nos nódulos da árvore representam valores de bootstrap. µ-agatoxinas
(SKINNER E COLS., 1989), ω-agatoxina (ADAMS E COLS., 1990), ω-atracotoxinas (WANG
E COLS., 1999), curtatoxinas (STAPLETON E COLS., 1990), δ-palutoxinas IT (CORZO E
COLS., 2000).
105
A árvore de similaridade obtida neste item (FIG.42) apresentou bom suporte
estatístico: bootstrap >50% em geral, o que significa que das várias combinações possíveis
para o agrupamento das seqüências analisadas, a combinação observada em cada nódulo
da árvore apresentada foi obtida em mais de 50% das 500 réplicas aleatórias realizadas
pelo software MEGA 2.1.
Para maiores detalhes sobre a interpretação da árvore obtida vide DISCUSSÃO (item
7.3).
6.4
SUBCLONAGEM
intermedia
DO
DNA
DAS TOXINAS
LITX1
E
LITX2
NO VETOR DE TRANSFERÊNCIA PSYNXIV
L.
DE
VI+ X3
DO
SISTEMA DE EXPRESSÃO BACULOVÍRUS
A amplificação do DNA da região madura de LiTx1 e de LiTx2 foi realizada com
sucesso como pode ser verificado pela presença de bandas de aproximadamente 216 e 225
pb, no gel de agarose 1%, correspondentes aos produtos resultantes das PCRs que
utilizaram os iniciadores de LiTx1 (FIG.15) e LiTx2 (FIG.16), respectivamente. Os controles
negativos, conforme a expectativa, não apresentaram tais bandas de amplificação (FIG.43).
As purificações a partir do gel de agarose dos DNAs amplificados de LiTx1 e LiTx2
também foram realizadas com sucesso, fato comprovado pela observação das mesmas
bandas, anteriormente citadas, em gel de agarose 1% no qual foram aplicados os produtos
de purificação obtidos pelo método da guanidina-HCl/sílica descrito no item 5.5.2 (FIG.43).
Após a clonagem do produto de PCR de LiTx1 no vetor de clonagem pCR2.1TOPO, bactérias E. coli TOP10F’ transformadas por eletroporação de acordo com o item
5.5.4 receberam o vetor pCR2.1-TOPO contendo o gene de resistência a canamicina, o
que permitiu que formassem colônias no meio seletivo LB-ágar/canamicina. Entre 40
colônias testadas, várias continham o inserto da região madura de LiTx1, como verificado
pela presença de fragmentos amplificados de aproximadamente 216 pb - idênticos ao
fragmento amplificado a partir do controle positivo - no gel de agarose corrido após a PCR
de colônias com os iniciadores dessa toxina. O controle negativo não apresentou um
produto de amplificação (FIG.44).
106
ERROR: undefined
STACK:
/Subrs
-dictionary/Private
(./n022004l.pfb)
/NimbusMonL-Bold
/Courier-Bold
-mark/Courier-Bold
1313830
/Courier-Bold
/Font
/Courier-Bold
151
8. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos neste trabalho permitem as seguintes conclusões:
Parte 1
1) A análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno de L. intermedia
identificou 169 uniques (136 singlets e 33 consensos).
2)
A anotação e classificação dos uniques identificados permitiram uma análise parcial
do transcriptoma da glândula de veneno da aranha L. intermedia. Verificou-se que
grande parte das seqüências ainda é desconhecida ou pobremente caracterizada e
que vários genes, participantes de vias bioquímicas eucarióticas e similares a toxinas
(cujas atividades são bastante promissoras do ponto de vista biotecnológico), estão
presentes neste importante órgão.
Parte 2
3) O veneno bruto da aranha L. intermedia apresenta atividade inseticida (DL 50)
similar à das aranhas Paracoelotes luctuosos, Agelenopsis aperta e Hololena curta
quando testado nas larvas de interesse agrícola Agrotis ipsilon, Anticarsia
gemmatalis, Diatraea saccharalis, Spodoptera cosmioides e Spodoptera frugiperda.
4) As toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 previamente identificadas por nosso
grupo sugerem possível função específica em canais de Na+, função esta,
identificada por análise em árvore de similaridade.
5) Através dos ensaios realizados (ensaio hemolítico, SDS-PAGE e Western Blotting),
nós confirmamos que as frações 35 a 40 de L. intermedia são constituídas sobretudo
de proteínas dermonecróticas.
6) Duas toxinas já descritas na literatura, as toxinas LiD1 e SMAse P2, foram
identificadas no grupo das frações 35 a 40 de L. intermedia; frações que
apresentaram, em ensaios anteriores, ação inseticida 80 vezes mais eficiente do que
