capítulo 1 - BioTecnologia

Transcrição

MARIA ANTONIA MALAJOVICH
BIOTECNOLOGIA
Segunda Edição (2016)
ISBN: 978-85-921077-0-3
MARIA ANTONIA MALAJOVICH
BIOTECNOLOGIA
2ª EDIÇÃO
Rio de Janeiro
Maria Antonia Muñoz de Malajovich
2016
BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (http://bteduc.com)
Copyright © 2016 Maria Antonia Muñoz de Malajovich
BIOTECNOLOGIA
Maria Antonia Malajovich
ISBN: 978-85-921077-0-3
Figuras e fotos dos embriões de Kalanchoe (capa e contracapa) da autora.
O meu agradecimento a Elisabeth Lissovsky pela revisão do português.
ii
SUMÁRIO
Seguir o link para ir diretamente ao capítulo de interesse.
C A P Í T U L O 1. O QUE É BIOTECNOLOGIA.......................................................................................................... 1
A biotecnologia tradicional. A biotecnologia moderna. As definições de biotecnologia. O impacto da biotecnologia.
Biotecnologia e desenvolvimento. A história da biotecnologia.
C A P Í T U L O 2. CÉLULAS E CROMOSSOMOS........................................................................................................9
A célula como unidade estrutural e funcional dos seres vivos. Técnicas laboratoriais. Toda célula deriva de outra preexistente.
Os cromossomos e a teoria cromossômica da hereditariedade. As primeiras manipulações gênicas. Nature vs nurture. Células
e cromossomos como agentes biológicos.
C A P Í T U L O 3. OS MICRORGANISMOS.............................................................................................................20
A diversidade microbiana (Eubactérias, algas, arqueas, fungos e vírus). As técnicas microbiológicas. Biossegurança e
biosseguridade. Os microrganismos como agentes biológicos.
C A P Í T U L O 4. ENZIMAS E ANTICORPOS..........................................................................................................32
As proteínas. Estrutura. O proteoma. As bases de algumas técnicas laboratoriais. As enzimas. A catálise enzimática. Os
anticorpos. A reação antígeno- anticorpo. A produção de anticorpos no organismo e no laboratório. A utilização dos
anticorpos.
C A P Í T U L O 5. OS ÁCIDOS NUCLEICOS..............................................................................................................46
Os ácidos nucleicos. A dupla hélice. O código genético. A expressão gênica. O fluxo da informação genética em células
procarióticas e eucarióticas. O complexo mundo dos RNAs. A diversidade existente. Interferência e silenciamento gênico. O
genoma humano: mapeamento e avanços posteriores. O DNA e o RNA como agentes biológicos.
C A P Í T U L O 6. BIOPROCESSOS...........................................................................................................................58
Bioprocessos, processos fermentativos e indústria. Os microrganismos industriais. Noções sobre o metabolismo primário e
secundário. As fases de crescimento da população microbiana. Meios de cultura e matéria-prima. A obtenção das linhagens.
Os diferentes tipos de bioprocessos (tradicionais e submersos). Do laboratório à indústria (mudança de escala, condução do
processo e recuperação do produto. Bioprocessos na indústria: o ácido cítrico e os biofertilizantes.
C A P Í T U L O 7. O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS...........................................................................................71
A manipulação in vitro de células e tecidos vegetais: as primeiras tentativas, os meios de cultura, as etapas do processo, as
diferentes modalidades, melhoramento e conservação da biodiversidade vegetal, a difusão da tecnologia. A manipulação in
vitro das células animais: as primeiras tentativas, as diferentes modalidades, os meios de cultivo, as linhagens celulares,
condições de cultivo, do laboratório à indústria.
C A P Í T U L O 8. A TECNOLOGIA DO DNA ...........................................................................................................83
As ferramentas disponíveis: as nucleases ou enzimas de restrição, a eletroforese do DNA, hibridização e sondas gênicas, o
método de Southern, o Fingerprint, a síntese e amplificação de DNA, o sequenciamento do DNA. Os arrays.
C A P Í T U L O 9. A ENGENHARIA GENÉTICA.........................................................................................................95
O nascimento da biotecnologia moderna: as primeiras experiências, mitos e realidade. As bibliotecas de genes. A construção
de um microrganismo recombinante: Encontrar o gene, inserir o gene e identificar os microrganismos recombinantes. A
chegada da comunidade DIY. A construção de plantas transgênicas: o transgene, a transferência dos genes a células vegetais,
do laboratório ao campo. Células e animais transgênicos: a transferência gênica a células animais, aplicações. As novas
tecnologias de edição gênica baseadas no RNA interferente, nas nucleases sítio-dirigidas: ZFN’S E TALEN, na imunidade
bacteriana: CRISPR-CAS9.Biossegurança e regulação.
C A P Í T U L O 10. BIOTECNOLOGÍA E INDÚSTRIA...............................................................................................114
O processo Weizmann. A indústria química: as vias química e biotecnológica. Os produtos biotecnológicos: metabólitos de
interesse comercial, enzimas, biopolímeros e bioplásticos. Os biocombustíveis: etanol, biogás, biodiesel. Panorama atual.
Biorrefinarias e novas bioindústrias: os casos Amyris e Solazyme (TerraVia).
C A P Í T U L O 11. BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE........................................................................................131
O desenvolvimento sustentável. As tecnologias limpas: substituição de processos industriais e de insumos agrícolas. A
redução dos resíduos: degradação do lixo, tratamento das águas residuais, tratamento dos efluentes industriais, emissões de
gases e efeito estufa. A recuperação de recursos naturais: o petróleo, a mineração. O diagnóstico de contaminação ambiental:
indicadores biológicos, técnicas genéticas e imunológicas, biossensores. A biorremediação: os vazamentos de petróleo, a
radiação. Organismos novos na natureza e biossegurança.
M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016)
http://bteduc.com
C A P Í T U L O 12. BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE.......................................................................................149
A desaparição dos ecossistemas naturais. O homem e as plantas alimentícias, comerciais e medicinais. A biodiversidade
ameaçada: erosão genética, expansão do agronegócio, transgênese. A proteção da biodiversidade: centros de diversificação,
conservação da biodiversidade. O CGIAR o centro internacional da batata. O protocolo de Cartagena de biossegurança.
C A P Í T U L O 13. BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA...........................................................................................162
A evolução das práticas agrícolas. A obtenção de novas variedades: mutação gênica e seleção, alteração do número de
cromossomos, engenharia genética. A biossegurança e o princípio de precaução. As PGMs de interesse agronômico:
tolerância a herbicidas, resistência a insetos, resistência a vírus, coexistência entre plantas convencionais e PGMs. O cultivo
de outros tipos de PGMs: interesse nutricional, produção de medicamentos. O agronegócio: As primeiras empresas
produtoras de sementes, os gigantes gênicos, a cadeia produtiva da semente, patentes e inovação tecnológica. A adoção dos
cultivos biotecnológicos no mundo: os Estados Unidos e a União Europeia, Israel, África subsaariana, China. A chegada das
novas tecnologias.
C A P Í T U L O 14. BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS.................................................................................179
A nutrição dos animais a necessidade de rações, de Liebig à vaca louca, variações sobre a composição das rações, as rações
transgênicas. O melhoramento genético do gado: o controle da reprodução, as novas tecnologias. A aquicultura. A saúde dos
animais: os modificadores metabólicos, a resistência a doenças, prevenção e tratamento. Novas utilizações dos animais
domésticos: modelos de estudo para doenças humanas, xenotransplantes, os animais como biorreatores, o marco conceitual
dos três Rs. Os animais de estimação.
C A P Í T U L O 15. BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS............................................................................................... 194
O pão. O vinho: a vinificação, o cultivo da videira, o rol da levedura na vinificação. A cerveja. Os queijos e iogurtes: a produção
de laticínios, o rol de microrganismos e enzimas. A proteína de célula única. Os aditivos: os diversos tipos, os adoçantes. Os
alimentos biofortificados. Segurança alimentar
C A P Í T U L O 16. BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS...................................................................................206
A entrada dos transgênicos na cadeia alimentar: melhorando a conservação, as propriedades industriais e as características
nutricionais. A favor ou contra? O que o consumidor precisa saber: a noção de segurança, a ingestão de DNA, os marcadores
de resistência a antibióticos, a composição química, a produção de toxinas, a produção de alérgenos, o risco de câncer, a
utilização de um promotor viral (CaMV), outros efeitos, perspectiva histórica. Como garantir a segurança alimentar? O
princípio de equivalência substancial, a avaliação de riscos, a rotulagem dos alimentos, rótulo e informação, o rastreamento
de um transgene.
C A P Í T U L O 17. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS.......................................................................................216
As doenças infecciosas. A aquisição de imunidade. Os diferentes tipos de vacinas: as vacinas tradicionais ou de primeira
geração. As novas vacinas ou de segunda geração, a última geração. A produção de vacinas: pesquisa e desenvolvimento, o
marco ético, operações industriais, o mercado das vacinas, um setor estratégico para a sociedade. As vacinas e a erradicação
da doença: a varíola, a poliomielite, a influenza, tuberculose, malária e HIV/AIDS. A ameaça das doenças emergentes.
Bioterrorismo e biosseguridade.
C A P Í T U L O 18. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / OS TESTES DIAGNÓSTICOS...........................................................233
As tendências atuais: dispositivos miniaturizados, o que é um bom teste, as técnicas com base bioquímica, base imunológica
e base genética. O diagnóstico das doenças infecciosas. A tipificação de tecidos: sangue, outros tecidos e órgãos. O
diagnóstico de doenças genéticas: as limitações dos testes, as estratégias seguidas, diagnóstico preventivo e preditivo. As
patentes. O esporte. A prática forense.
C A P Í T U L O 19. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / A INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS...............................................247
O desenvolvimento de um medicamento novo. Patentes, genéricos e biossimilares. Os princípios ativos das plantas: o caso
da aspirina, os fitoterápicos, as tendências recentes, a importância de um marco legal. As substâncias antibióticas: o caso da
penicilina, os limites ao uso de antibióticos, a necessidade de inovação. As primeiras moléculas terapêuticas: o caso da
insulina, a substituição do produto natural. As proteínas recombinantes: as bases tecnológicas, os produtos e suas utilizações.
Os medicamentos personalizados: a farmacogenômica, a farmacogenética, as doenças órfãs. O mercado dos
biomedicamentos: a tendência geral, América Latina.
C A P Í T U L O 20. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / OS NOVOS TRATAMENTOS....................................................... 264
A aprovação de um tratamento experimental. Os transplantes: os transplantes de órgãos, os xenotransplantes. A engenharia
de tecidos: as terapias celulares, fraudes e desatinos. As imunoterapias: o progresso, os anticorpos monoclonais, o desafio
da barreira hematoencefálica. O câncer: uma doença de origem genética, as terapias biológicas, os vírus oncolíticos, as
vacinas terapêuticas. As terapias gênicas: terapia somática e germinal, os altos e baixos de uma tecnologia, os resultados
alcançados, a FIV triparental. As promessas do RNA: as ribozimas, a tecnologia anti-sense, o RNA interferente, a edição gênica
C A P Í T U L O 21. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................................... 278
B I B L I O G R A F I A............................................................................................................................................ 280
iv
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.1. O campo da Biotecnologia
FIGURA 2.1. Representações esquemáticas da estrutura celular
FIGURA 2.2. As células-tronco embrionárias
FIGURA 2.3: Os cromossomos
FIGURA 2.4. Mitose e meiose
FIGURA 3.1. Bactérias, clones e intercâmbio de material genético
A. A – Formação de clones
B. B – Mecanismos de transferência lateral ou horizontal de material genético
FIGURA 3.2. Os vírus
A.
B.
C.
D.
Estrutura fundamental
Morfologia de diferentes vírus
(Os adenovírus e o HIV parasitam células humanas; o bacteriófago, bactérias).
A multiplicação de um bacteriófago
FIGURA 3.3. Logotipos utilizados como indicação de risco biológico
FIGURA 4.1. A composição química de uma bactéria
FIGURA 4.2. Aminoácidos e proteínas
FIGURA 4.3. Cromatografia em coluna
FIGURA 4.4. Eletroforese
FIGURA 4.5. Difração de raios X
FIGURA 4.6. O mecanismo da atividade enzimática
A. O modelo chave-fechadura
B. A enzima diminui a energia de ativação
FIGURA 4.7. A estrutura da molécula de anticorpo (IgG)
FIGURA 4.8. Os anticorpos e o reconhecimento do antígeno
FIGURA 4.9. O encontro do linfócito B e do antígeno, e a seleção clonal
FIGURA 4.10. A produção de anticorpos no laboratório
FIGURA 4.11. Os ensaios imunológicos
A. Associação dos anticorpos com moléculas fluorescentes
B. Associação dos anticorpos com enzimas
FIGURA 5.1. Composição química dos ácidos nucleicos
FIGURA 5.2. A molécula de DNA
FIGURA 5.3. O fluxo da informação genética
FIGURA 5.4. A organização e regulação dos genes nas células procarióticas
FIGURA 5.5. A organização e regulação dos genes nas células eucarióticas
FIGURA 5.6. As etapas da síntese de proteínas (Recapitulação)
FIGURA 5.7. O silenciamento gênico
FIGURA 6.1. O processo fermentativo genérico
FIGURA 6.2. Respiração e fermentação
FIGURA 6.3. As diversas fases do crescimento de uma população microbiana e a produção de metabólitos
A.
As fases de crescimento de uma população
B. A produção de metabólitos primários e secundários
FIGURA 6.4. A metodologia HTS para triagem e evolução dirigida de linhagens bacterianas
FIGURA 6.5. Modelos de biorreatores utilizados em processos tradicionais
A. Biorreator para fermentações em fase sólida
B. A produção de vinagre (Método de Orléans)
FIGURA 6.6. Modelo de biorreator utilizado em fermentações submersas
FIGURA 6.7. Fermentações, agentes biológicos e biorreatores
FIGURA 6.8. A mudança de escala, do laboratório à indústria
FIGURA 6.9. A obtenção de ácido cítrico por fermentação
FIGURA 7.1. As diversas partes de uma planta angiosperma
FIGURA 7.2. O procedimento a seguir para se obter uma cultura asséptica no laboratório
FIGURA 7.4. A cultura de meristemas
FIGURA 7.5. As diferentes possibilidades dos cultivos de calos
FIGURA 7.6. As possibilidades do cultivo de células vegetais
FIGURA 7.7. As culturas de células de origem animal
A. Etapas da cultura de leucócitos para a análise do cariótipo
B. Etapas da cultura de células a partir de um fragmento de tecido
FIGURA 8.1: As enzimas de restrição (EcoRI corta o DNA na sequência palindrômica GAATTC)
FIGURA 8.2. A eletroforese do DNA
FIGURA 8.3. Os polimorfismos
FIGURA 8.4. Hibridização de uma sequência de DNA com uma sonda complementar marcada
FIGURA 8.5. A técnica de Southern
FIGURA 8.6. A síntese de oligonucleotídeos
v
http://bteduc.com
FIGURA 8.7. A síntese de cDNA por transcriptase reversa
FIGURA 8.8. A reação em cadeia da polimerase
FIGURA 8.9. O sequenciamento de um fragmento de DNA
FIGURA 8.10. Fundamentos da tecnologia de arrays
FIGURA 9.1. Cortar, colar, copiar: a experiência que deu origem à engenharia genética
FIGURA 9.2. Sapobacter ou Bactosapo?
FIGURA 9.3. A construção de bibliotecas de genes
FIGURA 9.4. A produção de somatotropina por engenharia genética
FIGURA 9.5. Algumas estratégias possíveis de clonagem
FIGURA 9.6. A estrutura de um vetor de expressão
FIGURA 9.7. Semelhanças entre os Legos e os Biobricks (www.biochem.hku.hk/synbio/?_id=148)
A. Classificação hierárquica
B. Construções intercambiando as partes
FIGURA 9.8. A construção de uma planta transgênica no laboratório
FIGURA 9.9. As etapas da construção de uma planta transgênica
FIGURA 9.10. Construção de animais transgênicos
A. Microinjeção.
B. Transfecção de células-tronco embrionárias
FIGURA 9.11. A edição gênica com CRISPR-Cas9
FIGURA 10.1. As etapas necessárias para a produção de etanol a partir de diferentes matérias-primas
FIGURA 10.2. A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar
FIGURA 10.3. A biodigestão em condições aeróbias e anaeróbias.
FIGURA 10.4. As complexas etapas da produção de biogás dentro do biodigestor
FIGURA 10.5. As utilizações do biogás
FIGURA 10.6. A reação de transesterificação
FIGURA 10.7. O caso Amyris
A. Do quinghaosu à artemisina
B. Produtos gerados na plataforma tecnológica baseada na engenharia metabólica da levedura (via dos isoprenoides ou terpenos)
FIGURA 10.8. O caso Solazyme
FIGURA 11.1. A indústria de papel e de celulose.
FIGURA 11.2. Controle biológico do Aedes aegypti
A.
B.
C.
D.
Ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti
Controle por Wolbacchia
Controle por irradiação
Controle por engenharia genética
FIGURA 11.3. A compostagem
FIGURA 11.4. O tratamento das águas residuais
FIGURA 11.5. O funcionamento de um biossensor
TABELA 11.2. Os principais contaminantes do meio ambiente
FIGURA 11.6. As estratégias de biorremediação
FIGURA 12.1. O transporte de plantas de um continente a outro
FIGURA 12.2. Distribuição da produção agrícola na área habitável do planeta
FIGURA 12.3. Os vegetais na alimentação humana
FIGURA 13.1. O milho
FIGURA 13.2. A produção de milho híbrido
FIGURA 13.3. As etapas da construção de uma planta transgênica
FIGURA 13.4. Os elos que integram a cadeia produtiva da semente
FIGURA 14.1. O Controle da reprodução em bovinos
FIGURA 14.2. Dolly, um clone obtido por transferência nuclear
FIGURA 14.3. O salmão transgênico AquAdvantage (Aquabounty Technologies)
TABELA 14.2. Significado e alcance dos três Rs (do inglês replacement, reduction, refinement)
FIGURA 15.1. A panificação
FIGURA 15.2. A vinificação
FIGURA 15.4. A produção de laticínios
A. Iogurte tradicional e iogurte batido
B. Queijo. Os agentes biológicos intervêm nas etapas de coagulação e na maturação de alguns produto
FIGURA 15.5. A produção de xarope de frutose
FIGURA 16.1. O que é um transgênico?
FIGURA 16.2. A estrutura de um transgene
FIGURA 16.3. O símbolo de transgênico adotado no Brasil.
FIGURA 17.1. As respostas primária e secundária do organismo
FIGURA 17.2. A memória imunológica
FIGURA 17.3. A utilização da tecnologia do DNA-recombinante na vacina contra a hepatite B.
FIGURA 17.4. Os diferentes tipos de vacinas
FIGURA 18.1. Imagens comerciais de alguns dispositivos miniaturizados utilizados em testes diagnósticos
vi
SUMÁRIO
FIGURA 18.2. Imagem comercial dos sistemas API de Biomérieux (http://www.tgw1916.net/Tests/api.html).
FIGURA 18.3. O método direto e indireto de um teste positivo de ELISA.
FIGURA 18.4: As técnicas com base genética
FIGURA 18.5. O sistema HLA
A. A herança dos haplótipos.
B. Reação mista ou “cross-matching”. Colocam-se em contato as células do doador com o soro do receptor, em presença de
complemento. Se as células do doador ficam intactas, há compatibilidade.
FIGURA 18.6. O uso de arrays no diagnóstico de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2
FIGURA 19.1. As etapas do desenvolvimento de um medicamento
FIGURA 19.2: A fórmula da aspirina
FIGURA 19.3. A fórmula da penicilina
FIGURA 19.4. A insulina humana
A. A molécula de insulina
B. A síntese da insulina.
FIGURA 20.1. O princípio da clonagem terapêutica
FIGURA 20.2. A transformação de uma célula normal em cancerosa por mutação (câncer de cólon).
FIGURA 20.3. O tratamento com sipuleucel-T (Provenge®).
A. Extração das células dendríticas
B. Incubação das células com Provenge®
C. Reinfusão das células modificadas no paciente (3 vezes com 2 semanas de intervalo)
FIGURA 20.4: O princípio da terapia gênica.
FIGURA 20.5: As tecnologias de silenciamento gênico.
A. As ribozimas
B. O RNA anti-sense
C. O RNA interferente
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.1. Produtos e serviços de origem biotecnológica, em diferentes setores
TABELA 1.2. A linha do tempo
TABELA 2.1. A função e a distribuição das estruturas celulares
TABELA 2.2. As células como agentes biológicos
TABELA 3.1. Os microrganismos dentro do marco da uma classificação biológica atual
TABELA 3.2. As bactérias (Eubactérias e Arqueas) como agentes biológicos
TABELA 3.3. As algas como agentes biológicos
TABELA 3.4. Os fungos como agentes biológicos
TABELA 4.1. As funções das proteínas no organismo
TABELA 4.2. A classificação internacional das enzimas
TABELA 4.3. As enzimas como agentes biológicos
TABELA 4.4. Os anticorpos como agentes biológicos
TABELA 5.1: O código genético
TABELA 5.2. Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) como agentes biológicos
TABELA 7.1. Os componentes do meio de cultura para células vegetais
TABELA 7.2. Os componentes de um meio de cultura básico para células animais
TABELA 7.3. Origem e utilização de algumas linhagens celulares
TABELA 10.1. Diversidade de produtos derivados de algumas matérias-primas renováveis
TABELA 10.2. Metabólitos primários e secundários obtidos por fermentação e/ou bioconversão enzimática
TABELA 10.3. O poder calorífico de vários combustíveis.
TABELA 11.1. Alguns exemplos de utilização de agentes biológicos como pesticidas
TABELA 11.2. Os principais contaminantes do meio ambiente
TABELA 12.1. Os principais tipos de vegetais que entram em nossa alimentação
TABELA 12.2. As plantas e a indústria
TABELA 12.3. Os centros de diversificação e os cultivos originários
TABELA 14.1. O risco de escapamento de um animal transgênico
TABELA 14.2. Significado e alcance dos três Rs (do inglês replacement, reduction, refinement)
TABELA 16.1. As plantas geneticamente modificadas no mundo (Dados do ISAAA, março de 2016)
TABELA 17.1. A produção de vacinas no Brasil
TABELA 18.1. As qualidades de um bom teste de diagnóstico.
TABELA 18.2. Algumas das mais de 8.000 doenças genéticas descritas
TABELA 19.1. A linha do tempo de entrada dos antibióticos e antibacterianos no mercado
TABELA 19.2. Alguns biofármacos de interesse médico
TABELA 19.3. Os medicamentos biológicos mais lucrativos em 2014 (Statista, Phrma)
vii
viii
http://bteduc.com
CAPÍTULO 1
O QUE É BIOTECNOLOGIA
A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL
Cultivar vegetais, domesticar animais, transformar os alimentos ou aproveitar as propriedades
curativas de algumas plantas são atividades que remontam à alvorada da humanidade e se
desenvolveram com base no conhecimento empírico, ignorando a existência dos microrganismos ou
das leis da hereditariedade.
No início do século XIX, a demanda de mão de obra por uma indústria incipiente estimula a
migração da população do campo para a cidade. Em condições sanitárias cada vez mais degradadas,
as doenças e a fome acompanham o homem. Ao mesmo tempo, o progresso exige processos
industriais mais eficientes. A compreensão dos fenômenos naturais torna-se indispensável para
responder às necessidades da sociedade.
A partir de 1850 surgem novas áreas do conhecimento. Nasce a Microbiologia, a Imunologia, a
Bioquímica e a Genética. A Química Industrial desenvolve-se aceleradamente e aumenta, também, a
intervenção da Engenharia Agrícola e da Pecuária no gerenciamento do campo.
Em 1914, Karl Ereky, um engenheiro agrícola húngaro, desenvolve um gigantesco plano de criação
de suínos visando substituir as práticas tradicionais por uma indústria agrícola capitalista baseada no
conhecimento científico. Deve-se a Ereky (1919) a primeira definição de biotecnologia, como “a ciência
e os métodos que permitem a obtenção de produtos a partir de matéria-prima, mediante a
intervenção de organismos vivos”. Para ele, a era bioquímica substituiria a era da pedra e do ferro.
O século XX assiste a um desenvolvimento extraordinário da ciência e da tecnologia. Da
convergência entre ambas resultam logros extraordinários em vários setores produtivos, onde os seres
vivos constituem a base de itens tão diversos como a produção de variedades vegetais mais produtivas,
a fabricação de novos alimentos, o tratamento do lixo, a produção de enzimas e os antibióticos.
A BIOTECNOLOGIA MODERNA
A proposta de J. D. Watson e F. Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molécula de DNA
representa, sem dúvida, um marco fundamental na história da Biologia Molecular. Mas a divisória
entre a Biotecnologia clássica e a Biotecnologia moderna é uma série de experiências realizadas por H.
Boyer e S. Cohen que culmina em 1973 com a transferência de um gene de sapo a uma bactéria. A
partir desse momento é possível mudar o programa genético de um organismo transferindo-lhe genes
de outra espécie.
A importância e os riscos inerentes à nova tecnologia não passaram despercebidos às pessoas
envolvidas. Fato inédito na história, em 1975, os cientistas reunidos em Asilomar (USA) estabeleceram
uma moratória em seus trabalhos até serem definidas as condições de segurança adequadas, o que
aconteceria pouco tempo mais tarde.
http://bteduc.com
Na passagem de uma biotecnologia de laboratório a uma biotecnologia industrial, a Engenharia
Genética ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora do século XX. Em alguns casos, como
os da insulina e do hormônio do crescimento, a inovação consiste em substituir os métodos de
obtenção tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais ou do Golden Rice, um
arroz com vitamina A, trata-se de produtos inteiramente novos. As técnicas recentes de edição gênica
ampliam extraordinariamente as possibilidades de manipulação dos genes.
A Biotecnologia abrange uma área ampla do conhecimento que decorre da ciência básica (biologia
molecular, microbiologia, biologia celular, genética etc.), da ciência aplicada (técnicas imunológicas e
bioquímicas, assim como técnicas decorrentes da física e da eletrônica), e de outras tecnologias
(fermentações, separações, purificações, informática, robótica e controle de processos). Trata-se de
uma rede complexa de conhecimentos na qual ciência e tecnologia se entrelaçam e se complementam.
AS DEFINIÇÕES DE BIOTECNOLOGIA
O impacto causado pelas primeiras experiências em Engenharia Genética estimulou numerosas
tentativas de redefinição do campo da Biotecnologia. Mediante a substituição da expressão
“intervenção de organismos vivos” por “utilização de processos celulares e moleculares” tratou-se de
diferenciar a Biotecnologia clássica da moderna. Porém, devido à enorme difusão das técnicas de
manipulação gênica, elas acabam se superpondo, e, fora do contexto histórico, é difícil distinguir o
limite entre ambas.
Por outro lado, como a definição de um setor de atividades depende dos interesses dos grupos
envolvidos, muitas vezes reflete a visão dos setores profissionais predominantes. Por isso, se
revisitarmos os textos da década de 1980, anos em que a expressão “biotecnologia” se expande,
encontraremos mais de uma dúzia de definições diferentes do termo. Levantamos, entre as definições
encontradas com maior frequência, as seguintes:
o OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicação dos princípios da
ciência e da engenharia no tratamento de matérias por agentes biológicos na produção de bens e
serviços (1982).
o OTA – Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer
técnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar
plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usos específicos (1984).
o EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioquímica, da microbiologia e da
engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, células cultivadas animais ou
vegetais ou parte dos mesmos na indústria, na saúde e nos processos relativos ao meio ambiente
(1988).
o E.H. Houwink: o uso controlado da informação biológica (1989).
o BIO - Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia é "bio" + "tecnologia",
isto é o uso de processos biológicos para resolver problemas ou fazer produtos úteis (2003).
Observa-se que, com o tempo, o conceito ganha uma expressão mais simples. As definições mais
recentes não fazem mais referência aos processos tecnológicos envolvidos; talvez porque, além de
complexos e diversos, estes evoluam muito rapidamente.
Neste texto consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como uma atividade
baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biológicos para fazer produtos úteis
ou resolver problemas. Esta definição é suficientemente abrangente para englobar atividades tão
variadas como as de engenheiros, químicos, agrônomos, veterinários, microbiologistas, biólogos,
médicos, advogados, empresários, economistas etc. (Figura 1.1).
2
O QUE É BIOTECNOLOGIA?
O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA
Nascida nos laboratórios de Universidades e Centros de Pesquisa, onde ainda permanece, a
Biotecnologia se desenvolve também em empresas públicas e privadas de diferente porte, gerando
um segmento novo de empresas especializadas em plataformas tecnológicas avançadas que
disponibilizam insumos para as outras empresas.
Já não se trata de promessas ou de perspectivas futuras; os produtos e processos biotecnológicos
fazem parte de nosso dia a dia, trazendo oportunidades de emprego e investimentos. Incluem-se na
bioeconomia plantas resistentes a doenças, plásticos biodegradáveis, detergentes mais eficientes,
biocombustíveis, e também processos industriais menos poluentes, menor necessidade de pesticidas,
biorremediação de poluentes, centenas de testes de diagnóstico e de medicamentos novos (Tabela
1.1).
---------------FIGURA 1.1. O campo da Biotecnologia
Conhecimentos
Agentes biológicos
Ciência e tecnologia
Organismos, células, organelas, moléculas
BIOTECNOLOGIA
Fazer produtos úteis
Resolver problemas
TABELA 1.1. Produtos e serviços de origem biotecnológica, em diferentes setores
SETORES
TIPOS DE PRODUTOS OU SERVIÇOS
Energia
Etanol, biogás e outros combustíveis (a partir de biomassa).
Indústria
Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para outras indústrias
(têxtil, de detergentes etc.).
Meio ambiente
Recuperação de petróleo, biorremediação (tratamento de águas servidas e de lixo, eliminação
de poluentes).
Agricultura
Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenças, mudas de
árvores para reflorestamento. Plantas com características novas incorporadas (transgênicas):
maior valor nutritivo, resistência a pragas e condições de cultivo adversas (seca, salinidade etc.).
Pecuária
Embriões, animais com características novas (transgênicos), vacinas e medicamentos para uso
veterinário.
Alimentação
Panificação (pães e biscoitos), laticínios (queijos, iogurtes e outras bebidas lácteas), bebidas
(cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sódio,
adoçantes etc.); proteína de célula única (PUC) para rações, alimentos de origem transgênica
com propriedades novas.
Saúde
Antibióticos e medicamentos para diversas doenças, hormônios, vacinas, reagentes e testes
para diagnóstico, tratamentos novos etc.
3
http://bteduc.com
BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO
Por se tratar de uma coleção de tecnologias diversas, o uso das biotecnologias não se restringe
necessariamente aos países desenvolvidos. Existe um espaço que os países emergentes podem ocupar,
em função de suas riquezas naturais, desde que existam prioridades econômicas e políticas definidas
claramente. A condição fundamental é contar com instituições competentes que formem uma massa
crítica de pesquisadores e pessoal técnico treinado.
A China e a Índia contam hoje com uma indústria biotecnológica avançada e diversificada. Assim
como a América Latina, concentrada principalmente na Argentina, no Brasil, no Chile, na Colômbia, em
Cuba e no México. Países como Uruguai e Venezuela também têm atividade em algumas áreas, assim
como, em menor escala, Equador, Costa Rica, Paraguai, Peru e Bolívia. Na região, numerosas empresas
incidem em vários setores: meio ambiente e indústria, agroalimentos e pecuária, saúde animal e
humana.
No entanto, a Biotecnologia suscita ainda opiniões e sentimentos controversos. Enquanto alguns
setores a percebem como uma tecnologia baseada em um sólido conhecimento científico, para outros
se trata de uma atividade antinatural e perigosa. O enfrentamento de partidários e opositores ocorre
com menos frequência no terreno das razões que no das paixões, sejam elas políticas, religiosas ou
ideológicas. Ao discutir se a biotecnologia é progressista ou reacionária, boa ou ruim, se esquece que
o que caracteriza uma tecnologia é o uso que fazemos dela.
Produtos e processos inimagináveis cinquenta anos atrás entram em nosso cotidiano antes que os
alicerces científicos e tecnológicos correspondentes se insiram em nossa cultura, através de uma
divulgação ampla que atinja também o sistema educativo em todos os seus níveis. Não existe
possibilidade alguma de construir uma sociedade moderna se os seus integrantes ignorarem os
aspectos mais gerais de ciência e tecnologia. O desconhecimento aumenta o risco de rejeitar
tecnologias promissoras, capazes de abrir perspectivas novas, com vistas a um desenvolvimento
sustentável em áreas tão críticas como a saúde, a produção de alimentos, a energia e o meio ambiente.
A proposta deste livro é revisar os fundamentos das biotecnologias e mostrar como se aplicam em
diversos setores produtivos da sociedade, destacando como exemplos alguns empreendimentos
latino-americanos bem-sucedidos. Esperamos que ele seja de ajuda para todos os que nos
preocupamos com os alcances desta fascinante (r)evolução tecnológica.
A HISTÓRIA DA BIOTECNOLOGIA
A Tabela 1.2 reúne alguns dos mais importantes acontecimentos relacionados com a Biotecnologia.
---------------TABELA 1.2. A linha do tempo
DATA
ACONTECIMENTOS FUNDAMENTAIS
ANTIGUIDADE
Preparação e conservação de alimentos e bebidas por fermentação (pão, queijo, cerveja, vinho
e vinagre); cultivo de plantas (batata, milho, cevada, trigo etc.); domesticação de animais;
tratamento de infecções (com produtos de origem vegetal tais como pó de crisântemo e
derivados de soja com fungos).
IDADE MÉDIA
Século XII
4
Destilação do álcool.
IDADE MODERNA
Século XVI
Cronistas registram a colheita de algas para alimentação, nos lagos do México, pelos astecas.
Século XVII
Início da produção comercial de cerveja; extração de metais por ação microbiana na Espanha;
cultivo de fungos na França; Hooke descobre a existência de células (1665).
Século XVIII
Invento da máquina a vapor (1752). A partir de 1750, cresce o cultivo de leguminosas na Europa
e se difunde a prática de rotação de cultivos, aumentando a produtividade e melhorando o uso
da terra.
IDADE CONTEMPORÂNEA
1797
Jenner inocula uma criança com um vírus que o protege contra a varíola.
1809
Appert utiliza o calor para esterilizar e conservar comida, processo que será utilizado nas
campanhas napoleônicas.
1835 a 1855
Schleiden, Schwann e Virchow enunciam a teoria celular.
1863 a 1886
Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas propriedades
organolépticas (Pasteurização, 1863), derruba a teoria da abiogênese (1864), investiga as
doenças do bicho-da-seda (1865), identifica a levedura como o agente responsável pela
fermentação alcoólica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinas contra o antraz
e a cólera (1881), faz os primeiros testes de uma vacina contra a raiva (1881). Paralelamente,
Koch inicia o desenvolvimento de técnicas fundamentais para o estudo dos microrganismos
(1876) e enuncia quatro postulados sobre os agentes infecciosos como causa de doenças. Em
1865 Mendel apresenta o seu trabalho “Experiências de hibridização em plantas”.
1887
Inauguração em Paris do Instituto Pasteur.
1892
Descoberta do vírus do mosaico do tabaco; introdução do trator na agricultura.
1897
Büchner mostra que enzimas extraídas da levedura podem transformar açúcar em álcool.
1899
Primeiro transplante de um órgão: o rim de um cachorro a outro cachorro.
1900
Redescobrimento das leis da hereditariedade, já enunciadas por Mendel em 1865, porém
esquecidas.
1905
O primeiro transplante de córnea se realiza com sucesso; isto porque a córnea não tem
antígenos.
1906
Ehrlich descobre o primeiro agente quimioterápico, chamado Salvarsan, que será utilizado
contra sífilis.
1910
Em Manchester, na Inglaterra, começam a ser introduzidos os sistemas de purificação de esgoto
baseados na atividade microbiana.
1912 a 1914
Rhöm obtém a patente de uma preparação enzimática para a lavagem de roupas; Weizmann
consegue a produção de acetona e butanol por microrganismos.
1915
Morgan publica “Mechanism of Mendelian Heredity”.
1916
Imobilizam-se as enzimas, uma técnica que facilita sua utilização em processos industriais.
1918
Morrem de gripe espanhola mais de vinte milhões de pessoas, um número de vítimas superior
ao da Primeira Guerra Mundial. Constroem-se biodigestores para a produção de metano (China
e Índia).
1919
O engenheiro agrícola húngaro Ereky utiliza pela primeira vez a palavra biotecnologia.
1927
Muller descobre que os raios X causam mutações.
1928
F. Griffith descobre a transformação, isto é, a transferência de informação genética de uma
linhagem bacteriana a outra.
1933
Comercialização do milho híbrido, isto é, de sementes de milho mais produtivas.
1936
Obtenção de ácido cítrico por fermentação.
1938
Na França, produção comercial de um biopesticida (Bacillus thuringiensis).
5
1940 a 1950
6
http://bteduc.com
Avanços na mecanização do trabalho agrícola.
1944
Produção em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida por
Florey e Chain).
1951
Inseminação artificial de gado utilizando sêmen congelado. Descoberta da presença de genes
saltatórios no milho por Bárbara Mc Clintock.
1953
J. D. Watson e F. Crick propõem o modelo (dupla hélice) da estrutura do DNA.
1958
L.Stevens reconhece a existência de células de camundongo pluripotentes.
1959
Reinart regenera plantas de cenoura a partir de uma cultura de células (calo).
1960
Aumento da produção de ácido láctico, ácido cítrico, acetona e butanol por via fermentativa.
1961
Descoberta do código genético. Desenvolvimento de uma protease alcalina para uso em sabões
para a lavagem de roupas pela empresa dinamarquesa Novo. Inicia-se o cultivo in vitro de
células-tronco embrionárias pluripotentes.
1962
Plantio de novas variedades de trigo mais produtivas, no México, dando início ao que será
chamado de Revolução Verde.
1965
Hayflick observa que as células cultivadas se dividem um número finito de vezes antes de
morrer.
1967
Primeiro transplante de coração, na África do Sul; o paciente sobrevive 18 dias.
1968
Produção industrial de aminoácidos utilizando enzimas imobilizadas.
1973
Havendo desenvolvido técnicas de corte e reunião do DNA, Cohen e Boyer transferem um gene
a um organismo de outra espécie. Lançado no Brasil o programa de produção de álcool a partir
de biomassa (Proálcool).
1975
G. J. F. Köhler e C. Milstein desenvolvem a tecnologia de hibridomas e obtêm anticorpos
monoclonais. A empresa Novo produz xarope com alto conteúdo de frutose por via enzimática
como adoçante alternativo à sacarose.
1975
A Conferência de Asilomar pede ao National Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas
normas para a regulação dos experimentos com DNA-recombinante, o que acontecerá meses
mais tarde.
1976
Utilização da técnica de hibridização molecular no diagnóstico pré-natal da alfa talassemia.
1977
F.Sanger e W.Gilbert elaboram o primeiro método de sequenciamento do DNA.
1978
Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnológica, fundada um ano antes por Boyer e
Swanson, obtém a proteína somatotropina (hormônio de crescimento) mediante a tecnologia
do DNA-recombinante. Nasce na Inglaterra Louise Brown, o primeiro bebê de proveta.
1979
Produção do hormônio de crescimento humano, utilizando a tecnologia do DNA-recombinante.
1980
A Suprema Corte de Justiça dos Estados Unidos aprova o princípio de patentes para as formas
de vida de origem recombinante. As primeiras patentes são de A. N. Chakrabarty, para um
microrganismo para biorremediação de petróleo, e de H. Cohen e S.Boyer, pelo processo de
1973. Erradicação da varíola.
1982
A insulina humana de origem recombinante da Genentech, Inc. é comercializada. Uma licença
será obtida mais tarde pela empresa Eli Lilly, que a venderá com o nome de Humulina®. A
primeira vacina de DNA-recombinante para o gado é comercializada na Europa. S. Prusiner
descobre os príons.
1983
Realizam-se as primeiras experiências de Engenharia Genética em plantas (petúnia). Syntex
Corporation recebe a aprovação da Food and Drug Administration (FDA) de um teste para
Chlamydia trachomatis baseado na utilização de anticorpos monoclonais. Isolado o vírus HIV no
Instituto Pasteur (França) e no NIH (National Institute of Health, Estados Unidos). Anunciada a
obtenção das primeiras plantas geneticamente modificadas por quatro grupos independentes
da Universidade de Washington (St. Louis), a empresa Monsanto (Missouri), e a Universidade de
Gent (Bélgica). K. Mullis aporta modificações fundamentais à técnica da Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR).
1984
A. Jeffreys introduz a técnica do Fingerprint (impressões digitais), que, um ano depois, será
utilizada pelos tribunais para a identificação de suspeitos. Clonagem e sequenciamento do
genoma do HIV pela empresa Chiron Corp.
1986
A Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos aprova a liberação de plantas de
tabaco transgênicas. Um grupo de especialistas em segurança em Biotecnologia da Organização
para a Cooperação Econômica e o Desenvolvimento (OECD) declara que a previsibilidade das
mudanças genéticas obtidas por Engenharia Genética é frequentemente maior que a
correspondente às técnicas tradicionais, e que os riscos associados com organismos transgênicos
podem ser avaliados do mesmo modo que os riscos associados aos outros organismos. Aprovada
a primeira vacina biotecnológica para uso humano, trata-se de Recombivax-HB, contra a
hepatite B. alfa interferon para tratamento de câncer (Biogen)
1987
Advanced Genetic Sciences libera em campo bactérias DNA-recombinante (Frostban) que
inibem a formação de gelo nos cultivos de morango, na Califórnia; a FDA aprova o fator ativador
de plasminogênio, obtido por engenharia genética, para o tratamento de ataques cardíacos.
1988
A Universidade de Harvard obtém a patente de um rato transgênico desenvolvido especialmente
para o estudo do câncer; na mesma década, os europeus obterão a patente de outro rato
transgênico, sensível a substâncias carcinogênicas. Genencor International Inc. obtém a patente
de um processo que permite obter enzimas (proteases) resistentes a alvejantes (processo
bleach) para a fabricação de sabões para a lavagem de roupa.
1989
Com a criação do National Center for Human Genome Research se inicia o mapeamento do
genoma humano. Amgem libera o Epogen para tratamento de anemia.
1990
Primeira experiência de terapia gênica para uma doença rara (ADA) em uma menina de 4 anos.
Pfizer comercializa Chy-Max TM, uma enzima de origem recombinante para a preparação de
queijos. GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgênica que produz no leite
proteínas humanas para alimentação infantil. A Universidade da Califórnia (UCSF) e a
Universidade de Stanford contabilizam 100 patentes relativas ao DNA-recombinante. Aplicação
da cultura de células na produção de agentes bioterapêuticos.
1991
Obtida por engenharia genética a enzima β-glucorcerebrosidase para a doença de Gaucher
(Genzyme). Affymax lança os primeiros chips de DNA.
1992
Uma técnica, elaborada por cientistas americanos e britânicos, permite testar anormalidades
como a fibrose cística e a hemofilia em embriões in vitro. A FDA declara que os alimentos de
origem transgênica não demandam uma regulação especial. Convenção Internacional sobre
Diversidade Biológica (CDB).
1993
Aprovada a utilização do hormônio de crescimento bovino rBGH/rBST, produzido por Monsanto
Co., para aumentar a produção de leite.
1994
Lançamento no mercado do tomate FlavSavr®, que, devido à inativação de um gene, amadurece
na planta.
1995
Decifrado o primeiro genoma de uma bactéria, Haemophilus influenzae.
1996
Sequenciado o primeiro genoma de um organismo eucarionte, a levedura Saccharomyces
cerevisiae. Desenvolve-se o primeiro GeneChip (Stanford, Affymetrix). Isolamento e cultivo das
primeiras células-tronco extraídas de embriões humanos supernumerários originados por
fecundação in vitro.
1997
No Reino Unido, nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segunda ovelha,
Polly, clonada e geneticamente modificada. Os cultivos transgênicos são introduzidos em vários
países.
1998
Contabilizam-se mais de 1.500 empresas de Biotecnologia nos Estados Unidos e mais de 3.000
no mundo. Células-tronco embrionárias são utilizadas para regenerar tecidos. Sequenciamento
do primeiro genoma animal, o verme Caenorrabditis elegans. Isolada a primeira linhagem de
células-tronco embrionárias humanas. A.Z. Fire e C. Mello descobrem o silenciamento gênico, a
resposta antiviral a um RNA de filamento duplo.
1999
Sequenciamento do primeiro cromossomo humano. Pesquisadores descobrem que as célulastronco podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tipos celulares.
7
8
http://bteduc.com
2000
O rascunho do sequenciamento do genoma humano é anunciado simultaneamente por Collins,
do Consórcio do Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc. Sequenciados também o genoma da
mosca Drosophila melanogaster, o primeiro genoma de uma planta (Arabidopsis thaliana) e, no
Brasil, o de uma bactéria que ataca os cítricos (Xylella fastidiosa). Protocolo de Cartagena.
Moratória relativa ao uso da tecnologia Terminator, previamente patenteada por Delta&Pine.
2001
O rascunho do sequenciamento do Genoma Humano é publicado simultaneamente nas revistas
Science e Nature. Sequenciamento do genoma de plantas de interesse agronômico para os
países em desenvolvimento (arroz, banana). Sequenciamento do genoma de bactérias de
importância agronômica. Obtenção de células sanguíneas a partir de células-tronco
embrionárias.
2002
Completados o rascunho do proteoma funcional da levedura e o sequenciamento do genoma
do agente e do vetor transmissor da malária. Identificam-se mais de 200 genes envolvidos na
diferenciação das células-tronco. Descoberta da participação de moléculas de RNA na regulação
de vários processos celulares. Em diversos países inicia-se a utilização de células-tronco adultas
para o tratamento experimental de diversas doenças (leucemia, mal de Chagas, diabetes e
anemia falciforme).
2003
Comercialização como mascote, do GloFish, um peixe transgênico que brilha na escuridão,
originalmente criado para detectar poluentes. Clonagem de vários tipos de animais e de espécies
ameaçadas de extinção. O Genoma Humano é completado. O Massachussets Institute of
Technology (MIT) organiza a primeira iGEM (International Genetically Engineered Machine).
2004
Comercialização de novos medicamentos (Avastin® ou bevacizumab) e testes de diagnósticos.
Comercialização do peixe GloFish.
2005
Publicação dos resultados do projeto HApMap com o mapa das variações do Genoma Humano.
2006
O grupo de pesquisadores liderado por S. Yamanaka consegue induzir a pluripotencialidade
celular em células somáticas. Criada a Biobricks Foundation, um registro de Partes Biológicas
Standard - Open Source. Mantida a moratória sobre a tecnologia Terminator (Curitiba).
2007
As autoridades europeias de segurança alimentar concluem que os genes marcadores de
resistência aos antibióticos não apresentam riscos relevantes para a saúde humana ou animal
nem para o meio ambiente. Vacina contra o papilomavírus humano: primeira vacina contra o
câncer. Nova técnica mais eficiente de sequenciamento.
2008
Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul, geneticamente modificada.
Plataformas next generation diminuem os custos e aumentam a velocidade do sequenciamento.
Uma equipe de pesquisadores de Harvard cria linhagens de células-tronco para 10 doenças
genéticas.
2009
Um grupo internacional obtém as primeiras células-tronco iPS, sem utilizar virus.
Comercialização de soja com alta concentração de ômega 3, o primeiro alimento biofortificado.
2010
Autorizada na União Europeia a comercialização da batata transgênica Amflora (Basf) para uso
industrial. Pesquisadores do Instituto Craig Venter constroem a primeira célula sintética.
Desvendado o genoma do Neanderthal. Primeiro teste clínico com células-tronco.
2012
Publicação dos resultados do Projeto ENCODE descrevendo as regiões ativas do genoma
humano. J.Doudna e E. Charpentier descrevem a técnica CRISPR-Cas de edição de genomas.
2013
F.Zangh mostra que CRISPR/Cas9 também funciona em células de mamíferos, inclusive
humanas.
2014
Publicado o primeiro rascunho do proteoma humano.
CAPÍTULO 2
CÉLULAS E CROMOSSOMOS
A CÉLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS
UNIDADE ESTRUTURAL
A célula é a unidade estrutural dos seres vivos. Trate-se de bactérias, amebas,
espermatozoides ou neurônios, todas as células são formadas por água, íons inorgânicos e
moléculas orgânicas (proteínas, carboidratos, lipídios e ácidos nucleicos). E todas elas
apresentam uma membrana plasmática que separa o citoplasma do meio externo e permite
o intercâmbio de moléculas entre ambos.
As células procarióticas se encontram exclusivamente no reino Monera. Pequenas (0,001 a
0,005 mm) e com requerimentos nutricionais simples, estas células se multiplicam
rapidamente. A informação genética se encontra em um cromossomo circular formado por
uma molécula de DNA e associado a uma invaginação da membrana plasmática (mesossomo).
Pequenas moléculas circulares adicionais (plasmídeos) podem também estar presentes.
Numerosos ribossomos asseguram a síntese proteica (Figura 2.1).
Bem mais complexa é a estrutura das células eucarióticas, presentes nos quatro reinos
restantes (Protista, Fungo, Planta e Animal). Com um tamanho variando entre 0,01 e 0,10 mm,
estas células são dez vezes maiores que as procarióticas. A presença de compartimentos
diferenciados, ou organelas, que cumprem atividades específicas, resulta em uma subdivisão
do trabalho que garante a eficiência do funcionamento celular (Figura 2.2).
O citoplasma é percorrido por um sistema de membranas, o retículo endoplasmático, que
está associado aos ribossomos e, por conseguinte, à síntese de proteínas. Processados no
aparelho de Golgi, os produtos celulares são secretados ou distribuídos em outras estruturas
(lisossomos, membrana celular).
O metabolismo energético está associado a organelas citoplasmáticas, complexas e
rodeadas de membranas (mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos). Um citoesqueleto,
formado por túbulos e filamentos proteicos, mantém a forma da célula, além de assegurar o
transporte interno das organelas e os movimentos celulares. A informação genética está
distribuída em cromossomos, cada um deles formado por uma molécula linear de DNA
associada a proteínas.
http://bteduc.com
FIGURA 2.1. Representações esquemáticas da estrutura celular
Célula procariótica (bacteriana)
Célula eucariótica (vegetal)
Célula eucariótica (animal)
10
Os cromossomos e o nucléolo se encontram no núcleo, que funciona como um centro de controle
celular. A membrana nuclear, um envoltório com poros que separa o núcleo do citoplasma, permite o
intercâmbio de substâncias entre ambos.
Apesar de ter uma organização muito parecida, as células animais diferem das células vegetais em
alguns aspectos (Tabela 2.1). Nas células vegetais encontramos uma parede celular ao redor da
membrana plasmática; o citoplasma contém cloroplastos, onde ocorre a fotossíntese, e grandes
vacúolos, onde se armazenam substâncias e degradam macromoléculas. Nenhuma dessas estruturas
se observa nas células animais; estas têm um centríolo que falta nas células vegetais.
A célula também é a unidade funcional de um organismo. O citoplasma é uma solução viscosa onde
continuamente ocorrem reações de síntese e degradação de substâncias, consumindo ou liberando
energia. Estas reações constituem o que denominamos metabolismo.
---------------TABELA 2.1. A função e a distribuição das estruturas celulares
Estrutura
FUNÇÃO
CÉLULA BACTERIANA
CÉLULA
ANIMAL
CÉLULA
VEGETAL
Parede celular
Manutenção da forma e
proteção da célula.
Presente ou ausente
Ausente
Presente
Membrana plasmática
Manutenção da
estabilidade do meio
intracelular; controle das
trocas entre a célula e o
meio extracelular.
Carioteca ou
membrana nuclear
Controle do fluxo de
substâncias entre o
núcleo e o citoplasma.
Cromossomo(s)
Presente
Ausente
Presente
Controle da estrutura e
do funcionamento celular.
Único e circular;
apenas DNA.
Múltiplos e lineares; DNA e
proteínas.
Nucléolo(s)
Formação de ribossomos.
Ausente(s)
Presente(s)
Centríolos
Formação de cílios e
flagelos; participação na
divisão celular.
Ausentes
Ribossomos
Síntese de proteínas.
Retículo endoplasmático rugoso
Síntese de proteínas.
Retículo endoplasmático liso
Síntese de lipídios;
armazenamento e
inativação de substâncias.
Presentes
Ausentes
Presentes
Ausentes
Complexo de Golgi
Secreção celular.
Mitocôndrias
Respiração celular
aeróbia.
Vacúolo central
Equilíbrio osmótico e
armazenamento.
Lisossomos
Digestão intracelular.
Cloroplastos
Fotossíntese.
Ausentes
Citoesqueleto
Manutenção da forma
celular; contração e
ancoragem de organelas.
Ausente
Presentes
Ausente
Presente
Presentes
Ausentes
Ausentes
Presentes
Presente
11
http://bteduc.com
UNIDADE FUNCIONAL
As reações metabólicas são facilitadas por proteínas com atividade catalítica, denominadas enzimas.
Assim como as proteínas estruturais, as enzimas se sintetizam nos ribossomos, que são pequenos
componentes citoplasmáticos, não membranosos. A estrutura das proteínas depende da informação
genética codificada no ácido desoxirribonucleico (DNA), transcrita no ácido ribonucleico (RNA) e
traduzida nos ribossomos.
As semelhanças de estrutura e funcionamento celulares decorrem de uma origem evolutiva
comum, aproximadamente 3,8 bilhões de anos atrás. Os dois tipos celulares que reconhecemos hoje,
as células procarióticas e as eucarióticas, apareceram entre um e um bilhão e meio de anos mais tarde.
TÉCNICAS LABORATORIAIS
O estudo das células se vê facilitado por um conjunto de técnicas laboratoriais, tais como:
o Técnicas microscópicas que permitem uma visualização detalhada da célula.
-
Microscopia óptica, que se utiliza para observar os cortes de tecidos. Geralmente, estes são fixados
(álcool, ácido acético, formaldeído) e tingidos com corantes que reagem com as proteínas ou com os
ácidos nucleicos, aumentando o contraste da imagem.
-
Microscopia de contraste de fase, que transforma as diferenças de espessura ou de densidade do
fragmento observado em diferenças de contraste.
-
Microscopia fluorescente, que associa anticorpos específicos a um reagente como o PVF (proteína verde
fluorescente de medusa), de forma a marcar as moléculas e visualizar sua distribuição nas células.
-
Microscopia confocal, que combina a microscopia fluorescente com a análise eletrônica da imagem,
fornecendo uma imagem tridimensional.
-
Microscopia eletrônica, que permite a observação em um plano de cortes tingidos com sais de metais
pesados (microscopia de transmissão) e a observação tridimensional de células (microscopia de
varredura).
-
Microscopia de tunelamento, com os diversos tipos de microscópios de varredura por sonda (SPM, do
inglês scanning probe microscope) que, além de fornecer uma imagem de moléculas e átomos,
permitem medições e a manipulação de moléculas e átomos.
-
Nanoscopia, baseada na utilização de moléculas fluorescentes, permite a visualização de moléculas
individuais dentro da célula viva (STED, do inglês Stimulated emission depletion microscopy; SMM, do
inglês single-molecule microscopy).
o Técnicas físicas como a centrifugação diferencial (ultracentrifugação, centrifugação em gradiente)
para separar os componentes celulares para estudos bioquímicos posteriores.
o Técnicas instrumentais que possibilitam a contagem de células e a separação de populações
celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter).
o Técnicas de cultura de células com objetivos diversos.
TODA CÉLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE
Assim como uma planta se forma a partir de outra planta e um animal de outro animal, toda célula
deriva de outra preexistente. Este conceito, enunciado por R. Virchow em 1855, não foi plenamente
12
aceito até dez anos mais tarde, quando L. Pasteur mostrou experimentalmente que a proliferação de
microrganismos em um meio orgânico estéril se deve à contaminação deste com os microrganismos
presentes no ar, que, ao encontrar um meio propício, se multiplicam rapidamente.
Todo organismo multicelular resulta da multiplicação de uma única célula-ovo ou zigoto. As células
embrionárias diferenciam-se, formando centenas de tipos celulares com funções específicas, cuja
integração assegura a unidade do organismo. Nos vegetais, a persistência de tecidos embrionários
totipotentes (meristemas) na planta adulta permite o crescimento e a regeneração durante a vida toda
do organismo. Em condições apropriadas, células especializadas podem reverter a um estado não
diferenciado com a capacidade de regenerar um organismo completo. Nessa propriedade se
fundamenta a propagação de plantas in vitro.
Nos animais superiores, a totipotência se restringe às células do embrião com menos de quatro
dias, que são as únicas capazes de regenerar um organismo inteiro. Contudo, uma vez passado esse
período, algumas células internas pluripotentes do blastócito (células-tronco embrionárias) conservam
a capacidade de originar todos os tecidos do organismo (Figura 2.2).
Algumas células-tronco permanecem nos tecidos adultos, onde se multiplicam durante longos
períodos de tempo sem que ocorra a diferenciação. Estas células têm sido encontradas em órgãos
como a medula óssea e o cordão umbilical, o sangue, a córnea e a retina, a polpa dentária, o fígado, a
pele, o trato digestivo e o pâncreas.
Em determinadas condições fisiológicas, as células-tronco adultas originam células especializadas
de vários tipos que asseguram a manutenção e o reparo do tecido onde se encontram. Um único tipo
de célula-tronco multipotente da medula óssea, por exemplo, gera todas as células sanguíneas
(hemácias, leucócitos e plaquetas). Na pele, células-tronco unipotentes se diferenciam unicamente na
linhagem celular dos queratinócitos.
As células-tronco adultas encontraram rapidamente aplicações terapêuticas promissoras, como o
transplante de células-tronco hematopoéticas em casos de leucemia aguda ou de linfoma. Não
aconteceu o mesmo com as células-tronco embrionárias, cuja utilização está limitada a pesquisas e
estudos laboratoriais.
As células-tronco embrionárias podem ser extraídas de um embrião obtido por transferência de um
núcleo a um ovócito anucleado, ou dos embriões supranumerários congelados nas clínicas de
fertilização assistida. Os dois métodos suscitaram grandes debates éticos em torno de quem forneceria
os ovócitos e do status do embrião.
---------------FIGURA 2.2. As células-tronco embrionárias
As células-tronco embrionárias extraídas do blastócito (5 a 7 dias) e cultivadas in vitro diferenciam-se, em
condições experimentais adequadas, nos diferentes tipos celulares.
Espermatozóides
Massa interna de células
Células de pâncreas
Óvulo
Células de
medula óssea
Zigoto
Blastocisto (corte)
5 a 7 dias
Cultura de
células-tronco
embrionárias
Células de
músculo cardíaco
13
http://bteduc.com
A polêmica esmoreceu em 2006 com o desenvolvimento, por K. Takahashi e S. Yamanaka, da
tecnologia que permite, a partir de células somáticas, obter células iPS (do inglês, induced pluripotent
stem cells). Com algumas pequenas diferenças na expressão gênica, suas propriedades são
semelhantes às das células-tronco embrionárias. A indução de pluripotencialidade mediante a inserção
de alguns genes em células adultas é um passo importante, porque acaba com a necessidade de utilizar
embriões congelados.
Ainda no terreno laboratorial, a tecnologia de reprogramação celular se desenvolve rapidamente,
aumentando nosso conhecimento sobre o controle genético da diferenciação e abrindo uma nova
senda para a implementação de testes, medicamentos e tratamentos novos. Entender os mecanismos
que controlam o crescimento e a diferenciação celular é um dos maiores desafios atuais, porque as
células-tronco possibilitarão novos tratamentos de regeneração celular para doenças cardíacas,
diabetes e doença de Parkinson.
