MARIA FLAVIANA BEZERRA MORAIS BRAGA
Transcrição
MARIA FLAVIANA BEZERRA MORAIS BRAGA
MARIA FLAVIANA BEZERRA MORAIS BRAGA PROSPECÇÃO QUÍMICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DE Lygodium venustum SW (LYGODIACEAE) E AVALIAÇÃO DAS BIOATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTIEPIMASTIGOTA, ANTIPROMASTIGOTA, CITOTÓXICA E ANTIMICROBIANA DE EXTRATO E FRAÇÕES (in vitro). Dissertação apresentada ao programa de Pós – Graduação em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri como requisito para Defesa (Linha de pesquisa: Bioprospecção de Produtos Naturais e Microbiologia). Orientador: Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho Co-Orientador: Prof. Dr. Antonio Alamo Feitosa Saraiva CRATO – CE 2012 1 Autorizo a reprodução ou divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que seja citada a fonte. Braga, Maria Flaviana Bezerra Morais. B813p Prospecção química do extrato etanólico das folhas de Lygodium venustum SW (LYGODIACEAE) e avaliação das bioatividades antioxidante, antiepimastigota, antipromastigota, citotóxica e antimicrobiana de extrato e frações (in vitro)/ Maria Flaviana Bezerra Morais Braga. – Crato, 2012. 228p.; il. Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós – Graduação em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri - URCA. Orientador: Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho Co-Orientador:Prof. Dr. Antonio Alamo Feitosa Saraiva 1. Lygodium venustum SW, Atividade antimicrobiana - 2. Plantas medicinais. 3. Prospecção química I. Título. CDD: 615.323 Ana Paula Saraiva CRB – 3/1000 2 MARIA FLAVIANA BEZERRA MORAIS BRAGA PROSPECÇÃO QUÍMICA DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS DE Lygodium venustum SW (LYGODIACEAE) E AVALIAÇÃO DAS BIOATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTIEPIMASTIGOTA, ANTIPROMASTIGOTA, CITOTÓXICA E ANTIMICROBIANA DE EXTRATO E FRAÇÕES (in vitro). Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Stricto sensu em Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri – URCA, como requisito parcial para obtenção do titulo de Mestre em Bioprospecção Molecular. Área de concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais. Aprovada em 28 de fevereiro de 2012. BANCA EXAMINADORA CRATO – CE 2012 3 À Mariana... O amor da vida da mamãe. 4 AGRADECIMENTOS A Deus, pela existência. A meus pais Francisco Ivo Morais e Maria Socorro Bezerra Morais, a quem tanto amo, por tudo o fizeram para que eu me tornasse o que hoje sou. A meu irmão José Flávio Bezerra Morais, em quem me inspiro na tentativa de ser semelhante em sensatez, equilíbrio e positividade. Obrigada pelo carinho, apoio e ombro amigo. A meu esposo, Francisco Valdemiro Braga, “o escolhido”, pelo amor, carinho e companheirismo e ainda por nossa amada princesinha Mariana. A Maria Helena dos Santos Cordeiro (“mãe Nena”), a “mãe executiva” da Mariana, pelo apoio, dedicação, zelo, honestidade e, sobretudo, pelo auxílio na educação da nossa pequena. Pela presença constante, de inestimável valor. Ao meu Orientador Professor Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho, pelos ensinamentos, oportunidades, apoio, parceria, amizade e paciência. Minha vida acadêmica com certeza deverá ser registrada em dois períodos: antes de HDM Coutinho e depois de HDM Coutinho. Ao meu Co-Orientador Professor Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva, pelo auxílio na coleta e identificação da planta e pela disponibilização de informações na área de pteridologia. Muito grata pelo acolhimento e incentivo durante a realização desta etapa de vida. À Coordenação do Curso de Pós-Graduação, em reconhecimento por sua luta pela valorização e melhoria das condições de funcionamento do mestrado, nas pessoas do Coordenador o Prof. Dr. Waltécio de Oliveira Almeida e Vice-Coordenador, o Prof. Dr. Allysson Pontes Pinheiro. Ao Professor Dr. Irwin Rose Alencar Menezes, pelas contribuições com as análises estatísticas, entre outras, e pela disponibilidade e constante apoio moral. 5 Ao Professor Dr. José Galberto Martins da Costa e a equipe do LPPN pelo auxílio nas etapas iniciais da nossa pesquisa e, neste contexto, pela receptividade e zelo com o desenvolvimento dos trabalhos. À Dra. Maria Celeste Vega Gómez e equipe do CEDIC - Centro para el Desarrollo de la Investigacion Científica da Universidad de Asuncion - Paraguai, pela parceria e contribuição científica. A todos os meus professores das disciplinas do mestrado, Henrique Douglas Melo Coutinho Imeuda Peixoto Furtado, Irwin Rose Alencar Menezes, José Galberto Martins da Costa, Marta Maria de Almeida Souza e Marta Regina Kerntopf Mendonça pela riqueza de seus ensinamentos. A Rogério de Aquino Saraiva e demais membros pesquisadores dos laboratórios de pesquisa científica da Universidade Federal de Santa Maria, pela parceria na realização dos trabalhos. Aos queridos amigos e colegas de mestrado Carlito Santos, Helenicy Veras, Heloísa Souza, Jacqueline Andrade, Katiúcia Santos, Mariana Araruna, Morgana Delfino, Norma Fernandes, Samara Brito, Renata Souza, Teógenes Souza e Tiago Leite pelo companheirismo, aprendizado coletivo, carinho e partilha. Vocês são presentes valiosos que o mestrado me trouxe. Aos amigos do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Audilene Freitas, Cislânia Araújo, Elba Souza, Glaucia Guedes, Katiúcia Santos, Nadghia Leite, Natália Leite, Teógenes Souza e Saulo Tintino pela partilha de conhecimentos e experiências e pelo carinho recebido. Às secretárias do Programa de Pós-Graduação, Maria Andecieli Rolim de Brito e Maria Lenira Pereira, pelos todos os serviços prestados, receptividade e manifestações de apoio durante o período de realização do curso. Às agências brasileiras fomentadoras de pesquisa FUNCAP e CNPQ pelo auxilio financeiro para o desenvolvimento das pesquisas. 6 A URCA pela oportunidade de crescimento e por ceder o espaço para a realização deste trabalho. A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. 7 “Piensas en grande y tus hechos crecerán, piensa em pequeño y quedarás atrás” Christian Barnard (1922-2001) 8 RESUMO A pesquisa com produtos naturais, muito intensificada na atualidade, tem apontado novos caminhos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. Neste contexto, a biodiversidade mundial tem contribuído como fonte inestimável de matéria prima para a composição de fármacos, numa corrida frenética pelo combate à resistência de microrganismos e pela cura de diversas enfermidades. Populações mundiais padecem de males como leishmaniose, doença de Chagas, infecções bacterianas e fúngicas, além das doenças degenerativas causadas por danos oxidativos que surgem numa incidência assustadora. Plantas medicinais têm se destacado ao longo dos anos por suas propriedades terapêuticas e a ciência busca a comprovação de sua eficácia, numa triagem intensiva de compostos para uma dada atividade. Lygodium venustum SW é uma samambaia cosmopolita de hábito lianescente que tem sido utilizada na terapêutica popular contra distúrbios gastrointestinais, infecções, dermatoses e doenças parasitárias como a trichomoníase, entre outras. Neste estudo foram avaliadas suas bioatividades antioxidante, antibacterianas, antifúngicas e moduladora de drogas, assim como a atividade antiparasitária contra Trypanonoma cruzi (epimastigota) e Leishmania brasiliensis (promastigota). Sua citotoxidade também foi verificada contra células de mamíferos. Todos os ensaios foram realizados in vitro e para isto foi preparado o extrato etanólico, obtendo-se as frações hexânica, diclometano, acetato de etila e metanólica. Os constituintes químicos foram investigados qualitativamente quanto à presença de classes de metabólitos secundários no extrato bruto, tendo sido detectada as presenças de fenóis, taninos, flavonóides e alcalóides. Os testes antibacterianos e antifúngicos foram feitos em microdiluição em caldo e as amostras foram testadas em concentrações variando de 1024-8 µg/mL. Foram utilizadas as linhagens padrões fúngicas de Candida albicans, Candida krusei e Candida tropicalis e as bacterianas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphyloccocus aureus e Pseudomonas aeruginosa. A Concentração Inibitória Mínima de todos os microrganismos foi ≥1024 µg/mL, não tendo sido demonstrada atividade clinicamente relevante. A atividade moduladora da ação de drogas foi realizada em associação com aminoglicosídeos e antifúngicos tomando-se uma concentração subinibitória (MIC/8) dos produtos contra as linhagens fúngicas padrões e as multiresistentes S. aureus 358, P. aeruginosa 03 e E. coli 27. Extrato e frações não modularam a ação dos antifúngicos, entretanto potencializaram o efeito dos aminoglicosídeos contra E. coli e S. aureus. A fração acetato de etila potencializou todos os aminoglicosídeos. Determinou-se o tipo de interação entre produto natural/droga pelo método checkerboard onde se observou sinergismo e aditividade. A investigação das atividades tripanocida e leishmanicida foi realizada em triplicata em diferentes concentrações, baseando-se na citotoxicidade das amostras, que apresentaram toxicidade geralmente variando de elevada a moderada em concentrações acima de 100 µg/mL. Os melhores resultados foram verificados contra T. cruzi com percentuais (AE%) de 63%, nas concentrações de 1000 µg/mL e 500 µg/mL (frações hexânica e metanólica respectivamente), e contra L. brasiliensis com 68% de atividade (fração metanólica). A avaliação da atividade antioxidante foi realizada pelo método fotocolorimétrico do 2,2-difenil,1-picrilhidrazila (DPPH), onde extrato e frações foram testados em concentrações de 1 a 500 µg/mL e as leituras das absorbâncias foram feitas em espectofotômetro a 518 nm. Os resultados mostraram uma CE50 do extrato em 67,58 µg/mL e entre as frações, o melhor resultado foi exibido pela fração acetato de etila, com CE 50 na concentração de 82,70 µg/mL. Palavras-chave: Lygodium venustum. Atividade antimicrobiana. Atividade antiparasitária. Prospecção química. Citotoxicidade. Atividade Antioxidante 9 ABSTRACT The research on natural products, greatly enhanced today, has pointed out new ways for the development of therapeutic agents. In this context, the world's biodiversity has contributed as an invaluable source of raw materials for the composition of drugs, in a frantic race to combat the resistance of microorganisms and healing of various diseases. World population suffers from illnesses such as leishmaniasis, Chagas disease, bacterial and fungal infections, and degenerative diseases caused by oxidative damage that appear in a frightening incidence. Medicinal plants have been out standing over the years for their therapeutic properties and science seeks evidence of its effectiveness in an intensive screening of compounds for an specific activity. Lygodium venustum SW is a fern with a cosmopolitan latescence habit that has been used in popular therapy against gastrointestinal disorders, infections, skin diseases and parasitic diseases such as trichomoniasis, among others. We evaluated their antioxidant, antibacterial, antifungal and modulating drugs bioactivities as well as antiparasitic activity against Trypanonoma cruzi (epimastigote) and Leishmania brasiliensis (promastigote). Their cytotoxicity was also observed against mammalian cells. All assays were performed in vitro and to do that the ethanolic extract was prepared, resulting in the hexane fraction, diclometano, ethyl acetate and methanol. The chemical constituents were investigated qualitatively on the presence of secondary classes of metabolites in crude extract, the presence of phenols, tannins, flavonoids and alkaloids was detected. The antibacterial and antifungal tests were made in broth microdilution and the samples were tested at concentrations ranging from1024 - 8 μg/mL. We used the standard fungal strains of Candida albicans, Candida krusei and Candida tropicalis and the bacterial Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The Minimum Inhibitory Concentration of all microorganisms was ≥1024 μg/mL and it has not demonstrated clinically relevant activity. The modulating activity of the action of drugs was performed in combination with aminoglycosides and antifungal taking a subinhibitory concentration (MIC / 8) of the products against the fungal strains standards and the multiresistant S. aureus 358, P. aeruginosa 03 and E. coli 27.Extract and fractions did not modulate the action of antifungals, however potentiated the effect of aminoglycosides against E.coli and S.aureus. The ethyl acetate fraction potentiated all aminoglycosides. The type of interaction was determined between natural product/drug by the checkerboard method where synergy and additivity were observed. The investigation of trypanocidal and leishmanicidal activities were performed in triplicate at different concentrations, based on the cytotoxicity of the samples that showed toxicity usually ranging from high to moderate concentrations above 100 μg/mL. The best results were obtained against T. cruzi with percentage (AE %) of 63% at concentrations of 1000 μg/mL and 500 μg/mL (hexane and methanol fractions, respectively) and against L. brasiliensis with 68% activity (methanol fraction). The evaluation of antioxidant activity was carried out using the fotocolorimetric method 2, 2- diphenyl, 1 – picrilhidrazila (DPPH), where extract and fractions were tested at concentrations of 1 - 500 µg/ml and the absorbance readings were performed in a spectrophotometer at 518 nm. The results showed an EC50 of extract 67.58 µg/mL and between fractions the best result was shown by the ethyl acetate fraction, with the EC50 concentration of 82.70 µg/mL. Keywords: Lygodium venustum. Antimicrobial. Antiparasitic activity. Chemical prospecting. Cytotoxicity. Antioxidant activity. 10 LISTAS DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Samambaia Lygodium venustum Sw......................................................................27 Figura 2 – Diferenças estruturais entre as células bacterianas Gram positivas e Gramnegativas....................................................................................................................................34 Figura 3 – Microrganismos (bactérias): a. Staphylococcus aureus; b. Escherichia coli; c. Pseudomonas aeruginosa; d. Klebsiella pneumoniae...............................................................36 Figura 4 – Microrganismos (leveduras): a. Candida albicans; b. Candida tropicalis e c. Candida krusei..........................................................................................................................38 Figura 5 – Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi......................................................................40 Figura 6 – Distribuição de casos de infecção por Trypanosoma cruzi....................................41 Figura 7 – Ciclo de vida de Leishmania spp............................................................................42 Figura 8 – Distribuição de casos de leishmaniose cutânea......................................................43 Figura 9 – Distribuição de casos de leishmaniose visceral......................................................44 Figura 10 – Passos seguidos e todas as biatividades avaliadas durante o desenvolvimento da pesquisa..............................................................................................................................49 Figura 11 - Localização da área de coleta de Lygodium venustum..........................................50 Figura 12 – Exsicata de Lygodium venustum depositada no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL)..........................................................................................................51 Figura 13 – Identificação de compostos químicos (antocianinas, antocianidinas, flavonas, flavonois, xantonas, chalconas, auronas e flavonóis através de método colorimétrico......................................................................................................................53 Figura 14 – Identificação de leucoantocianidinas, catequinas e lavononas por método colorimétrico......................................................................................................................54 Figura 15 – Origem das linhagens e perfil de resistência das bactérias a antibióticos............55 Figura 16 – Placa de microdiluição (a) e revelação de placas com resazurina (b)..................56 Figura17-Fibroblastos de mamíferos NCTC-929 utilizados no teste de citotoxicidade............................................................................................................................59 Figura 18 – Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi......................................................59 Figura 19 – Forma promastigota de Leishmania spp...............................................................60 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS %AE - Percentual de inibição de epimastigotas %AP - Percentual de inibição de promastigotas %C – Percentual de citotoxicidade ≥ - maior ou igual que Ab - Antibiótico Abs - Absorbância AC – Grupo controle de absorbância ACB – Branco de meio de cultura AE – Absorbância do grupo experimental AEB – Branco de compostos ATCC - American Type Culture Collection ATP – Adenosina trifosfato BHI - Brain Heart Infusion (Caldo de coração e cérebro) BHT - Butil-hidroxitolueno CBM - Concentração bactericida mínima CCl4 – Tetracloreto de Carbono CE50 – Concentração efetiva CEDIC - Centro para el Desarrollo de la Investigacion Científica CIF – Concentração Inibitória Fracionada CIM – Concentração inibitória mínima CIM/8 – Concentração subinibitória CO2 – Gás carbônico COX – Ciclo-oxigenase CPRG – Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosídeo DAD - Diode-Array Detection DMSO – Dimetilsulfóxido DNA - deoxyribonucleic acid ou ADN: ácido desoxirribonucléico DP – Desvio padrão DPPH – 2,2-difenil,1- picrihidrazila DSM – Diferença Significativa Mínima EELV – Extrato etanólico de Lygodium vensutum EEPC – Extrato etanólico de Pityrogramma calomelanos 12 EROs – Espécies Reativas de Oxigênio et al – e outros; e colaboradores (latim) FAELV – Fração Acetato de Etila de Lygodium vensutum FAEPC – Fração acetato de etila de Pityrogramma calomelanos FBS – Fetal bovine serum (soro fetal bovino) FCPC – Fração clorofórmica de Pityrogramma calomelanos FDLV – Fração Diclorometano de Lygodium vensutum FeCl3 – Percloreto de ferro FHLV – Fração Hexânica de Lygodium vensutum FHPC – Fração hexânica de Pityrogramma calomelanos FMLV – Fração Metanólica de Lygodium vensutum FMPC – Fração metanólica de Pityrogramma calomelanos FRP – Ferric reducing Power g - grama(s) h - hora(s) HCDAL – Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima HCl – Ácido clorídrico HIA – Heart infusion Agar HIV – Human immunodeficiency vírus ou HIV: virus da imunodeficiência humana HPLC - High performance liquid chromatography IC50 - Half maximal inhibitory concentration (metade da concentração maxima inibitória) LIT - Liver infusion tryptose (infusão de fígado triptose) LMBM – Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular Min – Minuto (s) mM - milimol mm/Hg – milímetros de mercúrio MS – Ministério da Saúde MTC - Medicina Tradicional Chinesa MTCC - Culture Collection Microbial Tipo NaOH – Hidóxido de sódio NCCLS – National Comitee for Clinical Laboratory Standards NH4OH – Hidróxido de amônia nm - namômetro (s) NO – Óxido nítrico 13 ºC - graus Celsius OMS – Organização Mundial de saúde pH - Potencial hidrogeniônico PIV 3 – Parainflueza vírus 3 PTR1 - Pteridina-redutase 1 QR 2 – Redutase quinona 2 RMN – Ressonância magnética nuclear RNA - Ribonucleic acid ou ARN: ácido ribonucléico RPMI - Roswell Park Memorial Institute RSV – Vírus sincicial respiratório SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida ou AIDS: Acquired immune deficiency syndrome TR – Tempo de retensão TR – Transcriptase reversa U/mL – Unidade por mililitro UFC: Unidade formadora de colônia UFPB – Universidade Federal da Paraíba URCA – Universidade Regional do Cariri UV - Ultravioleta μg/mL - microgramas de soluto por mililitro de solvente μL - microlitro(s) μM - micromol 14 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................18 2. OBJETIVOS.........................................................................................................................22 2.1. OBJETIVO GERAL .........................................................................................................22 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................22 3. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................24 3.1 ESPÉCIE BOTÂNICA EM ESTUDO...............................................................................24 3.1.1 Posição taxonômica da planta.......................................................................................24 3.1.2 Sinonímia.....................................................................................................................24 3.1.3 Caracterização botânica.............................................................................................24 3.1.3.1 A ordem Schizaeles.......................................................................................................25 3.1.3.2 A família Lygodiaceae M. Roe.....................................................................................26 3.1.3.4 O gênero Lygodium SW................................................................................................26 3.1.3.4 A espécie Lygodium vensutum SW...............................................................................27 3.1.4 Importância etnobotânica e farmacológica de L. venustum.......................................28 3.2 PESQUISAS ENVOLVENDO O GÊNERO Lygodium................................................29 3.3 PRODUTOS NATURAIS E USO TERAPÊUTICO.....................................................30 3.4 MICRORGANISMOS EM ESTUDO E IMPLICAÇÕES CLÍNICAS.........................32 3.4.1 Bactérias..........................................................................................................................32 3.4.1.1 Staphylococcus aureus..................................................................................................33 3.4.1.2 Escherichia coli.............................................................................................................34 3.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa.............................................................................................35 3.4.1.4 Klebsiella pneumoniae..................................................................................................35 3.4.2 Fungos.............................................................................................................................36 3.4.2.1 Candida albicans..........................................................................................................37 3.4.2.2 Candida tropicalis.........................................................................................................37 3.4.2.3 Candida krusei..............................................................................................................38 3.4.3 Protozoários.................................................................................................................38 3.4.3.2 Trypanosoma cruzi........................................................................................................39 3.4.3.2 Leishmania spp.............................................................................................................41 3.5 RESISTÊNCIA DE MICRORGANISMOS.......................................................................44 3.6 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO, RADICAIS LIVRES E SUBSTÂNCIAS ANTIOXIDANTES..................................................................................................................46 15 4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................49 4.1 SELEÇÃO E COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO....................................................49 4.2 OBTENÇÕES DE EXTRATO ALCOÓLICO E FRAÇÕES.............................................50 4.3 PROSPECÇÃO DE CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO ETANÓLICO (EELV): ANÁLISE FITOQUÍMICA QUALITATIVA....................................................51 4.3.1 Preparação do extrato e operações preliminares........................................................52 4.3.2 Teste para identificação de fenóis e taninos.................................................................52 4.3.3 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides...............................................52 4.3.4 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavononas..........................................52 4.3.5 Teste para alcalóides......................................................................................................53 4.4 TESTES DE SUSCETIBILIDADE DE MICRORGANISMOS PELO MÉTODO DA MICRODILUIÇÃO EM CALDO.....................................................................................54 4.4.1 Preparo da solução inicial e das soluções de teste.......................................................54 4.4.2 Linhagens utilizadas......................................................................................................54 4.4.3 Drogas e reagentes.........................................................................................................55 4.4.4 Meios de cultura.............................................................................................................56 4.4.5 Teste Concentração Inibitória Mínima: execução e leitura.......................................56 4.4.6 Teste de modulação da ação de antibióticos e antifúngicos.......................................57 4.4.7 Teste para avaliação do tipo de interação droga/produto natural: método checkerboard...................................................................................................................57 4.5 TESTE DE CITOTOXICIDADE E ANTIPARASITÁRIOS.............................................58 4.5.1 Reagentes e drogas.........................................................................................................58 4.5.2 Cultura de células...........................................................................................................58 4.5.3 Execução e leitura do ensaio de citotoxicidade............................................................60 4.5.4 Ensaio de suscetibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi......61 4.5.5 Ensaio de suscetibilidade para as formas promastigotas de Leishmania brasiliensis.......................................................................................................................61 4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE........................................................62 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................62 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES......................................................................................64 5.1 ANTIMICROBIAL AND MODULATORY ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF THE LEAVES FROM Lygodium venustum SW…...........................................................65 16 5.2 COMBATING THE MULTIRESISTANCE TO ANTIBIOTICS WITH NATURAL PRODUCTS: ADDITIVE EFFECT OF Lygodium venustum SW. WITH GENTAMICIN………………………………………………...……………………….77 5.3 EVALUATION OF THE INTERACTION BETWEEN AMINOGLYCOSIDES AND NATURAL PRODUCTS OF Lygodium Venustum SW. AGAINST Escherichia Coli AND staphylococcus aureus CLINICALLY ISOLATED…………..............................85 5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE Lygodium venustum SW...................................................................................................................94 5.5 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA, ANTIFÚNGICA E MODULADORA DE FRAÇÕES OBTIDAS DE Lygodium venustum SW....................................................105 5.6 AVALIAÇÃO DA CITOTOCIXIDADE E ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DE Lygodium venustum SW. CONTRA Trypanosoma cruzi E Leishmania brasiliensis.....................................................................................................................117 5.7 ANTI-LEISHMANIA, ANTI- TRYPANOSOMA AND CYTOTOXIC ACTIVITIES OF NATURAL PRODUCTS FROM Lygodium venustum SW. (LYGODIACEAE)........130 5.8 PTERIDÓFITAS EM EVIDÊNCIA: ETNOBOTÂNICA E BIOATIVIDADES FARMACOLÓGICAS..................................................................................................142 6 CONCLUSÕES.................................................................................................................186 REFERÊNCIAS....................................................................................................................189 APÊNDICE A: QUADRO COM LEVANTAMENTO DE PESQUISAS ENVOLVENDO O GÊNERO Lygodium COMPREENDIDAS NO PERÍODO DE 1994 – 2011 (NOVEMBRO)..............................................................................................................199 ANEXO A: OUTRAS PRODUÇÕES CIENTÍFICAS VINCULADAS AO PROJETO.......225 ANEXO B – PRODUÇÕES CIENTÍFICAS NÃO VINCULADAS AO PROJETO............226 17 INTRODUÇÃO 18 1 INTRODUÇÃO O uso intensivo e inadequado de medicamentos tem provocado um crescente desenvolvimento de novos mecanismos de defesa nos microrganismos, acarretando um dos grandes problemas da atualidade que é a resistência microbiana a fármacos comercialmente utilizados (SEQUEIRA, 2004). Esta situação se estende a vários grupos de microrganismos, com merecido destaque para bactérias, porém incluindo também fungos e protozoários. Mesmo com a produção de novos antibióticos nas últimas três décadas, a resistência a estes medicamentos aumentou. Em geral, bactérias têm a capacidade genética de adquirir e transmitir resistência a medicamentos utilizados como agentes terapêuticos. Tal fato é motivo de preocupação por causa do número de pacientes em hospitais com imunidade suprimida expostos a novas cepas bacterianas multi-resistentes, podendo resultar em alta taxa de mortalidade (NASCIMENTO, et al., 2000). Infecções fúngicas invasivas constituem um problema significativo em pacientes imunocomprometidos. É crescente o espectro de fungos causadores de infecções. Entretanto, as opções terapêuticas disponíveis são bastante limitadas, principalmente para os patógenos resistentes a mais de uma classe de antifúngicos (KANAFANI; PERFECT, 2007). Doenças parasitárias de elevada incidência em países pobres, como leishmaniose e doença de Chagas tem sido um grande desafio, no que diz respeito à sua terapêutica, pois além de tais doenças não chamarem a atenção das indústrias farmacêuticas, as drogas atualmente existentes para seus tratamentos apresentam elevada toxicidade (WHO, 2003; MS, 2010). O aumento da expectativa de vida da população teve como consequência um crescente interesse no estudo de doenças neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, Huntington e Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA). Uma vertente destes estudos demonstra que o estresse oxidativo tem um papel importante e pode até mesmo desencadear o processo de neurodegeneração (BARBOSA et al., 2006). Substâncias antioxidantes exercem efeito protetor sobre o organismo e podem ser encontradas em vegetais. O processo de desenvolvimento de novos fármacos não tem conseguido acompanhar a rápida evolução dos microrganismos e a ciência tem reunido esforços para busca de novas substâncias que possam desarticular as defesas desenvolvidas por conta da exposição às drogas em uso. Neste contexto, produtos naturais de origem vegetal e animal, entre outros, têm sido o alvo de diversas pesquisas embasadas na existência de atividades biocidas, naturalmente desenvolvidas por seres vivos, para garantia da sobrevivência entre as espécies e 19 em variados ambientes (SIMÕES et al., 2010). A presença de compostos químicos, oriundos de uma via metabólica secundária, tem chamado a atenção para novas possibilidades de uso terapêutico, porque se criou a expectativa de que estes também se apresentam como agentes potencialmente promissores às aplicações terapêuticas diversas, entre elas a antimicrobiana e a antioxidativa. O interesse pela utilização de produtos naturais em favor do bem estar da humanidade data de tempos remotos. O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza pelos povos primitivos e pelos indígenas pode ser considerado fator fundamental para descobrimento de substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo (VIEGAS JR.; BOLZANI, 2006). Embora este conhecimento apresentado pelas populações seja processado empiricamente, ao longo dos anos vem sendo elaborados diferentes métodos para comprovação cientifica da eficácia de produtos naturais na cura de enfermidades. De maneira indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem os conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora mundial (LOPEZ, 2006). Através de pesquisas etnobiológicas, as plantas têm sido apontadas como os produtos naturais mais utilizados pelas populações em geral. Levantamentos etnobotânicos enaltecem as angiospermas como principais fitoterápicos, entre os grandes grupos vegetais. E apesar de serem bastante antigas, as pteridófitas têm tido pouco destaque no uso medicinal em diversas culturas, quando comparadas às angiospermas, entretanto, seu uso medicinal é difundido entre populações mundiais. De acordo com Singh et al. (2010), as pteridófitas, por sua utilidade medicinal e terapêutica, desde tempos passados têm sido prescritas sob a forma de extrato medicinal para a cura de várias doenças e hoje, por sua reconhecida importância, são tidas como um recurso biológico que eleva a sociedade humana. A Chapada do Araripe abriga um espaço com um bioma de características geológicas, geomorfológicas, pedológicas, climáticas, hidrográficas/hidrológicas e de vegetação bem diversificado. Faz parte dos condicionantes ecológicos de uma área com importância fundamental, tanto para a identificação dos processos evolutivos da Terra, por seus sítios paleontológicos, como para a sobrevivência das populações que dela tiram seu sustento e dos que vivem em seu entorno. As formações florestais da Chapada do Araripe podem, de maneira simplificada, ser estratificadas em mata úmida, cerradão, cerrado, carrasco e caatinga (AUGUSTO; GÓES, 2007). Este ambiente tão diversificado abriga inúmeras espécies de vegetais que apresentam além do potencial energético e madereiro, uma importância direta na 20 alimentação e na saúde das populações que lá vivem, por conta de seus frutos e outros produtos usados como fontes nutritivas e medicinais. Lygodium venustum, o objeto de estudo deste trabalho, é uma samambaia da família Lygodiaceae, comumentemente encontrada na encosta da Chapada do Araripe, mais precisamente no município do Crato, sul do Ceará, local em que foi coletada. Apresenta-se em abundância especialmente revigorada nas épocas chuvosas, enroscada na vegetação escassa das clareiras da zona de amortecimento da Floresta Nacional do Araripe-Apodi. Apesar de sua ocorrência no Cariri Cearense, não se tem dados etnobotânicos que registre o seu uso pelas populações locais. Entretanto seu uso tem sido muito difundido entre as populações Norte e Sul Americanas que lhe atribuem tanto importância econômica quanto medicinal (FUNDECI, 2002; DUKE, 2008). Estudos farmacológicos sobre a planta ainda são escassos, tendo sido investigadas apenas as atividades antibacteriana, anti-diarreica e tricomonicida. Neste trabalho, procurou-se ampliar os conhecimentos sobre a planta, investigando-se algumas de suas bioatividades farmacológicas, através de estudos pré-liminares in vitro das atividades antimicrobiana, antiparasitária e antioxidante. Neste processo, conhecer quimicamente o vegetal tornou-se algo indispensável e foi concretizado através de uma análise química qualitativa de classes de metabólitos secundários de relevância, importantes norteadores para atribuição das supostas bioatividades apresentadas pela samambaia. Outro aspecto relevante abordado foi o conhecimento do potencial citotóxico da espécie, no qual foi verificado se extrato e frações do vegetal apresentam reatividade em células de mamíferos, um passo bem pré-liminar, mas essencial na pesquisa de produtos naturais que antecede testes in vivo, que comprovam ou não a viabilidade e a segurança de seu uso na terapêutica com humanos. Estudos pteridológicos com esta abordagem não são tão comuns no contexto mundial, sendo este, pioneiro para o gênero Lygodium. Dessa forma, o estudo aqui apresentado, é a investigação mais abrangente sobre biatividades de uma pteridófita da família Lygodiaceae. As descobertas contribuirão para o conhecimento específico da espécie L. venustum e consequentemente da pteridoflora mundial, tendo em vista que os resultados obtidos servirão para o fortalecimento e complementação das informações disponibilizadas sobre este antigo e importante grupo vegetal. 21 OBJETIVOS 22 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar o perfil fitoquímico do extrato etanólico das folhas de Lygodium venustum SW, e as bioatividades antioxidante, antiepimastigota, antipromastigota, citotóxica, e antimicrobiana de extrato e frações (in vitro), verificando seu efeito modulador junto a drogas. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar o fracionamento do extrato etanólico bruto de L. venustum nas frações hexânica, acetato de etila, diclorometano e metanólica; Identificar por meio de prospecção fitoquímica preliminar das principais classes de metabólitos secundários presentes no extrato. Avaliar o potencial antimicrobiano para cepas padrões de bactérias e fungos ; Analisar o potencial modulador frente a cepas bacterianas multirresistentes e cepas fúngicas padrões, quando combinados a antibióticos aminoglicosídeos e antifúngicos. Determinar o Índice de Concentração Inibitória Fracionada (método de associação – checkerboard) dos produtos naturais com antibacterianos sintéticos. Identificar a citotoxidade in vitro frente à cultura de células de mamíferos. Avaliar a atividade tripanocida através de ensaios in vitro com a forma epimastigota de Trypanosoma cruzi. Analisar o efeito leishmanicida in vitro frente à cepa promastigota de Leishmania brasiliensis. Verificar a possibilidade de ação antioxidante. 23 REVISÃO DE LITERATURA 24 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 ESPÉCIE BOTÂNICA EM ESTUDO 3.1.1 Posição taxonômica da planta Classe: Polypodiopsida Ordem: Schizaeales Família: Lygodiaceae Gênero: Lygodium Espécie: Lygodium venustum 3.1.2 Sinonímia Lygodium commutatum C. Presl; L. mexicanum C. Presl; L. polymorphum (Cav.) Kunth. 3.1.3 Caracterização botânica As pteridófitas constituem um grupo de plantas vasculares sem flores nem sementes que se reproduzem por esporos. Seu ciclo de vida é heteromórfico com duas fases, diferenciando-se em gametofítica e esporofítica (PRYER et al., 2004). Ocupam uma grande diversidade de ambientes em variados ecossistemas, apresentando diferentes formas biológicas, incluindo quase todas as formas de crescimento e de adaptação das angiospermas (HOLTUM, 1938). Os ambientes de maior ocorrência das pteridófitas são os tropicais bastante úmidos, que não apresentam longos períodos secos durante o ano. Entretanto, podem ocorrer nos mais variados ecossistemas e microhabitats, em condições bem distintas, de ambientes árticos e alpinos das elevadas altitudes e latitudes até ambientes úmidos no interior das florestas tropicais; de condições subdesérticas até às formações costeiras pantanosas (PAGE, 1979a). Fatores físicos podem limitar ou possibilitar o desenvolvimento e o crescimento tanto do gametófito quanto do esporófito, dificultando ou facilitando a amplitude ecológica de adaptação e sobrevivência de suas espécies (PAGE, 1979b). O fato de compartilharem a alternância de gerações em seu ciclo lhe rendeu o tratamento taxonômico em uma única divisão, a “Pteridophyta”, constituída por classes 25 evolutivamente distintas, formando um táxon parafilético (STEVENSON; LOCONTE, 1996; PRYER et al., 2004; SMITH et al., 2006). Estudos envolvendo análises cladísticas com dados morfológicos, ultraestrutura de gametas e análises de seqüências de DNA, direcionaram as pteridófitas em duas linhagens monofiléticas distintas: as licófitas e as monilófitas (PRYER et al., 2004). Segundo Pryer et al. (2004), diferenciando-se da linhagem licófitas, as monilófitas possuem megafilos e uma vascularização diferenciada, onde o protoxilema apresenta-se confinado a lobos do cordão do xilema. A este grupo pertencem as classes Psilotopsida, Equisetopsida, Marattiopsida e Polypodiopsida (SMITH, 2006). De acordo com Smith (2006), a classe Polypodiopsida forma o maior grupo entre as monilófitas atuais e são comumente conhecidas como samambaias ou feto, sendo o grupo das pteridófitas leptosporangiadas, abrangendo cerca de 11.000 espécies distribuídas em 37 famílias. 3.1.3.1 A Ordem Schizaeales Pertencendo à ordem Schizaeales, descrevem-se as plantas terrestres, rupículas e raramente epífitas, com caule reptante ou ereto, que podem apresentar frondes eretas, prostradas ou escandentes e as lâminas diversificam-se entre inteiras, dicotômicas ou segmentadas. As nervuras observadas podem ser livres ou anastomosadas. Os espongióforos são dispostos em pinas basais modificadas na margem da lâmina ou do segmento (SMITH et al., 2008). A esta ordem monofilética, com registros fósseis do início do Jurássico, e amplamente distribuída nas regiões tropicais e sul temperadas (MORAN 1995a; COLLINSON, 1996), classicamente pertencia apenas uma família, Schizaeaceae, caracterizada como uma família de samambais leptosporangiadas basais, facilmente conhecida pelos esporângios sésseis e com ânulo apical e constituída por cinco gêneros, Anemia, Lygodium, Actinostachys, Mohria e Schizaea, apresentando cerca de 170 espécies (MICKEL, 1962; MORAN, 1995; SKOG et al., 2002; ARANTES et al., 2008). A partir de observação de caráter morfológico tais como hábito de crescimento e aspecto geral (MORAN, 1995) que culminara em segregações e uniões entre seus representantes, a ordem foi novamente redirecionada e dividida em três famílias distintas, Lygodiaceae (Lygodium), Anemiaceae (Anemia e Mohria) e Schizaeaceae (Actinostachys e Schizaea), que apresentam em comum as lâminas estéreis e férteis diferenciadas, a ausência 26 de soros bem definidos e o esporângio com ânulos transversais subapicais contínuos (SMITH et al., 2006). Entretanto, o tratamento taxonômico ainda difere entre os autores e há ainda os que consideram que os cinco gêneros pertencem a uma única família, Schizaeaceae, pelo fato de compartilharem relevantes características como ânulo apical do esporângio. 3.1.3.2 A família Lygodiaceae M. Roe Lygodiaceae M. Roe é tipicamente representada por plantas terrestres de hábito lianescente, com distribuição pantropical, formada por apenas um gênero Lygodium e cerca de 25 espécies (SKOG et al., 2002). As plantas possuem caule reptante delgado com tricomas e frondes escandentes com crescimento contínuo, volúvel. A lâmina apresenta-se alternadamente pinada, com pinas pseudodicotomicamente bifurcadas e uma gema dormente na axila. As nervuras podem ser livres ou anastomosadas. Os soros estão dispostos no ápice dos segmentos, com esporângios abaxiais, solitáriso, sendo 1 por soro, coberto por um falso-indúsio. Os esporos são tetraédricos-globosos, triletes (SMITH, 2006). 3.1.3.3 O gênero Lygodium Sw. Inclui as plantas lianescentes, com rizoma terrestre contendo tricomas aciculares, pluricelulares, alaranjados e caule curto-reptante com tricomas. Possui características incomuns como frondes volúveis e crescimento indeterminado, enrolando-se a partir da gema apical da raque, monomorfas. A lâmina pode ser 1–3-pinado-pinatífida, papirácea, glabra ou com tricomas pluricelulares alaranjados. Apresenta pinas alternas, pecioluladas; pínulas divididas, palmado-lobadas a pinadas. As nervuras distribuem-se livremente ou de forma anastomosadas. No ápice dos segmentos são encontrados os soros e nestes, os esporângios abaxiais solitários, formados na margem da lâmina foliar (contendo apenas 1 soro) protegidos pelo tecido laminar marginal, formando um falso-indúzio. Seus esporos são triletes (PRADO, 2005). Distribui-se pantropicalmente, chegando a atingir até mesmo regiões temperadas ao leste dos Estados Unidos, África do Sul, Japão e Nova Zelândia (MORAN, 1995). 27 3.1.3.4 A espécie Lygodium venustum SW. Lygodium venustum (Figura 1) é uma planta terrestre com rizoma subterrâneo a partir do qual são produzidas suas folhas, que possuem lâmina 2-3 pinado-pinatífida com crescimento indeterminado e pinas alternas com cerca de 14 cm de comprimento, pecioluladas. As pínulas, com 3-7,5 x 1,3 cm, podem ser de palmado-lobadas a pinadas, articuladas, sendo cobertas por tricomas pluricelulares, diminuem de tamanho em direção ao ápice da pina. A base do pedíolulo não apresenta dilatação e tem entre 1-3 mm de comprimento. As frondes são subdimorfas, sendo a estéril mais larga que a fértil. Os segmentos proximais são palmatilobados, com base hastada e margens dentadas. O ápice é obtuso, a venação é aberta e as nervuras são livres, podendo ser simples ou furcadas (PRADO, 2005). Possui terminal de gemas dormentes, que podem se desenvolver em resposta à lesão ou destruição da ponta da folha principal por herbívoros ou fungos em uma ramificação do limbo foliar (MUELLER, 1983). Figura 1. Samambaia Lygodium venustum Sw. Fonte: autora 28 Apresenta-se amplamente distribuído na América Latina, do México ao Paraguai e ilhas do Caribe, onde se desenvolve em até 1.100 m de altitude em relação ao nível do mar. No Brasil, distribui-se em diversas zonas fitogeográficas, tendo sido registrada a sua ocorrência em estados de regiões distintas (PRADO, 2005; ARANTES, 2008; COSTA, 2007; SANTIAGO, 2003). É normalmente observada crescendo em clareiras no interior da mata ou às margens de caminhos, em áreas perturbadas. Em algumas localidades apresentou comportamento ruderal, sendo observada em terrenos baldios da zona urbana. Por possuir raque volúvel, com forma adaptativa de cipó, especializa-se no hábito lianescente, sendo, após atingir 50 cm de altura, considerada uma exímia alpinista, apoiando-se geralmente em cipós, madeiras mortas ou arbustos, chegando a atingir mais de 5 metros de altura (COSTA, 2007; MEHLTRETER, 2006; PRADO, 2005; TRYON STOLZE, 1989). De acordo com Mehltreter (2006), esta espécie é capaz de manter uma reserva de vida quando a iluminação não lhe é favorável, podendo revigorar em condições propícias. Buscando condições de iluminação adequada e uma planta que lhe possibilite um suporte perfeito. L. venustum muitas vezes pode se tornar invasora, tida como uma espécie difícil de erradicar, uma vez que mesmo fragmentado o rizoma é capaz de se regenerar e produzir novas folhas. Entretanto, não é considerada uma espécie de rápido desenvolvimento, uma vez que seu ciclo de vida é lento. Em seus estudos, Mehltreter (2006) ainda observou que a luz do sol é de fundamental importância para a indução da fertilidade. A planta apresenta padrão de crescimento sazonal, correlacionado com a precipitação, indicando que a água age como um fator limitante para seu desenvolvimento. Das espécies do gênero Lygodium, L. venustum mostra certa semelhança com outras espécies, destacando-se a L. volubile, registrada também no Brasil (COSTA, 2007; CASARINO, 2009). A diferença entre as mesmas consiste na caracterização das pínulas, que na segunda apresenta-se aproximadamente do mesmo tamanho, sendo que as proximais não são lobadas, enquanto que, na primeira, as pínulas têm tamanhos diferentes, já que as proximais são lobadas e maiores que as demais (ROLIM, 2007). 