Curso em Maio de 2006

Introdução
Esterilizar é destruir ou remover todas as formas de vida
microbiana capazes de desenvolverem-se no ambiente
considerado; através de processos físicos e/ou químicos.
Esterilidade ou nível de segurança é a incapacidade de
desenvolvimento das formas sobreviventes ao processo de
esterilização, durante a conservação e utilização de um produto.
A manutenção do nível de esterilidade conferido a um produto garante
o prolongamento da vida útil de prateleira e depende das operações
pré-esterilização, de esterilização e pós-esterilização.
Os métodos de esterilização permitem assegurar níveis de
esterilidade compatíveis às características exigidas em produtos
farmacêuticos, médico-hospitalares e alimentícios. O método escolhido
depende da natureza e da carga microbiana inicialmente presente no
item considerado. O calor, a filtração, a radiação e o óxido de etileno
podem ser citados como agentes esterilizantes.
Autoclavação
Calor úmido saturado sob pressão
Método Overkill
nível de segurança > 10
-6
INDICADORES BIOLÓGICOS
Portaria 500 e ISO 11134: 1994 (E)
Bacillus atrophaeus
Bacillus coagulans
Clostridium sporogenes
Bacillus stearothermophilus
Definição
INDICADOR BIOLÓGICO consiste de
uma unidade contendo um tipo específico
de microrganismo, de concentração
conhecida, resistente a um determinado
agente esterilizante, que obedece a uma
taxa de morte previsível quando exposto a
determinados parâmetros físicos e/ou
químicos.
Usos
Indicadores Biológicos (IB) são utilizados
para:
• assegurar o nível de esterilidade atingido no
processo;
• monitorar ciclos de autoclavação já
estabelecidos; e
• a revalidação períodica dos mesmos
processos.
As unidades de IB devem ser posicionadas em locais
ce menor acesso ao agente esterilizante (calor úmido).
Indicadores Biológicos (IB)
• A escolha do IB e a determinação dos parâmetros de
autoclavação são funções da natureza química da
embalagem que acondiciona SPGV.
• Esporos de Bacillus stearothermophilus (Geobacillus
stearothermophilus) e de Bacillus atrophaeus em suspensão ou
veiculados em carreadores específicos (fitas) são considerados
convenientes IB na autoclavação de SPGV.
• Esporos de B. atrophaeus ATCC 9372 são utilizados
como IB de SPGV em frascos de polietileno, para as
operações de autoclavação terminal, às temperaturas
entre 94°C e 104°C;
• Esporos de B. stearothermophilus ATCC 7953 são
utilizados como IB de SPGV em bolsas de polipropileno,
para processos a 121 ºC.
Crescimento de esporos de B. subtilis
10
Log UFC
8
6
Total 25C
4
Total 35C
2
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tempo (h)
Crescimento e esporulação
Total a 25C
Esporos a 25C
Total a 33C
10
Esporos a 33C
Log UFC
8
6
4
2
0
-2 0
5
10
15
20
25
30
Tempo (h)
35
40
45
50
55
Esporulação
Cada esporo se origina de um única célula. Os gêneros Bacillus e
Clostridium são caracterizados, em parte, pela produção de esporos.
Através de métodos de coloração, o
esporo em formação, refringente ao
microscópio, é observado no interior
da célula de origem. Com o tempo,
os restos celulares dispersam-se,
sendo o esporo liberado.
Esporos de Bacillus atrophaeus
Esporulação – Esquema de Formação do Esporo
Parede Celular
Membrana Plasmática
DNA
Septo
Duas Membranas
Pré-esporo
Córtex
Capa do Esporo
Esporo Livre
Ativação
Ativação é um tratamento que resulta em um
esporo que está pronto para a germinação,
mas que ainda retém a maior parte das
propriedades de esporo.
Representa,
portanto,
um
processo
responsável pela quebra da dormência nos
esporos.
Ativação
Germinação
A estrutura do esporo contém informação genética
mínima associada a elementos citoplasmáticos
necessários à germinação (geração de uma célula
vegetativa), crescimento e multiplicação, quando as
condições do ambiente são favoráveis novamente.
Quando os esporos são transferidos para um
meio e um ambiente favoráveis ao
crescimento, ocorre a germinação, rompendose a parede do esporo; à medida que o esporo
desenvolve uma nova célula vegetativa, a
parede desprende-se.