a das frações do grupo das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3.
152
7) As seqüências codificantes para as toxinas maduras LiTx1, LiTx2 e LiD1 foram
subclonadas com sucesso em vetores de transferência do sistema de expressão
baculovírus, como verificado por seqüenciamento automático.
8) A produção dos vírus recombinantes das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 também foi
realizada com sucesso em sistema baculovírus, como comprovado pela observação
das células infectadas (hipertrofia celular, aumento dos vacúolos, baixa proliferação
celular e formação de corpos poliédricos quando for o caso) e pela técnica de PCR.
9) As expressões das toxinas maduras de LiTx1, LiTx2 e LiD1 em células de inseto,
através de DNAs virais do sistema baculovírus derivados do vírus AcMNPV foram
realizadas com sucesso. Estas expressões foram verificadas através das técnicas de
RT-PCR (somente para LiTx1 e LiTx2), SDS-PAGE e Western Blotting.
10) No bioensaio realizado com larvas da lagarta-do-cartucho do milho S. frugiperda
(Lepdoptera: Noctuidae), os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 apresentaram uma
maior toxicidade inseticida quando comparados ao vírus selvagem, mostrando assim
serem mais patogênicos que os vírus selvagens.
153
9. PERSPECTIVAS
Parte 1
Com relação à análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno de L.
intermedia pretendemos, em breve, publicar os dados aqui obtidos. Muitas das seqüências
estudadas também deverão ser depositadas em bancos de dados, de modo a se tornarem
disponíveis à comunidade científica. A identificação de seqüências similares a toxinas
inseticidas de diversas aranhas e com variados mecanismos de ação gera, sem sombra de
dúvidas, novos alvos para o desenvolvimento de baculovírus recombinantes - objetivo
principal deste trabalho.
Parte 2
A perspectiva mais imediata desta parte do trabalho é a realização de bioensaios
com os vírus recombinantes vSynLiTx1, vSynLiTx2 e Bac-to-BacLiD1 em larvas de
diferentes insetos-praga para a avaliação da patogenicidade desses vírus geneticamente
modificados (diminuição do tempo de vida e/ou da capacidade alimentar da lagarta). Esta
etapa do projeto será realizada, como já comentado, em colaboração com o Dr. Flávio
Moscardi da Embrapa de Londrina (PR) e utilizará a - já preliminarmente avaliada - lagartado-cartucho do milho Spodoptera frugiperda, a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis, entre
outras.
Outra perspectiva refere-se à expressão em grande escala dessas toxinas
recombinantes da aranha Loxosceles intermedia no sistema baculovírus. A obtenção das
toxinas através da expressão em culturas de células de inseto possibilitará a utilização de
tais toxinas inseticidas como ferramentas farmacológicas para estudos básicos sobre seus
mecanismos de ação através de estudos eletrofisiológicos, o que ajudará a melhor definir o
significado funcional de cada uma delas. Estudos sobre a estrutura destas toxinas
recombinantes também poderão ser realizados, o que será um passo importante para a
melhor caracterização dessas novas toxinas inseticidas de possível aplicação na agricultura.
154
10. ANEXOS
ANEXO A. Código de abreviatura dos vinte aminoácidos das proteínas.
ABREVIATURA DE TRÊS
ABREVIATURA DE UMA
LETRAS
LETRA
Ácido aspártico
Asp
D
Àcido glutâmico
Glu
E
Alanina
Ala
A
Arginina
Arg
R
Asparagina
Asn
N
Cisteína
Cis
C
Fenilalanina
Fen
F
Glicina
Gli
G
Glutamina
Gln
Q
Histidina
His
H
Isoleucina
Ile
I
Leucina
Leu
L
Lisina
Lis
K
Metionina
Met
M
Prolina
Pro
P
Serina
Ser
S
Tirosina
Tir
Y
Treonina
Tre
T
Triptofano
Trp
W
Valina
Val
V
AMINOÁCIDO
155
ANEXO B. O código genético.
1ª POSIÇÃO
EXTREMIDADE 5’
U
C
A
G
2ª POSIÇÃO
3ª POSIÇÃO
U
C
A
G
EXTREMIDADE 3’
Fen
Ser
Tir
Cis
U
Fen
Ser
Tir
Cis
C
Leu
Ser
Parada
Parada
A
Leu
Ser
Parada
Trp
G
Leu
Pro
His
Arg
U
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Gln
Arg
A
Leu
Pro
Gln
Arg
G
Ile
Tre
Asn
Ser
U
Ile
Tre
Asn
Ser
C
Ile
Tre
Lis
Arg
A
Met
Tre
Lis
Arg
G
Val
Ala
Asp
Gli
U
Val
Ala
Asp
Gli
C
Val
Ala
Glu
Gli
A
Val
Ala
Glu
Gli
G
156
ANEXO
C
CROMATOGRAMA
Seqüência de nucleotídeos da região madura da toxina