3.1.4 Importância etnobotânica e farmacológica de L. venustum A utilização de L. venustum como planta medicinal tem sido registrada na Mesoamérica por populações indígenas, entre outras, possuindo atividades antiséptica, 29 fungicida e tricomonicida e sendo indicada para o tratamento de dermatoses, micoses e infecções (DUKE, 2008). É também usada no tratamento de desordens gastrointestinais e ginecobstétricas e como antiinflamatório pós-parto (ARGUETA, 1994). Tradicionalmente tem destaque no preparo da bebida de efeito alucinógeno, ayahuasca, entre os Sharanahua e os índios do alto do rio Purus na Amazônia Peruana (RIVIER et al., 1972). No Brasil, é utilizada por afro-brasileiros em cultos místicos para banhos de limpeza (ALBUQUERQUE et al.,1997) e ainda, segundo Rahman (2008) para nervosismo e instabilidade emocional. Farmacologicamente, tem sido investigada diante do uso como planta medicinal. O primeiro relato sobre sua bioatividade foi em 2005, através de uma triagem feita por Alanis et al., onde investigando 26 plantas medicinais mexicanas sobre o potencial antibacteriano frente a 8 linhagens, verificou que L. venustum apresentou percentual de inibição abaixo de 50%. Neste estudo foram testados os extratos metanólico e aquoso (8 mg), usando o método da difusão em disco e neste estudo a planta foi considerada pouco eficiente como inibidora do crescimento bacteriano. Como é usada para o tratamento de desordens gastrointestinais, tais como diarréia, L. venustum teve sua atividade anti-secretora testada em modelo in vivo, induzido por toxina do cólera (VELÁZQUEZ et al., 2006), tendo sido utilizada a concentração de 300 mg/kg dos extratos metanólico e aquoso, ficando constatado que apenas o metanólico apresentou inibição (51,6%), mostrando uma interessante atividade antidiarreica. Nesta mesma concentração, o extrato metanólico foi investigado quanto à inibição do peristaltismo do trato intestinal em ratos, apresentando efeito moderado (42%) superior ao da droga usada como controle positivo, a lorepamida - 34% em 10 mg/Kg (CALZADA et al., 2010). Em 2007, Calzada et. al., avaliou a atividade tricomonicida de 22 plantas e constatou uma atividade moderada para L. venustum, apresentando uma IC50 de 60,9 µg/mL. 3.2 PESQUISAS ENVOLVENDO O GÊNERO Lygodium Pesquisas envolvendo o gênero Lygodium em geral, são bastante diversificadas quanto à temática. Entretanto, verifica-se que a maioria das pesquisas se reporta a tentativas de erradicação de algumas espécies que têm se tornado um grande problema como invasoras, especialmente nos Estados Unidos (Flórida) e China, de onde vem a maioria dos trabalhos registrados. Uma estratégia interessante vem sendo utilizada pelos chineses, que é a de conhecer a miúde as espécies (sua fitoquímica) e testar a sua bioatividade, tentando dar a elas uma importância farmacológica. Ecologia, fenologia, registros de novas espécies e descrição 30 das mesmas e em alguns casos isolamentos de compostos vem sendo realizados com espécies do gênero Lygodium. Porém, no contexto geral, poucos são os trabalhos relatando a atividade biológica destas samambaias. Em um levantamento realizado no Annual Review of Pteridological Research, entre outras fontes, sobre estudos envolvendo pteridófitas foram encontrados 163 trabalhos, sendo que apenas 18 abordavam bioatividades do gênero Lygodium. As biotividades testadas foram: antimicrobiana (05), antioxidante (04), antiangiogênica (03), antiviral (01), antiandrogênica (01), antissecretora (01), tricomonicida (01), antineoplásica (hepatoma) (01), antiepiléptica (01), antiansiolítica (01) e contra distúrbios gastrintestinais (01), sendo que dos 18 trabalhos, dois destes abordavam até 02 atividades. As pesquisas realizadas sobre este gênero foram compiladas anualmente (1994 a novembro de 2011) encontram-se no apêndice A. 3.3 PRODUTOS NATURAIS E USO TERAPÊUTICO O homem tem utilizado produtos naturais para diversas finalidades desde os primeiros indícios de sua existência, quando por experimentação e observação, descobria as propriedades de plantas e animais, e transmitia seus conhecimentos às sucessivas gerações, tradicionalizando e construindo uma cultura baseada na terapêutica experimental. Este uso tem se mantido até os dias de hoje, onde diferentes e modernos processos biotecnológicos têm facilitado a exploração e garantido a bioprospecção de produtos de interesse econômico e farmacológico que propiciam um maior conforto e melhoria na expectativa da vida da espécie humana. A convivência e o aprendizado com os mais diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais, do conhecimento da relação íntima entre a estrutura química de um determinado composto e suas propriedades biológicas e da inter-relação animais/insetos-planta (VIEGAS JR; BOLZANI, 2006). A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das substâncias orgânicas conhecidas. Dentre os diversos reinos na natureza, o reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, muitos deles de grande valor agregado devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PINTO et al., 2002). Neste sentido, diante da esplêndida biodiversidade mundial, e, mais especificamente, a brasileira, é um fato afirmar que o número de plantas contendo substâncias potencialmente 31 aplicáveis com propriedades biológicas, farmacológicas ou terapêutipas está longe de ser computado, se justificando o desenvolvimento de constantes pesquisas. Portanto, na prática, busca-se algumas características desejáveis das plantas medicinais que, de acordo com Toledo et al. (2003) que sejam eficazes, tenham baixo risco de uso, assim como reprodutibilidade e constância de sua qualidade. De uma forma geral, as plantas apresentam diversas vias metabólicas secundárias que culminam com a formação de compostos, os quais podem apresentar distribuição restrita a algumas famílias e gêneros ou espécies (LOPES, 2006). De acordo com Matos (1997), compostos terpênicos, alcalóides, glicosídicos, flavonóides e vários outros, oriundos de processos vitais de biossíntese, resultantes de um metabolismo secundário, são objeto de estudo da química de produtos naturais, que visa esclarecer e registrar os constituintes resultantes deste metabolismo dos seres vivos, isolando e elucidando suas estruturas, por conta de sua significância utilitária à alimentação e a saúde. Compostos destas classes são necessários à sobrevivência e preservação das espécies, garantindo vantagens para sua perpetuação (SIMÕES et al., 2010), mas também podem servir como princípios ativos de interesse farmacológico, já que diversas classes de produtos naturais estão sendo empregadas como matéria prima para a síntese de substâncias bioativas. A busca por fitoconstituintes ativos para formulação de fitoterápicos sugere um trabalho interdisciplinar. Neste sentido, Maciel et al. (2002) preconiza que as pesquisas com plantas medicinais envolvem investigações da medicina tradicional e popular (etnobotânica); isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos (química orgânica: fitoquímica); investigação farmacológica de extratos e dos constituintes químicos isolados (farmacologia); transformações químicas de princípios ativos (química orgânica sintética); estudo da relação estrutura/atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e farmacológia) e finalmente a operação de formulações para a produção de fitoterápicos. A integração destas áreas na pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho promissor e eficaz para descobertas de novos medicamentos. Um aspecto importante é abordado por Simões et al. (2010), que chama a atenção para a toxicidade das plantas, pois, tendo seus metabólitos secundários a função de defender a espécie de predadores, é natural que acumulem substâncias de elevada toxicidade. Novos conhecimentos e novas necessidades certamente encontrarão no reino vegetal soluções, através da descoberta e desenvolvimento de novas moléculas com atividade terapêutica, ou com aplicações na tecnologia farmacêutica ou no desenvolvimento de fitoterápicos com maior eficiência de ação (SIMÕES et al., 2010). 32 3.4 MICRORGANISMOS EM ESTUDO E IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Os microrganismos são definidos, em princópio, como seres microscópicos, individualmente invisíveis a olho nu. São seres vivos dotados de maior diversidade biológica conhecida, tanto morfológica como fisiológica e ecológica. Podem apresentar formas celulares as mais variadas, são metabolicamente capazes de realizar todos os tipos de reações químicas conhecidas e podem ser encontrados em praticamente todos os ambientes, dos mais simples aos mais extremos. De acordo com sua organização celular e estrutural, podem ser classificados em procariotos e eucariotos. Os principais grupos microbianos conhecidos são os vírus, as bactérias, as arqueas, as algas, os protozoários e os fungos (VERMELHO et al., 2006). Segundo Tortora et al. (2008), a microbiota normal tanto pode nos causar prejuízo, quanto nos beneficiar. Por exemplo, determinadas microbiotas normais nos protegem contra doenças impedindo o crescimento de micróbios nocivos, enquanto outras produzem substâncias úteis como as vitaminas K e B. Infelizmene sob determinadas circunstâncias, a microbiota normal pode nos fazer adoecer ou infectar pessoas com quem temos contato. Neste trabalho iremos abordar três grupos microbianos de reconhecida importância clínica: as bactérias, os fungos e os protozoários. 3.4.1 Bactérias O domínio Bacteria (organismos com parede celular contendo peptoglicano) apresenta uma grande variedade fisiológica e morfológica e diferentes tipos nutricionais quanto a fonte de carbono, energia e fatores ambientais (oxigêncio, pH, temperatura e pressão hosmótica) são encontrados (VERMELHO et al., 2007). As bactérias são organismos relativamente simples, de uma única célula (unicelulares), cujo material genético não está envolto por uma membrana nuclear especial, sendo por esta razão denominadas procariotos. As milhares de espécies de bactérias são diferenciadas por muitos fatores, incluindo a morfologia (forma), a composição química (frequentemente detectada por reações de coloração), as necessidades nutricionais, as atividades bioquímicas e a fonte de energia (luz solar ou química) (TORTORA et al., 2008). A organização celular bacteriana é bastante simples, compreendendo uma parede celular rígida, formada de peptoglicana, e uma membrana citoplasmática, composta basicamente de fosfolipídeos e proteínas, entretanto gliceroglicolipídeos, hopanóides e outros 33 tipos de lipídios também podem ser encontrados. O DNA se encontra no citoplasma, formando a região conhecida como nucleóide. Os ribossomos estão dispersos no citoplasma. Externamente podem apresentar o glicocálice, formado por glicoproteínas e glicolipídeos. Algumas espécies apresentam flagelos de locomoção, e outras ainda, podem possuir fímbrias de adesão e pili. Em algumas espécies há presença de endósporos (VERMELHO et al., 2006). A composição química da parede celular é usada para diferenciar os principais tipos de bactérias. Na maioria das bactérias Gram-positivas (assim chamadas porque podem ser coradas com a coloração de Gram), a parede celular consiste de muitas camadas de peptideoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida. Além disso, contém ácidos teicóicos, que consistem principalmente em um álcool (como glicerol ou ribitol) e fosfato. Já as bactérias Gram-negativas consistem de uma ou de poucas camadas de peptideoglicana e uma membrana externa que fornece uma barreira para certos antibióticos (por exemplo, penicilina). Não contém ácidos teicóicos e como contêm somente uma pequena quantidade de peptideoglicana, são mais suscetíveis ao rompimento mecânico (TORTORA, et al., 2008). As diferenças estruturais entre as células bacterianas Gram-positivas e Gram-negativas encontram-se evidenciadas na figura 2. Bactérias de interesse clínico, em detrimento das demais, representam um dos focos deste trabalho, por constituírem sob diversos aspectos sérios problemas de saúde pública. 3.4.1.1 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (Figura 3.a), bactéria Gram-positiva da família Micrococcae, é um dos mais significantes agentes etiológicos de processos infecciosos adquiridos, sendo a espécie mais virulenta dos Staphylococcus spp (KRUSZYNSKA et al., 1997). S. aureus são descritos morfologicamente por Trabulsi et al. (2004), como sendo cocos que quando observados por microscopia aparecem agrupados em cachos semelhantes a uva. São geralmente não-encapsulados e apresentam colônias com coloração amarelo-ouro. Esta espécie é frequentemente encontrada colonizando a microbiota natural, principalmente da pele, e, com a quebra de barreiras cutâneas ou diminuição de imunidade pode se tornar patogênica. É causadora de uma grande variedade de infecções, tais como infecções na pele e no subcutâneo, infecções pós-cirúrgicas, osteomielites, pneumonias, abscessos, endocardites e bacteremia (BARRAVIERA, 1994; FERREIRA, 1985; LOWY, 1998). 34 Figura 2: Diferenças estruturais entre células bacterianas Gram-negativas e Gram-positivas. Fonte: http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com/2010/12/microbiologia-online-com-foco-em.html. Acesso em 17 de novembro de 2011. 3.4.1.2 Escherichia coli Escherichia coli (Figura 3.b) é uma bactéria Gram-negativa pertencente à família Enterobacteriaceae normalmente encontrada no intestino grosso de seres endotérmicos, tornando-se reconhecida como um comensal inofensivo e um patógeno versátil (VOGT, et al, 2005). Espécies causadoras de patogenias são genericamente denominadas Escherichia coli enterovirulenta, dividindo-se em quatro classes distintas: E. coli patogênica (gastroenterites com diarréia aquosa e sanguinolenta, predominante em crianças com menos de um ano), E. coli enterotoxigênica (doença diarréica em indivíduos de todas as idades), E. coli enterohemorrágica (enterocolite hemorrágica em indivíduos de todas as idades) e E. coli invasora (diarréia sanguinolenta ou não, com presença de leucócitos e muco) (TRABULSI et al., 2004). 35 Diferentes cepas de E.coli estão associadas a quadros clínicos de colite hemorrágica, disenteria, cistite, nefrite, infecção diferida cirúrgicas, septicemia e especialmente da síndrome uremia–hemolítica (GERMANO P.; GERMANO M., 2011). 3.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (Figura 3.c), um bacilo Gram-negativo aeróbio, comumente habita o solo, água, vegetais e ambientes hospitalares (água, equipamentos, utensílios, desinfetantes), e ainda faz parte da microbiota normal do ser humano, sendo encontrada na pele, garganta e fezes de indivíduos sadios. Como apresenta poucas exigências para seu crescimento, possui ampla distribuição ambiental (SILVA, 1999; MURRAY et al., 2000; SOUZA, et al., 2007). Pode estar frequentemente envolvida em infecções hospitalares, provocando infecções localizadas em decorrência de contaminação oportunista, podendo infectar diversos locais do corpo, com vias urinárias, respiratórias, causar pneumonias, meningites, endocardites além de outros tipos de infecções e, além disso, tem sido relatada em eventos de resistência a antibióticos (DELDEN; IGLEWSKI, 1998). 3.4.1.4 Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae (Figura 3.d) é um bacilo Gram-negativo presente no trato gastrointestinal de indivíduos hígidos, sendo considerado um importante patógeno de infecções hospitalares, causando surtos em unidades de internação de pacientes críticos, e são descritas situações em que sua presença se tornou endêmica (DIPERSIO et al., 2005). É conhecida por muitos médicos como causa de pneumonia comunitária, ocorrendo principalmente em pacientes imunocomprometidos (PODSCHUN et al., 1998), dessa forma, apresenta-se como um dos maiores problemas relacionados à contaminação em unidades pediátricas com crianças imunodeprimidas (MENEZES, et al., 2007). De acordo com Menezes et al. (2007), esta bactéria produz enzimas betalactamases de espectro expandido (ESBLs) e estas são a principal causa de aumento da resistência às cefalosporinas normalmente utilizadas para o tratamento de indivíduos. 36 Figura 3: Microrganismos (bactérias): a. Staphylococcus aureus; b. Escherichia coli; c. Pseudomonas aeruginosa; d. Klebsiella pneumoniae. a b c d . Fontes:http://www.atlangram.com/resources;http://www.kimicontrol.com/edu-e.html; http://www.bioquell.com b acesso em 18 de novembro de 2011. /technology/microbiology/klebsiella-pneumoniae/; 3.4.2 Fungos Os fungos são organismos eucariontes, ubíquos e heterotróficos. Possuem vários cromossomos diferentes e uma membrana nuclear bem definida, além de mitocôndrias, retículo endoplasmático, ribossomos e vacúolos. Suas membranas plasmáticas, formadas por uma bicamada de fosfolipídeos, contêm esteróides, e, dessa forma eles assemelham-se mais às células superiores do que às bactérias, sendo na maioria multicelulares, embora alguns possam ser unicelulares. A membrana ainda possui ergosterol e microtúbulos compostos de b tubulina. Todos apresentam parede celular, pelo menos em algum estádio do seu ciclo de vida (ALMEIDA, 2008). A parede celular é uma estrutura dinâmica, geralmente composta por elementos microfibrilares insolúveis em água (quitina e glucanos), mergulhados em uma matriz amorfa, constituída de polissacarídeos solúveis em água. Algumas espécies de fungos apresentam melanina na parede celular (SIDRIN ROCHA, 2010). Os fungos podem ser divididos em dois grandes grupos, os fungos filamentosos e as leveduras, unicelulares (VERMELHO, et al., 2006). Conforme Sidrin e Rocha (2010) fazem parte das leveduras os fungos cujas estruturas unicelulares apresentam um único núcleo por célula e forma de divisão celular diferenciada, por brotamento simples, brotamento por fissão, ou ainda por divisão binária. Muitas espécies de leveduras constituem uma população residente da microbiota normal da superfície da pele e de algumas mucosas. De acordo com Almeida (2008), por se tratar de um fungo oportunista, a levedura aproveita-se quando as defesas do organismo estiverem comprometidas e, através de mecanismos de partenogênese, rompe o equilíbrio entre parasita e hospedeiro, causando infecção. 37 O gênero Candida é um dos que mais tem se destacado como causador de infecções superficiais e invasivas, passando de comensal a importante agente de infecções do organismo, sendo encontrado geralmente na vagina e trato gastrointestinal (KANTARCIOGLU; YUCEL, 2002). Cerca de 20 espécies são reconhecidamente patogênicas e entre estas se ressalta Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida krusei (ZARDO MEZZARI, 2004; COLOMBO ;GUIMARÃES, 2003; MACEDO et al., 2008). A epidemiologia de Candida spp, varia de acordo com a região demográfica, com as características do grupo de indivíduos estudado e com o sítio e causa da infecção (HAZEN, 1995; NGUYEN, et al., 1996). 3.4.2.1 Candida albicans Candida albicans (Figura 4.a) vem sendo considerada como sendo o patógeno mais comum nas candidíases cutâneas e da orofaringe (REX et al., 2000). Oportunista por excelência pode implantar-se secundariamente no decurso do diabetes, de traumatismos diversos, gravidez e, principalmente em indivíduos imunocomprometidos pelo HIV (ZHANG et al., 2002). Segundo Monge et al. (2006), esta levedura habita o corpo humano de forma comensal e tem sido a maior causa de infecções fúngicas em humanos, sendo que as infecções tem ocorrido normalmente como consequência de uma alteração imunológica e virulência da C. albicans, que apresenta plasticidade morfológica. Sidrin e Rocha (2010) preconizam que a doença pode se manifestar clinicamente tanto em mucosas, principalmente a oral, a vaginal e a esofágica, quanto em diversos órgãos, invadindo-os e produzindo um quadro sistêmico. 3.4.2.2 Candida tropicalis Candida tropicalis (Figura 4.b) é geralmente encontrada na pele e no trato digestivo de hospedeiros humanos saudáveis (ODDS, 1998). Foi a causa mais comum de fungemia em estudo realizado com pacientes hematológicos, resultando em elevada mortalidade (LEUNG et al. 2002). É um agente oportunista quando o hospedeiro encontra-se neutropênico, tem a flora bacteriana suprimida pelo uso de antimicrobianos ou possui danos na mucosa 38 gastrointestinal ou ainda quando é um paciente com neoplasias, especialmente em leucemias (WINGARD, 1995). Em hospitais brasileiros, é registrada como a segunda espécie mais comumente isolada e sua infecção acomete qualquer idade, predominantemente adultos e idosos (NUCCI COLOMBO, 2007). 3.4.2.3 Candida krusei Candida krusei (Figura 4.c) é uma levedura comensal em animais de sangue quente, com muito baixa patogenicidade e prevalência. Os locais mais frequentemente colonizados pela espécie em humanos é o trato gastrointestinal, seguido do trato respiratório superior e do trato urinário. (HURLEY; WINNER, 1966; ODDS, 1988). Tem o potencial de causar infecções graves em pacientes com doença imunossupressora, leucemia, em pacientes neutropênicos expostos prolongadamente ao fluconazol ou submetidos a transplante de medula óssea (MEUNIER-CARPENTIER et al., 1981; IWEN et al., 1995; WINGARD, 1995). Infecções focais por C. krusei incluem endoftalmia, artrite e endocardite, relacionadas a procedimentos invasivos em sistemas de defesa comprometidos (SAMARANAYAKE Y.; SAMARANAYAKE L., 1994). Figura 4. Microrganismos (leveduras): Candida albicans (colônias verdes), b) C. tropicalis (colônias azuis) e c) C. krusei (colônias rosas) em meio CHROMagar (CMA) Fontes: Agarwal et al., 2011 . 3.4.3 Protozoários Os protozoários englobam todos os organismos protistas, eucariotas, constituídos por uma única célula. Apresentam as mais variadas formas, processos de alimentação, locomoção 39 e reprodução. É uma única célula que, para sobreviver, realiza todas as funções mantenedoras da vida: alimentação, respiração, reprodução, excreção e locomoção (NEVES et al., 2004 ). De acordo com Moraes et al. (2008) sua estrutura celular apresenta membrana celular distensível ou rígida e o citoplasma é constituído pela porção do protoplasma delimitada internamente pelo núcleo ou núcleos e externamente pela membrana plasmática. Encontramse no citoplasma inclusões alimentares e de reserva, várias organelas, além do núcleo ou núcleos bem como áreas diferenciadas para determinadas funções. Dentre mais de 65.000 espécies identificadas, cerca de 10.000 correspondem a parasitos. Mas poucas interessam à patologia humana. Todas as espécies pertencentes à família Trypanosomatidae são parasitas. Aí se encontram, nos gêneros Trypanosoma e Leishmania, espécies extremamente importantes tanto na medicina humana como veterinária. No homem causam a trypanossomíase americana ou doença de Chagas (Trypanosoma cruzi), a tripanosomíase africana ou doença do sono (Trypanosoma grussei gambiense e T. b. rhodiense), as leishmaníases tegumentares (Leishmania brasiliensis, L. mexicana, L. peruviana, L. tropica) e o calazar (L. donovani e L, infantum) (REY, 2010). 3.4.3.1 Trypanosoma cruzi Conforme descrito por Jansen et al. (2000), T. cruzi é um protozoário flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, considerado um dos parasitas de maior e mais bem sucedida distribuição na natureza, reconhecido como o agente etiológico da doença de Chagas ou tripanossomíase americana. Possui um ciclo biológico complexo (Figura 5), envolvendo três formas evolutivas (tripomastigota, epimastigota e amastigota) e várias espécies de triatomíneos e de mamíferos, silvestres e domésticos, atuando respectivamente, como vetores e reservatórios do parasito (BRENER, 2000). A transmissão da Doença de Chagas é vetorial, se dá através das fezes dos vetores triatomíneos e tanto os machos como as fêmeas são hematófagos. No ato de picar, em geral defecam após o repasto, eliminando formas infectantes presentes em suas fezes que penetram pelo orifício da picada (REY, 1991). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (2010), estima-se que mais de 10 milhões de pessoas estejam infectadas com o parasita em todo o mundo e a doença, que antes encontrava-se confinada nas Américas, em especial na América do Sul, tem se difundido para outros continentes (Figura 6 ). A doença apresenta-se em duas fases (WHO, 2002): 40 a) Fase inicial aguda: dura cerca de dois meses após a infecção, quando um elevado número de parasitas circula no sangue. Os sintomas são ausentes ou leves na mioria dos casos, entretanto pode-se destacar febre, cefaléia, gânglios linfáticos aumentados, palidez, dor muscular, dificuldade em respirar, inchaço e dor abdominal ou no peito. b) Fase crônica: os parasitas encontram-se principalmente nos músculos causando distúrbios cardíacos (até 30%) e digestivos, como alargamento do esôfago ou do cólon (10%), além de alterações neurológicas ou mistas. Em anos posteriores, por conta da destruição progressiva do músculo cardíaco, a infecção poderá levar à morte súbita ou insuficiência cardíaca. Figura 5: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention – http://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.html; acesso em 17 de novembro de 2011. disponível em Os dois medicamentos usados para o tratamentos são o benznidazol e o nifurtimox. As principais contra-indicações para o tratamento são a gravidez e insuficiência renal. Nifurtimox é contra-indicado para pacientes com antecedentes de distúrbios psiquiátricos e neurológicos (WHO, 2010). 41 Figura 6: Distribuição de casos de infecção por Trypanosoma cruzi. Fonte: Primeiro relatório da OMS sobre as doenças tropicais negligenciadas (2010). 3.4.3.2 Leishmania spp. Protozoários deste gênero são parasitas unicelulares heteroxênicos que apresentam duas formas morfológicas no seu ciclo de vida (Figura 7): promastigota (quando estão infectando o inseto vetor) e amastigota (quando estão infectando o homem) (MICHALICK, 2003; MAGILL, 1995). Pertencem à ordem Kinetoplastida, que se caracteriza principalmente pela presença de uma única mitocôndria diferenciada, rica em DNA, chamada cinetoplasto (RODGERS et al., 1990). Estes protozoários são causadores de uma doença zoonótica infecciosa denominada leishmaniose. A Leishmania é transmitida por hospedeiros invertebrados flebotomíneos hematófagos do gênero Lutzomyia, no Novo Mundo, ou Phlebotomus, no Velho Mundo (ROBERTS; JANOVY, 2000). No que diz respeito às manifestações clínicas, as leishmanioses podem ser classificadas em três manifestações principais (WHO, 2010; SOARES-BEZERRA et al., 2004): a) Visceral ou calazar, que se caracteriza por causar febre irregular, perda de peso, hepatoesplenomegalia e anemia. Ataca os órgãos internos e é a forma mais grave da 42 doença. Geralmente é fatal dentro de dois anos. A mortalidade pode atingir aproximadamente 100% dos infectados não tratados. Pode ser causada principalmente por L. donovani, bem como por L. infantum e L. chagasi. b) Mucocutânea, que se caracteriza por apresentar lesões que destroem parcial ou totalmente as mucosas nasal e oral, causando grave mutilação, destruindo os tecidos moles da boca, nariz e garganta. Pacientes sofrem discriminação e preconceito. L. brasiliensis é a principal causadora deste tipo de manifestação. c) Cutânea, é a forma mais comum e compreende o aparecimento de lesões ulcerativas em áreas expostas (braços, pernas, entre outras) chegando a deixar cicatrizes permanentes. Causa lesões crônicas que não cicatrizam espontaneamente. Geralmente pode ser causada por L. mexicana, L. tropica e L. major. Figura 7: Ciclo de vida de Leishmania spp. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention – disponível em www.cdc.gov/parasites/ leishmaniasis/ biology.html. Acesso em 17 de novembro de 2011. 43 Estima-se que a doença cause 1,6 milhões de novos casos, dos quais cerca de 500.000 é visceral e 1,1 milhões cutânea ou mucocutânea. Destes casos estimados apenas 600.000 são relatados. A distribuição da leishmaniose tem se expandido ao longo dos anos, atingindo países onde antes sua ocorrência não era registrada. As figuras 8 e 9 mostram a distribuição da leishmaniose visceral e cutânea em todo o mundo. No Brasil, as crianças são mais severamente afetadas e desde 1999 tem havido um aumento acentuado no número de casos de leishmaniose visceral (WHO, 2010). Figura 8: Distribuição de casos de leishmaniose cutânea. Fonte: Primeiro relatório da OMS sobre as doenças tropicais negligenciadas (2010). As drogas utilizadas para o tratamento da leishmaniose visceral são os pentavalentes antimoniais (estibogluconato de sódio e antimoniato de meglumina), anfotericina B, paromomicina e miltefosina. Entretanto, como a leishmaniose visceral tem potencial para desenvolvimento de resistência às drogas, a doença deve ser tratada com uma combinação de medicamentos ao invés de se fazer monoterapia, dessa forma, ensaios com combinações de drogas têm sido realizados (WHO, 2010). 44 Figura 9: Distribuição de casos de leishmaniose visceral. Fonte: Primeiro relatório da OMS sobre as doenças tropicais negligenciadas (2010). 3.5 RESISTÊNCIA DE MICRORGANISMOS O advento dos quimioterápicos trouxe durante algum tempo conforto às populações humanas, pois se acreditava que enfermidades existentes seriam curadas e que a qualidade de vida seria primada e preservada. Desde os anos de 1940, o desenvolvimento de fármacos efetivos e seguros para lidar com as infecções bacterianas e outras revolucionou o tratamento médico, e a morbidade e a mortalidade associadas a estas doenças foram drasticamente diminuídas (RANGE et al., 2007). Entretanto, a história tomou outro curso quando se observou que as pessoas continuavam suscetíveis aos mais variados tipos de infecções, e que esta condição vinha sendo alarmantemente ampliada em relação a um grande número de microrganismos. O que ocorria é que em um curto espaço de tempo surgiam linhagens de microrganismos resistentes à droga e capazes de sobreviver ao tratamento realizado (VERMELHO et al., 2007). A situação atual da resistência às drogas tem sua origem em muitos fatores, incluindo a seleção de mutantes resistentes por exposição a agentes antimicrobianos, transferência de 45 determinantes genéticos de resistência entre cepas bacterianas e disseminação clonal de cepas resistentes entre pacientes hospitalizados e entre instituições hospitalares (McGOWAN JR, 2004). De acordo com Vermelho et al. (2007), o aumento do número de viagens nacionais e internacionais e a relativa facilidade com que bactérias resistentes a drogas cruzam barreiras geográficas podem ser considerados fatores que contribuem para a disseminação de genes de resistência. Este contexto tende a repercutir mundialmente trazendo como consequência o aumento da morbidade e mortalidade entre pacientes, a redução do número de drogas utilizáveis por futuras gerações de pacientes, além do impacto econômico trazido pelos custos com infecções (McGOWAN JR, 2004). Segundo Vermelho et al. (2007), os agentes microbianos são úteis porque geralmente possuem como alvos de ação estruturas celulares, vias metabólicas ou enzimas que são específicas para bactérias e não para o hospedeiro. Entretanto, uma variedade de mecanismos acaba mediando a resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos: as alterações no alvo das drogas, de forma que a ligação da droga ou a inibição da função não ocorrem; a redução da permeabilidade da célula bacteriana à droga, o que resulta na incapacidade do agente alcançar o seu alvo em uma concentração crítica; o efluxo da droga da célula e a destruição ou a modificação do quimioterápico, tornando o seu transporte para o interior da célula ou o reconhecimento do alvo impossíveis de ocorrerem. Dentre os diferentes mecanismos de resistência descritos para microrganismos, aqueles mais importantes em bactérias Gram-positivas podem ser classificados em três grupos distintos: destruição do antibiótico, efluxo contínuo do antibiótico e reprogramação e modificação da estrutura-alvo (SILVEIRA et al., 2006). A resistência aos quimioterápicos também pode se desenvolver em outros microrganismos além das bactérias, como por exemplo, nos fungos (CASTRO et al., 2006) e nos protozoários (OUELLETTE et al., 1994). Um crescente número de cepas fúngicas vem se tornando resistente aos fármacos antifúngicos atualmente comercializados. Kanafani e Perfect (2008) distinguem dois tipos de resistência: a primária (ou intrínseca), encontrada naturalmente em certos fungos, sem exposição prévia a drogas. E a secundária (ou adquirida), que se desenvolve em cepas após exposição ao agente antifúngico, sendo dependente de expressão do gene alterado. Nos fungos, dentre os principais mecanismos bioquímicos que contribuem para o aparecimento do fenótipo de resistência à drogas estão a redução da captação ou o aumento do 46 efluxo celular, modificação ou degradação da droga dentro da célula, mudanças na interação da droga com o seu sítio alvo ou ainda a interação com outras enzimas (SEGATO, 2008). A resistência fúngica aos agentes terapeuticamente disponíveis vem aumentando como conseqüência do crescimento da população imunocomprometida e do uso cada vez mais frequente de profilaxia e auto-medicação (WANNMACHER; FERREIRA, 2007). De acordo com Vigo (2008) em parasitos protozoários, diferentes mecanismos são responsáveis pelo aparecimento de resistência a quimioterápicos. Entre estes, elenca: a inativação da droga, a diminuição da sua concentração intracelular e alterações dos alvos moleculares. O bombeamento por efluxo também pode ser citado, sendo este realizado por uma superfamília de proteínas transmembrana (ATP-binding cassette ou ABC). Outras moléculas foram putativamente implicadas no fenótipo de resistência a drogas em T. cruzi como, por exemplo, a pteridina-redutase 1 (PTR1) que está envolvida em várias reações de óxido-redução e apresenta alta homologia com genes PTR1 de Leishmania. O mecanismo de resistência em Leishmania pode estar associado a um decréscimo do potencial da membrana mitocondrial com redução do acúmulo do fármaco em terapias prolongadas (MUKHERJEE et al., 2006). Hoje em dia, a quimioresistência apresentada pelos parasitos está muito presente em alguns países onde o fármaco não é mais utilizado com eficiência. Mesmo com as dificuldades, a falta de novos tripanocidas e o aumento da resistência conduziram os estudos para melhor entendimento dos mecanismos de ação e compreensão da quimioresistência frente aos tripanocidas (BOIBESSOT et al., 2002). Uma estratégia racional para busca de novas moléculas antiparasitárias é a exploração das diferenças bioquímicas entre parasito e a célula do mamífero hospedeiro. Outrossim, a filogenética indica que os tripanossomatídeos apesar de eucariotos apresentam diferenças consideráveis no que diz respeito à organização celular comparados a células de mamíferos. Neste sentido e em observância à capacidade mutante destes parasitos, a idealização de inibidores menos específicos pode ser mais vantajosa (GIL et al., 2007; DOERIG et al., 2002; BARRET et al., 1999). 3.6 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO, RADICAIS LIVRES E SUBSTÂNCIAS ANTIOXIDANTES Espécies reativas de oxigênio (EROs) é o termo utilizado para a inclusão, não apenas de radicais livres contendo oxigênio (O2.-), mas também para derivados de oxigênio não 47 radicais (HALLIWELL, 1994), tais como peróxido de hidrogênio (H2O2) e ozônio (O3). EROs são naturalmente encontradas em todos os sistemas biológicos por força do metabolismo normal, uma vez que, em condições fisiológicas aeróbicas, o O2 pode sofrer redução tetravalente em sua estrutura, com aceitação de quatro elétrons, o que resulta na formação de H2O. No decorrer do processo, são formados intermediários reativos, na forma de radical superóxido (O2-.), radical hidroperoxila (HO2.), radical hidroxila (OH) e peróxido de hidrogênio (H2O2), que é um agente oxidante (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Espécies reativas de oxigênio (ERO) e radicais livres podem provocar lesões celulares, muitas vezes irreparáveis (GOUVÊA, 2004). O termo radical livre diz respeito a qualquer espécie química capaz de existir independentemente de outras espécies, possuindo um ou mais elétrons pareados (HALLIWELL, 1994). Segundo Halliwell (1994), antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa concentração comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne significativamente a oxidação do mesmo. A utilização de substâncias com capacidade antioxidante pode ser de grande relevância na prevenção e terapêutica de doenças relacionadas com o aumento do estresse oxidativo, tais como arteriosclerose, câncer, e doenças degenerativas (ZHOU, et al., 2007). A atividade antioxidante de extratos de plantas vem sendo investigada ao longo dos anos, uma vez que a toxicidade do oxigênio atmosférico tem se mostrado com o principal desafio à sobrevivência de organismos vivos (GOUVÊA, 2004). Tem sido dado ênfase à identificação e purificação de novos compostos com atividade antioxidante, oriundos de fontes naturais, que possam agir sozinhos ou sinergicamente com outros aditivos, como uma forma de prevenir a deterioração oxidativa de alimentos e restringir a utilização dos antioxidantes sintéticos (SHAHIDI et al., 2007). 48 MATERIAL E MÉTODOS 49 4 MATERIAL E MÉTODOS Na figura abaixo (10) é possível observar a sequência de operações para a execução do trabalho. Figura 10: Passos seguidos e todas as biatividades avaliadas durante o desenvolvimento da pesquisa. METODOLOGIA GERAL FHLV: fração hexânica de Lygodium venustum; FDLV: fração diclorometano de L. venustum; FAELV: fração acetato de etila de L. venustum; FMLV: fração metanólica de L. venustum; CIM: concentração inibitória mínima. 4.1 SELEÇÃO E COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO Folhas de L. venustum foram colhidas em maio de 2010 entre 9:30 e 10:30 horas da manhã na encosta da Chapada do Araripe em uma localidade chamada Grangeiro, no município do Crato, sul do Ceará, Brasil (Figura 11). Do material coletado foi produzida uma exsicata que foi depositada no Herbário Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) da Universidade Regional do Cariri – URCA, sob o número 5569 (Figura 12), tendo sido identificada pelo Professor Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva. A planta foi escolhida por se 50 tratar de uma pteridófita muito encontrada na localidade, com uso medicinal registrado por algumas populações mundiais. Figura 11: Localização da área de coleta de Lygodium venustum. Fontes: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceara_Municip_Crato.svg; Centro de Processamento Remoto – Brasília – DF; 4.2 OBTENÇÕES DE EXTRATO ALCOÓLICO E FRAÇÕES Para obtenção das frações, 6 g do extrato foi misturado à sílicagel 60 (VETEC), sendo depois colocados em um funil de Busting com papel de filtro acoplado a um kitassato e bomba à vácuo para filtração. Solventes em escala crescente de polaridade foram vertidos sobre a mistura um a um nesta ordem: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol para enfim se obter as frações desejadas. Cada fração foi concentrada em evaporador rotativo e levadas a banho-maria para retirada de todo o solvente. Foram obtidos os seguintes rendimentos: fração hexânica de L.venustum (FHLV): 0,22 g; fração diclorometano de L. venustum (FDLV): 0,39 g; fração ecetato de etila de L. venustum (FAELV): 0,52 g e fração metanólica de L. venustum (FMLV): 3,01 g. 51 Figura 12: Exsicata de Lygodium venustum depositada no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) Fonte: Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) 4.3. PROSPECÇÃO DE CONSTITUINTES QUÍMICOS DO EXTRATO ETANÓLICO (EELV): ANÁLISE FITOQUÍMICA QUALITATIVA Os testes de identificação fitoquímica qualitativa foram realizados seguindo o método desenvolvido por Matos (1997) que detecta a presença de fenóis, taninos pirogálicos e flobabênicos, antocianinas, antocianidinas, flavonóides, leucoantocianidinas, catequinas, flavononas, a partir da mudança de coloração nas reações, e de alcalóides, verificando-se a formação de precipitado. 52 O resumo do procedimento para realização do teste encontra-se descrito a seguir. 4.3.1 Preparação do extrato e operações preliminares Para o preparo das soluções foram utilizadas 300 mg de extrato bruto, solvente hidrofílico etanol com 30% de água, sendo em seguida separadas seis porções de 3 mL em frascos de número identificados numericamente (1,2,3,4,5 e 6). 4.3.2 Teste para identificação de fenóis e taninos Ao frasco nº 1, adicionou-se três gostas de solução alcoólica de FeCl3. O conteúdo foi agitado e foram observadas variações quanto a cor ou formação de precipitado abundante, escuro. A solução foi comparada com um teste em branco, contendo apenas água e cloreto férrico. Na análise dos resultados, a coloração variável entre azul e vermelho é indicativo da presença de Fenóis; quando o teste for “branco” o resultado é negativo. O precipitado escuro de tonalidade azul indica a presença de taninos pirogálicos (taninos hidrolizáveis) e o verde, a presença de taninos flobabênicos (taninos condensados ou catéquicos). 4.3.3 Teste para antocianinas, antocianidinas e flavonóides Foram utilizados os frascos de nº 2, 3 e 4, sendo um deles foi acidulado a pH 3, alcalinize, outro a pH 8,5 e o terceiro a pH 11. Serão observadas mudanças de coloração do material. Para análise dos resultados será verificado o aparecimento de cores diversas indicando a presença de vários constituintes, de acordo com a figura 13. A presença de um constituinte pode mascarar a cor indicativa da presença de outro. 4.3.4 Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavononas Pra este teste foram utilizados os frascos nº 5 e 6, sendo o primeiro acidulado por adição de HCl até pH 1-3 e o segundo alcalinizado com NaOH até pH 11. Os frascos foram aquecidos com auxílio de uma lâmpada de álcool durante 2-3 min, cuidadosamente, devendo ser observada qualquer modificação na cor, por comparação com os tubos correspondentes usados no teste anterior. Análisando os resultados, o aparecimento ou intensificação de cor 53 indica a presença de constituintes especificados na figura 14. No caso da presença de ambos, um constituinte pode mascarar a cor indicativa de outro. 4.3.5 Teste para alcalóides Para identificação de alcalóides, inicialmente preparou-se uma solução diluiu-se 300 mg de extrato bruto em 30 mL de Ácido Acético a 5%. A solução foi então aquecida até a fervura por alguns minutos, sendo em seguida transferida para um funil de separação. Logo após, foi alcalinizada com Hidróxido de Amônia NH4OH 10% (aproximadamente 10 mL). A variação do pH foi acompanhada com auxílio de papel indicador. Foi adicionado clorofórmio (aproximadamente 15 mL), agitando-a e depois deixando-a em repouso. Caso haja a presença de alcalóides, estes irão passar para a fase clorofórmica denominada Fração Alcaloídica‖. A fase clorofórmica de verá então se coletada com auxílio de um béquer e o solventre deverá evaporar, restando apenas um resíduo que deve conter alcalóide. Gotas de HCl 1% serão adicionadas e a solução será homogeneizada. Deverá ser aplicada sobre uma lâmina de vidro uma gota da solução clorídrica obtida ao lado de 1 gota de reagente Draggendorff e estas deverão ser misturadas. Durante a análise dos Resultados deverá ser observado o aparecimento de precipitado e caso ocorra, será um indicativo da presença de alcalóides na planta. Figura 13: Identificação de compostos químicos (antocianinas, antocianidinas, flavonas, flavonois, xantonas, chalconas, auronas e flavonóis através de método colorimétrico. Constituintes Cor em meio Ácido pH 3 Alcalino pH 8,5 Alcalino pH 11 Antocianinas e Antocianidinas Vermelha Lilás Azul/púrpura Chalconas e Auronas Vermelha - Vermelho/Púrpura - Amarela - Vermelho/Laranja Flavonas, Flavonóis e Xantonas Flavononóis - 54 Figura 14: Identificação de leucoantocianidinas, catequinas e lavononas por método colorimétrico. Cor em meio Constituintes Leucoantocianidinas Ácido Alcalino Vermelho - Catequinas Pardo/amarelada - Flavononas - Vermelho/Laranja 4.4 TESTES DE SUSCETIBILIDADE DE MICRORGANISMOS PELO MÉTODO DA MICRODILUIÇÃO EM CALDO 4.4.1 Preparo da solução inicial e das soluções de teste. O preparo da solução inicial das amostras foi efetuado em observância aos rendimentos obtidos. As quantidades de 200 mg (EELV), 10 mg (FHLV), 19 mg (FDLV), 100 mg (FAELV) e 205 mg (FMLV) foram pesadas e solubizadas em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO – Merck, Darmstadt, Alemanha), para obter uma concentração inicial. A partir desta concentração, foi feito uma diluição em água destilada estéril para atingir a concentração de 1024 µg/mL (solução teste). Para os cálculos foi utilizada a fórmula: C1 x V1 = C2 x V2, onde C é a concentração e V é o volume. 4.4.2 Linhagens utilizadas A escolha dos microrganismos para a avaliação da atividade antimicrobiana foi efetuada levando em consideração a presença de pelo menos um representante dos seguintes grupos de importância clínica: bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras de Candida, devidamente mensionadas a seguir, de acordo com os testes realizados. Teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM): linhagens bacterianas (padrão): E. coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 15442 e K. pneumoniae ATCC 4362. Linhagens fúngicas (padrão): Candida albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC 2538 e C. tropicalis ATCC 40042. Teste de modulação da ação de antibióticos: linhagens bacterianas (multirresistentes 55 de isolados clínicos) P. aeruginosa 03, E. coli 27 e S. aureus 358, cujo perfil de resistência se encontra descrito na figura 15. Linhagens fúngicas (padrão): Candida albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC 2538 e C. tropicalis ATCC 40042. Avaliação pelo método checkerboard: linhagens bacterianas (multirresistentes de isolados clínicos) E. coli 27 e S. aureus 358. Todas as linhagens foram obtidas do Laboratório de Micologia Clínica da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). 4.4.3 Drogas e reagentes Para os testes de suscetibilidade bacteriana pelos produtos naturais em associação com antibióticos, as drogas utilizadas foram os aminoglicosídeos canamicina, amicacina, neomicina e gentamicina. No método checkerboard foram utilizados os aminoglicosídeos disponíveis no laboratório amicacina, neomicina e gentamicina. As drogas utilizadas como antifúngicos no teste de modulação foram o mebendazol, a anfotericina B, a neomicina e o benzoilmetronidazol (Sigma Co., St. Louis, USA). Para testes antibacterianos e antifúngicos as drogas foram preparadas em uma concentração inicial de 5.000 µg/mL e 1024 µg/mL, respectivamente. Todas as drogas foram dissolvidas em água destilada e estéril. O reagente resazurina sódica (Sigma) foi utilizado como indicador de crescimento bacteriano. Resazurina sódica foi obtida a Sigma–Aldrich (St Louis, MO) e armazenada a 4°C protegida da luz. Na leitura dos testes a mudança de coloração azul para rosa devido à redução da resazurina indica o crescimento bacteriano (PALOMINO et al., 2002). Figura 15: Origem das linhagens e perfil de resistência das bactérias a antibióticos Bactéria Escherichia coli 27 Origem Ferida cirúrgica Perfil de resistência Ast,Ax,Ami,Amox,Ca,Cfc,Cf, Caz,Cip,Clo,Im,Can,Szt,Tet,Tob Staphhylococcus aureus 358 Ferida cirúrgica Oxa,Gen,Tob,Ami,Can,Neo,Para, But,Sis,Net Pseudomonas Aeruginosa 03 Urocultura Cpm,Ctz,Imi,Cip,Ptz,Lev,Mer,Ami Ast-Aztreonan; Amx- Amoxacilina; Amp-Ampicilina; Ami-Amicilina; Amox-Amoxilina, Ca-Cefadroxil; Cfccefaclor; Cf-Cefalotina; Caz-Ceftazinidima; Cip-Ciprofloxacin; Clo-Clorafenicol; Imi-Imipenem; CanCanamicina; Szt-Sulfametrim; Tet-Tetraciclina; Tob-Tobramicina; Oxa-Oxacilina; Gen-Gentamicina; NeoNeomicina; Para- Paramomicina; But-Butirosina; Sis-Sisomicina; Net-Netilmicina; Com-Cfepime; CtzCeftazidime; Ptz-Piperacilina-tazobactam; Lev-Levofloxacina; Mer-Merpenem. 56 4.4.4 Meios de cultura Foram utilizados nos ensaios biológicos os seguintes meios de cultura: Agar Heart Infusion - HIA (Difco Laboratories ltda.), Caldo Brain Heart Infusion – BHI (concentração indicada pelo fabricante e 10%) (Acumedia Manufacturers Inc.). Todos os meios de cultura foram preparados segundo as especificações do fabricante. Culturas de fungos e bactérias foram mantidas a 4ºC em Heart Infusion Agar (HIA). Antes dos testes, as linhagens foram repassadas para o meio citado e incubadas a 35ºC por 24 horas. As linhagens repicadas a serem testadas foram inoculadas em Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e incubadas na mesma situação antes do teste. Suspensões com crescimento bacteriano foram diluídas até a obtenção de 105 céls/ml (NCCLS, 2000). 4.4.5 Teste Concentração Inibitória Mínima: execução e leitura Para distribuição na placa de microdiluição foram preparados tubos eppendorf ® contendo cada um deles com 1 mL de solução contendo 900 µL de BHI 10% e 100 µL da suspensão bacteriana ou fúngica. A placa foi preenchida no sentido numérico (Figura 16 a) adicionando-se 100 µL desta solução em cada poço (placa de 96 poços) e em seguida procededendo-se a microdiluição seriada com a solução de 100 µL do produto natural (extrato ou frações), variando nas concentrações de 512 a 8 µg/mL. As placas foram levadas à incubadora por 24 horas a 35º C (JAVADPOUR et al., 1996). A revelação da CIM bacteriana foi feita utilizando-se a resazurina (Figura 16 b), enquanto para os fungos foi observada a turbidez provocada pelo crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração na qual nenhum crescimento foi observado. Figura 16: Placa de microdiluição (a) e revelação das placas com resazurina (b) a b Fonte: autora 57 4.4.6 Teste de modulação da ação de antibióticos e antifúngicos Para verificar se o extrato modificaria a ação dos antibióticos frente às cepas testadas, utilizou-se o método proposto por Coutinho, et al. (2008), onde a solução do extrato foi testada em concentração sub-inibitória (CIM/8) de 128 µg/mL. Foram preparados tubos eppendorf® contendo cada um deles 1,5 mL de solução com 1.162 µL de BHI 10%, 150 µL da suspensão bacteriana ou fúngica e 188 µL do produto natural (extrato ou frações). Para o controle foram preparados tubos eppendorf® com 1,5 mL de solução contendo 1.350 µL era BHI (10%) e 150 µL de suspensão de microrganismos. A placa foi preenchida no sentido alfabético adicionando-se 100 µL desta solução em cada poço. Em seguida, 100 µL de droga (antibiótico ou antifúngico) foi misturada ao primeiro poço, procedendo a microdiluição em série, numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade. As concentrações de aminoglicosídeos e antifúngicos variavam gradualmente de 5000 a 2,44 µg/mL e 1024 a 8 µg/mL, respectivamente 4.4.7 Teste para avaliação do tipo de interação droga/produto natural: método checkerboard O método de titulação checkerboard foi usado para estudar os efeitos da combinação entre o produto natural e os antibióticos. As suspensões bacterianas foram padronizadas como citado anteriormente. As soluções dos produtos naturais (extrato, frações) e dos antibióticos foram utilizadas em uma concentração inicial de 1024 µg/mL e 5000 µg/mL. Em cada cavidade foi adicionado 100 µL do meio de cultura contendo 10% da suspensão bacteriana. Volumes de 100 µL dos produtos naturais e dos antibióticos foram diluídos seriadamente 1:2 em caldo BHI 10%. A concentração dos produtos naturais variaram de 512 µg/mL a 4 µg/mL e a dos antibióticos variaram de 2.500 µg/mL a 19,53 µg/mL. Cada microplaca estéril foi preenchida no sentido vertical e horizontal com um extrato ou fração e um antibiótico por vez para obtenção do índice de Concentração Inibitória Fracionada (Índice CIF) e o crescimento bacteriano foi evidenciado pelo uso da resazurina. As placas preenchidas foram incubadas a 35ºC por 24 horas. O Índice CIF foi calculado através da soma do CIFA + CIFB, onde A representa o antibiótico e B o extrato em teste. O CIFA, por sua vez, é calculado através da relação CIMA combinado/ CIMA sozinho, enquanto que o CIFB = CIMB combinado/ CIMB sozinho. Este 58 índice foi interpretado da seguinte forma: sinergismo (<0.5), aditividade (0.5–1.0), indiferença (>1) ou antagonismo (>4.0) (ELIOPOULOS; MOELLERING, 1991). 4.5 TESTE DE CITOTOXICIDADE E ANTIPARASITÁRIOS 4.5.1 Reagentes e drogas Resazurina sódica foi obtida a Sigma–Aldrich (St Louis, MO) e armazenada a 4°C protegida da luz. A solução de resazurina foi preparada em solução de fosfato 1% (PBS), pH 7, filtrada e esterilizada antes do uso. Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosídeo (CPRG; Roche, Indianápolis, IN) foi dissolvido em 0.9% Triton X- 100 (pH 7.4). Foram utilizados os antibióticos penicilina G (Ern, S.A., Barcelona, Espanha) e estreptomicina (Reig Jofr´e S.A., Barcelona, Espanha). 4.5.2 Cultura de células A linhagem de celulas utilizada no teste de citotoxicidade foi a de fibroblastos de mamífero NCTC clone 929 (Figura 17). As células foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma) suplementado a 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (30 minutos a 56 º C), penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL). Para os experimentos, as células na fase pré-confluência foram colhidas com tripsina. Culturas de células foram mantidas a 37 º C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Para estudos in vitro de T. cruzi, cepas de parasito CL-B5 (clone CL-B5) foram usados (BUCKNER et al., 1996). Os parasitos estavelmente transfectados com o gene βgalactosidase de Escherichia coli (LacZ ) foram gentilmente cedidos pelo Dr. F. Buckner através da Universidad Complutense de Madrid (España). Formas epimastigotas (Figura 18) foram cultivadas a 28°C em infusão de fígado triptose (LIT) com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina e estreptomicina como descrito anteriormente (LE SENNE et al., 2002), e colhidos durante a fase de crescimento exponencial. Para o estudo da atividade leishmanicida in vitro, foi utilizado formas promastigotas (Figura 19) de L. braziliensis (MHOM/CO/88/UA301) a 26°C em Schneider’s (meio para inseto) suplementado a10% (v/v) de SBF inativado pelo calor, 2% de urina humana normal (v/v) mais penicilina e estreptomicina. 