EXPOSIÇÃO AO CALOR ÚMIDO
VALOR
D
(Tempo de Redução Decimal)
Padrão de Morte Microbiana ou Tempo
de Redução Decimal (Valor D)
A palavra "morte", tal como é usada em
Microbiologia, é definida como a perda irreversível da
capacidade de reprodução. Os microrganismos viáveis
são capazes de se multiplicar, enquanto os germes
mortos não se reproduzem. A determinação da morte
requer técnicas laboratoriais que revelarão se o
crescimento ainda ocorre quando a amostra é inoculada
em meios sólidos ou líquidos.
Log UFC
log 106 = 6
Redução
logarítmica do
número de
sobreviventes
log 105 = 5
log 104 = 4
Temperatura
constante
log 103 = 3
log 102 = 2
log 101 = 1
0
2
4
6
8
10
12 Tempo (min)
Tempo de Redução Decimal
Valor D
Log UFC
6
Temperatura
constante
5
4
3
D121oC = 2,0 min
2
1
0
2
4
6
8
10
12 Tempo (min)
TEMPO NECESSÁRIO PARA
REDUZIR UM ( n = 1) CICLO
LOGARÍTIMICO NA POPULAÇÃO
MICROBIANA INICIAL,
à temperatura constante.
Log UFC/mL
Curva de sobreviventes de esporos
de B. subtilis em dextrose 5%.
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
D = 1.92 min.
D = 0.65 min
D = 1.30 min.
D= 1.21 min
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tempo (min)
T= 104 oC
T = 106oC
T = 108oC
T= 110oC
10
Log UFC
n = log No – log Nf
6
n = log 106 – log 105 = 6 – 5 = 1
5
n = log 106 – log 104 = 6 – 4 = 2
4
n = 6-3 = 3
3
n = 6-2 = 4
2
n = 6-1 = 5
1
0
2
4
6
8
10
12
Tempo (min)
Log UFC
Log 106
(Log
100)
0
(Log 10-1) -1
(Log 10-2 ) -2
(Log 10-3 ) -3
log 100 = log 1Mo
1 mL
Tempo (min)
log 10-1 = log 1Mo
10 mL
D
log 10-2 = log 1Mo
100 mL
D
log 10-3 = log 1Mo
1.000 mL
D
log 10-4 = log 1Mo
10.000 mL
(Log
10-4 )
-4
D
log 10-5 = log 1Mo
100.000 mL
(Log 10-5 ) -5
(Log 10-6 ) -6
D
log 10-6 = log 1Mo
1.000.000 mL
D
Número de ciclos logarítimicos reduzidos
n = Log No - Log Nf
¾ NÚMERO FINAL DE SOBREVIVENTES ( Nf )
¾ TEMPO DO PROCESSO
(FTr = t = n * DTr)
Nível de segurança. SAL = Sterility Assurance Level
Tempo
Inicial
processo
No
min
UFC/mL
Valor D Volume
min
0 1000000
mL
Sobreviventes
Nu:volume
n
Nf
Nf
UFC/mL
UFC/mL
Log Nf
1
1000000:1
1000000
10+6
6
Valor D Tempo total
log(No/Nf)
min
t= nxD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1000000
1000000
1000000
1000000
1000000
1000000
1000000
1000000
1000000
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
10
100
1000
10000:1
1000:1
100:1
100:1
10:1
1:1
1:10
1:100
1:1000
100000
10000
1000
100
10
1
0.1
0.01
0.001
1.E+05
1.E+04
1.E+03
1.E+02
1.E+01
1.E+00
10-1
10-2
10-3
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
6
8
10
12
14
16
18
10
11
12
13
1000000
1000000
1000000
1000000
2
2
2
2
10000
100000
1000000
1E+07
1:10000
1:100000
1:1000000
1:10000000
0.0001
0.00001
0.000001
0.0000001
10-4
10-5
10-6
-4
-5
-6
-7
10
11
12
13
2
2
2
2
20
22
24
26
14 1000000
15 1000000
2
2
1E+08
1E+09
1:108
1:109
0.00000001
0.000000001
-8
-9
14
15
2
2
28
30
16 1000000
2
1E+10
1:1010
10-10
-10
16
2
32
11
-11
-11
17
2
34
-12
-12
-13
-14
18
19
20
2
2
2
36
38
40
17 1000000
18 1000000
19 1000000
20 1000000
2
2
2
2
1E+11
1E+12
1E+13
1E+14
1:10
12
1:10
1:1013
1:1014
10
10
10-13
10-14
o
Log UFC/mL
Curva de sobreviventes a 121 C.
B.stearothermophilus
7
6
5
4
3
2
1
0
-1 0
-2
-3
-4
-5
-6
2
4
6
8
Valor D = 2.00 min.
