EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS E DETERMINAÇÃO DE COLESTEROL

EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS E DETERMINAÇÃO DE COLESTEROL
Os lípidos (do grego lipos, “gordura”), são umgrupo de compostos quimicamente
heterogéneo, agrupado pelo facto de serem insolúveis em água e solúveis em solventes não
polares, como por exemplo clorofórmio, hidrocarbonetos e alguns álcoois.
O trabalho experimental com lípidos requer uma série de precauções:
1. Utilize uma "hotte" sempre que possível.
2. Para pipetar soluções voláteis, utilize uma propipeta. Encha a pipeta com a solução e
deixe-a esvaziar várias vezes, para saturar o espaço acima do líquido; caso contrário, a
solução terá tendência a ser expelida da ponta da pipeta. Tenha muito cuidado ao encher a
pipeta: a solução nunca deve atingir a propipeta, caso contrário poderá introduzir
contaminantes na solução e deteriorar a borracha. Nunca inverta uma pipeta contendo
fluido.
3. A maioria das soluções utilizadas nestas experiências são altamente voláteis; por essa
razão devem estar tapadas (com papel de alumínio ou uma rolha) sempre que não estejam
a ser utilizadas. Evitará assim a acumulação de vapores tóxicos e/ou altamente inflamáveis
no ar, e por outro lado conseguirá a manutenção das soluções a uma concentração
relativamente constante. Após as experiências as soluções devem ser armazenadas a baixa
temperatura, devidamente tapadas.
4. MUITO IMPORTANTE: os solventes orgânicos são altamente inflamáveis; não usar
perto de chama aberta.
Fundamento teórico dos métodos de extracção
O isolamento de lípidos a partir de um tecido natural baseia-se no facto de serem
menos polares que a maioria dos componentes da célula. Podem assim ser extraídos
selectivamente com solventes orgânicos. No caso concreto do trabalho que vai realizar em
laboratório, as duas fontes das quais se via extrair a fracção lípidica são bastante diferentes.
A gema de ovo é bastante líquida, o que facilita a extracção; as sementes necessitam de
divididas em partículas, para aumentar a superfície de contacto com o solvente, havendo
ainda um aquecimento para facilitar a libertação da fracção lipídica para a mistura de
solventes.
A extracção de "lípidos totais" é geralmente feita com uma mistura
clorofórmio:metanol (2:1). Esta mistura solubiliza os lípidos, tendo a vantagem de
dissociar complexos lípido-proteína das membranas biológicas. O tecido é homogenizado
com a mistura de solventes, seguindo-se uma filtração que permite separar a parte sólida ou
particulada. O filtrado é posto em contacto com uma solução salina (por exemplo, CaCl2),
em conjunto com uma nova mistura de solventes, obtendo-se um sistema difásico. A
presença do sal facilita a extracção de contaminantes não lipídicos para a fase aquosa,
diminuindo também a tendência de dissociação dos lípidos com carácter ácido, que se
mantém deste modo na fase orgânica.
Os lípidos totais extraídos deste modo podem ser posteriormente separados e
quantificados, recorrendo a métodos cromatográficos vários. No entanto existem testes
específicos para alguns tipos de lípidos que nos permitem uma análise quantitativa sem
uma separação prévia. Um exemplo é a quantificação do "colesterol total" (colesterol +
ésteres do colesterol) pelo método de Liebermann-Buchard. Este método tem como
fundamento a reacção do colesterol e seus ésteres com anidrido acético e ácido sulfúrico
concentrado, da qual resulta a formação de um complexo corado de azul esverdeado.
Preparação do reagente de Liebermann-Buchard:
Sobre 60 ml de anidrido acético contido num copo arefecido verter, gota a gota e com agitação
constante, 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Juntar 30 ml de ácido acético glacial, seguido de 0,6 g de
sulfato de sódio anidro.
NOTA: o reagente já foi preparado pelo docente; na aula só terá de utilizá-lo. CUIDADO - É
EXTREMAMENTE CORROSIVO!!!
Vai ter oportunidade de comparar a quantidade de colesterol existente na gema de
ovo e na noz, de um modo qualitativo. Sabendo que o máximo de absorção do complexo
reagente-colesterol é a 550nm, de que maneira poderia quantificá-lo de modo mais
rigoroso?
Bibliografia:
ALEXANDER, R.R., Griffiths, J.M., Wilkinson, M.L. (1985)
"Basic Biochemical Methods", Ed. John Wiley and Sons, Inc., New York.
BOYER, R.F. (1986)
"Modern Experimental Biochemistry", Ed. Addison-Wesley Publishing Co., Reading,
Massachussets.
MEDEIROS, M.L.P. (1990)
"Contribuição para o estudo dos alcalóides solúveis em água das raízes de Chelidonium
majus L. da Ilha de São Miguel", Tese de Doutoramento, Universidade dos Açores
Páginas da Internet:
http://go.to/cyberlipid (Ciberlípidos - tipos de lípidos, métodos de extracção e de análise, e muito mais,
consultado a 19/2/2008)
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