---------------FIGURA 2.3: Os cromossomos
Os nucleossomos são pequenas unidades estruturais que se repetem ao longo do cromossomo, formando a
cromatina. Sua condensação explica que 2 m de DNA estejam concentrados em um núcleo de 5 µm de diâmetro.
A – Morfologia do cromossomo
B- Estrutura da cromatina
DNA
Genes
Centrômero
DNA enrolado sobre as histonas (nucleossomos)
Cromátides
irmãs
Sem duplicar
Nucleossomos compactados (cromatina)
Duplicado
C. Representação dos cromossomos humanos
(Cariótipo)
O arranjo segue uma classificação convencional que leva
em conta o tamanho, a posição do centrômero
(tracejado no esquema) e o padrão das bandas de cada
cromossomo.
Fonte:
http://www.molecularstation.com/molecular-biologyimages/data/502/karyotype.png
14
OS CROMOSSOMOS
A observação microscópica dos cromossomos durante a divisão celular permite diferenciá-los pelo
tamanho e a posição do centrômero, uma constrição que os divide em dois braços. Cada cromossomo
está composto por um filamento de DNA enrolado a espaços regulares sobre várias proteínas
(histonas), formando pequenas estruturas denominadas nucleossomos. No resto do ciclo celular, os
cromossomos distendidos formam uma rede de filamentos finos, denominada cromatina, (Figura 2.3).
O número de cromossomos (n) é constante em todos os indivíduos de uma mesma espécie: n = 4
em Drosophila melanogaster e n = 23 no homem, por exemplo. Como nas células somáticas, os
cromossomos se encontram sempre em pares; na espécie humana, o número de cromossomos (2n) é
de 46, sendo que um par determina o sexo. Os cromossomos sexuais são idênticos na mulher (46, XX)
e diferentes no homem (46, XY). Em outras espécies, a determinação do sexo segue mecanismos
diversos.
Um pouco antes da divisão de uma célula, os cromossomos se duplicam, de modo que cada uma
das células filhas receba (2n) cromossomos. A mitose mantém constante o número de cromossomos
nas células somáticas dos indivíduos de uma mesma espécie.
Já nas células reprodutivas, a meiose reduz a (n) o número de cromossomos. Durante o processo,
o entrecruzamento dos cromossomos permite a permuta de material e a recombinação dos genes
(Figura 2.4). Na fecundação, a fusão dos gametas restaura o número (2n) característico da espécie.
Durante a formação dos gametas podem ocorrer erros na disjunção dos cromossomos, dando
origem a indivíduos com fórmulas cromossômicas alteradas. Na síndrome de Down, por exemplo, a
pessoa apresenta geralmente um cromossomo 21 supranumerário (mulheres 47, XX + 21; homens 47,
XY + 21).
Estima-se que a percentagem de recém-nascidos com alguma anomalia cromossômica estaria em
torno de 0,85%, dos quais só alguns apresentariam algum sintoma. Alterações cromossômicas também
podem ser relacionadas com alguns tipos de câncer. Na leucemia mieloide crônica, por exemplo,
observa-se a translocação recíproca de dois pedaços dos cromossomos 9 e 22. De um modo geral, é
frequente encontrar alterações no número de cromossomos das células cancerosas.
A TEORIA CROMOSSÔMICA DA HEREDITARIEDADE
Em 1865, Gregor Mendel apresentou seu trabalho “Experiências de hibridização em plantas”; este
reunia os resultados experimentais realizados com ervilhas (Pisum sativum), durante sete anos, no
jardim do monastério Agostino de Brno (Morávia).
Apesar de passar quase despercebido, o trabalho acabou sendo distribuído por várias bibliotecas
da Europa e América, graças a sua publicação, um ano mais tarde, nos Anais da Sociedade de História
Natural.
No texto figuram algumas generalizações. Conhecida como Primeira Lei de Mendel, Lei de
Segregação ou Monoibridismo, a primeira delas se refere à segregação dos fatores (alelos) de um par
(um gene) na formação de gametas. A segunda, que é conhecida como Segunda Lei de Mendel, Lei de
Segregação Independente ou Diibridismo, se refere à segregação dos fatores (alelos) de dois ou mais
pares (dois ou mais genes) independentes na formação de gametas.
Em 1900, depois de chegar de maneira independente a conclusões semelhantes, os pesquisadores
K. Correns, E. Von Tschermak e H.de Vries redescobriram nas bibliotecas o trabalho de Mendel. Nesse
intervalo de 35 anos tinha sido descrita a divisão celular (mitose, 1875; meiose, 1890); o próximo passo
correspondeu a Sutton e Boveri (1902), sugerindo que os fatores hereditários de Mendel estariam nos
cromossomos.
15
http://bteduc.com
A confirmação desta hipótese decorreu dos trabalhos de T.H.Morgan e sua brilhante equipe na
Universidade de Columbia (Nova York), com a mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Em 1910,
depois de uma série de cruzamentos e de análises estatísticas, Morgan mostrou que a herança da cor
branca do olho do mutante white está associada à transmissão do cromossomo X, que determina o
sexo.
Morgan e seus colaboradores identificaram numerosos outros mutantes de Drosophila
melanogaster com um padrão mendeliano de hereditariedade. Além de moscas com olhos brancos em
vez de vermelhos, encontraram outras com asas curtas em vez de longas, com corpo de cor marrom
ou preta em vez de amarela etc. Os genes correspondentes foram classificados em quatro grupos de
ligação, sendo que cada um deles está associado a um dos quatro pares de cromossomos da
Drosophila.
Como durante a meiose se produzem permutas entre segmentos cromossômicos, nos cruzamentos
aparecem indivíduos recombinantes, isto é, com outras combinações gênicas diferentes das previstas
pelas leis mendelianas (Figura 2.4). A partir dos dados obtidos em milhares de cruzamentos sobre a
recombinação dos genes de um mesmo grupo de ligação chega-se a estabelecer a distância genética
entre eles.
---------------FIGURA 2.4. Mitose e meiose
MEIOSE
16
MITOSE
EIOSE
Com a descoberta de células com cromossomos gigantes (politênicos) nas glândulas salivares das
larvas de drosófila, começaram os primeiros trabalhos de mapeamento. A observação microscópica
das bandas nos cromossomos mostrou, com enorme riqueza de detalhes, uma sucessão consistente
de bandas largas e estreitas. Da associação entre os métodos genéticos e os métodos citológicos
surgiram os primeiros mapas físicos, associando uma região cromossômica a cada gene.
Das descobertas de Morgan e sua equipe, nasce a Teoria Cromossômica da Hereditariedade ou
Teoria do Gene, segundo a qual:
o Os caracteres de um indivíduo correspondem a elementos pares, os genes.
o Os genes estão ligados uns aos outros nos cromossomos, formando um determinado número de
grupos de ligação.
o Os genes de cada par se separam durante a gametogênese, de acordo com a Primeira Lei de Mendel
e, em consequência, cada gameta fica contendo apenas um conjunto de genes.
o Os genes pertencentes a grupos de ligação diferentes segregam independentemente, de acordo
com a Segunda Lei de Mendel.
o Entre os elementos pertencentes a cada grupo de ligação, ocorre uma troca ordenada chamada
permuta ou crossing-over, que leva à recombinação dos genes (Figura 2.4). A frequência da
permuta fornece a prova da linearidade dos genes em cada grupo de ligação e permite determinar
sua posição relativa.
AS PRIMEIRAS MANIPULAÇÕES GÊNICAS
Na genética clássica, um caráter pode ser considerado hereditário quando duas variações fenotípicas
podem ser atribuídas a dois alelos de um mesmo gene. Os primeiros mutantes de Drosophila
apareceram por acaso e em uma frequência tão baixa que limitava os estudos de análise genética. Era
necessário encontrar um método que acelerasse a obtenção de mutantes para poder avançar. Já na
década de 1920, H. Muller, um dos integrantes do “grupo das moscas” liderado por Morgan, iniciou os
experimentos de exposição das drosófilas a diferentes tipos de radiação.
O tratamento gerou em poucas semanas mais de 100 mutantes, um número equivalente à metade
dos mutantes espontâneos encontrados nos 15 anos anteriores. A radiação podia causar pequenas
mutações de ponto, afetando um único gene e originando uma pequena variação fenotípica. Contudo,
os efeitos da radiação também podiam ser letais para a descendência e/ou produzir vários tipos de
alterações cromossômicas: translocações, inversões, deleções, duplicações.
Muller viu claramente a importância do tratamento com radiação para a obtenção de novas
variáveis vegetais e no melhoramento agrícola; datam dessa época as primeiras mutações em plantas
de milho. A radiação é utilizada como agente mutagênico até os dias de hoje, sendo uma prática
considerada aceitável pelos agricultores orgânicos.
Percebendo o risco que a manipulação indiscriminada da radiação representava para o ser humano,
Muller teve um rol preponderante na conscientização dos trabalhadores da indústria e da saúde sobre
medidas de proteção e participou ativamente nas campanhas antinucleares das décadas de 19401950.
NATURE vs NURTURE
Assim como muitos outros posteriores, os estudos da equipe de Morgan mostraram a complexidade
dos padrões de hereditariedade, que incluem casos de:
17
http://bteduc.com
o Alelismo múltiplo, quando um gene admite múltiplos alelos; dominantes, recessivos ou
codominantes (Sistema ABO, por exemplo).
o Pleiotropia, quando um gene determina diversos caracteres (pelagem e sobrevivência em ratos,
por exemplo).
o Herança poligênica, quando um caráter está determinado por vários genes de efeito cumulativo
(altura, cor dos olhos).
o Interação gênica, quando uma característica depende da ação de muitos genes.
Contudo, a variação observada nos seres vivos não se deve exclusivamente à hereditariedade: o
desenvolvimento de um ser vivo resulta de uma delicada inter-relação entre os genes e o ambiente.
No século XX, duas interpretações extremas sobre sua importância relativa causaram grandes danos à
humanidade.
Uma delas é o determinismo genético, base ideológica do eugenismo, movimento que postula o
melhoramento genético do homem mediante a esterilização dos indivíduos considerados deficientes
físicos ou mentais, uma categoria que incluía também os desajustados sociais. Teve grande influência
nos Estados Unidos, na Inglaterra, nos países do Báltico, na Alemanha e no Japão.
No outro extremo, encontramos o determinismo ambiental, que, negando a influência dos genes,
se afirmou na União Soviética durante o período staliniano. Defendido por T. Lyssenko, esse preceito
foi uma das principais causas do fracasso da agricultura e da escassez de alimentos sofrida pela
população no período posterior à Segunda Guerra Mundial.
Em uma perspectiva histórica, os argumentos utilizados no debate atual sobre os organismos
geneticamente modificados conservariam algumas raízes nessa visão antagônica do século XX sobre
ciência burguesa reacionária vs ciência proletária progressista, ou ainda capitalismo-direitadeterminismo genético vs socialismo-esquerda-ambientalismo.
Para os geneticistas, o fenótipo de um indivíduo é o resultado da interação entre o genótipo e o
ambiente em que este se expressa. Os genes determinam o desenvolvimento dos seres vivos, mas
existem muitos traços que não são determinados exclusivamente pelos genes e dependem, em maior
ou menor grau, de influências ambientais.
CÉLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLÓGICOS
Um dos testes pioneiros de diagnóstico genético está baseado na observação microscópica dos
cromossomos de células somáticas durante a divisão celular (mitose). A identificação se vê facilitada
pela presença de regiões ou bandas reveladas mediante algumas técnicas de coloração. O número e a
estrutura dos cromossomos são analisados e apresentados em um arranjo (cariótipo) que segue uma
classificação convencional (Figura 2.3).
Os testes de diagnóstico genético envolvendo a análise de cariótipos estão amplamente difundidos
na prática médica, sendo facilitados atualmente pela utilização de corantes específicos para cada par
cromossômico.
Como agentes biológicos, as células encontram outras aplicações (Tabela 2.2). Células vegetais
cultivadas in vitro produzem substâncias de alto valor agregado, importantes para as indústrias
alimentar, cosmética e farmacêutica. Também são utilizadas para regenerar plantas. A multiplicação
de vírus em cultivos de células de insetos permite a comercialização de práticas de controle biológico.
A síntese de algumas substâncias importantes para a indústria farmacêutica, como o fator ativador
de plasminogênio, depende do cultivo in vitro de células animais. Estas também substituem os animais
nos testes toxicológicos e são utilizadas na multiplicação de vírus para a preparação de vacinas.
Também possibilitam a produção de anticorpos.
18
As células-tronco são ferramentas fundamentais na pesquisa básica sobre diferenciação celular. Sua
utilização tem permitido avanços notáveis nos testes de toxicidade, na triagem de medicamentos e na
modelagem de doenças.
Combinando as técnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biológicos
semelhantes ao colágeno, uma área nova de engenharia de tecidos visa a reparação ou substituição
de tecidos lesionados. Os enxertos de pele artificial, cultivada in vitro, saram ferimentos e/ou
queimaduras em seres humanos.
---------------TABELA 2.2. As células como agentes biológicos
Vegetais
Indústria alimentar e cosmética (adoçantes, corantes, flavorizantes e
aromatizantes).
Indústria farmacêutica (alcaloides e esteroides).
Estudos toxicológicos.
CÉLULAS
Animais
e/ou
humanas
Diagnóstico clínico e aconselhamento genético (cariótipos).
Indústria farmacêutica (produção de anticorpos e vacinas, testes de toxicidade,
triagem de medicamentos).
Medicina regenerativa (produção de tecidos de substituição).
19
CAPÍTULO 3
OS MICRORGANISMOS
A DIVERSIDADE MICROBIANA
O termo microrganismos se aplica a um grupo heterogêneo de seres que vivem como células
independentes ou como agregados celulares: bactérias, arqueas, protozoários, algas e fungos e,
também, vírus (Tabela 3.1). Salvo estes últimos, que estão na fronteira entre o vivo e o não vivo, os
encontramos dentro dos três domínios em que se classificam os seres vivos: Bacteria, Archaea e
Eukarya.
Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida. Alguns
são procariontes, como as bactérias; outros eucariontes, como os protozoários, as algas e os fungos.
Os aeróbios crescem se houver oxigênio, os anaeróbios, se não o houver. Formas livres colonizam
todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas até as profundidades dos oceanos. Mas
há também parasitas que crescem à custa de outros seres vivos, onde encontram abrigo e alimento, e
os que mostram diversos graus de dependência de outros seres vivos.
---------------TABELA 3.1. Os microrganismos dentro do marco da uma classificação biológica atual
DOMÍNIO
BACTERIA
ARCHAEA
REINO
EUBACTERIA
ARCHAEBACTERIA
PROTOCTISTA
FUNGI
PLANTAE
ANIMALIA
TIPO DE
CÉLULA
Procariótica
Procariótica
Eucariótica
Eucariótica
Eucariótica
Eucariótica
ESTRUTURA
CELULAR
Parede celular
com
peptidoglicano.
Parede celular sem
peptidoglicano.
Parede celular de
celulose, em
alguns.
Presença de
cloroplastos, em
alguns.
Parede celular
de quitina.
Ausência de
cloroplastos.
Parede celular de
celulose.
Sem parede
celular nem
cloroplastos.
Unicelular
Uni ou
pluricelular
Uni ou
pluricelular
Pluricelular
Pluricelular
ORGANIZAÇÃO Unicelular
EUKARYA
Presença de
cloroplastos.
NUTRIÇÃO (*)
Autotrófica ou
Heterotrófica
Autotrófica ou
Heterotrófica
Autotrófica ou
Heterotrófica
Heterotrófica
(absorção)
Autotrófica
Heterotrófica
(ingestão)
EXEMPLOS
Eubactérias
Arqueas
Protozoários e
Algas
Leveduras,
Mofos, Bolores
e Cogumelos.
Briófitas (musgos),
Pteridófitos
(samambaias),
Gimnospermas e
Angiospermas.
Invertebrados e
Cordados
* Nutrição
Autotrófica: o organismo produz seu próprio alimento a partir de substâncias inorgânicas e de uma fonte de energia. Os seres
autotróficos podem realizar fotossíntese (para a qual a fonte de energia é a luz solar) ou quimiossíntese (para a qual a fonte
de energia é uma reação química exotérmica).
Heterotrófica: o organismo se alimenta de moléculas orgânicas elaboradas por outros seres vivos por absorção (captação de
nutrientes dissolvidos na água), ou ingestão (entrada de partículas de alimentos não dissolvidas).
OS MICRORGANISMOS
Os autótrofos sintetizam seus alimentos a partir de dióxido de carbono; os fotossintéticos utilizam a
luz como fonte de energia; e os quimiossintéticos, algumas reações químicas inorgânicas. Os
heterótrofos dependem das moléculas orgânicas elaboradas pelos autótrofos, que absorvem ou
ingerem.
O fato de mantê-los agrupados sob a denominação de “microrganismos” talvez obedeça menos a
uma questão de semelhança que a razões práticas; já que os mesmos métodos básicos de estudo
(isolamento, cultura in vitro, identificação) podem ser aplicados, com pequenas variações, a esses
grupos.
Em condições favoráveis de umidade, acidez e temperatura, as bactérias se multiplicam
rapidamente por fissão celular, produzindo em poucas horas milhões de células ou clones, em uma
das acepções da palavra. Algumas espécies bacterianas também mantêm formas de reprodução
sexuada, possibilitando a recombinação do material genético de plasmídeos. A transferência
horizontal de genes entre bactérias e arqueas ocorre em consequência da infecção com bacteriófagos
ou simplesmente por entrada de um DNA “nu” (Figura 3.1).
AS EUBACTÉRIAS
As eubactérias ou bactérias são organismos unicelulares procarióticos em que uma parede celular
pode cumprir uma função protetora. Além do DNA cromossômico, podem apresentar moléculas
circulares extras de DNA denominadas plasmídeos.
As eubactérias formam um grupo com mais de 5 mil espécies conhecidas. Pequenas (0,0005-0,005
mm) e de formas diversas (esféricas, bastonetes, helicoidais), elas podem ser encontradas isoladas ou
em pares, cadeias ou agregados. Algumas se locomovem livremente, mediante um ou mais flagelos
distribuídos na superfície celular, outras aderem, mediante pelos ou fímbrias, a um organismo
hospedeiro. O grupo inclui as cianobactérias, que serão comentadas mais adiante, junto com as algas.
Em condições desfavoráveis, algumas bactérias formam esporos que resistem em forma latente até
que a situação mude, germinando e retomando sua atividade fisiológica. Um exemplo interessante, na
Europa do século XIX, é o da existência de campos malditos, onde as ovelhas não deviam transitar,
devido ao alto risco de contrair o carbúnculo ou antraz. De fato, os bacilos presentes nos animais
vitimados pela doença e enterrados nesses campos formavam esporos que, trazidos à superfície pelas
minhocas, contaminavam as pastagens.
Uma técnica laboratorial (coloração de Gram) permite diferenciar as bactérias pela estrutura da
parede celular. Entre as Gram-positivas, cuja parede celular é mais simples, encontramos gêneros
como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (com algumas espécies que causam a tuberculose e a lepra)
e os Actinomicetes, como Streptomyces, produtora de antibióticos como a estreptomicina.
Entre as Gram-negativas, encontramos os micoplasmas, Escherichia coli, uma colonizadora do trato
digestivo de muitos organismos; Salmonella, um agente de muitas intoxicações alimentares; as
cianobactérias fotossintéticas; as espiroquetas (Treponema pallidum e Borrelia burgdorferi, causantes
da sífilis e da doença de Lyme, respectivamente); e as clamídias (responsáveis por tracoma e uretrites).
Estima-se que as bactérias sejam responsáveis por aproximadamente metade das doenças
humanas, porém nem todas são patogênicas. As Gram-negativas são mais difíceis de tratar que as
Gram-positivas, devido a uma camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada
de antibióticos. Assim como o homem, os animais e as plantas também são afetados por patógenos
bacterianos. O dano decorre da invasão dos tecidos do hospedeiro ou da liberação de substâncias
tóxicas (exo e endotoxinas).
Pessoas diferentes, em lugares diferentes ou em um mesmo lugar, sejam sadias ou doentes, não
apresentam os mesmos microrganismos. Algumas comunidades microbianas desenvolvem-se na
21
http://bteduc.com
superfície e no interior de um organismo. Denominadas microbiomas, essas comunidades são
provavelmente necessárias para o hospedeiro. Técnicas avançadas de amplificação e sequenciamento
de DNA permitem identificar os microrganismos que se desenvolvem em diferentes localizações, seja
a pele ou o tubo gastrointestinal.
---------------FIGURA 3.1. Bactérias, clones e intercâmbio de material genético
Por divisão binária, uma bactéria gera um clone de bactérias semelhantes. O intercâmbio de material genético
entre bactérias responde a três mecanismos, mediados por DNA livre (transformação), por plasmídeos
(conjugação) ou por bacteriófagos (transdução).
A – Formação de clones
Bactéria
Clones
B – Mecanismos de transferência lateral ou horizontal de material genético
Conjugação
Bactéria doadora
Bactéria receptora
Transdução
Bactéria infectada
Bacteriófago
com um fragmento
de DNA bacteriano
Infecção
Lise celular
Bactéria competente
Incorporação do DNA
exógeno (Lisogenia)
Transformação natural
22
Bactéria transformada
OS MICRORGANISMOS
Em relação ao meio ambiente, a participação bacteriana na reciclagem dos elementos é fundamental
do ponto de vista ecológico. Dela dependem o tratamento de resíduos e de águas servidas e, também,
a eliminação de compostos recalcitrantes (biorremediação) e a extração de minérios (biolixívia). A
fixação de nitrogênio e a produção de toxinas pesticidas por bactérias contribuem para melhorar as
práticas agrícolas.
Devido a suas propriedades metabólicas, muitas eubactérias são utilizadas na produção de
alimentos (laticínios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminoácidos, gomas
emulsificantes e estabilizantes), na indústria química (acetona, butanol e plásticos biodegradáveis) e
na indústria farmacêutica (vacinas, toxinas e antibióticos). Também são usadas na produção de
enzimas para uso industrial e médico (Tabela 3.2).
Nos últimos anos começaram a ser estudados os biofilmes, comunidades microbianas protegidas
em uma matriz extracelular aderente. Tanto se fixam nos dentes, onde formam a placa dentária, como
na cortina do chuveiro, na pia da cozinha, nos tubos metálicos, nos sistemas de ar condicionado, ou
nos cateteres médicos e equipamentos de hemodiálise. Os biofilmes são extremamente resistentes
aos ataques dos agentes antimicrobianos.
AS ARQUEAS
As arqueobactérias, ou arqueas, diferem das eubactérias pela estrutura da parede celular e, também,
por alguns aspectos metabólicos relacionados com a síntese de proteínas que as aproximam dos
eucariontes. Algumas vivem em habitats inóspitos, como as solfataras dos vulcões ou gêiseres, a
temperaturas superiores a 60-800C (Islândia, Costa Rica). Outras prosperam em lagos onde a
concentração salina é altíssima, como o Grande Lago Salgado (Estados Unidos) ou o Mar Morto (Israel).
Entre as arqueas existem também alguns gêneros com vias metabólicas peculiares que as tornam
dependentes de enxofre ou produtoras de metano. Devido a estas características, nos últimos anos
tem-se acelerado a prospecção de arqueas para serem utilizadas em processos industriais que exijam
condições ambientais extremas. Contudo, estudos recentes de ecologia molecular mostram que as
arqueas não se limitam a ambientes extremos e que sua diversidade é bem maior do que o imaginado
previamente.
OS PROTOCTISTAS
Os Protozoários se classificam no reino Protoctista, um grupo mal definido de seres eucarióticos
unicelulares ou pluricelulares, autótrofos ou heterótrofos, de reprodução sexuada ou assexuada.
Trata-se de organismos unicelulares heterotróficos, cujo tamanho varia entre 0,002 e 1mm.
Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de água doce, ou simplesmente muito úmidos. Outros
parasitam outras espécies, nas quais causam doenças: Giárdia, Amoeba, Trichomonas, Plasmodium,
Toxoplasma, Leischmania etc. De importância fundamental para o ser humano, do ponto de vista
médico, sua caracterização molecular pode dar origem a testes diagnósticos e vacinas.
Classificadas junto com os protozoários no reino Protoctista, as algas são organismos uni ou
pluricelulares, autotróficos e aquáticos. Situadas na base das cadeias alimentícias aquáticas, as algas
cumprem um papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gás carbônico e produzir
oxigênio. Algumas participam na formação de solos e na fixação de nitrogênio.
Apesar de não ter órgãos diferenciados, as macroalgas marinhas (algas pardas, algas vermelhas e
parte das algas verdes) formam filamentos e talos que podem chegar a medir mais de trinta metros.
São utilizadas como adubo e, também, na alimentação humana (Porphyra ou nori e Laminaria, como
o kombu, no Oriente; cochayuyo, no Chile). Devido a sua capacidade de formar géis e emulsões, os
ficocoloides extraídos dessas algas (ágar, carragenina, alginato) são empregados em análises clínicas
23
http://bteduc.com
(preparação de meios de cultivo para cultivo de bactérias e fungos) e em várias indústrias, tais como a
alimentícia (sorvetes, cremes, geleias etc.), a farmacêutica (laxantes, cápsulas de remédios) e a
cosmética (cremes, sabonetes, xampus, dentifrícios etc.).
---------------TABELA 3.2. As bactérias (Eubactérias e Arqueas) como agentes biológicos
AGENTES BIOLÓGICOS
APLICAÇÕES
Tratamento de resíduos e de águas servidas.
Produção de energia (metano).
Biorremediação, extração de minério.
Indústria química (acetona, butanol, ácido láctico, ácido acético).
Bactérias
Enzimas industriais.
Agricultura (rizóbios, biopesticidas).
Alimentos (laticínios, vinagres, picles, azeitonas, silagem).
Indústria de alimentos (vitaminas B12 e β-caroteno, aminoácidos lisina e ácido glutâmico;
polissacarídeos xantana e dextrana*).
Indústria farmacêutica (enzimas de uso médico, antibióticos, vacinas e toxinas).
(*) A dextrana também tem usos médicos.
TABELA 3.3. As algas como agentes biológicos
AGENTES BIOLÓGICOS
APLICAÇÕES
Tratamento de efluentes, biomonitoramento de poluição, obtenção de energia.
Biomassa
Agricultura (adubo).
Produção de alimentos (alimentação humana, ração para avicultura e aquicultura).
Algas
Indústria de alimentos (aditivos, complementos nutricionais, substitutos proteicos,
espessantes e emulsionantes).
Moléculas
Indústria de cosméticos (ácidos graxos e outras substâncias tais como ficocoloides, pigmentos,
glicerol, abrasivos finos etc.).
Indústria farmacêutica (compostos biologicamente ativos, tais como toxinas, antibióticos,
antivirais e antitumorais).
TABELA 3.4. Os fungos como agentes biológicos
AGENTES BIOLÓGICOS
APLICAÇÕES
Agricultura (controle biológico de insetos e nematoides, micorrizos).
Produtos de fermentação (etanol, glicerol, ácido cítrico).
Fungos
Enzimas industriais.
Biomassa (fermento de padaria, micoproteína).
Indústria de alimentos (panificação, queijaria).
Indústria de bebidas (cervejas e vinhos, destilados).
Produtos metabólicos (extrato de levedura, hormônios de crescimento vegetal).
Indústria farmacêutica (antibióticos, vitaminas, vacinas, esteroides).
24
OS MICRORGANISMOS
As microalgas representam um grupo extremamente diversificado de umas 25.000 espécies das quais
só um pequeno grupo está bem estudado. Este compreende aproximadamente cinquenta espécies de
microrganismos fotossintéticos, tanto eucariontes (diatomáceas, dinoflagelados, euglenoides e outras
algas verdes) como procariontes (cianobactérias, antigamente algas azul-esverdeadas).
A proliferação de microalgas como florações na natureza (marés vermelhas) ou em reservatórios,
geralmente devido à eutrofização das águas, causa a morte de outros organismos, sendo muito
perigosa se estiver acompanhada pela liberação de toxinas. Porém, em alguns sistemas de tratamento
de efluentes, as microalgas são incorporadas nos tanques para remover nutrientes inorgânicos e
adicionar oxigênio. Também são usadas como indicadores de poluição.
O metano é um gás combustível que resulta da degradação de biomassa de algas por
microrganismos anaeróbios. Por outro lado, a produção de hidrogênio por algas representa uma
alternativa energética promissora.
As microalgas são aproveitadas na alimentação animal como ração para a avicultura e a aquicultura.
Algumas das substâncias que elas sintetizam são incluídas na alimentação humana como
complementos nutricionais e substitutos proteicos; trata-se de aminoácidos, ácidos graxos e vitaminas
(B12, -caroteno ou provitamina A). Também são utilizadas na formulação de cosméticos e na indústria
farmacêutica (Tabela 3.3).
OS FUNGOS
O Reino Fungi comporta mais de 100.000 espécies. Os fungos são organismos eucarióticos, uni ou
pluricelulares, com uma parede celular formada por quitina. Todos eles são heterótrofos e podem se
reproduzir sexuada ou assexuadamente.
As leveduras são fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares úmidos e se reproduzem por
brotamento. Pertence a esse grupo um dos microrganismos de maior importância econômica:
Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou, simplesmente, levedura) utilizado
tradicionalmente na preparação de alimentos e de bebidas, assim como na produção de etanol,
vitaminas e outros metabólitos.
Transformada mediante técnicas de engenharia genética, esta levedura produz uma vacina contra
a hepatite B (Tabela 3.4). Entretanto, nem todas as leveduras são benéficas; Candida albicans, um
microrganismo oportunista da flora normal humana pode, em certas condições, proliferar de maneira
anormal, tornando-se patogênica.
Nos bolores e mofos, as células formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominado
micélio. Os mofos crescem rapidamente por fragmentação do micélio e se disseminam mediante
esporos; como Aspergillus niger, um produtor de ácido cítrico; ou como Rhizopus, o fungo preto do
pão, que se expande sobre a superfície deste apesar dos conservantes acrescentados; ou ainda como
Aspergillus flavus, um bolor que ataca as sementes de leguminosas (amendoim, feijão, soja) e produz
uma toxina poderosa, a aflatoxina, causando graves intoxicações.
Neste grupo também se encontra o Penicillium, um gênero que conta com diversas espécies, uma
das quais é utilizada na indústria farmacêutica, para a produção de penicilina, e outras na indústria de
alimentos, para a maturação de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola e o Camembert.
Os cogumelos são os corpos reprodutivos de muitos fungos. Alguns são venenosos (Ammanita),
outros produzem substância alucinógena, tais como a psilobicina, utilizada por grupos nativos
mexicanos em rituais religiosos, ou a ergotamina, sintetizada quimicamente no século XX com o nome
de LSD (ácido lisérgico). Mas também os há comestíveis como o Agaricus ou champignon, o Shiitake e
o Pleurotus, que são cultivados e comercializados pelo homem.
Em termos ambientais, um quarto da colheita de frutas e vegetais é destruído pelos fungos; pragas
como a ferrugem do café, o esporão do centeio e a vassoura-de-bruxa afetam gravemente a
25
http://bteduc.com
agricultura. Na Irlanda no século XIX, o Phytophtora infestans atacou a batata, destruindo a fonte
básica de alimentação; a praga causou um milhão de mortes e a emigração forçada de boa parte da
população.
Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. Alguns são comestíveis, supondo-se
que a Lecanora esculenta seja o maná referido na Bíblia. O grupo não tem sido muito explorado
economicamente, apesar de ter encontrado aplicações como corantes (tintura de tornassol, um
indicador de pH), no tingimento de tecidos e como fixadores na indústria de perfumes. Também são
indicadores de poluição (biomonitoramento).
Em contrapartida, outra associação, desta vez entre um fungo filamentoso e as raízes das plantas
vasculares, os micorrizos, ocupam um lugar de destaque na agricultura em solos tropicais por
facilitarem a solubilização dos fosfatos.
OS VÍRUS, NA FRONTEIRA DO VIVO E DO NÃO VIVO
Os vírus são partículas sem nenhuma atividade metabólica; atravessam os filtros de porcelana e
cristalizam. O seu tamanho varia entre 20 e 300 nanômetros (1 nm = 10-4 mm). Sendo parasitas
obrigatórios de bactérias, plantas ou animais, ao infetar uma célula viva os vírus passam a utilizá-la
para sua própria reprodução.
Apesar de variar muito em complexidade, uma partícula viral típica compreende um ácido nucleico
(DNA ou RNA, como filamento simples ou duplo) dentro de uma capa proteica ou capsídeo e algumas
enzimas que serão liberadas dentro da célula hospedeira: DNA polimerase no caso dos poxvirus de
DNA duplo que se multiplicam no citoplasma: transcriptase reversa nos retrovírus; RNA replicase nos
vírus que se replicam sem passar por DNA. Alguns vírus que se integram no genoma da célula infectada
(bacteriófagos, retrovírus) têm sido utilizados na engenharia genética como vetores para introduzir
genes em uma célula hospedeira (Figura 3.2).
A entrada do vírus na célula depende do reconhecimento de um receptor na membrana celular do
hospedeiro, que seja específico para o vírus e essencial para a célula. A seguir, vários cenários são
possíveis: morte da célula infectada pelo sistema imune do hospedeiro; lise celular e dispersão de
partículas virais (vírus da influenza, poliovírus); brotação e saída envelopada; permanência latente
(herpesvírus); integração no hospedeiro e eventual transformação das células em cancerosas (tumores
devidos aos vírus da hepatite B e de Epstein-Barr).
Várias doenças humanas são causadas por vírus (poliovírus, HIV, coronavírus [responsável pela
síndrome aguda respiratória ou SAR] etc.). A destruição de habitats naturais pelo homem e as
mudanças climáticas alteram a dinâmica das populações naturais, em que a relação entre parasita e
hospedeiros está bem estabelecida. O contato dos vírus com outros hospedeiros possibilita a aparição
de algumas doenças emergentes como o Ebola, que assolou recentemente vários países da África
ocidental, e o Zika, introduzido recentemente no Brasil. A dispersão dos vírus se vê acelerada por
fatores culturais e sociais e pelo incremento do comércio e das viagens internacionais.
Na agricultura, o combate à lagarta da soja com o baculovírus evita a aplicação de 1,2 milhão de
litros de inseticidas por ano nas lavouras brasileiras. Em relação ao meio ambiente, pouco se sabe do
rol dos vírus, e dos microrganismos, nos oceanos. Uma questão relevante, considerando que 1 litro de
água de mar contém pelo menos 10 bilhões de micróbios e 100 bilhões de vírus, e que a maioria não
está caracterizada nem identificada. Estudos recentes destacam sua importância nos ciclos
biogeoquímicos e, particularmente, na reciclagem do carbono; a morte microbiana por infecção viral
libera, na cadeia alimentar, de 370 milhões a 630 milhões de toneladas de carbono por ano.
Os príons são pequenas proteínas que podem agir como agentes transmissíveis de algumas doenças
raras do sistema nervoso central. Possivelmente ativam mecanismos do hospedeiro para produzir
proteínas semelhantes que polimerizam, causando danos locais (Kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob).
26
OS MICRORGANISMOS
FIGURA 3.2. Os vírus
A.
Estrutura fundamental
Envelope (só nos vírus que se reproduzem por brotação)
Capsídeo (proteína)
Ácido nucleico (DNA ou RNA)
Enzimas virais (polimerases, transcriptase reversa)
B.
Morfologia de diferentes vírus
(Os adenovírus e o HIV parasitam células humanas; o bacteriófago, bactérias).
HIV
Adenovírus
Bacteriófago
C.
A multiplicação de um bacteriófago
A infecção da bactéria pelo bacteriófago destrói a célula (ciclo lítico). Em alguns casos, o DNA viral se integra no cromossomo,
sendo transmitido às células filhas; em determinadas condições, o vírus retoma sua atividade, reiniciando o ciclo lítico.
Bacteriófago
Bactéria
Infecção
DNA viral
O DNA viral se integra no
cromossomo bacteriano
e se transmite às
células-filhas
Eventualmente
Infecção
Adesão do bacteriófago
à parede celular e injeção
e injeção do DNA viral
CICLO LISOGÊNICO
DNA viral
CICLO LÍTICO
Lise da bactéria e liberação
de novas partículas de vírus
Formação de
novos vírus
Podendo voltar
a se ativar
Multiplicação do DNA viral
Síntese de proteínas virais e
destruição do cromossomo bacteriano
27
http://bteduc.com
AS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
Diversos tipos de técnicas facilitam o trabalho laboratorial. A identificação de um microrganismo
demanda a observação microscópica e a utilização de alguns métodos específicos de coloração,
complementados por testes bioquímicos e eventualmente genéticos e imunológicos. Encontrar e
manter um microrganismo no laboratório demanda a aplicação de técnicas bacteriológicas aplicáveis
também, com algumas variações, a fungos e algas.
Cultivar microrganismos exige, além do desenho de um meio nutriente que satisfaça suas
necessidades metabólicas, um cuidado especial com as condições de temperatura e iluminação em
que este será incubado. Os meios nutrientes se empregam líquidos ou solidificados com ágar, uma
substância que lhes confere uma consistência gelatinosa. Os recipientes mais comuns são tubos de
ensaio e placas circulares de vidro com tampa (placas de Petri); e, para inocular os meios, se utilizam
alças de platina e pipetas de diferentes tipos.
A grande dificuldade do laboratório microbiológico está em conseguir a multiplicação do
microrganismo desejado evitando as contaminações, isto é a multiplicação de outros microrganismos.
Trabalha-se em condições assépticas, o que demanda a esterilização prévia do material de vidro,
dos meios nutrientes e dos instrumentos (alças, pipetas) que serão utilizados. E, na transferência do
material biológico, evita-se cuidadosamente toda contaminação com os microrganismos do ar.
Equipamentos especialmente desenhados para trabalhar sob um fluxo de ar esterilizado ajudam o
profissional. Também se evitam as contaminações na hora de eliminar o material utilizado, a fim de
não liberar microrganismos prejudiciais no ambiente.
Os microrganismos são isolados a partir de amostras de solo, água, ar ou fluidos corporais. As
linhagens obtidas se conservam como culturas puras. Microrganismos com características diferentes
são obtidos induzindo mutações e selecionando as linhagens mutantes. Cada laboratório mantém os
estoques microbianos necessários, que também podem ser solicitados a centros especializados
(Coleções de Cultura).
O número de microrganismos em uma amostra pode ser estimado por diversos métodos: contagem
microscópica, contagem eletrônica, contagem em placa, turvação do meio, massa seca, conteúdo de
nitrogênio ou medidas indiretas da atividade microbiológica.
Em geral, as técnicas clássicas são trabalhosas e muito demoradas para o diagnóstico clínico, por
isso estão sendo substituídas por técnicas miniaturizadas mais rápidas que identificam os
microrganismos com base em algumas reações bioquímicas em kits padronizados. A tendência geral é
de automatização do laboratório microbiológico e de utilização de técnicas moleculares.
A identificação de bactérias e arqueas pode ser realizada hoje por comparação do RNA ribossômico.
A centrifugação dos ribossomos em gradiente de cloreto de césio separa os componentes, RNA 5S e
RNA 23S na unidade maior e RNA 16S na menor. Modificações na estrutura primária desta última
fração não afetam sua função, de modo que, se uma pequena parte está altamente conservada, o
restante do rRNA de 16S varia entre as espécies, tendo se transformado em um elemento chave para
a classificação.
A Microbiologia Ambiental nos traz uma nova visão das populações microbianas presentes na
natureza. Nossa ignorância é ainda enorme: o número de espécies que conseguimos cultivar no
laboratório não representa mais do que 1 a 5 % da totalidade existente. Dependemos dos avanços na
área da genômica para ampliar nosso conhecimento das comunidades microbianas do ambiente e para
identificar genes de interesse para a indústria (metagenômica).
28
OS MICRORGANISMOS
BIOSSEGURANÇA E BIOSSEGURIDADE
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o termo biossegurança abrange os princípios,
técnicas e práticas necessárias para evitar a exposição acidental a patógenos e toxinas assim como sua
liberação acidental (Figura 3.3).
Os microrganismos são classificados segundo o risco de causarem danos aos profissionais que
trabalham com eles e à coletividade. Os critérios são: a patogenicidade para o homem, a virulência, o
modo de transmissão, a endemicidade e a existência ou não de uma terapêutica eficaz. Segundo a
Organização Mundial da Saúde, definem-se assim quatro grupos de risco:
o
Grupo de Risco (nenhum ou baixo risco individual e coletivo). Um microrganismo que
provavelmente não pode causar doença no homem ou num animal. Exemplos: Bacillus cereus,
Bacillus subtilis, Escherichia coli (algumas linhagens), Lactobacillus sp.
o
Grupo de Risco 2 (risco individual moderado, risco coletivo baixo). Um agente patogênico que pode
causar uma doença no homem ou no animal, mas que é improvável que constitua um perigo grave
para o pessoal dos laboratórios, a comunidade, o gado ou o ambiente. A exposição a agentes
infecciosos no laboratório pode causar uma infecção grave, mas existe um tratamento eficaz, além
de medidas de prevenção, com risco de propagação de infecção limitado. Exemplos: Salmonella,
Toxoplasma, Schistosoma mansoni, Streptococcus sp, vírus da rubéola, vírus do sarampo e vírus da
hepatite B.
o
Grupo de Risco 3 (alto risco individual, baixo risco coletivo). Um agente patogênico que causa
geralmente uma doença grave no homem ou no animal, mas que não se propaga habitualmente
de uma pessoa a outra. Existe um tratamento eficaz, bem como medidas de prevenção. Exemplos:
Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis e vírus da imunodeficiência humana (HIV).
o
Grupo de Risco 4 (alto risco individual e coletivo). Um agente patogênico que causa geralmente
uma doença grave no homem ou no animal e que se pode transmitir facilmente de uma pessoa
para outra, direta ou indiretamente. Nem sempre estão disponíveis um tratamento eficaz ou
medidas de prevenção. Exemplos: vírus Ebola, vírus Lassa e vírus Marburg.
A classificação anterior é válida exclusivamente para o trabalho laboratorial. A cada grupo de
microrganismos correspondem normas estritas de trabalho, que abrangem desde a arquitetura do
laboratório e as características dos equipamentos até as precauções que devem ser tomadas pelos
profissionais e a forma como o lixo será descartado.
O conceito de biossegurança se complementa com o de biosseguridade, isto é, o conjunto de
medidas de proteção de uma instituição e dos trabalhadores necessárias para evitar a perda, o roubo,
o uso incorreto ou a liberação intencional de patógenos e toxinas (bioterrorismo). Um exemplo é o
envio de carta com antraz depois do atentado das Torres Gêmeas em Nova York (2001), mas existem
outros relacionados com aspectos econômicos, tais como a disseminação de pragas agrícolas do café,
do cacau, da soja etc.
---------------FIGURA 3.3. Logotipos utilizados como indicação de risco biológico
Biossegurança
Biosseguridade
29
http://bteduc.com
OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLÓGICOS
A Tabela 3.5 apresenta uma lista dos principais agentes biológicos microbianos e suas utilizações.
----------------
TABELA 3.5. Principais destaques entre os agentes biológicos microbianos
ARQUEOBACTÉRIAS
UTILIZAÇÃO
Thermus aquaticus
Isolada em uma poça do parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos), esta bactéria
produz uma enzima que copia o DNA a uma temperatura alta. Esta enzima permite
obter milhões de cópias de um fragmento de DNA em um processo automatizado que
revolucionou a Biotecnologia, chamado PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em
cadeia da polimerase).
Bactérias metanogênicas
Vivem em lugares onde há ausência de oxigênio, seja no tubo digestivo de alguns
animais (gado, cupins) ou nos pântanos. Estas bactérias transformam o acetato
resultante da degradação de celulose por outras bactérias em metano, um gás
combustível.
ALGAS
UTILIZAÇÃO
Spirulina
O seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lhe confere um elevado
valor nutritivo; as proteínas representam aproximadamente 2% do peso seco da batata
e 6-10% do trigo. Quando da chegada dos espanhóis, os astecas já preparavam umas
bolachas (tecuitlatl) com a Spirulina coletada no lago Texcoco. Na África, no lago Tchad,
ainda hoje ela é coletada e consumida como alimento. Spirulina, assim como Chlorella,
são vendidas em tabletes como complemento nutritivo.
Dunaliella
Acumula glicerol em condições de alta salinidade, com o qual consegue evitar a
desidratação. Pode crescer no Mar Morto, sendo também cultivada em tanques ou
lagoas, perto do Mar Vermelho, para a extração de outros produtos metabólicos
(glicerol e -caroteno).
FUNGOS
UTILIZAÇÃO
Saccharomy c es cerevisiae
Conhecido como levedo de cerveja ou levedura, é utilizado na preparação de alimentos
(pão, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e destilados), assim
como na produção de outras substâncias de importância industrial (etanol, vitaminas e
outros metabólitos). A levedura cresce facilmente em laboratório. Também pode ser
manipulada geneticamente. Nos fermentadores ou biorreatores industriais, onde se
multiplica rapidamente a partir de matérias-primas de baixo custo, ela permanece ativa
durante períodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada por filtração ou
centrifugação. Com 12.000.000 de pares de bases e 6.000 genes em 16 cromossomos,
Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997, o primeiro organismo eucariótico a ter o seu
genoma sequenciado.
Aspergillus
Algumas espécies alcançam grande importância industrial, como A.niger, utilizada para
a produção de ácido cítrico ou de enzimas (em linhagens modificadas geneticamente).
Penicillium
Algumas espécies são utilizadas na indústria farmacêutica (penicilina) ou indústria de
alimentos (queijos azuis, como o Roquefort e o Gorgonzola; queijo Camembert).
30
OS MICRORGANISMOS
EUBACTÉRIAS
UTILIZAÇÃO
Bactérias lácticas
Os gêneros Lactobacillus e Streptococcus são responsáveis por vários processos, tais
como a elaboração de queijos e de iogurtes, o envelhecimento dos vinhos, a
conservação de alimentos (sauerkraut ou repolho fermentado, silagem para o gado); a
produção de ácido láctico, um aditivo utilizado na indústria de alimentos como
acidulante e estabilizante.
Bacillus thuringiensis
Este microrganismo prolifera no solo e na superfície das plantas, sintetizando uma
toxina fatal para as larvas de insetos. Esta é produzida comercialmente há mais de 40
anos, representando 90% das vendas de inseticidas biológicos e reduzindo a
necessidade de aplicação de pesticidas químicos nas lavouras. Nos últimos anos, o gene
codificador da toxina tem sido transferido a plantas (algodão, milho) para que estas
sintetizem diretamente o inseticida.
Streptomyces
Além do cheiro característico da terra removida, este gênero de bactérias do solo
produz substâncias antibióticas (estreptomicina, tetraciclina, eritromicina), antifúngicas
(nistatina), herbicidas, antitumorais e supressoras de rejeição a transplantes.
Pseudomonas
Várias linhagens são utilizadas na eliminação de poluentes. Algumas quebram moléculas
de hidrocarbonetos, como os existentes nos acidentes de derramamento de petróleo;
outras podem remover o mercúrio aquático.
Agrobacterium tumefaciens
Agente patogênico para as plantas dicotiledôneas que desenvolvem um tumor ou galha
quando infectadas. Com a remoção de um gene, perde a capacidade de provocar
tumores, conservando a capacidade infecciosa, utilizada na engenharia genética de
vegetais.
Bactérias butíricas
Na indústria têxtil, Clostridium butiricum libera as fibras vegetais durante a maceração
do cânhamo e do linho. Clostridium acetobutyricum é utilizado na produção industrial
de acetona e butanol. Clostridium botulinum produz uma toxina poderosíssima; calculase que um grama desta bastaria para matar um milhão de pessoas. A ingestão de
conservas contaminadas e mal esterilizadas resulta quase sempre em um desfecho fatal.
Devido a sua ação inibitória da contração muscular, a toxina botulínica é utilizada em
concentrações muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas de expressão durante
certo tempo (efeito cosmético).
Escherichia coli
Descoberta em 1855, esta bactéria Gram-negativa vive no trato digestivo do homem e
de outros animais. Tem forma de bastonete (0,002 mm de comprimento, 0,0008 mm de
diâmetro), 1 a 4 moléculas de DNA e 15.000 a 30.000 ribossomos. Flagelos e pelos
permitem que se movimente rapidamente.
Algumas linhagens são patogênicas, podendo contaminar os alimentos (carne, leite,
vegetais), que devem ser cozidos adequadamente. Os seus requerimentos nutricionais
básicos são simples. Água, sais minerais, uma fonte de nitrogênio e uma fonte de
energia. Em condições adequadas, se divide a cada 20-40 minutos; também pode se
reproduzir de maneira sexuada (conjugação).
Devido à facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratório, Escherichia coli tem
se tornado uma ferramenta indispensável para estudos bioquímicos e genéticos,
incluindo a Engenharia Genética. O seu genoma compreende 4,6 milhões de pares de
bases que codificam em torno de 4.000 proteínas diferentes.
A introdução de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhagem inofensiva de
laboratório, possibilitou os primeiros processos de produção de insulina, de interferon
e de hormônio de crescimento. Entretanto, por se tratar de uma célula procariótica,
nem sempre é a melhor opção de "fábrica" para a síntese de produtos de origem animal
ou vegetal, tendo sido aos poucos substituída por outras células eucarióticas, como a
levedura.
31
CAPÍTULO 4
ENZIMAS E ANTICORPOS
AS PROTEÍNAS
Todos os organismos estão formados por água e moléculas de diversos tipos, inorgânicas e orgânicas
(Figura 4.1). Entre estas últimas, há um grupo de macromoléculas, as proteínas, que participam em
numerosas atividades, cumprindo um papel fundamental para os seres vivos (Tabela 4.1). Pertencem
a este grupo as enzimas, moléculas de ação catalítica, e os anticorpos, moléculas que participam na
defesa do organismo.
---------------FIGURA 4.1. A composição química de uma bactéria
Íons, moléculas pequenas (4%)
Fosfolipídios (2%)
DNA (1%)
Outras
moléculas
(30%)
RNA (6%)
MACROMOLÉCULAS
Proteínas (15%)
Água (70%)
Polissacarídeos(2%)
TABELA 4.1. As funções das proteínas no organismo
FUNÇÃO
EXEMPLOS
Componentes estruturais
Queratina do cabelo, colágeno da derme, actina e miosina das fibras musculares.
Substâncias de reserva
Albumina do ovo, caseína do leite.
Ação catalítica
Enzimas que controlam as reações químicas celulares.
Outras
Transmissão de informação (hormônios proteicos), participação nos mecanismos de
defesa (anticorpos, citocinas), transporte e armazenamento de pequenas moléculas
(hemoglobina).
FIGURA 4.2. Aminoácidos e proteínas
A. Fórmula dos aminoácidos
AMINOÁCIDO 1
AMINOÁCIDO 2
Grupo carboxila
Grupo carboxila
Grupo amino
Grupo amino
Cadeia lateral
Cadeia lateral
B. Formação da união peptídica
Aminoácido 1
Aminoácido 2
União peptídica
C. Estrutura de uma proteína
Aminoácidos
Folha pregueada
(Conformação β)
Hélice
(Conformação α)
α hélice
Folha pregueada
ESTRUTURA PRIMÁRIA
ESTRUTURA SECUNDÁRIA
ESTRUTURA TERCIÁRIA
ESTRUTURA QUATERNÁRIA
----------------
ESTRUTURA
As proteínas são macromoléculas formadas por 20 aminoácidos diferentes, que se distinguem por ter,
unidos ao átomo de carbono, um grupo amino (básico), um grupo carboxila (ácido) e um radical
variável (Figura 4.2 A). A presença de um carbono assimétrico resulta em duas formas moleculares (L)
e (D) que diferem por suas propriedades ópticas.
Os aminoácidos que compõem as proteínas correspondem à forma (L). A reação de condensação
entre o grupo carboxila de um aminoácido e o grupo amina de outro cria uma ligação peptídica (Figura
4.2 B). A união de vários aminoácidos forma uma cadeia peptídica que se caracteriza não só pelo
número e tipo de aminoácidos que a compõem, como pela sequência em que estes se encontram,
denominada estrutura primária.
Ao se estabelecerem ligações entre os grupos que formam os enlaces peptídicos, a cadeia adota
uma estrutura regular ou estrutura secundária, geralmente em forma de hélice ou de folha. As
interações entre as cadeias laterais dos aminoácidos causam o dobramento da proteína, resultando
uma configuração espacial que é chamada de estrutura terciária. A forma final de uma proteína
dependerá ainda da associação entre vários polipeptídios, no que se denomina de estrutura
quaternária (Figura 4.2 C).
Quando sintetizada dentro da célula, uma proteína adotará espontaneamente a configuração
33
http://bteduc.com
espacial que decorre de sua estrutura primária. Fatores ambientais como o pH, a concentração salina
ou a temperatura podem causar alterações momentâneas ou definitivas na forma da molécula.
O PROTEOMA
Uma das grandes surpresas reveladas pelos estudos do genoma humano foi encontrar um número
baixo de genes codificadores de proteínas, inferior ao esperado quando considerada a diversidade de
proteínas necessárias para o funcionamento celular. Diferentes tipos de processamento no núcleo e
modificações das proteínas no citoplasma explicam como, a partir do pequeno número de genes
conhecido, se formam todas as proteínas necessárias.
Essas observações chamaram a atenção sobre o proteoma, definido como o conjunto de proteínas
que uma célula, um tecido ou um organismo expressam em um momento dado, sob determinadas
condições. Também deram origem a uma nova disciplina, a proteômica.
Diferente do genoma que permanece essencialmente constante no tempo e em todas as células do
organismo, o proteoma abrange uma infinidade de variantes proteicas, diferentes em cada célula e a
cada momento. Publicado em 2014, o primeiro rascunho do proteoma humano identificou os produtos
correspondentes a 84% dos genes codificadores de proteínas, que representam 1,5% do genoma.
As aplicações da proteômica abrangem desde os estudos estruturais para elaborar modelos
tridimensionais até a identificação das proteínas associadas a uma organela, descobrindo sua função
e sua relação com outras proteínas. Também compreendem estudos da expressão quali e quantitativa
das proteínas em duas condições, uma normal e a outra alterada por stress ou doença.
Na área de saúde, as modificações do proteoma em células normais e cancerosas possibilitam a
identificação de biomarcadores para diagnóstico e monitoramento dos tratamentos. Em agronomia, a
proteômica pode esclarecer a inter-relação patógeno-hospedeiro nas infecções microbianas ou na
resposta das plantas aos animais herbívoros. Na área de microbiologia possibilita o controle de
qualidade nas diferentes etapas de produção de alimentos, com ênfase em aspectos de biossegurança.
AS BASES DE ALGUMAS TÉCNICAS LABORATORIAIS
O estudo das proteínas depende do objetivo a alcançar. Se este for simplesmente a obtenção de uma
proteína para pesquisa ou uso comercial, as etapas a seguir envolverão sua separação, purificação e
medida da concentração e/ou quantidade obtida. As técnicas bioquímicas utilizadas são clássicas e
dependem dos recursos disponíveis. Mas se o objetivo for a determinação das estruturas primária,
secundária e terciaria dessa proteína, as técnicas são bem mais complexas.
CROMATOGRAFIA
A cromatografia permite separar as substâncias de uma mistura com fins analíticos e preparativos.
Está baseada na migração diferencial das moléculas de uma mistura, colocada em uma fase móvel,
sobre um suporte estacionário ou matriz (Figura 4.3). A separação obedece a três tipos de mecanismos:
o Troca iônica. A matriz está formada por pequenas partículas carregadas que retêm as moléculas de
carga contrária. Como a associação depende de fatores como o pH e a força iônica da solução, a
modificação destes fatores permite controlar a separação.
o Filtração em gel. A matriz consiste em partículas porosas que separam as proteínas em função de
seu tamanho, como uma peneira molecular.
o Afinidade. As partículas da matriz estão unidas por ligações covalentes a moléculas (enzimas,
anticorpos) que interagem com a proteína de interesse. Para liberar a proteína retida na coluna,
muda-se o pH ou a concentração salina. Desse modo, consegue-se a proteína purificada.
34
FIGURA 4.3. Cromatografia em coluna
O processo está baseado na velocidade de migração diferencial das moléculas proteicas em uma matriz imersa
em um solvente.
Amostra
Solvente
Matriz
Saída do solvente
Tempo
Frações coletadas
FIGURA 4.4. Eletroforese
Separação dos peptídeos de uma mistura, por migração diferencial em um campo elétrico.
Mistura de peptídeos
Cátodo
Ânodo
Aplicação de um campo elétrico
Migração e separação dos peptídeos
FIGURA 4.5. Difração de raios X
Cristais
Raios X
Difração dos
Raios X
Filme
35
http://bteduc.com
Diferentes modalidades dependem das características da fase estacionária: cromatografia em papel,
em camada delgada, cromatografia em gás, cromatografia líquida etc. Na cromatografia em coluna, a
separação das proteínas de uma mistura depende da estrutura da matriz, sólida e permeável, que se
encontra imersa em um solvente. A resolução é maior com a técnica denominada HPLC (do inglês,
High-Pressure Liquid Chromatography), que separa os aminoácidos de uma mistura.
ELETROFORESE
Uma técnica analítica fundamental é a eletroforese, baseada na migração diferencial de moléculas
ionizadas colocadas em um campo elétrico. Se a carga for positiva, elas migrarão para o polo negativo
ou cátodo e, inversamente, se ela for negativa, a migração ocorrerá na direção do polo positivo ou
ânodo (Figura 4.4). Por outro lado, moléculas de menor peso molecular migram mais rapidamente que
moléculas maiores.
Se uma mistura de peptídeos for colocada em um campo elétrico, eles migrarão de acordo com sua
carga, forma e tamanho, formando cada um deles uma banda característica que será visualizada
mediante um corante ou uma reação química específica. Observe-se que a carga de um peptídeo
resulta da soma das cargas correspondentes aos grupos amina e carboxila terminais e dos radicais dos
aminoácidos que o compõem, e que essa carga varia com o pH do meio.
A eletroforese permite separar os componentes de uma mistura. Existem numerosas variações da
técnica em função do suporte (papel de filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de
agarose, amido ou poliacrilamida), da disposição da cuba (horizontal ou vertical), da direção da
migração (unidirecional ou bidirecional) etc. Na variante SDS-PAGE (do inglês SDS-Polyacrilamide Gel
Electrophoresis), por exemplo, as proteínas desnaturalizadas com dodecilsulfato de sódio (SDS)
migram em um gel de poliacrilamida.
OUTRAS TÉCNICAS
Utilizando métodos de ionização adaptados às moléculas biológicas como o MALDI (do inglês, Matrix
Assisted Laser Desorption/Ionization), a espectrometria de massa se tornou nos últimos anos uma
ferramenta indispensável na identificação de proteínas, por comparação da massa molecular com
outras de um banco de dados. Também fornece uma análise estrutural da molécula, indicando a
sequência de aminoácidos.
A espectrometria de massa permite estudar o conjunto de proteínas de um organismo (proteoma)
e dissecar as interações das proteínas com outras moléculas. Por ser um método automatizado e
rápido, tem alcançado múltiplas aplicações em farmacologia e diagnóstico.
Os métodos mais adequados para determinar a estrutura tridimensional das proteínas são a
ressonância magnética nuclear (NMR) e a cristalografia de raios X. O primeiro revela a estrutura
atômica tridimensional de uma macromolécula em uma amostra em solução, aplicando um campo
magnético e interpretando o espectro resultante. O segundo fornece uma imagem digital
tridimensional da molécula, baseada na difração dos raios X ao atravessar um cristal (Figura 4.5).