59 Figura 17: Fibroblastos de mamíferos NCTC-929 utilizados no teste de citotoxicidade Fonte: Centro para el Desarrollo de la Investigación Científica (Asunción, Paraguay). Figura 18: Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Fonte: Centro para el Desarrollo de la Investigacion Científica, Assuncion – Paraguai 60 Figura 19: Forma promastigota de Leishmania spp. Fonte: www.ufrgs.br/para-site/siteantigo/imagensatlas/protozoa/leishmania.htm; acesso em 15 de novembro de 2011. 4.5.3 Execução e leitura do ensaio de citotoxicidade O procedimento para a medição de viabilidade celular foi avaliada com resazurina por um método colorimétrico descrito anteriormente (RÓLON et al., 2006). Células clones NCTC 929 foram semeadas (3 x 104 ) em placas de microtitulação de fundo chato de 96 poços, com 100 µL de meio cultura RPMI 1640 por poço. As células foram cultivadas durante a noite a 37 º C e atmosfera de 5% de CO2. Posteriormente o meio foi substituído e o produto natural (extrato ou frações) foi adicionado em diferentes concentrações em 200 µL do meio por 24 h. Controles de crescimento também foram incluídos. Após a incubação, 20µL de solução resazurina a 2 mM foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 3 h para permitir condições ótimas de oxidação-redução e a redução da resazurina foi determinada por medida de absorbância do comprimento de onda a 490 e 595 nm em um leitor de microplacas. Cada concentração foi testada três vezes. Percentagens de citotoxicidade (% C) dos produtos naturais foram determinadas da maneira como segue: % C = [(A570 x 117,216 - A595 x 80,586) de amostras de teste / (A570 x 117,216 - A595 x 80,586) de controle)] x 100, onde, A570 e A595 representam os valores de meios de densidade 61 óptica a 570 e 595 nm, respectivamente, registrados para poços com células contendo diferentes doses do produto natural ou valor registrado para poços com células e sem produto natural (controla o crescimento positivo). Os valores 80,586 e 11,216 representam coeficientes de extinção molar para resazurina oxidada a 570 nm e 595 nm, respectivamente. 4.5.4 Ensaio de suscetibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi O ensaio de rastreamento foi realizado em placas de microdiluição de 96 poços (Sarstedt, Sarstedt, Inc.) com culturas que não atingiram a fase estacionária, como descrito por Vega et al. (2005). Epimastigotas foram semeadas a 1 x 105 por mililitro em 200 µL e as placas foram então incubadas com os produtos a 28°C por 72 horas, momento em que 50 µL de solução de CPRG foram adicionados para dar a concentração final de 200 µM. As placas foram incubadas a 37°C por mais 6h adicionais e então lidas a 595 nm em espectrofotômetro. O nifurtimox foi utilizado como droga de referência. Cada concentração foi testada em triplicata. Cada experimento foi realizado duas vezes separadamente. O percentual de inibição (%AE) foi calculado como segue: %AE = [(AE _ AEB)/(AC _ ACB)] x 100, onde AE = absorvância do grupo experimental; AEB = branco de compostos; AC = grupo controle de absorvância; ACB = branco de meio de cultura. As soluções dos produtos naturais a serem analisadas foram preparadas em dimetilsufóxido, com a concentração final uma mistura água/DMSO jamais excedendo 0.2% do solvente final. 4.5.5 Ensaio de suscetibilidade para as formas promastigotas de Leishmania brasiliensis O ensaio foi realizado usando o método desenvolvido por Mikus e Steverding (2000) com modificações. Formas promastigotas (2.5 x 105 parasitas/poço) foram cultivadas em placas de 96 poços de plástico. As amostras foram dissolvidas em dimetilsufóxido (DMSO). Diferentes diluições dos compostos de até 200 mL de volume final são adicionados. Após 48 h a 26 °C, 20 µL de solução de resazurina foi adicionado e a oxidação-redução foi quantificada a 570 a 595 nm Cada concentração foi testada em triplicata. Em cada ensaio foi utilizado como controle drogas de referência. As porcentagens antipromastigotas (%AP) formam calculadas. A eficácia de cada composto foi determinada. 62 4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE Para a avaliação da atividade antioxidante foi utilizado o método fotocolorimétrico do 2,2-difenil,1- picrihidrazila (DPPH), segundo Choi et al.(2002). Foi utilizado o extrato bruto e as frações nas concentrações de: 1 a 500 µg/mL em etanol (2,5 mL). A 2,5 mL de cada amostra, foi adicionado 1 mL da solução de DPPH 0,3 Mm. As soluções permaneceram no escuro em temperatura ambiente e após 30 minutos, foram feitas as leituras das absorbâncias em espectrofotômetro (Shimadzu- UV-1201) a 518 nm, onde o radical DPPH apresenta o máximo de absorção. Uma solução de DPPH (1 mL; 0,3 nM) em etanol (2,5 mL) foi usada como controle negativo e uma preparação de ácido ascórbico como padrão (controle positivo), em concentrações que variavam de 1 a 100 µg/mL. O etanol foi usado para zerar o espectrofotômetro, tendo como brancos as soluções testes de cada amostra (sem adição do DPPH), visando minimizar a interferência de componentes das amostras na leitura. O ensaio foi realizado em triplicata e o cálculo da atividade antioxidante seguiu a equação: %inibição = 100 – Abs amostra – Abs branco x 100 _____________________________ Abs controle Onde: Abs amostra é a absorbância das frações e do extrato bruto; Abs branco é a absorbância das frações e do extrato bruto sem adição do DPPH e Abs controle é a absorbância da solução de DPPH em etanol. Os testes foram realizados em duplicata com três repetições. Foi calculada a percentagem de inibição do radical DPPH e construído um gráfico de porcentagem de inibição versus a concentração do extrato e das frações. 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todas as análises foram realizadas em triplicata. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Diferenças foram estimadas por meio da análise de variância (ANOVA) seguida por teste de diferença significativa mínima (DSM). Valores de probabilidade inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. 63 RESULTADOS E DISCUSSÕES 64 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES O estudo realizado sobre as atividades biológicas de L. venustum originou oito trabalhos, entre estes, sete artigos e um capítulo de livro. Até o presente momento, dos sete artigos produzidos, um foi aceito e cinco já foram submetidos em revistas indexadas. Um dos sete artigos está em processo de tradução e logo será submetido. O capítulo do livro também já foi aceito. Estas produções estão apresentadas nos itens 5.1 a 5.8, bem como os comprovantes de aceite e submissão às referidas revistas e editora, aos quais foram encaminhadas. LISTA DE PRODUÇÕES 5.1 – Antimicrobial and Modulatory Activity of Ethanol Extract of the Leaves from Lygodium venustum SW. – Artigo submetido e aceito: American Fern Journal. 5.2 – Combating the multiresistance to antibiotics with natural products: additive effect of Lygodium venustum SW. with gentamicin – Artigo submetido: Clinical and Experimental Medicine. 5.3 – Evaluation of the interaction between aminoglycosides and natural products of Lygodium venustum SW. against Escherichia coli and Staphylococcus aureus clinically isolated – Artigo submetido: Chemoterapy. 5.4 – Atividade Modificadora da Ação de Aminoglicosídeos pela Fração Acetato de Etila de Lygodium venustum SW. – Artigo a ser submetido (em processo de tradução). 5.5 – Atividade antibacteriana, antifúngica e moduladora de frações obtidas de Lygodium venustum SW.– Artigo submetido: Revista Brasleira de Biociências. 5.6 – Avaliação da citotocixidade e atividade antiparasitária de Lygodium venustum SW contra Trypanosoma cruzi e Leishmania brasiliensis.– Artigo submetido: Boletim Latinoamericano Y Del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas. 5.7 – Anti-Leishmania, Anti- trypanosoma and cytotoxic activities of natural products from Lygodium venustum SW. (Lygodiaceae) – Artigo submetido: Journal of Biologically Active Products From Nature. 5.8 – Pteridófitas em evidência: etnobotânica e bioatividades farmacológicas – Capítulo de livro aceito e em processo de tradução. Será um dos capítulos da obra intitulada "Natural Products: Structure, Bioactivity and Applications", a ser editado pela Nova Science Publishers, Inc. 65 5.1 ANTIMICROBIAL AND MODULATORY ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF THE LEAVES FROM Lygodium venustum Sw. RESUMO A evolução dos sistemas de defesa de microorganismos tem levado a uma busca intensa por novos fármacos, sendo para isso testados vários produtos naturais. Lygodium venustum, uma samambaia trepadeira, teve sua atividade contra bactérias e fungos avaliada neste estudo. Foi realizada a prospecção química do extrato etanólico das folhas de L. venustum, detectando-se a presença de taninos, flavonóides e alcalóides. Utilizando o método da microdiluição em caldo, cepas bacterianas de Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa e cepas fúngicas de Candida albicans, C. krusei e C. tropicalis tiveram sua concentração inibitória mínima (CIM) avaliada, demonstrando ser ≥ 1024µg/mL. Utilizandose uma concentração sub-inibitória de 128µg/mL do EEFLV, seu potencial modulador de antibióticos foi testado frente a isolados clínicos multirresistentes de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa, tendo sido observado um significante sinergismo quando combinado a gentamicina, inclusive modificando o fenótipo da S. aureus de sensível para resistente. O extrato também potencializou o efeito da canamicina quando usado frente a S. aureus. Nesta concentração, não houve potencialização das drogas contra P. aeruginosa e cepas fúngicas testadas. Este foi o primeiro relato de atividade moduladora de antibiótico de uma pteridófita do gênero Lygodium. Palavras-chave - Lygodium venustum, microdiluição, antimicrobiano, modulador. 66 Antimicrobial and Modulatory Activity of Ethanol Extract of the Leaves from Lygodium venustum SW. Maria F. B. Morais-Braga1, Teógenes M. Souza1, Karla K. A. Santos1, Jacqueline C. Andrade1, Gláucia M. M. Guedes1, Saulo R. Tintino1, Celestina E. Sobral-Souza1, José G. M. Costa2, Irwin R. A. Menezes3, Antonio A. F. Saraiva4, Henrique D. M. Coutinho1 1 Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, Research, 3 2 Laboratory of Natural Products Laboratory of Molecular Pharmacology and Chemistry, 4 Laboratory of Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, Brazil. * Corresponding author: Maria Flaviana B. Morais-Braga Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. [email protected] Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: 67 ABSTRACT The evolution in microorganism defense systems has led to intensive searches for new drugs, extracted from various natural products. This study evaluated the antibacterial and antifungal activity of Lygodium venustum, a climbing fern. A phytochemical screening was performed using ethanol extract from leaves of L. venustum, detecting the presence of tannins, flavonoids and alkaloids. The minimal inhibitory concentration (MIC) of Escherichia coli, Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. krusei and C. tropicalis was evaluated using the microdilution method, resulting in concentrations ≥ 1024µg/mL. Using a subinhibitory concentration of 128µg/mL of EELLV, the modulatory potential of the extract was tested against multidrug-resistant clinical isolates, resulting in synergism when combined with Gentamicin and actually altering the phenotype of S. aureus from sensitive to resistant. The extract also potentiated the effect kanamycin against S. aureus. This was the first report of modulatory antibiotic activity by a Lygodium genus fern. Keywords – Lygodium venustum, microdilution, antimicrobial, modulator. INTRODUCTION Microbial infectious diseases have prompted the development of studies to understand their drug resistance mechanisms and the creation of drugs to avoid these defenses. Infection by Staphylococcus aureus is among the most common problems in hospitals due to its resistance against several antibiotics. Pseudomonas aeruginosa is the cause of nosocomial infections, particularly in people with cystic fibrosis. Escherichia coli is commonly found in the intestinal tract, but certain strains have been closely linked to serious urinary tract infections and diarrhea (Tortora et al., 2008). Klebsiella pneumonia, although confined to the normal flora, has emerged as an important hospital pathogen capable of causing severe morbidity and mortality in pediatric patients (Pfaller et al., 1998). Strains of Candida have concerned the medical community due to their role in high-morbidity and mortality infections, particularly in immunocompromised patients (Richardson and Lass-Florl, 2008; Coutinho, 2009). Through natural selection plants have developed several mechanisms against parasitism and herbivory. The production of defensive chemical compounds, such as secondary metabolites, indicates evolutionary adaptive responses from the pressure caused by 68 these ecological relationships (Rhodes, 1994). Products derived from plants that feature antimicrobial properties or the ability to improve the antimicrobial potential of existing drugs play an important role in battling infectious diseases (Coutinho et al., 2009). They can serve as alternative therapeutic agents with the ability to directly counter natural microbial resistance to drugs. Lygodium venustum is a fern with a pantropical distribution used as a bioindicator of degraded environments (Mehltreter, 2006). This fern is used as a medicinal plant in Latin America due to its antifungal, trichomonacidal, antidiarrheal, anti-inflammatory and analgesic activity (Duke and Ottesen, 2009; Argueta et al., 1994). It is used in the Peruvian Amazon as an adaptogen and as an ingredient of the sacred beverage “ayahuasca” (Rivier and Lidgren, 1972). Few studies have reported on the bioactivity of L. venustum in preclinical studies (Alanis et al., 2005; Calzada et al., 2007; Calzada et al., 2010), as is true in others ferns (Xavier, 2007). In this work, a phytochemical screening was performed on the ethanol extract from leaves of L. venustum; its antimicrobial activity was assayed against bacterial and fungal strains, as well the modulatory potential against aminoglycosides and antifungal drugs. MATERIAL AND METHODS Plant Material Leaves of L. venustum were collected in the city of Crato, Ceará, Brazil. The plant was identified by Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva and voucher specimens were deposited at the Herbarium Caririense Dárdano de Andrade-Lima of the Regional University of Cariri – URCA, under number 5569 HCDAL. Preparation of Ethanol Extract from Leaves of L. venustum (EELV) The leaves were partially milled and 211.18 g of powdered material was extracted by maceration using 1 L of 95% ethanol as solvent at room temperature. The mixture was allowed to stand for 72 h at room temperature. The extract was then filtered and concentrated under vacuum in a rotary evaporator at 60 ºC and 760 mm/Hg, yielding 103.9 g (Brasileiro et al., 2006). 69 Phytochemical characteristics The phytochemical assays were used for the qualitative analysis of the presence of secondary metabolites. The detection tests to evaluate the presence of heterosides, saponins, phenols, tannins, flavonoids, steroids, triterpenes, coumarins, quinones, organic acids and alkaloids were performed according to the method described by Matos (1997). The tests are based on the visual observation of color modifications and formation of precipitate after the addition of specific reagents. Microbial strains The bacteria used in the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) test were the standard strains of E. coli ATCC25923, S. aureus ATCC10536, P. aeruginosa ATCC15442 and K. pneumonia ATCC4362. The antifungal assays used standard strains of Candida albicans ATCC40006, C. krusei ATCC2538 and C. tropicalis ATCC40042. To evaluate the modulatory activity of the extract, the following multi-resistant bacterial strains were used, isolated from clinical environments: P. aeruginosa 03, E. coli 27 and S. aureus 358, with the resistance profile demonstrated in Table 1 and the same fungal strains used in the MIC test. All strains were obtained from the Laboratory of Clinical Mycology – UFPB. Drugs The drugs used in the tests were the aminoglycosides kanamycin, amikacin, neomycin and gentamicin, and antifungals mebendazole, amphotericin B, nystatin and benzoyl metronidazole (Sigma Co., St. Louis, USA). All drugs were diluted in sterile water. Minimal Inhibitory Concentration Broth microdilution was the method used. The EELV solution was dissolved using DMSO and diluted to 1024 µg/mL using sterile distilled water. The bacterial inoculum was diluted using BHI to a final concentration of 105 CFU/mL. A total of 100 µL of each inoculum was distributed in each well of a microtiter plate with 96 wells, and then submitted to a twofold serial dilution using 100 µL of the extract, with concentrations ranging between 8 and 512 µg/mL. The plates were incubated for 24 hours at 35 ºC (Javadpour et al., 1996). 70 Bacterial MIC was determined using resazurin, while the MIC of fungi was determined by turbidity. The MIC was defined as the lowest concentration where no growth can be observed, according to NCCLS (2008). Drug Modulation Test To observe whether the extract would alter the action of antimicrobial drugs against the tested strain, the method proposed by Coutinho et al. (2008) was used. The EELV was tested at a sub-inhibitory concentration (MIC/8 = 128 µg/mL). A 100 µL sample of a solution containing BHI, the microbial inoculums and extract were placed in each well. After this, 100 µL of the antimicrobial drug was mixed with the first well, following the twofold dilution. Concentrations of aminoglycosides and antifungals ranged between 2.44 and 2500 µg/mL and 2 to 512 µg/mL, respectively. RESULTS The phytochemical characterization showed the presence of phenols, tannins, flavonoids and alkaloids, as shown in Table 2. The antibacterial and antifungal assays of EELV did not demonstrate clinically relevant results, with MICs ≥1024 µg/mL. However, when the modifying activity of EELV against aminoglycosides was evaluated, the Gram-negative E. coli 27 and Gram-positive S. aureus 358 strains showed synergistic activity when combined with gentamicin and kanamycin (Table 3). The combination of the extract with antifungals did not show any modulatory activity against strains of Candida. DISCUSSION Several plants used in the religious beverage “ayahuasca”, such as L. venustum, contain alkaloids (Rivier and Lidgren, 1972). This fact is corroborated by the results of our phytochemical screening. Other species from the genus Lygodium have been the subjects of more detailed chemical studies, including the isolation of some compounds (Zhang et al., 2005; Kurumatani et al., 2001; Achari et al., 1986). However, this is the first work to focus on the chemical composition of L. venustum. 71 The lack of the antibiotic activity of L. venustum against strains of E. coli was verified in another report (Alanis et al., 2005). The results demonstrate that the extracts were not efficient inhibitors of bacterial growth, as their inhibition percentages were lower than 50%. A relevant note regarding this research is the value of the extract concentration used in the test, 8 mg, which is considered high for clinical applications (Houghton et al., 2007), as demonstrated in our work. Additionally, it is important to note that the microdilution method used in present study is currently the preferred technique to evaluate antimicrobial activity, compared to other methodologies using agar diffusion (Greger and Hadacek, 2000). The methanol extracts of other plants from the genus Lygodium such as Lygodium japonicum (Thumb.) SW. was tested against strains of P. aeruginosa, S. aureus, E. coli and C. albicans using the disk diffusion method, impregnated with 40 µg of dried plant material/disk, but no bioactivity was demonstrated (Taylor et al., 1995). Our results corroborate those obtained in this work by Taylor et al. (1995). Compared with the isolated action of drugs, EELV increased the antibiotic activity of amikacin against S. aureus. When associated with gentamicin, it demonstrated a very promising modulatory activity against E. coli and S. aureus, causing a reversal of the resistant phenotype of this strain to sensitive according to the classification of NCCLS (2005). The observed bioactivity of the extract in combination with the antibiotics may indicate that secondary metabolites such as tannins, flavonoids and alkaloids –all secondary metabolites with well-known antimicrobial activity and found in the EELV– could be acting in association with the assayed drugs, enhancing the activity of these drugs at lower concentrations (Scalbert, 1991; Bylka, et al., 2004; Zongo et al., 2009). This is the first report on the modulatory activity against aminoglycosides by a fern. This activity indicates the possibility of development of new drugs derived from the association between natural products isolated from L. venustum with antibiotics, to be used in antibiotic therapy against multi-drug resistant bacteria, as well as prevent the emergence of drug resistant bacteria. LITERATURE CITED ACHARI, B., BASU, K., SAHA, C. R. AND S. C. PAKRASHI. 1986.A New Triterpene Ester, an Anthraquinone and Other Constituents of the Fern Lygodium flexuosum. Plant Med; 52:329-30. 72 ALANIS, A. D., CALZADA, F., CERVANTES, J. A. AND G.M. CEBALLOS. 2005. Antibacterial properties of some plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of gastrointestinal disorders. Journal of Ethnopharmacology 100:153-157. ARGUETA, A., CANO, L. AND M. RODARTE. 1994. Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana, vol. I–III. Instituto Nacional Indigenista, Mexico City. BRASILEIRO, B. G., PIZZIOLO, V. R, RASLAN, D. S., JAMAL, C. M. AND D. SILVEIRA. 2006. Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district. Braz. J. Pharm. Sci. 42: 195-202. BYLKA, W., MATLAWSKA, I. AND N. A. PILEWSKI. 2004. Natural flavonoids as antimicrobial agents. JANA 7:24-31. CALZADA, F., LILIAN, Y. M. AND A. T. CONTRERAS. 2007. Effect of Mexican medicinal plant used to treat trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites. Journal of Ethnopharmacology 113:248–251. CALZADA, F., ARISTA, R. AND H. PÉREZ. 2010. Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats. Journal of Ethnopharmacology 128:49–51. COUTINHO, H. D. M., COSTA, J. G. M., LIMA, E. O., FALCÃO-SILVA, V. S. AND J. P. SIQUEIRAJÚNIOR. 2008. Enhancement of the Antibiotic Activity against a Multiresistant Escherichia coli by Mentha arvensis L. and Chlorpromazine. Chemotherapy 54:328– 330. COUTINHO, H. D. M. 2009. Factors Influencing the Virulence of Candida Spp. West Indian Med J 58 (2):160. COUTINHO, H. D. M., COSTA, J. G. M., LIMA, E. O., FALCÃO-SILVA, V. S. AND J. P. SIQUEIRAJÚNIOR. 2009. Increasing of the Aminoglicosyde Antibiotic Activity Against a Multidrug-Resistant E. coli by Turnera ulmifolia L. and Chlorpromazine. Biol Res Nurs 11:332-335. DUKE, J. A. 2009. Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. 2008. New York: CRC Press Taylor & Francis group. 832 p. GREGER, H. AND F. HADACEK. 2000. Testing of arttifungal natural products: Methodologies, comparability of results and assay choice. Phytochemical Analysis 11:137-147. HOUGHTON, P.J., HOWES, M.J., LEE, C. C. AND G. STEVENTON. 2007. Uses and abuses of in vitro tests in ethnopharmacology: Visualising an elephant. J Ethnopharmacol 110:391400. 73 JAVADPOUR, M. M., JUBAN, M. M., LO, W.C., BISHOP, S. M., ALBERTY, J. B., COWELL, S. M., BECKER, C. L. AND M. L. MCLAUGHLIN. 1996. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J Med Chem 39:107–3113. KURUMATANI, M., YAGI, K., MURATA, T., TEZUKA, M., MANDER, L. N., NISHIYAMA, M. AND H. YAMA. 2001. Isolation and identification of antheridiogens in the ferns, Lygodium microphyllum and Lygodium reticulatum. Biosci Biotechnol Biochem 65(10):2311-4. MATOS, F.J.A. 1997 Introdução à Fitoquímica Experimental. 2ª Ed. Fortaleza: Ed. UFC. MEHLTRETER, K. 2006. Leaf Phenology of the Climbing Fern Lygodium venustum in a Semideciduous Lowland Forest on the Gulf of Mexico. American Fern Journal 96(1):21–30. NCCLS, 2005. National Comitte for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: Approved standard, 6th ed. NCCLS document M7-A6. Wayne: National Committee for Clinical Laboratory Standards. PFALLER, A. M., JONES, R. N., DOERN, G. V. AND K. KUGLER. 1998. Bacterial pathogens isolated from patients with bloodstream infection: frequencies of occurrence and antimicrobial susceptibility patterns from the SENTRY antimicrobial surveillance program (United States and Canada, 1997). Antimicrob Agent Chemother 42:1762-70. RHODES, M. J. C. 1994. Phisicological roles for secondary metabolites in plants: from progress, many outstanding problems. Plant Mol. Biol 24:1-20. RICHARDSON, M. AND C. LASS-FLORL. 2008. Changing epidemiology of systemic fungal infections. Clinical Microbiology and Infection 14:5-24. RIVIER, L. AND J. E. LIDGREN. 1972. “Ayahuasca: the South American hallucinogenic drink. An ethnobotanical and chemical investigation”. Economic Botany 26(2):101-129. SCALBERT, A. 1991. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry 30:3875-83. TAYLOR, R. S., MANANDHAR, N. P. AND G. H. N. TOWERS. 1995. Screening of selected medicinal plants of Nepal for antimicrobial activities. Journal of Ethnopharmacology 46:153-159. TORTORA, G. J., FUNKE, B. R. AND C. L. CASE. 2008. Microbiologia, 8ª ed. Porto Alegre, Artmed. XAVIER, S. R. S. 2007. Pteridófitas da Caatinga: Lista anotada, Análise da Composição Florística e Padrões de Distribuição Geográfica. 147 p. Tese (Doutorado em Botânica) - Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife. 74 ZHANG, L. H., YIN, Z. Q., YE, W. C., ZHAO, S. X., WANG, L. AND F. HU. 2002. Studies on the chemical constituents in herb of Lygodium japonicum. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 30(19):1522-4 ZONGO, C., AKOMO, E. F. O., SAVADOGO, A., OBAME, L. C., KOUDOU, J. AND A. S. TRAORE. 2009. In vitro antibacterial properties of total alkaloids extract from Mitragyna inermis (Willd.) O. Kuntze, a West African traditional medicinal plant. Asian J. Plant Sci. 8: 172-177. Table 1. Bacterial source and antibiotic resistance profile. Bacteria Source Antibiotic resistance Escherichia coli 27 Surgical wound Ast, Amx, Ami, Amox, Ca, Cfc, Cf, Caz, Cip, Clo, Im, Can, Szt, Tet, Tob Staphhylococcus aureus 358 Surgical wound Oxa, Gen, Tob, Ami, Can, Neo, Para, But, Sis, Net Pseudomonas Aeruginosa 03 Urine culture Cpm, Ctz, Imi, Cip, Ptz, Lev, Mer, Ami Ast-Aztreonam; Amx-Amoxacillin; Amp-Ampicillin; Ami-Amicilina; Amox-Amoxillin, Ca-Cefadroxil; Cfccefaclor; Cf-Cephalothin; Caz-Ceftazinidima; Cip-Ciprofloxacin; Clo-ChlorampKenicol; Imi-Imipenem; CanCanamycin; Szt-Sulfametrim; Tet-Tetracycline; Tob-Tobramycin; Oxa-Oxacillin; Gen-Gentamicin; NeoNeomycin; Para- Paramomicina; But-Butirosina; Sis-Sisomicin; Net-Netilmicin; Com-Cefepime; Ctz- Ceftazidime; Ptz-Piperacilina-tazobactam; Lev-Levofloxacina; Mer-Merpenem. Table 2. Phytochemical characterization of Ethanol Extract of L. venustum. METABOLITES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 + - + - - + + + + - + - - + + 1 – Phenols; 2 – Tannin pyrogallates; 3 – Tannin Phlobaphenes; 4 – Anthocyanidins; 5 – Anthocyanins; 6 – Flavones; 7 – flavonols; 8 – Xanthones; 9 – Chalcones; 10 – Aurones; 11 – Flavononls; 12 – Leucoanthocyanidins; 13 – Catechins; 14 – Flavonones; 15 – Alkaloids; (+) presence; (-) absence. 75 Table 3. Antibacterial activity modulating the ethanol extract from leaves of Lygodium venustum (μg/mL). Modulation of antibiotic for EELV E. coli 27 S. aureus 358 Extract/ Antibiotic MIC combined MIC alone MIC combined MIC alone EELV + Kanamycin 156.25 156.25 39.06 156.25 EELV + Amikacin 312.5 312.5 78.125 78.125 EELV + Neomycin 156.25 156.25 39.06 39.06 EELV + Gentamicin 39.06 1250 2.44 19.53 EELV: ethanol extract of L. venustum; MIC: Minimal Inhibitory Concentration 76 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo foi submetido à revista American Fern Journal para apreciação e foi aceito para publicação no ano de 2012 (volume 102). Re: Response on the review of Article DE: Geiger, Jennifer PARA: Maria Flaviana Bezerra Morais Braga Terça-feira, 31 de Janeiro de 2012 22:24 Dear Maria Flaviana Bezerra Morais , Thank you for your email. Your article has been accepted for publication in the American Fern Journal and is scheduled to be published in the second issue of volume 102. Please let me know if you need a letter that is more official than this email. Best wishes, Jennifer Jennifer Geiger, Ph.D. Editor in Chief, American Fern Journal. Department of Natural Sciences. Carroll College Helena, MT 59625. [email protected]; [email protected] 406-447-4461 77 5.2 COMBATING THE MULTIRESISTANCE TO ANTIBIOTICS WITH NATURAL PRODUCTS: ADDITIVE EFFECT OF Lygodium venustum SW. WITH GENTAMICIN. RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar as interações entre gentamicina e o extrato etanólico (EELV) da samambaia Lygodium venustum SW. Foram identificados os fitoconstituintes do extrato etanólico obtido de Lygodium venustum e o EELV foi analisado pelo método checkerboard com gentamicina contra duas cepas de bactérias multirresistentes aos antibióticos. A atividade antibiótica de gentamicina, quando associada ao extrato, foi reforçada de uma forma aditiva contra ambas as linhagens. Os resultados indicaram que L. venustum pode ser uma fonte de metabólitos secundários para serem usados em associação com antibióticos como aminoglicosídeos na quimioterapia contra bactérias resistentes aos antibióticos. Palavras-chave: Lygodium venustum, extrato etanólico, método checkeboard, gentamicina. 78 Combating the multiresistance to antibiotics with natural products: additive effect of Lygodium venustum SW. with gentamicin Maria F. B. Morais-Bragaa, Teógenes M. Souzaa, Karla K. A. Santosa, Gláucia M. M. Guedesa, Jaqueline C. Andradea, Saulo R. Tintinoa, Celestina E. Sobral-Souzaa, José G. M. Costab, Antonio A. F. Saraivac, Henrique D. M. Coutinhoa* a Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, bLaboratory of Natural Products Research, cLaboratory of Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, Brazil. Running title: Lygodium venustum and gentamicin * Corresponding author: Henrique Douglas Melo Coutinho Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. [email protected] Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: 79 Abstract The aim of this work was evaluate the interactions between gentamicin and the ethanol extract of the fern Lygodium venustum SW (EELV). The ethanol extract of Lygodium venustum was obtained, the phytocompounds were identified and the EELV was assayed by the checkerboard method with gentamicin against two bacterial strains multiresistant to antibiotics. The antibiotic activity of gentamicin, when associated with the extract, was enhanced in a additive manner against both strains. The results indicated that L. venustum can be a source of secondary metabolites to be used in association with antibiotics as aminoglycosides in the antibiotic chemotherapy against resistant bacteria. Keywords: Lygodium venustum, ethanol extract, checkerboard method, gentamicin. Introduction Lygodium venustum SW. Is a fern that belongs to the Lygodiaceae family, commonly found in the Latin America. This fern is used in the traditional medicine to the treatment of dermatosis, infections, mycosis, thricomoniasis and other diseases [1,2]. This plant was pharmacologically assayed against gastric diseases and antibacterial activity [3,4]. Recently, many natural products had been tested to verify not only the antibacterial activity, but also the modulatory antibiotic activity as a strategy to combat bacterial pathogens with drugs multiresistance [5]. Many researches about this topic had been developed because the growing problems associated with the loss of the activity of drugs used in the bacterial chemotherapy due the bacterial mechanisms of resistance [6-8]. The aim of this work was evaluate the interactions between the ethanol extract of L. venustum (FAELV) with gentamicin by the checkerboard method. Materials and Methods Plant Material Leaves of L. venustum were collected in the Crato county, Ceará, Brazil. The plant amterial was identified by Dr. Álamo Feitosa Saraiva and a voucher specimen was deposited with the number #5569 HCDAL in the “Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima”, at URCA. 80 Obtention of the Ethanol extract of Lygodium venustum (EELV) 211.18 g of leaves were dried and keeped at room temperature. The powdered material was extracted by maceration using 1 L of 95% ethanol as solvent at room temperature. The mixture was allowed to stand for 72 h at room temperature. The extract was then filtered and concentrated under vacuum in a rotary evaporator under 60ºC and 760mm/Hg of temperature and pressure, respectively. 950 g of aerial parts yielded 50g of ethanol extract. The EELV was dilluted using DMSO and sterile water to obtain a concentration of 1024 µg/mL. Phytochemical prospection The phytochemical assays were used for the qualitative analysis of the presence of secondary metabolites. The detection tests to evaluate the presence of heterosides, saponines, tannins, flavonoids, steroids, triterpens, cumarins, quinones, organics acids and alkaloids were performed allowing the method described for Matos [9]. The tests are based in the visual observation of color modifications and formation of precipitate after the addition of specific reagents (Table 1). Bacterial strains The strains used in this work were the multiresistant clinical isolates Staphylococcus aureus 358 and Escherichia coli 27 (Table 2). The strains were obtained from the Clinical Mycology Laboratory, UFPB, Brazil. All strains were maintained in Heart Infusion Agar slants (HIA; Difco), and prior to the assays, the cells were grown for 24 h at 37°C in Brain Heart Infusion (BHI, Difco). Drugs Gentamicin, amikacin and neomycin were obtained from SIGMA. All drugs were dissolved in sterile water. Checkerboard Method The strains and the interactions between EELV and antibiotics were tested by the microdilution checkerboard technique [10]. Suspensions of 105 CFU/mL of bacterial culture were prepared and distributed into microtiter trays containing varying concentrations of the different drugs. The inoculated trays were incubated at 37°C for a period of 24 h, and then evaluated for bacterial growth. In order to evaluate the activity of combinations of drugs, fractional inhibitory concentration (FIC) indices were calculated as FIC A + FICB, where FICA 81 and FICB represent the minimum concentrations that inhibited the bacterial growth for drugs A and B, respectively: FICA = MICA combination/ MICA alone and FICB = MICB combination/MICB alone. A mean FIC index was calculated based on the following equation: FICA + FICB, and the interpretation made as follows: synergistic (< 0.5), additive (0.5-1.), indifferent (> 1), or antagonistic (> 4). Results and Discussion When assayed alone, the EELV had not show any clinically relevant antibacterial activity. However, when the extract was associetd with the gentamicin, was observed an additive effect with FIC índex = 0.5 against both bacterial strains (tabela 3). This result indicates that the EELV and gentamicin, using low concentrations and acting together against the bacteria affected several and different targets in the same moment, affecting the resistance mechanism against the antibiotic. This effect was identified in the Gram positive and negative strains, indicating a putative similar target in both strains. Due this fact, a possible mechanism involved in this additivity could be associated with the interaction of the non – polar phytocompounds from EELV as flavonids, tannins and terpenes with the cell membrane, enhancing the permeability to the antibiotic by alterations on the membrane fluidity. This process is calle herbal shotgun or synergistic multi-target effects [11]. Some studies have demonstrated the synergism between several natural products obtained from plants and animals when associetd with drugs used in the antibacterial chemotherapy [12,13]. However, this is the first report about the use of natural products isolated from ferns with this aim, demonstrating this activity. These interesting results demonstrate that the Ethanol extract of L. Venustum is a source of secondary metabollites with antimicrobial potential that could be used in the antibacterial therapy against pathogenic microorganisms with multiresistance to antibiotics in association with antibiotics, as gentamicin. Conflict of interest statement The authors declare that they have no conflict of interest related to the publication of this manuscript. 82 References 1. Shlaes DM, Gerding DN, John Jr JF, Craig WA, Bornstein DL, Duncan RA (1997) SHEA Position Paper. Society for Healthcare Epidemiology of America and Infectious Diseases Society of America Joint Committee on the Prevention of Antimicrobial Resistance: Guidelines for the Prevention of Antimicrobial Resistance in Hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol 18: 275-291. 2. Duke JA (2008) Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. CRC Press Taylor & Francis group. 3. Calzada F, Lilian YM, Contreras, AT (2007) Effect of Mexican medicinal plant used to treat trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites. J Ethnopharmacol 113: 248-251. 4. Calzada F, Arista R, Pérez H (2010) Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats. J Ethnopharmacol 128: 49-51. 5. Hemaiswarya SH, Kruthiventi AK, Doble M (2008) Synergism between natural products and antibiotics against diseases. Phytomedicine 15: 639-652. 6. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima EO, Siqueira-Júnior JP (2010) Additive effects of Hyptis martiusii Benth with aminoglycosides against Escherichia coli. Indian J Med Res 131:106-108. 7. Coutinho HDM, Vasconcellos A, Lima MA, Almeida-Filho GG, Alves RRN (2009) Termite usage associated with antibiotic therapy: enhancement of aminoglycoside antibiotic activity by natural products of Nasutitermes corniger (Motschulsky 1855). BMC Complem Alt Med 9:35. 8. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Junior JP (2009) In vitro interference of Momordica charantia in the resistance to aminoglycosides. Pharma Biol 47:1056-1059. 9. Matos FJA (1997) Introdução à Fitoquímica Experimental. 2nd Ed. Ed. UFC. 10. Eliopoulos GM, Moellering RC (1991) Antimicrobial combinations. In: Lorian V, editor. Antibiotics in laboratory medicine. Williams & Wilkins, Baltimore. 11. Coutinho HDM, Costa JGM, Falcão-Silva VS, Siqueira-Júnior JP, Lima EO (2010) Potentiation of Antibiotic Activity by Eugenia uniflora and Eugenia jambolanum. J Med Food 13: 1024-1026. 12. Coutinho HDM, Vasconcellos A, Lima MA , Almeida-Filho GG, Alves RRN (2009) Termite usage associated with antibiotic therapy: enhancement of aminoglycoside antibiotic activity by natural products of Nasutitermes corniger (Motschulsky 1855). BMC Complement Altern Med 9: 35. 13. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima E O, Falcão-Silva VS, Siqueira-Junior JP (2010) Increasing of the Aminoglicosyde Antibiotic Activity Against a Multidrug-Resistant E. coli by Turnera ulmifolia L. and Chlorpromazine. Biol Res Nurs 11: 332-335. 83 Tabela 1. Phytochemical prospection of the ethanol extract from Lygodium venustum SW. METABOLLITES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 + - + - - + + + - - + - - + + 1)phenols; 2) tannin pyrogallates; 3) tannin phlobaphenes; 4) anthocyanins; 5) anthocyanidins; 6) flavones; 7) flavonols; 8) xanthones; 9) chalcones; 10) aurones; 11) flavononols; 12) leucoanthocyanidins; 13) catechins; 14) flavonones; 15) alkaloids; 16) terpenes. Table 2. Origin of bacterial strains and resistance to antibiotics. Bacteria Origin Resistance Escherichia coli 27 Surgical Ast, Amx, Amp, Ami, Amox, Ca, Cfc, wound Cf, Caz, Cip, Clo, Im, Can, Szt, Tet, Tob Staphylococcus aureus 358 Surgical Oxa, Gen, Tob, Ami, Can, Neo, Para, wound But, Sis, Net Ast - Aztreonan; Amx - amoxicillin, Amp - ampicillin; Ami - Amikacin; Amox - Amoxicillin, Ca - Cefadroxil; Cfc - Cefaclor; Cf - Cephalothin; Caz - Ceftazidime, CIP - Ciprofloxacin; Chl - Chloramphenicol; Im Imipenem; Can - Kanamycin; SZT - sulphametrim, Tet - tetracycline; Tob - tobramycin; Oxa - Oxacillin; Gen gentamicin; Neo - neomycin; To - Paramomicina; But - Butirosin; Sis - sisomicin; Net – Netilmicin. Table 3. Minimal inhibitory concentration (MIC) of gentamicin and the combinatory effect of ethanol extract of Lygodium venustum (EELV) against bacterial isolates multiresistant to antibiotics. Natural Product + Escherichia coli 27 Staphylococcus aureus 358 Antibiotics MIC (µg/mL) FIC índex MIC (µg/mL) FIC index EELV ≥ 1024 - ≥ 1024 - Gentamicin 39.06 - 39.06 - 4.88/19.53 0.5 (add) 4.88/19.53 0.5 (add) EELV + Gentamicin FIC – Fractional Inhibitory Concentration; Syn – Synergism; Add – Additivity. 84 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo foi submetido à revista Clinical and Experimental Medicine (CEM) para apreciação e aguarda parecer. ---------- Forwarded message ---------From: Clinical and Experimental Medicine (CEM) <[email protected]> Date: 2011/11/10 Subject: CEM: Submission Confirmation To: Henrique Coutinho <[email protected]> Dear Prof. Henrique Coutinho, Thank you for submitting your manuscript, Combating the multiresistance to antibiotics with natural products: additive effect of Lygodium venustum SW. with gentamicin, to Clinical and Experimental Medicine. During the review process, you can keep track of the status of your manuscript by accessing the following web site: http://cem.edmgr.com/ Your username is: [email protected] Your password is: coutinho54438 Should you require any further assistance please feel free to contact the Editorial Office by clicking on the "contact us" in the menu bar to send an email to us. Alternatively, please call us at +91 44 42197752 anytime between 9.00 - 17.00 hrs IST/5.00 13.00 hrs CET. With kind regards, Springer Journals Editorial Office Clinical and Experimental Medicine 85 5.3 EVALUATION OF THE INTERACTION BETWEEN AMINOGLYCOSIDES AND NATURAL PRODUCTS OF Lygodium Venustum SW. AGAINST Escherichia Coli AND staphylococcus aureus CLINICALLY ISOLATED RESUMO Contexto: O objetivo deste trabalho foi avaliar as interações entre aminoglicosídeos e a fração acetato de etila (FAELV) da samambaia Lygodium venustum SW.. Método: A fração acetato de etila foi obtida a partir do extrato etanólico da samambaia L. venustum SW e foi ensaiado com aminoglicosídeos pelo método checkerboard contra duas cepas bacterianas multirresistentes a antibióticos. Resultados: A atividade antibiótica de todos os antibióticos, quando associados com a fração acetato de etila foram melhoradas de forma aditiva, exceto a associação entre a fração e a amicacina que mostrou um sinergismo Escherichia coli. Conclusão: Os resultados indicam que L. venustum pode ser uma fonte de metabólitos secundários para serem usados em associação com antibióticos aminoglicosídeos na quimioterapia contra bactérias resistente aos antibióticos. Palavras-chave: Lygodium venustum, fração acetato de etila, método checkeboard. 86 Evaluation of the interaction between aminoglycosides and natural products of Lygodium venustum SW. against Escherichia coli and Staphylococcus aureus clinically isolated M.F.B. Morais-Bragaa, T.M. Souzaa, K.K.A. Santosa, G.M.M. Guedesa, J.C. Andradea, S.R. Tintinoa, C.E. Sobral-Souzaa, J.G.M. Costab, A. Nogarad, R. A. Saraivad, A.A.F. Saraivac, H.D.M. Coutinhoa* a Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, bLaboratory of Natural Products Research, cLaboratory of Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, CE, Brazil; d Laboratory of Biochemistry toxicological, Federal University of Santa Maria, RS, Brazil. Running title: Lygodium venustum and aminoglycosides * Corresponding author: Henrique Douglas Melo Coutinho Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. [email protected] Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: 87 Abstract Background: The aim of this work was evaluate the interactions between aminoglycosides and the ethyl-acetate fraction of the fern Lygodium venustum SW (EAFLV) Methods: The ethyl-acetate fraction was obtained from the ethanol extract of Lygodium venustum SW and was assayed by the checkerboard method associated with aminoglycosides against two bacterial strains multiresistant to antibiotics Results: The antibiotic activity of all antibiotics, when associated with the ethyl-acetate fraction, were enhanced in a additive manner, except the association between the fraction with amikacin, that showed a synergistic interaction against the E. coli strain Conclusions: The results indicated that L. venustum can be a source of secondary metabolites to be used in association with antibiotics as aminoglycosides in the antibiotic chemotherapy against resistant bacteria. Keywords: Lygodium venustum, ethyl-acetate fraction, checkerboard method, aminoglycosides. Introdução Lygodium venustum SW. Is a fern that belongs to the Lygodiaceae family, commonly found in the Latin America. This fern is used in the traditional medicine to the treatment of dermatosis, infections, mycosis, thricomoniasis and other diseases [1-4]. This plant was pharmacologically assayed against gastric diseases and antibacterial activity [5-7]. Recently, many natural products had been tested to verify not only the antibacterial activity, but also the modulatory antibiotic activity as a strategy to combat bacterial pathogens with drugs multiresistance [8-11]. Many researches about this topic had been developed because the growing problems associated with the loss of the activity of drugs used in the bacterial chemotherapy due the bacterial mechanisms of resistance [12-15]. The aim of this work was evaluate the interactions between the ethyl-acetate fraction of L. venustum (FAELV) with aminoglycosides by the checkerboard method. Materials and Methods Plant Material Leaves of L. venustum were collected in the Crato county, Ceará, Brazil. The plant amterial was identified by Dr. Álamo Feitosa Saraiva and a voucher specimen was deposited 88 with the number #5569 HCDAL in the “Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima”, at URCA. Obtention of the Ethyl-acetate fraction of Lygodium venustum (EAFLV) 211.18 g of leaves were dried and keeped at room temperature. The powdered material was extracted by maceration using 1 L of 95% ethanol as solvent at room temperature. The mixture was allowed to stand for 72 h at room temperature. The extract was then filtered and concentrated under vacuum in a rotary evaporator under 60ºC and 760mm/Hg of temperature and pressure, respectively. 950 g of aerial parts yielded 50g of ethanol extract. 40 g of the ethanol extract was fractionated with ethyl-acetate producing 0,56 g of ethyl-acetate fraction (EAFLV). The EAFLV was dilluted using DMSO and sterile water to obtain a concentration of 1024 µg/mL. Bacterial strains The strains used in this work were the multiresistant clinical isolates Staphylococcus aureus 358 and Escherichia coli 27 (Table 1). The strains were obtained from the Clinical Mycology Laboratory, UFPB, Brazil. All strains were maintained in Heart Infusion Agar slants (HIA; Difco), and prior to the assays, the cells were grown for 24 h at 37°C in Brain Heart Infusion (BHI, Difco).. Drugs Gentamicin, amikacin and neomycin were obtained from SIGMA. All drugs were dissolved in sterile water. Checkerboard Method The strains and the interactions between EAFLV and antibiotics were tested by the microdilution checkerboard technique [16]. Suspensions of 105 CFU/mL of bacterial culture were prepared and distributed into microtiter trays containing varying concentrations of the different drugs. The inoculated trays were incubated at 37°C for a period of 24 h, and then evaluated for bacterial growth. In order to evaluate the activity of combinations of drugs, fractional inhibitory concentration (FIC) indices were calculated as FICA + FICB, where FICA and FICB represent the minimum concentrations that inhibited the bacterial growth for drugs A and B, respectively: FICA = MICA combination/ MICA alone and FICB = MICB combination/MICB alone. A mean FIC index was calculated based on the following equation: 89 FICA + FICB, and the interpretation made as follows: synergistic (< 0.5), additive (0.5-1.), indifferent (> 1), or antagonistic (> 4). Results and Discussion The EAFLV modified the antibiotic activity of all antibiotics assayed against both bacteria (Table 2), demonstrating an additive relation. However, when the EAFLV was associated with amikacin against the E. coli 27, the FIC índex was 0,4, indicating na synergistic interaction between the antibiotic and the natural product. One of the main classes of secondary metabollites extracted in the EAFLV are the flavonoids [17], that present several pharmacological properties, as antimicrobial [18]. This activity can be related to this phytocompound due the capacity to Interact with soluble proteins or with the plasmatic membrane, promoting the membrane disruption and enhancing the antibiotic uptake [19,20]. The results of our study are significant to a future clinical usage, due the fact of the assayed concentrations were low. The possibility of the use of natural products from L. Venustum associatied with antibiotics in the chemotherapy is according with the pharmaceutical industries necessities, being an alternative to combat the antibiotic bacterial resistance. Combinations using natural products and antibiotics could be used in the future against multiresistant microorganisms. This action could represent an interesting approach against the severe public health problem caused by the nosocomial infections. References 1. Duke JA: Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. New York, CRC Press Taylor & Francis group, 2008. 