10
12
14
16
18
20
Tempo (min)
22
VALOR Z
Representação do Log D em relação à
temperatura de referência, para destruir n=1
ciclo logarítmico de microrganismo.
Representação gráfica do Log t (t=nxD)
em relação à temperatura de referência
para atingir o mesmo n= nível de
destruição microbiana.
Valor z = intervalo de temperatura que
causa variação de 1 ciclo no valor D.
temperatura
Relação entre os valores D & temperaturas para
B.subtilis ou B. atrophaeus e
B. stearothermophilus .
B. subtilis, z= 13oC
1.50
B.stearothermophilus,
z= 11.8 oC
Log D
1.00
0.50
0.00
-0.50
100
102
104
106
108
110
112
114
Temperatura (oC)
116
118
120
122
Autoclavação
MÉTODO OVERKILL
(No ~105 - 106 esporos/ mL)
Processo
Destruição
n= 12 ciclos
NÍVEL DE ESTERILIDADE = SAL > 10 - 6
Autoclavação
Nível de esterilidade: SAL = 10-6
1 ESPORO SOBREVIVENTE EM 1000000 mL
1 esporo = 10 6 mL da solução.
Equivale:
¾ 1000 bolsas ou ampolas de 1000 mL
¾ 2000 ampolas de 500 mL
¾ 8000 ampolas de 125 mL
Número de ciclos logarítimicos reduzidos
n = Log No - Log Nf
¾NÚMERO FINAL DE SOBREVIVENTES
¾SAL = ( Nf )
¾ TEMPO DO PROCESSO
(FTr = ∑taxa letal* Δtp = n * DTr)
Valor F, à temperatura de processo, depende da
variação da temperatura do produto
com o tempo de processo
T = f (t) = variável
C A L IB R A Ç Ã O D O S T E R M O P A R E S
TER M Ô M ETR O
BAN H O
D E Ó LEO
A G IT A D O R
R E G IS T R A D O R
1 0 R A B IC H O S
PT100
(P L A T IN A )
R E G IS T R A D O R
D IG IT A L
Tempo
(min)
Temperatura
(oC)
Média
0
84,43
2
93,35
4
124,69
6
122,56
8
122,38
10
122,34
12
122,33
14
122,33
16
122,3
18
122,3
20
122,35
22
122,34
24
122,35
26
122,38
28
114,51
30
107,84
32
104,33
34
104,2
FTr = ∑ (L1+L2+…Ln-1) x Δt
Δt = constante ≤ 2 min
Tempo
(min)
Temperatura
(oC)
Média
0
84,43
2
93,35
4
124,69
6
122,56
8
122,38
10
122,34
12
122,33
14
122,33
16
122,3
18
122,3
20
122,35
22
122,34
24
122,35
26
122,38
28
114,51
30
107,84
32
104,33
34
104,2
Taxa Letal
F Tr
L=10 (T-Tr)/z
(F Tr= L x t)
(min)
0,000
0,000
0,002
0,003
2,339
4,678
1,432
2,864
1,374
2,748
1,361
2,723
1,358
2,717
1,358
2,717
1,349
2,698
1,349
2,698
1,365
2,729
1,361
2,723
1,365
2,729
1,374
2,748
0,224
0,449
0,048
0,097
0,022
0,043
0,021
0,042
17,703
35,405
35,406
Valor FzTr= ∫ taxa letal x d t = n x DTr
Tempo equivalente que o produto permaneceria, à
temperatura de referência, considerando aquecimento e
resfriamento instantâneos.
Taxa letal em função da temperatura e tempo
de processo.
2.5
140
Taxa letal
100
1.5
80
Área =
Valor F
1
60
40
0.5
20
0
Temperatura (oC)
120
2
0
0
5
Taxa Le tal
10
15
20
25
30
Te mpe ratura (oC)
35
40
Tempo (min)
Tempo de processo equivalente
à temperatura de processo (referência),
que o produto permaneceria
se o aquecimento e se o resfriamento
fossem instantâneos.