A bioinformática é uma ferramenta fundamental para a modelagem molecular e a interpretação
dos dados. Existem hoje bases de dados de sequências de proteínas de diferentes organismos que
permitem a identificação de moléculas e a comparação de sequências similares.
36
AS ENZIMAS
A CATÁLISE ENZIMÁTICA
As reações químicas que ocorrem nos seres vivos dependem da atividade catalítica de um tipo de
proteínas, as enzimas. Estas moléculas agem diminuindo a energia de ativação necessária de uma
reação química, sendo capazes de promovê-las e acelerá-las, sem ser alteradas ou destruídas.
A molécula de enzima reconhece um substrato específico (S), formando com ele um complexo
molecular ou estado de transição (SE). O encaixe no sítio ativo da molécula facilita a transformação do
substrato no(s) produto(s) da reação (P). A enzima é recuperada no fim da reação, podendo atuar
inúmeras vezes (Figura 4.6). A reação pode ser representada como a seguir:
S+E
SE
P+E
A primeira característica das enzimas é a especificidade; uma enzima como a lactase, que opera sobre
a lactose, não agirá sobre a sacarose; duas enzimas que hidrolisem o amido poderão fazê-lo cortando
a molécula de maneira diferente, como a -amilase e a -amilase. A segunda é que, em função de sua
origem biológica, as enzimas são biodegradáveis e agem em condições brandas de temperatura e pH.
A ação enzimática depende do pH, da temperatura, da presença de cofatores inorgânicos (zinco,
ferro, cobre) e/ou orgânicos (coenzimas, muitas das quais são vitaminas). Os metais pesados alteram
a estrutura molecular da enzima de maneira irreversível, impedindo sua ação catalítica (desnaturação).
Uma inibição da atividade enzimática ocorre quando moléculas muito parecidas com o substrato
competem com este para ocupar o sítio ativo da enzima (inibição competitiva), ou quando outras
moléculas se ligam a determinadas partes da enzima, alterando a estrutura espacial e dificultando o
encaixe com o substrato (inibição não competitiva).
OS DIVERSOS TIPOS DE ENZIMAS
Uma forma de classificar as enzimas é pelo tipo de reação que catalisam, acrescentando o sufixo “ase”
ao nome do substrato que é transformado: protease, lactase, amilase, lipase, celulase. Também se
pode adicionar “ase” ao nome da reação catalisada: hidrolase, oxirredutase. Quando combinadas as
duas regras anteriores, mencionam-se o nome do substrato e da reação catalisada adicionando ”ase”
como, por exemplo, em DNA-polimerase. Porém, algumas enzimas, como a renina ou a trombina,
conservam seus nomes tradicionais (Tabela 4.2).
IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DAS ENZIMAS
As enzimas apresentam numerosas vantagens quando utilizadas como agentes biológicos em
processos tecnológicos: especificidade, operação em condições facilmente controláveis e
biodegradabilidade. De um modo geral, os tratamentos enzimáticos diminuem a carga poluidora dos
efluentes industriais.
O mercado se distribui fundamentalmente entre as proteases (59%), as carboidrases (28%) e as
lipases (3%), três grandes conjuntos de enzimas que são utilizadas por diversas indústrias; os 10%
restantes do mercado correspondem às enzimas analíticas e farmacêuticas (Tabela 4.3).
Nos sabões lava-roupas, as enzimas prometem ao consumidor roupas limpas e com aparência de
novas. Um exército constituído por proteases, amilases e lipases digere as manchas difíceis (sangue,
leite, molho de tomate, capim, chocolate, batom etc.), enquanto que as celulases removem as
microfibrilas de celulose das roupas.
37
http://bteduc.com
Não sendo mais necessário esfregar as manchas, a limpeza se realiza com pouco esforço e sem
desgaste do tecido; como estas moléculas trabalham a temperaturas baixas, o consumo de energia é
menor. Com mais uma vantagem para o fabricante: as enzimas não representam mais que uma fração
muito pequena do sabão (0,4-0,8%), correspondente a 1% do seu custo. Em 1988, a empresa
Novozymes introduziu no mercado de detergentes a primeira enzima degradadora de lipídios
(Lipolase), obtida por engenharia genética.
As enzimas são empregadas também no acabamento de roupas. Para conseguir o aspecto usado,
os jeans eram lavados com pedras (stone washed), um processo que tinha o inconveniente de causar
a abrasão da maquinaria e o desgaste do tecido. Nos últimos anos, as pedras foram substituídas por
celulases, com resultados satisfatórios.
Os curtumes, em vez de excrementos de cachorro ou de pombo, se valem hoje de enzimas
pancreáticas para amaciar e desengordurar as peles.
Na indústria de alimentos e bebidas, as enzimas participam na produção de adoçantes, de pão,
biscoitos e bolachas e de queijos. Na extração de sucos de frutas, as pectinases aumentam
substancialmente o rendimento do processo, ao liberar o suco retido na pectina das paredes celulares
vegetais. Também facilitam a clarificação de vinhos e cervejas.
---------------FIGURA 4.6. O mecanismo da atividade enzimática
A. O modelo chave-fechadura
Substrato
Produtos
Enzima
Complexo enzima-substrato
Enzima
B. A enzima diminui a energia de ativação
Reação sem enzima
Reagente
Reação
com enzima
Energia de ativação
(sem a enzima)
Energia de ativação
(com a enzima)
Nível inicial de energia
Produtos
Nível final de energia
38
As enzimas são utilizadas em desodorantes e artigos para a higiene bucal. Em dermatologia e
cosmética, algumas das aplicações mais frequentes estão no combate ao envelhecimento (proteases,
lipases), no tratamento de acne e de caspa, no desbridamento e limpeza de ferimentos infetados e na
destruição de tecidos necrosados.
Como medicamentos, as enzimas são utilizadas em vários contextos, especialmente em
quimioterapia e nas terapias trombolíticas. E muitos entre os mais corriqueiros testes de diagnóstico
dependem de reagentes enzimáticos. As enzimas permitem a resolução de misturas de moléculas
racêmicas, nas que há duas formas isoméricas, tipo “mão direita” e “mão esquerda”, com diferente
atividade biológica. Desse modo, poderão ser evitados problemas como o da talidomida, um
medicamento que causou o nascimento de numerosos bebês com deformações congênitas, na década
de 1960. A tragédia teria sido consequência da presença no produto comercial da forma molecular
tipo “mão direita”, de ação teratogênica, junto ao tipo “mão esquerda”, de ação calmante.
Atualmente, estão sendo estudados métodos enzimáticos para eliminar os príons responsáveis pela
denominada “doença da vaca louca”. Também se cogita a utilização de enzimas para limpar áreas
contaminadas com agentes químicos como o gás sarin.
--------------TABELA 4.2. A classificação internacional das enzimas
CLASSE
TIPO DE REAÇÃO CATALISADA
EXEMPLOS
Oxirredutases
Reações onde se transferem elétrons.
Desidrogenases, oxidases.
Transferases
Reações onde se transferem grupos químicos.
Transaminases, fosforilases.
Hidrolases
Reações de hidrólise, isto é, de transferência de
grupos funcionais para a água.
Proteases, carboidrases, peptidases,
lipases.
Liases
Adição de grupos a duplas ligações ou formação de
duplas ligações por eliminação de grupos.
Decarboxilases (renina, trombina).
Isomerases
Produção de isômeros por transferência de grupos
dentro de moléculas.
Isomerases, mutases.
Ligases
Formação de ligações C-C, C-S, C-O e C-N por
reações de condensação.
Sintetases.
TABELA 4.3. As enzimas como agentes biológicos
AGENTES BIOLÓGICOS
APLICAÇÕES
Indústria de alimentos e bebidas (clarificação de vinhos e sucos de frutas, substituição da
maltagem pelo tratamento do amido na elaboração de cervejas, fabricação de pão, biscoitos e
bolachas, produção de adoçantes, fabricação de laticínios, suplementação de rações animais).
Produtos de limpeza (detergentes e lava-roupas para a remoção de manchas difíceis, produtos
para limpar dentaduras e lentes de contato).
Indústria têxtil (desengomado de tecidos, acabamento de jeans).
ENZIMAS
Curtumes (amaciamento de couros).
Indústrias de papel e celulose (branqueamento de polpa de celulose).
Cosmética (produtos de higiene bucal, depilatórios, tratamento da acne e da caspa,
cosmocêuticos em geral).
Indústria farmacêutica (reagentes para uso em análises clínicas, nucleases para a manipulação
gênica, bioconversões).
Tratamentos médicos (combate de inflamações, edemas e lesões; dissolventes de coágulos
sanguíneos; agentes terapêuticos em transtornos digestivos).
39
http://bteduc.com
OS ANTICORPOS
Assim como os animais vertebrados, os invertebrados e as plantas devem se proteger do ataque de
parasitas (vírus e bactérias) e da proliferação de células estranhas ou aberrantes. Também devem
reparar órgãos e tecidos de modo a conservar sua integridade. Estudos recentes indicariam que todos
os seres vivos apresentam algum tipo de resposta imune inata e adquirida.
Dentro da estratégia de defesa de um vertebrado, os anticorpos são proteínas fundamentais no
reconhecimento do “eu” e na eliminação do “não eu” (antígeno). Uma parte importante da resposta
imune envolve a produção de anticorpos que reconhecem o antígeno, desencadeando os mecanismos
de destruição adequados.
A REAÇÃO ANTÍGENO- ANTICORPO
Os anticorpos são proteínas globulares (PM 150.000 - 200.000) que contém um número pequeno de
grupos carboidrato presentes no soro e em outros fluidos dos vertebrados. Sua produção é induzida
quando o sistema linfoide do indivíduo entra em contato com um antígeno (Ig = imunoglobulinas).
Existem diferentes tipos de imunoglobulinas que cumprem funções diferentes no organismo, mas,
devido a sua importância como agentes biológicos de importância para as biotecnologias, neste texto
nos referiremos aos anticorpos contidos na fração proteica do soro sanguíneo caracterizada por
eletroforese como -globulina.
A molécula de IgG é formada por duas cadeias polipeptídicas leves e duas pesadas em forma de Y,
ao qual se associa um pequeno número de grupos carboidrato. Uma parte da molécula é constante;
as regiões variáveis localizadas nas extremidades dos braços do Y respondem pelo reconhecimento do
antígeno (Figura 4.7).
Em condições experimentais de laboratório, essa reação antígeno-anticorpo ocorre quando os
reagentes se encontram em meio líquido e nas concentrações adequadas, sendo visualizada como uma
precipitação, se os antígenos estiverem dissolvidos em um meio líquido ou em um gel (poliacrilamida)
ou uma aglutinação, se os antígenos estiverem localizados sobre partículas (hemácias ou bactérias).
A união antígeno-anticorpo ocorre quando um anticorpo encontra no antígeno uma forma
complementar, geralmente parte de uma molécula livre ou ancorada na membrana celular. Um
antígeno pode ter várias destas formas (epítopos ou determinantes antigênicos) e ser reconhecido por
anticorpos diferentes (Figura 4.8).
---------------FIGURA 4.7. A estrutura da molécula de anticorpo (IgG)
Cadeia leve
Cadeia pesada
Região constante
Região variável
40
Sítio de ligação com o antígeno
A PRODUÇÃO DE ANTICORPOS NO ORGANISMO
As células responsáveis pela produção de anticorpos são os linfócitos B, que se formam na medula
óssea. Depois de um processo de diferenciação que envolve uma série de rearranjos genéticos, cada
linfócito pode reconhecer um único epítopo (Figura 4.9).
Ao encontrar o epítopo específico, o linfócito B prolifera, originando um clone de células secretoras
de anticorpos. Uma vez eliminado o antígeno, algumas células desse clone permanecerão no
organismo como células-memória. Em um contato posterior com o mesmo epítopo, as célulasmemória darão início à resposta imune, que será mais rápida e mais intensa que a primeira.
Apesar de cada linfócito ser capaz de reconhecer um único epítopo, todos os linfócitos podem
reconhecer aproximadamente 108 epítopos diferentes, o que explica a eficiência da resposta imune.
---------------FIGURA 4.8. Os anticorpos e o reconhecimento do antígeno
Observe-se que, ao compartilhar estruturas (determinantes antigênicos ou epítopos), alguns antígenos podem
ser reconhecidos por um mesmo anticorpo, dando origem a uma reação cruzada.
Antígeno 1
Antígeno 2
Anticorpos
Antígeno 3
Anticorpos
Antígeno 4
Anticorpos
Anticorpos
FIGURA 4.9. O encontro do linfócito B e do antígeno, e a seleção clonal
Antígeno
Linfócitos B
de diferente especificidade
Seleção do linfócito específico
Proliferação celular e secreção do anticorpo correspondente
41
http://bteduc.com
A PRODUÇÃO DE ANTICORPOS NO LABORATÓRIO
Os anticorpos ocupam um lugar de destaque nos testes de diagnóstico clínico, por reunir duas
propriedades que os transformam em uma ferramenta ideal: especificidade e diversidade.
A injeção de animais (ratos, ovelhas, coelhos) com um antígeno induz em pouco tempo a produção
de anticorpos específicos que podem ser separados do soro sanguíneo do animal.
---------------FIGURA 4.10. A produção de anticorpos no laboratório
. Obtenção de anticorpos policlonais
B. Obtenção de anticorpos monoclonais
Injeção de uma
mistura de moléculas
Linfócitos B
Células de mieloma
Hibridomas
A: A produção de anticorpos policlonais.
Recolhe-se o soro de um animal imunizado
contra uma mistura de moléculas entre as quais
está a molécula X. No soro se encontrarão
misturados
anticorpos
de
diferente
especificidade, um dos quais reconhece X.
B: A produção de anticorpos monoclonais.
Injeta-se em um animal a mesma mistura de
moléculas; dias mais tarde, extrai-se o baço do
animal e fusionam-se os linfócitos B (alguns dos
quais reconhecem a molécula X) com células de
mieloma. Os hibridomas são separados,
cultivados e testados para identificar os que
produzem anticorpos contra X.
42
Cada hibridoma
origina um clone
Cada clone origina um
único tipo de anticorpo
FIGURA 4.11. Os ensaios imunológicos
A. Associação dos anticorpos com moléculas fluorescentes
O anticorpo marcado pode reconhecer diretamente o antígeno (reação direta) ou reconhecer o anticorpo unido ao
antígeno (reação indireta).
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
Antígeno
Anticorpo específico do antígeno,
associado a uma molécula fluorescente
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Antígeno
Anticorpo
específico
do antígeno
Anticorpo específico para a fração
constante dos anticorpos, associado
a uma molécula fluorescente
B. Associação dos anticorpos com enzimas
O antígeno pode ser reconhecido por um anticorpo associado a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um
produto colorido (reação direta). Também pode ser reconhecido por um anticorpo específico, e este por um anticorpo que
reconhece a fração constante do anticorpo. O segundo anticorpo está associado a uma enzima que, ao reagir com o seu
substrato específico, forma um produto colorido (reação indireta).
REAÇÃO IMUNOENZIMÁTICA DIRETA
Substrato específico
da enzima
Antígeno
Anticorpo específico
do antígeno, associado à enzima
Formação de um produto
colorido
REAÇÃO IMUNOENZIMÁTICA INDIRETA
Substrato específico
da enzima
Antígeno
Anticorpo
específico
do antígeno
Anticorpo específico para a
fração constante dos anticorpos,
associado à enzima
Formação de um produto
colorido
43
http://bteduc.com
Se o antígeno utilizado possuir vários epítopos, no soro extraído se encontrará uma mistura de
anticorpos, chamados “policlonais”, resultantes da ativação de vários clones de linfócitos B, cada um
dos quais reconhece um dos epítopos do antígeno. Observe-se que, além dos anticorpos específicos,
o soro também terá anticorpos contra eventuais impurezas do antígeno, e anticorpos contra outros
antígenos aos que o animal esteve exposto anteriormente. Em consequência, a purificação de um soro
será um processo longo e complexo a ser repetido a cada extração de sangue do animal. Contudo,
reagentes de laboratório deste tipo foram utilizados normalmente até a década de 1980.
Não é possível cultivar separadamente os linfócitos porque sobrevivem pouco tempo in vitro. A
obtenção de clones que sintetizem anticorpos específicos contra um único epítopo (monoclonais) só
se tornou possível com o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas (G. Kohler e C. Milstein, 1975).
Um hibridoma resulta da fusão entre um linfócito B e uma célula cancerosa de mieloma. Reunindo
as propriedades de ambas as células, cada hibridoma é capaz de sintetizar um único tipo de anticorpo
(monoclonal) e de se multiplicar indefinidamente no laboratório, seja em cultivo de tecidos, seja na
cavidade do peritoneu de um animal hospedeiro (Figura 4.10).
A UTILIZAÇÃO DOS ANTICORPOS
Os anticorpos monoclonais encontraram imediatamente aplicações, substituindo praticamente os
anticorpos policlonais, tanto na purificação de biomoléculas e células como nos testes de diagnóstico
clínico ou ambiental ou no controle de qualidade dos alimentos.
Anticorpos específicos fixados nas partículas de uma coluna de afinidade permitem separar
moléculas de uma mistura que circule por ela. Outra utilização extremamente engenhosa está na
separação de populações celulares em um aparelho denominado cell sorter. As células são marcadas
com anticorpos ligados a uma molécula fluorescente; ao passar através de raios laser, adquirem cargas
elétricas, sendo separadas mediante uma placa defletora do equipamento.
A visualização da reação entre o antígeno e o anticorpo se vê facilitada quando o anticorpo recebe
alguma marcação direta, fluorescente ou radiativa, ou indireta, por associação com uma enzima que,
em presença do substrato correspondente, forma um produto colorido. No Western blotting, por
exemplo, um anticorpo marcado reconhece a presença de uma proteína determinada em uma
amostra, após eletroforese e transferência a uma membrana de nitrocelulose.
Associados a uma molécula radiativa, os anticorpos são utilizados na dosagem de substâncias
presentes nos fluidos corporais, sendo quantificada a radioatividade por exposição de uma placa
sensível. Em cortes histológicos, o antígeno é localizado pelos anticorpos acoplados a uma molécula
fluorescente que possa ser identificada microscopicamente (Figura 4.11).
A obtenção de anticorpos contra a fração constante da molécula de anticorpos humanos
representa um avanço considerável na produção de reagentes para o diagnóstico clínico. Nos ensaios
imunoenzimáticos como o teste ELISA (do inglês, Enzyme-linked Immunosorbent Assay), que detecta
anticorpos específicos no soro humano e tem numerosas aplicações em diagnóstico, utilizam-se os
anticorpos acoplados a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido
(Figura 4.11).
A utilização de anticorpos monoclonais com fins terapêuticos demorou muito mais que o esperado.
Sendo produzidos por células de camundongo ou de rato, eles são reconhecidos como estranhos
quando injetados no homem, formando-se complexos imunes que lesionam gravemente os rins.
A fim de evitar essas reações, começaram a ser elaborados anticorpos monoclonais quiméricos (33%
de proteína animal) e humanizados (10% de proteína animal). Estes conservam parte das sequências
animais, especialmente nas partes que reconhecem o antígeno, sendo o restante da molécula
substituído por sequências humanas. A obtenção de anticorpos monoclonais humanos mediante
técnicas de engenharia genética abre novos caminhos para o diagnóstico e o tratamento de doenças
(Tabela 4.4).
44
TABELA 4.4. Os anticorpos como agentes biológicos
AGENTES BIOLÓGICOS
APLICAÇÕES
Purificação de moléculas.
Reagentes de laboratório.
Anticorpos
Reagentes para diagnóstico.
Imunoterapias.
45
CAPÍTULO 5
OS ÁCIDOS NUCLEICOS
Embora descobertos em 1869, por F. Miescher, no pus das bandagens de ferimentos, o papel dos
ácidos nucleicos (DNA e RNA) na hereditariedade e no controle da atividade celular começou a ser
esclarecido apenas em meados do século XX.
O ácido desoxirribonucleico (DNA) carrega em sua estrutura as instruções necessárias para a
construção de um organismo, direcionando o desenvolvimento de suas características bioquímicas,
fisiológicas, anatômicas e, inclusive, algumas das comportamentais. Nos cromossomos o DNA se
encontra associado a diversas proteínas de importante ação regulatória. O ácido ribonucleico (RNA)
pode ser encontrado tanto no núcleo como no citoplasma.
As células procarióticas contêm um cromossomo circular de DNA e uma ou duas moléculas
adicionais de DNA extracromossômico, denominadas plasmídeos. Nas células eucarióticas, os
cromossomos estão formados por moléculas lineares de DNA. O DNA está localizado principalmente
dentro do núcleo celular, mas há também DNA em algumas organelas, como os cloroplastos e as
mitocôndrias.
Do ponto de vista químico, os ácidos nucleicos (ácido ribonucleico e desoxirribonucleico) são
macromoléculas formadas por unidades chamadas nucleotídeos, unidos por ligações químicas
covalentes (Figura 5.1). Um nucleotídeo resulta da associação de três tipos de elementos: uma
molécula de ácido fosfórico, um açúcar de cinco carbonos (ribose ou desoxirribose) e uma base cíclica
nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina ou uracila. Da união dos nucleotídeos entre as
extremidades 5' e 3', formam-se as cadeias de polinucleotídeos.
A DUPLA HÉLICE
Já na década de 1940, vários trabalhos indicavam que o material responsável pela hereditariedade era
o DNA, mas não se entendia “como” até 1953, quando J. D. Watson e F. Crick formularam um modelo
da estrutura tridimensional do DNA que, segundo suas próprias palavras, apresentava “considerável
interesse biológico”.
No modelo de Watson e Crick, duas cadeias de nucleotídeos formam uma figura parecida com uma
escada de corda torcida, a dupla hélice. Nessa escada, o ácido fosfórico e o açúcar são as partes
verticais (corrimãos) e as bases nitrogenadas são os degraus (Figura 5.1). As cadeias são antiparalelas,
isto é, se uma corre na direção 5'  3' a outra corre na direção 3'  5. Ambas as cadeias estão unidas
entre si por pontes de hidrogênio entre as bases, sendo que as ligações ocorrem sempre entre adenina
e timina (2 pontes) e entre citosina e guanina (3 pontes).
De acordo com o modelo, quando em um filamento a sequência de bases é AGTACG, no outro
filamento ela será TCATGC. Como as sequências são complementares, cada filamento pode servir
como molde para a síntese de uma nova molécula. E, no momento da divisão celular, cada célula-filha
poderá receber uma molécula semelhante à da célula-mãe (Figura 5.2).
O CÓDIGO GENÉTICO
O funcionamento de uma célula depende, fundamentalmente, de dois tipos de moléculas: os ácidos
nucleicos e as proteínas. Ambos estão relacionados, porque segmentos de DNA (genes) codificam a
estrutura primária de peptídeo. O código é simples: a cada trinca de bases corresponde um
aminoácido.
---------------FIGURA 5.1. Composição química dos ácidos nucleicos
Observe-se a posição dos grupos 3´ e 5´ no açúcar
O FOSFATO
Ácido fosfórico
Íon fosfato
Também representado como
UM DESOXIRRIBONUCLEOTÍD
O AÇÚCAR
Também representado como
na ribose
na desoxirribose
AS BASES
Purinas: adenina (A), guanina (G)
Ao carbono 1’ da pentose
Pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U)
Ao carbono 1’ da pentose
47
http://bteduc.com
FIGURA 5.2. A molécula de DNA
Na molécula de DNA, o pareamento das bases ocorre sempre entre uma purina e uma pirimidina: adenina e
timina ou uracila; guanina e citosina. Na duplicação, a síntese de duas moléculas semelhantes permite que cada
célula receba uma cópia do material genético, com as instruções necessárias para a construção e funcionamento
do indivíduo. Observe-se que o processo de duplicação envolve numerosas enzimas, sendo bem mais complexo
do que está representado.
A DUPLA-HÉLICE DE DNA
Extremidade 3’
Nucleotídeo
Nucleotídeo
Extremidade 5’
A DUPLICAÇÃO DO DNA
TABELA 5.1: O código genético
Abreviaturas: Asp = Ácido Aspártico; Glu = Ácido Glutâmico; Ala = Alanina; Arg = Arginina; Asn = Asparagina; Cys = Cisteína;
Phe = Fenilalanina; Gly = Glicina; Gln = Glutamina; His = Histidina; Ile = Isoleucina; Leu = Leucina; Lys = Lisina; Met = Metionina;
Pro = Prolina; Ser = Serina; Tyr = Tirosina; Thr = Treonina; Trp = Triptófano; Val = Valina.
PRIMEIRA BASE
URACILA (U)
CITOSINA (C)
ADENINA (A)
GUANINA (G)
48
URACILA (U)
Phe
Phe
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Leu
Ile
Ile
Ile
Met
Val
Val
Val
Val
SEGUNDA BASE
CITOSINA (C)
ADENINA (A)
Ser
Tyr
Ser
Tyr
Ser
Stop
Ser
Stop
Pro
His
Pro
His
Pro
Gln
Pro
Gln
Thr
Asn
Thr
Asn
Thr
Lys
Thr
Lys
Ala
Asp
Ala
Asp
Ala
Glu
Ala
Glu
GUANINA (G)
Cys
Cys
Stop
Trp
Arg
Arg
Arg
Arg
Ser
Ser
Arg
Arg
Gly
Gly
Gly
Gly
TERCEIRA BASE
(U)
(C)
(A)
(G)
(U)
(C)
(A)
(G)
(U)
(C)
(A)
(G)
(U)
(C)
(A)
(G)
A tabela 5.1 mostra quais aminoácidos correspondem às diferentes trincas de bases ou códons de
mRNA. Alguns são codificados por uma única trinca, como o triptófano (UGG) ou a metionina (AUG);
outros admitem vários códons que geram sinonímia como, por exemplo, a prolina (CCU, CCC, CCA,
CCG). O início da sequência é sinalizado por AUG, o códon correspondente a metionina, sendo este
aminoácido removido posteriormente; o fim da sequência é sinalizado por UAA, UAG ou UGA, três
códons que significam stop.
Mudanças na sequência de bases do DNA podem ter como consequência a substituição de um
aminoácido por outro. No exemplo da figura 5.3, se GUG for substituído por CGU, no peptídeo
correspondente a valina será substituída por leucina. Mas, em função da sinonímia do código, se a
trinca GUG for substituída por GUA ou GUC, o aminoácido codificado continuará sendo a valina. Perdas
ou adições de uma base modificam o resto da sequência do peptídeo.
A frequência com que ocorrem estas pequenas mudanças aumenta em presença de alguns agentes
químicos e físicos como a luz ultravioleta e os raios X.
A EXPRESSÃO GÊNICA
O FLUXO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA
A informação codificada no DNA é transcrita em uma molécula mensageira que a leva até os
ribossomos onde, após a tradução da linguagem dos ácidos nucleicos à linguagem das proteínas, será
montado o peptídeo correspondente. Deste modo, se estabelece na célula um fluxo da informação
genética que segue em uma direção única: do DNA ao RNA, do RNA ao peptídeo (Figura 5.3).
---------------FIGURA 5.3. O fluxo da informação genética
DNA
Filamento codificador
Filamento molde
TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO
r RNA
mRNA
tRNA + aminoácidos
Ribossomo
TRADUÇÃO
Transporta os aminoácidos
e os coloca no lugar adequado
Onde ocorre a síntese
Peptídeo
49
http://bteduc.com
Uma exceção a esta regra é a dos retrovírus, cujo material hereditário é RNA e que contam com uma
enzima (transcriptase reversa) que lhes permite transcrever a informação no sentido RNADNA.
Na síntese de proteínas intervêm, basicamente, um RNA codificador (RNA mensageiro ou mRNA) e
dois RNAs não codificadores, o RNA ribossômico (rRNA) e o RNA de transferência (tRNA).
As células procarióticas e eucarióticas apresentam algumas diferenças em relação às etapas da
síntese de proteínas e aos mecanismos de regulação correspondentes (Figura 5.3). No entanto, em
ambos os tipos de organismos, a informação genética codificada no DNA é transcrita no mRNA e
traduzida no ribossomo com a participação dos tRNAs. O produto final é um peptídeo.
CÉLULAS PROCARIÓTICAS
Uma bactéria pode contar com aproximadamente 2.500 genes; nem todos funcionando
simultaneamente. Se houver lactose no meio (e faltar glicose), as bactérias sintetizarão aquelas
enzimas que possibilitem sua utilização. E se faltar o aminoácido triptófano no meio, produzirão os
vários tipos de enzimas necessárias para sintetizá-lo.
---------------FIGURA 5.4. A organização e regulação dos genes nas células procarióticas
O funcionamento do óperon depende da função exercida pelos genes (degradação ou síntese). Por isso, a presença de lactose
induz a transcrição do óperon lac, sendo sintetizadas várias enzimas necessárias para degradá-la; em ausência de lactose, o
óperon deixa de funcionar. Já no óperon Trp, a presença de triptófano reprime a transcrição das enzimas necessárias para
sintetizar esse aminoácido.
Óperon
Gene
regulador
Gene
promotor
Gene
operador
Genes estruturais
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Sequência transcrita
Fim da transcrição
Em alguns óperons, o produto do gene regulador bloqueia a entrada
da RNA-polimerase no operador; em outros a desbloqueia
FIGURA 5.5. A organização e regulação dos genes nas células eucarióticas
As sequências sinalizadoras UTR não são traduzidas.
Gene
Sequências reguladoras
promotoras da transcrição
UTR
Sequências reguladoras
finalizadoras da transcrição
UTR
DNA
Unidade de transcrição
Inclui as sequências iniciais e finais, os éxons e os íntrons
Início da transcrição
50
Fim da transcrição
Isso se vê facilitado pela agrupação dos genes correspondentes em baterias (óperons), que são ligadas
ou desligadas em conjunto (Figura 5.4), permitindo que a célula se adapte rapidamente e com
economia de recursos às condições ambientais.
O processo de “ligar e desligar” envolve três regiões anteriores à sequência codificadora: o
promotor, o operador e o regulador. Para iniciar a síntese do mensageiro, a enzima RNA-polimerase
deve encaixar no promotor, de onde começará a se deslocar ao longo do gene. O deslocamento
depende de proteínas sintetizadas pelo gene regulador, que agem no operador de modo a abrir ou
bloquear a passagem. Este sistema regula a indução ou repressão da transcrição da sequência
codificadora.
Uma bactéria pode contar com aproximadamente 2.500 genes; nem todos funcionando
simultaneamente. Se houver lactose no meio (e faltar glicose), as bactérias sintetizarão aquelas
enzimas que possibilitem sua utilização. E se faltar o aminoácido triptófano no meio, produzirão os
vários tipos de enzimas necessárias para sintetizá-lo. Isto se vê facilitado pela agrupação dos genes
correspondentes em baterias (óperons), que são ligadas ou desligadas em conjunto (Figura 5.4),
permitindo que a célula se adapte rapidamente e com economia de recursos às condições ambientais.
Na célula procariótica, além dos genes funcionarem em bloco, a síntese proteica começa quando o
mRNA está ainda sendo transcrito, de maneira que a transcrição e a tradução são simultâneas. Uma
sequência específica que não é traduzida indica o sítio de união ao ribossomo.
CÉLULAS EUCARIÓTICAS
As bactérias não são as únicas que ligam e desligam os seus genes, mas, salvo em nematódeos, não
foram achados óperons nas células eucarióticas; os genes responsáveis por uma sequência de reações
metabólicas se encontram dispersos em um ou em vários cromossomos.
O controle da transcrição começa na compactação do cromossomo em redor das histonas e na
metilação de algumas bases, podendo dificultar o acesso da maquinaria de transcrição ao DNA. Esta
inclui fatores de ativação, fatores de transcrição e proteínas reguladoras, algumas das quais dependem
de outras sequências, estimuladoras e inibidoras, distantes do gene em até vários milhares de bases
(Figura 5.5). Fatores externos influenciam a expressão gênica nas células somáticas. No entanto,
estudos recentes indicam que esses efeitos epigenéticos podem gerar alterações nos gametas, sendo
transmitidos às seguintes gerações.
A TRANSCRIÇÃO
Ao reconhecer a presença dos fatores e proteínas reguladoras na região anterior ao gene, a RNApolimerase encaixa-se nas sequências promotoras da transcrição. Associada a outros fatores
adicionais, a enzima se desloca abrindo a dupla hélice e transcrevendo a sequência codificadora de um
ou outro filamento no RNA. A enzima avança na direção 5´- 3´, sendo que várias moléculas de RNApolimerase podem estar transcrevendo o mesmo gene simultaneamente em algo parecido com uma
fila indiana. Quando a RNA-polimerase encontra uma sequência finalizadora, a síntese acaba e a
molécula de RNA-polimerase será liberada.
Regiões denominadas UTR (do inglês untranslated regions), portadoras de sequências sinalizadoras
que não serão traduzidas, se localizam a montante e a jusante da unidade de transcrição. As sequências
reguladoras levam, além do sítio de união ao ribossomo, outras que podem determinar quando, por
quanto tempo e em que células o gene será transcrito.
O PROCESSAMENTO DO RNA TRANSCRITO
Nos organismos eucarióticos, a estrutura do gene é fragmentada (Figura 5.5). A sequência gênica é
transcrita por inteiro no RNA e, posteriormente, um mecanismo de “corte e reunião” irá eliminar
algumas das sequências intercalares. Estas permanecerão no núcleo (íntrons) enquanto as restantes
51
http://bteduc.com
(éxons) formarão o RNA mensageiro que sairá do núcleo na direção do citoplasma. O número e o
tamanho das sequências intercalares variam em diferentes genes.
As consequências biológicas deste mecanismo são importantes. Basta um número pequeno de genes
para codificar numerosas proteínas que serão sintetizadas utilizando as vias alternativas de “corte e
reunião”. Também permite que um único gene se expresse de maneira diferente em diversos
tecidos. O corte e reunião dos fragmentos não é a única modificação do RNA transcrito; este recebe
um revestimento inicial ou cap (7-metilguanosina) que o dirigirá ao ribossomo, e uma cauda de
poli(A) que lhe dará estabilidade na sua viagem até a maquinaria de tradução.
A TRADUÇÃO E O DESTINO DAS PROTEÍNAS
A síntese proteica se inicia depois do mRNA atravessar a membrana nuclear e migrar para o citoplasma.
Assim como a transcrição, a tradução envolve a participação de numerosas enzimas e proteínas
reguladoras.
Algumas moléculas de mRNA levam sequências sinalizadoras que as dirigem até os ribossomos
associados ao retículo endoplasmático, sendo as proteínas sintetizadas secretadas fora da célula.
Outras moléculas de mRNA serão traduzidas nos ribossomos livres no citosol, sendo as proteínas
resultantes utilizadas no mesmo lugar ou nas organelas celulares.
---------------FIGURA 5.6. As etapas da síntese de proteínas (Recapitulação)
A. Célula eucariótica
B. Célula procariótica
Citoplasma
DNA
Núcleo
Íntrons
Éxons
mRNA
DNA
Gene
Proteínas
TRANSCRIÇÃO
hnRNA
PROCESSAMENTO
Na célula eucariótica, o
processamento
envolve
a
adição de um revestimento
inicial e de uma cauda de poli-A,
além dos mecanismos de corte
e reunião
mRNA
mRNA
TRADUÇÃO
Proteína
52
O mRNA reconhece o ribossomo mediante uma sequência específica, e a associação entre ambos dá
início à síntese peptídica. Cada tRNA carrega o aminoácido correspondente até o ribossomo, onde a
complementariedade entre seu anticódon e um dos códons do mRNA garante que este coloque o
aminoácido no lugar adequado na sequência.
Existem vários mecanismos de regulação. Um deles envolve a ação de proteínas associadas ao
complexo ribossômico, outro determina variações na vida média do mRNA e a tradução do mRNA por
vários ribossomos ao mesmo tempo.
O peptídeo sintetizado passará por diversas modificações e associações, até se constituir no
produto final ativo, uma proteína com uma estrutura quaternária determinada. Uma visão geral
comparativa da síntese proteica em células eucarióticas e procarióticas (Figura 5.6).
O COMPLEXO MUNDO DOS RNAs
A DIVERSIDADE EXISTENTE
Na síntese proteica, o mRNA carrega uma parcela de informação genética do DNA até os ribossomos,
estruturas celulares formadas por rRNA e proteínas onde ocorre a síntese proteica. Os aminoácidos
são carregados por um dos 61 tipos de tRNA, cada um dos quais é capaz de reconhecer
simultaneamente um aminoácido e um códon do mRNA. Tanto o rRNA como os tRNA são transcritos
a partir de genes não codificadores de proteínas.
A participação dos RNAs na regulação da expressão gênica é bem conhecida. As ribozimas, por
exemplo, são RNAs com capacidade catalítica que desempenham funções na replicação e no
processamento do mRNA, sem necessidade de nenhum componente proteico. A existência deste tipo
de moléculas é um argumento a favor da existência de um mundo de RNA prévio à aparição do DNA e
das proteínas. Outras moléculas de RNA, os riboswitches, agem como sensores afetando a expressão
gênica, em resposta a fatores ambientais ou metabólicos.
A atividade regulatória do RNA é possível devido à sua estrutura molecular, que permite o
pareamento com uma molécula de sequência complementar. E também a suas propriedades de se
associar a proteínas e de desenvolver uma atividade catalítica.
Nos últimos anos começou a ser desvendada a existência de pequenas moléculas de RNA não
codificadoras (sRNA, do inglês small RNA), que regulam as atividades celulares. Em procariontes, os
sRNAs determinam modificações metabólicas e estão envolvidos na defesa contra os vírus.
Em eucariontes, a variedade é muito ampla: os pequenos RNAs nucleares (snRNA) associados a
proteínas participam no mecanismo de corte e reunião e na remoção dos íntrons; os pequenos RNAs
nucleolares (snoRNA) processam o RNA ribossômico no nucléolo. Originados a partir de diferentes
moléculas precursoras, os microRNAs (miRNA) participam na repressão do mecanismo de tradução.
Novos tipos de RNA, de sequência mais longa (lncRNA, do inglês, long non coding DNA) cumprem
funções regulatórias, como a inativação do cromossomo X. Menos clara por enquanto é a função dos
RNAs transcritos antisense e dos transcritos a partir de pseudogenes, que sempre foram considerados
não funcionais.
INTERFERÊNCIA E SILENCIAMENTO GÊNICO
O fenômeno de interferência foi descoberto quando, com o objetivo de intensificar a produção de
pigmentos em petúnias, a inserção de um gene extra originou flores brancas em vez das flores O
fenômeno de interferência foi descoberto quando, com o objetivo de intensificar a produção de
pigmentos em petúnias, a inserção de um gene extra originou flores brancas em vez das flores
53
http://bteduc.com
ultracoloridas esperadas. Posteriormente, observou-se um fenômeno similar no desenvolvimento de
C. elegans, onde pequenas moléculas de RNA resultantes da clivagem de RNAs transcritos inibem a
tradução de diversos mRNAs.
Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas bifilamentares de 21 a 25 pares de nucleotídeos
que agem como silenciadores de mRNA, regulando a tradução. Sua descoberta, mostrando como esses
miRNA controlam a expressão dos genes, valeu a A. Fire e C. Mello o Prêmio Nobel de Medicina de
2006. Estima-se que existiriam entre 300 e 500 miRNAs regulando pelo menos a quarta parte dos genes
humanos.
Nos últimos anos, esse fenômeno de silenciamento gênico tem se transformado em uma
importante ferramenta de pesquisa. Sintetizadas no núcleo, as moléculas de miRNA de filamento
duplo são clivadas por enzimas no citoplasma, formando pequenos fragmentos de aproximadamente
20 nucleotídeos. A associação entre um pequeno fragmento de RNA e um complexo proteico (RISC, do
inglês RNA-induced silencing complex) desencadeia a degradação de um dos filamentos. O filamento
restante permanece associado a RISC, podendo parear com qualquer molécula de RNA, parcial ou
totalmente complementar, e causar sua degradação (Figura 5.7). Trata-se de uma forma de controle
da expressão gênica na célula, porque o miRNA afeta a tradução de qualquer RNA homólogo.
Por outro lado, do ponto de vista biológico, o fenômeno de silenciamento constituiria também uma
reação de imunidade inata das bactérias à infecção por vírus de RNA. O mecanismo de ação dos RNAs
envolvidos é semelhante ao do miRNA, porque utilizam a mesma maquinaria enzimática da célula.
Contudo, se no caso do miRNA de origem endógeno, descrito anteriormente, a molécula precursora
originava uma única molécula interferente, no caso da infecção por RNA exógeno formam-se vários
tipos de molécula interferente.
---------------FIGURA 5.7. O silenciamento gênico
O silenciamento gênico é uma forma de controle da expressão gênica na célula, porque o miRNA interfere na
tradução de um mRNA homólogo; também é uma forma de resistência à infecção viral.
Molécula de miRNA de dois filamentos
(20 nucleotídeos aproximadamente)
Complexo enzimático RISC
mRNA endógeno ou RNA viral
As duas moléculas são
complementares
(6 bases, mínimo)
Pareamento parcial e bloqueio da tradução
54
Pareamento total e destruição do RNA
O fenômeno existe em bactérias, plantas, drosófilas, camundongos e em seres humanos. Ferramenta
poderosa no laboratório, a injeção na célula de um RNA artificial de sequência parcialmente
semelhante à do DNA de um gene determinado permite silenciar parcialmente sua expressão, de
maneira transiente e sem danificar a célula.
Espera-se que algumas das primeiras aplicações do knockdown por silenciamento de mRNA estejam
relacionadas com testes clínicos e com a repressão de genes implicados no câncer, na degeneração
macular devida à idade e na amiloidose.
O GENOMA HUMANO
O MAPEAMENTO DO GENOMA
O termo genoma designa o conjunto completo de cromossomos haploides que contém toda a
informação genética de um indivíduo. Na espécie humana, o genoma nuclear compreende as 24
moléculas de DNA que formam os diferentes cromossomos (22 autossômicos, X e Y). Devido à
presença de DNA nas mitocôndrias, existe também um genoma mitocondrial de herança
exclusivamente materna, que conta com 37 genes, incluindo os genes codificadores de tRNA e rRNA
utilizados na síntese proteica dentro dessa organela.
Em 1990, teve início o Projeto Genoma Humano (HGP, do inglês Human Genome Project), um dos
projetos científicos mais ambiciosos já realizados, envolvendo pesquisadores de mais de 18 países na
tarefa de mapear e sequenciar o DNA humano e também o de outros organismos.
O projeto encontrou grandes resistências, em parte devido a seu custo faraônico comparável aos
dos projetos Manhattan ou Apolo, em parte pelas consequências que poderia trazer para a sociedade.
A resposta ao público foi o lançamento como parte integral do projeto do programa The Ethical, Legal
and Social Implications (ELSI) Research Program de pesquisa básica e aplicada sobre as implicações
éticas, legais e sociais dos estudos sobre o genoma para os indivíduos, as famílias e as comunidades.
Paralelamente ao mapeamento do genoma humano, milhares de outros organismos (microrganismos,
plantas e animais) foram parcial ou totalmente sequenciados.
Em junho do ano 2000, o International Human Genome Sequencing Consortium e a Celera
Genomics, uma empresa privada norte-americana, anunciaram simultaneamente ter completado o
primeiro rascunho do genoma humano. Os resultados foram publicados em fevereiro de 2001, nas
revistas Nature e Science. Em abril de 2003, cinquenta anos depois da descoberta da dupla hélice, o
Consórcio anunciou ter completado 99% do mapeamento. Os seus resultados estão armazenados em
bancos de dados públicos que podem ser acessados via Internet. As principais conclusões podem ser
resumidas da seguinte forma:
o O número de bases no genoma humano chega a 3,2 bilhões, e o número de genes a um valor entre
20.000 e 25.000 genes; só 1,5% do genoma codificaria proteínas.
o O número de genes em organismos como a mosca Drosophila melanogaster ou o verme
Caenorrabditis elegans é três vezes menor. Compartilhamos com estes organismos alguns genes e
contamos com outros que são característicos dos vertebrados como, por exemplo, vários dos genes
referentes ao sistema imune.
o A densidade dos genes em diversos cromossomos e em diferentes partes deles varia. Existem
grandes espaços entre os genes, às vezes chamados de DNA-lixo. Sequências repetidas, não
codificadoras, cuja função direta ainda não é bem conhecida, ocupam pelo menos 50% do genoma.
o O tamanho dos genes é variável, sendo na média de 3.000 bases. Na realidade, o tamanho não
parece ter muita importância. Como boa parte dos genes poderia ser lida de diversos modos, o
número de proteínas poderia ser bem maior.
55
http://bteduc.com
o Independentemente de nossa origem étnica, compartilhamos com os outros seres humanos 99,9%
da sequência gênica.
o As diferenças entre os seres humanos se devem a variações de uma base em 3.000.000 de pontos
dentro e fora dos genes. Estas variações são denominadas polimorfismos de um nucleotídeo único
ou SNPs (do inglês, single nucleotide polymorphisms). Os SNPs podem dar informações sobre a base
genética da susceptibilidade a uma série de doenças ou servir como marcadores das mesmas
(doença cardiovascular, diabetes, artrite e cânceres).
o Em vários genes foram encontradas sequências associadas a doenças (câncer de mama, cegueira,
surdez, doenças musculares).
Vários países de América Latina (Argentina, Brasil, Chile e México) desenvolveram ou participam em
projetos de genômica. De um modo geral, esses projetos envolvem parcerias entre instituições
públicas e privadas, sendo beneficiados por acordos internacionais com países desenvolvidos (Estados
Unidos, França, Alemanha) ou por redes de cooperação inter-regionais (Brasil, Argentina, Chile,
Uruguai e Paraguai). Um dos primeiros êxitos foi o sequenciamento por pesquisadores brasileiros da
bactéria Xylella fastidiosa, causadora da praga do amarelinho das videiras (2000).
OS AVANÇOS POSTERIORES
Nos últimos anos, os custos e o tempo necessários para sequenciar um genoma diminuíram
extraordinariamente. Atualmente, muito do trabalho feito por robôs e computadores está altamente
automatizado, e a informação está armazenada em grandes bancos de dados, acessíveis pela Internet.
O desenvolvimento da Bioinformática, um conjunto de novas tecnologias que utiliza métodos
computacionais e matemáticos para analisar a informação, tem sido fundamental para o progresso
dos estudos sobre os genomas. Muitos dos estudos atuais não são mais feitos in vivo nem in vitro, mas
in silico.
Ao Projeto Genoma sucederam outros projetos, alguns deles concluídos e outros em andamento,
desenvolvidos por redes de cooperação internacional. O projeto HapMap (do inglês, Map of Human
Genetic Variation) publicou um catálogo das variações genéticas que ocorrem nos seres humanos.
O projeto ENCODE confirmou ser pouco mais de 20.000 o número de genes codificadores de
proteínas e descobriu que 80% do DNA restante cumpre alguma função reguladora, de modo que não
pode ser considerado “lixo”.
O Projeto Epigenoma Humano irá identificar, catalogar e interpretar os padrões de metilação dos
genes humanos em cada tecido. Como estes padrões mudam em resposta a fatores exógenos, o
epigenoma pode ser um elo unindo genes, doença e ambiente.
O Projeto Genoma do Câncer fornece informação sobre a doença e especialmente sobre o câncer
de pulmão e o melanoma maligno.
O Projeto dos 1000 Genomas visa sequenciar o conjunto de um número amplo de pessoas. O
Projeto UK10K do Wellcome Trust, lançado em 2010, visa comparar os genomas de 4.000 pessoas
saudáveis com os de 6.000 pessoas afetadas por uma doença de presumida origem genética.
A Genômica surgiu como uma nova disciplina que tenta responder a algumas questões
fundamentais: Onde estão os genes? O que faz cada gene? Como diferem os organismos em relação a
seus genes? Cada uma dessas perguntas criou especialidades como a Genômica estrutural, a Genômica
funcional ou a Genômica comparativa.
No rastro do Genoma, outras perguntas começam a ser formuladas e surgem outras áreas de
investigação:
o A transcriptômica, concernente ao RNA transcrito ou transcriptoma, isto é, aos padrões de
expressão gênica.
56
o A proteômica, referente ao conjunto de proteínas da célula ou proteoma, que varia ao se
diferenciarem as células e em resposta a estímulos ambientais.
o A metabolômica, relativa ao conjunto de substratos e subprodutos de reações enzimáticas que
incidem no fenótipo celular.
DNA E RNA COMO AGENTES BIOLÓGICOS
A genômica encontrou aplicações imediatas no campo médico e farmacológico, como os testes
genéticos e de medicamentos novos (Tabela 5.2). Em função da importância econômica dos produtos
farmacológicos, a questão das patentes voltou a estar no centro das atenções. Em 2013, a Suprema
Corte dos Estados Unidos determinou que o DNA natural não pode ser patenteado. A discussão está
centrada atualmente em redor dos procedimentos e de sequências especialmente desenhadas para
testes de diagnóstico.
Nas áreas de agricultura e saúde, a interferência gênica tem sido utilizada na triagem de genes
funcionais em cultivos celulares e organismos modelos. Sabe-se que cumpre uma função reguladora
no amadurecimento das células sanguíneas em mamíferos e está envolvido em vários tipos de câncer,
obesidade e doenças autoimunes. Vários medicamentos baseados no fenômeno de interferência
gênica se encontram em fase de testes clínicos, sendo que a principal dificuldade está na administração
do RNA.
---------------TABELA 5.2. Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) como agentes biológicos
AGENTES
BIOLÓGICOS
APLICAÇÕES
Identificação de microrganismos patogênicos.
Controle da qualidade dos alimentos.
Medicina molecular (diagnósticos, tratamentos personalizados, terapias
gênicas).
DNA, RNA e
genômica
Testes genéticos (diagnósticos, avaliação dos riscos de saúde).
Agronomia e pecuária (métodos seletivos mais eficientes).
Indústria farmacológica (proteínas terapêuticas, vacinas recombinantes e
de DNA).
Prática forense (identificação das pessoas).
Estudos antropológicos e evolutivos.
57
CAPÍTULO 6
BIOPROCESSOS
BIOPROCESSOS, PROCESSOS FERMENTATIVOS E INDÚSTRIA
A produção de vinhos e cervejas é o primeiro processo fermentativo desenvolvido em escala industrial.
Ao longo do século XX, a expansão da Microbiologia Industrial possibilitou, mediante o
desenvolvimento de processos baseados no metabolismo microbiano, a produção de diversas
substâncias (acetona, butanol, etanol, ácido cítrico, antibióticos etc.). Atualmente, as fermentações
encontram aplicações novas, tanto no tratamento ambiental como na produção de alimentos e
aditivos, de produtos químicos e de medicamentos.
Tradicionais ou revigorados pelas possibilidades oferecidas pela manipulação gênica, os
bioprocessos ou "fermentações" visam um dos seguintes objetivos:
o
A multiplicação de microrganismos para a obtenção de biomassa (leveduras, rizobios, proteína de
célula única);
o
A obtenção de produtos microbianos (antibióticos, aditivos, álcool, enzimas etc.);
o
A conversão de um substrato em outro, por ação de microrganismos ou de enzimas
(transformação de esteroides, isomerização de glicose em frutose) ou
o
A purificação de um solvente (tratamento de efluentes, transformação de algum poluente em
alguma substância facilmente degradável etc.).
Por motivos históricos, os biotecnólogos ainda utilizam o termo processos fermentativos para qualquer
processo microbiano operado em grande escala, independentemente de ser ou não uma fermentação.
O recipiente onde ocorre o processo é chamado de biorreator ou fermentador (Figura 6.1). Células
animais e vegetais também podem ser cultivadas em escala, como será visto no próximo capítulo sobre
cultura de tecidos.
OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAIS
NOÇÕES SOBRE O METABOLISMO PRIMÁRIO E SECUNDÁRIO
Denominamos metabolismo o conjunto de reações químicas de degradação (catabolismo) e de síntese
(anabolismo) de substâncias em um organismo. As primeiras liberam energia, as outras a consomem.
As células e a maioria dos microrganismos retiram dos compostos orgânicos a energia que
precisam, para a manutenção de sua estrutura e para suas atividades. Nas vias catabólicas, a
degradação de compostos orgânicos em moléculas menores libera energia; uma parte desta será
acumulada sob a forma de ATP (trifosfato de adenosina), e a restante dissipada como calor.
OS BIOPROCESSOS
Respiração e fermentação são as principais vias catabólicas (Figura 6.2). A quantidade de energia
liberada e os produtos finais diferem se a oxidação do composto orgânico for total ou parcial. Na
glicólise, a glicose é degradada até uma molécula de três carbonos, o piruvato. Em presença de
oxigênio, a entrada do piruvato no ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa permitem a quebra total da
glicose em CO2 e H2O, liberando uma grande quantidade de energia sob a forma de ATP (respiração
aeróbia).
Mediante a redução do piruvato ou de algum de seus derivados (fermentação), vários
microrganismos geram outras substâncias orgânicas: acetona, butanol, etanol, ácido láctico, ácido
acético, glicerol etc.
Estas reações ocorrem geralmente em ambientes onde o substrato é abundante, sendo pequena
a quantidade de energia obtida. Dependendo das condições ambientais, isto é, da presença ou
ausência de oxigênio, algumas leveduras e bactérias (assim como as células musculares) podem
respirar ou fermentar.
A respiração e algumas fermentações são representadas mediante equações, como a seguir:
o Respiração aeróbia:
C6H12O6 + 6 O2 +38 ADP + 38Pi
Glicose
6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP
o Fermentação alcoólica (leveduras como S. cerevisiae e algumas bactérias):
C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi
Glicose
CH3 CH2OH
Etanol
+ CO2
+ 2 ATP
o Fermentação láctica (bactérias como Streptococcus e Lactobacillus):
C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi
Glicose
CH3 CHOH COOH + 2 ATP
Ácido láctico
No metabolismo, os caminhos de degradação e de síntese se entrecruzam. Em determinados pontos
da via catabólica da glicose, outras moléculas (aminoácidos, ácidos graxos) convergem para a produção
de energia e de pequenas moléculas simples (CO2, H2O e NH3). Inversamente, alguns dos compostos
intermediários do catabolismo são os pontos de partida para vias anabólicas.
Entretanto, as vias metabólicas não são reversíveis: o caminho seguido na degradação de uma
substância é parcial ou totalmente diferente do caminho de síntese correspondente, podendo
inclusive ocorrer em compartimentos celulares diferentes. Esta separação facilita a regulação
enzimática do metabolismo, que ocorre com menor desperdício de matéria e energia.
AS FASES DE CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA
De um modo geral, quando os microrganismos se desenvolvem em um meio com uma quantidade
limitada de nutrientes, a população passa por diversas fases (Figura 6.3A).
o
o
o
o
Fase lag: período de adaptação em que, apesar de não se multiplicar, os microrganismos sintetizam
enzimas e constituintes celulares.
Fase log: a população cresce de maneira exponencial, sendo sintetizados numerosos metabólitos
primários.
Fase estacionária: devido ao esgotamento dos nutrientes e à acumulação de excretas, algumas
células morrem, enquanto outras se dividem. No fim da fase log e início da fase estacionária
começam a ser sintetizados os metabólitos secundários.
Fase de declínio: sem a renovação dos nutrientes, as células morrem em um tempo variável.
59
http://bteduc.com
FIGURA 6.1. O processo fermentativo genérico
FASE DE LABORATÓRIO
Preparação do inóculo
FASE INDUSTRIAL
Preparação do meio
Esterilização
Ar
Controles (temperatura, pH)
Esterilização
Tratamento final
Subprodutos
Produtos
Resíduos
FIGURA 6.2. Respiração e fermentação
Na respiração, onde o último aceptor de elétrons é o oxigênio, a oxidação de glicose se completa até chegar a
CO2 e H2O, produzindo 36-38 moléculas de ATP. Na fermentação, o último aceptor de elétrons é o piruvato ou
algum outro derivado, produzindo 2 ATP.
Glicose
GLICÓLISE (2 ATP)
Citoplasma
Ácido pirúvico
Sem O2
FERMENTAÇÃO
Com O2
RESPIRAÇÃO
Ciclo de Krebs e cadeia respiratória
CO2 , H2O e 36-38 ATP
60
Citoplasma (procariontes)
Mitocôndria (eucariontes)
Substância orgânica
(etanol, ácido láctico)
OS BIOPROCESSOS
Além das vias metabólicas primárias, que são comuns a todos os microrganismos, existem outras vias
metabólicas secundárias específicas. A ativação de umas e/ou de outras depende do microrganismo e
das condições em que ele se desenvolve em seu ambiente natural ou em que irá ser cultivado.
Os metabólitos primários estão relacionados com o crescimento dos microrganismos e a
transformação de nutrientes em biomassa; sendo os principais exemplos o etanol, o ácido láctico ou
os aminoácidos. Mesmo não sendo essenciais, os metabólitos secundários permitem a sobrevivência
em ambientes extremamente competitivos e com escassos nutrientes. São metabólitos secundários
os antibióticos, os alcaloides, os pigmentos, algumas enzimas e toxinas.
Com vistas ao desenvolvimento de um bioprocesso, a escolha do microrganismo terá que ser feita
em função de suas vias metabólicas; e as condições de cultivo dependerão do objetivo da fermentação,
um metabólito primário ou um metabólito secundário (Figura 6.3B).
--------------FIGURA 6.3. As diversas fases do crescimento de uma população microbiana e a produção de metabólitos
A. As fases de crescimento de uma população
Log do número
de células
Tempo
Fase lag
B.
Fase log
Fase estacionária
Fase de declínio
A produção de metabólitos primários e secundários
Os nutrientes do meio permitem a multiplicação celular e a formação do metabólito primário, que pode ser
utilizado pelas células para sintetizar o metabólito secundário (a); este pode também ser sintetizado diretamente
a partir de alguma substância do meio (b).
Meio nutriente
Células
Metabólito primário
a
Metabólito secundário
b
61
http://bteduc.com
MEIOS DE CULTURA E MATÉRIA-PRIMA
A composição do meio de cultura depende das necessidades metabólicas do microrganismo escolhido.
Este deve conter todos os nutrientes necessários nas concentrações adequadas, que variam em função
do microrganismo e do objetivo do processo. Em geral, os meios de cultura utilizados no laboratório
incluem:
o Água.
o Uma fonte de energia e de carbono: glicose, amido etc.
o Uma fonte de nitrogênio: inorgânica (sulfato de amônia, nitrato de potássio etc.), orgânica (asparagina,
succinato de amônia, glutamato, ureia etc.) ou complexa (farinha de soja, peptona etc.).
o Sais minerais, tais como fosfato de potássio (K2HPO4 ou KH2PO4), sulfato de magnésio (MgSO4 7H2O), cloreto
de cálcio (CaCl2) etc.
o Elementos-traço: ferro, zinco, manganês, cobre, cobalto, molibdênio.
Com vistas a uma exploração comercial, os meios definidos são substituídos na indústria por matériasprimas de baixo custo como, por exemplo, soro de leite, melaço de cana ou de beterraba, amido de
milho etc. Em alguns casos, a matéria-prima passa por um tratamento prévio com métodos físicos e/ou
químicos.
No caso de se tratar de um processo enzimático, o meio deverá levar, além do substrato adequado,
os elementos necessários para que a enzima possa desenvolver sua atividade catalítica (precursores,
cofatores etc.).
A OBTENÇÃO DAS LINHAGENS
De um modo geral, para que o cultivo em um fermentador resulte economicamente viável, o
microrganismo deve ser capaz de se multiplicar rapidamente, sintetizando grande quantidade do
produto a partir de uma matéria-prima barata. Existem Bancos e Coleções de Cultura que vendem esse
tipo de linhagens de microrganismos como culturas puras, geneticamente estáveis e aptas para o
cultivo em grande escala.