AM3651

LiTx1 clonada no vetor pCR 2.1-TOPO . A região do vetor
pCR2.1-TOPO está em amarelo, a região madura da toxina
LiTx1 em verde. O sítio de restrição EcoR I está sublinhado em
azul. Circulado em vermelho, destaca-se o códon de iniciação
ATG e em verde o códon de terminação TGA.
D

AM3640

LiTx2 clonada no vetor pCR 2.1-TOPO . A região do vetor
pCR2.1-TOPO está em amarelo, a região madura da toxina
LiTx2 em verde. O sítio de restrição EcoR I está sublinhado em
azul. Circulado em vermelho, destaca-se o códon de iniciação
ATG e em verde o códon de terminação TGA.
E
AM4295
LiTx1 subclonada no vetor pSynXIV VI+ X3. A região do
vetor pSynXIV VI+ X3 está em amarelo, a região madura da
toxina LiTx1 em verde. O sítio de restrição EcoR I está
sublinhado em azul. Circulado em vermelho, destaca-se o
códon de iniciação ATG e em verde o códon de terminação
TGA.
Vale
destacar
que
a
seqüência
aparece
no
cromatograma de maneira complementar e reversa.
F
AM5154
LiTx2 subclonada no vetor pSynXIV VI+ X3. A região do
vetor pSynXIV VI+ X3 está em amarelo, a região madura da
toxina LiTx2 em verde. O sítio de restrição EcoR I está
sublinhado em azul. Circulado em vermelho, destaca-se o
códon de iniciação ATG e em verde o códon de terminação
TGA.
Vale
destacar
que
a
seqüência
aparece
no
cromatograma de maneira complementar e reversa.
G
TM
LiD1 subclonada no vetor pFastBac 1. A região do vetor
TM
pFastBac 1 está em amarelo, a região madura da toxina LiD1
em verde. O sítio de restrição BamH I está sublinhado em azul.
Circulado em vermelho, destaca-se o códon de iniciação ATG.
A03 Placa 15
031104

Loxosceles intermedia - Teses e Dissertações

Transcrição

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