2. Argueta A, Cano L, Rodarte M: Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana, vol. I–III. Mexico city, Instituto Nacional Indigenista, Mexico City, 1994. 3. Albuquerque U, Barros ICL, Chiapetta AA: Pteridófitas utilizadas nos cultos afrobrasileiros em Recife – PE: um estudo etnobotânico. Biológica Brasílica 1997; 7:23-30. 4. Rahman AU: Studies in Natural Products Chemistry. Editora Elsevier Science, 2008. 5. Calzada F, Arista R, Pérez H: Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats. J Ethnopharmacol 2010; 128: 49-51. 90 6. Calzada F, Lilian YM, Contreras, AT: Effect of Mexican medicinal plant used to treat trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites. J Ethnopharmacol 2007; 113: 248251. 7. Alanis AD, Calzada F, Cervantes JA, Ceballos GM: Antibacterial properties of some plants used in Mexican tradicional medicine for the treatment of gastrointestinal disorders. J Ethnopharmacol 2005; 100: 153-157. 8. Brasileiro BG, Pizziolo VR, Raslan DS, Jamal CM, Silveira D: Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district. Rev Bras Cienc Farm 2006; 42: 195-202. 9. Vieira OMC, Santos MH, Silva GA, Siqueira AM: Atividade antimicrobiana de Struthanthus vulgaris (erva-de-passarinho). Rev Bras Farmacogn 2005; 15:149-154. 10. Cardoso FL, Murakami C, MaywormAS, Marques LM: Análise sazonal do potencial antimicrobiano e teores de flavonóides e quinonas de extratos foliares de Aloe arborescens Mill.. Xanthorrhoeaceae. Rev Bras Farmacogn 2010; 20: 35-40. 11. Hemaiswarya SH, Kruthiventi AK, Doble M: Synergism between natural products and antibiotics against diseases. Phytomedicine 2008; 15: 639-652. 12. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima EO, Siqueira-Júnior JP: Additive effects of Hyptis martiusii Benth with aminoglycosides against Escherichia coli. Indian J Med Res 2010; 131:106-108. 13. Coutinho HDM, Vasconcellos A, Lima MA, Almeida-Filho GG, Alves RRN: Termite usage associated with antibiotic therapy: enhancement of aminoglycoside antibiotic activity by natural products of Nasutitermes corniger (Motschulsky 1855). BMC Complem Alt Med 2009; 9:35. 14. Coutinho HDM, Costa JGM, Lima EO, Falcão-Silva VS, Siqueira-Junior JP: In vitro interference of Momordica charantia in the resistance to aminoglycosides. Pharma Biol 2009; 47:1056–1059. 15. Eliopoulos GM, Moellering RC: Antimicrobial combinations. In: Lorian V, editor. Antibiotics in laboratory medicine. Baltimore, Williams & Wilkins, 1991. p. 434-441 16. Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR: Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ªed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2010. 17. Taleb-Contini SH, Salvador MJ, Watanabe E, Ito IY, Dionéia CRO: Atividade antimicrobiana dos flavonóides e esteróides isolados de duas espécies de Chromolaena. Rev Bras Ci Farm 2003; 30: 403-408. 18. Tsuchiya H, Sato M, Miyazaki T, Fuyiwara S, Ohyama M, Takasa T, Linuma M: Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavones against methicillinresistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol 1996; 50: 27-34. 19. Cowan MM: Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 1999; 12: 564582. 91 Table 1. Origin of bacterial strains and resistance to antibiotics. Bacteria Origin Resistance Escherichia coli 27 Surgical Ast, Amx, Amp, Ami, Amox, Ca, Cfc, wound Cf, Caz, Cip, Clo, Im, Can, Szt, Tet, Tob Staphylococcus aureus 358 Surgical Oxa, Gen, Tob, Ami, Can, Neo, Para, wound But, Sis, Net Ast - Aztreonan; Amx - amoxicillin, Amp - ampicillin; Ami - Amikacin; Amox - Amoxicillin, Ca - Cefadroxil; Cfc - Cefaclor; Cf - Cephalothin; Caz - Ceftazidime, CIP - Ciprofloxacin; Chl - Chloramphenicol; Im Imipenem; Can - Kanamycin; SZT - sulphametrim, Tet - tetracycline; Tob - tobramycin; Oxa - Oxacillin; Gen gentamicin; Neo - neomycin; To - Paramomicina; But - Butirosin; Sis - sisomicin; Net – Netilmicin. Table 2. Minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics and the combinatory effect of combinations with ethyl-acetate fraction of Lygodium venustum (EAFLV) against bacterial isolates multiresistant to antibiotics. Natural Product + Escherichia coli 27 Staphylococcus aureus 358 Antibiotics MIC (µg/mL) FIC index MIC (µg/mL) FIC index EAFLV ≥ 1024 - ≥ 1024 - Amikacin 156.25 - 39.06 - Neomycin 39.06 - 39.06 - Gentamicin 39.06 - 39.06 - EAFLV + Amikacin 128/39.06 0.4 (syn) 4/19.53 0.5 (add) EAFLV + Neomycin 4/19.53 0.5 (add) 4/19.53 0.5 (add) EAFLV + Gentamicin 4/19.53 0.5 (add) 4/19.53 0.5 (add) FIC – Fractional Inhibitory Concentration; Syn – Synergism; Add – Additivity. 92 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo foi submetido à revista Chemotherapy para apreciação e aguarda parecer. ---------- Forwarded message ---------From: <[email protected]> Date: 2011/11/10 Subject: Ms. No. 201111003, Chemotherapy To: [email protected] Chemotherapy Ms. No.: 201111003 Title: Evaluation of the interaction between aminoglycosides and natural products of Lygodium venustum SW. against Escherichia coli and Staphylococcus aureus clinically isolated Dear Dr. Coutinho, Thank you for submitting your manuscript to "Chemotherapy". It will now be forwarded to our reviewers and we shall inform you as soon as possible of the decision reached by the editorial board. The manuscript reference number is 201111003. Please use this number on all correspondence about the manuscript, which should be sent to the "Chemotherapy" editorial office at the address listed below. For information regarding the status of your manuscript and for future submissions to "Chemotherapy" you can access this system by logging into the journal's online peer review system as follows: http://www.karger.com/che Logon Name: henriquecoutinho Password: urca1998 With kind regards, 93 Esther Bettiol Chemotherapy Editorial Office S. KARGER AG - Medical and Scientific Publishers e: [email protected] f: +4161 3061434 t: +4161 3061361 w: http://www.karger.com/che 94 5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DE Lygodium venustum SW RESUMO Diferentes tipos de produtos naturais, suas frações ou substâncias isoladas destes vêm sendo investigados quanto ao potencial antimicrobiano. A utilização abusiva de medicamentos tem causado o desenvolvimento da resistência de microorganismos. A busca por fármacos com atividade antimicrobiana direta ou potencializadora da ação dos utilizados pelas populações tem estimulado a pesquisa farmacológica com plantas. Lygodium venustum é uma samambaia da família Lygodiaceae muito utilizada na medicina popular por Sul Americanos. Neste estudo avaliou-se a atividade antimicrobiana e modificadora da ação de antifúngicos e aminoglicosídeos pela fração acetato de etila obtida do extrato etanólico das folhas de L. venustum. Os testes de Concentração Inibitória Mínima foram realizados pelo método da diluição em caldo e as linhagens ensaiadas foram as fúngicas leveduriformes de Candida albicans, Candida krusei e Candida tropicalis e as bacterianas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphyloccocus aureus e Pseudomonas aeruginosa, todas padrões, que tiveram seu MIC avaliado sendo ≥1024µg/mL. A atividade moduladora de antibióticos foi verificada frente a linhagens clinicamente isoladas de E. coli e S. aureus, em concentração subinibitória (MIC/8). A fração acetato de etila conseguiu potencializar a ação de todos os aminoglicosídeos testados, mostrando um potencial clinicamente relevante e promissor para o desenvolvimento de fármacos associados. Palavras-chave: Samambaia. Atividade antifúngica. Atividade antibacteriana. Atividade moduladora. 95 Atividade Antimicrobiana da Fração Acetato de Etila de Lygodium venustum SW Maria F. B. Morais-Braga1*, Teógenes M. Souza1, Karla K. A. Santos1, Gláucia M. M. Guedes1, Jaqueline C. Andrade 1, Samara A. Brito2, Irwin A. de Menezes4, José G. M. Costa2, Antonio A. F. Saraiva3, Henrique D. M. Coutinho1, Aline Augusti Boligon5, Diones Caeran Bueno6. 1 Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular; 2Laboratório de Pesquisa com Produtos Naturais, 3 Laboratório de Paleontologia,4 Laboratório de Farmacologia e Química Molecular da Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil; 5Laboratório de Farmácia Industrial, 6Laboratório de Bioquímica Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil. * Autor para correspondência: Maria Flaviana B. Morais-Braga Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: [email protected] +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: 96 ABSTRACT Different types of natural products, their fractions and their isolated substances have been investigated as potential antimicrobial. The misuse of drugs has caused the development of resistant microorganisms. The search for drugs with directly antimicrobial activity or potentializer of the action of the used by populations has stimulated the pharmacological research with plants. Lygodium venustum is a fern from the Lygodiaceae family widely used in popular medicine by South Americans. This study evaluated the antimicrobial activity and modifying the action of antifungal agents and aminoglycosides by the ethyl acetate fraction obtained from the ethanol extract of the leaves of L. venustum. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) tests were performed by broth dilution method and the fungal strains tested were they east Candida albicans, Candida krusei and Candida tropicalis and the bacterial Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, all standards, which had their MIC being evaluated in ≥1024μg/mL. The modulating activity of antibiotics was checked against clinically isolated strains of E. coli and S.aureus in subinhibitory concentration (MIC / 8). The ethyl acetate fraction was able to potentiate the action of all aminoglycosides tested, showing a potential clinically relevant and promising for the development of associated drugs. Keywords: Fern. Antifungal activity. Antibacterial activity.Modulating activity. INTRODUÇÃO Lygodium venustum é uma samambaia pertencente à família Lygodiaceae (Smith et al., 2006), pesquisas em etnobotânica de populações da América Latina têm relatado a utilização de suas partes aéreas seja em forma de chá ou de uso tópico no tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases (Duke, 2008). Na etnofarmacologia já foi investigada quanto ao seu potencial antitricomonicida (Calzada et al., 2007), antibacteriano (Calzada et al., 2010) e para o tratamento de distúrbios gastrointestinal (Alanis, et al., 2005). Em geral, as Pteridófitas têm sido timidamente investigadas quanto a suas bioatividades, apesar de serem bastante utilizadas na medicina popular (Barros e Andrade, 1997). 97 O aumento da prevalência de bactérias resistentes, em conseqüência do acentuado e inadequado uso de antibióticos, vem indicando que estes são insuficientes para o tratamento de muitas das infecções existentes. A indústria farmacêutica tem tido, apesar de seu constante esforço, bastante dificuldade em encontrar ou desenvolver novas drogas efetivas com a rapidez com que elas se fazem necessárias (Vermelho, et al., 2007). Outro problema associado a microrganismos é o aumento de infecções fúngicas oportunistas. Apesar do número de antimicóticos comercialmente disponíveis ter aumentado nos últimos anos, estes ainda encontram-se em desvantagem, quando comparados às drogas antibacterianas. Além disso, a resistência aos antifúngicos tem representado um grande desafio para a clínica2 (Batista et al. 1999). Extratos, frações e substâncias isoladas de produtos naturais têm sido intensamente analisados com a finalidade de se comprovar a existência de ação antimicrobiana. Isto vem ocorrendo com freqüência na atualidade, pois o uso abusivo destes agentes tem provocado o desenvolvimento da resistência de microrganismos, tornando muito mais difícil o tratamento de infecções nosocomiais (Tortora et al., 2008). Neste trabalho avaliamos o potencial antimicrobiano e modulador de antibióticos da fração acetato de etila obtida do extrato etanólico das folhas frescas de L. venustum. MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal Folhas de L. venustum foram coletadas no município de Crato, Ceará, Brasil. O material vegetal foi identificado pelo Dr. Álamo Feitosa Saraiva e uma exsicata foi depositada sob o número 5569 HCDAL no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato, Ceará, Brasil. Preparação do Extrato Etanólico e fracionamento As folhas foram parcialmente trituradas e 211,18g da massa foliar foi submersa em etanol a 92% por um período de 72 horas. O extrato foi filtrado e em seguida concentrado em rotaevaporador (Q-344B – Quimis – Brasil) e banho-maria (Q-214M2 –Quimis – Brasil). . O fracionamento foi realizado tomando-se metade do extrato bruto, obtendo-se a fração acetato de etila com rendimento de 0,52g. 98 Material fúngico e bacteriano Foram utilizados microorganismos catalogados em coleções (cepas especificadas) do Laboratório de Micologia Clínica da Universidade Federal da Paraíba, conforme especificados: bactérias (padrões): E. coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 15442 e K. pneumoniae ATCC 4362; bactérias (multirresistentes): P.aeruginosa 03, E. coli 27 e S. aureus 358 e fungos (padrões): Candida albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC 2538, C. tropicalis ATCC 40042. Drogas Foram utilizados os aminoglicosídeos canamicina, amicacina, neomicina e gentamicina e antifúngicos mebendazol, anfotericina B, neomicina e benzoilmetronidazol (Sigma Co., St. Louis, USA), a uma concentração inicial de 5000µg/mL e 1024µg/mL, respectivamente. Todas as drogas foram dissolvidas em água esterilizada. Concentração Inibitória Mínima (CIM) O método utilizado foi o da microdiluição em caldo. Para se chegar à concentração de 1024µg/mL a ser utilizada nos testes, inicialmente uma concentração de 100mg/mL da fração acetato de etila foi diluída em 1mL de dimetilsufóxido (DMSO), que em seguida foi diluída em água destilada e estéril. O inóculo foi diluído em BHI 10% chegando-se a uma concentração de 105UFC/mL. Foram distribuídos 100µL do BHI e inóculo em cada poço de uma placa de 96 poços e em seguida procedeu-se a microdiluição seriada com a solução de 100µL do extrato, variando nas concentrações de 512 a 8µg/mL. As placas foram levadas à incubadora por 24 horas a 35º(Javadpour et al., 1996). A revelação da CIM bacteriana foi feita utilizando-se a resazurina, enquanto para os fungos foi observado a turbidez provocada pelo crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração na qual nenhum crescimento foi observado de acordo com a NCCLS (2008). Teste de Modulação de Drogas Utilizou-se o método proposto por Coutinho (2008), onde a solução da fração acetato de etila foi testada em concentração sub-inibitória (MIC/8). Foram distribuídos 100µL de uma 99 solução contendo BHI 10%, inóculo e extrato em cada poço no sentido alfabético da placa. Em seguida, 100µL da droga foi misturado ao primeiro poço, procedendo a microdiluição em série, numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade. As concentrações de aminoglicosídeos e antifúngicos variavam gradualmente de 5000 a 2,44µg/mL e 1024 a 8µg/mL, respectivamente. RESULTADOS A fração acetato de etila do extrato etanólico de L. venustum não apresentou atividade antimicrobiana de relevância clínica contra as cepas fúngicas e bacterianas padrões, sendo a concentração inibitória mínima sempre maior ou igual a 1024µg/mL. Quando combinando com as drogas antifúngicas, a fração acetato de etila não modificou a concentração inibitória mínima das drogas testadas. O bacilo P. aeruginosa 03, também não foi capaz de alterar a CIM dos antibióticos testados, apresentando inibição do crescimento em uma concentração ≥ 1024 µg/mL. Nos testes frente à cepa E. coli 27, todas as drogas testadas em combinação com a fração acetato de etila apresentaram uma diminuição da concentração inibitória mínima, sugerindo uma relação de sinergismo com o produto natural. Na verificação do potencial modulador de antibiótico contra a bactéria S. aureus 358, pôde-se perceber que houve uma interação sinérgica significativa com todos os aminoglicosídeos, mas novamente o resultado com a gentamicina surpreendeu, pois teve como conseqüência a mudança fenotípica da bactéria de resistente para sensível. Os resultados são expressos na tabela 1. DISCUSSÃO Os metabólitos secundários, por serem fatores de interação entre os organismos, frequentemente apresentam atividades biológicas interessantes (Simões et al., 2010). Testes fitoquímicos anteriormente realizados foram realizados indicam que L. venustum apresenta em sua composição metabólitos secundários como taninos flobabênicos, flavonas, xantonas, chalconas, flavonóides, flavononas e alcalóides, muitos destes responsáveis por atividades antimicrobianas. Com polaridade intermediária, o acetato de etila permite recuperar as agliconas livres pouco polares, tais como flavonas, flavonóis, flavanonas, di-hidroflavonóis, isoflavonas e outras agliconas com alto grau de polarização. Os Flavonóides representam um dos grupos 100 fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem vegetal (Simões, et al., 2010). Nos últimos anos o interesse pelas propriedades farmacológicas do grupo vem crescendo, isto porque, estudos apontam que estes apresentam atividades relevantes e diversificadas (Machado, et al, 2008), entre estas, a antimicrobiana (Taleb-Contini et al., 2003). Esta atividade é provavelmente devido à sua habilidade de formar complexos com proteínas solúveis extracelulares e com a parede celular ou ainda o caráter lipofílico dos flavonóides ser responsável pela ruptura da membrana celular dos microorganismos (TSUCHIYA et al., 1996; COWAN, 1999). Dessa forma, este fato pode nos levar a supor que estes compostos fenólicos talvez sejam os responsáveis pela atividade modificadora de antibióticos verificada frente às cepas S. aureus 358 e E. coli 27. S. aureus e E. coli são microrganismos bastante diferentes bioquimicamente, especialmente em seus envoltórios celulares. Na maioria das bactérias gram-positivas, aqui representadas pela S. aureus, a parede celular consiste de muitas camadas de peptideoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida. Em contraste, as paredes celulares de gramnegativas contêm somente uma camada fina de peptideoglicana1 (Tortora, et al.,2008). Isto talvez possa explicar o fato de que os resultados de modulação com E. coli terem sido bem mais significativos quando comparados com os da S. aureus, apesar de serem todos clinicamente relevantes. Os antibióticos aminoglicosídeos são parte importante do arsenal terapêutico antibacteriano desde seu descobrimento, na década de 40. Todos os aminoglicosídeos agem pelo mesmo mecanismo da ação, exercendo seu efeito bactericida ao se ligarem ao ribossomo bacteriano. Desta forma, é necessário que penetrem no interior da célula bacteriana para que possam agir. Isto ocorre por meio da interação do aminoglicosídeo com a superfície celular, o seu transporte por meio da membrana e, finalmente, o acoplamento com o ribossomo (Oliveira et al., 2006). Produtos naturais de origem vegetal podem alterar o efeito de antibióticos, seja aumentando ou reduzindo a atividade antibiótica (Coutinho et al. 2008). Vários trabalhos vêm demonstrando esta interação entre os fármacos e produtos vegetais, evidenciando o potencial modulador (Sousa et al, 2011; Matias, et al., 2010, Coutinho, et al., 2010). A combinação de antibióticos de uso comum pelas populações e compostos extraídos pela fração acetato de etila da pteridófita L. venustum, poderiam representar uma excelente opção terapêutica no tratamento de infecções causadas por S. aureus e E. coli, sugerindo a composição de um fármaco com multi-drogas. Entretanto, estudos fitoquímicos mais aprofundados são necessários no sentido de isolar e identificar os metabólitos secundários 101 imediatamente responsáveis por esta potencialização do efeito dos aminoglicosídeos aqui ensaiados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALANIS, A.D.; CALZADA, F.; CERVANTES, J.A.; CEBALLOS, G.M. Antibacterial properties of some plants used in Mexican tradicional medicine for the treatment of gastrointestinal disorders. Journal of Ethnopharmacology. v. 100, p. 153-157. 2005. BARROS, I.C.L.; ANDRADE, L.H.C. Pteridófitas medicinais (samambaias, avencas e plantas afins). Recife, Editora Universitária da UFPE. 1997. BATISTA, J.M.; BIRMAN, E.G.; CURY, A.E. Suscetibilidade a antifúngicos de cepas de candida albicans isoladas de pacientes com estomatite protética. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 13, n. 4, p. 343-348. 1999. CALZADA, F.; ARISTA, R.; PÉREZ, H. Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats. Journal of Ethnopharmacology. v. 128, p. 49–51. 2010. CALZADA, F.; LILIAN, Y.M.; CONTRERAS, A.T. Effect of Mexican medicinal plant used to treat trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites. Journal of Ethnopharmacology. v. 113, p. 248–251. 2007. COUTINHO, H. D. M., COSTA, J.G.M., LIMA, E. O., FALCÃO-SILVA, V. S., SIQUEIRAJÚNIOR. Enhancement of the Antibiotic Activity against a Multiresistant Escherichia coli by Mentha arvensis L. and Chlorpromazine. Chemotherapy. v.54, p. 328–330. 2008. COUTINHO, H.D.M.; COSTA, J.G.M.; FALCÃO-SILVA, V.S.; SIQUEIRA-JR, J.P. LIMA, E.O. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Pharmaceutical Biology. v. 48, n. 9: 1002– 1006. 2010. COWAN, M.M. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev, v. 12, n. 4, p. 564-582. 1999. DUKE, J.A. Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. New York: CRC Press Taylor & Francis group. 2008. JAVADPOUR, M.M.; JUBAN, M.M.; LO, W.C.; BISHOP, S.M.; ALBERTY, J.B.; COWELL, S.M.; BECKER, C.L.; MCLAUGHLIN, M.L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J Med Chem v. 39, p. 107–3113. 1996. MACHADO, H.; NAGEM, T.J.; PETERS, V.M.; FONSECA, C.S.; OLIVEIRA, T.T. Flavonóides e seu potencial terapêutico. Boletim do Centro de Biologia da Reprodução, Juiz de Fora, v. 27, n. 1/2, p. 33-39, 2008. 102 MATIAS, E.F.F; SANTOS, K.K.A; COSTA, J.G.M; COUTINHO, H.D.M. Light-enhanced antibiotic activity of Brazilian medical plants (Croton campestris A, Ocimum gratissimum L and Cordia verbenaceae DC. Asian Biomedicine v. 4 No. 1, p. 183-186. 2010. NCCLS. NATIONAL COMITTE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: Approved standard, 6th ed. NCCLS document M7-A6. Wayne: National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2008. OLIVEIRA, J.F.P.; CIPULLO, J.P.; BURDMANN, E.A. Aminoglycoside nephrotoxicity. Rev Bras Cir Cardiovasc. v.21, n.4, p. 444-452. 2006. SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ªed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC. 2010. SMITH, A.R.; PRYER, K.M.; SCHUETTPELZ, E.; KORALL, P.; SCHNEIDER, H.; WOLF, P.G. A classification for extant ferns. Taxon. v. 55, p. 705-731. 2006. SOUSA, E.O.; BARRETO, F.S; RODRIGUES, F.F.G.; COSTA, J.G.M. Atividade antibacteriana e interferência de Lantana camara L.e Lantana montevidensis (Spreng.) Briq. na resistência de aminoglicosídeos. Revista Brasileira de Biociências. Porto Alegre, v. 9, n. 1, p. 1-5, 2011. TALEB-CONTINI, S.H.; SALVADOR, M.J.; WATANABE, E.; ITO, I.Y.; DIONÉIA, C.R.O. Atividade antimicrobiana dos flavonóides e esteróides isolados de duas espécies de Chromolaena. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 30, n. 4: 403-408. 2003. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia 8ª ed. Porto Alegre, Artmed, 2008. TSUCHIYA, H.; SATO, M.; MIYAZAKI, T.; FUYIWARA, S.; OHYAMA, M.; TAKASA, T.; LINUMA, M. Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Ethnopharmacol., v. 50, p. 27-34, 1996. VERMELHO, A.B.; BASTOS, M.C.F.; BRANQUINHA, M. Bacteriologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2007. 103 Tabela 1. Atividade moduladora antibacteriana da Fração Acetato de Etila do Extrato Etanólico das Folhas de L. venustum (EEFLV) na concentração subinibitória de 128 µg/mL (CIM/8). Escherichia coli Staphyloccocus aureus Antibiótico Efeito isolado Efeito associado Efeito isolado Efeito associado Canamicina 156,25 19,53 156,25 39,06 Amicacina 312,5 39,06 78,125 19,53 Neomicina 156,25 19,53 39,06 9,76 Gentamicina 1.250 9,76 19,53 2,44 CIM: Concentração inibitória mínima 104 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo ainda não foi submetido. Atualmente está sendo traduzido para a língua inglesa, devendo ser posteriormente encaminhada para apreciação de editor e revisores de um períodico internacional. 105 5.5 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA, ANTIFÚNGICA E MODULADORA DE FRAÇÕES OBTIDAS DE Lygodium venustum SW. RESUMO: O tradicional uso das plantas na medicina popular vem indicando um caminho na busca de agentes farmacológicos. A necessidade de novos fármacos é evidenciada pela acentuada resistência dos microorganismos. A samambaia Lygodium venustum teve neste trabalho seu potencial antimicrobiano avaliado através do método de microdiluição em caldo. Também foi testada a sua capacidade de modular a ação de antibióticos. Foram ensaiadas suas frações hexânica, diclorometano e metanólica obtidas a partir do extrato etanólico das folhas frescas. A Concentração Inibitória Mínima foi avaliada frente às linhagens padrões de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Candida krusei e Candida tropicalis. Na verificação da atividade moduladora de antibióticos foram utilizadas linhagens multirresistentes de P. aeruginosa, E. coli e S. aureus e as mesmas linhagens fúngicas utilizadas na CIM. As drogas usadas na modulação foram antifúngicos e aminoglicosídeos. Todos os resultados da CIM demonstraram atividade ≥ 1024µg/mL. As frações não potencializaram a ação dos antifúngicos contra as linhagens de Candida, nem dos aminoglicosídeos frente à P. aeruginosa. Porém, interessantes resultados potencializando a ação destes foram obtidos frente à E. coli e S. aureus. Tais resultados sugerem que metabólitos secundários existentes no vegetal poderão ser utilizados para constituição de novas drogas em associação com aminoglicosídeos. Este foi o primeiro relato de atividade modificadora da ação de antibióticos por frações obtidas de uma pteridófita da família Lygodiaceae. Palavras-chave: Lygodium venustum, pteridófita, atividade antimicrobiana, atividade moduladora da ação de antibióticos, frações. 106 Atividade antibacteriana, antifúngica e moduladora de frações obtidas de Lygodium venustum SW. Maria Flaviana Bezerra Morais-Braga1, Teógenes Matias de Souza1, Karla Katiúcia. Alves dos Santos1, Gláucia Morgana de Melo Guedes1, Jaqueline Cosme Andrade 1, Saulo Relisson Tintino1, José Galberto Martins da Costa2, Irwin Rose Alencar de Menezes 3, Antonio Álamo Feitosa Saraiva4, Henrique Douglas Melo Coutinho1* 1 Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular; 2Laboratório de Pesquisa com Produtos Naturais, 3 Laboratório de Paleontologia,4 Laboratório de Farmacologia e Química Molecular da Universidade Regional do Cariri, Crato, Brasil. Título resumido: Atividade antimicrobiana de frações de Lygodium venustum SW. * Autor para correspondência: Henrique Douglas Melo Coutinho Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: [email protected] 107 ABSTRACT The traditional use of plants in popular medicine has also indicated the way in the search for pharmacological agents. The need for new drugs is evidenced by the strong resistance of microorganisms. The fern Lygodium venustum had its antimicrobial potential measured, in this work, by the broth microdilution method. Its ability to modulate the action of antibiotics was also tested. Its hexane, dichloromethane and methanol fractions obtained from the ethanolic extract of fresh leaves were assayed. The Minimum Inhibitory Concentration was evaluated from the standard strains of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Candida tropicalis and Candida krusei. To check the modulating activity of antibiotics were used multi-resistant strains of P. aeruginosa, E. coli and S. aureus and the same yeast strains used in CIM. The drugs used in modulating were antifungal and aminoglycosides. All results showed MIC ≥1024μg/mL activity. The fractions neither enhanced the action of antifungal agents against strains of Candida, nor the aminoglycosides against P. aeruginosa. However, interesting results potentiating the action of these were obtained against the E. coli and S. aureus. Such results suggest that secondary metabolites which are in this plant may be used to create new drugs in combination with aminoglycosides. This was the first report of activity-modifying action of antibiotics for fractions obtained from a fern family Lygodiaceae. Key words: Fern, antimicrobial activity, modulation of antibiotics. INTRODUÇÃO Plantas utilizadas na medicina popular tem sido alvo de investigações científicas devido as suas propriedades terapêuticas. Diversos estudos comprovam que a biodiversidade vegetal possui um arsenal de compostos que se mostram promissores na produção de novos fármacos. O tratamento de enfermidades com plantas é tão antigo quanto à espécie humana e estas vêm sendo comercializadas em feiras livres e mercados populares (Maciel et al., 2002). Devido ao rápido surgimento de resistência de microrganismos, a busca por novos agentes terapêuticos eficazes tem se tornado constante. Dessa forma, a pesquisa tem envolvido desde Briófitas até Angiospermas e suas diversas atividades farmacológicas têm se tornado uma alternativa promissora no combate às infecções causadas por bactérias e fungos 108 (Morantes et al. 2007, Peres et al. 2009, Lee et al. 2008, Santos et al. 2010, Nascimento et al. 2000). As leveduras de Candida, no homem, podem atingir superfícies cutâneas e mucosas, causando a candidíase oral, vaginal, onicomicose, intertrigo, podendo em alguns casos ser invasiva. O uso exacerbado de antibióticos de amplo espectro vem favorecendo o desenvolvimento de infecções fúngicas (Almeida 2008). Bactérias Gram-positivas e Gramnegativas têm se tornado a causa de infecções que inclusive podem apresentar implicações clínicas em ambientes hospitalares. Muitos patógenos estão se tornando resistentes a uma variedade crescente de quimioterápicos, tornando o combate às infecções por eles causadas extremamente difíceis (Vermelho et al. 2007). No grupo das plantas vasculares, a samambaia lianescente Lygodium venustum, têm sido tradicionalmente utilizada como um fitoterápico. Suas partes aéreas são utilizadas sob a forma de chá ou tópica, no tratamento de infecções e dermatoses, entre outras enfermidades (Duke 2008). Poucos estudos farmacológicos foram realizados, mas suas atividades tricomonicida (Calzada et al. 2007), antibacteriana (Alanis et al. 2005) e ainda seu efeito no tratamento de desordens gastrointestinais (Calzada et al. 2010) já foram investigados. Devido aos problemas causados por esses microrganismos e o rápido surgimento de resistência, as propriedades antibacterianas e antifúngicas das frações hexânica, diclorometano e metanólica, obtidas de L. venustum serão analisadas. MATERIAL E METODOS Material vegetal Folhas de L. venustum foram coletadas no município de Crato, estado do Ceará, Brasil. A planta foi identificada pelo dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva e depositada no Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade regional do Cariri – URCA, sob o número 5569 HCDAL. Preparação do Extrato Etanólico das Folhas de L. venustum (EEFLV) As folhas foram parcialmente trituradas e 211,18g da massa foliar foi submersa em etanol a 92% por um período de 72 horas. O extrato foi filtrado e em seguida concentrado em 109 rotaevaporador (Q-344B – Quimis – Brasil) e banho-maria (Q-214M2 – Quimis – Brasil), obtendo-se um rendimento de 49,2%. O fracionamento foi realizado tomando-se metade do extrato bruto, seguindo a escala de polaridade, sendo obtidas as frações hexânica, diclorometano e metanólica com rendimento de 0,22g, 0,38g e 3g, respectivamente . Material fúngico e bacteriano As bactérias utilizadas no teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram as linhagens padrões de E. coli ATCC 25923, S. aureus ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 15442 e K. pneumoniae ATCC 4362. Nos ensaios com fungos foram testadas as linhagens padrões de Candida albicans ATCC 40006, C. krusei ATCC 2538, C. tropicalis ATCC 40042. Todas as linhagens foram obtidas do Laboratório de Micologia Clínica da Universidade Federal da Paraíba. Para o teste de modulação foram usadas as linhagens bacterianas multirresistentes de isolados clínicos P. aeruginosa 03, E. coli 27 e S. aureus 358 com perfil de resistência apresentado na tabela 1 e as mesmas linhagens fúngicas utilizadas no teste de CIM . Drogas As drogas utilizadas nos testes foram os aminoglicosídeos canamicina, amicacina, neomicina e gentamicina e os antifúngicos mebendazol, anfotericina B, neomicina e benzoilmetronidazol (Sigma Co., St. Louis, USA), a uma concentração inicial de 5.000µg/mL e 1024µg/mL, respectivamente. Todas as drogas foram dissolvidas em água esterilizada. Concentração Inibitória Mínima O método utilizado foi o da microdiluição em caldo. Para se chegar à concentração de 1024µg/mL a ser utilizada nos testes, obteve-se inicialmente uma concentração de 200mg/mL do extrato etanólico de L. venustum em 1mL de dimetilsulfóxido (DMSO), que em seguida foi diluída em água destilada. O inóculo foi diluído em BHI 10% chegando-se a uma concentração de 105 UFC/mL. Foram distribuídos 100µL do BHI e inóculo em cada poço de uma placa de 96 poços e em seguida procedeu-se a microdiluição seriada com a solução de 100µL do extrato, variando nas concentrações de 512 a 8µg/mL. As placas foram levadas à incubadora por 24 horas a 35º (Javadpour et al. 1996). A revelação da CIM bacteriana foi 110 feita utilizando-se a resazurina, enquanto para os fungos foi observado a turbidez provocada pelo crescimento. A CIM foi definida como a menor concentração na qual nenhum crescimento foi observado de acordo com a NCCLS (2008). Teste de Modulação de Drogas Para verificar se o extrato modificaria a ação dos antibióticos frente às cepas testadas, utilizou-se o método proposto por Coutinho et al. (2008), onde a solução do extrato foi testada em concentração sub-inibitória (CIM/8) de 128µg/mL. Foram distribuídos 100µL de uma solução contendo BHI, inóculo e extrato em cada poço no sentido alfabético da placa. Em seguida, 100µL da droga foi misturado ao primeiro poço, procedendo-se a microdiluição em série, numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade. As concentrações de aminoglicosídeos e antifúngicos variavam gradualmente de 5000 a 2,44µg/mL e 1024 a 8µg/mL, respectivamente. RESULTADOS Nos testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM), realizados contra as linhagens de Candida, nenhuma das frações testadas apresentou atividade de relevância clínica, sendo todos os resultados ≥ 1024 μg/ml. Quanto ao teste de modulação, nenhuma alteração do CIM foi verificada quando as frações foram associadas aos antifúngicos. No teste de MIC com cepas bacterianas, todas as frações apresentaram crescimento ≥ 1024 μg/ml. Contudo, na avaliação da atividade moduladora de antibióticos, a fração hexânica associada à amicacina diminuiu dois pontos de CIM para a cepa E. coli 27, e sete pontos de CIM para a gentamicina frente à mesma cepa. A fração diclorometano também reduziu drasticamente o CIM de gentamicina frente à cepa E. coli 27. Todas as frações mostraram uma diminuição da CIM para gentamicina frente às cepas E. coli 27 e S. aureus 358, os resultados são mostrados na tabela 2. Nos testes usando o isolado clínico S. aureus 358, todas as frações mostraram atividade quando associadas à canamicina e gentamicina, com redução do MIC em dois pontos, os resultados podem ser visualizados na tabela 2. Nenhuma das frações testadas mostrou efeito quando associadas aos aminoglicosídeos frente à cepa P. aeruginosa 03. 111 DISCUSSÃO A atividade antibacteriana dos extratos metanólico e aquoso de L. venustum foram ensaiados frente a linhagens de E. coli (Alanis et al. 2005), porém os extratos não foram considerados eficientes inibidores do crescimento bacteriano, uma vez que apresentaram percentuais de inibição abaixo de 50%, além disso, a atividade do extrato foi apresentada diante de uma concentração considerada muito elevada para aplicação clínica (Hougnton et al. 2007). O extrato metanólico de outra planta do gênero, Lygodium japonicum, foi testado contra linhagens de P. aeruginosa, S. aureus, E. coli e C. albicans no método de difusão em disco, porém nenhuma atividade nas concentrações testadas foi apresentada (Taylor et al. 1995). No entanto, a metodologia utilizada apresenta desvantagens, pois é impossível medir a quantidade de substância que se difundiu no Agar (Greger & Hadacek 2000). Os nossos resultados permitiram perceber uma diferença de susceptibilidade entre as bactérias Gram-positiva S. aureus e Gram-negativa E. coli, em relação às frações testadas. A membrana externa das bactérias Gram-negativas apresenta uma barreira resistente à penetração de vários agentes microbianos e estas possuem também um espaço periplasmático com enzimas capazes de inativar alguns antibióticos (Vermelho et al. 2007), podendo esta ser a explicação pela diferença na vulnerabilidade dos microrganismos. Ao analisar o efeito potencializador de antimicrobianos pelas frações de L. venustum, ficou evidente que as bactérias apresentaram maior susceptibilidade ao produto natural que os fungos, isto talvez se justifique pela maior complexidade das células eucarióticas. Resultados semelhantes aos nossos já foram evidenciados em outros trabalhos, apesar de outras metodologias terem sido utilizadas (Khan et al. 2004, Al-Burtamani et al.2005). A atuação de diferentes produtos naturais potencializando o efeito de antibióticos frente a bactérias multirresistentes tem sido demonstrado em vários estudos (Coutinho et al 2009abcd, 2010abc). Esta estratégia é chamada “herbal shotgum” ou “synergistic multi-effect targeting” e se refere à utilização de plantas e drogas em uma abordagem usando mono ou multi extratos combinados afetando diversos alvos do microorganismo ao mesmo tempo, com componentes terapêuticos colaborando de forma sinérgica-agonista. Isto tem sido demonstrado não apenas a partir da combinação de extratos, mas também de produtos naturais ou extratos e produtos sintéticos ou antibióticos (Coutinho 2008, Wagner 2009). Este é o primeiro relato de atividade moduladora de antibióticos por frações obtidas do extrato de uma planta da família Lygodiaceae. Nossos resultados indicam que L. venustum 112 poderia ser uma fonte de produtos naturais com atividade modificadora de antibióticos. Dessa forma, devido a resultados tão relevantes novos ensaios de toxicidade devem ser realizados na tentativa de desenvolver novas alternativas terapêuticas para o tratamento de doenças infecciosas causadas por bactérias. REFERÊNCIAS ALANIS, A.D., CALZADA, F., CERVANTES, J.A. & CEBALLOS, G.M. 2005. Antibacterial properties of some plants used in Mexican tradicional medicine for the treatment of gastrointestinal disorders. Journal of Ethnopharmacology. 100:153-157. AL-BURTAMANI, S.K.S., FATOPE, M.O., MARWAH, R.G., ONIFADE, A.K. & ALSAIDI, S.H. 2005.Chemical composition, antibacterial, antifungal activities of the essential oil of Haplophyllum tuberculatum from Oman. Journal of Ethnopharmacology. 96:107-112. ALMEIDA, S.R. 2008.Ciências Farmacêuticas Micologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 161p. BRASILEIRO, B. G., PIZZIOLO, V. R, RASLAN, D. S., JAMAL, C. M. & SILVEIRA, D. 2006. Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district. Brazilian Journal of Pharmaceutical Science.. 42:195-202. CALZADA, F.; ARISTA, R. & PÉREZ, H. 2010. Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats. Journal of Ethnopharmacology. 128:49–51. CALZADA, F.; LILIAN, Y.M. & CONTRERAS, A.T. 2007. Effect of Mexican medicinal plant used to treat trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites. Journal of Ethnopharmacology. 113:248–251. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G., LIMA, E.O., FALCÃO-SILVA, V.S.& SIQUEIRAJÚNIOR, JP. 2009. Potentiating effect of Mentha arvensis and chlorpromazine in thresistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. In Vivo 23: 287-289. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G., LIMA, E.O,, FALCÃO-SILVA, V.S. & SIQUEIRAJÚNIOR, J.P. 2008. Enhancement of the antibiotic activity against a multiresistant Escherichia coli by Mentha arvensis L. and chlorpromazine. Chemotherapy 54: 328-330. COUTINHO, H.D.M, COSTA, J.G.M, FALCÃO-SILVA, V.S., SIQUEIRA-JR, J.P. & LIMA, E.O. 2010. Potentiation of antibiotic activity by Eugenia uniflora and Eugenia jambolanum. Journal of Medicinal Food 13:1024-1026. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G.M., FALCÃO-SILVA, V.S., SIQUEIRA-JR, J.P.& LIMA, E.O. 2010. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Pharmaceutical Biology. 48: 1002-1006. 113 COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G.M., FALCÃO-SILVA, V.S., SIQUEIRA-JÚNIOR, J.P. & LIMA, E.O. 2009: Effect of Momordica charantia L. in the resistance to aminoglycosides in the methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Comparative Immunology Microbiology and Infection Diseases. 33: 467-471. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G.M., LIMA, E.O., FALCÃO-SILVA, V.S. & SIQUEIRA JR, J.P. 2009. Herbal therapy associated with antibiotic therapy: potentiation of the antibiotic activity against methicillin - resistant Staphylococcus aureus by Turnera ulmifolia L. BMC Complementary and Alternative Medicine. 9: 1-4. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G.M., LIMA, E.O. & SIQUEIRA-JR, J.P. 2010. Additive effects of Hyptis martiusii Benth with aminoglycosides against Escherichia coli. Indian Journal of Medical Research. 131: 106-108. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G.M., LIMA, E.O. & SIQUEIRA-JR, J.P.2009. In vitro interference of Momordica charantia in the resistance to aminoglycosides. Pharmaceutical Biology.. 47: 1056-1059. COUTINHO, H.D.M., COSTA, J.G.M., LIMA, E.O., FALCÃO-SILVA, V.S.& SIQUEIRAJR, J.P. 2008. Enhancement of the Antibiotic Activity against a Multiresistant Escherichia coli by Mentha arvensis L. and Chlorpromazine. Chemotherapy. 54:328–330. DUKE, J.A. 2008. Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. New York: CRC Press Taylor & Francis group. 832 p. GISLENE, G.F., NASCIMENTO; LOCATELLI, J., FREITAS, P.C. & SILVA, G.L. 2000. Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 31:247-256 GREGER, H. & HADACEK, F. 2000. Testing of arttifungal natural products: Methodologies, comparability of results and assay choice. Phytochemical Analysis. 11:137-147. HOUGHTON, P.J., HOWES, M.J., LEE, C.C. & STEVENTON, G. 2007. Uses and abuses of in vitro tests in ethnopharmacology: Visualising an elephant. Journal of Ethnopharmacology. 110:391-400. JAVADPOUR, M.M., JUBAN, M.M., LO, W.C., BISHOP, S.M., ALBERTY, J.B., COWELL, S.M., BECKER, C.L. & MCLAUGHLIN, M.L. 1996. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. Journal of Medinal Chemistry. 39:107–3113. SANTOS, K.K.A., MATIAS, E.F.F., ALMEIDA, T.S., COSTA, J.G.M. & COUTINHO, H.D.M.. 2010. Atividade antifúngica de extratos vegetais e animais da região do cariri. Cadernos de Ciência e Cultura. 2(1): 53-65. KHAN, M.R.; OMOLOSO, A.D. & KIHARA, M. 2004. Antibacterial and antifungal of Euroschinus papuanus. Fitoterapia. 75: 412-416. LEE, J.H., YANG, H.Y., LEE, H.S. & HONG, S.K. 2008. Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oil from Cones of Pinus koraiensis. Journal of microbiology and biotechnology, 18(3):497-502. MACIEL, M.A.M.,. PINTO, A.C., VEIGA JR, V.F., GGRYNBERG, N.F. & ECHEVARRIA. 2002. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Quimica Nova, 25(3): 429-438. 114 PERES, M.T.L.P., SIMIONATTO, E., HESS, S.C., BONANI, V.F.L, CANDIDO, A.C. S. & CASTELLI, C. 2009. Estudos químicos e biológicos de Microgramma vacciniifolia (Langsd. & Fisch.) Copel (Polypodiaceae). Quimica Nova, 32 (4): 897-901. MORANTES, J., PRIETO, C., LINARES, E., RINCÓN, J., & ARISTIZÁBAL, F. 2007. Análisis y fitoquímico de actividad biológica del musgo Polytrichum juniperinum. Revista de La Academia Colombiana de Ciências Exactas, Físicas y Naturales 31(121) 473:479. NCCLS. National Comitee for Clinical Laboratory Standards 2008. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: Approved standard, 6th ed. NCCLS document M7-A6. Wayne: National Committee for Clinical Laboratory Standards. TAYLOR, R.S., MANANDHAR, N.P. & TOWERS, G.H.N. 1995. Screening of selected medicinal plants of Nepal for antimicrobial activities. Journal of Ethnopharmacology. 46:153-159. VERMELHO, A.B., BASTOS, M.C F.& BRANQUINHA, M. 2007. Bacteriologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 582 p. WAGNER, H. & ULRICH-MERZENICH, G. 2009. Synergy research: Approaching a new generation of phytopharmaceuticals. Phytomedicine 16: 97-110. Tabela 1 Perfil de resistência das bactérias a antibióticos Bactéria Escherichia coli 27 Origem Ferida cirúrgica Perfil de resistência Ast,Amx,Ami,Amox,Ca,Cfc,Cf, Caz,Cip,Clo,Im,Can,Szt,Tet,Tob Staphhylococcus aureus 358 Ferida cirúrgica Oxa,Gen,Tob,Ami,Can,Neo,Para, But,Sis,Net Pseudomonas Aeruginosa 03 Urocultura Cpm,Ctz,Imi,Cip,Ptz,Lev,Mer,Ami Ast-Aztreonan; Amx- Amoxacilina; Amp-Ampicilina; Ami-Amicilina; Amox-Amoxilina, Ca-Cefadroxil; Cfccefaclor; Cf-Cefalotina; Caz-Ceftazinidima; Cip-Ciprofloxacin; Clo-Clorafenicol; Imi-Imipenem; CanCanamicina; Szt-Sulfametrim; Tet-Tetraciclina; Tob-Tobramicina; Oxa-Oxacilina; Gen-Gentamicina; NeoNeomicina; Para- Paramomicina; But-Butirosina; Sis-Sisomicina; Net-Netilmicina; Com-Cfepime; CtzCeftazidime; Ptz-Piperacilina-tazobactam; Lev-Levofloxacina; Mer-Merpenem. 115 Tabela 2. Atividade moduladora da ação de antibióticos por frações de Lygodium venustum. Concentração subinibitória (CIM/8µg/mL). Antib. Escherichia coli 27 Staphylococcus aureus 358 Ab. Ab. + Ab. + Ab. + Ab. Ab. Isol. FHLV FDLV FMLV Isol. FHLV Can 156,25 156,25 156,25 156,25 Neo 156,25 156,25 156,25 Ami 312,5 78,125 Gen 1250 9,76 + Ab. + Ab + FDLV FMLV 156,25 39,06 39,06 39,06 156,25 39,06 9,76 39,06 312,5 312,5 78,125 78,125 78,125 78,125 9,76 39,06 19,53 2,44 2,44 9,76 2,44 Ab.: antibiótico; Ab. Isol.: antibiótico isolado; Can: canamicina; Neo: neomicina; Ami: amicacina; Gen: gentamicina; FHLV: Fração hexânica de L. venustum; FDLV: Fração diclorometano de L. venustum; FMLV: Fração metanólica de L. venustum. 116 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo foi submetido na Revista Brasileira de Biociências. Após avaliação, foram sugeridas alterações para que pudesse ser aceito para publicação. Dessa forma, serão feitas as modificações propostas e o artigo será resubmetido. Em 6 de fevereiro de 2012 10:32, Patrícia Valente <[email protected]> escreveu: Prezado Dr. Coutinho, O artigo intitulado "Atividade antibacteriana, antifúngica e moduladora de frações obtidas de Lygodium venustum SW." foi avaliado por dois especialistas na área, que mencionaram que o artigo necessita várias alterações para publicação. Portanto, infelizmente, ele não poderá ser aceito na atual forma para publicação na Revista Brasileira de Biociências. Caso se interessem, fiquem à vontade para submetê-lo novamente após as alterações. Atenciosamente, Patricia Valente Editora Assistente 117 5.6 AVALIAÇÃO DA CITOTOCIXIDADE E ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA DE Lygodium venustum SW. CONTRA Trypanosoma cruzi E Leishmania brasiliensis RESUMO Doenças parasitárias infecciosas como leishmaniose e doença de Chagas tem se difundido nas últimas décadas a locais onde antes não se observava sua ocorrência. São consideradas negligenciadas por assolarem países pobres e serem marginalizadas farmacologicamente. O tratamento não apresenta muitas opções de fármacos e estes demonstram relevante toxicidade contribuindo para o aparecimento de diversos efeitos colaterais. A pesquisa com produtos naturais tem se mostrado uma interessante alternativa para a procura por novos fármacos. Lygodium venustum é uma samambaia cosmopolita de hábito lianescente encontrada na encosta na Chapada do Araripe, considerada por algumas populações americanas como planta medicinal para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases. Neste estudo foi avaliada sua atividade antiparasitária contra Leishmania brasiliensis e Trypanosoma cruzi, bem como sua citotoxicidade através de ensaios in vitro. Foram testadas a fração hexânica e o extrato etanólico obtido das folhas de Lygodium venustum em diferentes concentrações. Para os testes in vitro de T. cruzi, foi utilizado o clone CL-B5 e para Leishmania brasiliensis foram utilizadas formas promastigotas. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com linhagens de fibroblastos. L. venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na forma de extrato etanólico bruto nem como fração hexânica contra Leishmania. A fração hexânica apresentou uma atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentração de efeito moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicação clínica. Entretanto, a citoxicicidade apresentada poderá ser útil em pesquisas sobre atividade antineoplásica em células tumorais. Palavras-chave: Lygodium venustum, atividade antiparasitária, citotoxicidade, extrato, fração hexânica. 118 Avaliação da citotocixidade e atividade antiparasitária de Lygodium venustum SW. contra Trypanosoma cruzi e Leishmania brasiliensis [Evaluation of citotocixity and antiparasitic activity of Lygodium venustum SW against Trypanosoma cruzi and Leishmania brasisliensis] Maria F.B. MORAIS-BRAGA1*, Teógenes M. SOUZA1, Karla K.A. SANTOS1, Jaqueline C. ANDRADE1, Glaucia M.M. GUEDES1, Saulo R. TINTINO1, Celestina E.S. SOUZA1, Celeste VEGA4, Miriam ROLÓN4, Antonieta R. ARIAS4 José G.M. COSTA2, Antonio A.F. SARAIVA3; Henrique D.M. COUTINHO1, 1 Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, 2Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais, 3Laboratório de Paleontologia da Universidade Regional do Cariri, Crato, Brasil. 