Apesar de terem sido isoladas do meio ambiente, as linhagens industriais diferem substancialmente
das linhagens originais, em virtude de uma série de alterações genéticas (mutações, recombinações)
obtidas no laboratório. Atualmente, as grandes empresas selecionam os microrganismos mais
eficientes mediante um processo de evolução dirigida, miniaturizado em plataformas robóticas (Figura
6.4).
A triagem de alta produtividade (HTS, do inglês high throughput screening) permite a seleção em
paralelo de milhares de linhagens e a realização dos ensaios biológicos básicos, em menos tempo e
com menor consumo de reagentes que os métodos tradicionais. Testes com centenas de milhares de
amostras diárias tornam-se rotineiros e acessíveis, graças aos recentes avanços em métodos
fluorescentes e sistemas robóticos que colocam líquidos em quantidades nanométricas.
Nas linhagens industriais, algumas vias metabólicas, especialmente as do metabolismo secundário,
podem ter sido alteradas, de maneira a aumentar ao máximo a síntese do produto desejado e evitar a
produção de algumas substâncias desnecessárias. Em geral, por estar tão selecionadas geneticamente,
tendo inclusive algumas vias metabólicas anuladas ou desbalanceadas, estas linhagens sobrevivem
pouco tempo no meio ambiente. Porém, como norma geral, as linhagens industriais não devem ser
patogênicas nem produzir toxinas. A produção de medicamentos ou de vacinas é um caso crucial,
porque exige medidas de segurança estritas.
62
OS BIOPROCESSOS
Os microrganismos constituem um grupo biológico muito diversificado e, ainda, pouco conhecido, por
isso existem muitas expectativas em relação à prospecção de linhagens em ambientes extremos ou
pouco usuais. Não se precisa desenvolver um processo novo para cada microrganismo que apresente
alguma característica comercial interessante. A tendência atual é transferir os genes correspondentes,
por engenharia genética, a algum dos microrganismos conhecidos, adaptados às condições industriais.
--------------FIGURA 6.4. A metodologia HTS para triagem e evolução dirigida de linhagens bacterianas
106 – 1010 de variantes
bacterianas
Biblioteca de mutantes
Gene parental
Mutação
Transformação
Próxima rodada seletiva
Mutante mais eficiente
Triagem
Transferência das colônias
a microplacas
Triagem por métodos colorimétricos,
fluorescentes ou por luminescência
OS DIFERENTES TIPOS DE BIOPROCESSOS
OS PROCESSOS TRADICIONAIS
Algumas fermentações se desenvolvem sobre resíduos agroindustriais ou florestais, como grãos,
palha, bagaço, serragem etc. Este tipo de fermentação em meio sólido umedecido é utilizada na
produção de alimentos como, por exemplo, o levedo da massa na panificação, a maturação de queijos
por ação de fungos (roquefort, gorgonzola), o cultivo de fungos, a fermentação do cacau, do café e do
chá etc. Na Ásia, a preparação do koji, soja fermentada, é a base de alimentos tradicionais como o tofu,
o missô, o shoyu e o sakê.
Em alguns lugares, estas fermentações ainda ocorrem artesanalmente, dentro de folhas de
bananeira e cestas de bambu ou mesmo em montões; também existem hoje equipamentos
sofisticados com bandejas, colunas, frascos e tambores rotativos, alguns totalmente automatizados
(Figura 6.5 A).
Outra variante interessante do processo fermentativo é a produção tradicional de vinagre
(processo francês ou de Orléans) em barris de carvalho. O vinho é inoculado com bactérias do gênero
Acetobacter que formam na superfície a "mãe do vinagre", uma película que flutua, presa a um
quadriculado de madeira que a impede de afundar. Deste modo, o microrganismo cresce na superfície
de um meio líquido, em contato simultâneo com o ar e com o meio.
O processo fornece excelentes vinagres, mas é lento e exige muito espaço, sendo a capacidade de
cada barril de 200 litros (Figura 6.5 B). Existem outros processos semelhantes, conduzidos por fungos,
que formam uma película de micélio na superfície do líquido.
63
http://bteduc.com
FIGURA 6.5. Modelos de biorreatores utilizados em processos tradicionais
C.
Biorreator para fermentações em fase sólida
Controles
Injeção de ar
Umidade
Saída de ar
Bandejas com a matéria-prima para
o cultivo de microrganismos
D. A produção de vinagre (Método de Orléans)
Tubo para adicionar o vinho
Entrada de ar
Mãe do vinagre
Mosto
Retirada do vinagre
FIGURA 6.6. Modelo de biorreator utilizado em fermentações submersas
Motor
Vapor
Bomba
Entrada de ácido ou de base
Indicador de pressão
Sonda de pH
(controle)
Misturador
Saída
de gases
Sonda de temperatura
(controle)
Vapor
Entrada de ar
Saída do produto
64
OS BIOPROCESSOS
OS PROCESSOS SUBMERSOS
O desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do processo, respondendo eventualmente a
diversos imperativos, tais como a esterilização do sistema, a aeração e homogeneização do meio, o
acréscimo de nutrientes e de aditivos antiespumantes, a manutenção do pH etc.
A maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de vidro ou de aço. Os agentes
biológicos submersos no meio de cultivo ocupam somente 75% da cuba porque, se for necessário
injetar ar, formará espuma.
--------------FIGURA 6.7. Fermentações, agentes biológicos e biorreatores
FERMENTAÇÕES SUBMERSAS
Podem ser conduzidas por
CÉLULAS E ENZIMAS
Livres
Imobilizadas
Em suportes inertes
Reatores com
agitação mecânica
Entre membranas
Reatores com
agitação pneumática
Reatores de
leito fixo
Reatores
em torre
Reatores STR
Reatores de
fibra oca
ou com
membranas planas
ou de leito
fluidizado
Coluna de bolhas
Reatores air-lift
65
http://bteduc.com
Os modelos de fermentadores mais utilizados com microrganismos contam com aeração e agitação
mecânica. Esta facilita a distribuição dos nutrientes, mas o calor gerado deve ser eliminado mediante
a circulação de água fria (Figura 6.6). Se o processo exigir assepsia, esta será conseguida mediante:
o
A esterilização do meio, dentro ou fora do fermentador.
o
A desinfecção ou esterilização do equipamento, por injeção de vapor ou mediante o calor gerado
por serpentinas, sendo esta medida extensiva a todos os dutos de entrada e saída e às válvulas
correspondentes.
o
A esterilização do ar, mediante filtros adequados.
Existem fermentadores adaptados às necessidades de cada agente biológico e de cada tipo de
processos. Nos biorreatores em coluna ou torre, a homogeneização depende da injeção de ar (Figura
6.7). Os tanques podem chegar a 3.000 m3 de capacidade como, por exemplo, os fermentadores para
a produção de proteínas de célula única, da Imperial Chemical Industries (ICI), no Reino Unido. O
monitoramento do processo acompanha o crescimento da população microbiana, ou a quantidade do
produto, nas amostras extraídas ao longo da fermentação.
Os sistemas submersos são apropriados para o cultivo de microrganismos livres, mas resultam
pouco econômicos quando se trabalha com células ou enzimas caras. Neste caso, é preferível a
imobilização do agente biológico a um suporte inerte ou sua inclusão dentro de um polímero que
permita o contato com o meio de cultura. Além de facilitar a reutilização das células ou das enzimas
que permanecem dentro do biorreator, os sistemas imobilizados simplificam a purificação do produto
(Figura 6.7).
---------------
FIGURA 6.8. A mudança de escala, do laboratório à indústria
A mudança de escala entre o processo laboratorial e o processo industrial cria vários problemas de índole tecnológica.
Bancada
Fermentador de laboratório
1 - 10 litros
LABORATÓRIO
66
Fermentador piloto
50 – 200 – 500 litros
PILOTO
Fermentador industrial
5.000 – 50.000 – 200.000 litros
5 – 50 – 200 m3
INDÚSTRIA
OS BIOPROCESSOS
DO LABORATÓRIO À INDÚSTRIA
A MUDANÇA DE ESCALA
Uma operação simples de laboratório pode ser impraticável, ou pouco econômica, quando realizada
em grande escala. No laboratório, após a triagem das linhagens mais eficientes ou das primeiras
experiências realizadas na bancada, o processo passa a ser estudado em um biorreator de até 10 litros
de capacidade, onde se analisam o rendimento da linhagem selecionada e as variáveis físico-químicas
em outra escala.
A capacidade de uma cuba varia entre 1 e 10 L para um fermentador de laboratório, chegando a
5.000 l em uma planta piloto e 100.000 l em uma planta industrial. Ao aumentar o tamanho do
equipamento, altera-se a relação superfície/volume, de modo que as condições de operação do
fermentador na planta piloto deverão ser ajustadas até se aproximar das correspondentes a um
processo comercial. Se a experiência na planta piloto for bem-sucedida, o processo poderá ser
desenvolvido em um fermentador industrial (Figura 6.8).
A automatização do monitoramento e do controle da fermentação permite que a informação
relativa aos parâmetros físicos e químicos (pH, temperatura, oxigênio, velocidade de agitação, o nível
do meio etc.) seja recolhida on-line por sondas e sensores. Para que o processo se aproxime das
condições ideais, a informação é analisada em relação a um modelo previamente estabelecido. Como
este se elabora a partir da experiência obtida com cubas menores (laboratório, piloto), os ajustes à
mudança de escala são de grande complexidade.
A CONDUÇÃO DO PROCESSO
O processo fermentativo pode ser conduzido de maneira contínua ou descontínua (batelada), sendo
que ambas as formas apresentam vantagens e inconvenientes.
Em um sistema descontínuo de produção, uma vez que o fermentador é carregado com a
matéria-prima e o inóculo correspondentes, a fermentação prossegue até o esgotamento dos
nutrientes. Concluído o processo e extraído o produto, o fermentador é esvaziado, limpo e esterilizado
antes de receber outra carga.
Apesar do tempo improdutivo entre uma batelada e a seguinte, o sistema é relativamente
flexível, já que o mesmo equipamento pode ser utilizado na fabricação de produtos diferentes. A
produção em bateladas é bastante utilizada na indústria farmacêutica porque o risco de contaminação
permanece relativamente baixo.
Já no sistema contínuo de produção, o acréscimo de nutrientes e a retirada do produto ocorrem
simultaneamente ao longo do processo, eliminando-se quase totalmente o tempo improdutivo. Como
o risco de contaminação aumenta, o sistema se adapta a processos que não exigem assepsia, como a
produção de proteína microbiana e de álcool e, obviamente, o tratamento de água. Entre o sistema
em batelada e o sistema contínuo existe um sistema intermediário de batelada alimentada em que,
periodicamente, parte do conteúdo (meio de cultivo + produto) é retirada e substituída por meio
fresco.
A RECUPERAÇÃO DO PRODUTO
A recuperação do produto representa uma fração considerável do custo de um processo fermentativo.
Se o produto for secretado fora da célula, estará disperso em um volume grande de água e será
necessário separá-lo por decantação ou filtração. Mas se o produto permanecer dentro das células,
estas terão que ser desintegradas antes de proceder a sua extração.
67
http://bteduc.com
O produto se concentra por sedimentação, precipitação, filtração, centrifugação, extração por
solventes, destilação, evaporação do solvente e secagem. Se a purificação for necessária, esta
envolverá outros procedimentos, como a cristalização e os métodos cromatográficos.
O acondicionamento final dependerá do tipo de produto. Isto é fundamental no caso das enzimas
usadas em cosméticos, onde os problemas técnicos principais são a manutenção da estabilidade do
produto e sua ativação pela hidratação da pele.
Um problema a considerar é o despejo dos resíduos de uma fermentação, alguns dos quais podem
representar um perigo para o meio ambiente como, por exemplo, o vinhoto resultante da produção
de etanol ou o soro das indústrias de laticínios. Existem formas de tratamento, como o crescimento de
biomassa sobre resíduos industriais, que eliminam o problema e ainda permitem a obtenção de mais
um produto.
BIOPROCESSOS NA INDÚSTRIA
Na produção de bens e serviços, os bioprocessos participam em vários setores produtivos. Os dois
exemplos escolhidos referentes à produção de ácido cítrico e de fertilizantes ilustram sua importância
em áreas tão diversas como a indústria química e a agricultura.
O ÁCIDO CÍTRICO
Descoberto no século XVIII no suco de limão, o ácido cítrico é ainda extraído das frutas cítricas em
alguns países da África e no México. No entanto, a maior parte da produção atual depende do fungo
Aspergillus, do qual tem-se obtido mutantes muito produtivos. Os três procedimentos que garantem
atualmente a produção industrial de ácido cítrico são os seguintes:
o O processo Koji.
A fermentação ocorre na superfície, em meio sólido, com Aspergillus niger como agente biológico.
Depois de 80 a 100 horas de fermentação a 280C, o ácido cítrico é extraído com água quente e
purificado. Muito desenvolvido nos países asiáticos, este tipo de bioprocesso garante ao Japão uma
parte importante da produção anual de ácido cítrico.
o Fermentação na superfície do meio líquido.
Em meio estéril, incubação a 300C com injeção de ar esterilizado. Inoculação com esporos de
Aspergillus niger que germinam e, em 24 horas, cobrem a superfície do líquido, diminuindo o pH a
um valor inferior a 2. O processo demora entre 7 e 15 dias e, a seguir, o ácido cítrico é extraído do
meio de cultivo. Para recuperar uma quantidade maior de ácido cítrico, o micélio é exprimido e
lavado. Este processo responde por 20% da produção anual de ácido cítrico.
o Fermentação submersa em meio líquido.
Em grandes biorreatores de acero inoxidável com agitação mecânica ou em torres air-lift. É o
procedimento preferido porque resulta fácil de automatizar e fornece rendimentos altos (125 g/L).
Responde por 80% da produção anual de ácido cítrico. A figura 6.9 mostra o procedimento de
separação downstream do ácido cítrico e sua purificação.
A produção de ácido cítrico por fermentação é um exemplo clássico de sucesso na utilização de
bioprocessos para a produção de insumos que atendam outras indústrias. O ácido cítrico é um
composto muito versátil, utilizado nas indústrias farmacêutica, de alimentos, de cosmética e de
detergentes. Devido a facilidade com que forma complexos metálicos, também é usado como
antioxidante e na limpeza de metais.
68
OS BIOPROCESSOS
FIGURA 6.9. A obtenção de ácido cítrico por fermentação
Uma vez retirado o micélio por filtração, acrescenta-se cal no caldo restante para elevar o pH e precipitar o citrato
de cálcio. Este último é retirado por filtração e tratado com ácido sulfúrico concentrado, formando-se sulfato de
cálcio. Outra filtração retira o sulfato de cálcio, deixando o ácido cítrico dissolvido no líquido. Eliminam-se as
impurezas com carvão ativado, e o cálcio residual e outros cátions por intercâmbio iônico. A evaporação do
solvente facilita a cristalização do ácido cítrico, que é recuperado por centrifugação e filtração. Uma vez seco, o
ácido cítrico é empacotado e distribuído.
BIORREATOR (200 m3)
20 m3 de cultivo de Aspergillus niger (starter)
Materiais estéreis: açúcar, melaço, nutrientes,
algum agente antiespumante
Controles de pH, temperatura, CO2, O2
Injeção de ar esterilizado
Retirada semanal do meio
Filtração
Solução de ácido cítrico impuro
Micélio
+ Ca (OH)2
Caldeiras
Metano
Fermentador
anaeróbico
Descarte
Precipitado de citrato de cálcio
Restos do meio nutriente
+ H2SO4 concentrado
Ácido cítrico + precipitado de sulfato de cálcio
Filtração
Solução de ácido cítrico puro
Gipsita
Evaporação, cristalização, centrifugação, secagem e empacotamento
Ácido cítrico CO2H-CH2-C(OH)(COOH)- CO2H-CH2
---------------
OS BIOFERTILIZANTES
O termo biofertilizante se aplica aos produtos que contém agentes biológicos vivos capazes de
favorecer o desenvolvimento vegetal. Um destes agentes é o Rhizobium, uma bactéria simbionte das
raízes de leguminosas que fixa o nitrogênio atmosférico, reduzindo a necessidade de aplicar
fertilizantes nitrogenados nas lavouras e permitindo assim a substituição de produtos químicos
derivados do petróleo por agentes biológicos, menos prejudiciais para o meio ambiente.
69
http://bteduc.com
Na América Latina, a produção de biofertilizantes envolve numerosas empresas, pequenas e médias,
que contam com um sólido suporte tecnológico originado em universidades e instituições públicas de
pesquisa agronômica. Vários países produzem inoculantes agrícolas; entre eles: Argentina, Brasil,
Chile, Colômbia, Cuba, México, Peru e Uruguai.
As linhagens bacterianas são estirpes selecionadas por sua eficiência em uma ampla gama de
cultivares e amplamente adaptadas às condições locais. O crescimento da população microbiana
ocorre em etapas sucessivas, utilizando recipientes cada vez maiores até chegar a biorreatores de
1.500 litros. Os microrganismos recuperados são veiculados em meio líquido ou em turfa estéril e, uma
vez empacotados, vendidos aos agricultores. Segundo a legislação do Mercosul, durante o prazo de
validade do produto, a concentração deverá ser de 108 microrganismos viáveis por grama de produto.
Até o presente, a indústria baseia a produção dos microrganismos na tecnologia clássica, mas com
mapeamento do genoma de microrganismos como o Rhizobium etli (México) e o Gluconacetobacter
diazotrophicus (Brasil), a biotecnologia moderna começa a se inserir neste campo. Frente as mudanças
climáticas e a necessidade de aumentar a produtividade agrícola, os novos métodos de triagem de
estirpes são uma ferramenta de incalculável valor para o estudo da relação simbionte entre o
microrganismo e a planta hospedeira.
70
CAPÍTULO 7
O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS
A MANIPULAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS E TECIDOS VEGETAIS
AS PRIMEIRAS TENTATIVAS
A reprodução assexual das plantas é utilizada para obter um grande número de mudas a partir de um
único exemplar. Dependendo do caso, aproveitam-se bulbos (cebola), cormos (gladíolo), rizomas
(samambaias), tubérculos (batata-inglesa), caules (banana), raízes (batata-doce, maçã, amora), folhas
(begônia, espada-de-são-jorge), estacas (videiras) etc. As plantas obtidas por propagação assexuada
ou vegetativa são idênticas à planta-mãe e idênticas entre si. Em outras palavras, são clones.
A capacidade de uma célula regenerar réplicas do organismo do qual ela deriva é denominada
totipotência. Restringida em animais, esta propriedade característica dos vegetais permite a
sobrevivência das plantas superiores após o ataque de herbívoros, pragas e patógenos ou em
condições ambientais desfavoráveis.
--------------FIGURA 7.1. As diversas partes de uma planta angiosperma
Gema apical
Estípula
Limbo
Pecíolo
Folha
Ramo ou broto lateral desenvolvido
a partir de uma gema axilar
Gema axilar
Entrenó
Nó
Superfície do sol
Região da raiz com pelos absorventes
Raiz central
Raízes laterais
http://bteduc.com
As primeiras tentativas de cultura de tecidos vegetais em laboratório datam de 1902. Contudo, a
primeira experiência bem-sucedida é a germinação in vitro de sementes de orquídea (Knudson, 1922).
Transferidas assepticamente ao meio de cultura e incubadas em condições favoráveis, as sementes e,
mais tarde, as plântulas crescem protegidas do ataque de fungos e bactérias.
Com algumas variações, o método é usado ainda hoje por numerosos floricultores porque, devido ao
tamanho minúsculo das sementes e à ausência de reservas nutritivas, as possibilidades de
sobrevivência das plântulas após a germinação in vivo são muito baixas.
Distintamente do cultivo in vivo, a micropropagação se inicia com a separação dos explantes, isto
é, de pequenos fragmentos de tecido extraídos de diversas partes da planta, tais como folhas, raízes,
segmentos nodais e gemas axilares, gemas florais e apicais (Figura 7.1). O cultivo desses explantes em
meios de composição adequada e condições assépticas possibilitará a regeneração direta da planta.
A cultura in vitro tem a vantagem de ser mais rápida e de ocupar muito menos espaço que a
multiplicação in vivo. As principais aplicações estão no cultivo de plantas ornamentais, de hortaliças e
na silvicultura. A capacidade de regeneração é maior nas plantas herbáceas que nas lenhosas, e em
algumas famílias (solanáceas, crucíferas, gesneriáceas, compostas e liliáceas). Também depende do
genótipo e das condições ambientais, diminuindo com a idade da planta.
--------------TABELA 7.1. Os componentes do meio de cultura para células vegetais
COMPONENTES
CARACTERÍSTICAS E EXEMPLOS
Água destilada
Representa 95% do meio nutriente.
Fonte de carbono
Geralmente se utiliza sacarose. A fonte de carbono é necessária porque os explantes
não são totalmente autotróficos e a fotossíntese in vitro não supre as necessidades
das células.
Substâncias inorgânicas
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) e microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo,
Cu, I), em uma proporção que depende da planta escolhida.
Vitaminas
Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B6 (piridoxina),
pantotenato de cálcio, ácido fólico, vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido
ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-aminobenzoico e vitamina E (tocoferol).
Reguladores de crescimento
Auxinas: Estas promovem o alongamento celular, a formação de calos e de raízes
adventícias; inibem a formação de brotos axilares adventícios e, às vezes, a
embriogênese em suspensões celulares. Exemplos: IAA (ácido indolacético), NAA
(ácido naftalenoacético), IBA (ácido indolbutírico), 2,4 D (2,4- diclorofenoxiacético).
Citocininas: Estas promovem a divisão celular, regulam o crescimento e o
desenvolvimento dos tecidos vegetais. Exemplos: cinetina, 2iP (2-isopentiladenina),
BAP (benzilaminopurina), zeatina.
Outras substâncias. Exemplos: giberelinas, ácido abcíssico, etileno.
Misturas de substâncias
pouco definidas
Exemplos: extrato de levedura, extratos vegetais, hidrolisados de caseína, peptona e
triptona. A tendência atual em pesquisa é de substituí-los por meios de composição
definida.
Materiais inertes
Utilizados como suporte. Exemplos: agar, agarose, outros polissacarídeos (Gelrite,
Phytagel), lã de vidro, papel de filtro, areia, esponjas de poliestireno.
72
OS MEIOS DE CULTURA
Um meio de cultura inclui água, uma fonte de carbono, substâncias inorgânicas (sais minerais),
vitaminas, hormônios e fatores reguladores do crescimento (Tabela 7.1). Alguns desses componentes
podem ser substituídos por misturas pouco definidas, mais econômicas ou simples de manipular (água
de coco, suco de tomate, suco de laranja). Geralmente, o pH do meio varia entre 5,0 e 6,5.
A composição do meio de cultura muda em função das necessidades de cada espécie. O crescimento
e a diferenciação celular são controlados mediante as substâncias reguladoras de crescimento (Tabela
7.1). De um modo geral, se a proporção entre citocininas e auxinas for maior que 1, desenvolvem-se
brotos, se for menor, raízes e, se for igual, calos.
A incubação ocorre a uma temperatura entre 23 e 28C, com 12 a 14 horas diárias de iluminação.
AS ETAPAS DO PROCESSO
Cultivam-se assepticamente os explantes em meios de composição adequada, possibilitando a
regeneração direta da planta. O processo envolve quatro etapas:
A. Estabelecimento de uma cultura asséptica.
Uma vez retirados da planta-mãe, os explantes são desinfetados com um agente químico,
geralmente hipoclorito de sódio, que é mais tarde retirado mediante sucessivas lavagens com água
estéril. A transferência dos explantes para o meio de cultura é realizada em condições assépticas
semelhantes às do cultivo de microrganismos (Figura 7.2). A incubação ocorre a uma temperatura
entre 23 e 28C, com 12 a 14 horas diárias de iluminação
B. Multiplicação.
Dividem-se e transferem-se os propágulos para um meio de multiplicação, de maneira a se obter
numerosas subculturas (Figura 7.3).
C. Preparação das plântulas para a transferência ao solo.
Transferem-se as plântulas das subculturas para um meio de enraizamento onde, além de desenvolver
raízes, enrijecem e começam a fotossintetizar.
D. Aclimatação.
Transferência das plântulas, primeiro para o solo ou para algum outro substrato, mais tarde para uma
casa de vegetação. Protegidas da iluminação solar direta, elas aumentarão sua capacidade
fotossintética adaptando-se lentamente às condições ambientais.
AS DIFERENTES MODALIDADES
A CULTURA DE MERISTEMAS
A regeneração de uma planta pode ocorrer a partir da gema apical onde se encontra o meristema, um
tecido embrionário a partir do qual se formam todos os outros tecidos das plantas (Figura 7.4). Os
exemplos citados na bibliografia sobre o cultivo de meristemas são, no mínimo, impressionantes. Se
um tubérculo de inhame de 100 g produz 25 kg de tubérculos em dois anos, por micropropagação
produzirá 300.000 kg; a partir de uma única gema apical podem-se obter 4.000.000 de cravos em um
ano.
73
http://bteduc.com
Associando a cultura de meristemas com a termoterapia (incubação a 32-340C, por um tempo
determinado), obtêm-se estoques de plantas livres de vírus e de outros patógenos. Com este método
são recuperadas algumas plantas que só se reproduzem naturalmente pela via assexuada e se
encontram ameaçadas de extinção, devido à contaminação por vírus.
Esta modalidade de cultivo permite a multiplicação de espécies que se reproduzem lenta e/ou
dificilmente (orquídeas) e o aceleramento da produção de mudas em plantas com ciclo anual ou
bianual. Outra variação é a microenxertia, que se aplica às essências florestais (eucalipto) e às árvores
frutíferas (citros). A técnica gera uma alta produtividade de mudas sadias, que são cultivadas em pouco
espaço (mais de 1.000 plantas / m2) sem depender dos fatores climáticos e da época do ano.
Do ponto de vista econômico, o custo destas mudas é alto porque a cultura em meio sólido
necessita um trabalho minucioso e mão de obra especializada. A multiplicação dos propágulos em
biorreatores, análogos aos fermentadores microbianos, visa reduzir os custos. Ao modelo tradicional
de pás giratórias que danifica os tecidos e as células, preferem-se pequenas cubas de 1 a 5 l onde os
propágulos permanecem em sistemas de imersão permanente ou temporária.
Apesar dos custos, a tecnologia é interessante quando se planeja introduzir uma espécie em uma
região determinada porque elimina qualquer contaminação prévia. Também é interessante para iniciar
a propagação vegetativa com mudas certificadas, visando a amplificação posterior dos cultivos.
--------------FIGURA 7.2. O procedimento a seguir para se obter uma cultura asséptica no laboratório
Separação
dos explantes
Esterilização
Lavados
Dissecação
e semeadura
Incubação
Água + detergente
+ hipoclorito de sódio
Água estéril
FIGURA 7.3. Obtenção de subculturas a partir de explantes nodais
Planta-mãe
74
Condições assépticas, 20-250C, na luz
A CULTURA DE CALOS
Um calo é uma massa de células desdiferenciadas que prolifera de maneira irregular em resposta aos
ferimentos em órgãos e tecidos, formando in vivo um tecido tumoral. A semeadura in vitro de um
explante em meio adequado gera um calo que pode ser mantido indefinidamente, com a condição de
proceder a uma subdivisão e transferência periódica a um meio nutriente com a mesma composição.
Se o calo for transferido a outro meio com uma concentração diferente de hormônios, formar-se-ão
órgãos ou embriões, a partir dos quais poderão ser regeneradas numerosas plantas (Figura 7.5).
A cultura de calo é a modalidade alternativa para plantas que não podem ser propagadas
diretamente a partir de meristemas e, por isso, menos conveniente para micropropagação. Contudo,
sua utilização é inevitável no caso de algumas espécies economicamente importantes (cereais,
leguminosas, forrageiras, espécies florestais e palmeiras tropicais).
--------------FIGURA 7.4. A cultura de meristemas
Gema apical
Meristema
Transferência a um meio
de diferente composição
Planta-mãe
Cultura de meristema
Formação de órgãos
Planta-filha
FIGURA 7.5. As diferentes possibilidades dos cultivos de calos
Planta-mãe
Explante
Calo
Formação de órgãos
Planta-filha
Metabólitos
secundários
Biorreator
Células
Embrioides
Sementes artificiais
75
http://bteduc.com
Diferentemente das outras modalidades de cultura de tecidos, na cultura de calos a proliferação
celular está acompanhada por um aumento das variações genéticas e da instabilidade cromossômica
(variação somaclonal). Esta permite a seleção de variedades de plantas com propriedades novas, tais
como a resistência ao estresse, ao ataque de insetos, a patógenos, a herbicidas, a concentrações
salinas elevadas, a moléculas químicas (Al, Mn). A variabilidade pode ser aumentada pela utilização de
agentes mutagênicos.
A CULTURA DE CÉLULAS E ÓRGÃOS VEGETAIS EM BIORREATORES
A desagregação de um calo em meio líquido gera suspensões de células, que são cultivadas em
biorreatores industriais para produzir metabólitos secundários ou embrioides. Os primeiros são
compostos naturais considerados produtos de Química Fina, de alto valor agregado no mercado. Tratase de alcaloides, de glicosídeos cardíacos, de substâncias antitumorais e antimicrobianas, de
hormônios esteroides etc. para a indústria farmacêutica e, também, de corantes, adoçantes e aromas
para as indústrias alimentícia e cosmética.
As “sementes artificiais” são embrioides, isto é, embriões formados a partir de células somáticas,
encapsulados em um gel com nutrientes e envoltos em plástico biodegradável. Como estas sementes
se desenvolvem normalmente quando semeadas na terra, uma das aplicações desta tecnologia é a sua
dispersão por aviões, ou por drones, para o reflorestamento de regiões de difícil acesso.
No início da década de 1990, gerou-se uma enorme expectativa comercial em relação à
possibilidade de substituir os métodos tradicionais de extração ou de síntese pela produção mediante
o cultivo de suspensões celulares em biorreatores. Vários estudos estimaram as condições necessárias
para que a síntese ou a bioconversão de compostos naturais em produtos de alto valor agregado fosse
vantajosa. Os cálculos mostraram que, se o mercado fosse suficientemente amplo e o valor do produto
superasse os US$ 500 ou 1.000 por kg, a produtividade do sistema deveria de ser igual ou superior a
um grama por litro de cultura celular. Essa condição é difícil de alcançar.
Existem numerosas dificuldades técnicas. As células vegetais são grandes (100 m) e sedimentam
com facilidade. A tendência a formar agregados as torna muito sensíveis ao cisalhamento. Como o
crescimento é lento, os riscos de contaminação aumentam. Também existem problemas relacionados
com a transferência de oxigênio.
Vários são os modelos de biorreatores para o cultivo de células vegetais, entre os quais o tradicional
de pás giratórias e outros preferíveis de tipo air-lift ou de leito fluidizado. A condução do processo
pode ser descontínua, semicontínua ou contínua; neste último caso, com células imobilizadas. A
escolha de uma modalidade ou outra de cultivo depende da substância estar, ou não, associada ao
crescimento celular e, também, de se tratar de um produto intra ou extracelular.
O cultivo de órgãos e especialmente de raízes transformadas (hair roots) tem dado bons resultados,
apesar de poucas iniciativas terem alcançado um nível comercial. Entre elas, a produção de shikonina
a partir de raízes (Lithospermum erythrorhizon) pela empresa Mitsui Petrochemical Ind. Ltd.; de
gingenosídeo (Panax ginseng) e de purpurina (Rubia akane) por Nitto Denko Corp.; e de paclitaxel
(Taxos cuspidata), comercializado como Taxol por Phyton Inc., uma empresa associada a Bristol-Myers
Squibb.
Espera-se o estabelecimento das bases de uma agricultura molecular combinando o
desenvolvimento de novos processos industriais com a engenharia metabólica das células. Por
enquanto, as aplicações se restringem à produção de alguns fármacos e de aditivos para a indústria de
alimentos (flavorizantes, corantes e aromas).
76
FIGURA 7.6. As possibilidades do cultivo de células vegetais
---------------
MELHORAMENTO E CONSERVAÇÃO DA BIODIVERSIDADE VEGETAL
Várias modalidades de cultura de tecidos contribuem para facilitar a tarefa de melhoramento (Figura
7.6). O método genético tradicional, isto é, a autofecundação das plantas por várias gerações, demora
oito ou dez anos para obter linhagens puras (homozigotas), em que se manifestem os caracteres
recessivos. Esse tempo pode se reduzir a meses mediante a cultura de anteras, gerando-se plantas
haploides (n cromossomos), que, tratadas com colchicina, originam diretamente plantas diploides (2n)
homozigotas. Como as plantas resultantes destes cruzamentos geram sementes que dificilmente se
desenvolvem, frequentemente é necessário retirar os embriões do resto da semente e proceder a sua
recuperação mediante a cultura in vitro.
Os protoplastos se formam por digestão enzimática da parede celular, que poderá ser regenerada
novamente no meio de cultura. Durante o período em que a célula está sem a parede celular, pode-se
introduzir DNA exógeno (transformação) ou fusionar protoplastos de diferentes cultivares ou espécies
(hibridização somática).
Protoplastos, células, calos, gemas apicais e laterais, meristemas, sementes, embriões somáticos e
zigóticos, todos podem ser congelados em nitrogênio líquido a –1960C. A criopreservação facilita a
preservação de numerosas plantas ornamentais, frutíferas, oleaginosas, leguminosas, medicinais e
aromáticas.
Finalmente, deve-se destacar a importância destas técnicas de cultura de células e tecidos vegetais
para a conservação em bancos de germoplasma, tanto das espécies cultivadas como das espécies
selvagens. A conservação da biodiversidade é importante não só do ponto de vista do melhoramento
agronômico como do farmacológico, já que a maioria dos medicamentos de que dispomos contém
princípios ativos extraídos de plantas.
A DIFUSÃO DA TECNOLOGIA
As técnicas de cultura in vitro de vegetais facilitam o melhoramento genético das variedades
comerciais e representam uma etapa indispensável na obtenção de uma planta transgênica, sendo
77
http://bteduc.com
rapidamente assimiladas por empresas e instituições de pesquisa e desenvolvimento. Numerosas
empresas as utilizam no mundo todo para garantir a qualidade genética e fitossanitária das mudas e
sementes comercializadas.
Em Cuba, por exemplo, o IBP (do espanhol, Instituto de Biotecnologia de las Plantas) desenvolveu,
junto com outros centros científicos, protocolos para batata, cana-de-açúcar, plátano, banana, goiaba,
abacaxi, maracujá etc. O IBP está associado a uma rede de 15 biofábricas com capacidade de produzir
60 milhões de plântulas in vitro e sementes artificiais.
Esta tecnologia representa, na América Latina, uma corrente comercial da biotecnologia agrícola,
com ampla difusão na olericultura, na hortifruticultura, na floricultura e na propagação de plantas
ornamentais, assim como na produção de plantas de interesse industrial (cana, café) e de mudas de
essências florestais para as indústrias de papel.
A MANIPULAÇÃO IN VITRO DAS CÉLULAS ANIMAIS
AS PRIMEIRAS TENTATIVAS
O primeiro experimento de cultivo de células animais data de 1885, quando W. Roux manteve uma
seção de placa medular de frango em solução salina por alguns dias. Em 1907, R. Harrison conseguiu
cultivar células de embrião de rã no sistema conhecido como “gota pendente”. Pouco depois, o
cirurgião A. Carrel conseguiu cultivar células de coração de galinha e manter os cultivos durante 34
anos, apesar das dificuldades causadas pelas contaminações bacterianas.
Em 1961, L. Hayflick e PS Moorhead demonstraram que as linhagens normais de células têm um
número finito de divisões e reavaliaram o experimento de A. Carrel. Como o crescimento das células
era estimulado mediante a adição de extratos embrionários de frango, é possível que, ao longo dessas
três décadas, numerosas células de frango foram acrescentadas ao cultivo original.
Dois avanços fundamentais permitiram o progresso das técnicas de cultivo de células animais: o
uso de enzimas proteolíticas para liberar as células da matriz tecidual (1916) e o desenho de meios
definidos (década de 1950). Em 1955, dá-se início à produção da primeira vacina da poliomielite em
cultivo de células de rim de macaco, desenvolvida por J. Salk. A partir desse momento, a tecnologia é
considerada madura para o lançamento de outros produtos.
AS DIFERENTES MODALIDADES
Uma das modalidades de importância clínica é a cultura de linfócitos para a análise do cariótipo,
visando detectar as alterações cromossômicas estruturais e numéricas que possam ser a causa de
distúrbios no funcionamento do organismo.
Os linfócitos extraídos do paciente são colocados em um meio líquido que induz a divisão celular.
A adição de colchicina inibe a formação das fibras do fuso mitótico, bloqueando as células na metáfase.
Um choque hipotônico provoca a lise das células e libera os cromossomos (Figura 7.7 A).
Nem todas as células, contudo, se desenvolvem bem em suspensão. Células derivadas de órgãos
como o rim ou o fígado devem primeiro ser separadas, mecânica ou enzimaticamente, da matriz
tecidual. Além de nutrientes, precisam aderir a um suporte inerte (vidro, plástico etc.) para crescer e
o fazem formando uma monocamada de células.
Uma vez esgotados o espaço e os nutrientes, uma fração dessa cultura primária será transferida
para outro recipiente com meio nutriente, onde crescerá até que seja necessário repetir o
procedimento. Assim, por repiques sucessivos, uma cultura primária originará várias culturas
secundárias (Figura 7.7 B).
78
Entretanto, à diferença dos microrganismos, que podem ser repicados indefinidamente, as células
animais normais sofrem um tipo de morte programada (apoptose) depois de 20 a 80 divisões. Devese então reiniciar o cultivo com uma nova amostra.
Existem algumas exceções que escapam dessa limitação, como as células extraídas de tumores ou
as células-tronco; e também os linfócitos B, imortalizados por infecção com o vírus de Epstein-Barr ou
por fusão com células de mieloma (hibridomas). Estas células, que podem crescer em suspensão ou
em camada, não dependem de um suporte onde aderir nem demostram inibição por contato,
dividindo-se a cada 12-24 horas, em vez de 24-96 horas como as células normais.
OS MEIOS DE CULTIVO
O cultivo de células animais só começou a se desenvolver com sucesso na década de 1950, quando H.
Eagle conseguiu definir quais os nutrientes indispensáveis para o crescimento celular (Tabela 7.2).
Basicamente, um meio para o cultivo de células animais inclui água, sais minerais, aminoácidos,
vitaminas, glicose, soro humano, bovino ou de cavalo (fatores de crescimento) e antibióticos (para
prevenir as contaminações microbianas).
--------------FIGURA 7.7. As culturas de células de origem animal
B.
Etapas da cultura de leucócitos para a análise do cariótipo
Amostra de
sangue com
anticoagulante
Separação dos
leucócitos por
centrifugação
Cultivo dos
leucócitos
Adição de colchicina
e lise celular
Fixação e coloração
(Bandeamento)
Observação
e comparação
B. Etapas da cultura de células a partir de um fragmento de tecido
Meio de cultivo
Suspensão
celular
Desagregação
mecânica ou enzimática
(tripsina, colagenase)
Cultura
primária
Cultura
secundária
Repique
79
http://bteduc.com
O soro bovino fetal é um suplemento de baixo custo, geralmente adicionado na proporção de 2-10%.
Além de melhorar as características físico-químicas do meio, o soro facilita a aderência ao suporte e
fornece nutrientes, hormônios, fatores de crescimento etc. Em compensação, a qualidade pode variar
de um lote a outro, e a riqueza de nutrientes favorece a contaminação. O soro também dificulta os
estudos imunológicos e a purificação dos produtos proteicos.
Em um meio definido, o soro é substituído por quantidades determinadas de diversas substâncias
inorgânicas e orgânicas, algumas destas últimas produzidas por engenharia genética em bactérias ou
leveduras.
AS LINHAGENS CELULARES
Nas Coleções de Culturas encontram-se linhagens celulares de diversos tipos, conservadas por
criopreservação (Tabela 7.3).
A linhagem de células HeLa, uma das mais utilizadas, continua sendo cultivada desde a década de
1950, quando foi isolada do carcinoma uterino de Henrietta Lacks, uma mulher negra e pobre de 31
anos, no Hospital Johns Hopkins (Maryland, Estados Unidos).
--------------TABELA 7.2. Os componentes de um meio de cultura básico para células animais
COMPONENTES
CARACTERÍSTICAS E EXEMPLOS
Água
Desmineralizada, destilada.
Fonte de carbono
Glicose.
Substâncias inorgânicas
NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2. 6H2O, NaH2PO4.H2O, NaHCO3.
L –aminoácidos
Arginina, cistina, fenilalanina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
treonina, triptófano, tirosina, valina.
Vitaminas
Biotina, ácido fólico, colina, nicotinamida, ácido pantotênico, piridoxal, riboflavina,
tiamina.
Misturas de substâncias
pouco definidas
Soro animal de diversa origem, inclusive humano.
Outros
Antibióticos (penicilina, estreptomicina) e vermelho de fenol (pH 7,2-7,4).
TABELA 7.3. Origem e utilização de algumas linhagens celulares
CÉLULAS
ORIGEM
APLICAÇÕES
HeLa(*)
Carcinoma cervical humano
Pesquisa
MDCK
Rim de cachorro
Produção de vacinas veterinárias
3T3
Tecido conjuntivo de camundongo
Técnicas laboratoriais
Nawalwa
Linfoma humano
-interferon
COS-7
Rim de macaco verde africano
Estudos sobre multiplicação viral e expressão
VERO (**)
Rim de macaco verde africano
Produção de vacinas humanas
CHO
Hamster
Estudos nutricionais e de expressão gênica
(*) Células originadas em 1951, provenientes do carcinoma uterino de Henrietta Lacks.
(**) Esta linhagem, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops) está aprovada pela OMS para a
produção de vacinas humanas.
80
A história de Henrietta Lacks levanta várias questões de bioética. Sem o seu consentimento ou o de
seus parentes, as células foram distribuídas a laboratórios do mundo inteiro com o nome fictício de
Helen Lane e, durante anos, foi negada a sua família qualquer forma de compensação que aliviasse sua
situação econômica. Por outro lado, experimentos da década de 1960 em que se injetaram células
HeLa em presidiários constituem uma das experiências mais antiéticas da história da ciência.
Além de ser mais difícil detectar uma contaminação por células que outra por bactérias ou fungos,
as células HeLa são uma fonte de contaminação temível, devido à facilidade e velocidade com que se
multiplicam. Em 1966, o geneticista S. Gartler descobriu que 18 das culturas de células mais usadas
continham o marcador glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD-A), característico da população negra
americana. A partir de esse momento, as linhagens celulares são monitoradas com marcadores
específicos.
CONDIÇOES DE CULTIVO
As células devem ser isoladas, inoculadas, e cultivadas assepticamente em um meio com os nutrientes
essenciais (aminoácidos, carboidratos, vitaminas, sais minerais) adicionado de hormônios e fatores de
crescimento, ambiente físico-químico regulado (pH, pressão osmótica, temperatura entre 350 a 370 C,
umidade, proporção definida de O2 e CO2). A viabilidade das células é avaliada microscopicamente no
hemocitômetro, após coloração das células mortas com azul tripano.
Uma das limitações destas técnicas é que o crescimento sempre ocorre em um plano, o que dificulta
a compreensão do que acontece dentro de um organismo, por isso trabalhos recentes desenvolvem
outras formas de cultivo que permitam o desenvolvimento em 3D.
A riqueza do meio de cultivo e a diferença na velocidade de crescimento entre uma bactéria e uma
célula favorecem as contaminações das culturas. O risco de contaminação com algum patógeno se
estende ao operador, especialmente se o trabalho envolve uma cultura primária de células humanas
ou de primatas. O risco potencial abrange os vírus HIV e HBV em amostras de sangue, bactérias como
Mycobacterium tuberculosis em amostras de pulmão, vírus SV40 em células transformadas e células
tumorogênicas.
DO LABORATÓRIO À INDÚSTRIA
A cultura in vitro de células animais é a rota seguida para a manufatura em grande escala de vários
produtos, tais como as vacinas e os anticorpos monoclonais. Também é adequada para a produção de
citocinas (linfocinas, interferones, eritropoietina) e de outras proteínas de origem recombinante (fator
ativador de plasminogênio, p.ex.) que, por exigir modificações pós-traducionais complexas, não podem
ser produzidas em bactérias ou leveduras transformadas.
Na hora de passar da escala do laboratório à escala industrial, algumas considerações devem ser
levadas em conta. A cultura de células animais exige um cuidado extremado, meios de cultivo
complexos e caros e condições muito rigorosas. Como as células se dividem lentamente (a cada 20
horas aproximadamente), a assepsia deve ser mantida durante períodos prolongados. A demanda de
oxigênio é alta, e as células são muito frágeis e sensíveis ao cisalhamento. Finalmente, as
concentrações celulares são baixas, o que diminui a produtividade e a rentabilidade do processo.
Embora algumas células possam crescer livremente em suspensão, outras precisam de um suporte
ao qual aderir. No biorreator, este problema pode ser resolvido de diversos modos: mediante o
confinamento das células dentro de membranas semipermeáveis, imobilização em géis ou cápsulas ou
fixação sobre suportes, tal como pequenas partículas de 100 a 400 m em vidro, plástico ou dextrina,
em modelos de fermentadores análogos aos representados no capítulo anterior.
81
http://bteduc.com
Biorreatores de tamanho pequeno (até 15 l) e processos descontínuos apresentam menos problemas
de contaminação, já os de maior tamanho (até 1.000 l) exigem a substituição da agitação mecânica por
sistemas de tipo air lift ou leito fluidificado. Evita-se a apoptose ou morte celular renovando
periodicamente parte do meio para retirar os produtos excretados.
Nos últimos anos, as técnicas de cultura in vitro de células animais deram um amplo impulso às
pesquisas básicas e aplicadas, aos testes de diagnóstico, às técnicas de fertilização in vitro, à produção
de compostos biológicos (proteínas recombinantes), de tecidos para transplante e de vacinas para uso
humano e veterinário. Nos estudos toxicológicos, esta tecnologia substitui, ao menos parcialmente, a
experimentação com animais, uma atividade que suscita forte resistência na sociedade devido aos
questionamentos éticos levantados.
82
CAPÍTULO 8
A TECNOLOGIA DO DNA
AS FERRAMENTAS DISPONÍVEIS
A tecnologia do DNA compreende uma série de procedimentos para extrair, fragmentar, sintetizar,
marcar, identificar, amplificar e sequenciar o DNA. Trata-se de um conjunto de ferramentas de uso
rotineiro em laboratórios, geralmente em sistemas automatizados especialmente desenhados para
efetuar rapidamente um número altíssimo de operações.
O primeiro passo a dar no campo da biologia molecular é a extração dos ácidos nucleicos. Os
sistemas tradicionais coexistem com métodos de extração em fase sólida, geralmente oferecidos como
kits por numerosas empresas. Estima-se que o mercado de extração e purificação de ácidos nucleicos
supere os 3.8 milhões de dólares em 2020.
AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Entre as numerosas enzimas utilizadas diariamente nos laboratórios, as nucleases merecem atenção
especial porque quebram as ligações entre os nucleotídeos de uma cadeia de DNA. As exonucleases
começam pelas extremidades enquanto as endonucleases cortam a molécula por dentro. Pertencem
a este último grupo as “enzimas de restrição” que reconhecem sítios específicos no DNA.
As enzimas de restrição são produzidas por bactérias como uma arma de defesa contra o ataque
de vírus (bacteriófagos): cortando o DNA viral impedem sua multiplicação. O DNA bacteriano não é
atacado por suas próprias enzimas, seja porque faltam as sequências correspondentes, seja porque
estas estão camufladas pela adição de um grupo metila.
Desde sua descoberta por Werner Arber, na década de 1960, já foram isoladas centenas de enzimas
de restrição que agem como tesouras químicas ao reconhecer, como os seus pontos-alvo,
determinadas sequências de 4 a 8 bases. Por exemplo, a enzima EcoRI, cujo nome deriva de
"Escherichia coli linhagem RY13 (R), primeira endonuclease a ser descoberta" corta o DNA em dois
pedaços (Figura 8.1). A sequência é um palíndromo porque pode ser lida do mesmo modo (GAATTC)
nos dois sentidos (5’- 3’ ou 3’- 5’), de forma análoga a frases como “Amor a Roma” (Figura 8.1).
Assim como há enzimas que cortam o DNA com pontas lascadas, outras fazem um corte reto.
Outras enzimas colam os fragmentos, restabelecendo a ligação entre os nucleotídeos (ligases).
http://bteduc.com
A ELETROFORESE DO DNA
A eletroforese separa os fragmentos de DNA obtidos com uma enzima de restrição. As amostras são
colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico. Os fragmentos de DNA carregados
negativamente se movimentam na direção do polo positivo. Ao encontrar uma resistência menor, os
fragmentos menores migram mais rapidamente (Figura 8.2).
--------------FIGURA 8.1: As enzimas de restrição (EcoRI corta o DNA na sequência palindrômica GAATTC)
5’
G A A T T C
3’
G
AATTC
3’
C T T A A G
5’
C T T A A
G
FIGURA 8.2. A eletroforese do DNA
A. Sistemas de eletroforese
Fonte de eletricidade
Vertical
Horizontal
Cátodo
Amostra
Tampão
Marco de plástico
Fonte de
eletricidade
Gel
Gel
Tampão
Tampão
Eletrodo
Ânodo
C. Migração de diferentes amostras no gel
Eletrodo
B. Formação de bandas por migração
dos fragmentos de restrição no gel
Fragmentos
maiores
Amostra
Fragmentos
de DNA
Migração
Eletrodo
84
Fragmentos
menores
A TECNOLOGIA DO DNA
O poder de separação varia com o suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida) e com o tamanho do
poro, que depende da concentração do meio. Também varia com as características do campo elétrico
aplicado. Os fragmentos de restrição formam bandas que podem ser observadas na luz ultravioleta,
após coloração com uma substância fluorescente. Fragmentos de tamanho conhecido inseridos no gel,
à maneira de uma régua molecular, servem como padrão de comparação para estimar o tamanho das
bandas do DNA analisado.
Uma das primeiras aplicações da eletroforese dos fragmentos de restrição foi o estudo dos
polimorfismos. A modificação do sítio de restrição de uma molécula de DNA (como, por exemplo, de
GAATTC para GAACTC) origina fragmentos de tamanhos diferentes, denominados RFLPs ou rifleps
(do inglês, restriction fragment length polymorphism). Os RFLPs são marcadores que podem ser
estudados do mesmo modo que um gene que determina um caráter visível ou uma modificação
bioquímica (Figura 8.3).
--------------FIGURA 8.3. Os polimorfismos
A. Polimorfismo de restrição (RFLPs)
Uma mutação pode gerar dois alelos diferentes, A1 (nenhum sítio de restrição) e A2 (um sítio de restrição). Na
eletroforese, o DNA dos indivíduos A1A1 será visualizado como uma banda, o de A1A2 como três bandas e o de A2A2 como
duas bandas.
A seta indica o sítio de restrição
Eletroforese
Caso I (Homozigoto)
Caso II (Heterozigoto)
Caso III (Homozigoto)
B. Polimorfismo de VNTRs presentes no mesmo fragmento de restrição, em 3 indivíduos diferentes.
Caso I (6,2)
Caso II (3,3)
Caso III (4,5)
VNTR
Sítio de restrição
85
http://bteduc.com
HIBRIDIZAÇÃO E SONDAS GÊNICAS
Determinadas condições físicas (temperatura, pH ou concentração salina) quebram as pontes de
hidrogênio entre as bases complementares, causando a dissociação dos dois filamentos de DNA. Em
condições favoráveis, essas ligações se restabelecem e os filamentos se associam novamente.
A reação de associação ou hibridização também ocorre entre filamentos de DNA ou de RNA de
diferentes origens e tamanhos, sempre que houver algumas sequências complementares. Em função
desta propriedade se constroem filamentos simples de DNA ou RNA de sequência conhecida, que são
usados como sondas para reconhecer a presença de uma sequência complementar em um
cromossomo ou em um fragmento de DNA (Figura 8.4).
-------------FIGURA 8.4. Hibridização de uma sequência de DNA com uma sonda complementar marcada
Moléculas de DNA
Sonda radioativa ou
fluorescente
Dissociação
Reassociação
--------------
O MÉTODO DE SOUTHERN
Em 1975, E.M. Southern descreveu um método para analisar fragmentos de restrição com sondas
específicas. As bandas de DNA cromossômico do gel de eletroforese são transferidas a uma membrana
de náilon ou de nitrocelulose e o alvo é reconhecido por hibridização com uma sonda radiativa de DNA,
registrando-se o resultado em um filme apropriado (Figura 8.5).
O método, denominado Southern blotting, é aplicado no diagnóstico de doenças genéticas, algumas
das quais causadas por mutações que modificam o padrão de bandas, ao eliminar ou criar um sítio de
restrição. Métodos análogos foram desenhados para estudos de RNA (Northern blotting) e de
proteínas (Western blotting). No primeiro caso, a sonda pode ser um fragmento de ácido nucleico, mas
no segundo a sonda é um anticorpo específico.
O FINGERPRINT
Descrita por A. Jeffreys em 1985, trata-se de uma variante do método de Southern que focaliza as
regiões do genoma que não se expressam e se repetem dispersas ao longo do genoma. Denominadas
VNTR ou vinters (do inglês variable-number tandem repeats), o número de repetições pode variar de
um cromossomo ao seu homólogo (Figura 8.3). Sendo assim, os fragmentos de restrição
correspondentes têm um tamanho diferente, o que pode ser visualizado por eletroforese.
Ao aumentar o número de sondas para o reconhecimento de vários tipos de VNTRs, obtém-se um
padrão de bandas individual, parecido com o código de barras do comércio. Assim como as impressões
86
A TECNOLOGIA DO DNA
digitais identificam as pessoas, as sondas revelam a identidade genética de cada um de nós. O
procedimento, não por acaso chamado de Fingerprint, encontrou rápida aplicação tanto na
investigação de paternidade (ou maternidade), como na identificação policial ou forense.
A SÍNTESE E AMPLIFICAÇÃO DE DNA
SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS
A síntese de oligonucleotídeos de DNA e RNA se realiza hoje em máquinas automatizadas
(sintetizadores) capazes de construir, em poucos minutos, moléculas com dezenas de pares de bases
(Figura 8.6). Estes oligonucleotídeos podem ser utilizados como sondas ou como primers para a PCR
(ver um pouco mais adiante).
-------------FIGURA 8.5. A técnica de Southern
A sonda revela a presença de uma sequência complementar. A desaparição de um sítio de restrição por
mutação permite completar o diagnóstico de anemia falciforme em I e II.
1. Preparação dos fragmentos de restrição
Três amostras de DNA de diferente
procedência + enzima de restrição.
Separação dos fragmentos de restrição
por eletroforese.
2. Eletroforese
Papel absorvente
Membrana
Gel
3. Transferência
Buffer
Papel de filtro para
garantir a hidratação
O DNA é desnaturado, e os fragmentos
unifilamentares são transferidos a uma
membrana de nitrocelulose.
Suporte
Buffer
4. Sonda radioativa
Acrescenta-se uma sonda unifilamentar
ao gene procurado. Esta hibridiza com
o fragmento portador da sequência
complementar.
5. Autorradiografia
Depois de lavar, para eliminar o excesso
de reagente, coloca-se sobre o filtro um
filme sensível à radioatividade.
87
http://bteduc.com
SÍNTESE DE cDNA
A transcrição da informação genética no sentido RNA  DNA pela transcriptase reversa garante aos
vírus com genoma de RNA (HIV, por exemplo) sua multiplicação no hospedeiro. Como ferramenta de
laboratório, a transcriptase reversa possibilita a construção de filamentos de DNA complementares
(cDNA) a qualquer molécula de RNA (Figura 8.7). Diferente do gene original, não haverá íntrons no
cDNA reconstruído a partir de RNA.
-------------FIGURA 8.6. A síntese de oligonucleotídeos
Bloqueio
Suporte
O primeiro nucleotídeo
(Base 1) está fixado a um
suporte. Acrescentam-se os
nucleotídeos seguintes (Base
2), bloqueados no sítio 5’
O segundo nucleotídeo (Base 2) se
une ao nucleotídeo fixo. O bloqueio
em 5’ determina a incorporação de
um único nucleotídeo
Depois de eliminar por meio
de lavagem os nucleotídeos
que não se incorporaram na
cadeia, retira-se o bloqueio.
Reinicia-se o processo
com a incorporação do
nucleotídeo seguinte
(Base 3)
FIGURA 8.7. A síntese de cDNA por transcriptase reversa
DNA (com íntrons)
mRNA
Transcriptase reversa
Degradação do RNA
Síntese do filamento de DNA complementar
Dois filamentos de DNA, sem íntrons
cDNA
88
Peptídeo
A TECNOLOGIA DO DNA
A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction ou PCR) permite obter milhões de
cópias de DNA em poucas horas (Figura 8.8). Para isso, os elementos necessários são: o DNA contendo
a sequência que se deseja amplificar, desoxinucleotídeos dos quatro tipos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP),
uma polimerase de DNA e os primers correspondentes. Estes últimos são pequenos fragmentos
sintéticos de DNA complementares às extremidades da sequência-alvo, indispensáveis para que a
polimerase comece a sintetizar DNA.
A chave do processo é a DNA-polimerase, uma enzima estável a altas temperaturas que permite à
bactéria Thermus aquaticus sobreviver em águas termais. Atualmente, esta enzima se produz por
engenharia genética.
-------------FIGURA 8.8. A reação em cadeia da polimerase
A. Os elementos necessários
Fragmento de DNA
Desoxinucleotídeos
Enzima taq-DNA polimerase
Primers
Os primers são pequenos fragmentos de DNA, complementares às extremidades da sequência que se quer amplificar
e indispensáveis para que a enzima DNA-polimerase inicie a síntese de DNA.
B. A amplificação do DNA
PRIMEIRO CICLO
950C
Molécula
original
680C
Dissociação dos
filamentos
complementares
720C
Associação dos
primers com a
sequência
complementar
A polimerase inicia
a síntese de DNA a
partir do primer
2 cópias
SEGUNDO CICLO
2 cópias
4 cópias
TERCEIRO CICLO
4 cópias
8 cópias
89
http://bteduc.com
Em um ciclo pontuado por mudanças de temperatura, os filamentos de DNA são dissociados e
anelados com os primers, possibilitando a síntese do resto da sequência pela polimerase. Repetindo
muitas vezes o ciclo, gera-se em pouco tempo um número altíssimo de cópias que podem ser utilizadas
em qualquer tipo de análise. Um termociclador pode realizar 25 ciclos em menos de uma hora,
amplificando 105 vezes o fragmento de DNA.
A empresa Cetus comprou de seu inventor, K. Mullis, a patente da PCR por U$S 10.000, vendendoa pouco tempo depois a Hoffmann-La Roche por U$S 300 milhões; hoje se trata de uma técnica
corriqueira em qualquer laboratório de Biologia Molecular e provavelmente nenhum dos dois fez um
bom negócio. Mais tarde, em 1993, Mullis recebeu o Prêmio Nobel pela invenção da PCR.
Uma das grandes vantagens da PCR é que não há necessidade de isolar previamente o fragmento
a ser amplificado, bastando conhecer as extremidades da sequência e escolher os primers adequados.
Desenvolvendo-se de forma totalmente automatizada, o procedimento admite mais de vinte
variantes.