Valor FzTr = t = n x DTr
Valor F ( z = 10 oC ) às temperaturas de
referência
Taxa Letal ( L )
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
Tem po (m in)
F (105 oC) = 418.7
min
5
4.5
4
F (115oC) = 41.9 min
3.5
3
2.5 min
F (121oC) = 10.5
2
1.5
1
0.5
0
40
50
“PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO
PLANO ESCRITO,
DIVIDIDO em ETAPAS (FDA, 1987)”:
Ratificação: RDC nº 134/2003 e
nº 210/2004
Fluxo de Validação do Processo
VALIDAÇÃO
QUALIFICAÇÃO
DE INSTALAÇÃO
QUALIFICAÇÃO
DE OPERAÇÃO
QUALIFICAÇÃO
DE DESEMPENHO
QUALIFICAÇÃO
FÍSICA
QUALIFICAÇÃO
MICROBIOLÓGICA
Qualificação de Instalação (QI)
Qualificação Operacional
Qualificação Operacional
Calibração e observância de que:
¾ Os equipamentos e instrumentos estão
operando segundo o projeto de instalação
¾ Treinamento nos procedimentos de operação,
manutenção e segurança do sistema;
¾ Validação física: Distribuição de calor na
câmara: Pontos frios e quentes.
P o s iç ã o d o s T e rm o p a re s n a
C â m a ra d a A u to c la v e V a z ia
e c o m C a rg a
01
09
06
05
08
04
07
03
S e n s o r d e T e m p e ra tu r a
10
F re n te d a
C â m a ra
02
Fundo da
C â m a ra
Qualificação Física
Evidências da total distribuição de calor
na Câmara Vazia.
Termopares ou Sensores de temperatura
Posição dos termopares na
câmara vazia
130
32
28
24
20
16
12
8
4
0
-4
-8
-12
120
110
Valor F
100
n ciclos
90
80
70
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tempo (min)
Valor F (min)
n ciclos
SAL
Temperatura oC
n= 12 ciclos (SAL = -6.4) & F (121oC) = 21 min & t = 22 min.
Temperatura
(oC)
Valor F
n & SAL
Distribuição de calor a 121oC.
Valor F (min), n (ciclos) e SAL.
110
105
90
100
75
60
90
Valor F
80
45
30
70
15
0
n ciclos
60
Temperatura (oC)
Valor F (min)
n & SAL
Distribuição de calor a 102oC.
Valor F (min), n (ciclos), e SAL.
50
-15
-30
20
30
40
Valor F
50
60
70 80 90
Tempo (min)
n (ciclos)
SAL
40
100 110 120 130
Temperatura (oC)
n= 12 ciclos (SAL = -6.59) & F (102oC)= 35 min. & t = 70 min.
Qualificação de Desempenho
ou de Processo ou de
Performance
Qualificação de Processo
• Sistema operacional é validado em relação ao
produto:
•Validação física:
•Distribuição de calor entre as embalagens
•Penetração de calor dentro do produto
•Validação Biológica: Nível de ESTERILIDADE (SAL)
•Esporos do IB inoculados no produto, justaposto ao
termopar.
•Reprodutibilidade dos parâmetros operacionais.
Depende da preparação, envase
da esterilização e transporte.
Análise do Produto Pré-Esterilizado (Frascos de 1000 mL)
110.0
UFC/1000 ml
90.0
70.0
50.0
30.0
10.0
-10.0
Emp re s a 1
Emp re s a 2
Emp re s a 3
Emp re s a 5
Emp re s a 7
B a c t é ria s
1 0 .7
1 4 .2
1 .6
3 1 .7
3 3 .1
M a i o r V a lo r - B a c t é ria s
5 4 .0
1 8 .0
2 0 .0
1 0 4 .0
6 0 .0
M e no r V a lo r - B a c t é ria s
0 .0
1 0 .8
0 .0
0 .0
8 .0
F ung o s
M a i o r V a lo r - F ung o s
M e no r V a lo r - F ung o s
Tempo médio de 5 horas entre o envase e a autoclavação
Penetração de Calor
75
110
60
100
45
90
30
80
15
70
0
60
-15
50
-30
40
20
30
40
Valor F
50
60
70 80 90
Tempo (min)
n ciclos
SAL
Temperatura
(oC)
Valor F (min)
n & SAL
Penetração de calor em frascos (500 mL) a 102oC.
Valor F (min), n (ciclos), e SAL.
100 110 120 130
Temperatura (oC)
n= 12 ciclos (SAL = -6.41) & F (102oC)= 35 min. & t = 97 min.
Posição dos sensores de temperatura.
Vista superior
11 a 18
18
10
9
8
17
6
7
15
16
5
19
13
3
1 a 10
11
12
Frasco
4
2
Bolsa
14
1
Dreno
Frente
o
Distribuição de calor com câmara vazia (121 C)
Valores médios Fo (min)
60
55
50
45
40
35
30
25
20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Termopares
Autoclave 01
Autoclave 02
Carga máxima. 960 bolsas de 1000 mL. Penetração
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
15
10
5
0
-5
-10
0
F (1 2 1 C) TC 0 4
20
n cicclo s (TC0 4 )
40
60
80
SAL (TC0 4 )
Tem po (m in)
Ponto frio da carga (Penetração de calor).