4 Centre for the Development of Scientific la Investigación (CEDIC), Fundación Moisés Bertoni/Laboratorios Diaz Gill. Asuncion-Paraguay Título resumido: Atividade antiparasitária e citotoxicidade de Lygoudium venustum *Autor para correspondência: Henrique Douglas Melo Coutinho Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: [email protected] 119 ABSTRACT Infectious and parasitic diseases like leishmaniasis and Chagas disease have spreading recent decades to places where there were not observed their occurrence before. They are considered neglected by desolating poor countries and marginalized pharmacologically. There are not many options for the treatment and these drugs have shown significant toxicity contributing to the appearance of several side effects. Research on natural products has been shown to be an interesting alternative to the search for new drugs. Lygodium venustum is a cosmopolitan fern with latescence habit foundon the Chapada do Araripe, considered by some American populations as a medicinal plant for the treatment of skin diseases, infections, fungal infections and trichomoniasis. This study evaluated its antiparasitic activity against Trypanosoma cruzi and Leishmania brasiliensis, as well as its cytotoxicity through trials in vitro. We tested the ethanolic extract and hexane fraction obtained from the leaves of L. venustum at different concentrations. For in vitro tests of T. cruzi, we used the clone CL-B5 and for L. brasiliensis we used promastigotes. The cytotoxicity assay was performed with strains of fibroblasts. L.venustums howed no antiparasitic activity clinically relevant in the form of crude ethanolic extractor as the hexane fraction against Leishmania. The hexane fraction showed an intermediate activity against T.cruzi, but the concentration of moderate effect has maximum cytotoxicity becoming unfeasible for clinical application. However, the cytotoxicity presented may be useful in research on antineoplastic activity in tumor cells. Keywords: Fern; leishmanicidal activity; trypanocidal activity; extract; hexane fraction. INTRODUÇÃO Doenças infecciosas que acometem primordialmente os países em desenvolvimento tem sido a causa de morte de milhões de pessoas em todo o mundo. Estas doenças são negligenciadas e têm afligido a humanidade há muitos anos, afetando principalmente comunidades marginalizadas, sem influência política, em áreas remotas, zonas de conflitos ou favelas urbanas onde há pouco ou nenhum acesso à saúde ou outros serviços. A alta morbidade das doenças afeta a freqüência escolar, o desenvolvimento cognitivo, o 120 crescimento e a produtividade em geral (WHO, 2003). Entre as doenças consideradas negligenciadas podemos citar a Doença de Chagas e Leishmaniose. Ações vêm sendo realizadas no sentido de estabelecer metas por tempo limitado para o controle de algumas destas doenças mesmo diante de dificuldades como recursos financeiros limitados, falta de pessoal treinado e fraqueza ou carência de infra-estruturas de saúde para alcançar as populações afetadas (WHO, 2003). Além das dificuldades impostas por estas situações, ainda há uma grande desafio que é chamar a atenção da indústria farmacêutica, diante do reduzido potencial de retorno lucrativo. Dessa forma, o conhecimento produzido pelas pesquisas não se reverte em avanços terapêuticos, como, por exemplo, novos fármacos, métodos diagnósticos e vacinas (Brasil MS, 2010). Portanto, além de estigmatizadas socialmente, as pessoas afetadas por estas doenças se vêem também marginalizadas farmacologicamente. A leishmaniose é uma doença prevalente em 88 países, em 4 continentes, estimando-se que cause 1,6 milhões de novos casos anualmente, dos quais cerca de 500.000 sejam visceral e 1,1 milhões cutânea ou mucocutânea (WHO, 2010). Os agentes causadores dessa doença são parasitas unicelulares heteroxênicos do gênero Leishmania que apresentam duas formas morfológicas no seu ciclo de vida: promastigota, quando estão infectando o inseto vetor e amastigota quando estão infectando o homem (Michalick, 2005; Magill, 1995). Apresenta diversos tipos de manifestações clínicas e se dividem em dois grupos principais: a forma tegumentar, que pode ser cutânea localizada, que se caracteriza por lesões únicas ou múltiplas na pele, geralmente no rosto, braços e pernas; cutânea difusa, com lesões nodulares persistentes, no corpo inteiro; e mucocutânea ou cutâneo mucosa, que afeta de maneira preponderante as mucosas da face, como fossas nasais e o palato; e as formas viscerais, que se caracteriza pelo aumento no volume do fígado e baço, anemia, perda de peso e febre, e que, se não tratada a tempo, pode ser fatal (Hepburn, 2000; Herwaldt, 1999; Grevelink and Lerner,1996). Apesar de sua alta toxicidade, os antimoniais pentavalentes têm sido utilizados como drogas de primeira escolha para tratamento da Leishmaniose. A anfotericina B lipossomal, pentamidina, paramomicina e miltefosine são drogas de interesse por representarem novas alternativas terapêuticas, porém apresentam grandes problemas como efeitos colaterais, preço do produto e produção da formulação (Pereira et al., 2011) . A Organização Mundial de Saúde (WHO, 2010) recomenda que a leishmaniose visceral – que tem potencial de desenvolver resistência a drogas – seja tratada com combinação de medicamentos ao invés de 121 monoterapia. Porém, desde 2009 foi recomendado que anfotericina B lipossomal seja utilizada como estratégia provisória até que as combinações possam ser implementadas. A doença de Chagas é uma zoonose causada por Trypanosoma cruzi, que continua a persistir na Região das Américas, entretanto com a introdução de medidas de controle de vetores e transfusão de sangue mais segura, diminuiu-se o risco de transmissão e com isto, o número estimado de pessoas infectadas caiu de aproximadamente 20 milhões em 1981 para cerca de 10 milhões em 2009. Porém, devido à mobilidade da população ser cada vez maior, tem ocorrido o movimento da doença para áreas antes consideradas não-endêmicas, representando um desafio sério de saúde pública (WHO, 2010). As formas de transmissão de maior importância epidemiológica são a vetorial através de insetos hematófagos, os triatomíneos (barbeiros), a transfusional, a congênita e a oral (Coura et al., 2007). O T. cruzi possui um ciclo biológico complexo, envolvendo três formas evolutivas (tripomastigota, epimastigota e amastigota) e várias espécies de triatomíneos e de mamíferos, silvestres e domésticos, que atuam respectivamente, como vetores e reservatórios do parasito (Lana and Tafuri, 2005). As doenças endêmicas parasitárias representam um grave problema médico, social e humano e sua prevenção, controle e tratamento representam um grande desafio mundial (Dias et. al., 2009). Atualmente, os dois medicamentos usados para o tratamento são benzonidazol e nifurtimox, sendo que este último é contra-indicado em pacientes com antecedentes psiquiátricos ou distúrbios neurológicos (WHO, 2010), tendo sido abolido em alguns países. Portanto, pesquisas por novos fármacos antiparasitários para o combate da leishmaniose e da doença de Chagas são urgentes e necessárias. Neste trabalho, iremos verificar o potencial leishmanicida e tripanocida, bem como a citotoxicidade de uma samambaia lianescente, Lygodium venustum, cujo uso popular tem sido relatado para o tratamento de dermatoses, infecções, micoses e tricomoníases (Duke, 2008). MATERIAIS E MÉTODOS Material vegetal Folhas de L. venustum foram coletadas em Crato, estado do Ceará, Brasil em maio de 2010. O material vegetal foi identificado pelo Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva e depositado no Herbário Cariense Dárdano de Andrade-Lima da Universidade Regional do Cariri URCA, com o número 5569 HCDAL. 122 Preparação do Extrato Etanólico e Fração Hexânica das folhas de L. venustum. Folhas frescas de L. venustum (211,18g) foram submersas em etanol 92% em temperatura ambiente durante 72h. O extrato obtido foi filtrado e concentrado à vácuo em rotaevaporador a 60ºC e 760mm/Hg de temperatura e pressão, respectivamente, obtendo-se 12,42g de extrato bruto. O fracionamento foi realizado tomando-se metade do extrato bruto, obtendo-se a fração hexânica com rendimento de 0,22g. Foram diluídos 0,01mg do extrato e da fração em dimetilsulfóxido (DMSO) para realização dos testes. Linhagens celulares utilizadas Para estudos in vitro de T. cruzi, cepas de parasito CL-B5 (clone CL-B5) foram usados. Os parasitos estavelmente transfectados com o gene β -galactosidase de Escherichia coli (LacZ ) foram cedidos pelo Dr. F. Buckner por meio do Instituto Comemorativo Gorgas (Panamá). Os epimastigotas foram cultivados a 28°C em infusão de fígado triptose (LIT) com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina e estreptomicina como descrito anteriormente e colhidas durante a fase de crescimento exponencial. Para o estudo da atividade leishmanicida in vitro, foi utilizado formas promastigotas de L. braziliensis (MHOM/CO/88/UA301) a 26°C em Schneider’s (meio para inseto) suplementado à 10% (v/v) de soro fetal bovino inativado pelo calor, 2% de urina humana normal (v/v) mais penicilina e estreptomicina. A linhagem de celulas utilizada no teste de citotoxicidade foi a de fibroblastos de mamífero NCTC clone 929. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma) suplementado a 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor (30 minutos a 56 º C), penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/mL). Para os experimentos, as células na fase pré-confluência foram colhidas com tripsina. Culturas de células foram mantidas a 37 º C em uma atmosfera de 5% umidificado CO2. Ensaio de susceptibilidade para as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi O ensaio de rastreamento foi realizado em placas de microdiluição de 96 poços (Sarstedt, Inc.) com culturas que não atingiram a fase estacionária, como descrito por Vega e colaboradores (2005). Epimastigotas foram semeadas a 1 x 105 por mililitro em 200 μl, as 123 placas foram então incubadas com os extratos a 28°C por 72 horas, momento em que 50 μl de solução CPRG foram adicionados para dar a concentração final de 200 μM, as placas foram incubadas a 37°C por mais 6 h adicionais e então lidas a 595 nm em espectrofotômetro. O Nifurtimox foi utilizado como droga de referência. Cada concentração foi testada em triplicata. Cada experimento foi realizado duas vezes separadamente. O percentual de inibição (%AE) foi calculado como segue: %AE = [(AE _AEB)/(AC _ACB)] x 100, onde AE = absorbância do grupo experimental; AEB = branco de compostos; AC = grupo controle de absorbância; ACB = branco de meio de cultura. As soluções dos extratos a ser analisado foram preparados em dimetilsufóxido, com a concentração final uma mistura água/DMSO jamais excedendo 0.2% do solvente final. Ensaio de suscetibilidade para formas promastigotas de Leishmania brasiliensis O ensaio foi realizado seguindo um método anteriormente descrito (Mikus and Steverding , 2000) com modificações. Formas promastigotas (2.5 x 105 parasitas/poço) foram cultivadas em placas de 96 poços de plástico. As amostras foram dissolvidas em dimetilsufóxido (DMSO). Diferentes diluições dos compostos de até 200 mL de volume final são adicionados. Após 48 h a 26 °C, 20 mL de solução de resazurina foi adicionado e a oxidação-redução foi quantificada a 570 a 595 nm Cada concentração foi testada em triplicata. Em cada ensaio foi utilizado como controle drogas de referência. As porcentagens antipromastigotas (%AP) formam calculadas. A eficácia de cada composto foi determinada. Ensaio de citotoxicidade O procedimento para a medição de viabilidade celular foi avaliada com resarzurina por método colorimétrico descrito anteriormente (Rólon et al., 2006). Fibroblastos NCTC929 foram semeados (5 x 104 células/ poço) em placas de microdiluição de fundo chato de 96 poços com 100 μl de meio RPMI 1640. Deixou-se que as células pavimentassem as placas por 24h a 37oC e atmosfera de 5% de CO2. O meio foi substituído por diferentes concentrações das drogas em 200 μl de meio e, em seguida, foram incubados por mais 24h. Controles de crescimento também foram incluídos. Posteriormente, um volume de 20 μl da solução 2mM de resazurina foi adicionado e as placas foram devolvidas à incubadora por outras 3h para avaliar a viabilidade celular. A redução da resazurina foi determinada por medida de absorbância do comprimento de onda a 490nm e 595nm. Cada concentração foi testada três 124 vezes. Meio e drogas controle foram 32 usados em cada teste como brancos. A citotoxicidade de cada composto foi estimada através do cálculo do percentual de citotoxicidade (C%). A atividade tripanocida e a citotoxicidade foram testadas paralelamente, enquanto que a atividade leishmanicida foi testada somente nas concentrações em que não foram tóxicas às células de mamíferos. RESULTADOS E DISCUSSÃO No presente estudo foram avaliadas a citotoxicidade de Lygodium venustum utilizando fibroblastos de mamíferos e a bioatividade antiparasitária contra as formas epimastigota de T. cruzi e promastigota de L. brasiliensis. A forma epimastigota de T. cruzi apresenta-se de forma alongada, com cinetoplasto justanuclear e anterior ao núcleo e flagelo livre na porção anterior. Podemos identificá-la como sendo a forma de replicação que se observa no hospedeiro invertebrado (triatomíneo) localizada na porção posterior do intestino e em cultura em meio líquido (Chagas, 1909; Rey, 2001; Lana and Tafuri, 2005;). A forma promastigota de Leishmania possui flagelo único, núcleo no terço médio da célula e cinetoplasto em posição anterior. Estas formas presentes no hospedeiro invertebrado são englobadas por macrófagos de hospedeiros vertebrados (Michalick, 2005). De acordo com Castilhos (2008), estudos envolvendo Leishmania spp apresentam o foco na forma extracelular do parasito, conhecido como promastigota, ao invés da forma amastigota, devido à facilidade de cultura in vitro e de não envolver outra cultura de células de células como macrófagos, por exemplo. Dessa forma, entende-se que o mesmo se pode dizer do T. cruzi e a forma epimastigota, ensaiada nesta pesquisa. Fibroblastos são células encontradas no tecido conjuntivo de mamíferos. Estas células têm sido geralmente escolhidas para realização de testes de citotoxicidade porque são de fácil manutenção e produzem resultados que apresentam alta correlação com os biológicos e ainda por estarem presentes em ferimentos, sendo o principal tipo de célula presente na regeneração (Ratner et al., 2004). Os testes de toxicidade são elaborados com os objetivos de avaliar ou prever os efeitos tóxicos nos sistemas biológicos e dimensionar a toxicidade relativa das substâncias (Forbes and Forbes, 1994), nesse sentido, os resultados podem fornecer informações valiosas para a triagem de produtos naturais que apresentem condições de serem considerados como prováveis candidatos a fármacos. 125 Leishmaniose e doença de Chagas são doenças cujo tratamento é feito com medicamentos considerados tóxicos, além disso, este tratamento tem sido dificultado pelo desenvolvimento da resistência pelos parasitos. A quimioresistência está muito presente em alguns países onde o fármaco não é mais utilizado com eficiência e novos estudos tiveram que ser conduzidos para o entendimento dos mecanismos de ação e compreensão da quimioresistência (Boibessot et al., 2002). Em busca de novos fármacos, pesquisas de produtos naturais com bioatividade antiparasitária e ausência ou uma baixa citotoxicidade vem sendo realizadas (Rojas et al., 2010; Mesquita et al., 2005; Luize, et al., 2005). Nos testes realizados, a citotoxicidade e a atividade tripanocida foram realizadas concomitantemente, observando-se o efeito do produto natural na medida em que se diminuía a sua toxicidade em fibroblastos (tabela 1). De uma maneira geral, tanto o extrato como a fração foram extremamente tóxicos na concentração mais elevada do produto (1000µg/mL), sendo que a fração hexânica continuou demonstrando toxicidade máxima até a concentração de 250µg/mL. Na concentração em que não houve citotoxicidade, o efeito antiepimastigota foi irrelevante. O extrato demonstrou mesma toxicidade que a fração na concentração de 500µg/mL e em ambos, o efeito sobre formas epimastigotas foi abaixo de 50%. Diante dos resultados da citotoxicidade é que foram realizados os testes de suscetibilidade para a forma promastigota. Nenhuma atividade foi demonstrada pelo extrato e a fração hexânica demonstrou um efeito extremamente baixo (tabela 2). Segundo hipóteses mais recentes, metabólitos secundários de plantas seriam formados com a função de defender a espécie de predadores. Por isso, não é surpreendente que muitas plantas acumulem substâncias de elevada toxicidade. As substâncias tóxicas em uma planta podem estar limitadas a uma estação do ano ou a certas condições ambientais, ou ainda a certas variedades ou cultivares (Simões et al., 2010). Estudos mostram que o mecanismo de ação da citotoxicidade está relacionado à capacidade destas plantas de induzir apoptopse celular (Block et al., 2004). Este foi o primeiro relato sobre a citotoxicidade da samambaia Lygodium venustum. A avaliação de sua bioatividade antiparasitária contra T. cruzi e L. brasiliensis também é pioneira na família Lygodiaceae. CONCLUSÕES L. venustum não apresentou atividade antiparasitária clinicamente relevante na forma de extrato etanólico bruto nem como fração hexânica contra Leishmania. A fração hexânica 126 apresentou uma atividade intermediária contra T. cruzi, porém a concentração de efeito moderado possui citotoxicidade máxima tornando-se inviável para aplicação clínica. Os compostos químicos presentes no produto natural foram incapazes de afetar as formas de protozoários em concentrações de baixa toxicidade. Portanto, para o caso do T. cruzi, as concentrações em que demonstraram atividade moderada foram tóxicas sobre as células fibroblásticas e para o caso da L. brasiliensis os produtos naturais não foram ativos nas concentrações não tóxicas. Entretanto, a citotoxicicidade apresentada poderá ser útil em pesquisas sobre atividade antineoplásica em células tumorais, pois a planta pode ser potencialmente considerada como fonte promissora de metabólitos secundários anticancerígenos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Block S, Gerkens P, Peulen O, Jolois O, Mingeot-Leclercq MP, De Pauw-Gillet MC, QuetinLeclercq J. 2005. Induction of apoptosis in human promyelocytic leukemia cells by a natural trachylobane diterpene. Anticancer Res 25: 363-368. Boibessot I, Turner CMR, Watson DG, Goldie E, Connel G, Mcintosh A, Grant MH, Skellern GG. 2002. Metabolism and distribution of phenanthridine trypanocides in Trypanosoma brucei. Acta Tropica 84: 219-228. Brasil. Ministério da Saúde. 2010. Doenças negligenciadas: estratégias do Ministério da Saúde. Texto de difusão técnico-científico do Ministério da Saúde. Rev Saúde Pública 44: 200-2. Castilhos P. 2008. Efeito da peçonha de Bothrops moojeni sobre formas promastigotas de Leishmania spp. Tese de doutorado. Programa de pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas. Universidade federal de Uberlândia. Minas Gerais. Chagas C. 1909. Nova tripanossomíase humana. Estudos sobre morfologia e o ciclo evolutivo do Trypanosoma Schizotrypanum cruzi, n. gen., n. sp., agente etiológico de nova entidade mórbida do homem. Mem Inst Oswaldo Cruz 1: 159-218. Coura JR, Junqueira ACV, Carvalho-Moreira CJ, Borges-Pereira J, Albajar PV. 2007. Uma visão sistêmica da endemia chagásica. Silveira In AC, La Enfermedad de Chagas a la Puerta de los 100 Años del Conocimiento de Una Endemia Americana Ancestral. Organización Panamericana de la Salud y Fundación Mundo Sano, Buenos Aires. Dias, LC, Dessoy MA, Silva JJN, Thiemann OH, Oliva G, Andricopulo AD. 2009. Quimioterapia da doença de chagas: estado da arte e perspectivas no desenvolvimento de novos fármacos. Quím Nova 32: 2444-2457. 127 Duke JA. 2008. Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. New York: CRC Press Taylor & Francis group. Forbes VE, Forbes TL. 1994. Ecotoxicology in theory and practice. Londres: Chapman and Hall. Grevelink SA, Lerner EA. 1996. Leishmaniasis. J Am Acad Dermatol 34: 257-272. Hepburn, N. C. Cutaneous leishmaniasis. 2000. Clin. Exp. Dermatol 25: 363-370. Herwaldt BL. 1999. Leishmaniais. Lancet 354: 1191-1199. Lana M, Tafuri WL. 2005. Trypanosoma cruzi e a Doença de Chagas. In: Neves DP. et al. Parasitologia Humana. São Paulo: Atheneu. Luize OS, Tiuman TS, Morello LG, Maza PK, Ueda-Nakamura T, Dias Filho BP, Cortez DA, Garcia JCPM, Nakamura CV. 2005. Effects of medicinal plant extracts on growth of Leishmania (L.) amazonensis and Trypanosoma cruzi. Rev Bras Cien Farm 41: 8594. Magill AJ. 1995. Epidemiology of leishmaniases. Dermatol Clin 13: 5055-5023. Mesquita ML, Desrivot J, Bories C, Fournet A, Paula JH, Grellier P, Espindola LS. 2005.Antileishmanial and trypanocidal activity of Brazilian Cerrado plants. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 783-787, Michalick MSM. 2005. Gênero Leishmania. In: Neves DP, Melo AL, Genaro O, Linardi PM Parasitologia humana. 11. ed. São Paulo: Atheneu. Mikus J, Steverding D. 2000. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using dye Alamar Blue®. Parasitology International 48: 265259. Pereira IO, Sacramento LVS, Marques MJ. 2011. Leishmanioses: “o estado da arte”. Rev da Universidade Vale do Rio Verde 9: 220-238. Ratner B, Hoffman A, Schoen F, Lemons J. 2004. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine. Seconde Edition, Elsevier Academic Press. Rey L. 2001. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nas Américas e na África. Terceira edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. Rojas J, Solís H, Palacios O. 2010. Evaluación in vitro de La actividad anti Trypanosoma cruzi de aceites esenciales de diez plantas medicinales. An Fac med 71: 161-5. Rolón M, Seco E, Vega C, Nogal JJ, Escario JA, Gómez-Barrio A., Malpartida F. 2006. Selective activity of polyene macrolides produced by genetically modified Streptomyces on Trypanosoma cruzi. International Journal of Antimicrobial Agents 28: 104–109. 128 Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello J CP, Mentz LA, Petrovick PR. 2010 Farmacognosia: da planta ao medicamento. Sexta edição. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC. Vega C, Rolón M, Martínez-Fernández AR, Escario JA, Gómez-Barrio A. 2005. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitol Res 95: 296-8. World Health Organization. International Workshop, Intensified control of neglected diseases, Summary Report, 10–12 December 2003 [http://whqlibdoc.who.int/hq/2004/WHO_CDS_CPE_CEE_2004.45.pdf] World Health Organization. 2010. Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases: First WHO report on neglected tropical diseases. [http://www.who.int/neglected_diseases/2010report/NTD_2010report_embargoed.pdf] Tabela 1: Citotoxicidade e atividade antiepimastigota de extrato e fração de Lygodium venustum. Produto natural Conc. µg/mL %C ± %DS Conc.(µg/mL) %AE ± %DS EELV FHLV 1000 100 0,04 1000 25,45 2,98 500 100 14,88 500 33,94 11,88 1000 100 1,78 1000 63,14 2,93 500 100 11,19 500 42,04 8,05 250 100 10,84 62,5 5,01 9,05 125 74,1 2,94 31,25 5,72 5,68 62,5 0 4,66 15,62 2,87 3,71 Conc.: concentração; EELV: Extrato etanólico de Lygodium venustum; FHLV: Fração hexânica de L. venustum; %C: percentual de citotoxicidade; %AE: percentual de atividade antiepimastigota; ± %DS: Desvio Padrão. Tabela 2: Atividade antipromastigota de extrato e fração de Lygodium venustum. Produto natural Conc. µg/Ml %AP ± %DS EELV 500 0,00 0,65 FHLV 62,5 2,61 1,86 Conc.: concentração; EELV: Extrato etanólico de Lygodium venustum; FHLV: Fração hexânica de L. venustum; %AP percentual de atividade antipromastigot 129 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo foi submetido ao Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromaticas, tendo sido rejeitado. Após a alterações propostas pelos revisores deverá ser ressubmetido. ---------- Forwarded message ---------From: Jose Luis Martinez <[email protected]> Date: 2012/1/31 Subject: Desde BLACPMA To: Henrique DM Coutinho <[email protected]> Estimado Dr. Coutinho: Adjunto encontrara las pautas de evaluación de su articulo BLACPMA Nº 447. Debido a los fundamentos dados por los dos evaluadores, queda RECHAZADO. Si usted hace las correcciones dados por ambos evaluadores y decide nuevamente enviarlo, este articulo ingresara como articulo nuevo, volviendo a ser evaluado. Lamentando esta noticia, le saluda Jose Luis Martinez Editor Jefe 130 5.7 ANTI-LEISHMANIA, ANTI- TRYPANOSOMA AND CYTOTOXIC ACTIVITIES OF NATURAL PRODUCTS FROM Lygodium venustum SW. (LYGODIACEAE) RESUMO A busca por novos agentes terapêuticos tem sido uma constante para o tratamento de doenças como leishmaniose e doença de Chagas. A grande maioria dos fármacos utilizados tem causado efeitos colaterais múltiplos e relevantes, justificando-se a necessidade da avaliação da citotoxicidade dos produtos testados, candidatos a novos fármacos. Neste estudo sobre bioatividade de Lygodium venustum, uma samambaia cosmopolita da família Lygodiaceae, avaliou-se o seu potencial leishmanicida e tripanocida, obtendo-se comparativamente, melhores resultados contra as formas epimastigotas. A fração que apresentou melhor atividade foi a metanólica, com percentual de inibição de 63% e 68% para as formas epimastigotas e promastigotas respectivamente, na concentração de 500µg/mL. A citotoxidade apresentou percentual relevante para as frações acetato de etila e metanólica. Este foi o primeiro relato da atividade leishmanicida, tripanocida e citotóxica de uma pteridófita da família Lygodiaceae. Palavras-chave: Lygodium venustum, atividade leishmanicida, atividade tripanocida, citotoxicidade. 131 Anti-Leishmania, Anti- trypanosoma and cytotoxic activities of natural products from Lygodium venustum SW. (Lygodiaceae) Maria F. B. Morais-Braga1, Teógenes M. Souza1, Karla K. A. Santos1, Gláucia M. M. Guedes1, Jaqueline C. Andrade 1, Celeste Vega4, Miriam Rolón4, Antonieta R. Arias4, José G. M. Costa2, Antonio A. F. Saraiva3, Henrique D. M. Coutinho1* 1 Laboratory of Microbiology and Molecular Biology, 2 Laboratory of Natural Products Research, 3 Laboratory of Paleontology, Regional University of Cariri, Crato, Brazil, 4Centre for the Development of Scientific la Investigación (CEDIC), Fundación Moisés Bertoni/Laboratorios Diaz Gill. Asuncion-Paraguay. * Corresponding author: Henrique D. M. Coutinho. Departamento de Química Biológica, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: [email protected] 132 ABSTRACT The search for new therapeutic agents has been a constant for the treatment of diseases such as leishmaniasis and Chagas disease. Most drugs used have side effects, justifying the need to evaluate the cytotoxicity of the tested products for candidates to new drugs. In this study, the bioactivity of Lygodium venustum, a cosmopolitan fern of Lygodiaceae, was assessed about their leishmanicidal and trypanocidal potential. The better activity was observed using methanol fraction, with inhibition percentage of 63 and 68% for promastigotes and epimastigotes, respectively, at a concentration of 500μg/mL. The ethyl acetate and methanol fractions demonstrated a higher cytotoxic potential. This was the first report of leishmanicidal, trypanocidal and cytotoxic activities to L. venustum. Keywords: Lygodium venustum, leishmanicidal activity, trypanocidal activity, cytotoxicity. INTRODUCTION The Leishmaniasis is a polymorphic group of diseases caused by protozoan parasites of the genus Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae), which are transmitted to humans and other mammals through the bite of the female insect Lutzomyia spp. The disease has diverse clinical presentations and can affect the skin, mucous membranes and internal organs. The parasite Leishmania brasiliensis is one of those responsible for the cutaneous form (CL) and mucocutaneous (LMC) of the disease, being understood as American Cutaneous Leishmaniasis (Genaro & Michalick, 2005; Genaro & Reis, 2005). For the treatment of Leishmaniasis are used pentavalent antimonials, amphotericin B, pentamidine and miltefosine, all demonstrating high toxicity, high cost and problems during the use, beside the possibility to cause resistance of parasite (Rath et al., 2003; Croft & Coombs, 2003). Chagas disease or American trypanosomiasis is a disease caused by Trypanosoma cruzi, transmited by haematophagous insects from the genus Triatoma, (Reduviidae) (Lana & Tafuri, 2005). Several tests were performed seeking a therapeutic solution against this infectious disease. Benzonidazole and nifurtimox are the main compounds used as antiparasitic drugs for American trypanosomiasis, bu these drugs are not consistently effective and have serious side effects, including cardiac and renal toxicity (Veloso et al., 2001; Ruiz et al., 2004). 133 Due the difficulty to discover drugs effective in the therapy and non toxic to humans, natural products have been tested. Many species of plants has been investigated for their antileishmanial and trypanocidal activities (Mesquita et al., 2005; Coro et al., 2005). Isolated semi-synthetic or synthetic compounds are also studied to discover new therapeutic agents against these diseases (Roldos et al., 2008; Saraiva, 2007; Moran, 1995). Lygodium venustum (Lygodiaceae) is a fern with worldwide distribution and lianescent habit (Mehltreter, 2006). This fern is used as a bioindicator of environmental degradation and as a remedie in the folk medicine by south American populations (Duke, 2008; Argueta et al., 1994; Brasileiro et al., 2006). The objective of this study was evaluate, through in vitro assays, the trypanocidal and leishmanicidal and cytotoxic activity of ethanol extract and dichloromethane, ethyl acetate and methanol fractions of leaves from L. venustum. MATERIALS AND METHODS Plant material Leaves of L. venustum were collected in may 2010 in the city of Crato, Ceará State, Brazil. The plant material was identified by Dr. Antonio Álamo Feitosa Saraiva, and voucher specimen have been deposited with the identification number 5569 HCDAL at the Herbarium Caririense Dárdano de Andrade-Lima, of the University of the Region of Cariri – URCA. Preparation of ethanol Extract (EELV) and dichloromethane, ethil acetate and methanol fractions (DFLV, EAFLV, MFLV) of L. venustum Leaves were collected and 211,18g were weightened, dried and keeped at room temperature. These material was powdered and extracted by maceration using 1L of 95% ethanol solvent at room temperature. The mixture was allowed to stand for 72h at room temperature. The extract was filtered and concentrated under vacuum in rotary evaporator at 60ºC and 760mm/Hg temperature and pressure, respectively (Buckner et al., 1996), obtaining 12,42g of ethanol extract. Fractionation was performed using the ethanol extract, resulting in the fractions used in the tests (dichloromethane, ethyl acetate and methanol to yield 0.39g, 0.52g and 3g respectively). The extract and fractions were diluted to 0.01mg each using DMSO before the assays. 134 Cell strains used For in vitro studies of T. cruzi, the clone CL-B5 was used (Le Senne et al., 2002). The stably parasites was transfected with the Escherichia coli β-galactosidase gene (lacZ), were kindly provided by Dr F. Buckner through Instituto Conmemorativo Gorgas (Panama). Epimastigotes were grown at 28ºC in liver infusion tryptose broth (Difco, Detroit, MI) with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA), penicillin (Ern, S.A., Barcelona, Spain) and streptomycin (Reig Jofré S.A., Barcelona, Spain), as described previously (Roldos et al., 2008), and harvested during the exponential growth phase. Culture of Leishmania was obtained from the Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud, Asunción, Paraguay - IICS. The maintenance of strain, the form of cultivation and isolation shape promatigota followed the procedures described by Roldos et al. (2008). The inhibition assays of promastigotes were performed using the strain of L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), grown at 22ºC in Schneider's Drosophila medium supplemented with 20% FBS. The cytotoxicity assays used strain of fibroblasts NCTC929 grown in Minimal Essential Medium (Sigma). The culture medium was supplemented with heat-inactivated FBS (10%), penicillin G (100U/ml) and streptomycin (100mg/mL). Cultures were maintained at 37ºC in humid atmosphere with 5% CO2. The viability of these strains was assessed according to Roldos, et al. (2008), through the use of resazurin as a colorimetric method. Reagents Resazurin sodium salt was obtained from Sigma-Aldrich (St Louis, MO) and stored at 4 °C protected from light. A solution of resazurin was prepared in 1% phosphate buffer, pH 7, and filter sterilized prior to use. Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside (CPRG; Roche, Indianapolis, IN) was dissolved in 0.9% Triton X- 100 (pH 7.4). Penicillin G (Ern, S.A., Barcelona, Spain), streptomycin (Reig Jofré S.A., Barcelona, Spain) and dimethylsulfate were also used. In vitro Epimastigote susceptibility assay The screening assay was performed in 96-well microplates with cultures that had not reached the stationary phase (Vega et al., 2005). Briefly, epimastigotes were seeded at 1 x 105 135 mL-1 in 200µL of liver tryptose broth medium. The plates were then incubated with the drugs (0.1-50µg/mL) at 28°C for 72 h, at which time 50 µL of CPRG solution was added to give a final concentration of 200µM. the plates were incubated at 37°C for an additional 6 h and were then read at 595 nm. Each experiment was performed twice and independently, each concentration was tested in triplicate in each experiment. The efficacy of each compound was estimated by calculating the antiepimatigote percentual (AE%). In vitro leishmanicidal assay The assay was performed using a modification of a previous method. Cultures of promastigotes of L. brasiliensis were grown to a concentration of 106 cells/mL and then transferred to the test. The compounds were dissolved in DMSO to the concentrations to be tested and were transferred to microplates. Each test was performed in triplicate. The activity of compounds was evaluated after 72h bydirect counting of cells after serial dilutions and compared with an untreated control. Cytotoxicity assays NCTC929 fibroblasts were plated in 96-well microplates at a final concentration of 3 x 4 10 cells/well. The cells were grown at 37ºC in an atmosphere of 5% CO2. After that, the culture medium was removed and the compounds were added to 200µL, and performed a new culture for 24h. After this incubation, 20µL of a 2mM solution of resazurin was added to each well. The plates were incubated for 3 hours and the reduction of resazurin was measured using dual absorbance at wavelengths of 490 and 595nm. The value of the control (blank) was subtracted. Each concentration was tested in triplicate. RESULTS AND DISCUSSION Cytotoxic in vitro assay is the first test to evaluate the biocompatibility of any material for use in biomedical devices (International Standard, 1992). In most cases, the results are not extrapolated directly to the animals, because if a product causes damage to cells in vitro, may also affect animals exposed (Carvalho, 1996). 136 The most widely used parameter to assess cytotoxic activity is the cell viability, which can be detected by the use of dyes as neutral red, which allows the distinction between living cells and damaged or dead (Ciapetti et al., 1996). Different products has been tested to evaluate the cytotoxic potential, allowing the possibility of discovering new drug candidates, whose side effects are lower. Among plants, the angiosperms are the most studied. Different cells can be used in these assays, as astrocytes, macrophages and human or murine fibroblasts, or brine shrimp as Artemia salina (Martins et al., 2009; Nakamura et al., 2006; Hughes et al., 2006; Lima et al., 2009). A qualitative chemical screening using the methodology de Matos (1997) showed that the ethanol extract of L. venustum presents in its composition of secondary metabolites (data not shown), such as flobabenic tannins, flavones, xanthones, chalcones, flavonoids, alkaloids and flavonones and some of these compounds have already demonstrated antiparasitic potential (Torres-Santos et al., 1999; Kam et al., 1999; Leite et al., 2010). Dichloromethane Fraction did not show any activity against the parasites at a concentration of 100μg/mL, but showed low activity when the concentration in creased to 500µg/mL (table 1). This fact suggest a dose-dependent effect, however, the required dose would be clinically irrelevant. The cytotoxic test of this fraction indicates that polar compounds extracted by the solvent did not cause high toxicity in fibroblasts in all tested concentrations. The ethyl acetate fraction had no effect on L. brasiliensis in the tested concentrations, but inhibited 45% of the epimatigote forms in the both concentrations. The cytotoxic effect increased with the concentration, killing 67% of fibroblasts in a concentration of 500µg/mL. One of the main types of secondary metabolites prospected by ethyl acetate solvent are flavonoids (Simões et al., 2010). In Argentina, flavonoids isolated from several plants were tested against Leishmania and Trypanosoma, achieving significant results (Sülsen et al., 2007). These results demonstrate that these metabolites could have significant potential against these parasites. However, other compounds present in the ethyl acetate fraction may have antagonist effect against the flavonoids of L. venustum, explaining the low activity in the same concentrations to Leishmania. The best results against the promastigote forms of L. brasiliensis and epimastigote T. Cruzi were obtained from the methanol that showed antiparasitic activity of 68% and 63% respectively at a concentration of 500µg/mL. However, this same concentration, the fraction showed 53% cytotoxicity. The use of methanol permit the extraction of glycosides and alkaloids (Simões et al., 2010). Studies have shown that these secondary metabolites showed 137 antiparasitic activity against Leishmania and Trypanosoma relevant (Bravo et al., 2001; Batista et al., 2007; Fournet et al., 2007). The analysis of biochemical factors involved in Leishmania- and Trypanosoma-host interactions shows that these parasites have metabolic pathways similar to those found in host cells. This condition makes the treatment of the diseases caused by these protozoa is difficult (Soares-Bezerra et al., 2004). So, the research of new drugs with antiparasitic activity and low toxicity is very important, mainly to be used as therapeutic alternatives against thes neglected diseases. Until this study, no species of the family Lygodiaceae had been tested against parasites of the genus Leishmania and Trypanosoma, as well as never before had their cytotoxic effects observed. So, this is the first report on bioactivity and cytotoxicity against parasites by a species of this pteridophytes group. This fact indicates the necessity of study these plants as a future source of natural products with antiparasitic and other activities. ACKNOWLEDGEMENTS The authors are grateful to the Brazilian research agencies FUNCAP and CNPq. REFERENCES Argueta, A.; Cano, L.; Rodarte, M. (1994). Atlas de las Plantas de La Medicina Tradicional Mexicana. Mexico City, Instituto Nacional Indigenista, 1786 p. Batista, R.; Humberto, J.L.; Chiari, E.; de Oliveira, A.B. (2007). Synthesis and trypanocidal activity of ent-kaurane glycosides. Bioorganic and Medical Chemistry, 15: 381-391. Brasileiro, B.G.; Pizziolo, V.R.; Raslan, D.S.; Jamal, C.M.; Silveira, D. (2006). Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, 42: 195-202. Bravo, B.J.A.; Sauvain, M.; Gimenez, T.A.; Balanza, E.; Laurent, S.; Laprévote, O,; Massiot, G.; Lavaud, C. (2001). Trypanocidal Withanolides and Withanolide Glycosides from Dunalia brachyacantha. Journal of Natural Products, 64: 720-725. Buckner, F.S.; Verlinde, C.L.; La Flamme, A.C.; Van Voorhis, W.C. (1996). Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40: 2592–2597. Carvalho, T.U. (1996). Cultura de Células Animais. In: Benchimol, M. Ed. Métodos de Estudo da Célula. Rio de Janeiro, FENORTE/UENF. p. 45-58. 138 Ciapetti, G.; Granchi, D.; Verri, E.; Savarino, L.; Cavedagna, D.; Pizzoferrato, A. (1996). Application of a combination of neutral red and amido black staining for rapid, reliable cytotoxicity testing of biomaterials. Biomaterials, 17: 1259-1264. Coro, J.; Pérez, R.; Rodríguez, H.; Suárez, M.; Veja, C.; Rolón, M.; Montero, D.; Nogalc, J.J. and Gomez-Barrio, A. (2005). Synthesis and antiprotozoan evaluation of new alkyl-linked bis(2-thioxo-[1,3,5]thiadiazinan-3-yl) carboxylic acids. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13: 3413–3421. Croft, S.; Coombs, G. (2003). Leishmaniasis, current chemotherapy and recent advances in the search for novel drugs. Trends in Parasitology, 19: 502-508. Duke, J.A. (2008). Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America. New York, CRC Press Taylor & Francis group. 832 p. Fournet, A.; Ferreira, M.E., Rojas de Arias, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H. (2007). Phytochemical and antiprotozoal activity of Ocotea lancifolia. Fitoterapia, 78: 382-384. Genaro, O.; Michalick, M.S.M. (2005). Leishmaniose Visceral Americana. In: Neves, D.P. Ed. Parasitologia Humana. São Paulo, Atheneu. p. 67-83. Genaro, O.; Reis, A.B. (2005). Leishmaniose Tegumentar Americana. In: Neves, D.P. Ed. Parasitologia Humana. São Paulo, Atheneu. p. 47-66. Hughes, J.B.; Silva, V.D.A. da; Silva, A.R.; Souza, C. dos S.; Silva, A.M.M. da; Velozo, E. da S.; Batatinha, M.J.M.; Costa, M. de F.D.; Tardy, M.; Elbachá, R. dos S.C. (2006). Cytotoxicity effect of alkaloidal extract from Prosopis juliflora Sw. D.C. (Algaroba) pods on glial cells. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, 43: 50-58. International Standard: Biological Evaluation of Medical Devices – Part 5 (1992): Tests for Cytotoxicity: in vitro methods. Kam, T.S.; Sim, K.M.; Koyano, T.; Toyoshima, M.; Komiyama, K. (1999). Leismanicidal alkaloids from Kopsia griffithii. Phytochemistry, 50: 75-79. Mehltreter K. (2006). Leaf Phenology of the Climbing Fern Lygodium venustum in a Semideciduous Lowland Forest on the Gulf of Mexico. American Fern Journal, 96: 21-30. Lana, M.; Tafuri, W. L. (2000). Trypanosoma cruzi e doenca de Chagas. Neves, D. Ed. Parasitologia humana. São Paulo, Atheneu. p. 73-96. Le Senne, A.; Muelas-Serrano, S.; Fernandez-Portillo, C.; Escario, J.A.; Gómez-Barrio, A. (2002). Biological characterization of a beta-galactosidase expressing clone of Trypanosoma cruzi CL strain. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 97: 1101–1105. Leite, A.C.; Neto A.P.; Ambrozin, A.R. P.; Fernandes, J. B.; Vieira, P.C.; Silva, M. F. das G. F. da; Albuquerque, S. de. (2010). Trypanocidal activity of flavonoids and limonoids isolated from Myrsinaceae and Meliaceae active plant extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia, 20: 1-6. 139 Lima, J.M.; Silva, C.A.; Rosa, M.B.; Santos, J.B.; Oliveira, T.G.; Silva, M.B. (2009). Prospecção fitoquímica de Sonchus oleraceus e sua toxicidade sobre o microcrustáceo Artemia salina. Planta Daninha, 27: 7-11. Martins, M.D.; Marques, M.M.; Bussadori, S.K.; Mesquita-Ferrari, R.A.; Pavesi, V.C.S.; Wadt, N.S.; Fernandes, K.P. (2009). Citotoxicidade in vitro de extratos de arnica brasileira (Solidago microglossa) e arnica paulista (Porophyllum ruderale). ConScientiae Saúde, 8: 99104. Matos, F.J.A. (1997) Introdução à Fitoquímica Experimental. 2ª Ed. Fortaleza: Ed. UFC. 141 p. Maya, J.D.; Repetto, Y.; Agosin, M.; Ojeda, J.M.; Tllez, R.; Gaule, C.; Morello, A. (1997). Effects of nifurtimox and benznidazole upon glutatione and trypanothione content in epimastigote, trypomastigote and amastigote forms of Trypanosoma cruzi. Molecular Biochemistry and Parasitology, 86: 101-106. Mesquita, M.L. de; Desrivot, J.; Bories, C.; Fournet, A.; Paula, J.E. de; Grellier, P.; Espindola, L.S. (2005). Antileishmanial and trypanocidal activity of Brazilian Cerrado plants. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 100: 783-787. Moran, R.C. (1995). Schizaeaceae. Moran R.C.; Riba R. Eds. Flora Mesoamericana 1. Psilotaceae a Salviniaceae. Ciudad de México, Universidad Nacional Autónoma de México. p. 52. Nakamura, C.V.; Santos, A.O.; Vendrametto, M.C.; Luize, P. S.; Dias Filho, B.P.; Cortez, D.A.G.; Ueda-Nakamura, T. (2006). Atividade antileishmania do extrato hidroalcoólico e de frações obtidas de folhas de Piper regnellii (Miq.) C.DC.var. pallescens (C. DC.) Yunck. Revista Brasileira de Farmacognosia, 16: 61-66. Rath, S.; Trivelin, L.A.; Imbrunito, T.R.; Tomazela, D.M.; Jesus, M.N.; Marzal, P.C.; Andrade Júnior, H.F.; Tempone, A.G. (2003). Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: estado da arte. Quimica Nova, 26: 550-553. Roldós V.; Nakayama H.; Rolon, M.; Montero, A. T.; Trucco F.; Torres, S.; Vega, C.; Ponce, Y.M.; Heguaburu, V.; Yalluff, G.; Gomes-Barrio, A.; Sanabria, L.; Ferreira, M.E.; Arias, A.R. de; Pandolfi, E. (2008). Activity of a hydroxybibenzyl bryophyte constituent against Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi: In silico, in vitro and in vivo activity studies. European Journal of Medicinal Chemistry, 43(9): 1797-1807. Roldos, V.; Nakayama, H.; Rolón, M.; Montero-Torres, A.; Trucco, F.; Torres, S.; Vega C.; Marrero-Ponce, Y.; Heguaburu, V.; Yaluff, G.; Gómez-Barrio, A.; Sanabria, L.; Ferreira, M. E.; Arias, A. R.; Pandolfi, E. (2008). Activity of a hydroxybibenzyl bryophyte constituent against Leishmania spp. and Trypanosoma cruzi: In silico, in vitro and in vivo activity studies. Journal of Medicinal Chemistry, 43: 1797-1807. Ruiz, P. G.; Garavito, G.; Acebey, C. L.; Arteaga, L.; Pinzon, R.; Gimenez, T. A. (2004). Actividad Leishmanicida y Tripanocida de algunas plantas reportadas como medicinales en Colombia. Biofarbo, 13: 27-32. 140 Saraiva, J.; Vega, C.; Rolon, M.; Silva, R.; Silva, M.; Donato, P.; Bastos, J.; Gomez-Bairro, A.; Albuquerque, S. (2007). In vitro and in vivo activity of lignan lactones derivatives against Trypanosoma cruzi. Parasitology Research, 100: 791-795. Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.; Petrovick, P. R. (2010). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ªed. Porto Alegre/Florianópolis, Editora da UFRGS/Editora da UFSC. 1102 p. Soares-Bezerra, R. J.; Leon, L.; Genestra, M.M. (2004). Recentes avanços da quimioterapia das leishmanioses: moléculas intracelulares como alvo de fármacos. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 40: 139-149. Sülsen, V.P.; Cazorla, S.I.; Frank, F.M.; Redko, F.C.; Anesini, C.A.; Coussio, D.J.; Malchiodi, E.L.; Martino, V.S.; Muschietti, L.V. (2007). Trypanocidal and Leishmanicidal Activities of Flavonoids from Argentine Medicinal Plants. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 77: 654-659. Torres-Santos, E.C.; Moreira, D.L.; Kaplan, M.A.C.; Meirelles, M.N.; Bergmann, B.R. (1999). Selective Effect of 2,6-Dihydroxy-4-Methoxychalcone Isolated from Piper aduncum on Leismania amazonensis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43: 1234-1241. Vega, C.; Rolón, M.; Martínez-Fernández, A. R.; Escario, J. A.; Gómez-Barrio, A. (2005). A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing bgalactosidase. Parasitology Research, 95: 296–298. Veloso, V.M.; Carneiro, C.M.; Toledo, M.J.O.; Chiari, E.; Tafuri, W.L.; Bahia, M.T. (2001). Variation in susceptibility to benznidazole in isolates derived from Trypanosoma cruzi parenteral strains. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 96: 1005-1011. Table 1: In vitro activity of fractions of ethanol extract of leaves of Lygodium venustum against Leishmania brasiliensis and Trypanosoma cruzi and cytotoxicity. Fractions Dichloromethane Ethyl acetate Methanol Concentrations (µg/mL) (%C) Antiparasitic activity (%EA) (%PA) 500 0 34 6 100 0 0 0 500 67 45 0 100 30 45 0 500 53 63 68 100 0 28 31 %C: Percentage of dead fibroblasts; %EA: Percentage of dead epimastigotes of T. cruzi; %PA: Percentage of dead promastigotes of L. braziliensis. 141 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O artigo foi submetido ao Journal of Essential Oil Bearing Plants, que, após ser revisado, retornou para alterações. O artigo deverá sofrer algumas modificações para em seguida ser reencaminhado à citada revista. ---------- Forwarded message ---------From: arvinder bhalla <[email protected]> Date: 2012/2/11 Subject: Re: informations about an article To: Henrique Douglas Coutinho <[email protected]> Dear Dr. HENRIQUE DOUGLAS MELO COUTINHO, Your article entitle "Anti-Leishmania, Anti- trypanosoma and cytotoxic activities of natural products from Lygodium venustumSW. (Lygodiaceae)" has been reviewed. Some comments are given by learned referee to improve the quality of your research (See attach file). When you submit your revised paper, please could you also enclose a covering letters in which you indicate the actions that you have taken with respect to each of the point raised by the referees. Please send me revise manuscript at your earliest or within one week best regards Arvinder Singh Bhalla Managing Editor Journal of Essential Oil Bearing Plants (JEOBP) 7/1/2C, Prem Nagar Dehradun - 248007 India website : www.jeobp.com (J. Essential Oil Bearing Plants) website : www.anachemletters.org (Analytical Chemistry Letters)New Publication website : www.jbappn.com (J. Biologically Active Products from Nature)New Publication Mobile : +91-9219506760 142 5.8 PTERIDÓFITAS EM EVIDÊNCIA: ETNOBOTÂNICA E BIOATIVIDADES FARMACOLÓGICAS Maria Flaviana Bezerra Morais-Braga1, Teógenes Matias de Souza2, Irwin Rose Alencar de Menezes2, José Galberto Martins da Costa2, João Batista Teixeira da Rocha4, Margareth Linde Athayde3, Antonio Álamo Feitosa Saraiva1, Henrique Douglas Melo Coutinho2. 1 Departamento de Ciências Biológicas e 2 Departamento de Química Biológica da Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil; 3Departamento de Farmácia Industrial e Departamento de Química4 da Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil. * Autor para correspondência: Henrique Douglas Melo Coutinho Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular, Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato-CE, Brasil. Rua Cel. Antonio Luis 1161, Pimenta, 63105-000. Fone: +55(88)31021212; Fax +55(88) 31021291. E-mail: [email protected] 143 Pteridófitas em evidência: Etnobotânica e Bioatividades Farmacológicas RESUMO As pteridófitas são um dos grandes grupos de vegetais vasculares existentes em diversos lugares do planeta terra. Neste sentido, este capítulo discorrerá a respeito de sua utilidade para o bem-estar e melhoria da qualidade de vida das populações humanas. Previamente, é necessário que este grupo de plantas seja primeiramente apresentado e caracterizado para facilitar o entendimento da relação entre as espécies deste grupo e o homem. Em seguida, antes de consignar diferentes relatos sobre bioatividades, torna-se necessário destacar o uso medicinal de plantas para a cura de diversos tipos de enfermidades, através de abordagens etnobotânicas com expressões do uso (partes da planta, espécies utilizadas e serventia) em diferentes tipos de culturas. Dessa forma, será possível deleitar-se com as diversas potencialidades farmacológicas deste grupo que há milhões de anos habita o planeta, confirmando o conhecimento empírico e tradicional que expressa o poder da medicina fitoterápica. Para enriquecer o discurso sobre as potencialidades de pteridófitas, um interessante estudo de caso será demonstrado sobre a investigação de atividade antioxidante em samambaias de diferentes famílias. Nesta abordagem será dado ênfase a compostos fenólicos, fitoconstituíntes encontrados nas plantas, e sua interrelação com a capacidade de sequestrar radicais livres. 