Como assinalado anteriormente em relação aos sintetizadores de oligonucleotídeos, uma das chaves
do êxito da PCR é o fato de ser um procedimento automatizado que se desenvolve em máquinas
rápidas e eficientes, resultado da integração da Biologia Molecular com a Informática e a Eletrônica.
Sendo uma tecnologia versátil, tem dado origem a mais de 20 variantes do procedimento inicial, todas
com aplicações específicas e diferentes níveis de sensibilidade.
O sucesso da PCR se deve a sua extraordinária versatilidade, permitindo que seja utilizada, com
objetivos diversos, em campos tão diferentes como a agricultura, a medicina veterinária, os estudos
ambientais, os testes de diagnóstico e a medicina forense. Aplica-se também nos estudos
antropológicos e evolutivos, tais como a extração de DNA de múmias egípcias, de animais extintos
como o quagga (um tipo de zebra) ou de insetos presos em âmbar 40 milhões de anos atrás.
O SEQUENCIAMENTO DO DNA
O sequenciamento de um fragmento de DNA é outro procedimento de tipo iterativo que possibilita a
construção de máquinas capazes de realizar rapidamente a tarefa (Figura 8.9). O sequenciamento com
didesoxinucleotídeos é um aprimoramento de Sanger (1977) do método inicial de Maxam & Gilbert
(1973).
O DNA é amplificado e incubado com DNA-polimerase, nucleotídeos normais e
didesoxinucleotídeos marcados. A síntese de DNA é interrompida a cada vez que um
didesoxinucleotídeo é incorporado, gerando fragmentos de diferente tamanho. Um sistema
automatizado permite identificar, na corrida eletroforética, cada um dos quatro didesoxinucleotídeos
incorporados, fornecendo diretamente a sequência do fragmento sequenciado.
Uma vez determinada a sequência de várias amostras, inicia-se a montagem da informação
armazenada nos bancos de dados. Esta etapa se realiza em supercomputadores, exigindo um
tratamento matemático para ordenar as sequências, preencher as lacunas e verificar os dados.
Existem sequenciadores automatizados em que o gel é colocado nos capilares por um braço-robô
que acrescenta o DNA e efetua a limpeza depois da eletroforese. No ano 2000, tais braços permitiam
o tratamento de uma centena de amostras em 4 horas, sem exigir mais do que 15 minutos diários de
atenção humana. No auge do estudo do genoma humano, uma empresa ligada a Celera (Biosystems
Applied) mantinha os computadores funcionando dia e noite, chegando a gastar U$S 1.000.000
mensais com eletricidade.
Apesar de ter possibilitado o estudo de numerosos genomas, a partir de 2006 o método
automatizado de Sanger começou a ser considerado pouco eficiente, surgindo a necessidade de
desenvolver uma nova geração de tecnologias, mais rápidas e mais baratas.
90
A TECNOLOGIA DO DNA
FIGURA 8.9. O sequenciamento de um fragmento de DNA
1.
2.
Preparar numerosas cópias do fragmento a sequenciar
(tamanho aproximado: 500 pares de bases)
Incubar a preparação com as substâncias necessárias para a síntese de filamentos complementares e
acrescentar alguns nucleotídeos, na forma didesóxi, marcados com substâncias fluorescentes de diferente cor.
Primer
3.
DNA-polimerase
Desoxinucleotídeos
Didesoxinucleotídeos
Iniciar a síntese dos filamentos complementares que
será bloqueada quando, em vez de um desoxinucleotídeo,
se incorporar um didesoxinucleotídeo, porque estes não
formam ligações fosfodiéster.
Síntese bloqueada devido à incorporação de
4.
Depois de vários ciclos teremos fragmentos de todos os tamanhos:
5.
Os fragmentos são separados por eletroforese. O sequenciador identifica cada um deles pela fluorescência do
nucleotídeo didesóxi incorporado e fornece a sequência.
Fragmentos maiores
Migração
Sequência
Fragmentos menores
91
http://bteduc.com
Várias tecnologias de sequenciamento next generation coexistem atualmente no mercado (454 Life
Sciences, Ion Torrent’s PGM, Pacific Biosciences’ RS and the Illumina MiSeq). O fator comum é o
sequenciamento em paralelo dos fragmentos de DNA sobre um substrato sólido (High throughput
sequencing). A leitura das bases incorporadas é simultânea à sua incorporação, não sendo necessário
separar os fragmentos, como no método didesóxi.
Em 2006, os métodos utilizados eram 500 vezes mais rápidos que os da década anterior. Hoje, além
de serem ainda mais velozes, as tecnologias next generation derrubaram os custos do
sequenciamento. Se, em outubro de 2004, o custo do sequenciamento de 1 Megabase (1.000.000 de
pares de bases) era de US$ 1598,91, em abril de 2014 o preço era de US $ 0,05.
Essas tecnologias revolucionaram as pesquisas genéticas e genômicas. Em consequência, temos
uma enorme avalancha de dados possibilitando estudos comparativos e evolutivos de uma dimensão
inimaginável alguns anos atrás. Também abre o caminho para estudos sobre as diferenças genéticas
que afetam a saúde e a doença.
OS ARRAYS
Como resultado do conhecimento acumulado sobre o genoma do homem e de outros organismos, já
podem ser estudados alguns aspectos relacionados com a expressão e a interação dos genes. Lidar
com um número enorme de informações demanda novos avanços tecnológicos, entre os quais a
construção de chips de DNA ou microarrays. Estes podem analisar em paralelo grandes quantidades
de material biológico (HTS).
Em um tipo de microarray, os testes são processados em microplacas de poliestireno com um
número variável de pequenas cavidades, cada uma delas cumprindo a função de um tubo de ensaio.
Estas placas permitem realizar simultaneamente numerosos testes, utilizando uma quantidade mínima
de reagentes e automatizando a leitura dos resultados.
Um segundo tipo de dispositivo consta de até 100.000 sondas de DNA por centímetro quadrado,
fixadas mediante diferentes tecnologias (robótica, fotolitografia a uma lâmina de vidro, náilon ou
sílica). A hibridização dessas sondas com as moléculas de ácidos nucleicos (cDNA) marcados será
visualizada por varredura (scanner) como pontos fluorescentes e analisada com um software
apropriado para o tratamento da informação (Figura 8.10).
Escolhem-se as sondas entre os genes codificadores de proteínas que se expressam na célula. Desse
modo, se excluem os genes que correspondem ao rRNA, aos tRNAs, às sequências de controle e ao
DNA extragênico. A escolha de sequências transcritas, denominadas ESTs (do inglês, expressed
sequence tags), aumenta as chances de detectar os genes que participam de alguma resposta
patológica.
Os microarrays são utilizados nos estudos de expressão gênica e para o sequenciamento rápido de
oligonucleotídeos. O estudo simultâneo de centenas de genes é um caminho para desvendar as
interrelações existentes entre eles e vários aspectos do funcionamento do genoma.
Numerosas empresas fabricam arrays comercialmente; algumas estimam que em pouco tempo
serão construídos arrays do tamanho de uma moeda, contendo todo o genoma humano.
A CONSTRUÇÃO DE GENOMAS MÍNIMOS
Com o desenvolvimento da genômica e a aparição de novas plataformas tecnológicas e na interface
entre a biologia e a engenharia, nasce a biologia sintética. Trata-se de uma nova área de conhecimento
com finalidades práticas, estimulada pela chegada dos métodos de sequenciamento “next generation”
e a existência de plataformas tecnológicas accessíveis para a síntese de oligonucleotídeos.
92
A TECNOLOGIA DO DNA
FIGURA 8.10. Fundamentos da tecnologia de arrays
Se as sondas representarem ESTs, saberíamos que os genes representados por B7, C2, D4, E10, G8 e H5 estão ativados. O
tamanho das sondas depende da tecnologia utilizada na construção do array. Observe-se que cada uma das sondas
representadas no desenho corresponde a um conjunto de moléculas semelhantes.
Microarray com sondas (Oligonucleotídeos de DNA)
fixadas a um suporte
A partir do mRNA extraído, se prepara o DNA, que
é marcado com uma substância fluorescente
Hibridização
Eliminação do cDNA marcado que não
emparelhar com nenhuma sonda
Varredura (scanner) para detectar
as sondas que hibridizaram com o cDNA
Resultado: Houve complementação com
as sondas B7, C2, D4, E10, G8 e H5
--------------
Na vanguarda deste movimento estão os pesquisadores do Instituto J. Craig Venter com a bactéria
sintética (Synthia, 2010). Na construção, unidades básicas de DNA de Mycoplasma mycoides foram
introduzidas em uma bactéria receptora de outra espécie, Mycoplasma capricolum, eliminando-se
posteriormente o genoma desta. Synthia se reproduz normalmente e carrega sequências específicas
que confirmam sua origem artificial.
Bactérias especialmente desenhadas seriam de interesse para a indústria e para projetos de grande
envergadura, mesmo que hoje nos pareçam um tanto fantasiosos, como a colonização de Marte.
Contudo, alguns aspectos resultam preocupantes. A síntese do vírus da pólio (2002) e a “ressurreição”
do vírus da gripe espanhola levantaram inquietude em relação à disseminação de material que possa
ser utilizado para elaborar armas biológicas ou toxinas.
Outro aspecto de biossegurança a considerar é o desenho de sistemas de contenção que impeçam
a liberação de organismos sintéticos no ambiente, seja utilizando sistemas bioquímicos não naturais,
como a introdução de benzopurinas ou benzopirimidinas no DNA, seja construindo ribossomos que
93
http://bteduc.com
reconheçam códons de 4 bases.
No leque de questões levantadas, destacam-se as seguintes: Quais os sistemas de contenção
necessários para impedir a liberação no ambiente de novas formas de vida? Como seriam modificadas
as leis de propriedade intelectual? Quais as medidas a tomar em caso de acidente? Como impedir o
uso dual de equipamentos e organismos? Quais as implicações éticas do desenho de seres vivos
diferentes?
Esperam-se da biologia sintética avanços substanciais em medicina, indústria, energia e meio
ambiente, porém, será essencial o monitoramento dos riscos para a biossegurança, a biosseguridade
e a bioética.
94
CAPÍTULO9
A ENGENHARIA GENÉTICA
O NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA
Ao término da Segunda Guerra Mundial, a Genética e a Biologia molecular se desenvolveram a uma
velocidade tal que bastaram 25 anos para esclarecer os temas fundamentais: a estrutura dos ácidos
nucleicos, o código genético, a ação dos agentes mutagênicos, a genética dos microrganismos, a
estrutura e a síntese das proteínas, a regulação gênica etc. É nesse contexto de avanços muito rápidos
que devemos situar as primeiras experiências de engenharia genética com a tecnologia do DNArecombinante.
A utilização da palavra “recombinante” nos remete à recombinação gênica, um fenômeno que
ocorre normalmente durante a meiose, devido à permuta de fragmentos cromossômicos homólogos.
Mediante o corte e a união de pequenos pedaços de DNA, a engenharia genética cria novas
combinações de genes, pertencentes ou não a indivíduos de uma mesma espécie.
A engenharia genética é um instrumento valioso para o estudo dos genomas, a produção de
proteínas em organismos modificados geneticamente e a geração de organismos transgênicos com
propriedades novas.
AS PRIMEIRAS EXPERIÊNCIAS
Em 1972, na Universidade de Stanford (Califórnia), P. Berg conseguira associar o DNA de dois
microrganismos diferentes e formar uma molécula mista de DNA. Na mesma universidade, Stanley
Cohen especializava-se na biologia dos plasmídeos microbianos, pequenas moléculas de DNA circular,
portadoras de alguns genes capazes de se replicar de maneira autônoma. E, na Universidade da
Califórnia (São Francisco), Herbert Boyer isolava a primeira das enzimas de restrição que corta o DNA
em fragmentos com pontas lascadas, uma característica que simplifica a tarefa de associar (“colar”) os
pedaços.
S. Cohen e H. Boyer se encontraram em uma conferência científica no Havaí. A ideia de uma
colaboração entre ambos teria surgido uma noite, diante da praia de Waikiki, ao redor de sanduíches
e cervejas. As experiências conjuntas começaram assim que eles regressaram a seus laboratórios em
São Francisco.
Boyer dispunha da enzima de restrição EcoRI, Cohen, de dois plasmídeos, um deles com um gene
de resistência à kanamicina (pSC102) e o outro com um gene de resistência à tetraciclina e um sítio de
restrição para EcoRI (pSC101).
http://bteduc.com
FIGURA 9.1. Cortar, colar, copiar: a experiência que deu origem à engenharia genética
A. Preparação dos plasmídeos recombinantes
Bactérias T R
CORTAR
COLAR
Enzimas de
restrição
Bactérias T S
pSC 101
pSC 102
B. Transferência dos plasmídeos e seleção das bactérias recombinantes
Bactérias T R K R recombinantes
Plasmídeos
Bactérias T S K S
COPIAR OU CLONAR
Multiplicar
Meio de cultivo com
tetraciclina e kanamicina
Legenda
T: tetraciclina, Ts: sensível à tetraciclina, Tr: resistente à tetraciclina, K= kanamicina, Ks: sensível à kanamicina, Kr:
resistente à kanamicina, pSC101: plasmídeo de Stanley Cohen n0 101; pSC102: plasmídeo de Stanley Cohen n0 102.
FIGURA 9.2. Sapobacter ou Bactosapo?
Com a entrada de um plasmídeo recombinante, com DNA codificador de rRNA de Xenopus, em uma bactéria,
esta passa a sintetizar rRNA de Xenopus.
Xenopus
DNA de Xenopus
Bactéria recombinante
Moléculas de Xenopus
Fragments of amplified Xenopus laevis DNA, coding for 18S and 28S ribosomal RNA and generated by EcoRI
restriction endonuclease, have been linked in vitro to the bacterial plasmid pSCl01; and the recombinant
molecular species have been introduced into E. coli by transformation. These recombinant plasmids,
containing both eukaryotic and prokaryotic DNA, replicate stably in E. coli. RNA isolated from E. coli minicells
harboring the plasmids hybridizes to amplified X. laevis rDNA.
Extraído de: Replication and Transcription of Eukaryotic DNA in Escherichia coli (MORROW J.F., COHEN S.N.,
CHANG A.C. Y., BOYER H.W., GOODMAN H.M.E R.B. HELLING. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71:5, 1974
96
No primeiro experimento, os pesquisadores abriram o pSC101 e inseriram fragmentos do pSC102,
utilizando a enzima de restrição EcoRI como “tesoura” e uma ligase como “cola”. A seguir, eles
introduziram o plasmídeo recombinante na bactéria Escherichia coli. A obtenção de clones resistentes
a ambos antibióticos (tetraciclina e kanamicina) mostrou o sucesso do experimento (Figura 9.1).
Boyer e Cohen repetiram a experiência, substituindo o DNA bacteriano por um fragmento de DNA
do sapo Xenopus laevis. Com esse objetivo, selecionaram um gene codificador de rRNA no DNA do
sapo e o inseriram no plasmídeo pSC101. Introduzido o plasmídeo recombinante na bactéria
Escherichia coli, esta começou a sintetizar rRNA de Xenopus (Figura 9.2).
A extraordinária novidade do experimento está na transferência de genes de uma espécie para
outra bem distante na escala evolutiva; um fenômeno limitado na natureza a uma mesma espécie ou
a espécies muito próximas.
MITOS E REALIDADE
As infinitas possibilidades da tecnologia do DNA-recombinante despertaram alguns dos antigos mitos.
Por desobedecer a Zeus, entregando o fogo ao homem, Prometeu sofreu o terrível castigo de ser
acorrentado a uma montanha e ter o fígado devorado por uma águia. Instrumento da vingança divina,
Pandora abrira a caixa da qual saíram todos os males da humanidade. A ambiguidade da nova
biotecnologia, com os seus desafios e promessas, costuma ser representada nas duas faces de Jano,
um rei com o dom de ver simultaneamente o passado e o presente.
Em 1974, P. Berg e mais nove pesquisadores publicaram uma carta nas revistas científicas Science,
Nature e Proceedings of the National Academy of Science, alertando os colegas sobre os possíveis
riscos da nova tecnologia e pedindo uma moratória sobre os experimentos com DNA, até serem
estabelecidos os cuidados e salvaguardas necessárias. Considerando que “o uso desta tecnologia
apresenta vários riscos possíveis porque novos tipos de organismos, alguns deles potencialmente
perigosos, podem ser introduzidos no ambiente, se não existirem os devidos controles”, o National
Institute of Health (NIH) formou o Recombinant DNA Advisory Committee (RAC).
Em 1975, a conferência de Asilomar (Monterrey, Califórnia), reunindo 139 pesquisadores de 17
países, classificou os experimentos em função do risco (baixo, médio ou alto), pedindo a suspensão
dos experimentos de alto risco enquanto não se determinassem quais as formas de contenção
adequadas, tanto físicas como biológicas. Enfatizava-se também a necessidade de trabalhar com
microrganismos enfraquecidos, incapazes de sobreviver fora do laboratório.
Em 1976, o RAC publicou um conjunto de normas de trabalho que, além de revisadas
periodicamente, devem ser seguidas por todos os pesquisadores e instituições que recebam dinheiro
do NIH para pesquisas com DNA-recombinante.
Com base nos trabalhos publicados em 1973, a Universidade de Stanford obteve uma patente que
lhe rendeu U$S 300 milhões, divididos com a Universidade da Califórnia. A Universidade de Stanford
licenciou o uso da tecnologia a mais de 400 empresas, entre as quais Amgen, Eli Lilly, Genentech,
Johnson & Johnson e Schering Plough. Qual o invento patenteado? O processo ou ferramenta
biotecnológica que consiste em inserir um DNA exógeno em um plasmídeo bacteriano e este em uma
bactéria, que, dessa forma, se transforma em uma fábrica capaz de reproduzir esse gene em
quantidades ilimitadas.
Nesta breve recapitulação do nascimento da Biotecnologia moderna, vale destacar a preocupação
com a segurança, mostrada oportunamente pelos pesquisadores e as instituições científicas
envolvidas. Não há na história da ciência ou da tecnologia um episódio de responsabilidade coletiva
comparável ao da Conferência de Asilomar.
Paralelamente a sua exploração comercial, a engenharia genética é utilizada atualmente em
centenas de laboratórios de universidades e institutos de pesquisa. E não há registro ou relato de
97
http://bteduc.com
nenhum acidente relacionado com essa tecnologia. Talvez valha a pena lembrar que Prometeu foi
liberado depois de 30 anos, e que bem no fundo da caixa de Pandora estava a esperança.
AS BIBLIOTECAS DE GENES
O enorme tamanho de um genoma dificulta a localização de um gene e seu mapeamento. Uma forma
de facilitar a manipulação é extrair o DNA de um organismo determinado, cortá-lo com enzimas de
restrição, inserir os fragmentos em plasmídeos e introduzir os plasmídeos recombinantes em
bactérias. Cada bactéria formará um clone e cada clone levará um fragmento do genoma do organismo
estudado. O conjunto de clones representa o genoma inteiro de um organismo, constituindo uma
biblioteca genômica (Figura 9.3).
Boa parte do DNA não leva genes codificadores de proteínas. Por isso, um procedimento alternativo
é a montagem de uma biblioteca gênica, incluindo exclusivamente os genes que se expressam, ou seja,
os genes responsáveis pela síntese de proteínas. Separa-se o mRNA codificador, e, com a enzima
transcriptase reversa, constroem-se as moléculas correspondentes de cDNA. Inserem-se estas em
plasmídeos, e os plasmídeos em bactérias. Com este procedimento, obviamente, o número de clones
na biblioteca será menor (Figura 9.3).
O número de clones também depende do tamanho do fragmento que o vetor pode carregar. Tanto
os plasmídeos bacterianos como o bacteriófago transportam fragmentos pequenos de DNA de 10 a 20
kb, outros vetores genéticos foram especialmente desenhados para carregar fragmentos maiores
(cosmídeos, YACs ou yeast artificial cromossomes, BACs ou bacterial artificial chromossomes,
transposons etc.).
A construção de bibliotecas de genes representa o primeiro passo para o mapeamento de um
genoma. Ao sequenciamento dos fragmentos segue a montagem da informação. Trata-se de uma
etapa complexa em que se alinham as sequências, se preenchem lacunas e se verificam os dados. O
tratamento matemático das informações demanda algoritmos sofisticados e computadores
poderosos. Uma vez organizada a sequência, esta é armazenada em bancos de dados. O usuário tem
acesso através da Internet, mediante programas especializados que acumulam uma enorme
quantidade de informações.
A CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE
Uma das primeiras proteínas de origem recombinante foi a somatotropina ou hormônio de
crescimento. Como a enzima de restrição eliminava do cDNA, além da sequência codificadora do
peptídeo-guia, os nucleotídeos correspondentes aos primeiros aminoácidos da molécula, estes
tiveram que ser acrescentados quimicamente, em um processo extremamente engenhoso (Figura 9.4).
A transferência gênica permite obter microrganismos que sintetizem alguma substância diferente,
geralmente visando o cultivo em grande escala. O gene de interesse costuma ser selecionado e
estudado na bactéria de laboratório Escherichia coli e, posteriormente, transferido à espécie na qual
se pretende produzir a proteína correspondente.
Além de Escherichia coli e de Saccharomyces cerevisiae, existem vários outros microrganismos que
são habitualmente utilizados como hospedeiros: Bacillus subtilis, Picchia pastoris, Pseudomonas,
Streptomyces, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa etc. Estes microrganismos são utilizados na
produção de fármacos (insulina, hormônio de crescimento, vacinas) ou de enzimas (quimosina) e,
também, na degradação de poluentes.
98
FIGURA 9.3. A construção de bibliotecas de genes
A triagem dos clones pode ser feita reconhecendo a "etiqueta" representada por uma sequência conhecida no DNA (STS, ou
sequence tagged site; ESTs, ou expressed sequence tagged); no caso do gene se expressar, a triagem também pode ser feita
com anticorpos específicos para a proteína sintetizada.
BIBLIOTECA GENÔMICA
Contém todas as sequências do genoma
BIBLIOTECA GÊNICA
Contém as sequências codificadoras
de proteínas
Extração de DNA
Extração de mRNA
Transcriptase reversa
Fragmentação com
enzimas de restrição
Síntese do cDNA
Inserção no vetor
Inserção no vetor
Plasmídeos
Plasmídeos
Incorporação do vetor na célula hospedeira
(Transformação)
Incorporação do vetor na célula hospedeira
(Transformação)
Bactérias
Bactérias
Multiplicação e seleção das células transformadas
Caracterização dos clones
Quando o gene não se expressa no hospedeiro
Quando o gene se expressa no hospedeiro
Mediante sondas gênicas
Mediante anticorpos específicos para a
proteína recombinante
99
http://bteduc.com
FIGURA 9.4. A produção de somatotropina por engenharia genética
Peptídeo – guia
cDNA obtido a partir do mRNA da somatotropina
A remoção do sinal correspondente ao peptídeo-guia, com a enzima de restrição Hae III,
remove também 72 bases, codificadoras dos primeiros 24 aminoácidos da molécula
Fragmento de DNA sintético com as 72 bases correspondentes
aos 24 primeiros aminoácidos
União dos dois fragmentos de DNA
Inserção em um plasmídeo
Plasmídeo recombinante
Transformação
Transcrição
Tradução
Somatotropina
FIGURA 9.5. Algumas estratégias possíveis de clonagem
Biblioteca genômica
Biblioteca gênica
Identificação do clone com o gene que se procura
Síntese in vitro
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Clonagem e subclonagem em Escherichia coli
Transferência a outro organismo, visando a expressão do gene
100
ENCONTRAR O GENE
De um modo geral, encontrar um gene equivale a procurar uma agulha num palheiro. O gene pode ser
localizado por triagem dos clones de uma livraria gênica ou genômica (Figura 9.3). Se esta não existir,
pode ser necessário construí-la, em uma primeira rodada de clonagem, para achar o gene de interesse.
A identificação do clone de interesse envolve a identificação de uma proteína com anticorpos
marcados ou o reconhecimento de um gene por hibridização com uma sonda marcada.
A segunda dificuldade está na obtenção de numerosas cópias desse gene. Uma solução é a
multiplicação do clone correspondente e posterior isolamento do gene procurado. Outra é a
amplificação do gene mediante a PCR, sempre que se conheçam as sequências iniciais e finais ou,
eventualmente, as sequências adjacentes à região onde está inserido. Se a sequência do gene for
conhecida e relativamente curta, podem-se construir cadeias curtas de oligonucleotídeos e associálas, formando um gene sintético que será amplificado por PCR. Existem numerosas estratégias, que
dependem do caso e, também, das características e possibilidades do laboratório (Figura 9.5).
Seja qual for o caminho seguido, uma vez que as cópias do gene de interesse forem obtidas, estas
terão que ser transferidas ao hospedeiro definitivo.
INSERIR O GENE
A transferência de um fragmento estranho de DNA se vê facilitada pela utilização de vetores. Um vetor
é uma molécula de DNA que se duplica de maneira autônoma dentro de uma célula, carregando vários
genes, entre os quais alguns marcadores que permitam reconhecer sua presença dentro da célula. É
no vetor que será inserido o fragmento de DNA estranho, para multiplicação ou integração no genoma.
Além dos plasmídeos (bacterianos e de leveduras) e bacteriófagos (, m13), também se utilizam
como vetores os transpósons, que são elementos genéticos móveis capazes de pular de um lugar a
outro do genoma, espalhando ou não cópias. Construídos em função das necessidades, existem hoje
vetores bacterianos, vetores de leveduras e vetores bifuncionais que podem ser utilizados tanto em
bactérias como em leveduras.
As primeiras experiências de Engenharia Genética foram feitas na bactéria Escherichia coli, um
microrganismo muito conhecido e fácil de cultivar em laboratório. Porém, Escherichia coli não é o
organismo ideal para a expressão de genes eucarióticos. Células procarióticas e eucarióticas diferem
em relação ao processamento do mRNA e às modificações das proteínas depois da tradução. Por este
motivo, quando se procura expressar genes de mamíferos, Escherichia coli é substituída por outras
células eucarióticas, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, um fungo utilizado há séculos na
produção de alimentos e bebidas.
Para que um gene se expresse em uma célula hospedeira, é necessário que esta reconheça seus
próprios sinais de expressão. Para poder sintetizar uma proteína exógena, a célula deverá ler a
sequência codificadora com seus próprios sinais de transcrição (promotor) e de tradução (sítio de
ligação com o ribossomo, término de leitura).
O ideal é construir um vetor que já contenha os genes marcadores para seleção ou reconhecimento,
os sítios de restrição, uma sequência promotora e os sinais adequados de início e fim da transcrição.
Ao colocar a sequência codificadora da proteína, o vetor funciona como um “cassette” de expressão
(Figura 9.6).
Outros fatores adicionais intervêm na construção de um vetor de expressão. Um promotor forte,
por exemplo, permitirá sintetizar uma quantidade grande de proteína, o que será comercialmente
interessante se esta for uma enzima. Entretanto, se a proteína em questão for uma toxina que possa
afetar o hospedeiro, será preferível escolher um promotor fraco. Uma possibilidade interessante é a
101
http://bteduc.com
utilização de um promotor que responda a um fator externo controlável (substrato, temperatura), de
maneira tal que o gene possa ser ligado ou desligado no momento que se considere conveniente.
Finalmente, também deve ser considerado o destino da proteína dentro da célula; se esta for
secretada haverá que acoplar na construção gênica um gene de sinalização que a leve até a membrana
celular.
Existem diversos métodos para inserir o DNA recombinante dentro da célula. Facilita-se a entrada
do DNA com algumas manipulações, tais como a adição de CaCl2 no meio e/ou a modificação da
temperatura. A aplicação de forças elétricas também aumenta as chances do DNA penetrar na célula,
ao abrir os poros da membrana (eletroporação).
Os plasmídeos atravessam a membrana celular em um processo denominado transformação, que
ocorre em determinadas condições fisiológicas da célula hospedeira. Em se tratando de vetores virais,
a infecção da célula promove a entrada do DNA exógeno dentro da célula. Fala-se neste caso de
transfecção (transformação + infecção).
-------------FIGURA 9.6. A estrutura de um vetor de expressão
Este deve incluir os elementos genéticos da célula hospedeira para a transcrição e tradução.
Origem da replicação
mRNA
Promotor
Sinais de término de leitura
Sinais de início de leitura
Gene exógeno
--------------
IDENTIFICAR OS MICRORGANISMOS RECOMBINANTES
A tecnologia do DNA-recombinante está baseada em fenômenos que ocorrem em frequências muito
baixas. A existência de métodos de seleção eficientes possibilita detectar e recuperar aquelas células
que incorporaram um gene estranho.
Associa-se o gene estranho a um marcador seletivo como, por exemplo, um gene de resistência a
algum antibiótico. Em presença deste, só poderão se multiplicar e formar clones ou colônias as células
que incorporaram ambos os genes. Entretanto, o uso de genes de resistência a antibióticos é
considerado polêmico, porque existe uma possibilidade remota dos genes serem transferidos das
bactérias transformadas para as bactérias do ambiente.
Também podem ser utilizados como marcadores seletivos os genes que codificam a síntese de um
aminoácido. Neste caso, a seleção do microrganismo recombinante ocorre em um meio sem esse
aminoácido.
102
Além dos marcadores seletivos, os pesquisadores contam com outro tipo de marcadores que
permitem identificar as bactérias transformadas e, também, acompanhar a expressão de um gene no
organismo modificado. Destacam-se entre estes marcadores, ou genes repórteres: GAL e GUS,
respectivamente o gene da -galactosidase e o gene da glucuronidase, que transformam o substrato
correspondente em um composto colorido; GFP, um gene da medusa Aequorea Victoria, que sintetiza
uma proteína fluorescente, verde brilhante na luz ultravioleta; LUC, o gene da luciferase, uma enzima
dos vaga-lumes, que emite luz em presença do substrato.
A CHEGADA DA COMUNIDADE DIY
A crise econômica do início de século XXI excluiu dos empregos formais numerosos jovens com boa
formação profissional e, paralelamente, o progresso tecnológico causou uma queda acentuada nos
preços dos equipamentos básicos de laboratório e de síntese/sequenciamento de ácidos nucleicos.
Nos países desenvolvidos, onde a cultura do empreendedorismo é muito forte, algumas iniciativas
educativas de várias organizações (Biobricks Foundation, SYNBIO etc.) e universidades (Harvard, MIT
etc.) promoveram a criação da comunidade DIYBIO (do inglês, do it yourself).
Tomando como referência o nascimento da indústria dos computadores pessoais na Califórnia, esta
geração monta laboratórios de fundo de garagem, absorve o conhecimento disponível em open source
e aproveita equipamentos de segunda mão, quando não cria os próprios. Trabalha com base na livre
difusão de protocolos e sequências biológicas standard que são usadas, com segurança, como blocos
fundamentais (biobricks).
O objetivo de desenhar e construir sistemas biológicos simplificados que cumpram funções
determinadas os integra à Biologia Sintética. Os elementos fundamentais são moléculas de DNA,
associadas entre si como os blocos de Lego. Denominados partes, dispositivos e sistemas em função
de sua complexidade, os elementos serão colocados em um microrganismo ou chassis (Figura 9.7).
Observe-se que os participantes utilizam exclusivamente microrganismos do Grupo de Risco 1, com
baixo ou nenhum risco individual e coletivo, e biobricks seguros disponibilizados por organizações
responsáveis. Inclusive figura na Internet um kit para bioengenharia (Amino, a US$ 700), equivalente
ao Arduino em eletrônica, com tudo o que é preciso para sintetizar microrganismos BS1,
geneticamente modificados, e criar fragrâncias, flavorizantes, materiais, medicamentos etc
-------------FIGURA 9.7. Semelhanças entre os Legos e os Biobricks (www.biochem.hku.hk/synbio/?_id=148)
A. Classificação hierárquica
PARTES
Codificam funções básicas e sua eficiência
Exemplos: sequência gênica de uma proteína ou de um promotor da
RNA polimerase, número de vezes / momento em que uma polimerase ou um
ribossomo passam por determinado ponto.
DISPOSITIVOS
Coleções de partes que implementam uma função
Exemplo: produção de uma proteína fluorescente como resposta à presença
de uma determinada substância no ambiente.
SISTEMAS
Tarefas complexas
Exemplo: oscilar na emissão de duas cores com uma frequência determinada.
CHASSIS
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae etc.
103
http://bteduc.com
B. Construções intercambiando as partes
Gene funcional
Promotor
Sítio de ligação com
o ribossomo (rbs)
c
Vamos mudar o promotor?
Sequência
codificadora
da proteína
Sequências
finalizadoras da
transcrição
Enzimas de restrição
c
Novo promotor
+ ligase
c
Novo gene funcional
--------------
A comunidade DIY compartilha valores e normas de trabalho. O estímulo à inovação científica e
econômica, assim como ao empreendedorismo, está presente nas competições internacionais iGEM
(International Genetically Engineered Machine), organizadas pelo Massachussets Institute of
Technology (MIT), a partir de 2003. No entanto, algumas organizações pedem um controle estrito,
temendo a participação de pessoas sem treinamento adequado (biohackers) ou mal-intencionadas
(biocrackers).
Na comunidade DIY, a biologia sintética se desenvolve em um sistema transparente de código
aberto (Open Source), não sendo possível restringir o acesso a informação, materiais e equipamentos.
Por outro lado, uma regulação estrita limitaria o acesso ao conhecimento de uma comunidade
promissora, explicitamente comprometida com o desenvolvimento de códigos de conduta, protocolos
seguros e regulamentações. Este movimento abre um novo canal para o ensino e divulgação da ciência
que, além de atingir o público geral e complementar a atividade acadêmica, contribui para a
democratização do conhecimento.
A CONSTRUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
As primeiras plantas transgênicas datam de 1983 quando, por caminhos independentes e
complementares, M. Van Montagu e J. Schell (Universidade de Gante, Bélgica), M. Dell-Chilton
(Universidade de Washington, St Louis) e R. T. Fraley (Monsanto) conseguiram transferir genes
bacterianos para plantas.
As plantas transgênicas se originam via cultura in vitro a partir de células vegetais modificadas
geneticamente. Portadoras de um gene exógeno ou transgene, sua obtenção visa o melhoramento das
propriedades agronômicas e nutritivas dos vegetais e, também, sua utilização para produzir
substâncias novas (biofábricas).
104
O TRANSGENE
Para garantir a transferência de uma sequência gênica determinada, deve-se construir em redor uma
estrutura complexa que inclua também um gene marcador, um promotor e as sequências de leitura
adequadas (sequências iniciais e terminais). Denomina-se transgene o conjunto formado pela
sequência gênica e a estrutura que o acompanha.
O promotor desencadeia a transcrição da sequência codificadora de interesse. Um promotor
constitutivo permitirá a expressão gênica na maioria dos tecidos e ao longo da vida da planta,
enquanto outro limitará a expressão a um tecido determinado. Também existem promotores que
respondem a estímulos ambientais internos ou externos, como a luz.
O gene marcador confere resistência a substâncias normalmente tóxicas para as células vegetais,
tais como os antibióticos ou os herbicidas, de modo que, em um meio seletivo, só sobrevivam células
que integraram o transgene.
O uso de marcadores de resistência a antibióticos na construção de plantas desperta vários
questionamentos, apesar de se tratar de antibióticos sem uso clínico e que já estão presentes nas
bactérias do intestino do homem. Estes marcadores podem ser substituídos, mas como sua utilidade
se limita ao processo de transformação, o melhor seria eliminá-los uma vez cumprida sua função. Já
foram desenvolvidas várias técnicas genéticas de remoção dos marcadores, esperando-se que nos
próximos anos sua retirada se transforme em uma prática corriqueira de laboratório.
A TRANSFERÊNCIA DOS GENES A CÉLULAS VEGETAIS
Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria do solo, que leva um plasmídeo denominado Ti (do inglês,
Tumour induced plasmid). Quando infectadas com a bactéria portadora desse plasmídeo, as plantas
eudicotiledôneas desenvolvem galhas, isto é, tumores característicos (crown gall).
A eliminação de alguns genes na região T do plasmídeo Ti conserva sua capacidade de inserção no
cromossomo da célula hospedeira, eliminando a propriedade de induzir tumores. Esta característica
transforma o plasmídeo em um vetor adequado para a transferência de genes de outras espécies às
células vegetais. Basta colocar o transgene na região T do plasmídeo previamente desarmado para se
obter um plasmídeo recombinante que poderá ser transferido novamente a Agrobacterium ou a
células hospedeiras, onde o transgene irá se inserir em algum lugar do genoma (Figura 9.8).
Com esta tecnologia criou-se a primeira planta transgênica, um tabaco resistente à kanamicina.
Continua sendo utilizada até hoje, com as eudicotiledôneas. Porém, as plantas monocotiledôneas
(arroz, milho, trigo) e algumas leguminosas não são infetadas por Agrobacterium, de modo que, para
conseguir transferir genes, deve-se recorrer a outros métodos.
Os métodos físicos têm a vantagem de poder ser aplicados tanto nas plantas monocotiledôneas
como nas eudicotiledôneas. A eletroporação e o tratamento com uma substância desestabilizadora da
membrana plasmática (polietilenglicol ou PEG) são técnicas muito utilizadas. Porém, o método
preferido atualmente é a biolística. Um revólver especial (gene gun) dispara microprojéteis de ouro ou
tungstênio, recobertos de DNA, em direção às células. O dispositivo possibilita a entrada do DNA
exógeno no núcleo, nas mitocôndrias ou nos cloroplastos. De um modo geral, a transformação se
realiza em protoplastos, células em que a parede celular foi eliminada com enzimas.
DO LABORATÓRIO AO CAMPO
No laboratório, transfere-se a construção genética às células receptoras por algum dos métodos
possíveis (geralmente eletroporação, biolística ou uso de vetores, como o plasmídeo Ti de
Agrobacterium tumefaciens); a seguir, se selecionam e recuperam as células transformadas e,
105
http://bteduc.com
mediante as técnicas de cultura in vitro, se regeneram as plantas correspondentes. Note-se que este
trabalho costuma ser realizado em plantas cujo genótipo favorece a transformação e a regeneração
da planta transformada, mas que geralmente resultam pouco vantajosas do ponto de vista
agronômico.
A presença do transgene, assim como o número de cópias e o lugar em que estas se integraram no
genoma, é conferida mediante técnicas bioquímicas e/ou marcadores moleculares (polimorfismos na
molécula de DNA, repetição de sequências), porque são aspectos que podem influir na expressão
gênica. Considera-se alcançado o êxito quando o transgene se expressa no lugar correspondente e
com um adequado nível de atividade, restando por verificar a estabilidade da expressão gênica e o seu
valor agronômico.
-------------FIGURA 9.8. A construção de uma planta transgênica no laboratório
O plasmídeo Ti "desarmado" portando um gene exógeno é transferido a células de discos foliares. Formam-se calos que
poderão regenerar a planta inteira.
Plasmídeo Ti
Plasmídeo Ti desarmado
DNA exógeno
Plasmídeo recombinante
Planta que será manipulada geneticamente
Transformação
Discos foliares
Cultura de calos
Regeneração da planta com o gene exógeno
integrado no genoma
106
Acabada a etapa de laboratório, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetação, para
selecionar as plantas-mãe que darão origem a várias gerações de retrocruzamentos seletivos com
alguma das linhagens “elite”. Os testes visam a obtenção de uma linhagem transgênica de alto
rendimento adaptada a um contexto específico. Em outros termos, uma variedade cultivada ou
cultivar, com uma produtividade potencial parecida à da linhagem “elite” e que expresse o traço
codificado pelo novo transgene (Figura 9.9).
Conceitualmente, estes testes são semelhantes aos efetuados no processo de melhoramento
tradicional; no entanto, a utilização de marcadores moleculares e de técnicas de cultura in vitro
permite caracterizar a progênie bem mais rapidamente. Só então se dá início à liberação planejada no
meio ambiente, que envolve o cultivo de plantas em experimentos protegidos e testes de campo em
diferente escala, até que o novo híbrido transgênico esteja pronto para o seu cultivo comercial. A
liberação do cultivo dependerá da autorização da legislação local, geralmente bastante restrita a esse
respeito.
-------------FIGURA 9.9. As etapas da construção de uma planta transgênica
Transformação por engenharia genética
Regeneração mediante técnicas de cultura de tecidos
Caracterização molecular e bioquímica
Avaliação do valor agronômico
Melhoramento mediante cruzamentos com linhagens de elite
Obtenção de uma variedade transformada geneticamente
Experimentos e testes de campo, em pequena e grande escala
Autorização da legislação local
Liberação do cultivo para sua exploração comercial
--------------
CÉLULAS E ANIMAIS TRANSGÊNICOS
A TRANSFERÊNCIA GÊNICA A CÉLULAS ANIMAIS
Um dos objetivos da engenharia genética é a produção de proteínas recombinantes em culturas
celulares. Em relação aos microrganismos, a grande vantagem das células animais é possuir os sistemas
de transcrição e de processamento das proteínas indispensáveis para a expressão dos genes de
organismos superiores.
Observe-se que, em relação às células animais, a palavra transformação designa a conversão de
uma célula normal em maligna, sendo substituída por transfecção. O transporte de DNA exógeno
107
http://bteduc.com
dentro da célula é assegurado por métodos físicos (eletroporação, microinjeção, ingestão de
micropartículas, fusão de lipossomos com a membrana plasmática) e por vetores (vírus, plasmídeos e
transpósons).
A transfecção mediante vetores virais dos quais se eliminaram as sequências patogênicas interessa
ao laboratorista porque os vírus animais infectam tecidos específicos e se integram no genoma da
célula hospedeira de maneira estável. Em mamíferos, os vírus utilizados mais frequentemente como
vetores são o SV40, a vacina, os retrovírus e os adenovírus. Células de inseto também podem ser
manipuladas geneticamente com vetores como os elementos P de transposição de Drosophila, ou
como o baculovírus, uma vez eliminado o gene que permite sua proliferação na natureza.
Assim como visto anteriormente em relação aos microrganismos e às plantas, a sequência
codificadora é colocada em uma construção gênica bem definida que inclui um gene marcador para
selecionar as células que receberam o transgene. Utilizam-se como marcadores genes de resistência a
antibióticos, genes para características metabólicas (Tk ou timidina quinase) etc.
O grande problema é sempre a integração do transgene no lugar desejado, sem interromper a
expressão de outros genes ou causar a ativação de algum oncogene. M. Capecchi, M. Evans e O.
Smithies receberam o Prêmio Nobel de Medicina de 2007 por solucionar esse problema em célulastronco de camundongo.
Para integrar a construção gênica em um determinado sítio, colocaram, nas extremidades do
transgene, sequências de DNA homólogas às extremidades do segmento a ser substituído. Como
distinguir a integração no lugar desejado (recombinação homóloga) da integração ocorrida em
qualquer outro lugar (recombinação não homóloga)? Acrescentando na construção gênica, um pouco
mais longe, um gene de “seleção negativa”. Se a célula integrar a construção em qualquer outro lugar
do genoma, ela se tornará sensível a um segundo antibiótico. Inversamente, se a célula for resistente
a este antibiótico, isto significa que houve integração no lugar desejado.
APLICAÇÕES
A ovelha Dolly nasceu em 1996, depois de numerosas tentativas de transferir o núcleo de uma célula
mamária a um ovócito anucleado (Figura 9.9). Adorada pela mídia, o clone Dolly teve que ser
sacrificado em 2003 com um tumor no pulmão, artrite e sinais de envelhecimento precoce.
Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e de PPL
Therapeutics anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgênica para o gene codificador do fator
IX, uma proteína que falta nos hemofílicos. Em vez de receber, como Dolly, o núcleo de uma célula
diferenciada mantida em cultivo, Polly recebeu um núcleo proveniente de células embrionárias
modificadas geneticamente.
Mesmo sendo difícil de obter, um animal transgênico pode ser bem mais interessante do ponto de
vista econômico que o cultivo de células em biorreatores, um processo complexo e de alto custo. Na
construção de animais transgênicos para a produção em grande escala de uma proteína recombinante,
escolhe-se habitualmente um promotor que se expresse na glândula mamária, de modo que o produto
gênico apareça no leite do animal. Cabras transgênicas produtoras de fator ativador de plasminogênio
(tPA), vacas produtoras de lactoferrina, somatotropina ou insulina já são uma realidade.
Na Argentina, BioSidus mantém uma dinastia de vacas produtoras de hormônio de crescimento. No
Brasil, a Universidade do Ceará conserva um rebanho de cabras transgênicas de raça Canindé que
secreta no leite o fator de estimulação de colônias de granulócitos humanos (hG-CSF). Chama-se Atryn
o primeiro anticoagulante liberado comercialmente, na Europa (2006) e nos Estados Unidos (2009),
produzido no leite de cabra transgênica (GTC Biotherapeutics).
Outra aplicação interessante da tecnologia de transfecção de células-tronco embrionárias
cultivadas in vitro na pesquisa clínica é a construção de modelos animais para o estudo de doenças
108
humanas. Desse modo se obtiveram camundongos transgênicos para genes determinantes de algumas
doenças humanas, tais como câncer de mama (BRCA 1), doença de Huntington, anemia falciforme etc.
Estes animais são de grande utilidade para as pesquisas farmacológicas
-------------FIGURA 9.10. Construção de animais transgênicos
A. Microinjeção.
Após a transfecção, implantam-se os ovos em fêmeas receptivas (pseudográvidas). Aqueles que incorporaram o transgene
originarão, neste caso, animais de tamanho maior (supermouse).
Cruzamento
Descendência
Ovos fertilizados
Implantação em fêmeas
pseudográvidas
Injeção de DNA exógeno
B. Transfecção de células-tronco embrionárias
A implantação do blastócito com células modificadas em uma fêmea aguti gera animais quiméricos, com células que levam o
caráter para pelagem marrom e células com o caráter para pelagem preta. Do cruzamento entre quimeras, nascem alguns
animais com pelagem preta, tendo incorporado o DNA exógeno no genoma.
Camundongos de pelo preto
Animais quiméricos
Blastocisto
Descendência
Transfecção e
seleção das células
Blastocisto
Camundongo de pelo
marrom (aguti)
Injeção das células
modificadas
Implantação
109
http://bteduc.com
Esta estratégia é utilizada não só para construir modelos animais com um gene ativo (knock in), mas
também para colocar um gene inativo (knock out). Após a transfecção de células-tronco embrionárias
com um gene desativado, realiza-se sua transferência a blastócitos, que, reimplantados, originarão
animais quiméricos, isto é, animais com células de dois tipos: umas em que o gene está ativado e outras
em que não está ativado porque incorporaram o transgene. Dos cruzamentos entre quimeras com
células germinais portadoras do gene desativado nascerão animais homozigotos com duas cópias do
gene inativo (Figura 9.10).
AS NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO GÊNICA
BASEADAS NO RNA INTERFERENTE
A injeção na célula de um RNA artificial (siRNA) de sequência parcialmente semelhante à do DNA de
um gene determinado possibilita silenciar sua expressão. Trata-se de uma ferramenta poderosa para
o estudo da genômica funcional para interferir parcialmente (knockdown) com sua tradução no
citoplasma, de maneira temporária e sem danificar a célula.
Com a integração no genoma de um DNA codificador de RNA em forma de grampo de cabelo
(shRNA, do inglês, short hairpin RNA) consegue-se uma resposta permanente. Depois de processado
pela maquinaria celular dos miRNA, o shRNA irá interferir na tradução de uma molécula externa que
lhe for complementar. Adicionando à construção gênica um promotor induzível, pode-se regular sua
expressão em diferentes tecidos ou em determinados intervalos de tempo. Um dos frutos desta
tecnologia é o feijão resistente ao vírus do mosaico dourado da Embrapa.
BASEADAS NAS NUCLEASES SÍTIO-DIRIGIDAS: ZFN’s e TALEN
As técnicas convencionais de engenharia genética inserem o DNA exógeno ao acaso, com o risco de
interromper algum gene de interesse. A recombinação homóloga é um procedimento eficiente em
células-tronco embrionárias de camundongo, mas não se aplica a outros tipos celulares nem a outras
espécies.
As primeiras tecnologias de edição gênica agem mediante proteínas sítio-específicas, unidas a uma
enzima de restrição que corta o DNA. Como o reconhecimento do alvo depende das proteínas, devemse construir proteínas específicas para cada sequência-alvo. As duas tecnologias mais utilizadas são as
nucleases dedos de zinco ou ZFN’s (do inglês zinc finger nucleases) e TALEN (do inglês Transcription
Activator-Like Effector Nucleases).
Quando o DNA é cortado, a célula une novamente os dois extremos, um mecanismo natural de
reparação sujeito a erros que causam o knockout do gene em questão. Mas não é esse o único
interesse destas técnicas. Uma vez efetuado o corte, tanto se podem induzir mutações de um par de
bases como gerar inserções ou deleções e, inclusive, inserir um gene exógeno em um lugar bem
definido do genoma.
Tanto ZFN’s (2003) como TALEN (2010) são complexas, trabalhosas e pouco precisas, mas TALEN é
preferida por ser mais fácil de desenhar e, por conseguinte, mais econômica.
BASEADAS NA IMUNIDADE BACTERIANA: CRISPR-Cas9
Como sobrevive uma bactéria ao ataque de um fago? Uma possibilidade é que o fago seja
metabolicamente inativo; a outra é que entrem em ação mecanismos de defesa bacterianos, como a
110
fragmentação do DNA viral pelas enzimas de restrição bacterianas. Estas reconhecem sequências
específicas que no próprio genoma estão protegidas por modificações químicas (metilação).
A bactéria sobrevivente poderá, mediante a nuclease Cas, incorporar algumas sequências de DNA do
fago em seu genoma, entre os segmentos repetitivos do sistema CRISPR (do inglês, Clustered regularly
interspaced short palindromic repeats). Se houver um novo ataque, a transcrição e o processamento
desse DNA pode levar à degradação Cas-dependente do DNA do bacteriófago. Estes mecanismos de
defesa (CRISPRs) são frequentes e têm sido encontrados em 40% das eubactérias e 90% das arqueas
sequenciadas.
Baseadas nesse mecanismo de imunidade bacteriana, E. Charpentier (Universidade de UMEA,
Suécia; Universidade de Viena, Áustria) e J. Doudna (Universidade de Califórnia, Estados Unidos)
mostraram que bastava juntar um RNA de fita única com a enzima Cas9 em um tubo de ensaio para
cortar qualquer sequência de DNA no lugar desejado. No ano seguinte, F. Zhang e G. Church (Harvard
Medical School) usaram o sistema CRISPR-Cas9 para editar o genoma de células animais e humanas.
Assim como as nucleases sítio-dirigidas ZNF’s ou TALEN, CRISPR pode ser utilizada para gerar
mutações de ponto, deleções ou inserções. Com pequenas alterações, CRISPR-Cas9 se transforma na
maquinaria ideal para inibir ou ativar genes, desenvolver estudos epigenéticos e induzir a expressão
gênica por substâncias químicas ou estímulos luminousos. Entre outras aplicações, O sucesso de
CRISPR-Cas9 se deve tanto a sua versatilidade como à simplicidade, já que as ferramentas básicas são
a enzima Cas e o RNA-guia, bem mais fácil e econômico de sintetizar que as proteínas (Figura 9.11).
Qual o status de um organismo editado? Em primeira aproximação, seria um organismo
geneticamente modificado. Porém, diferentemente dos OGMs que estão no mercado, um organismo
editado não carrega necessariamente genes de outras espécies. A edição pode inativar um gene, gerar
uma versão mais favorável de um gene existente ou transferir uma variante da mesma espécie, tal
como ocorreria na natureza por mutação espontânea ou por melhoramento. Deste ponto de vista, os
organismos editados não deveriam ser enquadrados na legislação existente.
--------------
FIGURA 9.11. A edição gênica com CRISPR-Cas9
Os mecanismos naturais da célula tendem a reparar o corte sítio-dirigido, produzindo-se alguns erros (mutação de ponto,
deleção) e possibilitando a inserção de um transgene.
Cas9
RNA-guia
DNA genômico
Corte
Transgene +
Gene repórter
Mutação de ponto
Deleção
Inserção de um transgene
111
http://bteduc.com
Em mamíferos, a enzima e o RNA-guia podem ser introduzidos por injeção em células embrionárias;
em plantas por transfecção de protoplastos ou por agroinfiltração. Posteriormente à edição, as
nucleases são degradadas pelas células e desaparecem do organismo. No caso de usar uma construção
gênica, esta desaparece por segregação na divisão celular. Legalmente, a edição gênica não entraria
nos padrões atuais da regulamentação.
Existem repositórios onde são armazenadas centenas de plasmídeos e milhares de linhagens virais,
expressando Cas e um guia diferente de RNA. Nas bibliotecas de vírus (lentivírus, vírus adenoassociados) estão armazenadas as sequências de mais de 18.000 genes. Estes bancos pertencem a
instituições como Harvard Plasmid Database, DNASU Plasmid Repository, National Institutes of
Health’s PlasmID, Mammalian Gene Collection ou a organizações independentes como Addgene e Zinc
Finger Consortium. Empresas como Thermofisher oferecem, além dos vetores, sistemas que por
transfecção mediada por lipídios podem ser introduzidos diretamente na célula, gerando resultados
em 4 dias.
A relevância das novas tecnologias de edição é indiscutível, como mostram algumas das primeiras
aplicações. Em bactérias, CRISPR permite remover modificações genéticas para se adequar a critérios
de biossegurança ou de proteção da propriedade intelectual; na indústria de laticínios, é utilizada para
proteger os bacilos lácticos das infecções virais. Também possibilita a obtenção de plantas resistentes
a vírus e árvores com menos lignina e menos taninos (Populus).
Como ferramenta de pesquisa, CRISPR é utilizada no estudo de ativadores e inibidores epigenéticos
e na edição de células-tronco para entender as doenças neurológicas. Desativando simultaneamente
vários genes, abre-se a possibilidade de estudar doenças poligênicas como autismo, diabetes ou
esquizofrenia. Conseguem-se criar animais knockin ou knockout por injeção de Cas9 e do RNA
específico no zigoto fertilizado. Basta que um animal ou as células de uma cultura in vitro tenham
incorporado por transfecção o gene codificador de Cas, para que só seja necessário acrescentar o RNAguia específico para as sequências-alvo escolhidas.
A patente das técnicas de edição gênica está sendo disputada por Doudna, Charpentier e Zhang. A
biotecnologia é hoje um empreendimento milionário construído sobre pesquisadores, universidades,
empreendedores, empresas, interesses econômicos de grandes capitais.
Pesquisadores chineses criaram macacos com dois genes alterados. Na Inglaterra, foram autorizados
experimentos de edição gênica com embriões que não serão implantados. A comunidade científica de
vários países começa a vislumbrar a possibilidade de edição genética de embriões para terapias
gênicas. A alteração da linhagem germinal representa até o momento uma fronteira técnica e
moralmente intransponível, mas qual será o posicionamento da sociedade?
BIOSSEGURANÇA E REGULAÇÃO
No Brasil, a principal norma reguladora sobre as atividades com organismos geneticamente
modificados é a Lei de Biossegurança (Lei n0 11.105, de 24 de março de 2005) que agrega diferentes
áreas do direito: ambiental, sanitário, defesa do consumidor, propriedade intelectual, civil,
administrativo e penal.
A palavra final sobre as questões técnicas corresponde à Comissão Nacional Técnica de
Biotecnologia (CTNBio), uma instância colegiada multidisciplinar “cuja finalidade é prestar apoio
técnico consultivo e assessoramento ao Governo Federal na formulação, atualização e implementação
da Política Nacional de Biossegurança relativa a OGM, bem como no estabelecimento de normas
técnicas de segurança e pareceres técnicos referentes à proteção da saúde humana, dos organismos
vivos e do meio ambiente, para atividades que envolvam a construção, experimentação, cultivo,
112
manipulação, transporte, comercialização, consumo, armazenamento, liberação e descarte de OGM e
derivados” (http://www.ctnbio.gov.br/index.php/content/view/2.html).
As normas da legislação brasileira estão de acordo com o Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança
e as diretrizes do Codex Alimentarius e da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento
Econômico (OCDE).
Nem a biologia sintética nem a edição de genes se enquadram totalmente dentro das previsões de
um sistema regulatório baseado na engenharia genética. À medida que as novas tecnologias se
desenvolvam será necessário adequar a legislação, mantendo os princípios de precaução, contenção
e biossegurança.
113
C A P Í T U L O 10
BIOTECNOLOGÍA E INDÚSTRIA
O PROCESSO WEIZMANN
No século XIX, os principais produtores de borracha natural eram o Brasil e a Inglaterra (plantações na
Malásia). O processo de vulcanização, que confere ao material sua elasticidade e resistência (C. B.
Goodyear, 1839), e a invenção dos pneus (J. Dunlop, 1888) transformaram a borracha em um insumo
estratégico para o crescimento da indústria automotora.
Quando, em uma tentativa de dumping, os países produtores diminuíram a oferta e provocaram
um aumento significativo do preço, desencadeou-se a corrida à borracha sintética. Enquanto a
Alemanha tentava sintetizar a borracha a partir de um derivado do petróleo (butadieno), a Inglaterra
explorava as possibilidades de síntese de moléculas precursoras por fermentação.
Nesse contexto histórico, o químico de origem russa Chaim Weizmann desenvolveu, na
Universidade de Manchester (1914), um processo fermentativo que utilizava a bactéria Clostridium
acetobutilycum para a produção de butanol (um precursor do butadieno) e acetona. Por ser o primeiro
processo fermentativo industrial desenvolvido em condições assépticas, o processo Weizmann é
considerado um marco histórico na biotecnologia industrial.
No início da Primeira Guerra Mundial, a atenção da Inglaterra desviou-se da borracha para a
produção de explosivos e, especialmente, de cordite, uma pólvora à base de nitrocelulose cuja
preparação demanda acetona. Por ser sintetizada a partir de carbonato de cálcio, um insumo
importado da Alemanha, a via química de produção de acetona tornou-se inviável, tendo a Inglaterra
que começar a explorar a via biotecnológica.
Recrutado pelo Comitê de Munições e tendo cedido a patente do processo ao governo britânico,
Weizmann começou a produzir acetona, por fermentação microbiana de amido de milho, na Nicholson
Gin Distillery (Londres), mas, devido à guerra e à falta de alimentos, o suplemento de carboidratos
acabou se tornando um fator limitante na produção.
Em 1916, os britânicos transferiram a produção para uma destilaria em Toronto (Canadá), ao tempo
que era construída outra instalação na Índia. Em 1917 começou a funcionar uma fábrica produtora de
acetona por fermentação de milho em Indiana (Estados Unidos). Finalizada a guerra, a acetona e o
butanol continuaram a ser utilizados como solventes.
Os caminhos da ciência, da tecnologia e da política se cruzaram várias vezes. Químico e jornalista,
Weizmann chegou a ser um dos mais importantes líderes comunitários do movimento sionista
mundial. Sua contribuição ao esforço bélico da Primeira Guerra Mundial estaria relacionada com a
declaração Balfour (1918), que prometera ao povo judeu um lar na Palestina. Finalizado o mandato
conferido pela Liga das Nações à Grã-Bretanha (1947), criou-se o Estado de Israel (1948), do qual
Weizmann foi o primeiro presidente. Fundado em Rehovot (Israel), o Instituto de Pesquisas Científicas
e Tecnológicas leva o seu nome.
BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA
A INDÚSTRIA QUÍMICA
A VIA QUÍMICA
A indústria química se caracteriza por produzir substâncias que atendem as necessidades de outras
indústrias. Enquanto algumas empresas sintetizam os derivados petroquímicos básicos (etileno,
propileno, butadieno), outras os transformam nos petroquímicos finais: polietileno (PE), polipropileno
(PP), policloreto de vinil (PVC), poliésteres e óxido de etileno. Um terceiro grupo converterá esses
materiais em objetos de consumo tais como filmes, recipientes, objetos diversos etc.