F (121C) = 42.92 min
n = 13 ciclos
SAL = (10-7) = 1 esporo sobrevivente em cada 10000000 mL
= 10 000 bolsas
Equivalentes
104 bolsas
60
50
40
30
20
10
0
20
10
0
-10
n (ciclos)
& SAL
Valor F (121C)
min
Carga m áxim a: 960 bolsas de 1000 m L.
Distribuição de calor.
-20
0
20
F (121C) TC 14
40
n ciclos (TC 14)
60
SAL (TC 14)
80
Tem po (m in)
Ponto frio da autoclave: Distribuição de calor
F (121C) = 56,16 min
n = 18 ciclos
SAL = (10-11) = 1 esporo sobrevivente em 100000000000 mL
= 1011 mL
Equivalem
10000000 bolsas = 10 7 bolsas.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
8
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
-14
-16
-18
0
10
20
30
40
50
60
70
SAL
Valor F
Bolsas (500 mL) com glicose 5%.
Valor F (121oC) & n (ciclos).
80
Tempo (min)
F câmara (6)
F carga mín. (6)
F carga mín. (19)
F carga máx (6)
F carga máx. (19)
n câmara (6)
n carga mín. (6)
n carga mín. (19)
n carga máx. (6)
n carga máx. (19)
n=12 ciclos
Câmara: Tp= 31 min.; Taq.= 15 min.
Carga mínima: Tp= 36 min.; T aq.= 23 min.
Carga máxima: Tp= 41 min.; T aq. = 24 min.
DESAFIO
IB com maior resistência térmica
• Para validação do processo de esterilização
terminal de soluções parenterais, esporos de
Bacillus subtilis geneticamente modificados,
expressando a proteína verde fluorescente,
GFPuv, foram utilizados como indicadores
biológicos.
A validação foi realizada em autoclave
com capacidade de 6000 litros.
Qualificação de Autoclaves
Capacidade de 6000 L
6 carrinhos com 4 prateleiras
Solução de cloreto de sódio 0,9%
30 termopares
Câmara Vazia
Carga Máxima (1000mL)
Carga Heterogênea (10 a 1000mL)
Valor D (min) – 102°C
Solução
Parenteral
RESULTADOS
Água para Injeção
B. atrophaeus B. subtilis
ATCC 9372
W (GFP) a
0,66
1,74
Glicose 25%
1,05
1,58
Glicose 50%
1,37
1,91
Cloreto de Sódio 0,9%
0,93
3,81
Esporos de Bacillus subtilis W
Carrinho
1
2
3
4
4
5
6
Carga
Termopar
(Frascos)
3
8
1000mL
11
13
14
4
6
500mL
19
28
21
24
250mL
27
29
30
22
10 – 20 mL
25
18
125mL
20
2
5
7
500mL
12
17
26
9
1000mL
10
16
Valor F
(minutos)
27,1
18,6
20,5
23,9
21,1
28,5
27,9
26,9
26
33,8
35,6
32,1
35,4
35,7
44,9
42,1
44,9
36,7
35,1
30,4
30,5
31,7
47
28,1
27,7
22,6
23,8
n
(ciclos)
7,1
4,9
5,4
6,3
5,5
7,5
7,3
7,1
6,8
8,9
9,3
8,4
9,3
9,4
11,8
11,0
11,8
9,6
9,2
8,0
8,0
8,3
12,3
7,4
7,3
5,9
6,2
O tempo equivalente de
processo (Valor F) a
temperatura de
tratamento (TR=102°C)
(F = n * D) variou de 18,6
a 47 minutos.
Para B. atrophaeus,
n = 46 ciclos
considerando
D= 0,93 min.
Cepa padrão indicou
nível de esterilidade
esperado.
Nível de segurança de
12 ciclos não foi
alcançado para B.
subtilis W (GFP),
considerando
valor D = 3,81 minutos.
Validação
Garantia do nível de esterilidade
estabelecido para o sistema e para o
produto.
Portanto, a Liberação Paramétrica é dependente dos
Fatores muito bem definidos para o Produto e Sistema.
ATENDIMENTO MERCADO INTERNO
COMPETITIVIDADE EXTERNA
Agradecimentos
Instituições
• Departamento de Tecnologia Bioquímico
Farmacêutica - FCF
• Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP
• Associação Brasileira de Soluções Parenterais ABRASP