144 1. INTRODUÇÃO Pteridófitas são criptógamas vasculares e formam um grupo negligenciado rico em biodiversidade. Seus valores alimentício e medicinal não são muito bem conhecidos pela população mundial, embora sejam difundidos amplamente na literatura científica. A utilização destas plantas como agente terapêutico por sociedades antigas e contemporâneas, entre outras serventias, tem instigado a curiosidade em se conhecer um pouco mais sobre a prática medicinal popular, comprovando este hábito com dados cientificamente elucidados. Desta forma, as pteridófitas adquirem função de protagonistas na história humana no que se refere à utilização de plantas sem prejuízos a saúde. Relações entre pteridófitas e o homem tem sido registrada ao longo de muitos anos. O uso das pteridófitas é relatado no sistema de medicina Ayurvedic elaborado por Sushruta (ca 100 AD) e Charka (ca 100 AD) que recomendava o uso de algumas samambaias em suas Samhitas, a literatura médica tradicional. Pammel [1] compilou um manual de plantas venenosas do leste da América do Norte com breves citações sobre os valores medicinais e econômicos de várias plantas, incluindo algumas pteridófitas. Samambaias também são usadas pelos médicos no sistema de medicina Unani [2]. No sistema de medicina chinesa, muitas samambaias são prescritas por médicos locais [3]. Mais tarde, modernos estudos biológicos e farmacêuticos foram realizados em pteridófitas por diferentes pesquisadores. Benerjee e Sem [4] conduziram uma extensiva pesquisa para a atividade antibiótica de inúmeras samambaias, relatando sobre uma centena de espécies com tal propriedade. Dixit e Vohra [5] reportaram que importantes espécies de pteridófitas da Índia são usadas na alimentação e medicina popular. Kaushik [6] enfatizou a importância etnobotânica de samambaias de Rajasthan, India. Estudos importantes sobre o valor alimentar e medicinal de pteridófitas foram conduzidos por Nayar [7], Hodge [8], e Dixit [9]. Em 2004 Gosh et al. [10] reportou o uso de pteridofitas como plantas alimentícias e medicinais. O uso etnobotânico desse grupo é de imensa importância e isto é claramente entendido por pesquisadores como substrato necessário para a descoberta de princípios ativos capazes de promoverem o bem-estar e a saúde humana. 2. PTERIDÓFITAS: CARACTERIZAÇÃO E ASPECTOS ECOLÓGICOS Pteridófitas são plantas vasculares sem flores e sementes, que se reproduzem por esporos, cujo ciclo de vida heteromórfico é apresentado em duas fases, a gametofítica e a 145 esporofítica, compartilhando dessa forma uma alternância de gerações [11]. Por um longo tempo, estas plantas foram tratadas como um único grupo sendo classificado como pertencendo a uma divisão chamada pteridophyta [12], constituída por classes evolutivamente distintas, formando um táxon parafilético [13,14]. A partir da década de 90, novos estudos envolvendo análises cladísticas com dados morfológicos, ultraestrutura de gametas e análises de seqüências de DNA com uso de marcadores moleculares de genes plastidiais, mitocondriais e nucleares culminaram com o direcionamento das pteridófitas em duas linhagens monofiléticas distintas: as licófitas e as monilófitas (samambaias) [14,15,16]. Na nova classificação, o termo “pteridófitas”, designado para representar um grupo parafilético começa a cair em desuso e o que antes conhecíamos como “pteridófitas”, de acordo com Prado e Sylvestre [11] corresponde hoje às linhagens monofiléticas licófitas e samambaias. Apesar das semelhanças no ciclo de vida, estes grupos diferem filogeneticamente, e as samambaias são mais relacionadas com as plantas com semente do que as licófitas. As samambaias possuem megafilos e uma vascularização diferenciada, onde o protoxilema apresenta-se confinado a lobos do cordão do xilema. As raízes laterais são formadas a partir da endoderme, o protoxilema é mesarco (primeiras células do xilema em posição mediana, com maturação radial) nos brotos e os anterozoides possuem de 30 a 1.000 flagelos. A este grupo pertencem às classes Psilotopsida, Equisetopsida, Marattiopsida e Polypodiopsida e são reconhecidas 37 famílias e aproximadamente 12.240 espécies [13,14,17]. As licófitas caracterizam-se por apresentarem folhas do tipo microfilo (com apenas uma nervura central), arranjo dos microfilos helicoidal ou oposto, microfilos ligulados ou sem lígulas, esporângios nascidos na axila do microfilo (lado adaxial) ou esporângios geralmente organizados em estróbilos no ápice dos ramos [14,18] estima que hoje as licófitas representam menos de 1% de todas as plantas vasculares, sendo compostas pelas famílias Lycopodiaceae, Selaginellaceae e Isoetaceae [19, 20], com cerca de 1.300 espécies descritas [17]. Licófitas e samambaias ocupam uma grande diversidade de ambientes em variados ecossistemas, apresentando diferentes formas biológicas, incluindo quase todas as formas de crescimento e de adaptação das angiospermas [21] e são representadas por plantas terrestres, epífitas, hemiepífitas, rupículas ou aquáticas [11]. Segundo Moram [17], o número de espécies aumenta em ambos os hemisférios quando se aproxima da linha do equador, atingindo aproximadamente um total de 13.600 espécies, distribuídas em quatro centros de 146 maior diversidade: Sudeste Asiático com 4.500 spp., América do Sul com 3.500 spp., Mesoamérica com 1.800 spp. e a região das Antilhas com 1.200 spp. Ambientes tropicais úmidos e montanhosos com diferentes formas de disponibilidade híbrida, como precipitação, condensação e neblina, são locais de maior prevalência deste grupo de vegetais. Ocorrência em áreas de estação seca ou em clima semi-árido também é registrada; entretanto, como é de se esperar, isto ocorre em menor proporção. Informações contidas no Catálogo de Plantas e Fungos do Brasil [11] apontam que este país, por exemplo, com área territorial de 8.514.880 Km2, provavelmente possui a maior flora do mundo, perfazendo de 8,8 a 12,8%. Deste percentual, 9,2 a 13,1% de sua diversidade florística é distribuída entre samambaias e licóficas, sendo a ocorrência maior verificada nos Domínios Fitogeográficos Mata Atlântica, seguida pela Amazônia, Cerrado, Caatinga, Pampa e Pantanal. Portanto, para finalidade didática, neste capítulo será utilizado o termo pteridófita, uma vez que nem todas as plantas mencionadas, encontram-se apropriadamente classificadas em licófitas e monilófitas por seus pesquisadores. 3. ASPECTOS ETNOBOTÂNICOS: A IMPORTÂNCIA SÓCIO-ECONOMICA DO SEGUNDO MAIOR GRUPO DE PLANTAS VASCULARES. Com uma grande riqueza de espécies, era de se esperar que o homem se beneficiasse delas com o objetivo de melhorar sua qualidade de vida. Ao longo dos anos as pteridófitas vêm sendo amplamente utilizadas de diversas formas pelas populações humanas e a importância do grupo abrange aspectos econômicos diversificados, embora não sejam tão reconhecidos mundialmente. Como exemplo, pode-se destacar o uso etnobotânico como plantas ornamentais, como matéria prima para a fabricação de artesanatos, utensílios domésticos e cosméticos, em rituais místicos, na alimentação e na medicina popular. A utilização como planta ornamental, viva ou desidratada, tem despertado desde muito tempo o interesse das populações, e tem sido considerada uma das principais atividades econômicas deste grupo de plantas vasculares. Como exemplo disto, cita-se a espécie Rumohra adiantiformis (G. Forst) Ching a samambaia-preta ou verdes, que, através de sua extração direta do ambiente natural, tem sido a fonte de renda para cerca de três mil agricultores da Encosta Atlântica do rio Grande do Sul, Brasil (Ribas e Miguel, 2003) [22]. Outras espécies são citadas por Santos e Sylvestre (2006) [23] como plantas ornamentais, sendo estas Polypodium catharinae Langsd. & Fisch., Polypodium triseriale Sw., Adiantopsis 147 radiata (L.) Fée, Adiantum raddianum C. Presl., Pityrogramma calomelanos (L.) Link, Anemia collina Raddi, Thelypteris dentata (Forssk.) E.P. St. John, muito utilizadas na ornamentação de ambientes ou no preparo de arranjos de flores. Dicksonia sellowiana Hook, o xaxim, apesar da iminente ameaça de esgotamento como recurso natural não renovável e mesmo constando na lista oficial de plantas ameaçadas de extinção, tem sido extraída em atividade exploratória no estado do Paraná – Brasil, para a fabricação de vasos, placas, palito e pó [24]. Na Nicarágua, a samambaia de hábito lianescente Lygodium venustum SW., chamada localmente de crespillo é extraída para fabricação de cestas, sendo de grande importância para as famílias que sobrevivem desta atividade econômica. Esta mesma espécie é também utilizada no preparo da bebida sagrada ayashuasca pelas tribos indígenas Sharanahua e Culina na Amazônia Peruana [25, 26]. O uso místico de algumas espécies também é relatado. Selaginella bryopteris (L.) Bak. é fumada juntamente com o tabaco em rituais místicos causando alucinações, enquanto Trichomanes vittaria e Selaginella amazônica são empregadas em banhos para acalmar e atrair felicidade. Asplenium formosum e Microgramma vaccinifolia são usadas em banhos mediúnicos [27]. Pteridófitas são também apreciadas na alimentação, sendo que a grande maioria só é consumida depois de cozida, para que perca o sabor amargo. Como exemplo citam-se espécies como Maratta salicina (Sm.), Diplazium esculentum (Retz.) Sw., Máxima diplazium (D. Don) C. Chr., Dicranopteris linearis (Burm. f.) Und., Angiopteris evecta (Hoffm.) e Pteridium aquilinum (L.) Kuhn var. arachnoideum (Kaulf.) Brade, sendo que esta última pode desenvolver tumores no trato gastrointestinal em ratos e por causa deste efeito e da ação carcinogênica e mutagênica demonstrada por outras variedades desta espécie, aconselha-se que seja cessado o seu uso na alimentação [23, 28, 29, 30]. Entretanto, o uso secundário mais comum das pteridófitas é como planta medicinal. Nos últimos anos, diversos trabalhos vêm sendo realizados em inúmeras localidades e listagens contendo nome científico e popular, partes utilizadas e formas de uso pelas populações, além da sua serventia são divulgados no meio científico. Na realidade, os levantamentos etnobotânicos são muito importantes, pois fornecem informações valiosas sobre a terapêutica popular e, além disso, norteiam pesquisas sobre atividades farmacológicas de espécies mencionadas como medicinais, na busca incessante por compostos clinicamente utilizáveis. 148 4. ETNOMEDICINA DE PTERIDÓFITAS: SABEDORIA POPULAR E SAÚDE. Ao longo dos anos, experiências com plantas medicinais vêm sendo repassadas de geração em geração. O uso contínuo de pteridófitas por povos de todo o mundo ainda tem tido pouco destaque em relação ao grupo das angiospermas. Mesmo assim, espécies de diversas famílias são utilizadas em tratamentos fitoterápicos tradicionais, nos quais são utilizadas folhas, pinas, rizomas, raízes ou esporos, sob a forma de chá, decocto, pó, pomada ou xarope, entre outros, no combate a diversos tipos de enfermidades. Na literatura científica constam levantamentos etnofarmacológicos realizados em diferentes partes do mundo, mas a Índia tem se destacado como um dos países de maior divulgação do uso medicinal de pteridófitas. Diversas pesquisas etnofarmacológicas têm sido desenvolvidas registrando um número considerável de plantas. Pesquisadores como Karthik [31], Kumari [32], Upreti [28], Srivastava [29] e Benjamim e Manickam [33] realizaram levantamentos etnobotânicos sobre a fitoterapia popular deste país, nos quais foram totalizadas 91 espécies diferentes, sendo que apenas a espécie Angiopteris evecta (Forst.) Hoff. da família Marattiaceae foi citada em comum em todos os trabalhos. Tais pesquisas, apesar de sua grande relevância, não chegam a exprimir nem representar a etnofarmacologia mundial de pteridófitas. Muitas espécies utilizadas como fitoterápicos em diferentes regiões mundiais não chegaram a ser citadas, ou por não fazerem parte da biodiversidade indiana ou simplesmente por não terem esta finalidade nas localidades pesquisadas. Uma pequena amostra da medicina popular da pteridoflora indiana é aqui demonstrada, em uma seleção de sete espécies citadas comumente em pelo menos quatro trabalhos (quadro 01). As informações disponibilizadas podem ser consideradas um interessante guia para a busca de produtos naturais bioativos. Quadro 1. Uso medicinal de algumas pteridófitas Nome Botânico Adiantum capillus-veneris Linn. Uso Etnomedicinal O decocto das folhas é usado contra bronquite aguda e febre. A fronde contra tosse, gripe, contra mau hálito e como colírio. A planta é ainda usada como demulcente, espectorante, diurético, emenagogo, tônico, adstringente, depurativo, emético. A planta inteira é usada em um gel misturada com babosa e aplicada em cortes, feridas e como tônico capilar. O chá ou suco é usado contra tosse, bronquite e infecções de garganta. Internamente, é usada também contra alcoolismo e contra vermes. Externamente, é usada 149 contra picada de cobra e de abelhas. Para esta planta ainda são relatadas atividades anticancerígenas, hipoglicemiante, afrodisíacas, antimicrobianas e antivirais. Angiopteris evecta Hoffm. O rizoma pulverizado é utilizado misturado com água contra diarréia. È usada como alimento e contra fraturas. Ainda é utilizada na medicina tradicional como calmante e contra dor, febre e contra piolhos. O óleo essencial é utilizado na perfumaria local. O decocto das folhas é ingerido junto ao suco de limão para tratamento de dores de estômagos e úlcera. O extrato das folhas é utilizado no tratamento de disenteria. Os esporos são eficazes no tratamento de hanseníase e outras doenças de pele. Blechnum orientale Linn. O rizoma tem ação antihelmíntica e contra S. typhimurium. O suco das folhas é usado para curar úlceras intestinais e a pasta do rizoma é utilizada para tratar problemas na bexiga. Dicranopteris linearis (Burm. f.) Os brotos são consumidos como alimentos e as frondes Und. são utilizadas com cobertura de telhado e de paredes. O decocto é utilizado como laxante. Frondes também são utilizadas contra asma e apresentam ação antibacteriana e antihelmíntica. Na medicina tradicional, ainda é utilizada para curar a esterilidade feminina misturado com leite de vaca. Helminthostachys zeylanica (L.) Esta planta é utilizada contra processos de intoxicação e Hook., utilizada contra dores no nervo ciático. As fronds são usadas como afrodisíaco. O decocto do rizoma é utilizado contra impotência. As folhas jovens são cozinhadas como verduras. O rizoma pulverizado misturado com leite de vaca é usado como tônico estimulante e cerebral e aperiente. Na medicina tradicional, esta planta é utilizada como anestésico e no tratamento de bolhas, úlceras e disenteria. Lygodium flexuosum (L.) Sw. O rizoma pulverizado é usado contra herpes, doenças de pele, como expectorante, contra reumatismo, piolhos, eczemas, cortes e feridas. As raízes frescas misturadas com óleo de mostrda são utilizadas contra reumatismo, carbúnculos, úlceras. O extrato aquoso do rizoma é utilizado contra gonorréia. A planta ainda é usada como espectorante. Osuco da planta combate a febre e a ovulação. Pteris vittata Linn. Folhas são utilizadas para a prevenção de doenças. O extrato da planta é utilizado como demulcente, hipotensor, tônico, antiviral e antibacteriano. A planta inteira é utilizada como pasta e aplicada sobre as áreas afetadas por feridas. A pasta é misturada com pimenta e ingerida para combater gripe, tosse e febre. 150 Caso os dados descritos nos trabalhos citados forem cruzados com outros levantamentos etnobotânicos, seria perceptível que algumas espécies são de fato utilizadas para os mesmos fins em diferentes culturas. O uso em comum de algumas espécies por diferentes populações tem despertado a atenção e a curiosidade de pesquisadores quanto à investigação sobre a eficácia de bioatividades tão referenciadas pela tradição popular em testes de pré-triagem quanto à utilidade terapêutica, aplicada continuamente ao longo de várias gerações. Dessa forma, diversos questionamentos surgem a respeito, como por exemplo: o que há de tão especial neste grupo de vegetal que justifique seu uso desde culturas primitivas a contemporâneas? Existem, de fato, componentes bioativos que atuam em sistemas corpóreos reequilibrando suas funções? Que parte da quimiodiversidade destas plantas é responsável pela cura de enfermidades? Que quantidade do produto é efetivamente necessária para um efeito desejado? Em que tipo de célula age melhor e de que forma? Que conseqüências o uso contínuo de pteridófitas poderão trazer à saúde humana? De fato, a busca pelas respostas a estes questionamentos fomenta as pesquisas mundiais sobre as bioatividades deste antigo grupo de plantas vasculares e cada vez mais, porém não com tanto alarde, os mistérios da etnomedicina da pteridoflora são desvendados em laboratórios de todo o mundo. Fitoconstituíntes são identificados e comparados em suas propriedades biológicas com os existentes em plantas de outros grupos vegetais de reconhecida importância, e ensaios são realizados in vitro e in vivo desvendando bioatividades terapêuticas quer sejam orientadas pelas pesquisas etnobotânicas, quer pela intuição dos cientistas a despeito dos metabólitos secundários encontrados nas plantas. 5. COMPROVANDO BIOATIVIDADES: A ELUCIDAÇÃO DE MISTÉRIOS DA ETNOMEDICINA Ensaios biológicos realizados a fim de se comprovarem a eficácia de pteridófitas como fitoterápicos foram mais frequentemente desenvolvidos a partir do final do século XX. Diversas bioatividades foram então exploradas, sendo confirmada ou contestada a sua eventual possibilidade de aplicação clínico-terapêutica, indicando interessantes alternativas para a criação de novos fármacos ou classificando as plantas como ineficazes quanto à finalidade terapêutica. Como exemplos destas possibilidades, elencou-se alguns estudos realizados que comprovam algumas das atividades biológicas demonstradas pelas pteridófitas. É importante ressaltar que a grande maioria das pesquisas aborda atividades antimicrobianas 151 (antibacterianas, principalmente), onde produtos naturais na forma de extrato, frações ou substâncias isoladas de pteridófitas são ensaiados frente a diferentes tipos de microrganismos de relevância patológica. Entretanto, outras atividades também serão aqui abordadas, tais como o potencial antifúngico, antiviral e antiparasitário de algumas espécies além da atividade anticarcinogênica e antioxidante que poderão ser úteis na identificação de matériasprimas para a síntese de substâncias bioativas potencialmente viáveis na utilização como novos fármacos. Atividade antibacteriana O desenvolvimento de resistência bacteriana tem levado a uma crescente procura por novos fármacos que possam de alguma forma eliminar ou neutralizar as defesas microbianas. Nas últimas décadas, os antibióticos sintéticos tiveram sua eficácia reduzida frente a versatilidade das bactérias, e os produtos naturais representam hoje, uma alternativa a ser explorada em suas propriedades farmacológicas. Neste contexto, diversos representantes da pteridoflora foram avaliados para sua potencialidade antimicrobiana e mostraram resultados muito promissores. Osmunda regalis foi avaliada em seu potencial antimicrobiano por ser uma pteridófita conhecida nos sistemas tradicionais de medicina. Thomas [34] pelo método de difusão em disco testou extratos de diferentes polaridades contra cepas de bactérias patogênicas. Atividade antibacteriana foi confirmada pela concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). O extrato acetônico exibiu melhores resultados com MIC e CBM de 12.5 mg/ml e 25 mg/ml respectivamente frente a Pseudomonas aeruginosa, enquanto valores de MIC e CBM de 25 mg/ml e 50mg/ml foram observados para Shigella sonnei. Os compostos ativos de O. regalis, portanto, são solúveis em acetona e apresentam a capacidade de dificultarem o crescimento e a multiplicação de algumas cepas de bactérias multiresistentes. Parihar et al. [35] desenvolveu um estudo bastante abrangente envolvendo 12 espécies de pteridófitas: Adiantum capillus-veneris L., Adiantum incisum Forsk., Adiantum lunulatum Burm. F., Actiniopteris radiata (Swartz.), Link, Araiostegia pseudocystopteris Copel., Athyrium pectinatum (Wall Mett ex.) T. Moore, Chelienthes albomarginata Clarke, Cyclosorus dentatus (Forsk.) Ching, Dryopteris cochleata (Don.) C. Chr., Hypodematium crenatum (Forsk.) Kuhn, Marsilea minuta L. e Tectaria coadunata (J. Smith) C. Chr. frente a bactérias gram-negativas, gram-positivas e fitopatogênicas: Escherichia coli MTCC 443, 152 Salmonella arizonae MTCC 660, Salmonella typhi MTCC 734, Staphylococcus aureus MTCC 96 e Agrobacterium tumefaciens MTCC 431. Utilizando o método da difusão em disco, testou extratos aquosos e alcoólicos (metanol) das folhas, obtendo resultados que mostraram, com poucas exceções, que todos os produtos naturais mostraram-se eficazes na inibição bacteriana e assim passaram a constituir um excelente acervo para a busca de substâncias ativas com potencial para a constituição de novos fármacos antibacterianos. Algumas espécies do gênero Adiantum, foram testadas frente a 11 bactérias pelo método da microdiluição por Singh et al. [36]. Os extratos metanólicos das espécies Adiantum capillus-veneris, Adiantum peruvianum e Adiantum venustum inibiram o crescimento de todas as linhagens bacterianas gram-positivas ensaiadas em Concentrações Inibitórias Mínimas que variaram entre 3,90 e 62,50 µg/mL. Das espécies utilizadas no estudo, Adiantum venustum foi a única que demonstrou atividade contra todas as linhagens gram-negativas. Merece destaque, a inibição de E. coli por A. capillus-veneris na concentração de 0,48 µg/mL. Todas as espécies de Adiantum ensaiados demonstraram notável atividade antibacteriana, atribuída pelos autores à presença de compostos fenólicos encontrados nas espécies. Outro screening de agentes antibacterianos que merece ser mencionado em razão do grande número de espécies investigadas e resultados obtidos foi realizado por Banerjee e Sen em 1980 [4]. Neste primoroso estudo, 114 espécies foram investigadas. De diferentes partes das plantas (rizoma, estipe e folhas estéreis e férteis) foram obtidos extratos aquoso e orgânico (metanol, etanol 70%, éter e acetona) e os ensaios foram realizados pelo agar cup method contra as linhagens de Staphylococcus aureus (sensível e resistente a penicilina), Sarcina lutea, Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae e Vibrio cholerae. Um total de 73 espécies (64%) apresentaram atividade antibiótica, sendo que 33 inibiram bactérias gram-positivas, 9 inibiram gram-negativas e 15 espécies inibiram ambos os tipos de bactérias. Algumas espécies se destacaram quanto ao potencial antimicrobiano como Microsorium alternifolium, Leptodecurrens chillus, Polypodium irioides, Pyrrosia mannii e Phymatodes ebenipês, as dos gêneros Dryopteris e Adiantum, entre outras. Com a grande quantidade de relatos sobre atividade antibacterianas de pteridófitas evidenciados nestes e em outros tantos trabalhos, podemos vislumbrar que este representa realmente o grande foco das pesquisas por bioatividades. Fitoconstituintes ativos existentes em extratos e frações têm demonstrado grande capacidade para desarticular mecanismos de defesa desenvolvidos por bactérias. Isto é muito importante, ao considerarmos a expectativa de serem utilizados como fontes de novos fármacos, pois apesar de termos diversos tipos de 153 antibióticos lançados no mercado, infelizmente estes não tem conseguido acompanhar o ritmo de desenvolvimento da resistência microbiana, tornando-se clinicamente ineficazes. Atividade antifúngica Estudos abordando o potencial antifúngico de pteridófitas são mais escassos quando comparados às pesquisas por antibacterianos. Dessa forma, a maioria dos relatos encontrados sobre esta atividade é oriunda de pesquisas na qual se busca também uma atividade antibacteriana nas espécies estudadas e não apenas antifúngica. Entretanto, é importante esclarecer que estas plantas também têm demonstrado capacidade de inibir o crescimento de diversos tipos de fungos e por este motivo deve lhe ser dada maior atenção neste aspecto. Como exemplo de pesquisas que buscam concomitantemente atividades antibacteriana e antifúngica, citam-se os estudos desenvolvidos por Singh et al. [36] e Banerjee e Sem [4] mencionados anteriormente. No primeiro estudo, espécies de Adiantum foram ensaiadas contra oito linhagens fúngicas (Candida albicans, Cryptococcus albidus, Trichophyton rubrum, Aspergillus Níger, Aspergillus flavus, Aspergillus spinulosus, Aspergillus terreus e Aspergillus nidulans) e os autores verificaram que o extrato metanólico de A. capillus veneris, A. peruvianum, A. venustum e A. caudatum foram eficazes na inibição de C. albicans e os três últimos também foram ativos contra Aspergillus terreus. No estudo feito por Banerjee e Sen, de 114 plantas pesquisadas apenas três mostraram potencial contra os fungos fitopatógenos Curvularia lunata, Aspergillus Níger e Helminthosporium oryzae, sendo estas das espécies Dryopteris cochleata, Pteris biaurita e Gleichenia glauca . De maneira geral, as pteridófitas crescem em locais úmidos, onde ocasionalmente há presença de água devido às suas limitações de condições reprodutivas. Comumente isto ocorre junto a fungos e assim, ambos passam a compartilhar o mesmo hábitat. Dessa forma, é natural que fungos tenham desenvolvido diferentes mecanismos de defesa como forma de adaptação e sobrevivência a metabólitos secundários produzidos e liberados pelas plantas, quando estas também buscavam melhores condições de existência livres de fitopatógenos. Os compostos formados pelas vias secundárias metabólicas das plantas exercem um importante papel na perpetuação das espécies. A prospecção química das espécies Psilotum nudum, biserrata Nephrolepis e cordifolia Nephrolepis feita por Hani et al. [37], revelou a presença de flavonóides, taninos, alcalóides, açúcares redutores, triterpenóides e esteróides e a atividade antimicrobiana demonstrada por estas espécies pode ser atribuída a estes fitoconstituintes que inclusive já tem demonstrado efeito inibidor de microrganismos. Neste 154 estudo, foram realizados ensaios antimicrobianos utilizando extratos aquosos e não aquosos de partes aéreas das espécies pelo método da difusão em disco contra nove tipos de bactérias e três importantes fungos dermatófitos (Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes e Trichophyton rubrum). O extrato aquoso das três espécies exibiu diferentes graus de inibição dos fungos. Psilotum nudum foi a única espécie cuja maioria dos tipos de extrato (aquoso, clorofórmio e etanólico) foi ativo contra todos os fungos testados. Os resultados mostraram que estas espécies apresentam substâncias ativas com propriedades antifúngicas e antibacterianas, já que também inibiram bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O gênero Adiantum além de ser uma das melhores indicações entre as samambaias contra bactérias, também demonstrou potencial antifúngico. Ghosh et al. [38] analisou o efeito contra Aspergillus niger e Rhizopus stolonifer pelas espécies Adiantum capillus-veneris L. e Adiantum lunulatum. Foram testados o extrato bruto e fenóis (fenóis totais, carboidratos e aminoácidos) extraídos tanto de gametófitos quanto de diferentes partes dos esporófitos. Os testes foram feitos em três métodos distintos: agar disc method, liquid culture method e suspension culture médium, com objetivo de minimizar o erro e ambos os extratos exibiram atividade antifúngica, mas os gametófitos se destacaram com os melhores resultados. Este caráter pode ser atribuído, de acordo com os autores, ao grande acúmulo de metabólitos, em especial compostos fenólicos existentes no gametófito que, sendo precursor do zigoto, deve se manter metabolicamente mais ativo para que possa conferir resistência a agentes patógenos. Outras pesquisas ainda podem ser sucintamente relatadas como a realizada por Dalli et al. [39] que constatou que a espécie Pteris biaurita possui uma forte atividade antimicrobiana, principalmente antifúngica e antibacteriana, supostamente devido a presença de eicosanóides e heptadecanos em suas folhas; e por Lee et al. [40] demonstrando que Selaginella tamariscina possui o biflavonoide isocryptomerin, bastante usado na medicina tradicional e que este composto apresenta forte ação antifúngica por causar despolarização da membrana plasmática. Ruiz-Bustos [41] demonstrou que o extrato metanólico da samambaia Jatropha cuneata na concentração de 90 μg/mL exibe forte atividade antifúngica frente a Fusarium verticillioides e Aspergillus niger. A evolução natural dos fungos é algo que preocupa muito a comunidade científica. Suas células são semelhantes às humanas, pois são todos eucariontes, e por este motivo existem dificuldades em encontrar fármacos eficazes que agridam apenas alvos específicos. Caso sejam desenvolvidos novos mecanismos de defesa (o que é absolutamente natural que ocorra), fármacos comercialmente utilizados se tornarão obsoletos dificultando o tratamento de infecções fúngicas. Estas pesquisas com produtos naturais, neste caso, as pteridófitas, em 155 triagens experimentais, apontam um caminho para a descoberta de novos princípios ativos extremamente necessários no contexto atual para suprir a carência de substâncias quimioterápicas. Verifica-se que estas plantas contêm fitoconstituíntes promissores do gametófito até o esporófito e estes poderão ser usados para salvaguadar organismos humanos debilitados pelas infecções oportunistas causadas por fungos. Atividade anticancerígena O câncer tem abalado muitas famílias em todo o mundo. O grande sofrimento causado por esta doença, bem como sua grande incidência na população mundial, tem levado a uma crescente busca por princípios ativos com capacidade de inibir a proliferação de células tumorais. Neste contexto, a ciência tem investigado diversas possibilidades em relação a produtos naturais. As plantas, partindo de briófitas a angiospermas, têm sido testadas quanto ao potencial antineoplásico em investigações preliminares e diante de resultados que sinalizam a existência desta bioatividade, é dada uma atenção especial procedendo ao isolamento de compostos e realizando testes in vitro e in vivo, até que seja finalmente verificada a eficácia de seu efeito em sistemas corporais humanos. Neste caso, uma grande preocupação aponta no sentido de que a ação do produto natural sobre células saudáveis e neoplásicas a fim de que só haja comprometimento das células alteradas e que também os efeitos colaterais quimioterápicos sejam nulos ou minimizados. Alguns pesquisadores têm realizado pesquisas antineoplásicas em tumores vegetais causados por Agrobacterium tumefaciens baseados na existência de semelhança entre mecanismos de formação de tumor em animais pelas bactérias Bartonella henselae e Helicobacter pylori. É uma triagem bastante singular que pode ou não ter um efeito promissor em humanos, mas é antes de tudo um indicativo para que se possa ir mais longe passando a novas fases investigativas. Sarker et al. [42] testou partes aéreas de Selaginella ciliaris (Retz.), Marsilea minuta (L.) e Thelypteris prolifera (Retz.) em bioensaio com disco de batata exibindo crown-gall tumors. Antes, porém, verificaram se as espécies demonstravam efeito antibacteriano (250.000 ppm) contra A. tumefaciens, e após constararem nenhuma atividade, deram continuidade aos testes onde verificaram que as mesmas inibiram o tumor com percentuais de 80%, 82,32% e 75,68%, respectivamente, em 1.000 ppm. Os estudos revelam que existem fitoconstituintes ativos nas plantas capazes de interromper o ciclo da divisão celular; entretanto, ainda há um longo percurso até se saber quais são os metabólitos responsáveis por esta ação antitumoral. 156 Porém, em estudos mais específicos in vitro realizado por Lai et al. [43], linhagens celulares de adenocarcinoma humano do cólon HT-29, carcinoma humano do cólon HCT116, adenocarcinoma de mama MCF-7, leucemia humana K562 e de fígado Chang foram usadas em ensaios de citotoxicidade, nos quais foram testadas frações obtidas do extrato metanólico da samambaia Blechnum orientale Linn. Uma interessante atividade citotóxica foi demonstrada pelas frações acetato de etila, butanólica e aquosa contra o adenocarcinoma de células do cólon HT-29. A curcumina foi usada como controle positivo por ser amplamente empregada em ensaios clínicos para quimioprevenção do câncer de cólon, e células Chang foram utilizados em estudos de citotoxicidade para testar os efeitos de drogas/agentes sobre as células normais. A fração butanólica não exibiu efeito citotóxico contra as células normais, o que significa que compostos presentes nesta fração poderão ser utilizados em quimioterapias de câncer de cólon. Uma triagem por compostos fenólicos registrou a presença de terpenóides, flavonóides e taninos, estes últimos em maior abundância nas frações butanólica e aquosa. O isolamento de componentes da fração butanólica desta samambaia em testes complementares poderá levar à elucidação de substâncias ativas contra as células tumorais, algo de extrema importância na luta contra o câncer do cólon. Compostos isolados têm sido investigados quanto à atividade quimiopreventiva do câncer. De raízes secas da samambaia ornamental Neocheiropteris palmatopedata (Baker) foram isolados seis glicosídeos kaempferol (palmatosideos A, B e C, multiflorinas A e B e afzelina) e estes foram ensaiados quanto à capacidade de inibir o TNF-α induzido por atividade NF-kB, o óxido nítrico (NO), produção de aromatase, redutase quinona 2 (QR-2) e a atividade de COX-1/-2, fatores importantes para o desencadeamento de processos cancerígenos. Os palmatosideos A e B apresentaram inibição de TNF-α induzida por atividade de NF-kB, com valores de IC50 de 15,7 e 24,1 µM, respectivamente e apenas a multiflorina B apresentou percentuais acima de 50% de inibição da produção de óxido nítrico. O palmatosídeo A foi o único composto que mostrou inibição das enzimas COX acima de 50% a 10 µg/mL. Na inibição da aromatase, a multiflorina A foi mais ativo com um valor de IC50 de 15,5 µM e o melhor desempenho na inibição da enzima QR2 foi demonstrada por afzelina na concentração de 11,5 µg/mL. Neste estudo realizado por Yang et al. [44] foi avaliada também a citotoxicidade em cultura de células Hepa1c1c7 de hepatoma e MCF-7 de carcinoma da glândula mamária e os compostos não apresentaram efeito inibitório significativo no crescimento celular. Os resultados sugerem que a samambaia exerce efeito quimiopreventivo através de seus compostos e isto deve ser investigado com maior 157 profundidade por conta da habilidade demonstrada de atingir alvos específicos sem causar efeitos citotóxicos. Além do kaempferol, outros constituintes da classe dos flavonóides têm apresentado atividade quimiopreventiva e anticarcinogênica. A samambaia Thelypteris torresiana tem sido exaustivamente estudada pelo fato de ter apresentado atividade anticancerígena quando testada sob a forma de extrato. Desde então, pesquisadores tem continuamente isolado e testado seus compostos na busca do fitoconstituinte responsável pelo efeito. O alvo principal das pesquisas tem sido os flavonóides, isto porque têm apresentado potencial quimiopreventivo e quimioterápico em tratamentos antineoplásicos com atividades que variam de antiproliferativas, interrupção do ciclo celular a indução de apoptose. O flavonóide protoapigenona foi testado por Chang et al. [45] em células de câncer de próstata (linhagem LNCaP) e conseguiu inibir a proliferação celular, induzir a apoptose por anexina V-FITC (labeling phosphatidylserine) e a progressão do ciclo celular, além de também inibir a ativação da p38 MAPK e JNK1 / 2 que regulam os processos de crescimento, proliferação e diferenciação celular. Protoapigenone suprimiu o crescimento de células cancerígenas da próstata tanto in vitro como in vivo, sem hepatotoxicidade significativa, nefrotoxicidade e toxicidade hematológica. Este composto já havia sido foi testado por Lin et al. [46], em células neoplásicas hepáticas e da mama (Hep G2, Hep 3B, MCF-7, A549, e MDA-MB-231) exibindo considerável atividade anti-tumoral. Em face disto, este flavonóide isolado de samambaia poderá vir uma grande alternativa para tratamentos quimioterápicos contra neoplasias. Atividade antiviral A pesquisa de novas substâncias com potencial antimicrobiano nos dias atuais é crescente e necessária, sobretudo, devido ao desenvolvimento da resistência de agentes infecciosos a drogas sintéticas amplamente utilizadas. Neste sentido, os compostos naturais, principalmente flavonóides, têm sido muito importantes para a descoberta de agentes antivirais. De acordo com a literatura, o gênero Selaginella apresenta inúmeras propriedades medicinais, contendo vários metabólitos secundários tais como: alcalóides, terpenóides e fenóis. Além destes, possui também, uma grande variedade de diflavonoides, uma forma dimérica de flavonóides, ainda bastante pouco estudados. Os diflavonóideis, apresentam diversas propriedades medicinais, principalmente antioxidante, anti-câncer, anti-inflamatória 158 e antimicrobiana (antiviral, antibacteriana, antifúngica, antiprotozoária). O gênero Selaginella é usado amplamente na medicina tradicional Chinesa (MTC) como forma complementar e alternativa aos medicamentos sintéticos tradicionais, sendo a espécie S. tamariscina a espécie mais utilizada. O gênero Selaginella possui 13 compostos bioativos estudados até o momento, especialmente, amentoflavona e ginkgetina [47]. Esse metabólito foi obtido pela primeira vez a partir da espécie Selaginella sinensis e estudado isoladamente por Ma et al. [48]. Em 2009 o pesquisador Hafidh et al. [49] divulgou que a amentoflavona apresenta atividade antiviral potente contra o vírus sincicial respiratório (VSR), exibindo uma IC50 de 5,5 µg/mL. Neste estudo, a quantidade de amentoflavona de nove espécies de Selaginella foi determinada por HPLC de fase reversa, e a espécie S. sinensis foi a que apresentou o maior teor possuindo 1,13% de amentoflavona. Em outro estudo sobre o gênero Selaginella, Maly [50] isolou cinco compostos da espécie Selaginella uncinata. Dois destes compostos são novos glicosídeos Chromona, nomeados 5-hidroxi-2,6,8-trimetilchromona 7-O-beta-D-glucopiranosideo (uncinoside A) e 5acetoxil-2,6,8-trimethilchromona 7-O-beta-D-glucopiranosideo (uncinoside B). Suas estruturas foram elucidadas por métodos espectroscópicos incluindo técnicas tridimensionais como RMN. Os outros três compostos foram identificados como 8-metil eugenitol, amentoflavona e hinokiflavona. Os glicosídeos, Uncinosideo A e B, mostraram potente atividade antiviral frente ao vírus sincicial respiratório (VSR) exibindo uma IC50 de 6.9 e 1.3 µg/mL e atividade antiviral moderada frente ao vírus tipo 3 parainfluenza (PIV 3), exibindo uma IC50 de 13,8 e 20,8 µg/mL, respectivamente. Alguns trabalhos têm focado a descoberta de produtos naturais contra o vírus HIV. Este vírus é o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), e tem causado graves problemas de saúde pública, pois a cada dia o número de pessoas infectadas pelo HIV e doentes de SIDA continua aumentando na população mundial, especialmente nos países em desenvolvimento. Pesquisas recentes têm observado que a enzima Transcriptase Reversa (TR) do HIV tem demonstrado ser muito importante para a replicação viral, pois cada função catalítica da RT interfere na produção do vírus. Esta enzima exibe atividade RNAdependente DNA polimerase, DNA dependente DNA polimerase e ribonucleases H [51]. Até o momento, duas classes de drogas inibidoras, análogas e não-análogas de nucleotídeos, têm sido desenvolvidas; porém, sua utilização para o tratamento de pacientes com AIDS é limitada devido sua toxicidade e surgimento de vírus cada vez mais resistentes. O desenvolvimento e produção de medicamentos inibidores seletivos para o HIV RT é pertinente ao contexto e com este objetivo, Min et al. [51], realizou uma triagem in vitro de 159 50 espécies de plantas medicinais coreanas e chinesas na busca de potencial antiviral, sendo descoberto neste que o rizoma de Dryopteris crassirhizoma Nakai (Aspidiaceae) inibia sensivelmente a atividade RNase H de HIV-1 RT, tendo o extrato metanólico exibido uma IC50 de 25 µg/mL. Segundo Min, este rizoma é conhecido na medicina chinesa por sua ação taenicida. As espécies do gênero Dryopteris são geralmente caracterizadas pela presença de derivados de floroglucinol, tais como ácidos flavaspicos, ácidos triflavaspidicos, dryocrassinos e albaspidinos e ácidos filixicos e além disso, glicosídeos e kaempferol foram isolados a partir das espécies do gênero Dryopteris. Atividade antiparasitária A Leishmaniose é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por protozoários do gênero Leishmania, que apresenta três tipos de manifestações. Estima-se que a doença cause 1,6 milhões de novos casos, dos quais cerca de 500.000 é visceral e 1,1 milhões cutânea ou mucocutânea, de acordo com informações disponibilizadas pela Organização Mundial de Saúde [52]. A distribuição da leishmaniose tem se expandido ao longo dos anos, atingindo países onde antes sua ocorrência não era registrada, o que é muito preocupante tendo em vista as poucas opções de agentes terapêuticos e ainda o fato de ter sido observado Leishmania um potencial de resistência à drogas. Os trabalhos científicos envolvendo pesquisa de atividade leishmanicida de pteridófitas, entretanto, ainda são bastante escassos. Um dos poucos estudos produzidos nesta área é o do pesquisador El-On [53] que em 2009 divulgou que o extrato metanólico de Pteris vittata possui atividade leishmanicidal moderada (25%-50%). De acordo com a Organização Mundial de Saúde [52], estima-se que mais de 10 milhões de pessoas estejam infectadas com o parasita Trypanosoma cruzi em todo o mundo. Este protozoário é o causador da doença de Chagas que na fase inicial apresenta sintomatologia de inexistente a leve, até que se passe à fase crônica causando distúrbios sistêmicos, culminado com o comprometimento progressivo do músculo cardíaco, o que pode levar à morte. Nos últimos anos, a atividade contra protozoários tem sido avaliada para diversos produtos naturais, sendo o gênero Selaginella muito estudado para este fim. Atualmente é conhecido que mais de 60 espécies de Selaginella ocorrem na Índia, sendo pouco usadas na medicina popular. Segundo a literatura, este gênero é rico em diflavonóides, uma forma dimérica de flavonóides. 160 Em um estudo realizado por Olaf et al., [54], espécies de Selaginella foram avaliadas para atividade antiprotozoária. Neste trabalho, extrato etanólico e frações de Selaginella bryopteris de diferentes polaridades foram obtidos usando tolueno, acetato de etila, e butanol por partição líquido-líquido. Estes produtos naturais foram testados frente a Trypanosoma brucei, Trypanosoma rhodesiense STIB 900, Trypanosoma cruzi cepa tulahuen C2C4, Leishmania donovani cepa MHOM-ET-67 e Plasmodium falciparum K1. A fração acetato de etila mostrou elevada atividade e foi selecionada para isolamento de 11 compostos puros. De acordo com o trabalho, foi encontrada uma elevada atividade antimalarial para o composto 7’4’7-tri-O-metilamentoflavona que exibiu uma IC50 de 0,26 µM. Este composto não mostrou atividade citotóxica significante (IC50 ˃ 150 µM) frente a células L-6. Para avaliar a atividade in vivo frente ao protozoário Plasmodium berghei, foi realizada uma síntese parcial a partir da amentoflavona (diflavonóide) para produção do 7’4’7-tri-O-metilamentoflavona. Este semisintético foi testado na concentração de 50 mg/Kg e não apresentou aticidade frente ao Plasmodium berghei. Uma forte atividade leishmanicida foi detectada no composto 2,3 dihidronokiflavona, apresentando uma (IC50 de 1,6 µM), enquanto que para o Trypanosoma nenhuma atividade significante foi observada (IC50 ˃ 12,5 µg/mL para o extrato). A pesquisadora Esther del Olmo [55], em um ensaio preliminar na busca por novos compostos de origem natural, constatou que o ácido isonotholaenic, um estilbenóide, foi o componente principal do extrato diclorometano da samambaia Notholaena nívea. Este extrato obteve resultados bastante promissores frente a formas epimastigotas de T. cruzi, exibindo uma IC50 de 30 µg/mL sendo semelhante ao benznidazole que possui IC50 de 7,4 µg/mL. Curiosamente, a transformação do ácido isonotholaenic em piperidide dobrou sua potência em relação ao benznidazole. Com base em outros ensaios desta pesquisa, foi visto que estes compostos não são citotóxicos para células humanas normais. Portanto, eles representam estruturas importantes para o desenvolvimento de novos agentes contra a doença de chagas. Atividade antioxidante O equilíbrio de sistemas orgânicos pode ser caracterizado pela produção constante de radicais livres, que por sua vez, são neutralizados por mecanismos de defesa antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. Quando por alguma razão este equilíbrio é rompido e a produção de radicais livres supera a capacidade antioxidante, espécies altamente instáveis e reativas de oxigênio, nitrogênio ou enxofre, entre outras, poderão se ligar a moléculas orgânicas essenciais à vida como DNA, proteínas e lipídios, gerando conseqüências como 161 mutações e outros tipos de danos estruturais e funcionais que podem induzir à morte celular. Doenças degenerativas como a de Parkinson, Alzheimer e esclerose múltipla, além de diversos tipos de doenças pulmonares e do sistema imune diabetes, cardiopatias, asteroclerose e também cânceres, são enfermidades que podem surgir em decorrência de danos causados por estresse oxidativo [56]. Substâncias antioxidantes são aquelas que, presentes em baixas concentrações, porém em concentrações superiores às oxidáveis, retardam ou inibem a ação destas, prevenindo ou reduzindo a extensão do dano oxidativo [57]. É sabido que produtos naturais possuem compostos que exibem esta capacidade e por este motivo, alimentos, temperos e plantas medicinais têm sido alvos de estudos sobre suas propriedades protetoras. Não obstante, diversas pesquisas têm mostrado o potencial antioxidante de pteridófitas como uma importante bioatividade deste grupo. As samambaias medicinais Blechnum orientale L., Dicranopteris linearis (Burm.), Cibotium barometz (L.) J. Sam, Acrostichum Aureum L. e Asplenium nidus L. foram investigadas por Lai et al. [58] e todas demonstraram potencial antioxidante. Nos métodos de redução do radical livre 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila (DPPH) e capacidade de reduzir íons férricos (FRP) as espécies demonstraram atividade seguindo a ordem em potencial decrescente: B. orientale ≥ D. linearis > C. barometz > A. aureum > A. nidus. Esta mesma ordem foi também observada quanto à presença de compostos fenólicos, e a estes foi atribuída a capacidade antioxidante, já comprovada em tantos outros estudos. Na avaliação pelo método de branqueamento do ß-caroteno (BCB), D. linearis se destacou com 99% de inibição da peroxidação lipídica. Em contradição à tendência observada nos demais ensaios, ao se avaliar a atividade quelante de íons ferrosos (FIC), as espécies mostraram baixa atividade, com exceção de A. aureum que exibiu um percentual de 58% (6,7 mg/mL). Os resultados evidenciam que estas plantas revelam um notável potencial protetor que poderá auxiliar sistemas orgânicos na defesa contra radicais livres. Recentemente, um estudo realizado por Lai e Lim [59] rastreou quinze samambaias na busca de fontes antioxidantes naturais utilizando métodos como potencial de redução de ferro (FRP), redução (branqueamento) do ß-caroteno (BCB) e redução do radical DPPH, conseguiu prospectar cinco espécies cujos extratos metanólicos exibiram forte capacidade de seqüestrar radicais livres. Das espécies Cyathea latebrosa (Wall. ex Hook) Copel, Cibotium barometez (L.) J. Sm., Drynaria quercifolia (L.) J. Sm., Blechnum orientale L. e Dicranopteris linearis (Burm.), esta última demonstrou o potencial antioxidante mais alto sendo de 61% em 0,1 mg/mL e 99% em 0,7 mg/mL. Estes dados confirmam, portanto, o expressivo potencial de 162 Blechnum orientale e Dicranopteris linearis anteriormente investigadas. Na pesquisa por compostos, fenólicos as cinco espécies foram as que se destacaram por apresentar altos teores, sinalizando, como no estudo anterior, que o efeito antioxidante das espécies provavelmente está relacionado à presença e à ação destes fitoconstituíntes. Na procura por substâncias ativas capazes de se ligarem a espécies de radicais livres, alguns trabalhos têm ido um pouco mais além de ensaios com extratos, e assim, compostos isolados de espécies como Cheilanthes anceps Swartz e Salvinia natans L. foram avaliados quanto ao potencial antioxidante. Chowdhar [60] isolou seis flavonóides de C. anceps a partir da fração butanólica oriunda do extrato etanólico de folhas: (1) Kampferol-3-O- δ-Lramnopiranosil (1→2)-ß- D-glucopiranosideo-7-O-ß -D-glucopiranosideo, (2) Quercetina 3O- δ-L-ramnopiranosil (1→2)-ß-D-glucopiranosideo-7-O-ß-D-glucopiranosideo, (3) Quercetina-3-O-ß-D-glucosil (1→2)-ß -D-glactosideo-7-O- ß -D-glucosideo, (4) Quercetina3-metil éter-5-O-glucosideo, (5) Kampferol-3-O-glucosideo e (6) Quercetina-3-O-glucosideo. Pelo ensaio de bioautografia em camada delgada e DPPH foi verificado que o potencial antioxidante seguia a seguinte ordem: 6 > 3 > 2> 4, mostrando que glicosídeos de quercetina eram ativos, enquanto glicosídeos de kaempferol não exibiram atividade. O efeito antioxidante de S. natans, uma samambaia aquática, foi observado por Srilaxmi [61] através de um ensaio in vivo utilizando ratos albinos Wistar com lesão hepática induzida por tetracloreto de carbono CCl4. Esta substância é um solvente industrial conhecido por sua hepatotoxicidade, causando estresse oxidativo e degeneração celular. Utilizando sistema de cromatografia em coluna, foi isolado o composto natansnin glicosídeo benzoílo, que em seguida foi ensaiado pelo método do DPPH, demonstrando um alto potencial antioxidante (60,6%) quando comparado ao controle positivo BHT (63,6%). Nos testes in vivo, os ratos foram intoxicados com CCl4 e em seguida foram tratados com natansnin (20 mg/Kg de peso corporal). A leitura dos parâmetros demonstrou que ambas as doses diminuíram os danos causados pelo estresse oxidativo induzido e inibiu a expressão de proteínas inflamatórias, além da apoptose celular. O efeito protetor verificado pode estar relacionado à atividade antioxidante do flavonóide natansnin. Dessa forma, o fato deste composto ter sido isolado de uma samambaia só reforça a importância das atividades biológicas deste grupo, como fontes de quimioconstituíntes de interesse clínico. 