As empresas devem responder às mudanças do mercado ajustando-se rapidamente a qualquer
variação de preço da matéria-prima ou da energia. Para subsistir, uma indústria terá que reagir com
versatilidade, mediante o desenvolvimento de processos tecnológicos inovadores e rentáveis. Os
processos descartados poderão ser reutilizados, se a condição do mercado tornar-se favorável
novamente.
Um exemplo típico é a evolução do mercado da acetona. Subproduto da corrida à borracha sintética
durante a Primeira Guerra Mundial, a acetona passou a ser um produto indispensável para a indústria
de armamentos. Uma vez concluído o conflito, reapareceu como solvente essencial na fabricação de
lacas, uma função da qual seria afastada mais tarde por outras substâncias.
A indústria química do século XX se baseou, principalmente, no petróleo e seus derivados. A crise
dos anos 1970 chamou a atenção da sociedade para os riscos da dependência de um recurso não
renovável. A diminuição das reservas conhecidas cria a necessidade de apelar a tecnologias de
extração novas e caras, geralmente insustentáveis. A situação poderá mudar quando, respondendo
aos apelos da sociedade para diminuir as emissões de carbono, o petróleo seja substituído parcial ou
totalmente, por fontes de energia alternativas.
A VIA BIOTECNOLÓGICA
A via biotecnológica está baseada na transformação da biomassa, um recurso barato e renovável. Para
substituir a via química, devem-se desenvolver processos que possibilitem a obtenção de produtos,
materiais e energia a um custo competitivo e com menor impacto ambiental. Todas estas condições
se encontram satisfeitas na obtenção de numerosas moléculas de interesse industrial, a partir de
milho, de óleos vegetais ou de madeira (Tabela 10.1).
-------------TABELA 10.1. Diversidade de produtos derivados de algumas matérias-primas renováveis
SETOR
MATÉRIA-PRIMA
COMPONENTES
APLICAÇÕES
Açúcar e
amido
Cana-de-açúcar, beterraba
açucareira, sorgo sacarino, trigo,
milho, batata, arroz, mandioca
etc.
Açúcar, amido,
melaço.
Solventes, produtos farmacêuticos, adesivos,
resinas, polímeros, selantes, limpadores, etanol.
Óleos
vegetais
Canola, soja, coco, girassol,
dendê, gorduras animais.
Triglicerídeos,
ácidos graxos,
glicerol.
Surfactantes para sabões e detergentes,
ingredientes inativos de produtos farmacêuticos,
tintas, pinturas, resinas, cosméticos, ácidos
graxos, lubrificantes, materiais de construção.
Madeira
Pinho, eucalipto.
Celulose, papel e
lignina.
Materiais de construção, fibras, polímeros,
resinas, adesivos, pinturas, revestimentos, tintas,
piche.
115
http://bteduc.com
A Biotecnologia Industrial fundamenta-se na microbiologia, nas fermentações e na biocatálise,
recebendo o impacto da biotecnologia moderna (genômica, engenharia metabólica, engenharia
genética), que abre perspectivas novas no melhoramento das linhagens microbianas e das variedades
vegetais.
A produção da vitamina B2 (BASF) e do antibiótico cefalexina (DSM Life Sciences Products) são dois
exemplos bem-sucedidos da substituição da síntese química pela ação microbiana. Esta resultará
vantajosa sempre que, entre o substrato inicial e o produto final, existam vários metabólitos
intermediários, porque um agente biológico será capaz de realizar diretamente a sequência completa
de reações.
A utilização de organismos geneticamente modificados, permite melhorar os processos produtivos
e desenhar produtos novos. Em relação à segurança, cabe lembrar que as características metabólicas
das linhagens industriais estão alteradas, de modo a elas crescerem em condições artificiais muito
estritas, tornando-as incapazes de sobreviver fora do laboratório ou, eventualmente, de competir com
os microrganismos do ambiente.
A percepção pública nutre uma atitude neutra, ou favorável, em relação à biotecnologia industrial.
Em parte, porque os produtos são utilizados como insumos para outras indústrias, o que lhes confere
pouca visibilidade. E também porque, ao utilizar matérias-primas renováveis e desenvolver processos
menos poluentes com menor gasto de energia, as biotecnologias ajudam a atenuar a imagem
poluidora da indústria química. Não é por acaso que a biotecnologia industrial é denominada
“biotecnologia branca”.
OS PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS
Alguns processos biotecnológicos geram substâncias em quantidades pequenas (volume baixo) que
serão vendidas a um preço elevado (alto valor agregado). Trata-se geralmente de metabólitos
secundários cuja produção demanda grandes investimentos, um nível tecnológico avançado e uma
mão de obra altamente qualificada. Nesta categoria, denominada química fina, inserem-se os produtos
farmacêuticos e agrícolas, alguns aditivos alimentares, os aminoácidos, as vitaminas e as enzimas.
A via biotecnológica também se aplica a algumas substâncias fabricadas em grandes quantidades
(volume alto), em processos que demandam investimentos menores, e operações mais simples. Entre
estes produtos, de valor agregado intermediário, encontramos metabólitos primários, tais como
alguns solventes, ácidos orgânicos e polímeros.
No caso de substâncias produzidas em grandes quantidades e com baixo valor agregado, como os
biocombustíveis líquidos (etanol, biodiesel) ou gasosos (biogás), alguns países contam com sistemas
produtivos em pequena escala, funcionando em instalações sépticas e com mão de obra não
especializada. Esses sistemas não exigem mais que equipamentos simples e pequenos investimentos,
mas sua eficiência é baixa, de modo que vão sendo substituídos, gradual e progressivamente, por
outros de nível tecnológico avançado, gerenciados por grandes empresas, em empreendimentos
economicamente sustentáveis.
Atualmente, a via biotecnológica resulta economicamente viável para alguns metabólitos, as
enzimas, os bioplásticos e os biocombustíveis.
METABÓLITOS DE INTERESSE COMERCIAL
Estima-se que a biotecnologia branca responderá, nos próximos anos, por 20% das vendas do setor
químico. Entre as moléculas de interesse comercial, vários metabólitos primários e secundários se
destacam por sua versatilidade (Tabela 10.2).
116
ÁLCOOIS E SOLVENTES
Vimos previamente alguns aspectos históricos relacionados com a produção de acetona e butanol por
fermentação. Estima-se que a imobilização de microrganismos daria um novo impulso à síntese de
solventes, aumentando a produtividade em aproximadamente 60%. Também deve-se destacar a
importância do etanol, 95% do qual é produzido por via biotecnológica.
ÁCIDOS ORGÂNICOS
A produção de ácido cítrico (4.0 x 105 toneladas/ano) depende quase exclusivamente do cultivo do
fungo filamentoso Aspergillus niger, em processos fermentativos de diversos tipos. O ácido cítrico é
utilizado na indústria de alimentos como aditivo (acidulante e antioxidante), na cosmética como
regulador do pH e, na indústria farmacêutica, como anticoagulante e ingrediente de tabletes
efervescentes.
Em relação ao ácido acético, os processos industriais modernos também dependem da ação
bacteriana (gêneros Acetobacter, Gluconacetobacter e Gluconobacter). Com numerosas aplicações, o
ácido acético é um precursor de várias moléculas intermediárias, como o anidrido acético e os acetatos
éster, e de produtos como o acetato de celulose, o celofane, o acetato raiom etc. Também participa
como solvente na produção de borracha, plásticos, gomas, resinas e óleos voláteis. A indústria
farmacêutica o utiliza como acidificante.
O ácido láctico é obtido por fermentação bacteriana (Lactobacillus) ou fúngica (Rhizopus oryzae),
sendo um importante insumo para as indústrias de alimentos e de fármacos e a cosmética. Também
toma parte, como monômero, na síntese de um polímero biodegradável, o ácido poliláctico (PLA).
O ácido succínico encontra aplicações em várias indústrias (alimentos, fármacos, cosmética), assim
como na produção de plásticos e de materiais para a indústria automotora. Trata-se de outro bloco
fundamental para a síntese de polímeros, resinas de ABS (acrilo-nitrilo-butadieno), Nylon 6.6,
solventes etc.
AMINOÁCIDOS
A produção industrial de aminoácidos se destina, principalmente, à nutrição humana (66%) e ao
enriquecimento de rações animais (33%) e, em menor grau, às indústrias farmacêuticas e cosméticas
(1%). O método produtivo mais antigo é a extração, por hidrólise de proteínas (soja, cabelos); os outros
métodos incluem a síntese, a fermentação e a biocatálise.
A síntese química apresenta o inconveniente de gerar misturas das duas formas isoméricas (acil-D
e acil-L), representadas habitualmente como tipo “mão direita" e tipo "mão esquerda". Como os
organismos vivos só assimilam L-aminoácidos, estes devem ser separados das misturas racêmicas por
biocatálise. A imobilização de enzimas estereoespecíficas nos biorreatores facilita a produção
industrial, reduzindo os custos de maneira significativa. Observe-se que a separação é desnecessária
no caso da glicina, que não apresenta ambas as formas, e da DL-metionina, já que os seres vivos
convertem a forma D em L.
A via fermentativa é conveniente para a produção de vários aminoácidos. O agente biológico
Corynebacterium glutamicum produz ácido glutâmico (1,1 milhão de toneladas/ano), que é usado na
cozinha oriental como flavorizante (glutamato monossódico), para realçar o sabor dos alimentos.
A L-fenilalanina e o ácido L-aspártico são obtidos por imobilização conjunta de Escherichia coli e
Pseudomonas dacunhae, em uma coluna de fermentação, ou por uma bactéria geneticamente
modificada (Escherichia coli). Ambos são os componentes do adoçante não calórico Aspartame®
(15.000 toneladas/ano).
117
http://bteduc.com
TABELA 10.2. Metabólitos primários e secundários obtidos por fermentação e/ou bioconversão enzimática
METABÓLITOS PRIMÁRIOS
EXEMPLOS
Álcoois e solventes
Etanol, butanol, acetona, glicerol, manitol.
Ácidos orgânicos
Ácido láctico, ácido cítrico, ácido acético, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido
málico, ácido tartárico, ácido pirúvico, ácido succínico.
Aminoácidos
Ácido L-glutâmico (monoglutamato de sódio), L-lisina, L-fenilalanina, ácido Laspártico, L-carnitina.
Polissacarídeos
Xantana, dextrana, pululana, gelana, agar, alginatos, carrageninas.
Nucleotídeos e nucleosídeos
Ácido guanílico (5’GMP) e ácido inosínico (5’IMP).
Vitaminas
Vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido L-ascórbico), vitamina B12
(cianocobalamina).
Corantes
β-caroteno, astaxantina, ficocianina, monascina.
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
EXEMPLOS
Moléculas para a saúde humana
e/ou animal
Antibacterianos, antivirais, antifúngicos, anti-helmínticos, antitumorais, soros,
imunoglobulinas, vacinas, imunossupressores, estatinas etc.
Moléculas para a agricultura
Inseticidas e pesticidas, fatores de crescimento vegetal.
Moléculas para a indústria de
alimentos
Condimentantes e aromatizantes para a indústria alimentícia.
--------------
Outros aminoácidos cumprem a função de aditivo em alimentos (L-cisteína, 3.000 toneladas/ano), ou
de complemento nutricional em rações animais (L-treonina, 50.000 toneladas/ano; L-lisina 550.000
toneladas/ano). Por outro lado, a indústria farmacêutica absorve 1.000 toneladas/ano de L-arginina e
500 toneladas/ano de L-triptófano, de L-valina e de L-leucina.
NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS
No Japão, os ácidos guanílico (5’-GMP) e inosínico (5’-IMP) são obtidos mediante diferentes processos
fermentativos, e vendidos comercialmente como potenciadores de sabor.
POLISSACARÍDEOS
Os espessantes e gelificantes, extraídos das algas marinhas, estão sendo substituídos, parcialmente,
por polissacarídeos de origem microbiana. A goma xantana (20.000 toneladas/ano), um produto de
fermentação da bactéria Xanthomonas campestris, entra na composição de molhos prontos, pudins,
geleias, sorvetes, dentifrícios etc. Suas propriedades espessantes também são utilizadas na
recuperação do petróleo.
As dextranas (200 toneladas/ano) são obtidas por via fermentativa, a partir de diversos
microrganismos. As de alto peso molecular são empregadas como espessantes na indústria de
alimentos, na preparação de filmes protetores de sementes (indústria agrícola) e na composição das
emulsões fotográficas. As de baixo peso molecular são usadas como plasma sanguíneo artificial, para
melhorar o fluxo sanguíneo em casos de traumatismos e cirurgias.
VITAMINAS
Apesar da maior parte das vitaminas serem obtidas, industrialmente, por via sintética ou extrativa, a
via fermentativa é vantajosa nos casos da riboflavina (vitamina B2) e do ácido ascórbico (vitamina C).
Ainda é a única possível para a cianocobalamina (vitamina B12), uma molécula complexa que não é
118
sintetizada nem por animais nem por vegetais.
Um precursor da vitamina A, o -caroteno, é sintetizado pela alga Dunaliella bardawil, que cresce
na água salobra, em grandes tanques ao ar livre, em uma região desértica perto da costa do Mar
Vermelho (Israel).
ENZIMAS
Algumas enzimas podem ser extraídas facilmente dos tecidos ou dos órgãos de seres vivos: as amilases
do malte da cevada; a papaína da papaia; a ficina do figo, a bromelina do látex do abacaxi. Do estômago
de suínos se separa a pepsina e do pâncreas dos mesmos se obtém a pancreatina, que é uma mistura
de amilases, proteases e lipases. Já a renina é extraída do quarto estômago de bezerros, e a catalase,
do fígado ou do sangue de bovinos.
A extração de enzimas de origem vegetal ou animal está sujeita à disponibilidade de terra e às
flutuações das colheitas ou do abate. Por isso, a tendência é substituí-las por outras de origem
microbiana que, obtidas mediante processos fermentativos em grande escala, garantem uma
produção regular de qualidade constante.
Mesmo cumprindo uma função idêntica, duas enzimas produzidas por microrganismos diferentes
podem apresentar propriedades dessemelhantes. Por exemplo, a lactase (-galactosidase), uma
enzima que hidrolisa a lactose, está presente em bactérias, leveduras e fungos. No entanto, as
condições ótimas de funcionamento diferem uma da outra: 400C, 370C e 55-600C (temperatura); 3-4,
7,2 e 6,6 (pH). A escolha de uma enzima proveniente de um microrganismo ou de outro dependerá
das condições que o bioprocesso demande.
Considerando que ainda há muito a desvendar sobre a biodiversidade microbiana e a arte de alterar
suas vias metabólicas, existem grandes chances de encontrar enzimas com propriedades diferentes,
que possibilitem o desenho de processos industriais inovadores. Por outro lado, a chegada das novas
técnicas de biologia molecular aliadas aos sistemas robotizados de HTS (do inglês, High Throughput
Selection) dará, certamente, um impulso extraordinário a esta área.
A otimização de um processo industrial contempla o custo da matéria-prima, o tipo de fermentação
(submersa ou em meio semissólido) e os controles de pH e temperatura, necessários para o bom
desenvolvimento do processo. Do ponto de vista econômico, não vale a pena elaborar ou
redimensionar esses parâmetros para todo microrganismo produtor de uma enzima interessante.
Muito mais proveitosa é a transferência da sequência codificadora dessa enzima a um dos
microrganismos industriais já bem conhecidos, tais como as bactérias do gênero Bacillus (Bacillus
subtilis) e os fungos do gênero Aspergillus (Aspergillus oryzae).
Mais de 60% da produção comercial de enzimas procede da biotecnologia moderna, com linhagens
seguras, versáteis, altamente produtivas, sem desvios metabólicos laterais, e adaptáveis aos
bioprocessos industriais.
Um fator que incide no custo de uma enzima é a dificuldade técnica encontrada na separação e
purificação (etapa downstream). Em geral, as enzimas mais baratas são as extracelulares, ou seja, as
que são secretadas para fora da célula como, por exemplo, as hidrolases (amilases, proteases e
celulases). As mais caras são as enzimas intracelulares, que precisam ter um grau de pureza maior para
ser utilizadas como fármacos, ou como reagentes em testes de diagnóstico.
As enzimas são insumos para outras indústrias, especialmente as de alimentos e bebidas, rações,
detergentes, analíticas e farmacêuticas. Atualmente, o maior produtor é Novozyme (Dinamarca), que
responde por 48% do mercado. A empresa mantém em funcionamento vários fermentadores de
80.000 l, contabiliza mais de 6.000 patentes e 700 produtos, dedicando a quase totalidade de seu
orçamento de pesquisa e desenvolvimento à otimização de microrganismos, produtos enzimáticos e
tecnologia. A demanda de enzimas industriais se mantém relativamente estável em economias
119
http://bteduc.com
maduras (Estados Unidos, União Europeia, Japão e Canadá) e cresce em economias em
desenvolvimento.
BIOPOLÍMEROS E BIOPLÁSTICOS
A denominação de biopolímeros abrange aqueles que são sintetizados pelos seres vivos, como a
celulose, o amido e os óleos vegetais; e os que resultam da polimerização de uma molécula básica,
como o ácido láctico, proveniente de uma fonte renovável.
Um dos bioplásticos mais versáteis é o polilactato (PLA), um poliéster comercializado como Ingeo®,
obtido por polimerização do ácido láctico, um produto da fermentação de milho. Utiliza-se como
revestimento de filmes e de papel (BASF), recheio de almofadas e edredons (NatureWorks) e material
de embalagens descartáveis por diversas empresas (Coca-Cola, McDonald’s). Também está sendo
aproveitado na indústria automotora (Hyundai) e eletrônica (Samsung). Uma das novas aplicações do
Ingeo® por NatureWorks, está nas impressoras 3D.
Polímeros sintetizados diretamente por microrganismos, como os poli-hidroxialcanoatos (PHAs) e
o poli-hidroxibutirato (PHB), já entraram no mercado de embalagens das indústrias de alimentos e de
cosméticos. Este último, por ser biocompatível, encontrou importantes aplicações nas áreas médica e
veterinária (Biopol). No interior de São Paulo, uma usina piloto (Biocycle), relacionada com empresas
do setor sucroalcooleiro (Biagi, Balbo), já está produzindo PHB por fermentação bacteriana do açúcar
de cana. Está sendo pesquisada a transferência dos genes codificadores de PHA (Ralstonia eutropha)
e de PHB (Alcaligenes eutropus), a microrganismos e plantas (canola).
A indústria dispõe atualmente de, aproximadamente, trinta moléculas essenciais para a construção
de polímeros, tais como os ácidos carboxílicos, o etanol, os aminoácidos, os triglicerídeos, o furfural, o
sorbitol, o glicerol etc. Essas biomoléculas possibilitam tanto a obtenção de plásticos inovadores
biodegradáveis, como a de plásticos convencionais, não biodegradáveis e semelhantes aos de origem
petroquímica. Entre estes: as resinas de poliuretano sintetizadas a partir de óleo de soja, o poliéster
de origem bacteriano Sorona 3GT (DuPont, Genencor) de amplo uso na indústria têxtil, do PVC ou
“polietileno verde” (Braskem, Tetrapak), que é um polímero do etileno obtido a partir do etanol de
cana utilizado nas embalagens de leite e sucos de fruta, e na confecção de sacos de lixo.
Como caracterizar um bioplástico? Pela origem? Pela biodegradabilidade? Existe bastante confusão
a esse respeito, porque alguns setores consideram que a proveniência ou a biodegradabilidade
bastariam para aplicar-se o rótulo de bioplástico. Contudo, uma substância só deveria ser considerada
bioplástico se respondesse, simultaneamente, aos dois critérios: proveniência de uma fonte renovável
e biodegradabilidade.
OS BIOCOMBUSTÍVEIS
A combustão é a forma mais simples de liberar energia; por isso algumas comunidades rurais queimam
madeira, resíduos vegetais ou excrementos secos de ruminantes. Contudo, 75% da energia consumida
no planeta é retirada dos combustíveis fósseis (carvão, petróleo e gás natural). Considerando que as
reservas são limitadas, e que a queima de combustíveis fósseis é a causa de vários problemas
ambientais, parece acertado buscar outras formas de extrair energia.
Uma fonte alternativa é a biomassa, um recurso que, por ser renovável, pode fornecer energia de
modo sustentável. A grande vantagem da biomassa sobre os combustíveis fósseis é que libera uma
quantidade de CO2 igual à que absorveu durante o seu crescimento em um período recente, enquanto
a quantidade de CO2 liberada pelos combustíveis fósseis fora removida do ambiente há milhões de
anos.
--------------
120
FIGURA 10.1. As etapas necessárias para a produção de etanol a partir de diferentes matérias-primas
BIOMASSA AMILÁCEA
BIOMASSA SACARINA
Hidrólise enzimática
BIOMASSA CELULÓSICA
Hidrólise ácida ou enzimática
CALDO AÇUCARADO FERMENTESCÍVEL
Fermentação
Destilação
ETANOL
--------------
A tecnologia fermentativa nos oferece combustíveis eficientes, como o etanol ou o biogás. Existem
outras possibilidades, tais como a obtenção de biodiesel por transformação química de óleos vegetais
e, futuramente, a produção de hidrogênio a partir de água, utilizando a capacidade fotossintética das
microalgas.
Os biocombustíveis contribuem para reduzir alguns dos problemas ambientais que tanto nos afligem,
tais como a acumulação de CO2 e outros gases de efeito estufa (óxido nitroso e metano). Nos países
que os adotam, os biocombustíveis substituem a gasolina, parcial ou totalmente, modificando a
realidade do setor de transportes.
Curiosamente, os primeiros automóveis de Henry Ford, com motores de ignição por centelha,
funcionavam com etanol de milho, e os primeiros motores de Rudolf Diesel, de ignição por
compressão, o faziam com óleo de amendoim. Com o petróleo barato, passou-se a utilizar gasolina e
óleo diesel para os automotores, mas o aumento dos preços, ocorrido na década de 1970, mostrou a
conveniência de substituir os derivados do petróleo por etanol e biodiesel.
Atualmente, o etanol é o principal biocombustível líquido para transporte. A maior parte da
produção (90%) está concentrada no Brasil e nos Estados Unidos, como produto da fermentação da
cana-de-açúcar e do milho, respectivamente. Os outros países produtores são o Canadá, a China, a
União Europeia (França e Alemanha) e a Índia.
Embora um litro de etanol forneça bem menos energia que um litro de gasolina (66%), sua maior
octanagem melhora o desempenho das misturas etanol-gasolina. Até que ponto o etanol será capaz
de substituir a gasolina? A resposta dependerá da tecnologia disponível, do processo produtivo e do
preço do petróleo. Estima-se que, no Brasil, o bioetanol de cana-de-açúcar seria competitivo com o
barril de petróleo a US$ 30-35; nos Estados Unidos, onde o etanol se produz a partir de milho, isso
ocorreria com o barril de petróleo a US$ 55-80.
No entanto, a produção de etanol a partir de biomassa levanta alguns problemas. Como os cultivos
do milho e da cana demandam muita água, procura-se encontrar outras fontes menos exigentes:
pinhão-manso, sorgo sacarino, capim (Panicum virgatum) e outras gramíneas perenes (Miscanthus).
121
http://bteduc.com
Uma fonte de controvérsia é o desvio de matérias-primas alimentícias, como o milho ou a soja, para a
produção de biocombustíveis, porque redunda no aumento do preço dos alimentos e penaliza os
setores mais pobres da população. Também preocupa a expansão dos cultivos agroindustriais,
favorecendo o desmatamento e afetando a biodiversidade. A solução parece estar na obtenção de
etanol a partir de resíduos lignocelulósicos, uma tecnologia complexa, ainda em desenvolvimento
(Figura 10.1).
O ETANOL
A PRODUÇÃO POR VIA FERMENTATIVA
A produção de etanol pela via biotecnológica envolve a ação fermentativa de leveduras sobre um
substrato adequado: cana-de-açúcar, beterraba açucareira, sorgo sacarino, milho. No Brasil, a matériaprima é a cana-de-açúcar (Figura 10.2).
Após a colheita, a cana é transportada até a usina onde é triturada, separando o caldo do bagaço, que
é utilizado como combustível, gerando calor e eletricidade para o próprio estabelecimento. Reservase o caldo à produção de açúcar ou de etanol. Um subproduto da produção de açúcar, o melaço, é
reincorporado ao processo produtivo de sacarose ou misturado ao caldo de cana para a obtenção de
etanol.
Antes de dar início à fermentação, são acrescentados no caldo os nutrientes e antissépticos
necessários, ajustando-se também outros parâmetros, como a temperatura e o pH. O processo
fermentativo ocorre nas dornas (biorreatores) por obra das leveduras, naturais ou selecionadas. A
condução do procedimento, contínua ou descontínua, depende do estabelecimento assim como da
complexidade e automação dos equipamentos disponíveis. Concluída a fermentação, recuperam-se as
leveduras por centrifugação, com vistas a uma posterior reutilização e/ou à produção de ração animal.
Da destilação do vinho se obtém a flegma, um líquido com álcool em maior concentração, e um
resíduo denominado vinhaça ou vinhoto, que deve ser tratado antes de despejado no ambiente. A
retificação, isto é, a eliminação das impurezas da flegma, gera o álcool hidratado, que é convertido em
álcool anidro por desidratação.
A SUBSTITUIÇÃO DA GASOLINA – O CASO DO BRASIL
No Brasil, 63% da energia provém de fontes renováveis: grandes hidroelétricas (42%), madeira (10%),
cana-de-açúcar (9%), outras (2%). A contribuição da cana-de-açúcar está diretamente relacionada com
o uso do etanol como combustível.
Calcula-se que 60% da cana-de-açúcar plantada no Brasil destina-se à produção de etanol por
fermentação. Em outros países utilizam-se matérias-primas diferentes, tais como a beterraba
açucareira (União Europeia) ou o milho (Estados Unidos). A desvantagem das matérias-primas
amiláceas é que demandam um tratamento enzimático (sacarificação), antes da fermentação (Figura
10.1).
A crise do petróleo, na década de 1970, provocou um aumento significativo do preço, mostrando a
necessidade de substituir a gasolina por outras fontes de energia. Em 1975, o Brasil instituiu o
Programa Nacional do Álcool (Pró-Álcool), visando a produção de etanol como combustível alternativo
para os carros de passeio. Pouco tempo depois, na década de 1980, 5.000.000 de carros funcionavam
com etanol (94% de etanol, 6% de água), e outros 9.000.000 com uma mistura de álcool e gasolina
(78% de gasolina, 22% de álcool).
Em 1989, a queda do preço do petróleo e os problemas inerentes ao próprio Pró-Álcool (subsídios,
baixa produtividade) provocaram uma crise de desabastecimento, abalando seriamente o programa.
122
Reativado na década de 1990, desta vez obedecendo a critérios de produtividade, tanto na lavoura
como na indústria, o programa deixou de receber subsídios.
Hoje, mais de três milhões de carros são movidos com álcool hidratado, enquanto o álcool anidro
é aditivado à gasolina, em uma proporção que varia entre 20 e 24%, dependendo da relação
oferta/procura. A introdução, em 2003, da tecnologia flexfuel, que permite abastecer os carros tanto
com gasolina como com álcool hidratado, deixa ao consumidor a possibilidade de escolher o
combustível, em função de considerações econômicas e ambientais.
A produção de etanol no Brasil, estimada em 29,2 bilhões de litros, passa por uma fase de pouco
crescimento, devido às políticas energéticas. O setor sucroalcooleiro de hoje é um enorme complexo
-------------FIGURA 10.2. A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar
LAVOURA
Transporte
CANA-DE-AÇÚCAR
Trituração e extração
CALDO, GARAPA
OU MOSTO
BAGAÇO Combustível
LEVEDURAS
Reaproveitamento
Fermentação
MELAÇO
AÇÚCAR
CO2
VINHO
LEVEDURAS Ração animal
Destilação
FLEGMA
VINHAÇA Fertilizante
Retificação
ETANOL HIDRATADO
Desidratação
ETANOL ANIDRO
123
http://bteduc.com
industrial de mais de 400 indústrias, com participação de várias multinacionais em um mercado
consolidado através de ciclos de aquisições e fusões. As pequenas usinas foram suplantadas por outras,
tecnologicamente aprimoradas, que desenvolvem sistemas de produção integrados (biorrefinerias).
Lentamente, a mecanização da colheita elimina a necessidade das queimadas e modifica as
condições de trabalho nos canaviais. Além de etanol, as instalações industriais fabricam aglomerado,
ração animal, adubo, celulose etc. O aproveitamento do bagaço é fundamental, porque permite gerar
a energia necessária para o funcionamento das usinas e até exportá-la, aumentando a matriz
energética renovável do país.
A obtenção de variedades de cana-de-açúcar com diferentes períodos de desenvolvimento (rápido,
médio e tardio), assim como o plantio sequencial, diminuem as flutuações na oferta de matéria-prima.
O projeto Genoma-cana, uma parceria entre a Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo), várias universidades e o setor sucroalcooleiro, facilitará o melhoramento da planta (teor
de açúcar, resistência a pragas, resistência à seca). Encontra-se em andamento o melhoramento das
leveduras, procurando desenvolver microrganismos mais produtivos e tolerantes ao etanol, ou com
características (floculação) que facilitem sua recuperação uma vez concluída a fermentação.
O BIOGÁS
A BIODIGESTÃO ANAERÓBIA
A digestão microbiana da matéria orgânica, em condições aeróbias produz água (H 2O) e dióxido de
carbono (CO2), e em condições anaeróbias, metano (CH4), dióxido de carbono (CO2) e água (Figura
10.3). Nos ambientes confinados de pântanos e sepulcros, o metano liberado gera alguns fenômenos
assustadores de combustão espontânea (“luzes dos cemitérios”). Nas condições mais controladas de
um aterro sanitário ou de um biorreator (= biodigestor), o gás acumulado poderá ser utilizado como
combustível (biogás).
O processo fermentativo de biodigestão anaeróbia se desenvolve sobre resíduos rurais (esterco),
agroindustriais (vinhaça, efluentes das indústrias de laticínios e dos matadouros), domésticos ou
comunitários (lama de esgotos) e, também, sobre plantas (aguapé). Coloca-se a matéria-prima no
biodigestor, em condições anaeróbias e pH neutro (6,7-7,7), evitando a presença de substâncias
solventes ou de inseticidas, que prejudicariam o desenvolvimento do processo.
Dependendo da temperatura do biodigestor, haverá uma multiplicação de bactérias mesófilas
0
(35 C) que processarão a matéria-prima em 15-30 dias, ou termófilas (550C) que o farão em 12-14 dias.
A segunda opção libera mais biogás, mas requer maior consumo de energia e um monitoramento
cuidadoso, porque as bactérias termófilas não suportam bem as variações de temperatura.
A decomposição anaeróbia envolve a sucessão biológica de várias populações naturais de
microrganismos, de modo que as melhoras tecnológicas visam, exclusivamente, a engenharia do
processo. Este pode ser conduzido tanto de maneira descontínua como contínua, em biodigestores
especialmente construídos para permitir o abastecimento diário de matéria-prima e a retirada de
biogás. Existe um número grande de modelos de fermentadores, desde os muito simples (modelo
tailandês, chinês, indiano) até os automatizados, que processam um volume grande de matéria-prima.
Um dos resíduos da biodigestão é um material sólido fibroso que, uma vez compostado e prensado,
vende-se como “solo artificial”, para o cultivo de plantas ou para melhorar a qualidade do solo. O outro
é um efluente líquido, que se aproveita como adubo (Figura 10.4).
A UTILIZAÇÃO DO BIOGÁS
O biogás está formado por 50-65% de metano e 35-50% de dióxido de carbono, com traços de gás
sulfídrico (corrosivo), nitrogênio, oxigênio e hidrogênio; pode ser usado diretamente ou armazenado.
124
Entre as aplicações possíveis está o abastecimento do consumo doméstico (fogões, lampiões ou
aquecedores), a geração de energia elétrica e o acionamento de motores de veículos. Seu poder
calorífico é menor que o do gás natural, um combustível fóssil cuja composição inclui metano, etano,
propano e butano (Tabela 10.3).
A primeira fábrica de biogás começou a funcionar em 1859 em Bumbai (Índia). A iniciativa
alcançou bastante sucesso e, em 1980, a Índia contava com 150.000 biodigestores. Talvez seja esta
uma das razões pelas quais a digestão anaeróbia seja considerada um processo biotecnológico
apropriado para pequenas cidades e comunidades rurais. No entanto, a produção de biogás pode
alcançar outra dimensão, se for encarada como uma tecnologia moderna que visa a produção de calor
e de eletricidade (Figura 10.5).
A Dinamarca é o líder mundial na produção de biogás, estando a tecnologia bem desenvolvida em
outros países como os Estados Unidos, a Alemanha, a França, o Japão e a Suécia. Em 1995, quando
contabilizava mais de cinco milhões de pequenos biodigestores rurais, a China teve o empenho de
construir reatores tecnologicamente avançados para o tratamento de rejeitos urbanos e a geração
de eletricidade.
Na América Latina, algumas pequenas comunidades contam com geradores de biogás que as
abastecem com energia suficiente para cozer os alimentos ou alimentar um motor. Contudo, nos
últimos anos surgiram vários projetos ambiciosos de exploração do potencial existente nos aterros
sanitários urbanos (Olavarría, Argentina; Bandeirantes, Nova Iguaçu e Petrópolis, Brasil; Santiago,
Chile; Monterrey, México; Maldonado, Uruguai). O tratamento dos rejeitos agroindustriais,
especialmente da indústria açucareira e da suinocultura, também é uma fonte considerável de biogás.
Cuba conta com mais de 100 fábricas produtoras de biogás.
A produção de bioplásticos a partir do biogás gerado em estabelecimentos agrícolas representa
uma tecnologia recente, patenteada pela empresa norteamericana Newlight. A empresa sueca IKEA,
especializada em mobiliário doméstico, planeja substituir 40% do plástico utilizado pelo bioplástico
da Newlight.
-------------FIGURA 10.3. A biodigestão em condições aeróbias e anaeróbias.
RESÍDUOS ORGÂNICOS VEGETAIS E ANIMAIS
O2
MOLÉCULAS ORGÂNICAS SIMPLES
ACETATO
Aerobiose
H2O
Anaerobiose
CO2
H2 O
CH4
CO2
BIOGÁS
125
http://bteduc.com
FIGURA 10.4. As complexas etapas da produção de biogás dentro do biodigestor
MATÉRIA-PRIMA
MOLÉCULAS COMPLEXAS
Microrganismos fermentativos
MOLÉCULAS SIMPLES
Bactérias acidogênicas
BIODIGESTOR
ÁCIDOS E ÁLCOOIS
Bactérias acetogênicas
ACETATO
Bactérias metanogênicas
MATERIAL SÓLIDO FIBROSO
+ EFLUENTE LÍQUIDO
BIOGÁS
TABELA 10.3. O poder calorífico de vários combustíveis.
GÁS
Butano
Propano
Metano
PODER CALORÍFICO (Kcal/m3)
28.000
22.000
8.500
GÁS
Gás natural
Biogás
Gás de cidade
PODER CALORÍFICO (Kcal/m3)
7.600
5.500
4.000
FIGURA 10.5. As utilizações do biogás
BIOGÁS
PLANTAS PURIFICADORAS
E DE ARMAZENAMENTO
ENERGIA TÉRMICA
ENERGIA ELÉTRICA
COMBUSTÍVEL
TRANSPORTE AUTOMOTOR
126
O BIODIESEL
A TRANSESTERIFICAÇÃO
O biodiesel é um combustível composto por ésteres (etílicos ou metílicos) produzidos na reação
química de transesterificação entre óleos vegetais e álcool (etanol ou metanol), em presença de um
catalisador inorgânico ou enzimático (lípases) (Figura 10.6).
Um dos subprodutos da reação é o glicerol (5 a 10% do produto bruto), geralmente aproveitado
pelas indústrias de alimentos, de cosmética e de medicamentos. Diferentemente do bagaço de cana,
o glicerol gera uma substância tóxica (acroleína) quando é queimado, de modo que aumentar a
produção de biodiesel significa aumentar o leque de aplicações do glicerol.
O biodiesel fornece entre 88 e 95% da energia do diesel, mas pode ser misturado com o diesel
convencional, em proporção variando de 1% (B1) a 20% (B20), aumentando a qualidade do
combustível e diminuindo a emissão de partículas poluentes e de gases tóxicos na atmosfera.
-------------FIGURA 10.6. A reação de transesterificação
H2C – O – CO – R
HC – O – CO – R
CH2OH
+
3R’ – OH
H2C – O – CO – R
Triglicerídeos
HCOH
+
3R – O – CO – R’
CH2OH
Álcool
Glicerol
Ésteres
--------------
A PRODUÇÃO DE BIODIESEL
A produção de biodiesel está localizada principalmente na União Europeia (60%) e, em menor parte,
nos Estados Unidos, na China, na Indonésia e na Malásia. A matéria-prima é variada: soja nos Estados
Unidos, canola na União Europeia e no Canadá, soja e girassol na Argentina, dendê na Ásia. No Brasil,
tem-se experimentado soja, mamona, babaçu, dendê, girassol, milho, amendoim, pinhão-manso etc.
A implementação do Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB) estimula a
produção sustentável, enfatizando a inclusão social e o desenvolvimento regional. Desde 2010,
adiciona-se no Brasil 5% de biodiesel ao diesel convencional, estimando-se que a proporção chegue a
20% até 2020.
Restam alguns pontos a considerar, especialmente em relação à utilização de matérias-primas
como a mamona, com o intuito de estimular o pequeno agricultor. Em princípio, o biodiesel é carbononeutro. No entanto, diferente do etanol de cana, o sistema produtivo seria carbono-negativo, quando
se leva em conta a energia necessária para adubação e irrigação da terra, a movimentação da
maquinaria agrícola, o armazenamento e transporte da matéria-prima e dos produtos etc.
127
http://bteduc.com
Do ponto de vista energético, os sistemas produtivos tradicionais mais eficientes seriam os associados
aos complexos agroindustriais (soja, milho, girassol), embora apresentem o grave defeito de desviar
para a produção de energia as matérias-primas de alimentos e rações.
O PANORAMA ATUAL
A primeira geração de biocombustíveis abrange o etanol (açúcar de cana-de-açúcar, sorgo sacarino ou
beterraba, amido de milho) e o biodiesel (óleos vegetais). A segunda geração de bioetanol utilizaria
biomassa lignocelulósica proveniente dos resíduos agroindustriais, tais como bagaço e folhas de cana,
palha e sabugo de milho, serraduras e aparas de madeira etc.
A maior dificuldade reside na própria estrutura da matéria-prima lignocelulósica. A celulose
(polímero de hexoses) e a hemicelulose (polímero de hexoses e de pentoses) se encontram
circundadas por lignina, uma substância de suporte das plantas, sendo necessário um pré-tratamento
que as separe, possibilitando a hidrólise enzimática e a liberação de açúcares fermentescíveis (hexoses
e pentoses).
Equipamentos com o design apropriado e enzimas celulolíticas (celulases e hemicelulases) para uso
indústrial já estão a caminho. Algumas indústrias funcionam experimentalmente na Suécia, na
Espanha, na Dinamarca, no Canadá e nos Estados Unidos. O Brasil conta, desde 2013, com uma
instalação piloto em Alagoas (GranBio).
BIORREFINARIAS E NOVAS BIOINDÚSTRIAS
O milho dá origem a numerosos produtos: glicose, ácido cítrico, bioplástico, biocorantes, bioetanol,
xantano, lisina, vitaminas etc. Por analogia com as refinarias de petróleo, uma biorrefinaria é um
complexo industrial com instalações para o processamento biotecnológico, químico, físico e térmico
da matéria-prima renovável, que será transformada em numerosos intermediários químicos e
bioquímicos, alimentando um conjunto de linhas de produção muito diversificado.
Localizadas perto das fontes de matéria-prima, e visando a autossustentabilidade energética, o
objetivo final das biorrefinarias é gerar numerosos produtos intermediários e funcionar sem
desperdício algum.
Distante do consumidor, a Biotecnologia Industrial encontra poucas resistências. O
desenvolvimento da biologia molecular e a chegada da biologia sintética abrem novas perspectivas,
que vão desde a produção de biocombustíveis (volume alto, baixo valor agregado) para o transporte
até a obtenção de metabólitos intermediários (volume baixo, alto valor agregado) para as indústrias
de cosmética e de alimentação.
Dentre as numerosas empresas existentes, que utilizam a biologia sintética para novas aplicações,
Amyris do Brasil e Solazyme Bunge mantêm instalações no Brasil, perto do setor sucroalcooleiro ao
qual estão ligadas. Os pareceres da CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) sobre as
construções microbianas respectivas podem ser consultados em www.ctnbio.gov.br.
O CASO AMYRIS
A artemisina (quinghaosu) é um medicamento antimalárico, obtido a partir de um extrato da planta
Artemisia annua. Sua descoberta, em plena Revolução Cultural, valeu o Prêmio Nobel de Medicina de
2015 à pesquisadora chinesa Tu YouYou.
Em 2000, a equipe de J. Keasling em Berkeley (Califórnia, Estados Unidos) obteve, via engenharia
genética, uma levedura produtora de artemisina. Em 2003, Keasling fundou a empresa Amyris
128
Biotechnology e, com o apoio da Fundação Bill e Melinda Gates e de Sanofi-Aventis, conseguiu
aumentar significativamente (100.000 X) a produção de artemisina, diminuindo o custo do tratamento
a menos de 1 dólar (Figura 10.7 A).
Bloqueando uma via metabólica celular da levedura, Amyris obteve uma linhagem que, em vez de
artemisina, produz farneseno (Biofene®, C15H24). Além de ser o precursor químico de numerosos
produtos, a hidrogenação o transforma em farnesano ou bioquerosene. Um trunfo, considerando que
os custos tornam inviável a produção de farneseno pelas vias convencionais.
O caminho metabólico da artemisina consta de nove genes, cada um com aproximadamente 1.500
bases. Modificações nas vias metabólicas abrem o caminho para a produção de combustíveis, ou de
qualquer outra substância (Figura 10.7 B). Procurando as combinações mais interessantes e eficientes,
infinitas variantes génicas da levedura foram sintetizadas e testadas, utilizando microarrays de DNA e
sistemas robotizados de rastreio de alto rendimento (HTS).
-------------FIGURA 10.7. O caso Amyris
A. Do quinghaosu à artemisina.
Artemisia annua
QINGHAOSU
Escherichia coli
ARTEMISINA
Saccharomyces cerevisiae
B.
Produtos gerados na plataforma tecnológica baseada na engenharia metabólica da levedura (via dos
isoprenoides ou terpenos)
MATÉRIA-PRIMA (Açúcar)
ARTEMISINA (antimalárico)
®
BIOFENO
Farneseno (C15)
Farnesano
®
NEOSSANCE
Esqualeno e
Hemiesqualeno
COSMÉTICOS
BIODIESEL E OUTROS PRODUTOS QUÍMICOS
Isopreno (C5)
COMBUSTÍVEL DE AVIAÇÃO
Isoprenoides (C10)
POLÍMEROS
129
http://bteduc.com
A empresa conta hoje com leveduras capazes de transformar a cana de açúcar (Amyris do Brasil) ou o
sorgo sacarino (Amyris Fuels, Estados Unidos) em biodiesel ou combustível de avião, este último
testado em parceria com a empresa TOTAL. Atualmente, a plataforma tecnológica do farneseno
renovável pode sintetizar mais de 1.000 produtos, entre combustíveis, cosméticos, emolientes,
fragrâncias, polímeros, lubrificantes e biofármacos.
De particular interesse são o esqualeno e hemiesqualeno, derivados do farneseno, que compõem
a linha Biossance®, um emoliente com numerosas aplicações em cosmética, inclusive na remoção de
maquillage.
O CASO SOLAZYME (TerraVia)
Assim como as plantas, as microalgas sintetizam e acumulam lipídios. Existem dois métodos clássicos
para o cultivo de microalgas autotróficas, ambos com algumas vantagens e desvantagens. Os grandes
tanques ao ar livre aproveitam terras não cultiváveis, água salobra e luz solar, mas contaminam com
facilidade. Os fotobiorreatores fechados contaminam muito menos, mas são mais caros, porque
demandam iluminação artificial e certa complexidade tecnológica.
A empresa Solazyme modificou geneticamente a alga heterotrófica Prototheca moriformis, de
modo a produzir grande quantidade de óleos vegetais (triglicerídeos) e bioprodutos a partir de uma
matéria-prima que pode ser sacarose de cana, dextrose de milho e, inclusive, materiais de origem
celulósicos (Figura 10.8).
Em relação ao biodiesel, o uso de algas para a produção de hidrocarbonetos e triacilglicerídeos
permitiria dedicar terras férteis e água doce à produção de alimentos. Por outro lado, a adição de
bioquerosene ao querosene diminuiria os custos do combustível de avião. A plataforma tecnológica
permite a produção de biodiesel, surfactantes, lubricantes, polímeros, óleos comestíveis, suplementos
nutricionais etc.
Recentemente, a empresa Solazyme mudou seu nome para TerraVia anunciando que no futuro sua
plataforma estaria dedicada à produção de produtos alimentícios (proteína, lipídios, óleos de cozinha)
e cosméticos. Um dos produtos de sucesso é o Algenist® um emoliente para a pele, de interesse
cosmético, que pode ser encontrado em grandes redes de distribuição dos Estados Unidos, da Europa
e do Japão (Sephora).
-------------FIGURA 10.8. O caso Solazyme
Luz solar + CO2
BIOCOMBUSTÍVEIS (Biodiesel)
Biomassa
QUÍMICA VERDE (Surfactantes, lubricantes e polímeros)
Algas
Triglicerídeos
ALIMENTOS E RAÇÕES
(Suplementos nutricionais, óleos comestíveis)
COSMÉTICA (emolientes, Algenist® para o cuidado da pele)
130
C A P Í T U L O 11
BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE
O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
Qual o impacto das atividades humanas sobre o meio ambiente? Que legado deixaremos para as
próximas gerações? Da resposta emerge o conceito de desenvolvimento sustentável, definido como
“a capacidade de atender às necessidades do presente, sem comprometer a capacidade das gerações
futuras em atender suas próprias necessidades” (Informe Brütland, 1987).
O desenvolvimento sustentável depende das ações realizadas nas áreas econômica, social e
ambiental. Esse é o consenso alcançado ao longo de mais de duas décadas, de várias conferências
internacionais (Rio de Janeiro, 1992 e Agenda 21; Kyoto, 1997; Johanesburgo, 2002; Copenhague,
2009; Cancún, 2010; Durban, 2011; Rio de Janeiro, 2012) e dos acordos alcançados, na Agenda 21 e
nas Conferências das Partes sobre Biodiversidade e Clima. Os relatórios publicados, em 2007, pelo
Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas (IPCC) apontaram a responsabilidade do
homem no futuro do planeta, indicando que não podem ser proteladas as ações concretas de proteção
do meio ambiente.
Qual a contribuição das biotecnologias para o desenvolvimento sustentável? Em relação à
economia, diminuir os custos não só da matéria-prima como da produção industrial, com processos e
produtos novos e/ou de maior valor agregado. Na área social, possibilitar a conservação ou a criação
de empregos através do desenvolvimento de novas plataformas tecnológicas. E, na área ambiental,
cumprir um importante papel na prevenção, no monitoramento e na remediação da contaminação.
Pensar globalmente, agir localmente. Os problemas ambientais são muito pontuais, cada um deles
demanda um tratamento particular, e o procedimento deve ter uma relação custo/benefício
interessante. Nem sempre existe um produto a patentear; havendo um serviço a prestar, a tecnologia
fica a cargo de organizações governamentais ou de firmas que agem localmente. A fim de responder
às diversas demandas do mercado, algumas contam com uma plataforma de produção de
microrganismos, isolados da natureza, em escala industrial.
AS TECNOLOGIAS LIMPAS
Pouco a pouco, a sociedade está aceitando que é preferível deixar de contaminar, a desenvolver
métodos para limpar o ambiente. No contexto das chamadas "biotecnologias brancas", várias
tecnologias limpas podem substituir outras mais poluentes, ajudando também a reduzir o volume de
resíduos domésticos, agrícolas e industriais.
http://bteduc.com
A SUBSTITUIÇÃO DE PROCESSOS INDUSTRIAIS
A TECNOLOGIA ENZIMÁTICA
Diferentemente dos catalisadores não biológicos, as enzimas são específicas, não tóxicas e
biodegradáveis. Essas propriedades permitem, à tecnologia enzimática, a substituição de alguns
processos e produtos industriais por outros menos agressivos ao meio ambiente em setores
reconhecidamente poluentes, tais como as indústrias de alimentos, rações, detergentes, têxteis, papel
e celulose, couros etc.
Nos curtumes, o uso de enzimas reduz em 40% o consumo de derivados do enxofre, ao tempo que
produz couro de melhor qualidade. A introdução de até oito enzimas nos detergentes evita a fervura
das roupas, diminuindo o consumo de energia e facilitando a retirada das manchas.
Os plásticos representam uma fração significativa (20% v/v) do lixo dos países industrializados,
sendo a maior parte proveniente das embalagens convencionais da indústria de alimentos. Além de
permanecerem por longo tempo na natureza, sua fabricação envolve uma matéria-prima não
renovável (petróleo) e um processo de síntese muito poluente, que gasta uma quantidade grande de
energia.
Em curto ou médio prazo, esses plásticos convencionais poderão ser substituídos por polímeros de
origem bacteriana ou vegetal, compostáveis em poucos meses. Uma das vantagens das embalagens
bioplásticas de alimentos é que degradam junto com os restos de comida, dispensando as etapas de
triagem e limpeza.
Na maioria dos casos, as linhagens utilizadas na tecnologia enzimática e na produção de bioplásticos
são OGMs (Organismos Geneticamente Modificados) que não geram maior oposição na sociedade,
talvez devido ao seu uso para a produção de insumos, dentro de fermentadores industriais, em
sistemas de contenção.
Como agentes biológicos, as enzimas tornam os processos produtivos mais limpos e seguros,
diminuindo o consumo de energia e a quantidade de resíduos. O desenvolvimento de enzimas ativas
a altas temperaturas, em solventes não aquosos e em meios sólidos, poderá futuramente expandir
suas aplicações.
A INDÚSTRIA DE PAPEL E CELULOSE
A indústria de papel e celulose é uma atividade em expansão que gera, no Brasil, 128.000 empregos
diretos (77.000 na indústria e 51.000 nas florestas) e 640.000 indiretos, em 540 municípios.
Atualmente, as principais empresas são Klabin, Suzano e Fibria, uma fusão entre a Votorantim e a
Aracruz.
A atividade industrial exige a expansão das florestas, porque a matéria-prima para a produção de
papel e celulose é a madeira. Estima-se que, em 2017, o Brasil contará com 2,5 milhões de hectares de
florestas plantadas de eucaliptos (60%) e pinhos (30%).
A maior dificuldade reside na própria estrutura da matéria-prima lignocelulósica. Na madeira, a
celulose (polímero de hexoses) e a hemicelulose (polímero de hexoses e de pentoses) estão
circundadas por lignina, uma substância de suporte das plantas, que deve ser descartada, mediante
um tratamento químico, em meio alcalino e a altas temperaturas. A eliminação da maior parte da
lignina (90%) libera as fibras de celulose e hemicelulose, possibilitando a hidrólise enzimática da
madeira e a formação de açúcares fermentescíveis (hexoses e pentoses).
No tratamento químico da lignina, resta uma pequena quantidade (10%) que confere uma cor
característica à pasta Kraft, base da fabricação de cartão e papel pardo. O branqueamento do papel
requer outro tratamento específico, com oxigênio e cloro, no qual se formam derivados clorados
132
tóxicos. Um procedimento alternativo é o biopulping, em que a enzima xilanase degrada o xilano da
hemicelulose, facilitando a eliminação da lignina que lhe está associada (Figura 11.1).
A inserção da biotecnologia moderna ocorre através de duas linhas de ação: o desenvolvimento da
tecnologia enzimática e o melhoramento vegetal. O sequenciamento do genoma do fungo
Phanerochaete chrysosporium ("podridão branca") revelou a existência de mais de 240 genes
codificadores de enzimas extracelulares, envolvidas na degradação de carboidratos, que poderiam ser
utilizadas na degradação da madeira e no branqueamento da polpa de papel e de têxteis. O
sequenciamento do genoma do eucalipto trouxe novas perspectivas para o melhoramento da
qualidade da madeira, especialmente visando aumentar a proporção celulose/lignina.
Em 2015, a CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) aprovou a liberação no meio
ambiente, para uso comercial, do eucalipto geneticamente modificado da FuturaGene, uma empresa
controlada pela Suzano Papel e Celulose. A produtividade do eucalipto transgênico de crescimento
rápido é 20% maior que a do eucalipto convencional. A invasão da empresa por mulheres do MST
(Movimento Sem Terra) e a destruição dos laboratórios e das mudas que demandaram dez anos de
trabalho mostram as dificuldades em separar tecnologia de ideologia, em alguns setores da sociedade.
Um fenômeno análogo ocorreu na Europa, em 2010, depois da aprovação pela Comissão Europeia
da batata Amflora (Basf Plant Science), geneticamente modificada, para uso na fabricação do papel.
Essa batata produz amido de alta qualidade com 99% de amilopectina, uma substância que confere
rigidez à massa e melhora o acabamento. Destinado exclusivamente ao uso industrial, o tubérculo
estaria fisicamente separado da batata destinada ao consumo humano ou animal. Porém, em função
da oposição encontrada, em 2012, BASF Plant Science decidiu suspender a comercialização da batata
Amflora. Em 2013, um tribunal anulou a decisão de aprovação da Comissão Europeia.
-------------FIGURA 11.1. A indústria de papel e de celulose.
O branqueamento da pasta Kraft admite tratamentos químicos (cloro) e biológicos (xilanase); estes últimos diminuem a carga
poluidora do efluente
MADEIRA
Lignina + celulose + hemicelulose
Extração alcalina a alta temperatura
Lignina (90%)
PASTA KRAFT
Lignina (10%) + celulose + hemicelulose
Branqueamento com cloro
Branqueamento com xilanase
Eliminação da lignina
Derivados clorados da lignina
EFLUENTE
POLPA BRANCA
EFLUENTE
133
http://bteduc.com
A SUBSTITUIÇÃO DE INSUMOS AGRÍCOLAS
Um segundo conjunto de tecnologias limpas visa a substituição parcial de alguns insumos utilizados na
agricultura, tais como os fertilizantes e praguicidas.
A intensa aplicação de fertilizantes agrícolas, derivados do petróleo, tem consequências negativas
no ambiente, porque uma parte do nitrogênio (N) e do fósforo (P) não é absorvida pelas plantas e
acaba sendo arrastada pelas chuvas até os rios e as reservas de água. O excesso de nutrientes estimula
a proliferação de algas, consumindo o oxigênio dos cursos de água e produzindo toxinas que afetam
os peixes e o gado.
MICRORGANISMOS VS FERTILIZANTES QUÍMICOS
O nitrogênio é um nutriente indispensável para os cultivos vegetais porque faz parte da composição
das proteínas e dos ácidos nucleicos. Encontra-se na atmosfera como N2 e no solo como nitrato,
resultante da decomposição da matéria orgânica, ou proveniente dos fertilizantes agrícolas. Alguns
microrganismos livres (Azotobacter, Azospirillum) e outros simbiontes (Rhizobium ou Bradirhizobium),
que vivem nos nódulos das raízes das leguminosas (soja, feijão), podem fixar diretamente o nitrogênio
atmosférico em uma forma utilizável pelas plantas.
Aplica-se o termo biofertilizante aos produtos que contêm agentes biológicos vivos, capazes de
favorecer o desenvolvimento vegetal. Um destes agentes é o Rhizobium, uma bactéria simbionte das
raízes de leguminosas que fixa o nitrogênio atmosférico, reduzindo a necessidade de aplicar
fertilizantes nitrogenados nas lavouras. Para proceder à inoculação, mistura-se o produto com as
sementes umedecidas, antes do plantio, em tambores ou betoneiras.
A produção industrial de rizóbios selecionados para aplicação antes do plantio permite substituir
produtos químicos, derivados do petróleo, por agentes biológicos, menos prejudiciais para o meio
ambiente. Na América Latina, a produção de biofertilizantes envolve numerosas empresas, pequenas
e médias, que contam com um sólido suporte tecnológico originado em universidades e instituições
públicas de pesquisa agronômica.
Vários países produzem inoculantes agrícolas, entre eles: Argentina, Brasil, Chile, Colômbia, Cuba,
México, Peru e Uruguai. No Brasil, várias empresas nacionais e estrangeiras produzem inoculantes para
leguminosas; a maioria está localizada no Paraná e Rio Grande do Sul.
As linhagens bacterianas são estirpes selecionadas por sua eficiência, em uma ampla gama de
cultivares, e amplamente adaptadas às condições locais. Até o presente, a indústria baseia a produção
dos microrganismos na tecnologia clássica, mas com o mapeamento do genoma de microrganismos
como o Rhizobium etli (México) e o Gluconacetobacter diazotrophicus (Brasil), a biotecnologia
moderna começa a se inserir neste campo. Frente às mudanças climáticas e a necessidade de
aumentar a produtividade agrícola, os novos métodos de triagem de estirpes são uma ferramenta de
incalculável valor para o estudo da relação simbionte entre o microrganismo e a planta hospedeira.
As pesquisas sobre a fixação de nitrogênio nas gramíneas forrageiras, iniciadas por Johanna
Döbereiner (Embrapa), na segunda metade do século XX, permitem dispensar parcialmente a aplicação
de nutrientes químicos nos cereais e na cana-de-açúcar, com a correspondente economia de recursos.
O fósforo se origina a partir das rochas do solo e da decomposição dos seres vivos. Nos solos ácidos,
característicos das regiões tropicais, a maior parte dos fosfatos (95-99%) forma compostos minerais
ou orgânicos insolúveis, que não são acessíveis diretamente às plantas. Por isso, o fósforo se torna um
nutriente limitante para o crescimento das plantas.
Os micorrizos são associações simbióticas entre raízes vegetais e fungos, que absorvem os
nutrientes minerais e a água do solo, transferindo-os para a planta hospedeira. Muitas espécies de
134
fungos micorrízicos são comestíveis, e vários gêneros são comercializados a nível mundial: Tuber,
Tricholoma, Boletu, Cantharellus, Morchella, Lactarius e Suillus.
A inoculação dos solos ou micorrização é uma tecnologia agrícola, associada ao reflorestamento de
pinhos e eucaliptos, que elimina ou diminui a necessidade de se acrescentar fósforo.
Além dos fertilizantes agrícolas, outra das causas de liberação excessiva de fósforo no ambiente é
a criação intensiva de animais. Os porcos e as aves não metabolizam o fitato, um derivado do fósforo
presente nas rações. Complementando-as com fitase, uma enzima produzida industrialmente por um
microrganismo geneticamente modificado, o fósforo excretado diminui em mais de 30%, reduzindo a
contaminação dos lençóis de água.
MANEJO INTEGRADO DE PRAGAS VS AGROTÓXICOS
A utilização de variedades selecionadas e a rotação dos cultivos são práticas agrícolas que reduzem,
substancialmente, a necessidade de aplicar pesticidas sintéticos. Um passo além é dado pelo controle
biológico, que preconiza a substituição dos praguicidas químicos por alternativas biológicas, tais como
bactérias, fungos e vírus entomopatogênicos. Observe-se que, em seu clássico livro A primavera
silenciosa (1972), a pesquisadora Rachel Carson já alertava para os danos causados pelo uso do DDT,
recomendando a procura de soluções de cunho biológico para o controle das populações de insetos.
Anos mais tarde, contamos com numerosos exemplos em que os pesticidas são substituídos por
agentes biológicos específicos (Tabela 11.1). Um deles é a aplicação, nas lavouras de soja, de partículas
de baculovírus, um organismo que, normalmente, infecta e mata as lagartas de Anticarsia gemmatalis,
parasitas das plantas. Gemstar, um produto que contém o baculovírus Ihara é usado no combate à
Helicoverpa armigera, uma praga que afeta os cultivos de soja. A pulverização de esporos do fungo
Metarhizium anisopliae, é uma arma na luta contra a cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar ou a
broca-dos-citros. A broca-da-cana é controlada pela ação sinérgica de duas microvespas (Cotesia e
Trichogramma) que agem em diferentes momentos do ciclo de vida da praga.
Contudo, o exemplo mais conhecido dessa tecnologia verde envolve a bactéria do solo Bacillus
thuringiensis ou Bt. Citada como promissora por R. Carson, essa bactéria é utilizada como pesticida
agrícola há mais de cinquenta anos, sem que suas toxinas tenham causado danos às pessoas, à vida
silvestre ou à maioria dos insetos benéficos.
-------------TABELA 11.1. Alguns exemplos de utilização de agentes biológicos como pesticidas
AGENTE BIOLÓGICO
PRAGA COMBATIDA
Fungo Metarhizium anisopliae
Cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar (Mahanarva posticata), cigarrinha-da-raiz-dacana-de-açúcar (Mahanarva fimbriolata), cigarrinha-das-pastagens (Deois flavopicta).
Fungo Beauveria bassiana
Diversas, florestais.
Bactéria Bacillus thuringiensis
var kurstaki
Lagartas desfolhadoras de grandes culturas e reflorestamentos.
Bactéria Bacillus thuringiensis
var israelensis
Larvas do mosquito da dengue (Aedes aegypti, transmissor da dengue e da febre
amarela) e dos borrachudos (Simulium spp.).
Bactéria Bacillus sphaericus
Larvas do mosquito prego (Anopheles spp., transmissor da malária) e do mosquito
urbano ou pernilongo (Culex spp., transmissor da encefalite e da filaríase).
Vírus Baculovírus anticarsia
Lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis).
Vírus Baculovírus spodoptera
Lagarta-do-cartucho-do-milho (Spodoptera frugiperda).
Vespa Cotesia flavipes
Broca-da-cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis).
135
http://bteduc.com
No Brasil, existem atualmente numerosos produtos a base de Bacillus thuringiensis para o combate às
pragas que afetam a agricultura, comercializados com diferentes nomes (Bac-control, Bactur, Dipel,
Ecotech, Thuricide etc.) por várias empresas nacionais e estrangeiras (Vectorcontrol, Milenia,
Sumitomo, Bayer, Iharabras etc.).
Com o desenvolvimento da engenharia genética, os genes correspondentes foram transferidos a
várias plantas (milho, algodão etc.) que agora produzem diretamente a toxina inseticida. Baseado no
conhecimento da ecologia dos agroecossistemas, o controle biológico permite o Manejo Integrado de
Pragas (MIP). No Brasil, deve-se destacar o trabalho da Embrapa e de várias universidades visando a
preservação das plantações e a salvaguarda da produção de alimentos.
A formação de nuvens de gafanhotos, uma das pragas mais temidas da humanidade, é atualmente
monitorada e companhada por via satélite. A aplicação do feromônio PAN (fenilacetonitrilo) induz a
dispersão dos insetos e sua volta a um comportamento solitário. No combate aos gafanhotos também
são utilizados reguladores de crescimento e, como biopesticida, o fungo Metarrizhium anisopliae
varacridum.
O controle biológico envolve, além do uso de feromônios, armadilhas e atrativos alimentares.
Alguns procedimentos são econômicos e muito engenhosos, como o desenvolvido em Cuba para
combater o tetuán del camote, um gorgulho (Cylas formicarius) que ataca a batata-doce. Pendura-se
na plantação uma lata com uma pequena quantidade de feromônio, pulverizando em redor esporos
do fungo Beauveria bassian. Atraídos pelo feromônio, os machos se aproximam da lata e são
contaminados mortalmente pelo fungo, que é inócuo para os seres humanos, os animais e as plantas.
Para Cuba, a experiência de várias décadas de trabalho com controle biológico resultou crucial
quando, devido ao embargo propiciado por Estados Unidos, o país teve que substituir o uso de
agrotóxicos nas lavouras. Atualmente, o programa cubano de controle biológico de pragas envolve
laboratórios regionais, estações de defesa vegetal, postos equipados com laboratórios de diagnósticos
e mais de 200 centros de reprodução de entomófagos e entomopatógenos.
BIOINSETICIDAS VS. INSETICIDAS QUÍMICOS
Em 2016, o Brasil vive uma situação sanitária dramática, devido à proliferação do mosquito Aedes
aegypti, cuja fêmea é transmissora de várias doenças de origem viral: dengue, chikungunya, zika. Em
fins do século XIX e início do século XX, o Aedes causou epidemias terríveis de febre amarela, sendo
erradicado das zonas urbanas graças à ação pioneira de Oswaldo Cruz. Por falta de saneamento básico
e de medidas de combate eficientes, hoje, o mosquito está novamente disseminado no Brasil e no
restante das Américas.
A primeira medida para diminuir o número de focos do mosquito é a eliminação das águas paradas,
onde ele deposita os ovos e as larvas proliferam. Se isso não for feito, deverá se apelar para os
inseticidas químicos, como o Pyriproxyfen, um produto para uso em campanhas de saúde pública.
Inseticidas químicos podem ser substituídos por bioinseticidas. Desenvolvido a partir de estudos da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, a empresa Bthek Biotecnologia comercializa um
bioinseticida que tem como ingrediente ativo a bactéria Bacillus thuringiensis israelensis e permite o
controle das larvas do mosquito (Aedes aegypti) e do borrachudo (Simulium spp.).
Outra das armas para evitar a transmissão de doenças por Aedes aegypti contempla a infecção da
população natural do mosquito pela bactéria Wolbacchia pipientes, um parasita intracelular frequente
em várias espécies de insetos, sem risco algum para os vertebrados.
Os mosquitos infetados com Wolbacchia não transmitem dengue e passam a bactéria a sua
descendência. Como o acasalamento de uma fêmea não infetada com um macho infetado é estéril,
basta liberar mosquitos infetados com Wolbacchia para que a infecção com Wolbacchia se espalhe,
diminuindo o número dos transmissores de dengue.
136
FIGURA 11.2. Controle biológico do Aedes aegypti
B. Ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti
Aedes aegypti (fêmea)
Pupa
Ovos (100-200)
4 a 5 dias
2 a 3 dias
Larva
Duração total do ciclo: 10 a 14 dias
E. Controle por Wolbacchia
Ovos infetados
Cruzamentos possíveis
Linhagem infetada com Wolbacchia
F. Controle por irradiação
Criação de mosquitos
Pupas
Irradiação
Seleção
adultos estéreis
G. Controle por engenharia genética
Criação de mosquitos transgênicos
Larvas
transgênicas
Mosquitos
transgênicos
Mosquitos
da natureza
Sem tetraciclina,
as larvas morrem
Seleção
(com tetraciclina)
Acasalamento
137
http://bteduc.com
Os primeiros experimentos, em algumas cidades no nordeste da Austrália, no Vietnã e na Indonésia,
foram bem-sucedidos. A Fundação Oswaldo Cruz iniciou os primeiros testes em alguns bairros do Rio
de Janeiro.
Uma estratégia de controle biológico tradicional consiste na liberação, no ambiente, de mosquitos
machos esterilizados por radiação. Embora o comportamento de cópula dos machos estéreis e dos
férteis seja o mesmo, o acasalamento das fêmeas com os machos estéreis não deixa descendência.
Recentemente aplicada na ilha de Fernando de Noronha (PE), esta metodologia levou à redução do
tamanho da população e do número de casos de dengue.
Mais elaborada, e na linha da biotecnologia moderna, é a construção de uma linhagem transgênica
de mosquito que depende de tetraciclina para seu desenvolvimento, uma condição que só existe no
laboratório. Liberados no ambiente, os machos transgênicos copulam com as fêmeas normais, gerando
larvas que morrem por falta de tetraciclina.
Em 2013, a CTNBio aprovou a liberação comercial da linhagem OX513A de Aedes aegypti. Os testes
realizados oportunamente em bairros de Juazeiro (PE) e de Piracicaba (SP) reduziram
significativamente a população de mosquitos. Participam no empreendimento do chamado “mosquito
do bem” a USP (Universidade de São Paulo) e as empresas Oxitec (Reinio Unido) e Moscamed (Brasil).
Como em ocasiões anteriores, alguns setores se posicionaram contra o mosquito transgênico,
invocando o princípio de precaução.
Das mais simples às mais sofisticadas, não faltam armas para lutar contra o Aedes aegypti; todas
podem contribuir para melhorar o saneamento básico e a saúde da população (Figura 11.2).
A REDUÇÃO DOS RESÍDUOS
A degradação do lixo (resíduos sólidos) e o tratamento de esgoto (resíduos líquidos) são dois exemplos
tradicionais de prestação de serviços da biotecnologia tradicional nem sempre valorizados, apesar do
imenso volume de matéria que transformam e de sua relevância para o meio ambiente.
A DEGRADAÇÃO DO LIXO
Em condições adequadas, todos os compostos naturais podem ser biodegradados. As populações
microbianas do ambiente degradam as substâncias orgânicas através de numerosas reações, sem que
sejam necessários os cuidados assépticos ou a utilização de culturas puras. Em condições aeróbias, os
produtos finais da mineralização da matéria orgânica são dióxido de carbono (CO2) e água; em
condições anaeróbias, forma-se biogás.
Na compostagem, uma etapa intermediária da mineralização, os próprios microrganismos do lixo
degradam a matéria orgânica, previamente fragmentada e misturada (Figura 11.3). No início da
biodigestão, a liberação de energia provoca um aumento de temperatura que elimina a maioria dos
microrganismos indesejáveis (sanitização). À medida que a atividade microbiana decresce, o sistema
se estabiliza e amadurece, até perder todo o seu potencial de biodegradação.
O processo pode ser conduzido em sistemas simples (pilhas ao ar livre), ou complexos (silos,
biorreatores), sendo necessário, em ambos os casos, remover o material periodicamente, de maneira
manual ou mecânica, para assegurar a aeração. A otimização do processo depende do controle de
alguns parâmetros, tais como a relação carbono/nitrogênio, o oxigênio, a umidade e a temperatura.
O tratamento dos resíduos sólidos urbanos (RSU) em usinas de compostagem é um procedimento
alternativo à incineração e ao depósito em lixões e aterros sanitários. Nesses estabelecimentos, a
separação prévia dos componentes permite a reciclagem de alguns materiais (metais, vidro etc.).
138
A biodegradação aeróbia dos restos orgânicos os transforma em um "composto", utilizado no
melhoramento de solos, em atividades de reflorestamento, para colmatar terrenos e combater a
erosão. A decomposição in natura do lixo, nos aterros sanitários, cria uma zona de anaerobiose onde
se produz biogás, que é liberado na atmosfera, contribuindo para o efeito estufa e as alterações
climáticas.
-------------FIGURA 11.3. A compostagem
LIXO ORGÂNICO
AR
ÁGUA
FONTE DE NITROGÊNIO
Fragmentação e mistura das partículas
Aumento da temperatura (sanitização)
BIODIGESTÃO AERÓBIA
Diminuição e estabilização da temperatura
Maturação
CALOR
CO2
ÁGUA
OUTRAS SUBSTÂNCIAS
COMPOSTO
O TRATAMENTO DAS ÁGUAS RESIDUAIS
O esgoto arrasta excrementos (fezes e urina), águas de uso doméstico (banho, lavagem de roupas etc.)
e, eventualmente, alguns dejetos de origem industrial. Liberadas diretamente nos cursos de água, as
águas servidas causam a desestabilização das populações microbianas, que se multiplicam
rapidamente, consumindo o oxigênio dissolvido e ocasionando a morte de peixes e crustáceos.
Várias populações naturais participam na biodegradação das águas do esgoto. Os microrganismos
aeróbios (bactérias e protozoários ciliados) mineralizam parte da matéria orgânica do efluente. As
bactérias anaeróbicas procedem à biodigestão dos lodos, permitindo a obtenção de biogás e a
remoção de alguns nutrientes (N e P principalmente), que poderiam criar desequilíbrios ecológicos.
O tratamento das águas residuais envolve métodos físicos, químicos e biológicos (Figura 11.4),
aplicados em pelo menos três etapas:
o Tratamento primário.
O esgoto passa por um processo de filtração, que remove objetos grandes, lixo e areia. No tanque
de sedimentação, a gordura sobrenadante é separada do lodo sedimentado, que pode ser
transferido a um biodigestor.
o Tratamento secundário.
-
O líquido efluente do tanque de sedimentação pode ser tratado de vários modos:
139
http://bteduc.com
-
Em lagoas de baixa profundidade.
-
Em filtros de gotejamento (1), colonizados pelos próprios microrganismos do esgoto que se
desenvolvem digerindo a matéria orgânica do meio.
-
Em tanques de lodo ativado (2), onde o meio é agitado e oxigenado, mediante a injeção de ar
comprimido.
-
Em um segundo tanque de sedimentação para separar o efluente do lodo.
o Tratamento terciário.
Este é realizado para eliminar substâncias inorgânicas e orgânicas, envolvendo procedimentos
como a filtração, a volatilização da amônia, a precipitação de fosfato etc.
o Tratamento avançado.
A degradação microbiana dos resíduos orgânicos diminui consideravelmente a carga de
microrganismos patogênicos liberada no ambiente, mas não a elimina totalmente. Os
microrganismos patogênicos recalcitrantes só podem ser eliminados mediante alguns métodos
adicionais, como a cloração, a irradiação UV e o tratamento com ozônio.
-------------FIGURA 11.4. O tratamento das águas residuais
ESGOTO
Fossas sépticas
Gradeamento
Lagoas de oxidação
Tanque de areia
Filtros de gotejamento (1)
EFLUENTE
Tanque de
sedimentação
Tanque de
sedimentação
Lodo ativado (2 )
EFLUENTE
Lodo
EFLUENTE
Lodo
Biodigestor
anaeróbico
RESÍDUO
SÓLIDO
O TRATAMENTO DOS EFLUENTES INDUSTRIAIS
O tratamento dos efluentes industriais é fundamental para a população e o ambiente; também é
estratégico para o melhoramento da imagem das indústrias mais poluentes, entre as quais figuram as
químicas, as papeleiras, as têxteis, as de couro, as de alimentos, as de extração de metais e minerais e
as de produção de energia.
A produção de etanol gera um efluente (vinhaça) que, anos atrás, era liberado diretamente nos rios
e cursos de água, provocando a eutrofização e a mortandade de peixes e de outros seres vivos. Para
avaliar a dimensão do problema, basta lembrar que, para cada litro de álcool, a indústria produz até
12 litros de vinhaça. Hoje, as indústrias mais responsáveis tratam o efluente por biodigestão anaeróbia,
gerando fertilizante e biogás.
140
Outro caso interessante é o dos efluentes das indústrias de laticínios, utilizados como matéria-prima
para o crescimento de microrganismos que, posteriormente, serão adicionados às rações animais. De
forma análoga, o licor sulfítico dos efluentes da indústria de papel e celulose pode ser eliminado
produzindo biomassa, com o fungo Paecilomyces.
Em 2014, a enxurrada de lama provocada pela ruptura de uma barragem, com o refugo de extração
de minério da empresa Samarco, causou 17 mortes, além da destruição do vilarejo de Bento Rodrigues
e a contaminação do Rio Doce. A tragédia de Mariana, considerada o pior acidente da história da
mineração, reflete o descaso de algumas empresas com o meio ambiente.
À diferença dos resíduos agrícolas e urbanos, que são biodegradados, os metais procedentes das
atividades extrativas e industriais (cádmio, zinco, chumbo, selênio) permanecem no ambiente, em
concentrações tóxicas. Sua absorção e concentração (bioacumulação) por plantas tolerantes aos
metais reduz a toxicidade do solo e facilita sua remoção em faixas de terreno pouco profundas.
Existem já plantas geneticamente modificadas para transformar os compostos organomercuriais
formados em diversas atividades (extração de carvão e de ouro etc.) em uma forma volátil muito
menos tóxica.
Em relação aos resíduos gasosos de processos industriais, o tratamento de compostos orgânicos
voláteis (VOCs, da sigla em inglês) é feito mediante filtros biológicos de diferentes tipos e
complexidade tecnológica.
AS EMISSÕES DE GASES E O EFEITO ESTUFA
Existem fontes naturais de gases, como os vulcões e os cupins. Estes, devido à atividade da flora
intestinal simbionte que lhes permite digerir celulose, liberam 40 milhões de toneladas de metano por
ano. No entanto, o homem é o principal responsável pela emissão dos gases que causam o efeito
estufa, através de atividades como o depósito do lixo em aterros sanitários, o cultivo do arroz, a criação
de gado, a liberação de efluentes agroindustriais sem tratamento e a queima de combustíveis fósseis
(petróleo, gás natural e carvão).
Os níveis de metano atmosférico são hoje duas vezes maiores que na era pré-industrial, um dado
preocupante, sabendo que a contribuição do metano para o efeito estufa é 20 vezes superior à do
dióxido de carbono. Embora sua utilização como combustível elimine uma fonte de contaminação
atmosférica, a rentabilidade do processo nem sempre justifica o seu aproveitamento.
Várias iniciativas tendem a recuperar o metano dos aterros sanitários e utilizá-lo como combustível
alternativo. A América Latina, que emite 6% dos gases contaminantes, já está entrando neste mercado
com vários projetos de reaproveitamento do metano (aterros sanitários, resíduos agroindustriais) na
Argentina, no Brasil, no Chile, em Cuba, no México, no Uruguai. As iniciativas dependem de empresas
privadas e/ou de organismos governamentais; alguns estudos preliminares contaram com
financiamento do Banco Mundial.
Em relação à gasolina, a combustão dos biocombustíveis (mistura gasolina-etanol ou etanol puro)
emite quantidades menores de monóxido de carbono (CO), óxidos de enxofre (SOx), hidrocarbonetos
e outros compostos poluentes. Em compensação, liberam-se aldeídos cancerígenos e, dependendo do
motor, óxidos de nitrogênio (NOx). Apesar disso, estima-se que, entre 2004 e 2008, o uso de
biocombustíveis na frota flexfuel brasileira teria deixado de liberar na atmosfera 35 milhões de
toneladas de CO2. Calcula-se também que, para que essa economia fosse de 530 milhões de toneladas
de CO2, bastaria misturar com álcool apenas 10% da gasolina disponível no planeta.
O Protocolo de Kyoto (1997) previa a redução da emissão de gases contaminantes (dióxido de
carbono, metano, óxidos nitrosos e clorofluorocarbonetos). Ratificado por numerosos países, mas não
por Estados Unidos nem Rússia, responsáveis respectivamente por 36% e 17% das emissões, o
protocolo de Kyoto não teve ainda os resultados esperados.
141
http://bteduc.com
Contudo, criou-se um mercado paralelo da descontaminação através da compra e venda do Certificado
de Redução de Emissões (CER, do inglês Certificate of Emission’s Reduction), que nada mais é que um
bônus sobre a quantidade de contaminação deixada de emitir. Deste modo, o Protocolo de Kyoto
permite que, tendo superado a cota de gases a emitir, um país continue contaminando a atmosfera,
se comprar bônus de um país que não a contamina, ou que reduz sua própria contaminação.
A RECUPERAÇÃO DE RECURSOS NATURAIS
O PETRÓLEO
Na extração de petróleo, técnicas especiais (EOR, do inglês enhanced oil recovery) envolvem o uso de
polímeros de origem microbiana (xantana) para aumentar a viscosidade e facilitar o seu
bombeamento. A introdução direta dos microrganismos no poço (MEOR, do inglês microrganism
enhanced oil recovery) parece menos interessante do ponto de vista econômico, mas isso poderia
mudar, se o petróleo começar a se esgotar.
A MINERAÇÃO
A extração dos metais solubilizados nas águas escuras e ácidas do Rio Tinto (Andaluzia, Espanha) data
do domínio romano; abandonadas durante séculos, as minas foram exploradas a partir do século XIX
por uma empresa inglesa, hoje australiana. Em 1947, o isolamento de bactérias quimiotróficas do
gênero Thiobacillus mostrou que a acidificação das águas e a consequente solubilização dos metais
eram o resultado de uma ação combinada entre agentes químicos e biológicos.
As bactérias transformam os sulfetos metálicos insolúveis em sulfatos solúveis, mediante uma
reação de oxidação que libera a energia necessária para sua reprodução e crescimento. A fixação de
dióxido de carbono fornece o carbono necessário para a síntese dos componentes celulares, de modo
que os requerimentos bacterianos se limitam ao oxigênio e a pequenas quantidades de nitrogênio e
fósforo.
A biolixiviação se aplica especialmente à extração de cobre, urânio, ouro, zinco, chumbo, níquel e
cobalto. A tecnologia é relativamente simples e requer pouca inversão, sendo adaptada aos países em
desenvolvimento. Na América Latina, usa-se a biolixiviação para a extração de cobre (Chile, México e
Peru) e de ouro (Brasil, Chile e Peru).
A BIOMINERAÇÃO NO CHILE
Os Andes chilenos guardam as maiores reservas de cobre do planeta. Na época pré-colombiana, foi
utilizado, pelas culturas Tiahuanaco e Inca, na produção de bronze, uma liga de cobre e estanho.
Durante o período colonial, a produção de cobre se manteve baixa, mas entre 1820 e 1900 extraíramse dois milhões de toneladas. Ao finalizar o século XIX, as jazidas com alta concentração de cobre
começaram a dar indícios de esgotamento.
No século XX, os consórcios internacionais, que dominavam a tecnologia necessária para a extração
do cobre chileno de baixa concentração, assumiram o controle da indústria (Braden Copper Co.,
Kenecott Corporation, Chile Exploration Company). Após uma década de “chilenização”, em 1971 as
principais minas de cobre foram nacionalizadas. Atualmente, 31% da produção de cobre do Chile está
em mãos da Codelco (do espanhol, Corporación Nacional del Cobre), uma empresa estatal criada em
1976, que emprega 47.000 pessoas; o resto é produzido pelo setor privado. Em 2014, Codelco foi o
maior produtor de cobre de mina do mundo e o segundo de molibdeno de mina.
As primeiras experiências de biolixiviação foram realizadas, entre 1950 e 1980, em Rio Tinto
(Espanha), Cananea (México) e Toromocho (Peru). A exploração da mina de Pudahuel (Codelco, Chile),
com tecnologia nacional de biolixiviação, começou na metade da década de 1980. A bio-
142
hidrometalurgia se estendeu rapidamente, havendo estabelecimentos que extraem o cobre
exclusivamente por biolixiviação.
As operações são especialmente apropriadas para as minas de baixa qualidade ou semiesgotadas,
assim como para a recuperação do cobre, nos refugos existentes. A tecnologia envolve a produção de
biomassa, em biorreatores que geram diferentes soluções de microrganismos específicos, com as
quais se regam as pilhas de minério. Os microrganismos dissolvem o ferro e o enxofre, liberando o
cobre e deixando-o em forma solúvel. Uma vez recolhido em piscinas, esse líquido rico em cobre passa
para as plantas de extração, onde se obtêm os cátodos de cobre de alta pureza.
A oxidação biológica dos amontoados ou pilhas permite recuperar 75 a 90% do cobre, a um custo
muito baixo, em períodos de 6 a 12 meses. No desenvolvimento tecnológico da biomineração,
participaram universidades e institutos de pesquisa, além do setor produtivo, com apoio do governo e
do Pnud (Programa das Nações Unidas para o Desenvolvimento). As pesquisas atuais contemplam o
uso de microrganismos termofílicos (Sulfobolus) e a otimização do processo de bio-oxidação
(Thiobacillus ferroxidans).
Fundada em 2002, por Codelco e Nippon Mining & Metals Co. Ltd., a empresa BioSigma desenvolve
estudos microbiológicos e genômicos, assim como as tecnologias de produção de biomassa, que
permitem a inoculação das pilhas, acelerando a recuperação de minério. A partir de uma primeira
patente, descrevendo um método para modificar geneticamente as bactérias extremófilas, do gênero
Acidithiobacillus, encontradas no minério de cobre, Biosigma conta com mais de 80 patentes
concedidas no Chile e no exterior, além de muitas outras em andamento. Hoje, 5% da produção
cuprífera do Chile é obtida por biolixiviação.
O DIAGNÓSTICO DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
O diagnóstico de contaminação ambiental exige o monitoramento da água, do ar e do solo. As
biotecnologias desenvolvidas abrangem o uso de indicadores biológicos, de técnicas imunológicas e
genéticas e de biossensores.
INDICADORES BIOLÓGICOS
Plantas e animais, capazes de acumular metais pesados, e poluentes orgânicos persistentes podem ser
utilizados como indicadores biológicos. A contaminação ambiental é avaliada, diretamente, pela
concentração do contaminante em um organismo específico. Na avaliação indireta, são analisadas
outras variáveis, tais como o número de plantas e de espécies microbianas, o número de indivíduos
nessas espécies etc.
TÉCNICAS GENÉTICAS
As técnicas genéticas são aplicadas para identificar as populações microbianas presentes no ambiente.
Como ainda não sabemos como cultivar no laboratório a maior parte dos microrganismos ambientais,
uma boa parte dessa biodiversidade permanece desconhecida.
A tecnologia do DNA facilita a identificação dessas espécies, em função das sequências gênicas
correspondentes ao RNA ribossômico (rRNA de 16S), e ajuda a monitorar as mudanças nas
comunidades microbianas utilizadas na remoção de poluentes, de maneira a detectar qualquer
variação ambiental e restaurar rapidamente as condições ótimas do sistema.
Microarrays adequados avaliam a expressão dos genes em uma linhagem ou uma comunidade
microbiana em relação a um agente ambiental (genossensores).
143
http://bteduc.com
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
As técnicas imunológicas utilizam anticorpos específicos, marcados ou associados a enzimas. As
técnicas imunoenzimáticas, cujos resultados podem ser apreciados, simplesmente, por uma mudança
de cor, resultam especialmente apropriadas para os testes de campo. Substituem testes tradicionais e
lentos, que exigem um equipamento complexo, como os de presença de coliformes na água.
Imunoensaios de diversos tipos permitem o monitoramento contínuo, automatizado e barato de
pesticidas como o dieldrin, o parathion e os PCBs.
BIOSSENSORES
Os biossensores combinam diferentes componentes biológicos e eletrônicos, geralmente sob a forma
de um chip; alguns são muito seletivos, outros são sensíveis a um amplo espectro de substâncias.
O componente biológico pode ser uma enzima, um anticorpo ou um microrganismo. Respondendo
a um estímulo ambiental se verifica uma mudança em suas propriedades, mudança que é detectada
óptica ou eletronicamente, fornecendo uma medida quantitativa do contaminante (Figura 11.5).
Bactérias ou leveduras imobilizadas revelam a presença de uma determinada substância, seja
porque a metabolizam, seja porque esta inibe o próprio metabolismo microbiano. Especialmente
interessante é a utilização de organismos geneticamente modificados, associando o promotor do gene
de uma enzima, que reage com a substância procurada (arsênico, por exemplo), com genes indicadores
(luminescência, fluorescência ou produção de uma substância colorida).
-------------FIGURA 11.5. O funcionamento de um biossensor
O sinal aumenta ou diminui em função da concentração do substrato contaminante, que estimula ou inibe a ação do agente
biológico.
Substrato
Membrana
Biodetector imobilizado
O substrato reage com o biodetector,
originando um produto específico
Ao detectar um produto específico,
o transdutor gera um sinal elétrico
Amplificador
Circuito
Sinal de saída (Output)
144
A BIORREMEDIAÇÃO
Como resultado das atividades humanas, aproximadamente 2,5 milhões de toneladas de substâncias
químicas perigosas são liberadas anualmente no meio ambiente (Tabela 11.2). Em alguns casos, tratase de emissões deliberadas e regulamentadas (resíduos industriais), em outros, de escapamentos
acidentais (manchas de óleo ou de petróleo).
Muitas das substâncias químicas presentes no ambiente foram geradas pelo homem. Algumas
podem ser degradadas, em poucos meses, por algum organismo; outras persistem na natureza
durante um longo tempo. Consideradas recalcitrantes, essas moléculas são alheias ao mundo dos seres
vivos (xenobióticas). Não são biodegradadas ou, quando o são, o processo é lentíssimo, podendo
demorar centenas de anos.
Existem várias estratégias para retirar substâncias recalcitrantes do meio ambiente (Figura 11.6).
As opções contemplam a construção de barreiras físicas, a lavagem ou ventilação do solo contaminado
e sua destruição, por incineração ou por biorremediação. Para que esta última possa ser aplicada, é
necessário que o poluente seja transformado metabolicamente por algum agente biológico, que os
produtos finais sejam seguros e que as condições ambientais favoreçam a atividade microbiana.
-------------TABELA 11.2. Os principais contaminantes do meio ambiente
CATEGORIA
EXEMPLO
Inorgânicos
Metais (cádmio, mercúrio, prata, cobalto, chumbo, cobre, cromo, ferro), isótopos radiativos,
nitratos, nitritos, fosfatos, cianetos, asbestos.
Orgânicos
Resíduos petroquímicos: petróleo, gasóleo, compostos aromáticos (benzeno, tolueno, etilbenzeno,
xileno).
Produtos sintéticos: pesticidas organo-halogenados como os bifeniles policlorados (PCBs) ou os
hidrocarbonetos poliaromáticos.
Gasosos
Gases: dióxido de enxofre (SO2), dióxido de carbono (CO2), óxidos nitrosos (NOx), metano (CH4).
Compostos voláteis: clorofluorocarbonetos (CFCs), compostos orgânicos voláteis (VOCs).
FIGURA 11.6. As estratégias de biorremediação
Microrganismos
do ambiente
Microrganismos
selecionados
Microrganismos geneticamente
modificados (em sistema fechado)
MEIO CONTAMINADO
Otimização dos fatores que estimulam
a ação bacteriana (estrutura do solo,
pH, aceptores de elétrons).
Suplemento de nutrientes
MEIO DESCONTAMINADO
145
http://bteduc.com
Uma forma de biorremediação é o tratamento in situ, que envolve a produção de biomassa específica
no local contaminado. Bactérias e/ou fungos do ambiente digerem o material tóxico, transformandoo em produtos inofensivos, voltando posteriormente a seu nível populacional normal no ambiente ou
morrendo. O crescimento da população microbiana pode ser estimulado pelo acréscimo de nutrientes.
Outra forma de biorremediação dos solos contaminados é o tratamento ex situ, em que o solo
escavado é transferido a um biodigestor. Como a liberação de microrganismos geneticamente
modificados no ambiente é vista com extrema desconfiança, sua utilização costuma estar restringida
a esses sistemas fechados.
Uma das raízes dessa desconfiança pode ser atribuída à Conferência de Asilomar. Em 1975, a
preocupação principal dos pesquisadores era a contenção dos microrganismos geneticamente
modificados, recomendando o uso de microrganismos fracos que, eventualmente, não sobrevivessem
no ambiente. Essas condições eram fundamentais para a continuidade das pesquisas, apesar de ter
estimulado o medo e a hostilidade da sociedade, em relação à liberação de microrganismos
geneticamente modificados engenherados no ambiente.
Na década de 1980, com o objetivo de evitar o congelamento dos cultivos de morango da Califórnia,
a empresa AGS (Advanced Genetic Sciences) desenvolveu a bactéria Pseudomonas syringae,
geneticamente modificada para eliminar uma proteína que facilitava a formação de gelo.
Boa parte da opinião pública se mostrou totalmente contrária à utilização da P.syringae, variedade
ice minus, temendo que alterasse a composição das nuvens e o regime de chuvas. Em 1987, um
processo judicial culminou com a autorização para realizar os testes de campo correspondentes. Os
experimentos foram bem-sucedidos, mas, em função da resistência encontrada, a empresa
abandonou o projeto.
Em compensação, AGS comercializou Snowmax®, um produto criado para aumentar a eficiência da
maquinaria produtora de neve artificial. Um dos principais ingredientes era a variedade convencional
de P. syringae, produtora da proteína facilitadora da formação de gelo. Snowmax® garantiu a neve
dos Jogos Olímpicos de Inverno de 1988, em Calgary (Canada).
OS VAZAMENTOS DE PETRÓLEO
A formação de carvão e de petróleo nas profundezas da terra é possível porque, em condições
anaeróbias, tanto a lignina como os hidrocarbonetos são compostos químicos estáveis. Porém, em
condições aeróbias, ambos são degradados pelos microrganismos presentes no ambiente.
Um dos mais sérios problemas de contaminação ambiental é o derramamento de petróleo nos
mares, devido a acidentes notórios (Prestige, Exxon Valdez, Torrey Canyon, Amoco Cadiz, Braer and
Sea Empress, British Petroleum) e a situações bélicas (Guerra do Golfo). As manchas de óleo
despejadas no mar contêm compostos tóxicos, que representam uma ameaça para a ecologia marinha
e costeira, afetando todas as formas de vida aquática e constituindo um risco para a saúde da
população.
O petróleo derramado no mar flutua na superfície, onde os componentes voláteis evaporam
rapidamente. O que não for recuperado pelo homem será dispersado pelo movimento das ondas,
permanecendo em alto-mar, ou sendo levado até a costa. Sua degradação dependerá dos
microrganismos naturalmente presentes no ambiente marinho.
Em 1971, A. Chakrabarty desenvolveu, a partir de várias linhagens de Pseudomonas spp., uma
superbactéria que reunia, em um único plasmídio, os genes necessários para degradar quatro
componentes do petróleo: cânfora, xileno, octano e naftaleno. Depois de um longo processo judicial
que culminou em 1980, Chakrabarty recebeu a primeira patente de um ser vivo: uma bactéria
geneticamente modificada, projetada para degradar componentes do petróleo. Embora tenha
146
passado com êxito nos testes laboratoriais, a bactéria de Chakrabarty não chegou a ser utilizada no
acidente do Exxon Valdez no Alaska (1989) nem em outros vazamentos posteriores.
Hoje, admite-se que um microrganismo geneticamente modificado teria poucas possibilidades de
sobrevivência na natureza, onde enfrentaria populações de microrganismos extremamente
competitivas. Por isso, a tendência atual é de estudar consórcios microbianos naturais, selecionados
de modo a que cada tipo de microrganismo sintetize alguma das enzimas necessárias para a
degradação da substância contaminante.
Obviamente, existem também pesquisas sobre microrganismos ambientais, como Alcanivorax
borkumensis, que é capaz de metabolizar 70% dos componentes do petróleo; sendo de especial
interesse toda informação nova sobre suas rotas metabólicas e seus requerimentos de fósforo e de
nitrogênio. Também há pesquisas visando a produção de biosurfactantes por algas, para substituir os
surfactantes usados atualmente, que são muito tóxicos.
A principal estratégia aplicada, atualmente, para remediar os vazamentos de petróleo é a
bioestimulação. Como o ambiente marinho é geralmente pobre em nitratos e fosfatos, acrescentamse nutrientes aos dispersantes químicos (detergentes), ou às espumas de limpeza das rocas da costa,
de maneira a estimular a ação dos microrganismos presentes no sítio contaminado. Estima-se que, até
o momento, o solo de mais de 30.000 sítios contaminados com petróleo, proveniente de vazamentos
de tanques de armazenamento, tenha sido tratado por bioaumentação.
A RADIAÇÃO
Após o acidente da planta nuclear de Chernobyl (1986), tentou-se remover a contaminação mediante
o plantio de girassóis, que absorvem e concentram o césio radiativo. As plantas devem ser cortadas e
tratadas como material contaminado, após a floração e antes da frutificação, porque as sementes
poderiam ser dispersadas pelos pássaros. Devido à estrutura diferente do solo, esta estratégia não
funcionou em Fukushima (Japão), onde uma mistura de algas e fungos parece ser mais eficiente.
ARMAS E CONFLITOS BÉLICOS
Além de causar enorme sofrimento humano, a indústria bélica cria também problemas ambientais de
grandes proporções, como ocorrido na Carolina do Sul (Estados Unidos), na década de 1990, quando
o tricloroetileno (TCE) utilizado, como desengordurante, na fabricação de armas, fora despejado no
solo, contaminando as águas subterrâneas e o rio Savannah.
Na descontaminação, utilizaram-se microrganismos que sobrevivem no ambiente contaminado,
por ter sistemas enzimáticos capazes de digerir os poluentes-alvo, ligeiramente diferentes de seus
substratos normais. Escolheu-se uma bactéria que metaboliza metano, mas é capaz de degradar o TCE.
Ao bombear metano no solo, a bactéria se multiplica; ao suspender o bombeamento, ela passa a
degradar o TCE por um tempo, até o bombeamento de metano se tornar novamente necessário.
A repetição cíclica do processo reduziu a contaminação a um nível aceitável. A utilização do
“metabolismo gratuito” bacteriano é considerada viável do ponto de vista comercial.
Outro composto que causou danos incalculáveis foi o Agente Laranja, lançado como desfolhante
nas florestas vietnamitas, pelos Estados Unidos, durante a guerra do Vietnam. Em fins da década de
1960, Chakrabarty conseguira uma mistura de linhagens bacterianas capaz de degradar um de seus
principais componentes, o herbicida 2,4,5-T. Não temos encontrado registros de uso dessa bactéria.
Porém, recentemente, foram aplicadas com sucesso técnicas de biorremediação no entorno da base
de Danang para eliminar a dioxina, outro dos componentes do Agente Laranja.
Um problema de difícil solução é a detecção e eliminação das 60 a 70 milhões de minas
antipessoais, espalhadas no mundo. Uma possível saída parece ser a utilização de plantas de
147
http://bteduc.com
Arabidopsis transgênicas (Aresa, Dinamarca). Estas plantas, portadoras de genes microbianos,
degradam a trinitroglicerina (TNT) liberando NO2, que é absorvido pela planta, modificando, três
semanas mais tarde, a cor das folhas.
Os conflitos bélicos atuais no Oriente Médio não se limitam unicamente a uma tragédia humana
sem precedentes. Deixarão uma herança ambiental terrível.
ORGANISMOS NOVOS NA NATUREZA E BIOSSEGURANÇA
A construção de Synthia (Instituto J. Craig Venter, 2010) e a disponibilidade das novas plataformas
tecnológicas sugerem que os organismos novos na natureza (NTN, do inglês, New to Nature),
originados por Biologia Sintética, podem estar mais próximos do que imaginamos.
Poderia ser inseguro um NTN construído com partes seguras? A preocupação com biossegurança é
inerente ao desenvolvimento da biotecnologia e, assim como em Asilomar, a questão fundamental
continua sendo a contenção. Vários são os questionamentos para os quais ainda não temos respostas:
qual seria o comportamento na natureza de um organismo construído juntando partes, dispositivos e
sistemas biológicos, dentro de determinado chassis? Qual seria o impacto ambiental desse organismo
sintético, se a contenção for insuficiente? O que aconteceria com um NTN liberado em um ambiente
sem predadores específicos? Poderia haver intercâmbio genético entre um organismo NTN e um
organismo biológico convencional, contaminando o pool genético natural?
Poder-se-ia falar de certeza de contenção (CoC, do inglês Certainty of Contention) de um NTN se a
probabilidade de escapamento, sua disseminação e a interação não intencionada com o ambiente
fossem praticamente zero. Nesse caso, em vez de Organismos Geneticamente Modificados, teríamos
Organismos Geneticamente Seguros.
Algumas das primeiras hipóteses contempladas, para garantir a contenção de um NTN, esbarraram
no fenômeno de transferência horizontal, frequente entre os microrganismos ambientais. Por esse
motivo, foram descartados tanto o uso de marcadores de resistência a antibióticos, como a inclusão
de genes suicidas, desenhados para provocar a morte do organismo, uma vez cumprida sua função.
As discussões atuais estão centradas na utilização de alguns sistemas bioquímicos modificados que
garantiriam a certeza de contenção. Entre as possibilidades consideradas, teríamos a expansão do
alfabeto genético com outras bases de DNA, a construção de ribossomos que reconheçam um código
de 4 bases, a substituição de códons para permitir a inclusão de aminoácidos não naturais etc.
Contudo, resta avaliar qual seria a eficiência desses sistemas e, ainda, responder à seguinte
pergunta: Solucionariam o problema ou criariam outros?
148
C A P Í T U L O 12
BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE
O conceito de biodiversidade abrange toda a variação existente nos seres vivos. Há 1,75 milhão de
espécies identificadas até o momento, o que representa uma pequena fração dos 13 milhões que
existiriam no planeta. Pouco sabemos da biodiversidade existente em regiões remotas, como as
calotas glaciares ou as profundezas submarinas.
Em outra acepção do termo, a biodiversidade compreende a variabilidade genética intraespecífica.
Considerando que apenas estamos começando a entender a estrutura dos genomas correspondentes
às diferentes espécies, muito resta a estudar.
As mudanças climáticas terão graves consequências para a biodiversidade. A desestabilização dos
ecossistemas afetará a extensão de terra cultivável, deixando sequelas na produção de alimentos e
favorecendo a aparição de doenças emergentes e reemergentes. O Plano Estratégico para a
Conservação da Biodiversidade (Nações Unidas) fixa, para a década de 2011 a 2020, os seguintes
objetivos: conservar a biodiversidade e fomentar sua utilização sustentável; distribuir de maneira justa
os benefícios do uso dos recursos genéticos.
A DESAPARIÇÃO DOS ECOSSISTEMAS NATURAIS
O cultivo de plantas e a domesticação de animais acompanharam o homem na passagem de uma vida
nômade para uma vida sedentária; uma mudança que ocorreu repetidas vezes, em diversas
populações e em lugares diferentes. As primeiras plantas cultivadas foram a cevada e o trigo (vales do
Eufrates e do Nilo, entre 13.000 a.C. e 10.000 a.C.), o arroz (regiões fluviais da China e da Índia, 10.000
a.C.), e o milho e a abóbora (América Central, entre 9.000 e 7000 a.C.).
No continente europeu, durante a Antiguidade, os cultivos estiveram restringidos a umas poucas
espécies locais. As plantas provenientes de outros lugares chegaram lentamente, através do incipiente
intercâmbio comercial, ou como troféus de guerra, de romanos e cruzados. As técnicas agrícolas
primitivas limitavam-se à tração animal do arado e ao armazenamento de alimentos. Na Idade Média,
a introdução da rotação trienal de culturas possibilitou a conservação do solo e o aumento da
produção.
As grandes navegações e a descoberta do Novo Mundo mudaram o perfil das plantas cultivadas em
cada continente. O milho, a batata, o tomate, o feijão, o girassol e o tabaco foram introduzidos na
Europa. Procedentes de diferentes lugares, o trigo, o grão-de-bico, o arroz, os cítricos, a banana, o café
e a cana-de-açúcar se aclimataram na América (Figura 12.1).
No Novo Mundo e ligado ao tráfico de escravos, o ciclo da agricultura das plantações providenciou
o cultivo de plantas produtoras de fibras (algodão, juta) e de borracha (caucho), de açúcar (cana-deaçúcar), de óleo (amendoim, palma), de frutos (banana), de substâncias estimulantes (chá, café, cacau)
etc.
http://bteduc.com
FIGURA 12.1. O transporte de plantas de um continente a outro
1: Trigo, aveia, videira, grão-de-bico.
2: Abóbora, feijão, milho, pimenta,
tabaco, batata, tomate.
3: Café, inhame.
4: Abacaxi, amendoim, cacau, caucho,
mandioca, milho, tomate, pimenta,
cinchona.
5: Cítricos, banana, soja, cana-deaçúcar, arroz.
6: Abacaxi, amendoim, cacau, caucho,
mandioca, milho, tomate, algodão,
abacate.
FIGURA 12.2. Distribuição da produção agrícola (grãos e cereais, pradarias e pastagens, cultivos diversos) na área
habitável do planeta
Cultivos diversos (1%)
Grãos e cereais (10%)
Florestas (31%)
Pradarias e pastagens (24%)
Outros usos (34%)
--------------
Nesse marco econômico, ficaram definidas algumas das características da agricultura moderna, que
visa satisfazer as necessidades dos consumidores, relativas à produção de alimentos e de insumos
industriais.
A história da domesticação dos animais segue um curso parecido, começando com o cachorro, na Ásia,
no final do Paleolítico. Entre 8.000 e 7.000 a.C., foram domesticadas a cabra e a ovelha (Mesopotâmia),
o boi e o zebu (Mesopotâmia, Egito), o porco (China, Europa) e o gato (Mediterrâneo). A domesticação
do cavalo ocorreria bem mais tarde (Ucrânia, 4.000 a.C.).
Antes da chegada dos europeus ao continente americano, os povos originários sustentavam
criações de lhamas, alpacas, vicunhas, perus e preás. Os europeus importaram seus animais
domésticos uma vez conquistado o Novo Mundo. Cavalos, vacas, porcos e cachorros se multiplicaram
rapidamente, causando grande devastação na flora local e tornando as grandes planícies um lugar
ideal para a criação de gado.
A expansão dos ecossistemas agrícolas acompanhou a ocupação, pelo homem, da superfície
habitável do planeta, que exclui os oceanos, os mares, os desertos, as montanhas e as regiões polares
(Figura 12.2). O aumento significativo da produtividade agrícola no século XX esteve diretamente
150
ligado às novas práticas agronômicas, à mecanização do trabalho no campo e ao melhoramento
genético. Contudo, esse progresso teve um impacto negativo na biodiversidade, ao limitar o número
de espécies cultivadas.
Para evitar o desaparecimento dos ecossistemas naturais, precisa-se de uma agricultura e pecuária
sustentáveis, que possibilitem a conservação e a manutenção dos solos, da água, dos processos
ecológicos e dos recursos genéticos.
O HOMEM E AS PLANTAS
AS PLANTAS ALIMENTÍCIAS
Os vegetais ocupam um lugar preponderante na dieta humana. Embora nossa alimentação inclua
também produtos animais (carne, leite, ovos, peixes, mariscos), a maioria das proteínas que ingerimos
é de origem vegetal. Os carboidratos presentes nos cereais fornecem 75% de nossas necessidades
calóricas, sendo as restantes complementadas pela ingestão de tubérculos, raízes, plantas oleaginosas
e sacarinas. Embora provendo uma pequena quantidade de calorias, as hortaliças e as frutas são
importantes devido a outros valores nutritivos (Tabela 12.1).
Apesar de existir uma enorme diversidade de plantas comestíveis, 90% dos alimentos consumidos
pelo homem restringem-se a um pequeno grupo de 20 a 25 espécies, sendo os principais a banana, a
mandioca, o milho, o amendoim, algumas leguminosas, o milheto, a batata, o arroz, o sorgo, a batatadoce, a soja e o trigo (Figura 12.3).
A população humana passará, em meio século, de 6 bilhões de pessoas (2000) a 9 bilhões (2050).
Será suficiente a produção de alimentos para satisfazer as necessidades dessa população? Ao longo
dos últimos sessenta anos, duplicou-se a colheita de cereais e reduziram-se significativamente os
preços. O aumento da produção de alimentos deve-se à seleção de variedades mais produtivas e ao
cultivo em condições otimizadas. O progresso tecnológico da Revolução Verde (década de 1960) gerou
suficientes alimentos para suprir a humanidade, até hoje.
Contudo, ainda hoje, 4,5 bilhões de pessoas vivem na pobreza, 24.000 pessoas morrem diariamente
de fome e outras 800.000, principalmente crianças e mulheres, sofrem de desnutrição. A carência de
vitamina A afeta 14 milhões de crianças, e a falta de ferro, um bilhão de pessoas. Mesmo havendo
suficientes alimentos para todos, eles não chegam aos dois bilhões de pessoas que vivem com menos
de dois dólares por dia.
-------------TABELA 12.1. Os principais tipos de vegetais que entram em nossa alimentação
TIPOS DE VEGETAIS
EXEMPLOS
Cereais
Trigo, arroz, milho, centeio, aveia, cevada, sorgo etc.
Plantas proteaginosas
Diversos tipos de feijão, lentilha, grão-de-bico, amendoim, ervilha etc.
Raízes e tubérculos
Batata, cará, batata-doce, mandioca, cenoura, beterraba etc.
Plantas oleaginosas
Soja, algodão, colza, canola, amendoim, girassol etc.
Plantas produtoras de
açúcar
Cana-de-açúcar, beterraba sacarina.
Frutas e hortaliças
Banana, tâmara, coco, azeitona, abacate, manga, uva, fruta-pão, couve, couve-flor, tomate,
pimenta, quiabo, berinjela, pepino, abóbora etc.
151
http://bteduc.com
FIGURA 12.3. Os vegetais na alimentação humana
Espécies comestíveis
(10.000 – 80.000)
Espécies outrora consumidas como alimento (5.000)
Espécies cultivadas atualmente (2.300)
Espécies cultivadas comercialmente (150)
Espécies essenciais na dieta humana (20-25)
--------------
Segundo a Food and Agriculture Organization (FAO), para responder às necessidades da população, a
produção de alimentos deverá aumentar em 60%, nos próximos 30 anos. Considerando que 90% das
pessoas viverão na faixa intertropical do planeta, onde está situada a maioria dos países em
desenvolvimento, a falta de alimentos poderá se agravar. Em parte, porque, salvo algumas exceções
significativas (chá, café, cacau, banana etc.), os alimentos são consumidos no mesmo lugar onde são
produzidos. E também porque, em função das mudanças climáticas e da tendência migratória para as
grandes cidades, aumentará o número de pessoas que, em vez de produzir alimentos, deverá comprálos.
Embora em vários lugares tenham aparecido sinais de erosão e de esgotamento do solo, a expansão
da fronteira agrícola parece improvável. Boa parte da terra não utilizada se encontra em regiões pouco
férteis, distantes, carentes de infraestrutura ou cobertas por florestas. Sua ocupação aceleraria a
degradação de ecossistemas, com perda de biodiversidade e risco de aparição de doenças.
Os grandes desafios atuais da humanidade são o aumento da produtividade dos sistemas agrícolas
e a redução da desigualdade de acesso aos alimentos. Se, para o primeiro, o desenvolvimento
tecnológico é indispensável, a história mostra que, sem mudanças sociais e políticas, não haverá
solução para o problema da fome.
AS PLANTAS COMERCIAIS
A PRODUÇÃO DE INSUMOS
Várias plantas são cultivadas e comercializadas, às vezes internacionalmente, como matéria-prima
para diversas indústrias (Tabela 12.2). Assim como o ouro, a carne, o petróleo e o gás natural, os grãos
são considerados produtos equivalentes (commodities), independentemente do produtor. Os preços
são fixados em mercados futuros, que estabelecem a quantidade e a qualidade da commodity a ser
comercializada.
De todas as plantas industriais, a soja é uma das mais importantes, devido à extraordinária
versatilidade de seus produtos.
O grão e os brotos podem ser consumidos diretamente ou como farinha na composição de pães,
doces, bebidas, massas, biscoitos etc. Os grãos fermentados são utilizados na culinária oriental (misó,
tempeh).
A fração proteica do grão substitui a proteína de origem animal como carne de soja. Também é
usada na elaboração de produtos dietéticos, pastas e cremes, massas, sucrilhos, comida de bebês,
bebidas etc. A torta de soja é incluída nas rações animais. Por outro lado, essa fração proteica entra
na composição de adesivos, reagentes analíticos, colas de madeira, emulsão asfáltica, produtos de
limpeza, cosméticos, substitutos de couro e plásticos.
O óleo extraído do grão é usado para cozinhar e como condimento para saladas e, na indústria de
alimentos, entra na composição de molhos, maioneses, coberturas de bolo, bebidas, patês e
152
margarinas. Outras indústrias o utilizam como anticorrosivo e antiestático, entrando na composição
de agentes dispersantes e antiespumantes, selantes, cosméticos, madeirite, corantes e tintas.
Atualmente, 80-90% do óleo de soja produzido provém de culturas transgênicas.
Assim como a soja, o milho apresenta um espectro de aplicações de amplidão equivalente na
alimentação e na indústria. Não é de surpreender que os primeiros cultivos transgênicos
comercializados correspondessem a quatro das plantas industriais: a soja, o milho, o algodão e a
canola.
-------------TABELA 12.2. As plantas e a indústria
PRODUTO
PLANTAS INDUSTRIAIS
Biocombustíveis
Cana-de-açúcar, beterraba sacarina, cereais, soja, mamona etc.
Fibras têxteis
Algodão, sisal, linho, cânhamo, juta, coco, rami, piaçava.
Óleos e gorduras
Soja, algodão, colza, canola, amendoim, girassol, dendezeiro, babaçu, mamona, sésamo,
oliveira, linhaça.
Essências e fragrâncias
Sassafrás, menta, citronela, geraniol, eugenol, capim-limão.
Látex
Borracha, chicle (sapoti).
Ceras
Carnaúba, jojoba.
Resinas
Bálsamos e gomas.
Especiarias
Pimenta-do-reino, noz moscada, canela, gengibre, cravo-da-índia.
Taninos
Acácia, quebracho, eucaliptos.
Tinturas
Pau-brasil, pau-campeche, urucum.
--------------
A EXPLORAÇÃO DAS FLORESTAS
As florestas naturais têm um valor intrínseco fundamental na preservação da biodiversidade. No
entanto, a lenha ainda é utilizada como combustível, e as madeiras nobres continuam a ser exploradas.
As florestas também são uma fonte de matéria-prima para a indústria de papel e celulose. As
biotecnologias facilitam o reflorestamento, através da micropropagação e do plantio clonal de árvores
mais produtivas, obtidas por melhoramento genético convencional ou por engenharia genética.
Técnicas de engenharia genética visam reduzir a lignina em 45-50%, de modo a diminuir a necessidade
de tratamentos poluentes, no processamento da polpa.
A maioria dos estudos sobre essências se limita aos gêneros Pinus, Eucalyptus, Picea, Populus,
Quercus e Acácia. O mapeamento de genomas (Pinus, Eucalyptus) e a utilização de marcadores
genéticos permitem selecionar alelos em genes que controlam a variação fenotípica. Aplicam-se
também as duas tecnologias para a obtenção de árvores que possam crescer em solos ácidos ou com
salinidade acentuada.
A comercialização do eucalipto transgênico de crescimento rápido da FuturaGene (Suzano),
aprovado pela CTNBio, redundaria na limitação da expansão das plantações, diminuindo a energia
gasta em transporte.
Além do Brasil, outros países já realizaram experiências de transformação genética em árvores. Na
China, a tecnologia é considerada fundamental para o reflorestamento; plantações de Populus
resistente a insetos (portador de um transgene codificador da toxina do Bacillus thuringiensis) estão
153
http://bteduc.com
sendo monitoradas, desde o ano 2000. Outros estudos visam a resistência à salinidade, ao estresse, à
seca etc.
A FLORICULTURA
A floricultura é o cultivo de plantas ornamentais e de flores. Trata-se de um mercado em expansão, de
importância comercial para a América do Sul, o Oriente Médio, a Asia e a África. A produção de material
de propagação (mudas, sementes e bulbos) para a floricultura tende a se concentrar em grandes
empresas internacionais. Cultivam-se poucas espécies nativas para exportação. A maioria das plantas
comercializadas é o resultado de cruzamentos tradicionais, técnicas de cultivo de tecidos
(micropropagação e embriogênese somática), haploidização e fusão de protoplastos.
A produção comercial de orquídeas, por exemplo, depende hoje totalmente das técnicas de cultura
in vitro; boa parte do desenvolvimento das plantas ocorre em condições de laboratório bem
controladas, que permitem a obtenção de mudas sadias e de variedades novas.
O Brasil exporta flores e plantas tradicionais (crisântemos, rosas, gladíolos, cravos, gérberas etc.) e
plantas tropicais (helicônias, bromélias, orquídeas, antúrios etc.) em diferentes modalidades (flores de
corte, flores em vaso, plantas verdes e plantas para paisagismo).
A Argentina exporta rosas, cravos e palmas para cidades como Miami e Milão, de onde são
distribuídas internacionalmente. Também exporta bulbos de tulipa e uma variedade de rosa preta sem
espinhos. O Instituto Nacional de Tecnologia (INTA) e a Japan International Cooperation Agency (JICA)
participam de um programa de cooperação para o desenvolvimento da floricultura, assim como da
produção hortifrutícola.
Aproximadamente 75% do mercado mundial de flores corresponde a cravos, rosas, crisântemos e
gérberas, espécies nas quais faltam os pigmentos responsáveis pela coloração azul (antocianinas). Com
a transferência de um gene de petúnia ao cravo, as empresas Florigene (australiana) e Suntori
(japonesa) conseguiram colocar no mercado flores inovadoras, tais como os cravos (Dianthus
caryophyllus L.) de cor malva (Moondust) ou violeta (Moonshadow).
Na Colômbia, os cravos azuis são cultivados, desde 2000, por Flores Colombianas S.A., uma filial da
empresa holandesa Floriyin, e comercializados em diversos países, inclusive dentro da União Europeia,
onde levam a seguinte ressalva: “Este produto é um cravo geneticamente modificado” e “inapropriado
para o consumo por seres humanos e animais”.
Em 2009, a Colômbia iniciou o cultivo de rosas e crisântemos azuis transgênicos, que não são
vendidos na União Europeia; os melhores clientes estão no Japão que, no século VIII, adotara o
crisântemo como emblema do selo imperial.
Em relação à engenharia genética, não há muito interesse em desenvolver novas variedades,
porque os custos dos testes necessários para obter a aprovação de um transgênico são muito altos.
No entanto, existem várias linhas de pesquisa visando o desenvolvimento de fragrâncias e a resistência
a doenças e ao estresse. Também se estuda a transferência, a várias espécies ornamentais, de genes
que prolonguem a conservação das flores nos vasos.
A COSMÉTICA
As indústrias cosméticas utilizam, em seus produtos, numerosos ativos vegetais extraídos de plantas e
de algas. Em conjunto com pequenas comunidades rurais, várias empresas desenvolveram uma forma
de produção sustentável de substâncias intermediárias, como óleos (coco, castanha) e outros extratos
vegetais (maracujá, açaí, andiroba etc.).
A “onda verde” que se alastra na sociedade levou várias empresas nacionais (Natura, O Boticário,
Granado etc.) e estrangeiras (L’Oréal-Body Shop, Zhiel’s, Yves Rocher etc.) a aderir, com sucesso, a este
modelo.
154
AS PLANTAS MEDICINAIS
Até o momento, foram identificadas aproximadamente 20.000 espécies de plantas medicinais. Sem
acesso aos medicamentos comercializados, 80% da população rural depende delas.
A metade das drogas medicamentosas consumidas atualmente é extraída de 250 espécies de
plantas silvestres, que representam 0,1% das 250.000 plantas vasculares. Em alguns casos, o princípio
ativo das plantas foi identificado e sintetizado quimicamente. O ácido acetilsalicílico da fórmula da
aspirina, por exemplo, tem um efeito comparável ao do ácido salicílico, extraído da casca do salgueiro
e administrado como analgésico e antitérmico, em chás e poções, desde a Antiguidade.
A procura por novos medicamentos começa pela coleta das plantas, seguida da extração de
substâncias químicas que são submetidas a testes de atividade biológica. Encontrar um princípio ativo
pode gerar lucros muito altos, embora só um, em cada 10.000 produtos testados, chegue ao mercado.
Entre os fitoquímicos bem-sucedidos estão: a diosinina (produção de anticoncepcionais), a vincristina
e a vinblastina (medicamentos anticancerosos), a morfina (anestésico) e o curare (relaxante em
cirurgias).