163 6. UM ESTUDO DE CASO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE Lygodium venustum SW. E Pityrogramma calomelanos (L.) LINK. Introdução Lygodium venustum (Figura 1) é uma samambaia da família Lygodiaceae que normalmente é vista crescendo em clareiras no interior da mata ou às margens de caminhos, em áreas perturbadas, podendo apresentar comportamento ruderal, sendo observada em terrenos baldios da zona urbana. A espécie caracteriza-se por apresentar pínulas com tamanhos diferentes, onde as proximais são lobadas e maiores que as demais Por possuir raque volúvel, com forma adaptativa de cipó, especializa-se no hábito lianescente, sendo considerada, após atingir 50 cm de altura, uma exímia alpinista, enroscando-se e apoiando-se geralmente em cipós, madeiras mortas ou arbustos, chegando a tingir mais de 5 m de altura [61]. Figura 1: Fotografia da samambaia Lygodium venustum. Fonte: autora A utilização de L. venustum como planta medicinal tem sido registrada na Mesoamérica por populações indígenas, entre outras, possuindo atividades antiséptica, 164 fungicida e tricomonicida, sendo indicada para o tratamento de dermatoses, micoses e infecçõe [62]. É também usada no tratamento de desordens gastrointestinais e ginecobstétricas e como antiinflamatório pós-parto [63]. É utilizada como um dos componentes para o preparo tradicional da bebida de efeito alucinógeno, ayahuasca, entre os Sharanahua e os índios do alto do rio Purus na Amazônia Peruana [26]. No Brasil, é utilizada por afro-brasileiros em cultos místicos para banhos de limpeza, além de ser indicada na medicina popular para nervosismo e instabilidade emocional [64, 65]. Pityrogramma calomelanos (Figura 2) pertence à família Pteridaceae e apresenta distribuição subcosmopolita, sendo muito comum ser encontrada nos trópicos. Normalmente cresce em solo areno-argiloso de barrancos; como terrícola em solos muito encharcados, freqüentemente próxima da margem dos regatos ou do açude, exposta ao sol e com poucos indivíduos. P. calomelanos é conhecida pelos nomes populares de feto-branco, avenca-branca ou avenca-preta. A espécie se diferencia das outras da família por apresentar pinas equilaterais; pínulas ascendentes e pela presença de indumento farináceo branco, amarelo ou rosado na superfície abaxial da lâmina foliar [66,67, 68]. Figura 2: Fotografia da samambaia Pityrogramma calomelanos. Fonte: autora 165 Na medicina popular é utilizada como planta ornamental e medicinal, sendo indicada como adstringente, analgésica, anti-hemorrágica, peitoral, depurativa, emenagoga, antigripal, anti-hipertensiva, antitérmico, antitussígeno e estimulante da circulação sangüínea, além de ser indicada para tratamento de distúrbios renais [69, 70, 71]. Este estudo tem como objetivo avaliar o potencial antioxidante de extratos e frações das pteridófitas L. venustum e P. calomelanos e investigar a existência de compostos fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides), determinando o seu percentual. Material e métodos Material vegetal L. venustum e P. calomelanos foram coletadas no município de Crato, Ceará – Brasil, na encosta da Chapada do Araripe em uma localidade chamada Grangeiro (Figuras 3 e 4). Foram produzidos extratos etanólicos e a partir destes foram obtidas as frações hexânica, diclorometano, acetato de etila e metanólica para L. venustum e hexânica, clorofórmica, acetato de etila e metanólica para P. calomelanos. Prospecção química qualitativa A análise fitoquímica qualitativa preliminar para detectar as presenças de classes de metabólitos secundários como taninos, flavonóides e alcalóides foi realizada seguindo um método de prospecção fitoquímica já descrito anteriormente [72]. Quantificação de compostos fenólicos por HPLC-DAD As análises cromatográficas de fase reversa foram realizadas sob condições de gradiente usando coluna C18 (4.6 mm x 250 mm) empacotada com partículas de diâmetro de 5μm; como fase móvel foi usada água contendo 2% ácido acético (A) e metanol (B), e a composição do gradiente foi: 5% de B até 2 minutos com mudança para 25%, 40%, 50%, 60%, 70% e 100% B, 10, 20, 30, 40, 50 e 80 minutos, respectivamente, seguindo o método descrito por Laghari [73] com pequenas modificações. 166 Figura 3: Mapas com localização da área de coleta de Lygodium venustum e Pityrogramma calomelanos Fontes: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ceara_Municip_Crato.svg , acesso em 15 de novembro de 2011; Centro de Processamento Remoto – Brasília – DF; Figura 4: Fotografia da área de coleta: Encosta da Chapada do Araripe-Apodi, no município do Crato, Ceará, Brasil. Fonte: autora 167 As amostras (extratos e frações) foram analisadas, dissolvendo em etanol a uma concentração de 3 mg/mL. A presença de seis compostos fenólicos foi investigada: ácidos gálico, clorogênico e caféico e os flavonóides quercetina, rutina e kampferol. A identificação destes compostos foi realizada comparando seu tempo de retenção e espectro de absorção UV com padrões de referência. A vazão foi de 0.6 mL/min, volume de injeção 40 μL e o comprimento de onda 254 nm para ácido gálico, 325 nm para ácido caféico e clorogênicos, e 365 nm para quercetina, rutina e kampferol. Todas as amostras e a fase móvel foram filtradas com filtro de membrana 0.45 μm (Millipore) e então, desgaseificado por banho ultra-sônico antes do uso. Soluções estoque de padrões de referência formam preparadas na fase móvel na HPLC em uma faixa de concentração de 0.020 – 0.200 mg/mL para kampferol, quercetina e rutina; e 0.050 – 0.250 mg/ml para ácidos gálico, caféico e clorogênico. Os picos foram confirmados por cromatograma, comparando o seu tempo de retenção com padrões de referência e espectros DAD (200 para 400 nm). Curva de calibração para ácido gálico: Y = 10523x + 1478.8 (r = 0.9999); ácido caféico: Y = 12765x + 1381.7 (r = 0.9995); rutina: Y = 12691 – 1165.0 (r = 0.9998); quercetina: Y = 13495x – 1092.6 (r =0.9999) e kampferol: Y = 15692x – 1218.1 (r = 0.9997). Todas as operações cromatográficas foram realizadas à temperatura ambiente e em triplicata. Avaliação da atividade antioxidante – DPPH Para a avaliação da atividade antioxidante foi utilizado o método fotocolorimétrico do 2,2-difenil,1- picrilhidrazila (DPPH), segundo Choi et al. [74]. Foi utilizado o extrato bruto e as frações nas concentrações de: 1 a 500 µg/mL em etanol (2,5 mL). A 2,5 mL de cada amostra, foi adicionado 1 mL da solução de DPPH 0,3 Mm. As soluções permaneceram no escuro em temperatura ambiente e após 30 minutos, foram feitas as leituras das absorbâncias em espectrofotômetro (Shimadzu- UV-1201) a 518 nm, onde o radical DPPH apresenta o máximo de absorção. Uma solução de DPPH (1 mL; 0,3 nM) em etanol (2,5 mL) foi usada como controle negativo e uma preparação de ácido ascórbico como padrão (controle positivo), em concentrações que variavam de 1 a 100 µg/mL. O etanol foi usado para zerar o espectrofotômetro, tendo como brancos as soluções testes de cada amostra (sem adição do DPPH), visando minimizar a interferência de componentes das amostras na leitura. O ensaio foi realizado em triplicata e o cálculo da atividade antioxidante seguiu a equação: 168 %inibição = 100 – Abs amostra – Abs branco x 100 _____________________________ Abs controle Onde: Abs amostra é a absorbância das frações e do extrato bruto; Abs branco é a absorbância das frações e do extrato bruto sem adição do DPPH e Abs controle é a absorbância da solução de DPPH em etanol. Os testes foram realizados em duplicata com três repetições. Foi calculada a percentagem de inibição do radical DPPH e construído um gráfico de porcentagem de inibição versus a concentração do extrato e das frações. Análise estatística Todas as análises foram realizadas em triplicata. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Diferenças foram estimadas por meio da análise de variância (ANOVA) seguida por teste de diferença significativa mínima (DSM). Valores de probabilidade inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados e Discussão A Avaliação fitoquímica preliminar (screening) de L. venustum indicou a presença de fenóis, taninos, flavonóides e alcalóides. Para Pityrogramma calomelanos o screening do extrato revelou a presença de alcalóides, catequinas, chalconas, sapononas, flavonóides e fenóis. Estes compostos exercem importantes funções na defesa e conservação das espécies no meio ambiente. Pelo método analítico de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi possível detectar e quantificar a presença de conteúdos fenólicos das espécies. Extrato e frações das samambaias revelaram a presença do ácido gálico A1 (tR =17,83 min; pico 1), ácido clorogênicoA2 (tR = 28,14 min; pico 2), ácido caféicoA3 (tR = 34,09 min; pico 3), rutinaF (tR = 42,11 min; pico 4), quercetinaF (tR = 49,78 min; pico 5) e kaempferolF (tR = 58,96 min; pico de 6) (Figuras 5 e 6), demonstrando portanto, que os produtos naturais em análise contêm flavonóides do grupo dos flavonóisF e compostos fenólicos ácidos (derivado do ácido benzóicoA1, derivado do ácido fenilacrílicoA2 e derivado do ácido cinâmicoA3, cujos percentuais estão dispostos nas tabelas 2 e 3. 169 Figura 5 – Perfil representativo de cromatografia liquida de alta eficiência da fração acetato de etila de Lygodium venustum FAELV (a); fração diclorometane de L. venustum FDMLV (b); extrato etanol de L. venustum EELV (c); fração metanólica de L. venustum FMLV (d) e fração hexânica de L. venustum FHLV (e). A detecção UV foi feita a 327nm. para ácido gálico (pico 1), ácido clorogênico (pico 2), ácido cafeico (pico 3), rutina (pico 4), quercetina (pico 5) e kampferol (pico 6). 170 Figura 6 – Perfil representativo de cromatografia liquida de alta eficiência da fração acetato de etila de Pityrogramma calomelanos FAEPC (a); fração clorofórmica de P. calomelanos FCPC (b); extrato etanol de P. calomelanos EEPC (c); fração metanólica de P. calomelanos FMPC (d) e fração hexânica de P. calomelanos FHPC (e). A detecção UV foi a 327nm. para ácido gálico (pico 1), ácido clorogênico (pico 2), ácido cafeico (pico 3), rutina (pico 4), quercetina (pico 5) e kampferol (pico 6). 171 Tabela 2. Composição de compostos fenólicos e flavonóides em Lygodium venustum SW Produto natural Ácido gálico Ácido clorogênico Ácido cafèico Rutina Quercetina Kampferol FAELV mg/g 3.07 ± 0.01a 6.65 ± 0.03b 13.02 ± 0.04c 10.74 ± 0.02d 59.83 ± 0.01e 11.09 ± 0.01cd FAELV % 0.30 0.66 1.30 1.07 5.98 1.10 FDCMLV mg/g 0.62 ± 0.03a 0.57 ± 0.01b 0.71 ± 0.01ab - 0.80 ± 0.02b 3.93 ± 0.01c FDCMLV % 0.06 0.05 0.07 - 0.08 0.39 EELV mg/g 1.76 ± 0.01a 6.12 ± 0.01b 2.95 ± 0.03c 3.28 ± 0.01c 6.05 ± 0.05b - EELV % 0.17 0.51 0.29 0.32 0.60 - FMLV mg/g 2.02 ± 0.03a 11.39 ± 0.02b 3.91 ± 0.03c 6.16 ± 0.01c 1.88 ± 0.01a - FMLV % 0.20 1.13 0.39 0.61 0.18 - FHLV mg/g 1.53 ± 0.02a 0.70 ± 0.03b 0.64 ± 0.07b 0.44 ± 0.01c 0.75 ± 0.01b 0.86 ± 0.03d FHLV % 0.15 0.07 0.06 0.04 0.08 0.09 Os resultados são expresssos com media ± desvio padrão (DP) de três determinações médias, seguidas de letras diferentes de acordo com o teste de Tukey p < 0.005. FAELV: fração acetato de etila de L. venustum; FDCMLV: fração diclorometano de L. venustum; EELV: extrato etanólico de L. venustum; FMLV: fração metanólica de L. venustum; FHLV: fração hexânica de L. venustum. Tabela 3. Composição de compostos fenólicos e flavonóides em Pityrogramma calomelanos (L.) Link. Produto natural Ácido gálico Ácido clorogênico Ácido cafèico Rutina Quercetina Kampferol FCPC mg/g 2.65 ± 0.01a 18.09 ± 0.04b 11.48 ± 0.09c 5.73 ± 0.01a 9.38 ± 0.05c 22.52 ± 0.01d FCPC % 0.26 1.70 1.14 0.57 0.93 2.25 FAEPC mg/g 2.08 ± 0.03a 36.49 ± 0.11b 27.13 ± 0.02c 9.22 ± 0.01d 36.89 ± 0.03b 48.03 ± 0.03e FAEPC % 0.20 3.64 2.71 0.92 3.68 4.80 EEPC mg/g 10.07 ± 0.03a 33.52 ± 0.01b 8.19 ± 0.04a 28.03 ± 0.01c 5.44 ± 0.02d 12.75 ± 0.09a EEPC % 1.00 3.35 0.81 2.80 0.54 1.27 FMPC mg/g 9.37 ± 0.05a 30.15 ± 0.02b 6.84 ± 0.01c 20.63 ± 0.01d 1.19 ± 0.03e 9.96 ± 0.01a FMPC % 0.93 3.01 0.68 2.06 0.11 0.99 FHPC mg/g - 1.05 ± 0.01a 4.59 ± 0.03b - 1.14 ± 0.02a 0.93 ± 0.01a FHPC % - 0.10 0.45 - 0.11 0.09 Os resultados são expresssos com media ± desvio padrão (DP) de três determinações médias, seguidas de letras diferentes de acordo com o teste de Tukey p < 0.005. FAEPC: fração acetato de etila de P. calomelanos; FCPC: fração clorofórmica de P. calomelanos; EEPC: extrato etanólico de P. calomelanos; FMPC: fração metanólica de P. calomelanos; FHPC: fração hexânica de P. calomelanos. 172 Os ácidos clorogênico e caféico, bem como o flavonóide quercetina tiveram sua presença registrada tanto nos extratos quanto nas frações de ambas as plantas. O ácido gálico e a rutina, entretanto, não foram encontrados na fração hexânica de P. calomelanos e a rutina estava ausente na fração diclorometano de L. venustum. O kaempferol também não constava na fração metanólica, nem no extrato etanólico desta espécie. Compostos fenólicos e alguns de seus derivados são considerados agentes eficazes na prevenção da oxidação, inibindo ou eliminando radicais livres que comprometem os sistemas orgânicos. São muito reativos quimicamente e a maior parte destes encontra-se sob a forma de ésteres ou de heterosídeos, sendo solúveis em água e em solventes orgânicos polares [75]. Conforme os dados obtidos, observou-se que o teor de compostos fenólicos totais presentes em P. calomelanos foi mais alto do que o encontrado em L. venustum. A quercetina, o flavonóide encontrado em maior quantidade em L. venustum apresentou maior afinidade com o solvente acetato de etila, o mesmo ocorrendo com o flavonóide kaemferol, composto majoritário de P. calomelanos. A fração acetato de etila foi, entre todos os produtos naturais testados, a que mais se destacou em conteúdo fenólico e os mais baixos teores foram verificados na fração hexânica em ambas as plantas. A ocorrência está de acordo com que foi o preconizado por Simões et al. [75], ao afirmar que flavonóides são preferencialmente extraídos pelo solvente acetato de etila. No screening por atividade antioxidante e compostos fenólicos realizado por Lai e Lim [59], P. calomelanos constou entre as quinze espécies avaliadas e seus dados mostraram que esta apresentou uma quantidade moderada de compostos fenólicos no extrato metanólico, porém os autores não chegaram a especificar quais e em que percentuais estavam presentes. Vale ressaltar que estes ensaios foram realizados utilizando extrato metanólico, enquanto nosso estudo avaliou, além do extrato (etanólico), frações com polaridades diferentes. Esta foi a primeira triagem para compostos fenólicos em L. venustum. Jeetendra e Manish [76] analisaram diferentes tipos de extrato de outra espécie do mesmo gênero, L. flexuosum, e encontraram quantidades consideráveis dos compostos que variavam de acordo com o extrator utilizado, encontrando-se mais elevados quando extraídos pelo solvente metanol. Em L. venustum e P. calomelanos, a fração metanólica foi a segunda melhor fração extratora, só perdendo para acetato de etila, esta também considerada polar. A capacidade de inibir a formação de radicais livres pode ser medida, entre outros métodos, pela descoloração da solução etanólica pelo DPPH. Segundo o método descrito por Choi, [74] A solução de DPPH absorve na banda de 518 nm que mede a intensidade da 173 coloração violeta. Na presença de boa atividade contra radicais livres ocorre descoloração [77]. A atuação do ácido ascórbico (conhecida substância antioxidante) ligando-se ao radical livre 2,2–Difenil–1–picril–hidrazila (DPPH) é usada muitas vezes como parâmetro para avaliar o poder antioxidante de extratos e frações de plantas in vitro [78]. O IC50 de extratos etanólicos e frações foram obtidos através da equação das retas y = - 0,7104x + 98,01 n = 6 (R = 0,9953) e y = - 16,51ln(x) + 112,25 n = 6 (R2 = 0,8764), respectivamente (Figuras 7 e 9). Foram considerados os quatro primeiros pontos da curva, resultando no IC50 de ambas as pteridófitas. Para o ácido ascórbico o IC50 foi estimado matematicamente a partir da primeira concentração utilizada (7,81µg/mL), que demonstrou atividade antioxidante próxima ou superior a 50%. Para o ácido ascórbico não foi possível demonstrar linearidade nas demais concentrações testadas. O ácido ascórbico, cuja atividade antioxidante é bastante documentada, apresentou um IC50 de 17,64 e 8,47 µg/mL. Figura 7. Percentual da atividade antioxidante do ácido ascórbico (padrão); extrato etanólico de Pityrogramma calomelanos (EEPC); fração acetato de etila de Pityrogramma calomelanos (FAEPC); fração clorofórmica de P. calomelanos (FCPC); fração metanólica de P. calomelanos (MFPC) e fração hexânica de P. calomelanos (FHPC). Em nosso estudo verificou-se que entre todos os produtos analisados, os extratos etanólicos de P. calomelanos e L. venustum exibiram os melhores resultados para atividade antioxidante, apresentando respectivamente IC50 nas concentrações de 43,4 µg/mL e 67,58 µg/mL (Figuras 8 e 10). Já no que dizem respeito às frações, as plantas divergiram em potencial de atividade uma vez que aquela que apresentou melhor desempenho em P. 174 calomelanos foi a metanólica, enquanto a acetato de etila foi a que mais se destacou quanto a capacidade de seqüestrar radicais livres, entre todas as frações de L. venustum. Este comportamento pode ser justificado devido à presença de compostos com propriedades polares nos extratos, como é o caso dos ácidos fenólicos e flavonóides, os quais possuem comprovada atividade antioxidante. Figura 8. Gráfico do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) do ácido ascórbico (padrão); extrato etanólico de Pityrogramma calomelanos (EEPC); fração acetato de etila de Pityrogramma calomelanos (FAEPC); fração clorofórmica de P. calomelanos (FCPC); fração metanólica de P. calomelanos (MFPC) e fração hexânica de P. calomelanos (FHPC), bem como seus respectivos valores de EC50. Figura 9. Percentual da atividade antioxidante do ácido ascórbico (padrão); extrato etanólico de Lygodium venustum (EELV); fração acetato de etila de Lygodium venustum (FAELV); fração diclorometano de L. venustum (FDMLV); fração metanólica de L. venustum (FMLV) e fração hexânica de L. venustum (FHLV). 175 Diversas pesquisas têm evidenciado a presença de quercetina e kaempferol em samambaias e algumas delas inclusive têm demonstrado que estes compostos, alguns já isolados e apropriadamente descritos, contribuem efetivamente na captação de radicais livres e auxiliam na proteção de moléculas essenciais à vida, como foi o caso do estudo realizado por Chowdhary, anteriormente descrito. Figura 10. Gráficos do teste do seqüestro de radicais livres (DPPH) do ácido ascórbico (padrão); extrato etanólico de Lygodium venustum (EELV); fração acetato de etila de Lygodium venustum (FAELV); fração diclorometano de L. venustum (FDMLV); fração metanólica de L. venustum (FMLV) e fração hexânica de L. venustum FHLV, bem como seus respectivos valores de EC50. O potencial antioxidante de ácidos fenólicos caféico e clorogênico já é conhecido [79], possuindo boa atividade antioxidante em sistemas lipídicos e na inibição da peroxidação celular. Os resultados obtidos a partir deste estudo indicam que as espécies analisadas possuem compostos químicos capazes de capturarem radicais livres, e estas substâncias podem ser consideradas promissoras na busca de fármacos antioxidantes que previnem doenças decorrentes do estresse oxidativo. Vale ressaltar que o teste do DPPH não permite uma definição precisa dos efeitos antioxidantes por se tratar de uma metodologia in vitro [80]. É sabido que a atividade de extratos e frações de plantas não podem ser avaliadas apenas por um método [74]; portanto, torna-se necessário um estudo in vivo para determinar se estas espécies medicinais poderão ser utilizadas em escala industrial. 176 CONCLUSÃO As pesquisas etnobiológicas têm demonstrado ao longo dos anos que diversas espécies de plantas são os produtos naturais mais utilizados pelas populações humanas. Sem duvida alguma, a ampla biodiversidade da pteridoflora mundial fornece variedades de espécies ricas em compostos biologicamente ativos, que por sua vez, são capazes de restabelecerem a homeostase afetada por microrganismos, vírus e estresse oxidativo, entre outros fatores. A relativa fragilidade dos sistemas orgânicos nos coloca diante de emergentes e reemergentes ameaças à saúde. Com isso, novos desafios surgem a cada vez que somos expostos a elas. A luta incessante pela vida, nossa e de outros seres, é uma guerra onde ambos os lados lançam mão dos mais variados artifícios e mecanismos de sobrevivência. Em cada batalha, os produtos naturais com suas estratégias de defesa, são colocados propositalmente a nosso favor, e a partir destes, “fórmulas mágicas”, os fármacos, são criadas com o objetivo de desarticularem as defesas dos agressores ou reequilibrarem moléculas e sistemas avariados, numa tentativa constante para o restabelecimento do bem-estar humano. O estudo realizado para composição deste capítulo permitiu reconhecer o quanto as pteridófitas são necessárias às populações, contribuindo de forma efetiva para a cura ou tratamento de enfermidades em localidades onde os sistemas de saúde são precários ou inexistentes. Porém, constatou-se também, que as potencialidades deste grupo de vegetal estão ainda muito longe de serem plenamente conhecidas. O conhecimento empírico de fato tem sido o principal contribuinte na elucidação das propriedades biológicas das pteridófitas, entretanto, o conhecimento racional e científico, sem dúvida alguma, é um aspecto decisivo para a segurança de seu uso em terapias. Em suma, diante de tantas atividades biológicas exibidas por diferentes e numerosas espécies de pteridófitas, uma quantidade maior de estudos ainda se faz necessário. Um olhar especial e criterioso deve ser dado a este grupo em investigações mais aprofundadas e também mais abrangentes, tendo em vista a sua abundância em biodiversidade, ampla distribuição mundial em regiões propícias e, evidentemente, seu uso pelas populações desde tempos antigos onde apenas se poderia contar com a riqueza do seu extrato bruto. 177 REFERÊNCIAS 1. Pammel, LH. A Manual of Poisonous Plants - Chiefly of Eastern North America with Brief Notes on Economic and Medical Plants and Numerous illustrations. The Torch Press Cedar Rapdis, 1911, p. 323-325. 2. Uddin, MG; Mirza, MM; Pasha, MK. The medicinal uses of pteridophytes of Bangladesh. Journal Plant Taxonomy, 1998, v. 5, n. 2, p. 29-41. 3. Kimura, K; Noro, Y. Pharmacognostical studies on Chinese drug "Gu-sui-bu". I. consideration on "gu-sui-bu" in old herbals (Pharmacognostical studies on fern drugs XI). Syoy - akugaku Zasshi, 1965, v. 19, p. 25-31. 4. Benerjee, RD; Sen, SP. Antibiotic activities of Pteridophytes. Ec. Botany, 1980, v. 34, n. 2, p. 284-298. 5. Dixit, RD; Vohra, JN. A Dictionary of the Pteridophytes of India (Flora of India Series 4) Botanical Survey of India Publication, Department of Environment, Government of India, Botanical Garden, Howrah, 1984, p. 1-177. 6. Kaushik, P. Ethnobotanical Importance of Ferns of Rajsthan: Indigenous Medicinal Plants. Today and Tommorrow Printers and Publication, New Delhi, 1998, p. 61-66. 7. Nayar, BK. Medicinal ferns of India. Bulletin of the National Botanic Gardens, 1957, n. 58, p. 1-38. 8. Hodge, WH. Fern food of Japan and the problem of toxicity. American Fern Journal, 1973, n. 63, p. 77-80. 9. Dixit, RD. Ferns - a much neglected group of medicinal plants. III. Journal Research India Medical, 1975, v. 10, n. 2, p. 74-90. 10. Ghosh, SR; Ghosh, B; Biswas, A and Ghosh, RK. The Pteridophytic Flora of Eastern India. Flora of India Series 4. Botanical Survey of India, 2004, v. 1, p. 1-591. 11. Prado, J; Sylvestre, LS. As samambaias e licófitas do Brasil. In: Forzza, RC. et al. Catálogo de plantas e fungos do Brasil. Rio de Janeiro: Andrea Jakobsson Estúdio: Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, v. 1, 2010; p. 69-74. 12. Tryon, RM; Tryon, AF. Ferns and Allied Plants, with Special Reference to Tropical America. Berlin: Springer-Verlag; 1982. 13. Pryer, KM; Schuettpelz, E.; Wolf, PG; Schneider, H; Smith, AR; Cranfill, R. Phylogeny and evolution of ferns (monilophytes) with a focus on the early leptosporangiate divergences. American Journal of Botany, 2004, v. 91, n. 10, p. 1582–1598. 14. Smith, AR.; Pryer, KM.; Schuettpelz, E.; Korall, P.; Schneider, H.; Wolf, PG. A Classification for Extant Ferns. Taxon, 2006, v. 55, n. 3, p. 705-731. 178 15. Pryer, KM; Schneider, H; Smith, AR; Cranfill, R; Wolf, PG; Hunt, JS; Sipes, SD. Horsetails and ferns are a monophyletic group and the closest living relatives to seed plants. Nature, 2001, v. 409, p. 618-622. 16. Smith, AR; Pryer, KM; Schuettpelz, E; Korall, P; Schneider, H.; Wolf, PG. Fern Classification. In: T.A. Ranker; C.H. Haufler. Biology and Evolution of Ferns and Lycophytes. Cambridge: Cambridge University Press, 2008; p. 417-467. 17. Moran, RC. Diversity, biogeography, and floristics. In: Ranker, TA; Haufler, CH. Biology and evolution of ferns and lycophytes. Cambridge: Cambridge University Press, 2008; p. 367394. 18. Pietrobom, MR; Maciel, S; Costa, JM; Souza, MGC; Trindade, MJ; Fonseca, MSS. Licófitas ocorrentes na Floresta Nacional de Caxiuanã, estado do Pará, Brasil: Lycopodiaceae e Selaginellacea. Boletim Museu Paraense Emílio Goeldi. Ciências Naturais, Belém, 2009, v. 4, n. 1, p. 37-45. 19. Bateman, RM. An overview of Licophyte phylogeny. In: Camus, JM.; Gibby, M.; Johns, RN. Pteridology in perspective. Kew: Royal Botanical Gardens, 1996; p. 405-415. 20. Kenrick, P; Crane, PR. The origin and early evolution of plants on Land. Nature, 1997, v. 389, p. 33-39. 21. Holttum, RE. The ecology of tropical pteridophytes. In: Veerdorn, F. Manual of Pteridology. Amsterdan: The Hague Martinus Nijhoff, p. 420-450, 1938. 22. Ribas, RP; Miguel, LA. Extração e comercialização de folhagens ornamentais da Mata Atlântica: o caso da verdes (Rumohra adiantiformis) no RS. RER, Rio de Janeiro, v. 42, n. 4, 2004, p. 575-596. 23. Santos, MG; Sylvestre, LS. Aspectos florísticos e econômicos das pteridófitas de um afloramento rochoso do Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Acta botânica brasílica, 2006, v. 20, v. 1, p. 115-124. 24. Schmitt, JL; Schneider, PH; Windisch, PG. Crescimento do cáudice e fenologia de Dicksonia sellowiana Hook. (Dicksoniaceae) no sul do Brasil. Acta botânica brasílica, 2009, v. 23, n. 1, p. 282-291. 25. FUNDECI - Gendered Access: Commodity Chain Analysis of Non-timber Forest Products from Laguna de Apoyo Nature Reserve, Nicaragua, Managua, Nicaragua: WIDTech/USAID; 2002. 26. Rivier, L; Lidgren, JE. “Ayahuasca: the South American hallucinogenic drink. An ethnobotanical and chemical investigation”, Economic Botany, 1972, v. 26, n.2, p. 101-129. 27. Silva, VA; Andrade, LHC. Etnobotânica Xucuru: espécies místicas. Biotemas, 2002, v. 15, n. 1, p. 45-57. 179 28. Upreti, K; Jalal, JS; Tewari, LM; Joshi, GC; Pangtey, YPS, Tewari, Geeta. Ethnomedicinal uses of Pteridophytes of Kumaun Himalaya, Uttarakhand, India. Journal of American Science, 2009, v. 5, n. 4, p. 167-170. 29. Srivastava, K. Ethnobotanical Studies of Some Important Ferns. Ethnobotanical Leaflets, 2007, v. 11, p. 164-172. 30. Fenwick, GR. Bracken (Pteridium aquilinum) - toxic effects and toxic constituents. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1989, v. 46, n. 2, p. 147–173. 31. Karthik, V; Raju, K; Ayyanar, M; Gowrishankar, K; Sekar, T. Ethnomedicinal uses of pteridophytes in Kolli Hills, Eastern Ghats of Tamil Nadu, India. Journal of Natural Product Plant Resourse, 2011, v. 1, n. 2, p. 50-55. 32. Kumari, P; Otaghvari, AM; Govindapyari, H; Bahuguna, YM; Uniyal, PL. Some ethnomedicinally important pteridiphytes of India. International Journal of Medicinal and Aromatic Plants , 2011, v. 1, n. 1, p. 18-22. 33. Benjamin, A; Manickam, VS. Medicinal pteridophytes from the Western Ghats. Indian Journal of Traditional Knowledge, 2007, v. 6, n. 4, p. 611-618. 34. Thomas, T. Preliminary Antibacterial and Phytochemical Assessment of Osmunda regalis L. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives, 2011, v. 2, n. 1, p. 559562. 35. Parihar, P.; Parihar, L.; Bohra, A. In vitro antibacterial activity of fronds (leaves) of some important pteridophytes. Journal of Microbiology and Antimicrobials, 2010, v. 2, n. 2, p. 1922. 36. Singh, M; Singh, N; Khare, PB; Rawat, AKS. Antimicrobial activity of some important Adiantum species used traditionally in indigenous systems of medicine. Journal of Ethnopharmacology, 2008, v. 115, n. 2, p. 327-329. 37. Rani, D; Khare, PB; Dantu, PK. In vitro antibacterial and antifungal properties of aqueous and non-aqueous frond extracts of Psilotum nudum, Nephrolepis biserrata and Nephrolepis cordifolia. Indian Journal of pharmaceutical sciences, 2010, v. 72, n. 6, p. 818-822. 38. Ghosh, PG; Mukhopadhyay, R; Gupta, K. Antifungal activity of the crude extracts and extracted phenols from gametophytes and sporophytes of two species of Adiantum. Taiwania, 2005, v. 50, n. 4, p. 272-283. 39. Dalli, AK; Saha, G; Chakraborty, U. Characterization of antimicrobial compounds from a common fern, Pteris biaurita. Indian Journal of Experimental Biology, 2007, v. 45, p. 285290. 40. Lee, J; Choi, Y; Woo, E-R, Lee, DG. Isocryptomerin, a novel membrane-active antifungal compound from Selaginella tamariscina. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, v. 379, n. 3, p. 676–680. 180 41. Ruiz-Bustos, E; Velazquez, C; Garibay-Escobar, A; García, Z; Plascencia-Jatomea, M; Cortez-Rocha, MO; Hernandez-Martínez, J; Robles-Zepeda, RE. Antibacterial and antifungal activities of some Mexican medicinal plants. Journal of Medicinal Food, 2009, v. 12, n. 6, p. 1398-1402. 42. Sarker, AQ; Mondol, PC; Alam, J; Parvez, MS; Alam, F. Comparative study on antitumor activity of three pteridophytes ethanol extracts. Journal of Agricultural Technology, 2011, v. 7, n. 6, p. 1661-1671. 43. Lai, HY; Lim, YY; Kim, KH. Blechnum Orientale Linn - a fern with potential as antioxidant, anticancer and antibacterial agent. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2010, 10:15. 44. Yang, JH; Kondratyuk, TP; Marler, LE; Qiu, X, Choi, Y; Cao, H; Yu, R; Sturdy, M; Pegan, S; Liu, Y; Wang, L; Mesecar, AD; Breemen, RBV; Pezzuto, JM, Fong, HHS; Chen, Y; Zhang, H. Isolation and evaluation of kaempferol glycosides from the fern Neocheiropteris palmatopedata. Phytochemistry, 2010, v. 71, n. 5-6, p. 641–647. 45. Chang, HL; Wu, YC; Su, JH; Yeh, YT; Yuan, SSF. “Protoapigenone, a novel flavonoid, induces apoptosis in human prostate cancer cells through activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun NH2-terminal kinase 1/2,” Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2008, v. 325, n. 3, p. 841–849. 46. Lin, AS; Chang, FR; Wu, CC; Liaw, CC; Wu, YC. New Cytotoxic Flavonoids from Thelypteris torresiana. Planta Med, 2005, v. 71, p. 867-870. 47. Ahmad, DS. Review: Natural products from genus Selaginella (Selaginellaceae). Bioscience, 2001, v. 3, n. 1, p. 44-58. 48. Ma, SC; But, PP; Ooi, VE; He, YH; Lee, SF; Lin, RC. Antiviral amentoflavone from Selaginela sinensis, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2011, v. 24, p. 311. 49. Hafidh, RR; Abdulamir, AS; Jahanshiri, F; Abas, F; Bakar, FA; Sekawi, Z. Asia is the Mine of Natural Antiviral Products for Public Health. The Open Complementary Medicine Journal, 2009, v. 1, p. 58-68. 50. Ma, LY; Ma, SC; Wei, F; Lin, RC; But, PP; Lee, SH; Lee, SF. Uncinoside A and B, two new antiviral chromone glycosides from Selaginella uncinata. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2003, v. 11, n. 51, p. 1264-7. 51. Min, BS; Tomiyama, M; Ma, CM; Nakamura, N; Hattor, M. Kaempferol Acetylrhamnosides from the Rhizome of Dryopteris crassirhizoma and Their Inhibitory Effects on Three Different Activities of Human Immunodeficiency Virus-1 Reverse Transcriptase. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2001, v. 5, n. 49, p. 546-550. 52. World Health Organization. First WHO report on neglected tropical diseases. Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases, 2010. 53. El-On, J; Ozer, L; Gopas, J; Sneir, R; Enav, H; Luft, N; Davidov, G; Golan-Goldhirsh, A. Antileishmanial activity in Israeli plants. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 2009, v. 4, n. 103, p. 297-306. 181 54. Olaf, K; Rumalla, CS; Marcel, K; Armin, P; Silke,B; Appa, R; Wolfgang, S. Antiplasmodial and leishmanicidal and activity of biflavonoids from India Selaginella bryopteris. Phytochemistry Letters, 2008, v. 1, p. 171-174. 55. Esther, DO; Marlon, GA; Jose, LLP; Victoria, M; Eric, D; Arturo, SF. Leishmanicidal Activity of Some Stilbenoids and Related Heterocyclic Compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2001, v. 11, p. 2123–2126. 56. Bianchi, MLP; Antunes, LMG. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Revista de Nutrição, Campinas, 1999, v. 12, n. 2, p. 123-130. 57. Halliwell, B. Free radical and antioxidant a personal view. Nutrition Reviews, 1994, v. 52, n.8, p. 253-261. 58. Lai, HY; Lim, YY; Tan, SP. Antioxidative, tyrosinase inhibiting and antibacterial activities of leaf extracts from medicinal ferns. Bioscience, Bioteechnology and Biochemistry, 2009, v. 73, n. 6, p. 1362-1366. 59. Lai, HY; Lim, YY. Antioxidant Properties of Some Malaysian Ferns. 3rd International Conference on Chemical, Biological and Environmental Engineering IPCBEE. Singapore: IACSIT Press, 2011, v. 20. 60. Chowdhary, S; Verma, DL; Pande, R; Kumar, H. Antioxidative properties of flavonoids from Cheilanthes anceps Swartz. Journal of American Science, 2010, v. 6, n.5, p. 203-207. 61. Mehltreter K. Leaf phenology of the climbing fern Lygodium venustum in a Semideciduous Lowland Forest on the Gulf of Mexico, American Fern Journal, v. 96, n. 1, p. 21–30, 2006. 62. Duke, JA. Duke's Handbook of Medicinal plants of Latin America. New York: CRC Press Taylor & Francis group, 2008; 832 p. 63. Argueta, A; Cano, L; Rodarte, M. Atlas de las plantas de la medicina tradicional mexicana, vol. I–III. Instituto Nacional Indigenista, Mexico City, 1994. 64. Rodrigues, E; Tabach, R; Galduróz, JCF; Negri, G. Plants with possible anxiolytic and/or hypnotic effects indicated by three Brazilian cultures — Indians, Afro-Brazilians, and riverdwellers. Studies in Natural Products Chemistry, 2008, v. 35 (C), p. 549-595. 65. Albuquerque, U; Barros, ICL; Chiapetta, AA. Pteridófitas utilizadas nos cultos afrobrasileiros em Recife – PE: um estudo etnobotânico, Biológica Brasílica, 1997, v. 7, p. 23-30. 66. Moran, RC. Pityrogramma Link. In: G. Davidse et al. Flora Mesoamericana. México: Universidad Nacional Autónoma de México, 1995, p. 137-140. 67. Prado, J. Flora da Reserva Ducke, Amazonia, Brasil: Pteridophyta - Blechnaceae, Rodriguesia, 2005, v. 56, n. 86, p. 33-34. 182 68. Pietrobom, MR; Barros, ICL. Pteridófitas de um remanescente de Floresta Atlântica em São Vicente Férrer, Pernambuco, Brasil: Pteridaceae. Acta botânica brasílica, 2002, v. 16, n. 4, p. 457-479. 69 May, LW. The economic uses and associated folklore of ferns and fern allies. The Botanical Review, 1978, v. 4, p. 491-528. 70. Corrêa, MP. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro, Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, 1984. 71. Barros, ICL; Andrade, LHC. Pteridófitas medicinais (samambaias, avencas e plantas afins). Recife: Ed. Universitária da Universidade Federal de Pernambuco, 1997; 213 p. 72. Matos, FJA. Introdução à fitoquímica experimental. Fortaleza: UFC Edições, 1997; 141 p. 73. Laghari, AH; Memon, S; Nelofar, A; Khan, K.M; Yasmin, A. Determination of free phenolic acids and antioxidant activity of methanolic extracts obtained from fruits and leaves of Chenopodium album. Food Chemistry, 2011, v. 126, p. 1850–1855. 74. Choi, CW; Kim, SC; Hwang, SS; Choi, BK; Ahn, HJ; Lee, MY; Park, SH; Kim, SK. Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison. Plant Science, 2002, v. 163, p. 1161-1168. 75. Simões, CMO; Schenkel, EP; Gosmann, G; Mello, JCP; Mentz, LA; Petrovick, PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ªed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2010; 1102 p. 76. Jeetendra, N; Manish, B. Correlation of antioxidant activity with phenolic content and isolation of antioxidant compound from Lygodium flexuosum (L.) SW. Extracts. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2011, v. 3, n. 2, p. 48-52. 77. Kulisic, T; Radonic, A; Katanilic, V; Milos, M. Use of different methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil. Food Chemistry, 2004, v. 85, p. 633-640. 78. Rice-Evans, CA; Miller, NJ; Paganga, G. Structure – antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology & Medicine, 1996, v. 20, n. 7, p. 933956. 79. Soares, SE. Ácidos fenólicos como antioxidantes. Revista de Nutrição, Campinas, 2002, v. 15, n. 1, p, 71-81. 80. Ursini, F; Maiorino, M; Marazzoni, P; Roveri, A; Pifferi, G. A novel antioxidant flavonoid (idB 1031) affecting molecular mechanisms of cellular activation. Free Radical Biology & Medicine, 1994, v. 16, n. 5, p. 547-553. 183 AGRADECIMENTOS Aos membros dos Laboratórios de Bioquímica Toxicológica e Farmácia Industrial da Universidade Federal de Santa Maria – RS, Brasil, com menção especial a Rogério de Aquino Saraiva, Diones Caeran Bueno e Pablo Andrei Nogara e Aline Augusto Boligon pela realização dos ensaios laboratoriais. 184 CORRESPONDÊNCIA REFERENTE À SUBMISSÃO O capítulo foi aceito pela Nova Science Publishers para compor a obra intitulada "Natural Products: Structure, Bioactivity and Applications". ---------- Forwarded message ---------From: <[email protected]> Date: 2011/11/22 Subject: Publication Cooperation To: [email protected] Dear Dr. Coutinho, Good day. Thank you for your email message. I am pleased to confirm preliminary acceptance of your chapter based on the abstract received. Please send the final version by email attachment to [email protected] or by regular mail or courier to the address listed below. If the file(s) for the chapter exceeds 10MB in size, please contact Nova at the same email address ([email protected]) for FTP instructions. If you have the opportunity, we invite you to visit our website at novapublishers.com. We will be sending electronic page proofs. As soon as a book is listed, the codes in the status field on the Nova website are changed to show production progress through to publication: A copyright transfer form must accompany the full chapter. It is specifically stipulated that no permission is required of the publisher by the author to republish or reuse any tables or graphics contained in the article in other published works or research or oral presentations. We look forward to working together. Sincerely yours, Nadya Gotsiridze-Columbus President Nova Science Publishers, Inc. 400 Oser Avenue, Suite 1600 Hauppauge, NY 11788 Tel: 631- 231-7269 Fax: 631-231-8175 Email: [email protected] Web: www.novapublishers.com P.S. Should you have any proposals now or in the future for a separate book under your authorship or editorship please see our Publication Idea Form in the attachment to this email for your perusal. Date: Sun, 20 Nov 2011 19:52:19 -0300 Subject: Proposal of chapter Dear sir, attached to this e - mail I´m sending the abstract proposal of a chapter for the book entitled "Natural Products: Structure, Bioactivity and Applications". Sincerely yours. 185 CONCLUSÕES 186 6 CONCLUSÕES A análise fitoquímica do extrato etanólico de L. venustum revelou a presença de importantes classes de metabólitos secundários, sendo eles taninos, flavonóides e alcalóides. L. venustum não apresentou atividades antibacteriana e antifúngica isoladamente nas concentrações testadas. Extrato e frações não modularam o efeito das drogas utilizadas como antifúngicas contra os fungos do gênero Candida. L. venustum potencializou a ação dos aminoglicosídeos amicacina, canamicina, neomicina e gentamicina contra Escherichia coli 27 e Staphylococcus aureus 358. A fração acetato de etila potencializou o efeito de todos os aminoglicosídeos. Nenhum efeito modulatório foi observado contra Pseudomonas aeruginosa 03. Extrato e fração acetato de etila contribuíram de forma aditiva para a inibição dos microrganismos quando associado a drogas. A fração acetato de etila apresentou interação sinérgica associada à amicacina contra E. coli 27. Apenas a fração diclorometano não exibiu citotoxicidade. O extrato e as demais frações apresentaram variações de alta a nenhuma citotoxicidade em 100 µg/mL. As frações metanólica e hexânica demonstraram moderada atividade tripanocida. A atividade antileishmania revelou-se insignificante para extrato e frações de L. venustum, exceto para a fração metanólica que exibiu efeito moderado. 187 De todos os produtos testados, o extrato etanólico e a fração acetato de etila exibiram o potencial antioxidante mais expressivo, destacando-se entre os demais. A fração acetato de etila contém compostos químicos de grande relevância para as atividades biológicas apresentadas pela samambaia, tais como atividade antioxidante e moduladora de antibióticos. A fração metanólica apresenta fitoconstuíntes importantes para a ação antiparasitária e não apresenta citoxicidade. L. venustum poderá ser fonte de agentes antimicrobianos em compostos multidrogas. 188 REFERÊNCIAS 189 REFERÊNCIAS Aquí estarão disponibilizadas as referências da introdução, da revisão de literatura e da metodología. As referências da parte dos resultados e discussão encontram-se apresentadas no final dos artigos e do capítulo do livro. ALANIS, A.D. et al. Antibacterial properties of some plants used in Mexican tradicional medicine for the treatment of gastrointestinal disorders, Journal of Ethnopharmacology, v. 100, n 1-2, p. 153-157, 2005. ALBUQUERQUE, U.; BARROS, I.C.L.; CHIAPETTA, A.A. Pteridófitas utilizadas nos cultos afro-brasileiros em Recife – PE: um estudo etnobotânico, Biológica Brasílica, v. 7, p. 23-30, 1997. ALMEIDA, R. S. Micologia. Ciências Farmacêuticas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008, 161 p. ARANTES, A.A.; PRADO, J; RANAL, M.A. Samambais da Estação Ecológica do Panga, Uberlândia, Minas Gerais, Brasil: Anemiaceae, Aspleniaceae, Cyatheaceae e Lygodiaceae, Rodriguésia, v. 59, n.4, p. 845-858, 2008. ARGUETA, A.; CANO, L.; RODARTE, M., Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana, vol. I–III. Instituto Nacional Indigenista, Mexico City. 1994. AUGUSTO, L.G.S.; GÓES, L. Compreensões integradas para vigilância da saúde em ambiente de floresta: O caso da Chapada do Araripe, Ceará, Brasil. Cadernos de Saúde Pública, vol. 23, sup. 4, p. 5549-5558, 2007. BARBOSA, L.F.; MEDEIROS, M.H.G.; AUGUSTO, O. Danos oxidativos e neurodegeneração: o quê aprendemos com animais transgênicos e nocautes? Química Nova, v. 29, n. 6, p. 1352 – 1360, 2006. BARRAVIERA, B. Estudo clínico das estafilococcias, Jornal Brasileiro de Medicina, v. 67, n. 1, p.160-92, 1994. BARRETT, M.P.; COOMBS, G.H.; MOTTRAM, J.C., Recent advances in identifying and validating drug targets in trypanosomes and leishmanias, Trends in Microbiology, v. 7, n.2, p. 82-88, 1999. BOIBESSOT, I. et al. Terapêutica Experimental na Doença de Chagas. In: BRENER, Z.; ANDRADE, Z.; BARRAL-NETO (eds). Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas, Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, p. 379-388, 2000. BRASIL. Ministério da Saúde. Departamento de Ciência e Tecnologia, Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Doenças negligenciadas: estratégias do Ministério da Saúde. Revista de Saúde Pública, v. 44, n.1, p. 200-2, 2010. 190 BRASILEIRO, B.G.; PIZZIOLO, V.R.; RASLAN, D.S.; JAMAL, C.M.; SILVEIRA, D. Antimicrobial and cytotoxic activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador Valadares district, Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, p. 195-202, 2006. BRENER, Z. Terapêutica Experimental na Doença de Chagas. In: BRENER, Z.; ANDRADE, Z.; BARRAL-NETO (eds). Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, p. 379-388, 2000. BUCKNER, F.S. et al. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 40, p. 2592–2597, 1996 CALZADA, F.; ARISTA, R.; PÉREZ, H. Effect of plants used in Mexico to treat gastrointestinal disorders on charcoal - gum acacia - induced hyperperistalsis in rats, Journal of Ethnopharmacology, v. 128, n. 1, p. 49–51, 2010. CALZADA, F.; LILIAN, Y.M.; CONTRERAS, A.T. Effect of Mexican medicinal plant used to treat trichomoniasis on Trichomonas vaginalis trophozoites, Journal of Ethnopharmacology, v.113, n. 2, p. 248–251, 2007. CASARINO, J.E.; MYNSSEN, C.M.; MESSIAS, M.C.T.B. Schizaeales no Parque Estadual do Itocolomi, Minas Gerais, Brasil, Revista Brasileira de Botânica, v. 32, n. 4, p. 737-748, 2009. CASTRO, T.L. et al. Mecanismos de resistência da Candida sp WW a antifúngicos. Infarma, v. 18, n. 9/10, 2006. CHOI, C.W. Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison, Plant Science, v. 163, n. 6, p. 1161-1168, 2002. COLLINSON, M.F. “What use are fossil ferns?” 20 years on: with a review of the fossil history of extant pteridophyte families and genera. In: Camus, J. M.; Gibby, M & Johns, R. J. (eds.), Pteridology in perspective. Royal Botanic Gardens, Kew, p. 349–394. 1996. COLOMBO, A.L.; GUIMARAES, T. Epidemiologia das infecções hematogênicas por Candida spp., Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, ano 36, n. 5, p. 599-607, 2003. COSTA, J.M.; PIETROBOM, M.R.. Pteridófitas (Lycophyta e Monilophyta) da Ilha de Mosqueiro, município de Belém, estado do Pará, Brasil, Boletim do Museu Paraense Emílio Goeldi Ciências Naturais, Belém, v. 2, n. 3, p. 45-55, 2007. COUTINHO, H.D.M.; COSTA, J.G.M.; LIMA, E.O.; FALCÃO-SILVA, V.S.; SIQUEIRAJÚNIOR. Enhancement of the Antibiotic Activity against a Multiresistant Escherichia coli by Mentha arvensis L. and Chlorpromazine. Chemotherapy, v. 54, p. 328–330, 2008. DELDEN, C.V.; IGLEWSKI, B. H. Cell-to-Cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections. Emerging Infectious Diseases, v. 4, n. 4, 1998. 191 DIPERSIO, J.R.. Evolution and dissemination of extended-spectrum beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae: epidemiology and molecular report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2003), Diagnostic Microbiology Infectious Disease, v. 51, n. 1, p.1-7, 2005. DOERIG, C; MEIJER, L; MOTTRAM, J.C. Protein kinases as drug targets in parasitic protozoa, Trends in Parasitology, v.18, n. 8, p. 366-71, 2002. DUKE, J.A. Duke's Handbook of Medicinal Plants of Latin America, New York: CRC Press Taylor & Francis group, 2008, 832 p. EDWARDS, J.E. Jr. Invasive Candida infections. Evolution of a fungal pathogen. The New England Journal of Medicine, v. 324, n. 15, p.:1060-2, 1991. ELIOPOULOS, G.M.; MOELLERING, R.C. Antimicrobial combinations. In: LORIAN, V. (ed): Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore, MD, p. 434-441, 1991. FERREIRA, A.L.A.; MATSUBARA, L.S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica, v. 43, n. 1, p. 61-68, 1997. FERREIRA, M.S.; GONÇALVES, E.G.; ASSIS, V.P. Como diagnosticar e tratar infecções estafilocócicas, Revista Brasileira de Medicina, v. 42, n. 6, p. 179-89, 1985. FUNDACIÓN NICARAGÜENSE PRO DESARROLLO COMUNITARIO INTEGRAL FUNDECI -. Gendered Access: Commodity Chain Analysis of Non-timber Forest Products from Laguna de Apoyo Nature Reserve, Nicaragua, Managua, Nicaragua: WIDTech/USAID, 2002. GERMANO, P.M.L.; GERMANO, M.I.S. Higiene e Vigilância Sanitária de alimentos. 4ª ed. Barueri, São Paulo: Manole. 2011. GIL, E.S. et al. Leishmaníase: Arsenal Terapêutico e Alvos Moleculares, Vita et Sanitas, Trindade/Go, v. 1, n . 01, 2007. GOUVÊA, C.M.C.P. Oxidações biológicas e atividade vegetal. In: Fitoterápicos anti-infl amatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Carvalho, J.C.T. coord. Ribeirão Preto: Tecmedd, p. 101-124, 2004. HALLIWELL, B. Free radical and antioxidant a personal view. Nutrition Reviews, v. 52, n.8, p. 253-261, 1994. HAZEN, C.K. New and emerging pathogens, Clinical Microbiology Reviews, Washington, D.C., v. 8, n. 4, p. 462-478, 1995. HOLTTUM, R.E. The ecology of tropical pteridophytes. In: VEERDORN, F. (Ed.) Manual of Pteridology. Amsterdan: The Hague Martinus Nijhoff, p. 420-450, 1938. HURLEY, R; WINNER, H.I. Pathogenicity in the genus Candida, International Journal of Dermatology, v. 5, n. 3, p. 151-153, 1966. 192 IWEN, P.C. et al. Invasive infection due to Candida krusei in immunocompromised patients not treated with fluconazole, Clinical Infectious Diseases, v. 20, n. 2, p. 342-347, 1995. JANSEN, A.M. et al. “A Ecologia e a Complexidade dos Ciclos de Transmissão do Trypanosoma cruzi na Natureza’. In: Doença de Chagas: Manual de Experimentação Animal. ARAÚJO-JORGE, T.C e DE CASTRO, S.L. (Orgs.), Rio de Janeiro, Editora Fiocruz, p. 33-38, 2000. JAVADPOUR, M.M, et al. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity, Journal of Medicinal Chemistry, v. 39, n. 16, p. 3107–3113, 1996. KANAFANI, Z.A.; PERFECT, J.R. Resistance to Antifungal Agents: Mechanisms and Clinical Impact, Clinical Infectious Diseases, v. 46, n. 1, p. 120–8, 2008. KANTARCIOGLU, A.S.; YUCEL, A. Phospholipase and protease activities in clinical Candida isolates with reference to the source of strains, Mycoses, v. 45, n. 1,p.160165, 2002. KRUSZYNSKA, E. et al. Susceptibility to antibiotics of Staphylococcus aureus strains. In: Medycyna. Doswuiadczalna I Mikrobiologia, Varsovia: Scientia, v. 49, p. 141-144, 1997. . LE SENNE, A. et al. Biological characterization of a beta-galactosidase expressing clone of Trypanosoma cruzi CL strain. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 97: 1101–1105. 2002. LEUNG, A.Y.H. et al. Candida tropicalis fungaemia in adult patients with haematological malignancies: clinical features and risk factors, Journal of Hospital Infection, v. 50, n. 1, p. 316-319, 2002. LÓPEZ, C.A.A. Considerações gerais sobre plantas medicinais, Ambiente: Gestão e Desenvolvimento, v. 1, n.1, p. 19-27, 2006. LOWY, F.D. Staphylococcus aureus infections, New England Journal of Medicine, v. 339, p. 520-32, 1998. MACÊDO, D.P.C. Candida glabrata esophagitis: new case reports and management, Brazilian Journal of Microbiology, v. 39, n. 2, p. 1-7, 2008. MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA JR., V.F. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares, Química Nova, v. 25, n. 3, 429-438, 2002. MAGILL, A.J. Epidemiology of leishmaniasis, Dermatologic Clinics, v. 13, n. 3, p. 50555023, 1995. MATOS, F.J.A., Introdução à fitoquímica experimental. Fortaleza: UFC Edições. 1997. McGOWAN Jr, J.E. Minimizing antimicrobial resistance: The key role of the infectious diseases Physician, Clinical infectious disease, v: 38, n. 7, p. 939-942, 2004. 193 MEHLTRETER K. Leaf Phenology of the Climbing Fern Lygodium venustum in a Semideciduous Lowland Forest on the Gulf of Mexico, American Fern Journal, v. 96, n. 1, p. 21–30, 2006. MENEZES, A.E. et al. Evaluation of the in vitro activity of meropenem against strains of extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolated in the city of Fortaleza, Ceará. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 40, n. 3, p. 349350, 2007. MEUNIER-CARPENTIER, F; KIEHN, T.E.; ARMSTRONG, D. Fungemia in the immunocompromised host. Changing patterns, antigenemia, high mortality. The American Journal of Medicine, v. 71, n. 3, p. 363-370, 1981. MICHALICK, M.S.M. Gênero Leishmania. In: Neves, D.P., Melo, A.L.; Genaro, O.; Linardi, P.M. Parasitologia humana. 10. ed. São Paulo: Atheneu, p.31-35, 2003. MICKEL, J.T. A monographic study of fern genus Anemia, subgenus Coptophyllum. Iowa State College Journal of Science, v. 36, p. 349-492, 1962. MIKUS, J; STEVERDING, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using dye Alamar Blue®. Parasitology International, v. 48, p. 265-259, 2000. MONGE, R.A.; ROMA’N, E.; NOMBELA, C.; PLA, J. The MAP Kinase signal transduction network in Candida albicans. Microbiology, v. 152, n. 1, p. 905-912. MORAES, R.G.; COSTA LEITE, I., GOULART, E.G. Parasitologia & Micologia Humana. 5ª ed. Rio de Janeiro: Cultura Médica: Guanabara Koogan. 2008. MORAN, R. C. Schizaeaceae. In Moran, R.C. e Riba, R. (eds.), Flora Mesoamericana 1. Psilotaceae a Salviniaceae. Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México. p. 52, 1995. MUELLER, R. J. Indeterminate growth and ramification of the climbing leaves of Lygodium japonicum (Schizaeaceae), American journal of botany, v. 70, n. 5, p. 682–690, 1983. MUKHERJEE, A. et al. Roles for mitochondria in pentamidine susceptibility and resistance in Leishmania donovani. Molecular e Biochemical Parasitology, v. 145, p. 1-10, 2006. MURRAY P.R. et al. Microbiologia médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000 NASCIMENTO, et al. Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistance bacteria, Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, p. 247-256, 2000. NCCLS – NATIONAL COMITTE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. Methods for dilution antimicrobial susceptibility testes for bacteria that grow aerobically. 5ª ed. Villanova, PA: NCCLS approved standard M7-A5, 20: 2, 2000. NEVES, D.P. Parasitologia Humana. 11ª ed. Editora Atheneu. São Paulo, 2004. 194 NEVES, R.P. et al. Yeasts isolated from clinical samples of AIDS patients. Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, n. 4, p. 363-364, 2002. NGUYEN, M.H. et al. The changing face of candidemia: emergence of non-Candida albicans species and antifungal resistance. The American Journal of Medicine, v. 100, n. 6, p. 617– 623, 1996. NUCCI, M.; COLOMBO, A.L. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v. 58, n. 1, p. 77-82, 2007. ODDS, F.C. Candida and candidosis, 2nd edn. London: Bailliere Tindall. 1988. ______. Ecology of Candida and epidemiology of candidosis. Candida and candidosis: a review and bibliography. 2nd ed. London: Bailliere Tindall, p. 68–82.1988. OUELLETTE, M.; LEGARE, D.; PAPADOPOULOU, B. Drug resistance and Pglycoprotein gene amplification in the protozoan parasite Leishmania, Research in microbiology, v. 142, p. 407-411, 1994. PAGE, C. N. The diversity of ferns: An ecological perspective. In: Dyer, A.F. (ed.). The experimental biology of ferns. Academic Press, London, p. 10-5, 1979a. ______. Experimental aspects of fern ecology. In: Dyer, A.F. (ed.). The experimental biology of ferns. Academic Press, London, p. 551-589, 1979b. PALOMINO, J.C. et al. Resazurin microtiter assay plate: simlpe and unexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.46, n.8, p.2720-2722, 2002. PINTO, A.C. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas, Química Nova, vol 25, n. 1, 45-61, 2002. PODSCHUN, R..; ULLMANN, U. Klebsiella spp as Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors, Clinical Microbiology Reviews, v. 11, n. 4, p. 589-603, 1998. PRADO, J. Flora da Reserva Ducke, Amazonia, Brasil: Pteridophyta - Blechnaceae, Rodriguesia, v. 56, n. 86, p. 33-34. 2005. PRYER, K. M. et al. Phylogeny and evolution of ferns (Monilophytes) with a focus on the early leptosporangiate divergences, American Journal of Botany, v. 91, n. 10, p. 1582-1598, 2004. RAHMAN, A. U. Studies in Natural Products Chemistry. Editora: Elsevier Science. 2008. V. 35, Part L. RANGE, H.P. Farmacologia. 6ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007, 829 p. 195 REX, J.H. et al. Practice Guidelines for the treatment of candidiasis, Clinical Infectious Diseases, v. 30, n. 4, p. 662-678, 2000. REY, L. Bases da Parasitologia Médica. 3ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010, 391 p. ______. Parasitologia. 2a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991. 731 p. RICHARDSON, M.; LASS-FLORL, C. Changing epidemiology of systemic fungal infections, Clinical Microbiology and Infection, v. 14, n. 4, p. 5-24, 2008. RIVIER, L.; LIDGREN, J.E. “Ayahuasca: the South American hallucinogenic drink. An ethnobotanical and chemical investigation”, Economic Botany, v. 26, n.2, p. 101-129, 1972. ROBERTS, L.S.; JANOVY, J.J. Foundations od parasitology. In: . New York: McGraw-Hill, cap. Kinetoplastida:Trypanosomes and their kin, p. 55-81, 2000. RODGERS, M.R,; POPPER, S.J.; WIRTH, D.F. Amplification of kinetoplast as a tool in the detection and diagnosis of Leishmania. Experimental Parsitology, v. 71, n. 3, p. 267-275, 1990. ROLIM, L. B. Pteridófitas do parque estadual do Itacolomi, Minas Gerais, Brasil. 2007. 271 f. Dissertação (Mestrado em Botânica)-Universidade de Brasília, Brasília, 2007. ROLÓN. M. et al. Selective activity of polyene macrolides produced by genetically modified Streptomyces on Trypanosoma cruzi, International Journal of Antimicrobial Agents, v. 28, n. 2, p. 104 -109, 2006. SAMARANAYAKE, Y.H.; SAMARANAYAKE, L.P. Candida krusei: biology, epidemiology, pathogenicity and clinical manifestations of an emerging pathogen, Journal of Medical Microbiology, v. 41, n. 5, p. 295-310, 1994. SANTIAGO, C.A.P.; BARROS, I.C.L. Pteridoflora do Refúgio Ecológico Charles Darwin (Igarassu, Pernambuco, Brasil), Acta Botânica Brasílica, v.17, n.4, p. 597-604, 2003. SEGATO, F. Expressão gênica envolvida nos mecanismos de resistência à acriflavina, griseofulvina e terbinafina em fungos filamentosos. 2008. Tese (doutorado). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Universidade de São Paulo, 2008. SEQUEIRA, M. Resistência aoss antibióticos: o uso inadequado dos antibióticos na prática clínica, Revista de La O.F.I.L., v. 14, n. 1, p. 45-68, 2004. SHAHIDI, F.; ALASALVAR, C. ; LIYANA-PATHIRANA, C.M. Antioxidant Phytochemicals in Hazelnut Kernel (Corylus avellana L.) and Hazelnut Byproducts, Journal of agricultural and Food Chemistry, v. 55, n. 4, p. 1212-1220, 2007. SIDRIN, J.J.C.; ROCHA, M.F.G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2010. 388 p. SILVA, C.H.P.M. Bacteriologia: um texto ilustrado/Carlos Henrique de Menezes e 196 Silva. Teresópolis, RJ, Eventos, p. 121-134, 165-206, 1999. SILVEIRA, G.P. et al. Estratégias uitlizadas no combate a resistência microbiana, Química Nova, v. 29, n. 4, p. 844-855, 2006. SIMÕES, C.M.O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ªed. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC. 2010, 1102 p. SINGH, A.P. et al. Perspectives of Pteridophytes Biodiversity: a source of economy elevation. NATIONAL CONFERENCE ON BIODIVERSITY, DEVELOPMENT AND POVERTY ALLEVATION. Disponível em: uspbdb.org/pdf/Souvenir2010/7.pdf. 2010. Acesso em 10 de novembro de 2011. SKOG, J.E.; ZIMMER, E.A.; MICKEL, J.T. Additional support for two subgenera of Anemia (Schizaeaceae) from data for the chloroplast intergenic spacer region trnL-F and morphology, American Fern Journal, v. 92, n. 2, p. 119-130, 2002. SMITH, A.R. et al. Fern classification. In: Ranker, T.A. & Haufler, C.H. (eds). Biology and evolution of fern and Lycophytes, Cambridge University Press, Cambridge, p.417-467, 2008. SMITH, A.R. et al. A classification for extant ferns, Taxon, v. 55, n. 3, p. 705-731, 2006. SOARES-BEZERRA, R.J.; LEON, L.; GENESTRA, M. Recentes avanços da quimioterapia das leishmanioses: moléculas intracelulares como alvo de fármacos, Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, vol. 40, n. 2, 2004. SOUZA, O. C. et al. Antimicrobial resistance profile of Pseudomonas aeruginosa isolated in feces of patients infected with human immunodeficiency vírus. Caderno Saúde Coletiva, Rio de Janeiro, v.15, n.3, p. 392 -379, 2007. STEVENSON D.W.; LOCONTE H. Ordinal and familial relationships of pteridophyte genera. In: Camus, J.M., Gibby M., Johns R.J. (eds.) Pteridology in perspective. Royal Botanic Gardens, Kew, p. 435-467, 1996. TOLEDO, A. C. O. et al. Fitoterápicos: uma abordagem farmacotécnica. Revista Lecta, v. 21, n.1/2, p. 7-13, 2003. TORTORA, GJ; FUNKE, BR; CASE, CL. Microbiologia, 8 ed. Porto Alegre, Artmed, 2008. TRABULSI, L.R; RACHID, L. Microbiologia. 4 ed, São Paulo: Atheneu, 2004, p. 720. TRYON, R. M; STOLZE, R. G.. Pteridophyta of Peru. Part I. 1. Ophioglossaceae–12. Cyatheaceae. Fieldiana Botany, New series, n. 27: 111-139, 1989. VEGA, C, et al. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Reseach, v. 95: n.4, p. 296-8, 2005. 197 VELÁZQUEZ, C. et al. Antisecretory activity of plants used to treat gastrointestinal disorders in Mexico. Journal of Ethnopharmacology, v. 103, n. 1, p. 66–70, 2006. VERMELHO, A. B.; BASTOS, M. C F.; BRANQUINHA, M. Bacteriologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007, 582 p. VERMELHO, A.B.; PEREIRA, F.P.; COELHO, R.R.R.; SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006, 239 p. VIEGAS, J.R.; BOLZANI, V.S. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova, v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006. VIGO, M.M.M. Microarranjos de DNA para análise da expressão gênica em cepas de Trypanosoma cruzi suscetíveis e resistentes a benznidazol (Tese de doutorado). Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade de São Paulo. 2008. VOGT, B. Urate oxidase (rasburicase) for treatment of severe tophaceous gout. Nefrology, Dyalisis, Transplantation, v. 20, n. 2, p. 431 – 433, 2005. WANNMACHER, L. Antifúngicos. In: Wannmacher, L.; Ferreira, M.B.C. Farmacologia Clínica para Dentistas. 3 ed. Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 2007. WINGARD, J.R. et al. Increase in Candida krusei infection among patients with bone marrow transplantation and neutropenia treated prophylactically with fluconazole. The New England Journal of Medicine, v. 325: 1274-1277, 1991. WINGARD J.R. Importance of Candida species other than C. albicans as pathogens in oncology patients, Clinical Infectious Diseases, v. 20, n. 1, p. 115-125, 1995. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Control of Chagas disease: second report of the WHO Expert Committee. WHO Technical Report Series, n. 905. 2002. WORLD HEALTH ORGANIZATION. First WHO report on neglected tropical diseases. Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases, 2010. ZARDO, V.; MEZZARI, A. Os antifúngicos nas infecções por Candida sp. News Lab. 63: 136-146. 2004. ZHANG, Z. et al.Natural products inhibiting Candida albicans secreted aspartic proteases from Tovomita krukovii, Planta Medica, v. 68, n. 1, p. 49-54, 2002. ZHOU, F. et al. The changes of oxidative stress and human 8-hydroxyguanine glycosylase1 gene expression in depressive patients with acute leukemia. Leukemia Research, v. 31, p. 387–393, 2007. 198 APÊNDICE 199 APÊNDICE A - QUADRO COM LEVANTAMENTO DE PESQUISAS ENVOLVENDO O GÊNERO LYGODIUM COMPREENDIDAS NO PERÍODO DE 1994 – 2011 (NOVEMBRO). ANO 1994 PESQUISA AUTORES E REVISTA The effects of white flourescent light, Pérez–García, B., A. Orozco–Segovia far–red light, darkness, and moisture & R. Riba. American Journal of Botany on spore germination of Lygodium 81(11): 1367–1369. heterodoxum (Schizaeaceae). Effect of sulphite on spore Sahi, A. N. & S. K. Singh. germination and rhizoid development Revista de Biologia Tropical 42(1–2): in the tropical fern Lygodium 53–57. japonicum (Filicales: Lygodiaceae). 1995 Lygodium. Moran, R. C. In R. C. Moran & R. Riba (Eds.). Pp. 56-57. Flora Mesoamericana. Vol. 1. Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Ciudad Universitaria, Mexico. Gametophytes sporophytic derived tissues in from Nakamura, M. & M. Maeda. Journal of a fern, Plant Physiology 145 (1-2): 185-188. Lygodium japonicum L.: 1. Induction of the gametophytes and their protoplast isolation. Sorophores of the genus Lygodium Ratcliffe, G. E., M. A. Gandolfo, K. C. Sw. (Schizaeaceae) from the Late Nixon & W. L. Crepet. Cretaceous of New Jersey. American Journal of Botany 82 Suppl. 6: 90-91. 1996 Antiviral activities medicinal plants. of Nepalese Taylor, R. S. L., N. P. Manandhar, J. B. Hudson & G. H. N. Towers. Journal of 200 Ethnopharmacology 52: 157-163. Identification of antheridiogens in Yamauchi, T., N. Oyama, H. Yamane, Lygodium circinnatum and Lygodium N. Murofushi, H. Schraudolf, M. Pour, flexuosum. M. Furber & L. N. Mander. Plant Physiology (Rockville) 111: 741-745. 1997 A survey of root pressures in vines of Ewers, F. W., Cochard, H. & Tyree, M. a tropical lowland forest. [Lygodium T. Oecologia Berlin 110: 191-196. venustum] Survey of root pressure in tropical Fisher, J. B., Angeles, Ewers, F. W. & vines and woody species. Lopez-Portillo, J. International Journal of Plant Sciences 158: 44-50. The homoeopathic treatment of otitis Friese, K. H., Kruse, S., Luedtke, R. & media in children - comparisons with Moeller, H. International Journal of conventional therapy. Clinical Pharmacology and Therapeutics 35: 296-301. Paleocene plant macrofossils from Pole, M. Journal of the Royal Society Kakahu, South Canterbury, New of New Zealand 27: 371-400. Zealand. Weeds in slash-and-burn rice fields in Roder, northern Laos. W., Phengchanh, S. & Keobulapha, B. Weed Research 37: 111-119. Biosynthesis of GA-73 methyl ester Yamauchi, T., Oyama, N., Yamane, H., in Lygodium ferns. Murofushi, N., Schraudolf, H., Pour, M., Seto, H. & Mander, L. N. Plant Physiology Rockville 113: 773-778. 1998 A monographic study of Lygodium Hanks, J. G. City College of New York, 201 Swartz (Pteridophyta: Lygodiaceae). 371 pp. [Dissertation] The potential of biological control to Pemberton, R. W. American Fern manage Old World climbing fern Journal 88: 176-182. (Lygodium microphyllum), an invasive weed in Florida. Old world climbing fern (Lygodium Pemberton, R. W. & A. P. Ferriter. microphyllum), a dangerous invasive American Fern Journal 88: 165-175. weed in Florida. Synthesis of 12-hydroxy 9,15- Pour, M., G. M. Wynne, L. N. Mander cyclogibberellins. & A. C. Willis. Tetrahedron Letters; April 2 39, no.14: 1991-1994. Gibberellin A117 methyl ester, a new Wynne, G., L. M. Mander, N. Goto, H. antheridiogen from Lygodium Yamane & T. Omori. Phytochemistry circinnatum. (Oxford) 49: 1837-1840. Biosynthetic origin of the Wynne, G. M., L. M. Mander, N. Goto, antheridiogen, gibberellin A73 methyl H. Yamane & T. Omori. Tetrahedron ester, in ferns of the Lygodium genus. 1999 An ultrastructural study of Letters 39: 3877-3880. the Liu, Z. H., N. Liu&Y. L. Zhou. Acta development of blepharoplast and the Botanica Sinica 41: 1160-1163. origin of multilayered structure in the sperm of Lygodium japonicum. Prothallic development of Lygodium Mendoza, A., B. Perez-Garcia & R. heterodoxum and Lygodium venustum Riba. Revista de Biologia Tropical 47: (Schizaeaceae). 2000 Sorophores of 83-92. Lygodium Sw. Gandolfo, M. A., K. C. Nixon, W. L. 202 (Schizaeaceae) from the Late Crepet Cretaceous of New Jersey. & G. E. Ratcliffe. Plant Systematics & Evolution 221: 113-123. Phenology of the climbing leaf of Punetha, N. Phytomorphology 50: 75Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. 85. (Schizaeaceae). 2001 Impacts of Lygodium the introduced microphyllum, on fern, Brandt, L. A. & D. W. Black. Florida the Scientist 64: 191-196. native vegetation of tree islands in the Arthur R. Marshall Loxahatchee National Wildlife Refuge. A new species of Lygodium Dixit, R. D., J. B. Bhandari & R. (Lygodiaceae) from North Andamans, Mukhopadhyay. India. The Nordic Journal of Botany 21: 427-430. effects of storage on the Griggs, J. K., N. P. Manandhar, G. H. biological activity of medicinal plants N. Towers & R. S. L. Taylor. Journal of from Nepal. Isolation Ethnopharmacology 77: 247-252. and identification of Kurumatani, M., K. Yagi, T. Murata, antheridiogens in the ferns, Lygodium M. Tezuka, microphyllum and L. reticulatum. Nishiyama Bioscience. L. N. Mander, & Yamane. Biotechnology M. H. & Biochemistry 65: 2311-2314. The reproductive Lygodium biology microphyllum and of Lott, M. S. Florida Atlantic University, L. Boca Raton, Florida. 34 pp. [Masters japonicum, two invasive fern species Thesis] in Florida. Dispersal, reproduction and Lott, M. S., J. C. Volin & D. V. Owen. 203 physiological ecology of two invasive Ecological Society of America Annual non-indigenous Lygodium fern species microphyllum & Meeting Abstracts 86: 312. and Lygodium japonicum. Pathogenicity assessment of Puccinia Rayachhetry, M. B., R. W. Pemberton, lygodii, a potential biological control L. L. Smith & R. Leahy. Plant Disease agent of Lygodium japonicum in 85: 232. Southeastern United States. Occurrence and paleoecology of Rich, F. J., D. M. Johnson & T. V. Marsilea from the Eocene Wasatch Durkin. Palaios 16: 608-613. Formation, Johnson County, Wyoming. Architecture of the sperm cell of Smith, R. L. & K. S. Renzaglia. Lygodium. Transactions of the Illinois State Academy of Science 94(Supplement): 83. 2002 New eriophyoid mites (Acari: Knihinicki, D. K. & J. Boczek. Eriophyoidea) from Australia. International Journal of Acarology 28: 241-249. Comparisons between pre-released Lopez-smith, R. & K. S. Renzaglia. In and swimming sperm Lygodium japonicum. cells of Botany 2002: Botany in the Curriculum, 4-7 August. Abstracts. Botanical Madison, Society of America, Wisconsin (www.2002.botanyconference.org). Anti-androgenic and hair growth Matsuda, H., M. Yamazaki, S. Naruto, promoting activities of Lygodii Spora Y. Asanuma & M. Kubo. Biological & (spore of Lygodium japonicum) I. Pharmaceutical Bulletin 25: 622-626. 204 Active constituents inhibiting testosterone 5alpha-reductase. Lygodium und ander Kletterfarne. Octothrips lygodii sp. Mehltreter, K. Palmengarten 66: 20-23. n. Mound, L. A. Australian Journal of (Thysanoptera: Thripidae) damaging Entomology 41: 216-220 weedy Lygodium ferns in southeastern Asia, with notes on other Thripidae reported from ferns. Some new records and little known Nath, A. & M. K. Bhattacharya. Indian species of pteridophytes from Barak Fern Journal 19: 97-106. Valley, Assam, India. Lygodium altum (C.B. Clarke) Singh, S. Journal of Economic & v.A.v.R.: A fern new to Orissa. Taxonomic Botany 26: 537-539. The distribution of non-indigenous Stewart, invasive Old World climbing fern, University, J. E. Florida Atlantic Boca Raton. 52 pp. Lygodium microphyllum, in southern [Thesis]. Florida: the relationship to abiotic and biotic variables. 2003 Exploratory surveys in Australia and Goolsby, J. A., A. D. Wright & R. W. Asia for natural enemies of Old Pemberton. Biological Control 28: 33World climbing fern, Lygodium 46. microphyllum: Lygodiaceae. First report of the pathogenicity of Jones, K. A., M. B. Rayamajhi, P. D. Colletotrichum invasive gloeosporioides ferns, on Pratt & T. K. Van. Plant Disease 87: Lygodium 101. microphyllum and L. japonicum, in Florida. 205 The relationship between the sperm Lopez-Smith, R. & K. Renzaglia. In cell architecture and the female sex Botany 2003: Aquatic and Wetland organ of two leptosporangiate ferns. Plants: Wet and Wild, 26-31 July 2003. Botanical Society of America, Mobile, Alabama. The growth and physiological ecology Lott, M. A. & J. C. Volin. Ecological of two invasive non-indigenous fern Society of America Annual Meeting species, Lygodium microphyllum and Abstracts 88: 211. L. japonicum. The reproductive biology of the Lott, M. S., J. C. Volin, R. W. invasive ferns microphyllum and (Schizaeaceae): Lygodium Pemberton & D. F. Austin. 2003. L. japonicum American Journal of Botany 90: 1144- Implications for 1152. invasive potential. Predicting the landscape spread of Muss, J. D., D. V. Owen & J. C. Volin. Lygodium microphyllum in South Ecological Society of America Annual Florida. Meeting Abstracts 88: 247. Northward range extension in Florida Pemberton, R. W. SIDA Contributions of the invasive fern Lygodium to Botany 20: 1759-1761. microphyllum (Lygodiaceae). Gibberellins, antheridiogens and Pour, M. Chemicke Listy 97: 1061- incrustoporins: A personal account of 1069. syntheses of small, highly functionalized molecules. Lygodium. Praptosuwiryo, T. N. Pp. 128-133. In 206 W. P. De Winter & V. B. Amoroso (Eds.). Plant resources of south-east Asia No. 15(2). Cryptogams: Ferns and fern allies. Backhuys Publishers, Leiden. Isolation of the MLS-type flagellar Sakaushi, S., T. Mizutani, S. Miyamura apparatus from the an-1 mutant of & T. Hori. Cytologia (Tokyo) 68: 271fern Lygodium japonicum and its 281. preliminary immunological analysis. Swimming behavior and Sakaushi, S., M. Okoshi, S. Miyamura ultrastructure of sperm of Lygodium & T. Hori. Sexual Plant Reproduction japonicum (Pteridophyta). 16: 113-122. The life history of the invasive fern Volin, J. C., M. J. Lott, J. D. Muss, D. Lygodium microphyllum: From Owen & J. E. Stewart. Ecological reproductive strategy to landscape Society of America Annual Meeting dispersal. 2004 Abstracts 88: 345. Potential distribution of the invasive Goolsby, J. A. Natural Areas Journal old world climbing fern, Lygodium 24: 351–353. microphyllum, in North and South America. Prerelease assessment of impact on Goolsby, J. A., R. Zonneveld & A. biomass production of an invasive Bourne. Environmental Entomology weed, Lygodium microphyllum 33: 997–1002. (Lygodiaceae: Pteridophyta), by a potential biological control agent, Floracarus perrepae (Acariformes: Eriophyidae). Biology of (Lepidoptera: Callopistria Noctuidae): sp a Jesudasan, R. W. A., B. Muthuraj & J. A A. Goolsby. Journal of Applied 207 herbivore of the old world climbing Zoological Researches 15: 43–47. fern, Lygodium microphyllum. Notes on the genus Lygodium Swartz Maideen, H., A. Latiff, A. Bidin, A. (Schizaeaceae) in Malaysia. Damanhuri & R. Jaman. Fern Gazette 17: 53–57. Efficacy of ethyl acetate. extract of a Ragupathy, E., R. W. A. Jesudasan, A. fern, Lygodium microphyllum against Jeyasankar & K. Subramanian. 2004. the Asian army worm, Spodoptera Journal litura (Fabr.). of Applied Zoological Researches 15: 4–8. Species of Lygomusotima new genus Solis, M. A., S. H. Yen & J. H. and Neomusotima (Lepidoptera: Australia and Yoshiyasu Goolsby. Annals of the Entomological Crambidae) southeastern from Society of America 97: 64–76. Asia feeding on Lygodium microphyllum (Schizaeaceae). Thermo sensitivity and regulation of Upadhyay, R. K. & S. K. Panda. activities of superoxide dismutase and Advances in Plant Sciences 17: 705– guaiacol peroxidase by chromium 708. ions in plants. Ethnobotanical studies in Muslim Upho, U., C. Trisonthi & K. Thai communities located around Chayamarit. Chiang Mai Journal of Toh–Daeng peat swamp forest in Science 31: 157–170. Thailand. Predicting rapid invasion of the Volin, J. C., M. S. Lott, J. D. Muss & Florida Everglades by old world D. Owen. Diversity & Distributions 10: climbing microphyllum). fern (Lygodium 439–446. 208 Modeling optimal management Volin, V. C., J. C. Volin, J. D. Muss & strategies to control the invasion of D. Owen. Ecological Society of Lygodium microphyllum over the America Annual Meeting Abstracts 89: Florida landscape. 525. Hungry mite may quell Old World Wood, M. International Pest Control climbing fern. 46: 288–289. Austroinusotima, a new musotimine Yen, S. H., M. A. Solis & J. A. genus (Lepidoptera: crambidae) Goolsby. Annals of the Entomological feeding on old world climbing fern, Society of America 97: 397–410. Lygodium microphyllum (Schizaeaceae). 2005 Antibacterial properties of some Alanis, A.D.; Calzada, F.; Cervantes, plants used in Mexican tradicional J.A.; medicine for the treatment Ceballos, G.M. Journal of of Ethnopharmacology 100:153-157. gastrointestinal disorders. First report of Biopolaris sacchari Elliott, M. L. & M. B. Rayamajhi. Plant causing leaf spot on Lygodium Disease 89: 1244. japonicum and L. microphyllum in Florida. An ultrastructural relationship study between of the the Freeman, T. P., J. A. Goolsby, S. K. mite Ozman & D. R. Nelson. Australian Floracarus perrepae Knihinicki & Journal of Entomology 44: 57–61. Boczek (Acariformes: Eriophyidae) and the fern Lygodium microphyllum (Lygodiaceae). Continental comparisons of the Goolsby, J. A., R. W. A. Jesudasan, H. interaction between climate and the Jourdan, B. Muthuraj, A. S. Bourne & herbivorous mite, Floracarus R. W. Pemberton. Florida Entomologist 209 perrepae (Acari : Eriophyidae). 88: 129–134. Host–range and cold temperature Goolsby, J. A., R. Zonneveld, J. R. tolerance of Knihinicki Floracarus & Boczek perrepae Makinson & R. W. Pemberton. (Acari: Australian Journal of Entomology 44: Eriophyidae), a potential biological– 321–330. control agent of microphyllum Lygodium (Pteridophyta: Lygodiaceae). Lygodium japonicum fern Konno, H., T. Nakato, S. Nakashima & accumulates copper in the cell wall K. Katoh. Journal of Experimental pectin. Botany 56: 1923–1931. Helpful and harmful ferns. Moran, R. In Abstracts of Botany 2005. Botanical Society of America (www.2005.botanyconference.org), Austin Texas. The use of conceptual ecological Ogden, J. C., S. M. Davis, K. J. Jacobs, models to guide ecosystem restoration T. Barnes & H. E. Fling. Wetlands 25: in South Florida. Biology and 795–809. phenology of the Ozman, S. K. & J. A. Goolsby. 2005. eriophyid mite, Floracarus perrepae, Experimental & Applied Acarology 35: on its native host in Australia, Old 197–213. World climbing fern, Lygodium microphyllum. First report of infection of Lygodium Rayamajhi, M. B., R. W. Pemberton, T. microphyllum by Puccinia lygodii, a K. Van & P. D. Pratt. 2005. Plant potential biocontrol agent of an Disease 89: 110. invasive fern in Florida. 210 Siamusotima aranea, a new stem– Solis, M. A., U. Chattrukul, A. Winotai, boring musotimine (Lepidoptera: S. Rimbut, A. Thagong, J. H. Goolsby, Crambidae) from Thailand feeding on S. H. Yen, R. Pemberton & T. Wright. Lygodium flexuosum (Schizaeaceae). Annals of the Entomological Society of America 98: 887–895. Architectural mutation and leaf form, White, D. A. Journal of Theoretical for the palmate series. Biology 235: 289–301. Extracting Flavone from Lygodium Bi yong-guang, Qiu Tai-qiu, Yan Jie. Japonicum (Thunb.) Sw. Assisted by Light Bifrequency Ultrasound. Industry and Chemical Engineering Institute, South China University of Technology, Guang zhou510640, China. 2006 Declining hydraulic efficiency as Brodribb, T. J. & N. M. Holbrook. transpiring leaves desiccate: two types Plant Cell & Environment 29: 2205of response. 2215. Applying landscape-scale modeling to Duke-Sylvester, S. M. University of Everglades restoration. Tennessee, Knoxville [Dissertation; Tennessee. Lygodium microphyllum] Matching the origin of an invasive Goolsby, J. A., P. J. De Barro, J. R. weed for selection of a herbivore Makinson, R. W. Pemberton, D. M. haplotype for a biological control Hartley & D. R. Frohlich. Molecular programme. Ecology 15: 287-297. Maximising the contribution native-range studies towards of Goolsby, J. A., R. D. van Klinken & W. the A. Palmer. Australian identification and prioritisation of Entomology 45: 276-286. Journal of 211 weed biocontrol agents. Natural colonization of plant species Hazarika, P., N. C. Talukdar & Y. P. on coal mine spoils at Tikak Colliery, Singh. Tropical Ecology 47: 37-46. Assam. Survey of control measures on old Hutchinson, J. T. & K. A. Langeland. world climbing fern (Lygodium Florida Scientist 69: 217-223. microphyllum) in Southern Florida. Evaluation of the invasiveness of non- Hutchinson, J. T. & E. S. Menges. native plants at Archbold Biological Florida Scientist 69: 62-68. Station. Paralygodium (Schizaeaceae) from Karafit, S. J. & R. A. Stockey. the Upper Cretaceous (Coniacian) of Abstracts of Botany 2006. Botanical Vancouver Island, Canada. Society of America (www.2006.botanyconference.org), Chico California. Noteworthy plants reported from the Lamont, E. E. & S. M. Young. Journal Torrey Range - 2004 and 2005. of the Botanical Society 133: 648-659. Evaluation of metsulfuron methyl for Langeland, K. A. & M. L. Link. Florida selective control of Lygodium Scientist 69: 149-156. microphyllum growing in association with Panicum hemitomon and Cladium jamaicense. Leaf phenology of the climbing fern Mehltreter, K. American Fern Journal Lygodium venustum in a 96: 21-30. semideciduous lowland forest on the Gulf of Mexico. 212 Ferns represent an untapped Rathinasabapathi, B. New Phytologist biodiversity for improving crops for 172: 385-390. environmental stress tolerance. Paralygodium nov. vancouverensis (Schizaeaceae), sp. Trivett, M. L., R. A. Stockey, G. W. additional Rothwell & G. Beard. International evidence for filicalean diversity in the Journal of Plant Sciences 167: 657-681. Paleogene of North America. Hurricane impacts to tree islands in Ugarte, C. A., L. A. Brandt, S. Melvin, Arthur R. Marshall Loxahatchee F. National Wildlife Refuge, Florida. J. Mazzotti & K. G. Rice. Southeastern Naturalist 5: 737-746. Antisecretory activity of plants used Velázquez Claudia; Calzada Fernando; to treat gastrointestinal disorders in Torres, Mexico. Javier; Ceballos González Guillermo. Felipe; Journal of Ethnopharmacology 103 (2006) 66–70. Protective effect of Lygodium Wills, P. J. & V. V. Asha. Journal of flexuosum (L.) Sw. (Lygodiaceae) Ethnopharmacology 108: 116-123. against D-galactosamine induced liver injury in rats. Protective effect of Lygodium Wills, P. J. & V. V. Asha. Journal of flexuosum (L.) Sw. extract against Ethnopharmacology 108: 320-326. carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rat. Antiangiogenic effect of Lygodium Wills, P. J., V. Suresh, M. Arun & V. flexuosum against nitrosodiethylamine-induced hepatotoxicity in rats. N- V. Asha. Chemico-Biological Interactions 164: 25-38. 213 The spatial pattern and dispersion of Wu, Y., K. Rutchey, N. Wang & J. Lygodium microphyllum in the Godin. 2006. Biological Invasions 8: Everglades wetland ecosystem. 1483-1493. Chemical constituents from Lygodium Zhang, L. H., Z. Q. Yin, C. L. Fan, W. japonicum. C. Ye & S. X. Zhao. Chinese Journal of Natural Medicines 4: 154-155. Flavonoids from Lygodium Zhang, L. H., Z. Q. Yin & W. C. Ye. japonicum. Biochemical Systematics & Ecology 34: 885-886. 2007 Mating biology of Austromusotima Boughton, A. J., J. Wu & R. W. camptozonale (Lepidoptera: Pemberton. 2007. Florida Entomologist Crambidae), a potential biological 90: 509-517. control agent of Old World climbing fern, Lygodium microphyllum (Schizaeaceae). Ethnopharmacological investigation Bourbonnais-Spear, N., R. Awad, Z. of plants used to treat susto, a folk Merali, P. Maquin, V. Cal & J. T. illness. Arnason. Journal of Ethnopharmacology 109: 380-387. The influences of closing for Cai, D.X.; Lu, L.H.; Jia, H.Y.; He, R. afforestation on vegetation diversity M. Forest Research 20: 319-327. restoration under Chinese fir plantation. Old World Climbing Fern (Lygodium Call, E. M., L. A. Brandt & D. L. microphyllum) spore germination in Deangelis. Florida Scientist 70: 55-61. natural substrates. Effect of Mexican medicinal plant Calzada, F., L. Yepez-Mulia & A. 214 used to treat trichomoniasis on Tapia-Contreras. Trichomonas vaginalis trophozoites. Journal of Ethnopharmacology 113: 248-251. Myrothecium verrucaria - a potential Clarke, T. C., K. G. Shetty, K. biological control agent for the Jayachandran & M. R. Norland. invasive 'old world climbing fern' BioControl (Dordrecht) 52: 399-411. (Lygodium microphyllum). Effects of hydrology and applied Gandiaga, S. gibberellic acid and paclobutrazol on University, Boca Florida Raton Atlantic Florida. the growth of the invasive exotic [Thesis]. Lygodium microphyllum (Old World climbing fern). The power of partnerships: Landscape Higgins, A., K. Serbesoff-King, M. scale conservation through King & K. O'Reilly-Doyle. Natural public/private collaboration. Areas Journal 27: 236-250. The potential for herbicide resistance Hutchinson, J. T., G. E. MacDonald & in non-native plants in Florida's K. A. Langeland. Natural Areas Journal natural areas. A new 27: 258-263. report of Lygodium Misra, D. R. & P. C. Misra. Indian Fern microphyllum (Cav.) R. Br. from Journal 24: 151-155. Kathmandu, Nepal. Florida's invasive plant research: Schmitz, D. C. Natural Areas Journal Historical perspective and the present 27: 251-253. research program. Studies on the development embryo in (Thunb.) Sw. Lygodium of Shao, W., X. C. Zhang & B. D. Liu. japonicum Bulletin of Botanical Research 27: 141144. 215 Protective mechanism of Lygodium Wills, P. J. & V. V. Asha. Chemicoflexuosum extract in treating and Biological Interactions 165: 76-85. preventing carbon tetrachloride induced hepatic fibrosis in rats. A new phenolic glycoside from the Ye, W., C. Fan, L. Zhang, Y. Zhiqi & roots of Lygodium japonicum. Isolation, S. Zhao. Fitoterapia 78: 600-601 Purification Antimicrobial Polysaccharides Activities from and SU, Y. Journal of Fujian Normal of the University (Natural Science); 2005-04. Lygodium japonicum. 2008 Neomusotima (Lepidoptera: fuscolinealis Bennett, C. A. & R. W. Pemberton. Pryalidae) is an Florida Entomologist 91: 26-29. unsuitable biological control agent of Lygodium japonicum. Efforts to establish a foliage-feeding Boughton, A. J. & R. W. Pemberton. moth, Austromusotima camptozonale, Biological Control 47: 28-36. against Lygodium microphyllum in Florida, considered in the light of a retrospective review of establishment success of weed biocontrol agents belonging to different arthropod taxa. Internal coordination between Brodribb, T. J. & G. J. Jordan. Plant hydraulics and stomatal control in Cell and Environment 311: 1557-1564. leaves. Lower temperature during the dark Elliott, M. L. & M. B. Rayamajhi. cycle affects disease development on Biological Control 45: 56-63. 216 Lygodium microphyllum (Old World climbing fern) by Bipolaris sacchari. Lygodium palmatum. Gottlieb, J. E. Hardy Fern Foundation Quarterly 18: 4-7. Control of Old World climbing fern Hutchinson, J. T. & K. A. Langeland. (Lygodium microphyllum) with Florida Scientist 71: 201-207. increased rates of glyphosate and metsulfuron methyl under greenhouse conditions. First report of Glomerella cingulata Ireland, K. B., N. A. Haji, M. Noor, E. (Colletotrichum gloeosporioides) A. B. Aitken, S. Schmidt & J. C. Volin. causing anthracnose and tip dieback Plant Disease: an International Journal of Lygodium microphyllum and L. of Applied Plant Pathology 92: 1369. japonicum in Australia. Paralygodium (Schizaeaceae) meckertii from the sp nov Karafit, S. J. & R. A. Stockey. Review Upper of Palaeobotany & Palynology 149-4: Cretaceous (Coniacian) of Vancouver 163-173. Island, British Columbia, Canada. A molecular phylogeny of the genus Madeira, P. T., R. W. Pemberton & T. Lygodium (Schizaeaceae) with special D. Center. Biological Control 45: 308reference to the biological control and 318. host range testing of Lygodium microphyllum. 2009 Ethnopharmacology of Q'eqchi' Maya Awad, R., F. Ahmed, N. Bourbonnaisantiepileptic and anxiolytic plants: Spear, M. Mullally, C. A. Ta, A. Tang, Effects on the GABAergic system. Z. Merali, P. Maquin, F. Caal, V. Cal, L. Poveda, P. Sanchez Vindas, V. L. 217 Trudeau & J. T. Arnason. Journal of Ethnopharmacology 125: 257-264. Phytochemical study on some ferns of Bhattacharya, N. and Halder, S.. Indian semi-arid habitats of District Fern Journal 26: 37-45. Burdwan, West Bengal. Laboratory host range testing of Boughton, A. J., C. A. Bennett, J. A. Neomusotima (Lepidoptera: conspurcatalis Goolsby Crambidae) - and Pemberton, R. W. a Biocontrol Science and Technology 19: potential biological control agent of 369-390. the invasive climbing weed, fern, Old World Lygodium microphyllum (Lygodiaceae). Establishment of an imported natural Boughton, A. J. & R. W. Pemberton. enemy, Neomusotima conspurcatalis Biocontrol Science and Technology 19: (Lepidoptera: Crambidae) against an 769-772. invasive weed, Old World climbing fern, Lygodium microphyllum, in Florida. Structure and development of Dai, X. L., J. G. Cao, R. L. Zhu & Q. sporoderm of Lygodium japonicum X. Wang. Xibei Zhiwu Xuebao 29: (Thunb.) Sw. (Lygodiaceae). 1328-1334. Effects of hydrology on the growth Gandiaga, S., J. C. Volin, E. L. Kruger and physiology of an invasive exotic, & K. Kitajima. Weed Research Lygodium microphyllum (Old World (Oxford) 49: 283-290. climbing fern). Bailing out creatures great and small. Ghazoul, J. Science (Washington D C) 323: 460. 218 Old world climbing fern (Lygodium Lynch, R. L., H. Chen, L. A. Brandt & microphyllum) invasion in hurricane F. J. Mazzotti. Natural Areas Journal caused treefalls. 29: 210-215. Traditional uses medicines among Katarniyaghat of some folk Maliya, S. D. Journal of Economic and Tharus of Taxonomic Botany 33 Suppl. S: 220- Wildlife sanctuary 223. region of district Bahraich, Uttar Pradesh. Hydrologic restoration of wetlands on Toth, L. A. Florida Scientist 72: 103the Kissimmee River floodplain: 120. Complementarity of an herbicide treatment of the exotic vine Lygodium microphyllum. Chemopreventive action of Lygodium Wills, P. J. And Asha, V. V.. Journal of flexuosum extract in human hepatoma Ethnopharmacology 122: 294-303. PLC/PRF/5 and Hep 3B cells. Study on GC fingerprint of volatile Xu, Q. Y., Ouyang Y. Z., Tang S. Y. components from Lygodium And Che, S. L. Jishou Daxue Xuebao japonicum. (Ziran Kexue Ban) 30: 78-81. Tiny moth tackles old world climbing Yao, fern. S.; Wood M.. Agricultural Research 57: 6-7. Study on the Scavenging Activities of Bi Y. et al. Journal of Extracts from Lygodium japonicum Agricultural Sciences. 2009-19. (Thunb) Sw.with Different Solvents to Free Radicals. Anhui 219 Influence of Flavonoid Extracts from Che; S.; Ouyang, Y.; Tang, S.; Xu, Q. Lygodium Japonicum on Antioxidant Journal of Xiangnan University. 2009Stability of Peanut Oil. Ultrasound-assisted 05. Extraction of Ding, L; Sun, J.; Zhou, S. Modern Food Flavonoids from Lygodium and Its Science and Technology. 2009-10. Bacteriostasis Properties. 2010 Effect of plants used in Mexico to Calzada, F.; Arista, R.; Pérez, H. treat gastrointestinal disorders on Journal of Ethnopharmacology 128:49– charcoal - gum acacia - induced 51. hyperperistalsis in rats. Physiological characteristics of Hutchinson, J.T., ph.d., University of herbicides and management of Old Florida, 2010, 158 pages World climbing fern (Lygodium microphyllum). Study on antioxidant activity of Wang, T.; Chen, J.; Peng, Z.; Wu, Q.; flavones from Lygodium japonicum in Chen, P. Science and Technology of vitro. Food Industry. 2010-03. Review of Two Non-Native, Invasive Hutchinson, J.T.; Langeland, K.A. Climbing Ferns (Lygodium japonicum American Fern Journal 100(1):57-66. 2. and L. microphyllum), Sympatric Records and Additional Distribution Records from Florida. Stantonia pallida (Ashmead) Kula, R.R.; Boughton, A.J.; Pemberton, (Hymenoptera: Braconidae) reared R. W.Proceedings of the Entomological from Neomusotima conspurcatalis Society of Washington. 112(1): 61-68. Warren (Lepidoptera: Crambidae), a 220 classical biological control agent of Lygodium microphyllum (Cav.) R. Br. (Polypodiales: Lygodiaceae). Absorption and Glyphosate, Translocation Metsulfuron, of Hutchinson, J.T.; Langeland, K.A., and Macdonald, G.E.; Querns, R. Weed Triclopyr in Old World Climbing Science, 58 (2): 118-125. Fern (Lygodium microphyllum). Extraction Optimization of Water- Wu Y., Zheng X., Bu G., Zeng Z. Food soluble Polysaccharides from the Science. 2010-18. Shoot of Lygodium japonicum Using Response Surface Methodology. A New Observation on Several Guo Z., Liu B, Zhang X. Bulletin of Morphological Characteristics of Botanical Research. 2010-1. Gametophyte in Lygodium japonicum. Japanese Climbing Fern (Lygodium Minogue, P.J.; Bohn, K.K.; Osiecka, japonicum) Management in Florida's A.; Lauer, D.K. Invasive Plant Science Apalachicola Bottomland Hardwood and Management, 3 (3): 246-252. Forests. Colonization, Spread, and Growth Fujisaki, I.; Brandt, L.A.; Chen, H.; of Lygodium microphyllum on Tree Mazzotti, F.J. Invasive Plant Science Islands in a Wetland in Florida. and Management 3(4):412-420. New naphthoquinone from the root Chen, L.; Zhang, G.; He, J.; Guan, J.; of Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. Pan, C.; Mi, W.; Wang, Q. Journal of Natural Medicines, 64(1):114-116. Does release from natural Volin, J.C. ; Kruger, E.L. ; Volin, V. 221 belowground enemies help explain C.; the invasiveness Tobin, M. F. and Kitajima, K. of Lygodium Plant Ecology, 208 (2):, 223-234. microphyllum? A cross-continental comparison. Chemical constituents of root from Chen, L.; Dong, S.; Pan, C.; Mi,W.; He, Lygodium japonicum (Thunb.) Sw. J.; Zhang, G. Journal of Shenyang Pharmaceutical University. 2010-4. Study on Separation of Flavonoids Yuzhu, O.; Shaolin, C.; Weitao, H. from Lygodium japonicum with Chinese Wild Plant Resources. 2010- Macroporous Resin. 2011 06. Fenologia e sobrevivência de três Farias, R.P.; Xavier, S. R.S. Biotemas, populações de samambaias em 24 (2): 13-20. remanescente de Floresta Atlântica Nordestina, Paraíba, Brasil Ultrasonic-assisted Extraction of Zheng, N.; Zhang, S.; Wang, T.; Lin, J. Total Polyphenol from Seeds of Chinese Syzygium jambos by of of Experimental Response Traditional Medical Formulae. 2011- Surface Methodology. Enhancement Journal 17. antioxidant and Gou, J.; Zou, Y.; Ahn, J. Food Science antimicrobial activities of Dianthus and Biotechnology. 20 (1): 283-287. superbus, Polygonum aviculare, Sophora flavescens, and Lygodium japonicum by pressure-assisted water extraction. 222 Control of Invasive Japanese Bohn, K.K.; Minogue, P.J.; Pieterson, Climbing Fern (Lygodium japonicum) E.C. Ecological Restoration. 29 and Response of Native Ground (4):346-356. Cover During Restoration of a Disturbed Longleaf Pine Ecosystem. Laboratory hostrange Austromusotim of Boughton, A.J.; Buckingham, G.R.; acamptozonale Bennett, C.A.; (Lepidoptera: Crambidae), a potential Goolsby, J.A.; Zonneveld, R.; Pemberton, R.W. ; biological control agent of Old World Center, T. D. Biocontrol Science and climbing fern, Lygodium Technology. 21 (6): 643-676. microphyllum (Lygodiaceae). Impact of climatic factors on leaf roll- Muthuraj, inducing mite, perrepae (Acari: B. ;Jesudasan, R.W.A. Floracarus International Journal of Acarology. 37 Eriophyidae) (4): 325-330. feeding on the Old World climbing fern, Lygodium microphyllum (Pteridophyta: Lygodiaceae). Identification and Research Ad vance on Pharmaceutical Science of Zhao P et al. Journal of Anhui Lygodium Sw. Plants. Agricultural Sciences. 2011-14. Experimental Study of Lygodium's Chen L. China Pharmaceuticals. 2011Liposoluble Constituent for Treating 4. Scald in Mouse. Invasion of a Southeastern Pine Leichty, E.R.; Carmichael, B.J.; Platt, Savanna by Japanese Climbing Fern. W.J. Castanea 76(3):293-299. Studies on antimicrobial activities of Mandal, A.; Mondal, A.K. African 223 some selected ferns and lycophytes in Journal of Plant Science Vol. 5(7), pp. Eastern India with special emphasis 412-420. on ethno-medicinal uses 224 ANEXOS 225 ANEXO A – OUTRAS PRODUÇÕES CIENTÍFICAS VINCULADAS AO PROJETO Resumos publicados em anais de congressos BRAGA, M.F.B.M.; SOUZA, T.M.; SANTOS, K. K.A.; GUEDES, G.M.M ; SOUZA, E.S.S; COSTAS, J.G.M.; MENEZES, I.R.A ; SARAIVA, A.A.F; COUTINHO, H.D.M. Potentiation of aminoglycosides antibiotic activity by Lygodium venustum (SW) against mrsa. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM 2011. Foz do Iguaçu. 2011. BRAGA, M.F.B.M.; SOUZA, T.M.; SANTOS, K.K.A. ; GUEDES,G.M.M ; TINTINO,S.R ; TAVARES.C.C.A ; LEITE, N.F. ; COSTAS, J.G.M. ; SARAIVA, A.A.F ; COUTINHO, H. D.M . In vitro interference of Lygodium venustum in the Escherichia coli resistance to aminoglycosides. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM 2011, 2011, Foz do Iguaçu. 2011. BUENO, D.C.; NOGARA, P.A.I.; SARAIVA, R.A.; BRAGA, M.F.B.M.; SOUZA, T.M.S.; BOLIGON, A.A.; ATHAYDE, M.L.; SARAIVA, A.A.F.; ROCHA, J.B.T. “Identificação de polifenóis e atividade antioxidante de extratos e frações das folhas de Pityrogramma calomelanos L. (Pteridaceae) e Lygodium venustum SW. (Schizaeaceae). III SIMPÓSIO DE BIODIVERSIDADE – Filosofia da Ciência e a Prática Científica. Santa Maria, RS, 2011. 226 ANEXO B – PRODUÇÕES CIENTÍFICAS NÃO VINCULADAS AO PROJETO Resumos publicados em anais de congressos SOUZA, T.M.; BRAGA, M.F.B.M.; COUTINHO, H.D.M.; SARAIVA, A.A.F ; MENEZES, I.R.A.; COSTA, J.G.M.; TINTINO,S.R. Enhancement of antibiotic activity of aminoglycosides by natural products from Pityrogramma calomelanos against Escherichia coli. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do Iguaçu 2011. 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do Iguaçu. 2011. SOUZA, T.M.; BRAGA, M.F.B.M.; COUTINHO, H.D.M.; SARAIVA, A.A.F.; MENEZES, I.R. A.; COSTA, J.G.M.; SOBRAL-SOUZA, C.E, GUEDES, G.M.M Modifying-antibiotic activity of natural products from Pityrogramma calomelanos associated with aminoglycosides against MRSA. In: 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do Iguaçu. 2011. 26º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA CBM. Foz do Iguaçu. 2011. TINTINO, S.R ; SANTOS, K.K.A. ; BRAGA, M.F.B.M. ; VEGA, C. ; COUTINHO, H.D.M Atividade citotóxica e tripanocida de extrato etanólico e fraçoes de Piper arboreum. In: XX ITALO-LATINAMERICAN CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011, Fortaleza. XX ITALO-LATINAMERICAN CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011 BARRETO, H.M.; LIMA.S.I. ; BRAGA, M. F. B. M.; TAVARES, C.C.A ; TINTINO,S.R.; COUTINHO, H.D.M. Modulation of antibiotic resistance on multirresistant bacterial strains by essential oil of Rosimarinus officinales L.. In: XX ITALO-LATINAMERICAN CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011, Fortaleza. XX ITALO-LATINAMERICAN CONGRESS OF ETHNOMEDICINE, 2011. 227 Artigos publicados HENRIQUE D.M. COUTINHO, EDINARDO F.F. MATIAS, KARLA K.A. SANTOS, FRANCISCO A.V. SANTOS, MARIA FLAVIANA B. MORAIS-BRAGA, TEÓGENES M. SOUZA, JACQUELINE COSMO ANDRADE, CELESTINA E.S. SOUZA, SAULO R. TINTINO, GLÁUCIA M.M. GUEDES, VIVYANNE S. FALCÃO-SILVA, JOSÉ P. SIQUEIRA-JÚNIOR, JOSÉ G.M. COSTA. Modulation of the norfloxacin resistance in Staphylococcus aureus by Croton campestris A. and Ocimum gratissimum L. Biomédica 2011, 31: 608-612. SANTOS, KARLA K.A. DOS; MATIAS, EDINARDO F.F.; TINTINO, SAULO R.; SOUZA, CELESTINA E.S.; BRAGA, MARIA F.B.M.; GUEDES, GLÁUCIA M.M.; ROLÓN, MIRIAM; VEGA, CELESTE; DE ARIAS, ANTONIETA ROJAS; COSTA, JOSÉ G.M.; MENEZES, IRWIN A.; COUTINHO, HENRIQUE D.M.. Cytotoxic, Trypanocidal, and Antifungal Activities of Eugenia jambolana L. Journal of Medicinal Food, v. 15, p. 6670, 2012. SANTOS, ISRAEL J.M.; MATIAS, EDINARDO F.F.; SANTOS, KARLA K.A.; BRAGA, MARIA F.B.M.; ANDRADE, JACQUELINE C.; SOUZA, TEÓGENES M.; SANTOS, FRANCISCO A.V.; SOUSA, ANA CARLA A.; COSTA, JOSÉ G.M.; MENEZES, IRWIN R.A.; ALVES, RÔMULO R.N.; ALMEIDA, WALTECIO O.; COUTINHO, HENRIQUE D.M.. Evaluation of the Antimicrobial Activity of the Decoction of Tropidurus hispidus (Spix, 1825) and Tropidurus semitaeniatus (Spix, 1825) Used by the Traditional Medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (Print), v. 2012, p. 1-6, 2012. SANTOS, K.K.A.; MATIAS, E.F.F ; SOUZA, E.S.S ; TINTINO, S.R ; MORAIS-BRAGA, M.F.B.; GUEDES, G.M.M ; ROLÓN M.; VEGA C.; ROJAS DE ARIAS A ; COSTAS, J.G.M.; MENEZES, IRWIN .R.A; COUTINHO, H.D.M. Trypanocide, cytotoxic, and antifungal activities of Momordica charantia. Pharmaceutical Biology, 2012; 50(2): 162–166. SANTOS, K.K.A.; MATIAS,E.F.F; SOUZA,E.S.S; TINTINO,S.R; MORAIS-BRAGA, M.F.B.; GUEDES, G.M.M.; NOGUEIRA, L.F.; MORAIS, E.C.; COSTA, J.G.M.; MENEZES, I.R.A.; COUTINHO, H.D.M.. Anti-Candida activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia. Journal of Medicinal Food, 2011. 228 Artigos aceitos para publicação GUERRA, F.Q.S ; MENDES, J.M. ; SOUSA, J.P ; BRAGA, M. F. B. M.; SANTOS, B.H.C.; COUTINHO, H.D.M; LIMA, E. O. . Increasing of the Antibiotic Activity against a Multidrug Resistant Acinetobacter spp by essential oil of Citrus limon and Cinnamomum zeylanicum. Natural Product Research (Print), 2012. ARARUNA, M.K.A.; MORAIS-BRAGA, M.F.B.; SOUZA, T.M.; BRITO, S.A.; SANTOS, K.K.A.; Leite, T.R.; COSTAS, J.G.M.; COUTINHO, H.D.M . Evaluation of antibiotic and antibiotic modifying activity of pilocarpine and rutin. Indian Journal of Medical Research, 2011. MATIAS, E.F.F ; SANTOS.F.V.A ; SOUZA,E.S.S ; SANTOS, K. K. A. ; TINTINO,S.R ; MORAIS BRAGA, M.F.B. ; ALMEIDA, T. S. ; COSTA, J. G. M. ; MENEZES, I..R.A ; COUTINHO, H. D. M . Screening the in vitro modulation of antibiotic activity of the extracts and Fractions of Ocimum gratissimum L. Afr J Microbiol RES, 2011. KARLA K.A. SANTOS, EDINARDO F.F. MATIAS, CELESTINA E. SOBRAL-SOUZA, SAULO R. TINTINO, MARIA F.B. MORAIS-BRAGA, GLAUCIA M.M. GUEDES, MIRIAM ROLÓN, CELESTE VEGA, ANTONIETA ROJAS DE ARIAS, JOSÉ G.M. COSTA, IRWIN R.A. MENEZES, HENRIQUE D.M. COUTINHO. Evaluation of the antiTrypanosoma and anti-Leishmania activity of Mentha arvensis and Turnera ulmifolia. Boletin Latino Americano de PLantas Medicinales Y aromáticas, 2012. SOUZA, T. M. ; MORAIS-BRAGA, M.F.B. ; COSTAS, J.G.M. ; SARAIVA, A.A.F ; COUTINHO, H.D.M. Enhancement of antimicrobial activity of antibiotics and antifungals by the use of natural products from Pityrogramma calomelanos (L.). Archives Of Biological Sciences, 2012.
Documentos relacionados
Potencial alelopatico de espacies de Pteridaceae
Pteridaceae, in concentrations of 250, 500 and 1,000mg.L-1, were evaluated using germination and growth bioassays under laboratory conditions, to verify the potential for allelopathic activity agai...
Leia mais