A BIODIVERSIDADE AMEAÇADA
A EROSÃO GENÉTICA
A perda de biodiversidade acarreta a perda de variação genética (erosão genética). Os dados são
estarrecedores: 11 milhões de Ha/ano de florestas destruídas; avanço da desertificação em 27 milhões
de Ha/ano; desaparição de 30 a 300 espécies por dia. A destruição dos ecossistemas, a diminuição do
número de espécies existentes e a perda de variabilidade genética são danos irreparáveis, porque é
preciso recorrer aos genes das variedades silvestres para melhorar geneticamente as plantas
cultivadas e os rebanhos existentes.
A erosão genética é inquietante em relação às plantas alimentícias, cultivadas em número restrito
e uniformizadas em função das práticas agrícolas modernas. Se, no início do século XX, existiam na
Índia mais de 30.000 variedades nativas de arroz, hoje provavelmente não restam mais de 50. Por
outro lado, o risco de extinção ameaça, aproximadamente, 30% das variedades ou raças dos animais
de criação.
Também preocupa o futuro das plantas medicinais, muitas delas silvestres, porque as melhores
plantas são as primeiras a ser colhidas, enquanto as restantes ficam no terreno, produzindo as
sementes que darão origem às próximas gerações. Este tipo de seleção negativa contribui para a
erosão genética das espécies.
A EXPANSÃO DO AGRONEGÓCIO
Embora as novas tecnologias de edição genética possam modificar rapidamente o panorama, as
plantas geneticamente modificadas se limitam, por enquanto, a um número reduzido de espécies e a
poucos traços, principalmente tolerância a herbicidas e resistência a insetos. A globalização dos
cultivos de plantas geneticamente modificadas traz alguns questionamentos relativos ao seu impacto
sobre a biodiversidade.
Vários cenários são possíveis, com diferentes consequências para os ecossistemas e sua
biodiversidade. No primeiro, a expansão do agronegócio afetaria os espaços dedicados a outras
culturas, pastagens e florestas. No segundo, ao aumentar a produção agrícola, as variedades
transgênicas diminuiriam a pressão sobre as áreas não cultivadas, especialmente as florestas.
155
http://bteduc.com
A materialização de um ou outro, assim como a de qualquer outro cenário intermediário, dependerá
das pressões socioeconômicas e das políticas públicas relativas à produção de alimentos, exportações
e proteção do meio ambiente. Mas não da transgênese em si, porque os cenários seriam os mesmos
se em vez de plantas geneticamente modificadas dispuséssemos de plantas melhoradas por métodos
tradicionais.
A expansão da monocultura de um pequeno número de espécies representa, sem dúvida, uma
perda da biodiversidade existente no ambiente natural. No entanto, o mercado de sementes difere de
outros mercados globalizados, como o de bebidas gasosas, o de eletrônica ou o de informática, que
geram produtos standard, de modo que a comercialização de um único tipo de semente não significa
necessariamente a total uniformização do material genético.
Nenhuma semente está presente ou é comercializada em todo o globo, criando-se variedades
adaptadas a contextos específicos. Essas variedades ou cultivares distinguem-se entre si por suas
características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas ou moleculares, herdadas geneticamente. A
estratégia é a mesma em relação às plantas transgênicas. Por exemplo, das 668 cultivares de soja
(Glycine max (L.) Merrill), registradas no Registro Nacional de Cultivares (RNC/ MAPA), mais de 200 são
transgênicas.
A TRANSGÊNESE
Muitas das plantas consideradas naturais são um invento recente do homem. Um exemplo é o
morango, resultante de um cruzamento acidental entre duas variedades que não coexistem na
natureza: a norte-americana Fragaria virginiana e a sul-americana Fragaria chiloense, ocorrido no
século XIX em um Jardim Botânico da França.
Outro exemplo é o tritical, um híbrido de trigo e centeio, obtido em laboratório em fins do mesmo
século. Tratado inicialmente como uma curiosidade científica, este cereal teve suas propriedades
agronômicas desenvolvidas recentemente, sendo utilizado hoje na composição de pães e biscoitos e
de rações animais; também é vendido em algumas lojas de produtos naturais.
A valorização do que é natural varia de uma pessoa a outra. Se a natureza for vista como boa e
protetora, toda intervenção humana será observada com desconfiança. Ao contrário, frente a uma
natureza perigosa e ameaçadora, cabe ao homem se resguardar. Dessas duas visões do mundo natural
nascem a tecnofobia e a tecnofilia, duas correntes que se enfrentam frequentemente.
A transgênese é especialmente perturbadora para alguns setores de opinião, contrários ao uso
dessa tecnologia. Em alguns casos, existiria desconfiança na ligação atual entre a ciência, a tecnologia
e o mundo empresarial. Ao associar o progresso científico às vantagens econômicas, a ciência perderia
sua histórica imagem de pureza, honestidade e desinteresse.
Em outros, o temor consistiria na modificação do padrão das espécies, por transferência de genes,
quebrando a ordem estabelecida na Criação e gerando o caos genético. Na mitologia, esse medo se
encontra representado na quimera, um misto de leão, cabra e dragão que vomitava fogo e que, na
Idade Média, simbolizava o mal. Figuras mistas de homem, animal e planta se encontram
magistralmente representadas pelo pintor flamengo Hieronymus Bosch (El jardín de las delicias, 1510).
Por ser de cunho religioso e essencialmente subjetiva, esta última visão não corresponde ao nosso
conhecimento atual sobre as espécies, que são unidades morfológicas e reprodutivas essencialmente
dinâmicas. Sem fundamentação científica, o criacionismo e o fixismo ignoram os inúmeros estudos
sobre a evolução dos seres vivos, assim como descobertas recentes sobre os genomas, mostrando o
compartilhamento de um número grande de genes entre as diferentes espécies.
156
A PROTEÇÃO DA BIODIVERSIDADE
OS CENTROS DE DIVERSIFICAÇÃO
No início do século XX, o geógrafo e geneticista russo Nikolai I. Vavilov organizou mais de 100
expedições que percorreram 64 países, coletando sementes, grãos, tubérculos etc. Nessas viagens, ele
observou que a diversidade das variedades cultivadas era muito maior em algumas áreas que em
outras. Essas áreas geográficas seriam os centros de origem dessas variedades.
Na Cordilheira dos Andes, existem mais de 1.000 variedades de batata, cada uma delas identificada
com um nome pela população local. Para Vavilov, isso revelaria que a região andina seria seu centro
de origem e de diversificação. A partir de observações análogas, ele localizou seis a oito centros
geográficos onde, presumivelmente, teria-se originado a agricultura (Tabela 12.3).
Vavilov não chegou a completar sua obra. Encarcerado por defender o conceito mendeliano da
herança, faleceu na prisão de Saratov, em 1943. Como comentado anteriormente, a genética foi
considerada uma teoria reacionária e burguesa, na antiga União de Repúblicas Socialistas Soviéticas
(URSS), entre 1929 e 1964.
A teoria de Vavilov foi extremamente fecunda para os estudos evolutivos das plantas cultivadas e,
consequentemente, para a conservação da biodiversidade. Admite-se hoje que a diversidade das
plantas cultivadas e silvestres, bem maior em alguns pontos geográficos, indica que alguns biomas
foram mais propícios que outros para o nascimento de práticas agrícolas.
Atualmente, sabe-se que os centros origem nem sempre coincidem com os centros de diversidade,
porque as migrações humanas geraram centros de diversidade secundária em que, respondendo às
práticas agrícolas e à pressão do ambiente, as espécies se diversificaram, tornando-se tolerantes às
condições ambientais e resistentes às doenças locais.
A CONSERVAÇÃO DA BIODIVERSIDADE
Uma das consequências do processo evolutivo é a extinção de espécies: o número de espécies vivas
não chega a 1% das que, alguma vez, povoaram a Terra. Mais que a aparição e desaparição das
espécies, o que preocupa é a velocidade com que isso está acontecendo, porque configura uma
extinção em massa, causada pelo homem.
-------------TABELA 12.3. Os centros de diversificação e os cultivos originários
REGIÃO
CULTIVOS
América Central e do Norte
Milho, amaranto, feijão, batata-doce, mandioca, algodão, sisal, papaia, abacate, goiaba,
pimenta, abóbora, tomate, baunilha, cacau, girassol, morango, noz pecã, tabaco etc.
América do Sul
Amaranto, amendoim, feijão, lupino, batata, mandioca, amendoim, algodão, caju, frutade-conde, abacaxi, papaia, abacate, morango, pimentão, abóbora, coca, mate, borracha
etc.
Índia e Sudeste asiático
Limão, pepino, arroz, melão, manga, cana-de-açúcar, algodão, cânhamo, coco, arroz, frutapão, laranja, tangerina, banana, plátano, noz-moscada, berinjela etc.
China
Soja, colza, lichia, pera, pêssego, repolho, chá, gengibre, ginseng, cânfora etc.
África (Etiópia)
Café, melão, melancia, inhame, sorgo etc.
Ásia menor
Alfafa, trigo, aveia, centeio, cevada, rabanete, cenoura, ervilha, grão-de-bico, lentilha,
azeitona, figo, amêndoa, vinha, maçã, beterraba, alho, cebola, açafrão, papoula, alcaçuz
etc.
157
http://bteduc.com
Consideremos, por exemplo, o caso da Mata Atlântica brasileira, cuja biodiversidade é maior que a da
Amazônia. A devastação é tal que só restam pedaços da floresta original, e sua conservação depende
da manutenção de corredores entre os diversos fragmentos.
Preservar a biodiversidade e os recursos genéticos é muito mais que salvá-los da extinção, significa
conservar suficiente diversidade dentro de cada espécie, de forma a garantir que seu potencial
genético possa ser usado no futuro.
Todas as variedades cultivadas atualmente têm incorporados genes de variedades selvagens, ou
dos estoques genéticos, conservados pelos povos que praticam uma agricultura tradicional. A
produção comercial do tomate, por exemplo, seria impossível sem a contribuição de genes silvestres
de América Latina. Graças aos trigos selvagens, dispomos de variedades resistentes aos fungos, à seca,
ao calor ou ao frio. A resistência a quatro doenças do arroz cultivado atualmente deve-se a uma única
variedade, encontrada na Índia central.
A CONSERVAÇÃO IN SITU
A biodiversidade pode ser conservada in situ, mediante a proteção ambiental de uma determinada
região. Além de manter a dinâmica evolutiva das espécies, nas Unidades de Conservação Ambiental
devem-se contemplar as necessidades da população local, criando reservas de desenvolvimento
sustentável (Mamirauá, Brasil; Slan K’an, México). Na Costa Rica, uma lei de 1996 compensa aqueles
que conservem, ou aumentem, a área de floresta dentro de suas propriedades.
Algumas iniciativas interessantes para a proteção da biodiversidade envolvem o rastreamento por
satélite (baleias, lontras) e o uso de aplicativos para telefones celulares, que facilitam o monitoramento
da fauna silvestre (SISSGEO, Centro de informação em Saúde Silvestre, Fiocruz).
Uma nova tendência é o retorno da vida selvagem, mediante a reintrodução de animais como o
urso, nos Pirineus, ou o lobo, nas florestas europeias. Projetos mais arrojados contemplam a criação
de comunidades de grandes mamíferos. Em Oostvaarderplassen (Países Baixos), o objetivo é
reconstituir, sem intervenção humana, a paisagem original da região. Os animais extintos foram
substituídos por outros que lhes são aparentados. Em vez do auroque, que desapareceu em 1627,
introduziu-se o auroque de Heck, criado em 1920 por cruzamento entre as mais antigas raças de
bovinos europeus. O pônei Konik da Polônia ocupa o lugar do tarpan, um cavalo selvagem extinto.
A ideia é controvertida porque, inevitavelmente, o ecossistema reconstituído será diferente do
padrão antigo e, também, porque os defensores dos direitos dos animais consideram uma crueldade
o abandono dos animais a seu destino. Um projeto análogo procura recriar as estepes da tundra,
anteriores à última era glacial (Parque Pleistocênico, Rússia).
Outra tendência é o uso da biotecnologia moderna para salvar espécies ameaçadas, como os
rinocerontes, mortos por caçadores inescrupulosos para extrair e vender os chifres, como troféu ou
como medicamento. Uma empresa norte-americana transferiu a uma levedura um gene capaz de
sintetizar queratina de rinoceronte que, misturada ao DNA do animal, seria utilizada para fabricar
chifres artificiais. Outra empresa, envolvida na conservação dos rinocerontes, injeta no chifre do
animal anestesiado um corante azul que pode causar vômitos e diarreias, de modo a impedir seu uso
como ornamento ou medicamento.
A CONSERVAÇÃO EX SITU
Os anfíbios enfrentam sérios riscos de extinção em massa, devido à perda de habitats e a uma doença
causada pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis, nativo de África do Sul, onde vive em forma
simbiótica com a rã de unhas africana (Xenopus laevis). Na década de 1930, essa rã fora distribuída no
mundo inteiro, para a realização de testes de gravidez. Embora a doença possa ser tratada facilmente
158
em cativeiro, o mesmo não ocorre na natureza. Até o momento, a conservação dos anuros depende
da manutenção e cuidado das espécies em jardins zoológicos.
Diferentemente dos tradicionais, os jardins zoológicos modernos recriam os habitats naturais dos
animais, sem jaulas (San Diego Zoo, California). Esses jardins cumprem um rol importante na
preservação das espécies ameaçadas, mantendo instalações de criopreservação (Frozen Zoo) e
coleções de DNA, esperma, ovos, embriões e tecidos vivos.
O progresso tecnológico permite o sequenciamento de animais extintos, como os dois mamutes
(Mammuthus primigenius) congelados no permafrost da Sibéria, 60 mil e 20 mil anos atrás. Uma vez
descartadas as sequências de microrganismos que contaminaram os fósseis, a comparação com o
genoma do elefante africano atual permitirá entender as principais mudanças evolutivas e, talvez, a
causa de sua extinção.
Contudo, a expectativa de clonar um mamute resulta um tanto fantasiosa, lembrando-nos do livro
de M. Crichton, “Parque dos dinossauros”. Para recriar o mamute, seria necessário complementar as
partes do genoma faltantes com sequências de elefante africano; substituir, em um zigoto, o genoma
do elefante africano pelo do mamute; inseminar artificialmente uma fêmea de elefante africano e
aguardar dois anos até a cria nascer. Esta seria, provavelmente, muito parecida ao mamute, mas qual
seria o destino desses animais?
A conservação ex situ de plantas envolve a coleta de amostras representativas de uma população
e sua manutenção em bancos de germoplasma e/ou jardins botânicos, na forma de sementes, estacas,
plantas inteiras etc.
A criopreservação é aplicada, especialmente, às plantas cultivadas que se reproduzem por
sementes. Estas podem ser conservadas, no frio, durante longos períodos de tempo (20 a 30 anos a
50C; um século a -180C-200C). Periodicamente, algumas sementes serão germinadas para retirar, das
plantas que frutifiquem, a geração seguinte de sementes frescas e substituir as antigas nas câmaras
frias.
A criopreservação tem a vantagem de manter o material em um espaço reduzido e com cuidados
extremos. Porém, devido às limitações no tamanho das amostras e aos custos de manutenção, nem
sempre o sistema consegue conservar os recursos fitogenéticos. Um exemplo é a coleção da Estação
Experimental Vavilov (São Petersburgo, Rússia), que sobreviveu à Segunda Guerra Mundial e
atualmente enfrenta grandes dificuldades econômicas.
As técnicas de cultura de tecidos permitem conservar muitas das plantas que não resistem à
dessecação (coco, cacau, cítricos, café, dendê, borracha e 70% das árvores das florestas tropicais) e,
também, as plantas de multiplicação vegetativa (raízes, como a mandioca, tubérculos como a batata,
banana, cana-de-açúcar).
A incorporação da tecnologia do DNA e dos estudos genômicos facilita os estudos de diversidade
genética; a disponibilidade dos dados no domínio público abre perspectivas novas de conservação.
Existem hoje mais de 1.400 bancos de genes e de germoplasma, com mais de 6.000.000 de amostras.
Os principais se encontram nos Estados Unidos, na China, na Alemanha e no Brasil (Embrapa). Na
Noruega, a 1.000 km do Polo Norte, um lugar considerado a salvo de mudanças climáticas, desastres
naturais e guerras, criou-se recentemente o banco de sementes de Svalbard, com capacidade para
armazenar 4,5 milhões de amostras, cada uma com 500 sementes.
Devido à localização geográfica dos centros de origem e de diversificação, é preocupante a
multiplicação recente dos conflitos bélicos (Afeganistão, Iraque, Síria), que afetam a população local e
comprometem seu futuro, ao devastar a Ásia Menor, uma região de grande biodiversidade e riqueza
genética.
Os bancos de germoplasma podem, também, ajudar a restaurar uma agricultura devastada por
conflitos bélicos. Em Ruanda, um país em que 90% das pessoas dependiam da agricultura e onde eram
conhecidas 600 variedades de feijão, o conflito bélico entre etnias rivais causou, em 1994, a morte de
159
http://bteduc.com
800.000 pessoas e a migração forçada de dois milhões de pessoas. Durante esse período, organizações
internacionais conservaram, em bancos de germoplasma, as sementes essenciais para a reconstrução
do país.
A LEGISLAÇÃO VIGENTE
Aprovada por 175 países, a Convenção sobre Diversidade Biológica (1992) reconhece a soberania
nacional sobre a biodiversidade, estabelece a repartição de bebefícios decorrentes do uso dos recursos
genéticos e reconhece os direitos das comunidades locais e indígenas sobre seus conhecimentos.
No Brasil, a proteção da biodiversidade está regida pela Lei nº 13.123/2015 que determina as regras
para acesso ao patrimônio genético e ao conhecimento tradicional associado, assim como a repartição
de benefícios.
O CGIAR E O CENTRO INTERNACIONAL DA BATATA
Uma das organizações dedicadas à conservação da biodiversidade e ao desenvolvimento agrícola dos
países em desenvolvimento é a Future Harvest, uma iniciativa com 16 centros localizados em diversos
lugares, porém mantendo uma estrutura descentralizada que favorece a difusão das informações. Os
centros são mantidos pelos governos de 165 países, fundações privadas e organizações internacionais
e regionais que integram o Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR), apoiado
pela Food and Agriculture Organization (FAO). Os centros do CGIAR na América Latina são: o Centro
Internacional para el Mejoramiento del Maíz y el Trigo (CIMMYT) no México, o Centro Internacional de
la Papa (CIP) no Peru e o Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) na Colômbia.
A batata é originária da região andina. No século XVI chegou à Europa onde, depois de vencer a
resistência da população, transformou-se em um dos poucos alimentos consumidos pela população
mais pobre. Quando, em meados do século XIX, o fungo Phytophtora infestans infectou as batatas,
desencadeou-se na Irlanda um terrível período de fome, que causou a morte de um milhão de pessoas
e a emigração de boa parte da população.
Hoje, a batata é o quarto cultivo mais importante do mundo, com uma produção anual de 300
milhões de toneladas. Em muitos países, a população depende de batata e de outros tubérculos
(batata-doce) para sua alimentação, por serem relativamente ricos em energia e nutrientes.
O Centro Internacional da Papa (CIP) preserva a batata (Solanum tuberosum), a batata-doce
(Ipomoea batatas) e nove tubérculos ou raízes andinas (Oca, Ulluco, Mashua, Arracacha, Yacon, Achira,
Ahipa, Maca, Mauka). O banco de germoplasma de batata inclui amostras de uma centena de espécies
selvagens, coletadas em 8 países de América Latina, além das variedades cultivadas tradicionalmente
pela população andina.
Entre os objetivos do CIP se encontra o melhoramento da qualidade nutricional, da resistência a
doenças e a condições climáticas adversas, como a seca e a geada. O centro utiliza a biotecnologia para
criar formas adaptadas às condições locais e distribui as variedades tradicionais e melhoradas sob a
forma de sementes, tubérculos ou vitroplantas. Atualmente também estimula as utilizações comerciais
das variedades autóctones: distribuição em pacotes (t’ikapapa), elaboração de chips ou hojuelas a
partir de rodelas com um visual variado.
O PROTOCOLO DE CARTAGENA DE BIOSSEGURANÇA
Vigorando desde setembro de 2003, o Protocolo de Cartagena de Biossegurança suplementa a
Convenção sobre a Diversidade Biológica. O acordo contempla o risco potencial decorrente do
transporte e do manuseio de todos os organismos vivos modificados (OVMs) que possam ter um efeito
160
adverso na conservação e no uso sustentável da diversidade, levando em consideração os riscos para
a saúde humana.
Frente à apreensão suscitada pelo trânsito e movimento dos organismos transgênicos através de
fronteiras, os países membros determinaram que a expressão pode conter OGMs identifique toda
carga proveniente de lavouras transgênicas destinada à alimentação, ração ou processamento.
O Protocolo não cobre os produtos derivados dos transgênicos (como, por exemplo, papel
produzido a partir de árvores transgênicas) nem os transgênicos produtores de fármacos, que são
regulados por outras organizações.
Mediante o Protocolo de Cartagena se estabelece a cooperação internacional, a fim de ajudar os países
em desenvolvimento a utilizar a biotecnologia com segurança e a regulá-la eficientemente. Os
governos membros se propõem a promover o fluxo de informações e a transferência de tecnologia,
conhecimentos e recursos, mediante o treinamento científico e técnico correspondente.
161
C A P Í T U L O 13
BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA
A EVOLUÇÃO DAS PRÁTICAS AGRÍCOLAS
Embora as práticas agrícolas e as plantas cultivadas tenham-se desenvolvido em um curto período da
história evolutiva dos vegetais, as plantas cultivadas atualmente são o resultado de milhares de anos
de seleção artificial pela mão do homem e guardam muito pouca semelhança com suas ancestrais
selvagens (Figura 13.1).
Na Europa, o uso de ferramentas rudimentares prevaleceu até a Idade Média, quando, em função
de várias inovações, as práticas agrícolas se tornaram mais eficientes. Datam desse período o
aproveitamento da força de tração animal, a invenção dos moinhos, a prática de descanso dos solos e
a construção de sistemas de irrigação.
No século XVIII, a integração das atividades agrícolas e a criação de animais originou uma nova
agricultura que, além de envolver a utilização de esterco como fertilizante, promoveu a rotação entre
os cultivos de gramíneas, leguminosas e plantas forrageiras.
A incidência do progresso científico e tecnológico caracteriza a agricultura do século XIX,
destacando-se a preocupação com as necessidades nutricionais das plantas e com as doenças que
afetavam os cultivos e as criações (antraz das ovelhas, cólera das aves, doenças do bicho-da-seda etc.).
Originadas por cruzamentos seletivos, novas variedades e híbridos de trigo foram comercializadas
internacionalmente, a partir de 1850. Com a invenção da máquina a vapor e as primeiras utilizações
da eletricidade, iniciou-se a mecanização do campo.
No início do século XX, o uso do trator se espalhou rapidamente. A substituição da tração animal
pela maquinaria agrícola diminuiu a necessidade de produzir rações, liberando para outros cultivos a
superfície anteriormente dedicada à produção de feno e aveia. Com o redescobrimento das leis de
Mendel e a teoria cromossômica da herança, iniciou-se uma nova era no melhoramento de vegetais e
animais.
O cruzamento entre duas linhagens puras de milho origina um híbrido semelhante às linhagens
parentais, mas com qualidades superiores. Esta propriedade, denominada heterose ou vigor híbrido,
permite a geração de plantas mais produtivas, suficientemente homogêneas para facilitar a colheita
mecânica (Figura 13.2). As primeiras empresas comerciais a explorar a heterose do milho surgiram, a
partir de 1920, nos Estados Unidos e no Canadá (Hi-Bred Corn Company, mais tarde Pioneer Hi-Bred).
Essas empresas selecionavam as linhagens parentais de milho, procediam aos cruzamentos
correspondentes e vendiam as sementes híbridas ao agricultor. A perda do efeito da heterose diminui
a produtividade da descendência das plantas híbridas, de modo que o agricultor passou a comprar as
sementes
Em 1960, o milho híbrido era cultivado, com raras exceções, em todas as plantações dos Estados
Unidos e do Canadá. O melhoramento das plantas já não dependia daqueles que estavam diretamente
envolvidos em seu cultivo, mas daqueles que produziam as sementes.
Na década de 1960, o desenvolvimento de uma variedade de trigo de alto rendimento e resistente
a doenças permitiu aumentar a quantidade de alimentos disponíveis, salvando da fome mais de 1
bilhão de pessoas. Por ser o artífice da “revolução verde”, uma contribuição fundamental para a paz
mundial, o engenheiro agrônomo Norman Borlaug recebeu o Prêmio Nobel da Paz (1970).
A “revolução verde” duplicou a produtividade dos cereais mediante o desenvolvimento e cultivo de
variedades melhoradas geneticamente, complementados por práticas agrícolas complexas (irrigação,
mecanização, aplicação de fertilizantes e pesticidas). Porém, trouxe problemas ambientais, sociais e
de saúde, devido à necessidade de grandes investimentos de capital para a mecanização e à aplicação
de produtos químicos, que foram usados em quantidades excessivas.
-------------FIGURA 13.1. O milho
O milho de 5.000 a 7.000 anos atrás era bem menor do que o que
conhecemos atualmente. O cruzamento acidental com o teosinto, uma
erva que ainda existe na natureza, teria dado origem ao milho moderno,
que passou por várias modificações até se estender pela América précolombiana. Diversas variedades de milho persistem até hoje no
continente.
www.learner.org/courses/essential/life/session5/closer1.html
FIGURA 13.2. A produção de milho híbrido
A hibridização permite obter híbridos simples, a partir de duas linhagens, e híbridos duplos, a partir de quatro linhagens.
Existem híbridos múltiplos construídos a partir de pelo menos cinco linhagens.
Linhagem A
Linhagem B
Linhagem (AxB)
Linhagem (AxB)x(CXD)
(Planta de milho híbrido)
Colheita
Linhagem C
Linhagem D
Linhagem (CxD)
163
http://bteduc.com
Em alguns países, os pequenos agricultores não chegaram a usufruir a “revolução verde”. Se, desde
1960, a produção de cereais aumentou em mais de 40% na Ásia e na América do Sul, na África diminuiu
13%.
Com a crise do petróleo da década de 1980, o setor de sementes agrícolas foi invadido por grandes
empresas transnacionais, produtoras de agrotóxicos e fertilizantes que, mediante um investimento
extraordinário de recursos em pesquisa e desenvolvimento, conseguiram introduzir as técnicas de
engenharia genética no melhoramento das sementes. Traspassando as barreiras interespecíficas,
obtiveram plantas mais produtivas ou com propriedades novas.
Comercializadas a partir de 1996, as principais plantas geneticamente modificadas (PGMs)
cultivadas atualmente são a soja, o milho, o algodão e uma variedade de colza denominada canola. Os
traços mais frequentes são a tolerância a herbicidas e/ou a resistência a pragas. Em relação aos
métodos tradicionais, as biotecnologias modernas inserem a tecnologia na semente.
Em 2015, dos 28 países que semearam cultivos biotecnológicos, 20 deles foram países em
desenvolvimento. Produtores de América Latina, Ásia e África cultivaram 54% da área global plantada
com PGM.
A OBTENÇÃO DE NOVAS VARIEDADES
MUTAÇÃO GÊNICA E SELEÇÃO
O melhoramento clássico está baseado na reprodução seletiva entre indivíduos de uma mesma
espécie. A variação intraespecífica é limitada, mas alguns agentes físicos e químicos podem induzir
mutações aleatórias. No caso de aparecer algum mutante interessante, será cruzado por várias
gerações com um dos tipos parentais, até que este incorpore, por introgressão gênica, as
características desejadas.
Esse processo de mutação e seleção demora de cinco a quinze anos e, quando finalizado, o gene
selecionado pode estar acompanhado por outros não desejáveis. Duas variedades comerciais de
batata (Lenape, 1960; Magnum bonum, 1990), obtidas por este método, tiveram que ser retiradas do
mercado devido ao alto conteúdo de alcaloides, característico das plantas selvagens.
O progresso alcançado na indução de mutações (TILLING, do inglês Targeting induced local lesions
in genomes) e na seleção assistida por marcadores moleculares facilita a obtenção de novas variedades
(batata Amflora, BASF). A genômica também trouxe avanços notáveis, como a identificação de 40
genes de resistência a patógenos no tomate, que foram reunidos em um genótipo único. Contudo, em
ambos os casos, a variação se deve a genes pertencentes à mesma espécie.
ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CROMOSSOMOS
A multiplicação do número de cromossomos (poliploidia) é um fenômeno que acontece
espontaneamente nos vegetais, seja por não disjunção dos cromossomos ou por uma falha da
citocinese durante a divisão celular. Ao longo do processo evolutivo, duplicações dos lotes
cromossômicos originais (autopoliploidia) ocorreram em várias das espécies cultivadas atualmente,
tais como a batata ou a cana-de-açúcar.
A multiplicação dos lotes cromossômicos pode ocorrer em híbridos interespecíficos, pouco férteis
ou estéreis, restaurando a fertilidade e gerando uma nova espécie, diferente de ambas as linhagens
parentais. Este mecanismo (alopoliploidia) deu origem a plantas como o trigo, a colza, a aveia, o
tabaco, o algodão, o café etc.
A descoberta da colchicina (1935), uma substância que interfere com a formação dos fusos
mitóticos, permitiu a criação de novas espécies poliploides. A hibridização do trigo e do centeio,
164
seguida de uma duplicação cromossômica, originou o triticale, uma planta que reúne a qualidade do
grão do primeiro e a rusticidade do segundo.
Outra forma de alteração do número de cromossomos é a cultura de anteras, para a obtenção de
plantas haploides. Essa tecnologia permite identificar mutantes recessivos e obter rapidamente
variedades diferentes por hibridização ou duplicação cromossômica.
ENGENHARIA GENÉTICA
À medida que a distância entre as espécies aumenta, os cruzamentos se tornam cada vez mais difíceis
e a transferência dos genes pode exigir o uso de técnicas complexas, como a fusão de protoplastos e
o cultivo de embriões. Quando os recursos genéticos provêm de outros organismos distantes na escala
evolutiva (plantas, microrganismos ou animais), sua transferência só é possível por engenharia
genética.
Qual a diferença entre uma planta obtida por cruzamento seletivo e outra por engenharia genética?
Na primeira, genes da mesma espécie ou de uma espécie muito próxima são introduzidos
aleatoriamente. Na segunda, incorpora-se diretamente uma construção gênica, proveniente da
mesma espécie (construção cisgênica) ou de uma espécie distante (construção transgênica). Trata-se
de uma tecnologia poderosa demais para ser negligenciada.
NO LABORATÓRIO
A construção de uma planta geneticamente modificada (PGM) começa com o isolamento e
caracterização do gene de interesse (transgene) e a construção de uma estrutura genética complexa,
que inclui um gene promotor e um gene marcador. O primeiro possibilita a transcrição do transgene,
determinando se este irá se expressar em todas as células ou somente em alguns tecidos. O segundo
permite selecionar as células transformadas.
A construção genética é transferida às células receptoras por algum dos métodos disponíveis
(eletroporação, biolística ou uso de vetores, como o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens). As
células transformadas são recuperadas, procedendo-se à regeneração das plantas mediante técnicas
de cultura in vitro. Mediante técnicas bioquímicas e/ou acompanhamento de marcadores moleculares
(polimorfismos na molécula de DNA, repetição de sequências), constata-se a transferência gênica e
outros aspectos que podem influir na expressão gênica, como o número de cópias e o lugar em que
estas se integraram ao genoma.
O trabalho laboratorial é realizado com plantas cujo genótipo favoreça a transformação e a
regeneração da planta transformada, geralmente pouco vantajosas do ponto de vista agronômico.
Considera-se alcançado o sucesso quando o transgene se expressa no lugar correspondente e com um
adequado nível de atividade, restando por verificar a estabilidade da expressão gênica e o seu valor
agronômico.
AS ETAPAS POSTERIORES
Acabada a etapa de laboratório, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetação, para
selecionar as plantas-mãe das quais procederão várias gerações de retrocruzamentos seletivos com
alguma das linhagens elite, visando a obtenção de uma linhagem transgênica de alto rendimento,
adaptada a um contexto específico. O resultado é uma variedade ou cultivar que expressa o traço
codificado pelo transgene e apresenta um potencial de produtividade parecido ao da linhagem elite.
Conceitualmente, a metodologia seguida depois da transformação mantém semelhança com à do
melhoramento tradicional, mas o processo é acelerado pela utilização de técnicas de cultura in vitro e
de marcadores moleculares na caracterização da progênie.
165
http://bteduc.com
Uma vez obtida a nova variedade de PGM, dá-se início à liberação planejada no meio ambiente, que
abrange o cultivo em experimentos protegidos e testes de campo realizados em diferente escala, até
a nova variedade estar pronta para o seu cultivo comercial. A liberação do cultivo dependerá da
autorização da legislação local, geralmente bastante restrita a esse respeito (Figura 13.3).
No Brasil, esta autorização é dada pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio),
definida pela Lei de Biossegurança como o órgão multidisciplinar responsável pelo controle dessa
tecnologia no país (Lei 11.105/2005, Política de desenvolvimento da Biotecnologia; Decreto
6.041/2007).
A BIOSSEGURANÇA E O PRINCÍPIO DE PRECAUÇÃO
Poucas tecnologias suscitaram tanta polêmica como a introdução das PGMs na agricultura, uma
questão que não pode ser tratada levianamente. Além de conhecimentos e tempo, a construção de
uma planta transgênica exige o consenso das numerosas pessoas que participam no processo e a
aprovação da autoridade correspondente.
-------------FIGURA 13.3. As etapas da construção de uma planta transgênica
Duração do processo: 10 a 15 anos.
Transformação
Regeneração das plantas transformadas
Caracterização molecular e bioquímica
Avaliação do valor agronômico
(Casa de vegetação, campo)
Introgressão em uma linhagem comercial de elite
Linhagem-mãe
Linhagem comercial de elite
Retrocruzamentos
Obtenção da variedade geneticamente modificada
Experimentos protegidos e testes de campo, em pequena e grande escala
Autorização das autoridades locais, de acordo com a legislação vigente
Liberação do cultivo para sua exploração comercial
166
Ainda hoje, parte da opinião pública considera que as PGMs não deveriam ter sido introduzidas no
ambiente, nem utilizadas para o consumo humano, até não ser demonstrada a ausência de qualquer
risco. A exigência apoia-se no princípio de precaução, um princípio que pode ser entendido de diversas
maneiras.
Podemos dizer, de maneira simplista, que “havendo a possibilidade de algo ruim me acontecer na
rua, melhor ficar em casa”, ou que “havendo a possibilidade de algo ruim me acontecer na rua, ao sair
de casa é bom ter cuidado e prestar atenção no sinal, nos carros, nas bicicletas que circulam na
contramão e, também, no bandido”. Note-se que a decisão de “não sair de casa” também envolve
riscos, tais como escorregar e levar um tombo no banheiro, queimar-se ao acender o fogão ou receber
um vírus via Internet. Não existe risco zero, toda ação apresenta riscos que devem ser analisados para
ser posteriormente gerenciados.
No Brasil, o cultivo de plantas transgênicas é regido pela Lei de Biossegurança, que estabelece a
observância do princípio da precaução para a proteção do meio ambiente. O Princípio 15 da Declaração
do Rio de Janeiro sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável (1992) diz o seguinte: “De
modo a proteger o meio ambiente, o princípio da precaução deve ser amplamente observado pelos
Estados, de acordo com as suas capacidades. Quando houver ameaça de danos sérios ou irreversíveis,
a ausência de absoluta certeza científica não deve ser utilizada como razão para postergar medidas
eficazes e economicamente viáveis para prevenir a degradação ambiental”.
Diferente da prevenção, que trata de riscos conhecidos, a precaução contempla riscos potenciais
que demandam uma avaliação detalhada. Mesmo havendo incertezas ou falta de unanimidade entre
os expertos, o princípio de precaução não justifica a falta de ações concretas para a proteção do meio
ambiente.
Por outro lado, o Princípio 10 da mesma declaração nos diz que: “A melhor maneira de tratar
questões ambientais é assegurar a participação, no nível apropriado, de todos os cidadãos
interessados. No nível nacional, cada indivíduo deve ter acesso adequado a informações relativas ao
meio ambiente de que disponham autoridades públicas, inclusive informações sobre materiais e
atividades perigosas em suas comunidades, bem como a oportunidade de participar em processos de
tomada de decisões. Os Estados devem facilitar e estimular a conscientização e a participação pública,
colocando a informação à disposição de todos. Deve ser propiciado acesso efetivo a mecanismos
judiciais e administrativos, inclusive no que diz respeito à compensação e reparação de danos”.
Vários pontos merecem ser destacados: admite-se a incerteza e a falta de unanimidade entre os
expertos, afirma-se o direito de todos à informação e pede-se a participação, no nível apropriado, de
todos os cidadãos interessados. A responsabilidade pela tomada de decisões não será exclusivamente
de um grupo de indivíduos, sejam estes cientistas, administradores, empresários, políticos ou
comunicadores. Terá que ser democraticamente assumida por um grupo heterogêneo que represente
os interesses da sociedade, mesmo tendo que abrir as portas ao marketing, aos lobbies e à pressão
dos grupos políticos, ambientalistas ou não.
Considerado por alguns grupos de opinião como um dos alicerces do desenvolvimento sustentável
e uma proteção contra o controle da tecnologia pelas grandes empresas, o princípio de precaução
também é visto por outros como um obstáculo ao progresso e uma tentativa de protecionismo.
A formalização do princípio mediante uma estrutura jurídica, como a Lei de Biossegurança, assim
como o estabelecimento de normas, regras e procedimentos claros, é a melhor maneira de gerenciar
o desenvolvimento tecnológico, minimizando os riscos correspondentes.
167
http://bteduc.com
AS PGMs DE INTERESSE AGRONÔMICO
As PGMs atuais apresentam traços, inseridos como transgenes, que visam modificar suas propriedades
agronômicas e/ou melhorar suas qualidades nutricionais, industriais ou ambientais.
Poderiam escapar dos limites do plantio e suplantar as plantas silvestres, tornando-se invasoras?
Existe o precedente de plantas ornamentais se transformarem em pragas quando introduzidas,
inadvertidamente, em um ambiente novo: a lantana prolifera descontroladamente na Austrália; o
kudzu, procedente do Japão, se espalha no sul dos Estados Unidos; e o rododendro, originário da
Península Ibérica, se multiplica na Inglaterra.
Além da degradação ambiental devida ao desmatamento, à jardinagem ou à agricultura, para que
o cenário se repetisse seriam necessárias várias características hereditárias, que são sistematicamente
eliminadas como fatores indesejáveis nas plantas cultivadas: dormência da semente, plasticidade
fenotípica, crescimento indeterminado, florescimento e produção contínua de sementes etc.
Com o objetivo de reduzir o risco futuro de introduzir um gene que transforme uma planta normal
em praga, a FAO (Food and Agriculture Organization) estabeleceu uma série de diretrizes, cumpridas
em 130 países, que se aplicam também a insetos, bactérias e fungos. Nenhum dos cultivos
biotecnológicos disponíveis no mercado mostrou-se persistente ou invasor nos testes prévios a sua
comercialização ou no monitoramento posterior.
Diante da necessidade de mitigar os efeitos das mudanças climáticas, espera-se que em um futuro
próximo sejam desenvolvidas plantas mais eficientes no uso do nitrogênio e tolerantes à salinidade. A
maior produtividade dos cultivos também é necessária para conseguir mais alimentos sem aumentar
a área plantada e, também, porque plantas de uso industrial podem ser exportadas, gerando divisas.
Os principais cultivos comercializados atualmente, conforme já dito, são a soja, o milho, o algodão
e uma variedade de colza denominada canola. As propriedades agronômicas modificadas são a
tolerância a herbicidas, a resistência a insetos, a resistência a vírus, o conteúdo e a qualidade do óleo,
a tolerância à seca etc.
A TOLERÂNCIA A HERBICIDAS
A LUTA CONTRA AS ERVAS DANINHAS
O crescimento das ervas daninhas no campo é prejudicial por dois motivos: competem pelos mesmos
nutrientes e contaminam a colheita. Para eliminá-las, o agricultor pode aplicar herbicida antes do
plantio, uma prática que demanda o revolvimento prévio do solo, acelerando a erosão. Contudo, se
uma planta for tolerante a um herbicida de amplo espectro, bastará semeá-la diretamente e aplicar o
herbicida depois da germinação, para eliminar as ervas daninhas.
Os cultivos tolerantes a herbicidas facilitam o plantio direto, um sistema no qual as sementes e os
fertilizantes são depositados em sulcos, reduzindo a erosão e a demanda de combustível. Em vários
países, comercializam-se sementes transgênicas de soja, de milho, de algodão e de canola tolerantes
a herbicidas.
O herbicida não seletivo mais utilizado é o glifosato, presente em vários produtos comerciais, tais
como Roundup®, Buccaneer®, Rodeo®, Accord® etc. Sua ação inibitória se aplica a sistemas
enzimáticos dos vegetais, ausentes em animais e seres humanos. Considerado pouco tóxico em caso
de exposição oral ou de inalação, o glifosato é degradado rapidamente no ambiente.
As sementes de plantas tolerantes ao glifosato são comercializadas com o nome de
RoundupReady® (RR, Monsanto). As vendas geminadas de sementes e herbicida encerraram-se no ano
2000, com o vencimento da patente do Roundup® e o aparecimento no mercado de outras variações
do produto, mais econômicas para o agricultor.
168
Outro herbicida utilizado é o glufosinato, presente em outro grupo de produtos (Basta®, Liberty®,
Ignite® etc.). As sementes tolerantes ao glufosinato são comercializadas com o nome LibertyLink por
BayerCropScience.
Glifosato e glufosinato não são os únicos herbicidas no mercado. Existem outras substâncias, do
grupo das imidazolinonas, cuja tolerância tem sido transferida à soja Cultivance®, um
empreendimento conjunto da Embrapa e da Basf.
O GLIFOSATO
No Brasil, o glifosato não está limitado exclusivamente à agricultura, sendo utilizado, desde 1978, em
áreas urbanas e na manutenção de estradas e ferrovias, sem evidências de impactos no meio
ambiente.
Em 2015, o IARC (do inglês, International Agency on Research on Cancer), uma extensão
semiautônoma da Organização Mundial da Saúde, reclassificou o glifosato como provável agente
carcinogênico, no grupo 2 A. Esta categoria inclui, além do malation e da acrilamida, o chimarrão
quente, a malária, a carne vermelha, a disrupção dos ritmos circadianos e as emissões de frituras em
alta temperatura.
Das quatro agências encarregadas de avaliar o glifosato, o IARC foi a única a encontrar essa
associação. Outras agências manifestaram seu desacordo e questionaram a reclassificação. Nos
Estados Unidos, a EPA (do inglês, Environmental Protection Agency) continua classificando o glifosato
na categoria E, que reúne substâncias que apresentam “evidências de ausência de carcinogenicidade
em seres humanos”. Na União Europeia, a EFSA (do inglês, European Food Safety Agency) considera
improvável que o glifosato represente um risco para os seres humanos e não justifica sua classificação
como agente carcinogênico potencial.
A APARIÇÃO DE PLANTAS SILVESTRES RESISTENTES AO GLIFOSATO
Ao diminuir a aplicação dos agroquímicos tradicionais, os cultivos biotecnológicos favorecem a
conservação dos recursos ambientais. Sua vantagem sobre as plantas silvestres depende da presença
de um agente seletivo como, por exemplo, um herbicida ao qual elas sejam tolerantes. Sem o
herbicida, ou fora de seu alcance, as PGMs não têm nenhuma vantagem sobre as plantas silvestres
nem conseguem competir com elas em ambientes naturais.
Contudo, o fluxo gênico em sentido contrário é preocupante, porque, tornando-se tolerantes a
herbicidas, as plantas silvestres podem competir no terreno com as plantas cultivadas e comportar-se
como ervas daninhas. Admite-se que a aparição de resistência em pelo menos 34 espécies poderia ter
sido causada pela transferência do gene correspondente, das plantas cultivadas às plantas silvestres.
No Brasil, há relatos sobre resistência ao glifosato no azevém (Lolium multiflorum) e na buva (Conyza
bonariensis e C. canadiensis). Por outro lado, algumas plantas são naturalmente resistentes ao
glifosato como, por exemplo, a trapoeraba (Commelina benghalensis).
A aparição de plantas resistentes ao glifosato, que é o herbicida mais utilizado no mundo, está
sendo acompanhada com atenção. Estima-se que, depois de 10 a 20 anos de uso intenso, seja
inevitável o aparecimento de plantas silvestres tolerantes. Contudo, o agricultor pode retardar a
aparição dessa tolerância, mediante algumas ações preventivas: rotar as culturas, evitar o uso repetido
do mesmo herbicida, aplicar as doses adequadas em condições meteorológicas propícias, acrescentar
outras modalidades de controle etc.
169
http://bteduc.com
A RESISTÊNCIA A INSETOS
A TRANSFERÊNCIA DA TOXINA Bt ÀS PLANTAS
Os insetos causam quebras de safra, estimadas em 20 a 40% da produção agrícola. Contudo, o combate
mediante o uso de agrotóxicos tem causado problemas no ambiente e na saúde humana, sendo,
portanto, necessário encontrar métodos alternativos de luta.
Há mais de 50 anos que os agricultores convencionais e orgânicos utilizam um inseticida biológico
para proteger suas colheitas. Trata-se da toxina produzida por um microrganismo do solo, o Bacillus
thuringiensis, inócua para o ser humano e fatal para os insetos. Uma vez ingerida pelas lagartas, a
toxina age no sistema digestório, matando-as em poucos dias. O produto comercial é vendido com os
nomes de Dipel®, Thuricida® ou Vectobac®.
Uma vez transferido o gene codificador da toxina do Bacillus thuringiensis às plantas, estas passam
a produzi-la diretamente. Existem diversas versões do gene Cry que codificam toxinas muito
específicas, efetivas em diferentes ordens de insetos. Algumas variedades (YieldGard®, Agrisure®)
diferem pela posição do transgene, o que caracteriza eventos diferentes e permite a comercialização
com nomes diferentes, como algodão Bollgard® e milho Yieldgard®, da Monsanto, ou milho Agrisure®,
da Syngenta.
As plantas Bt demandam menos pesticidas e reduzem as emissões de carbono, ao diminuir o uso
de combustível. Outra das vantagens das variedades Bt sobre as variedades convencionais está na
menor quantidade de micotoxinas (aflatoxina e fumonisina) perigosas para a saúde humana, em
função da menor contaminação por fungos dos ferimentos causados pelos insetos.
AS PRÁTICAS AGRONÔMICAS
Todo inseticida age como agente seletivo, sendo inevitável a aparição de insetos resistentes. A fim de
evitar ou retardar a aparição de larvas resistentes à toxina do Bacillus thuringiensis, uma possibilidade
é utilizar variedades Bt que produzam uma quantidade de toxina maior que a dose aplicada
habitualmente como inseticida.
Outra possibilidade mais sutil é o plantio de variedades convencionais (não Bt) em espaços
predeterminados onde os insetos não entram em contato com a toxina. Em vez de tentar eliminar o
inseto, diminui-se a infestação mediante uma pressão seletiva mais frouxa, que mantém a
sensibilidade ao inseticida em uma proporção considerável da população. Hoje, a manutenção de
refúgios nas lavouras de plantas Bt (algodão, milho) é uma prática bem estabelecida para o controle
de insetos.
O gerenciamento dos riscos envolve algumas medidas complementares que visam amortecer o
impacto eventual do fluxo gênico a outros cultivos. Um gene que confere tolerância a um herbicida
não será vantajoso em ausência do mesmo. Mas o que ocorreria se esse gene conferisse algum valor
adaptativo, tal como a produção de um inseticida?
O risco de polinização cruzada depende da espécie, sendo mais fácil de acontecer no milho, em que
o pólen se dispersa levado pelo vento, do que na soja ou no trigo, plantas com autofecundação. A
presença de espaços ou corredores de isolamento evita a disseminação de pólen transgênico para as
variedades silvestres e, também, para as convencionais semeadas nos campos vizinhos, evitando
prejuízos significativos para o agricultor que as comercializa.
O tamanho dos espaços ou corredores de isolamento depende das características reprodutivas da
espécie em questão e de fatores ambientais, como o vento. No caso do milho, por exemplo, estima-se
que o risco de polinização cruzada entre os cultivos diminui, de 1% a zero, quando a distância entre
ambos aumenta de 100 a 1.000 pés.
170
A VIDA SILVESTRE
A probabilidade de ocorrer fluxo gênico aumenta se houver, na proximidade, espécies silvestres
compatíveis. Por isso, devem-se extremar os cuidados em relação ao cultivo de plantas geneticamente
modificadas nos lugares onde existam variedades silvestres aparentadas, tais como a batata no Peru,
o milho no México, o arroz na Índia, a soja na Coreia e na China. No Brasil, onde existem variedades
silvestres do algodão, a CTNBio delimitou preventivamente zonas de exclusão para o cultivo de algodão
biotecnológico.
Em relação à vida silvestre, apesar do estardalhaço causado oportunamente pela notícia de que as
borboletas monarcas seriam afetadas pelo contato com pólen de plantas de milho Bt, os próprios
autores do estudo declararam que era uma experiência laboratorial, desenvolvida em condições
diferentes das de um ambiente natural.
A RESISTÊNCIA A VÍRUS
Assim como a vacinação, a resistência a vírus está baseada na transferência ao hospedeiro de uma
parte do genoma viral. A produção em excesso da proteína de revestimento viral, por exemplo, inibe
a síntese de seu material genético. Esta tecnologia foi utilizada para erradicar viroses da batata, da
beterraba, do pepino, do tomate, da couve-flor e do melão.
Os produtos hortícolas têm recebido menos atenção que os cereais e as leguminosas, em parte
devido à resistência do consumidor e, também, porque o custo da construção de uma planta
transgênica para cultivos com pequena produção não é interessante economicamente. Contudo, as
variedades de papaia resistente a vírus (UH Rainbow, UH SunUp), comercializadas nos Estados Unidos,
salvaram o estado do Havaí de um desastre econômico.
No Brasil, a CTNBio autorizou em 2011 o cultivo do feijão tolerante ao vírus do mosaico dourado,
desenvolvido pela Embrapa, por tecnologia do iRNA. O vírus é transmitido pela mosca branca Bemisia
tabaci e causa a perda de 40 a 85% da safra, uma quantidade de feijão que poderia alimentar entre 9
milhões a 18 milhões de pessoas adultas. Esse feijão deve ser comercializado a partir de 2016.
A COEXISTÊNCIA ENTRE PLANTAS CONVENCIONAIS E PGMs
Todos os sistemas agrícolas exercem algum impacto sobre o meio ambiente. No entanto, uma
agricultura sustentável pode minimizar os efeitos negativos da produção agrícola, restaurando a
fertilidade e limitando a erosão da terra.
Algumas práticas agrícolas já são compartilhadas pelas diversas modalidades agrícolas (orgânica,
industrial ou de precisão), incluindo a rotação de culturas, a adubação verde, o manejo de pragas e de
nutrientes, o plantio direto com uma cobertura na superfície do solo etc. Outras são específicas, como,
por exemplo, a proibição para os produtores orgânicos de utilizar sementes geneticamente
modificadas ou de cultivar terrenos onde previamente tenham sido plantadas PGMs.
Cultivos convencionais e biotecnológicos ocupam diferentes faixas de mercado e crescem em
função das oportunidades econômicas. A proporção de variedades convencionais e biotecnológicas
varia nos principais cultivos industriais, que são a soja, o algodão, o milho e a canola. No Brasil a CTNBio
exige um isolamento mínimo de 400 metros, ou de 40 dias, entre os plantios de milho GM e milho
convencional.
A contaminação de um cultivo convencional por um cultivo biotecnológico acarreta perdas
consideráveis para o produtor rural. Nos Estados Unidos, a contaminação de cultivos convencionais de
arroz e milho por cultivos geneticamente modificados custou 1 bilhão de dólares às empresas
produtoras de sementes.
171
http://bteduc.com
Medidas de proteção são tomadas, envolvendo o distanciamento dos cultivos e a manutenção de
faixas de exclusão de diferente tamanho, segundo as características da fecundação, autopolinização
ou polinização cruzada. Testes genéticos e imunológicos permitem identificar a presença de
organismos geneticamente modificados em uma carga de cultivos convencionais. O objetivo dessas
medidas é reduzir a presença de sementes adventícias a um limite comercialmente aceitável (0,9%).
Os modelos de regulação dos cultivos tradicionais, orgânicos e biotecnológicos são considerados
de índole econômica, porque dão ao agricultor a possibilidade de escolher a modalidade que melhor
lhe convier. Não envolvem biossegurança, porque esta é analisada no momento da aprovação da
variedade biotecnológica, uma vez satisfeitas as normas legais.
Nos países onde o cultivo de OGMs está permitido, os agricultores têm a opção de semear cultivos
orgânicos, convencionais e biotecnológicos sempre que sejam respeitadas as medidas de coexistência.
Um modelo de regulação, baseado em normas de coexistência, vem sendo desenvolvido na
Espanha desde 2005.
O CULTIVO DE OUTROS TIPOS DE PGMs
PGMs DE INTERESSE NUTRICIONAL
Uma segunda leva de plantas transgênicas contempla a modificação das qualidades das plantas, isto
é, das propriedades que interessam ao consumidor como, por exemplo, o melhoramento da qualidade
nutricional, a redução de alérgenos, modificações do tempo de conservação e das características
organolépticas, a adequação ao processamento industrial dos óleos e amidos etc.
Em 1974, a variedade Tower de Brassica napus recebeu o nome de canola (do inglês “canadian oil,
low acid”). Trata-se da colza, uma planta oleaginosa que a modificação genética tornou comestível, ao
diminuir o teor de ácidos graxos saturados e a quantidade de glucosinolato. Modificações posteriores
originaram numerosas variedades que diferem na composição dos ácidos graxos, sendo algumas delas
também tolerantes a herbicidas.
Entretanto, o principal marco no desenvolvimento deste tipo de transgênicos é o arroz com
vitamina A (Golden Rice). A carência de vitamina A decorrente de uma dieta baseada exclusivamente
no arroz causa a cegueira irreversível e a morte de milhões de crianças na Ásia.
A inserção de dois genes de narciso e um gene bacteriano em uma variedade de arroz indica deu
origem a um grão amarelado contendo -caroteno, que é um dos precursores da vitamina A.
Considerado um empreendimento humanitário, várias empresas cederam, nos países em
desenvolvimento, os seus direitos sobre suas patentes relacionadas com a construção do arroz
dourado.
Espera-se que sejam produzidas plantas com outras alterações no teor de nutrientes: arroz
contendo ferro, milho enriquecido com os aminoácidos lisina e triptófano e batata com alto teor de
proteínas com metionina e lisina. A soja Vistive® apresenta baixo teor de ácido linolênico, o que torna
o óleo mais estável e dispensa a hidrogenação, uma fonte de gordura trans. Este óleo de soja é utilizado
como ingrediente de biscoitos (Cargill e Kellogg’s).
A China desenvolveu e liberou recentemente o milho com fitase para integrar as rações animais.
Este milho permitirá a assimilação de fosfatos pelos suínos, melhorando a produtividade do rebanho
e diminuindo a poluição ambiental.
PGMs PRODUTORAS DE MEDICAMENTOS
Existe uma terceira leva de plantas biotecnológicas desenvolvidas especialmente para desempenhar o
papel de fábricas biológicas, produzindo fármacos, vacinas e plásticos. Estão em andamento os testes
172
de campo com alfafa, milho, arroz, tabaco, banana e batata.
Para evitar a contaminação acidental dos alimentos, essas plantas terão que ser cultivadas em
confinamento e processadas separadamente das plantas comuns. Formas alternativas de evitar a
disseminação do transgene no pólen estão sendo desenvolvidas, tais como sua inserção no DNA dos
cloroplastos. As proteínas extraídas e purificadas serão utilizadas pela indústria farmacêutica. Uma
regulação estrita deverá controlar o cultivo, o transporte e a distribuição destas plantas.
Os sistemas que poderiam tornar estéreis as plantas de interesse agronômico ou nutricional
despertaram uma forte reação contrária na opinião pública (sistemas de proteção tecnológicos ou
TPSs, do inglês technology protection systems; tecnologias de uso genético restrito ou GURTs, do
inglês, genetic use restriction technologies). No entanto, é bem possível que voltem a ser considerados
em relação às plantas produtoras de medicamentos.
O AGRONEGÓCIO
AS PRIMEIRAS EMPRESAS PRODUTORAS DE SEMENTES
Nos países do continente africano e de parte da Ásia, em que a agricultura é a principal fonte de
alimentos, os pequenos agricultores dependem das sementes. Na época da colheita, eles separam uma
parte e a conservam para o plantio do próximo ano.
Devido à mecanização do campo, nos países desenvolvidos, a proporção da população dedicada às
tarefas agrícolas é bem menor. A agricultura de subsistência cede lugar a um enorme complexo
agroindustrial, que integra outras atividades, como a venda de insumos (maquinarias, produtos
químicos, sementes etc.) e a transformação e distribuição de produtos.
A produção de sementes como atividade lucrativa remonta ao ano 1774 e à pequena loja da família
Vilmorin, na França. Em 1874, Henry de Vilmorin obtém o primeiro trigo híbrido (Dattel),
comercializado em 1883 e cultivado até hoje. Nos Estados Unidos e no Canadá, as primeiras empresas
a comercializarem os milhos híbridos surgem a partir de 1920.
As construções genéticas conferem vigor (heterose) às plantas híbridas, mas forçam o agricultor a
comprar novas sementes, ano após ano. A transgênese não inviabiliza a utilização de sementes para o
ano seguinte. No entanto, as novas tecnologias inseridas no grão devem ser pagas mediante
complexos sistemas de royalties às empresas detentoras das patentes correspondentes.
OS GIGANTES GÊNICOS
Logo depois da crise do petróleo da década de 1980, as grandes empresas transnacionais produtoras
de agrotóxicos e fertilizantes químicos entraram na área agrícola. Uma das razões é que o mercado de
sementes tem uma margem de lucro maior; a outra é que leva menos tempo desenvolver uma planta
geneticamente modificada que um produto químico novo.
Vários ciclos de fusões caracterizaram um processo de concentração e consolidação em que
centenas de pequenas empresas foram absorvidas por enormes conglomerados, produtores de
agroquímicos e de sementes, com ramificações na indústria farmacêutica. Na linha de frente das novas
tecnologias, estas empresas concentram um enorme poder que é malvisto pelo público.
Denominadas Gigantes Gênicos (do inglês, Gene Giants), as principais empresas produtoras de
sementes são Monsanto, Dupont (Pioneer), Dow AgroSciences nos Estados Unidos, Syngenta na Suiça,
Limagrain (Vilmorin) na França, Bayer CropScience na Alemanha e Sakata no Japão. Estima-se que, em
2020, o mercado de sementes biotecnológicas será de 42 bilhões de dólares comerciais, em um
mercado global de sementes comerciais de 73 bilhões de dólares.
173
http://bteduc.com
A CADEIA PRODUTIVA DA SEMENTE
Cada país desenvolve variedades adaptadas a seus solos e condições climáticas. Uma vez aprovadas e
registradas, esses cultivares poderão ser disponibilizados para os agricultores. O processo de
amplificação do número de sementes, estritamente regulamentado, contempla várias etapas de que
participam diferentes entidades do setor público ou privado (Figura 13.4).
No caso da característica transgênica, esta precisa da aprovação das instâncias legais competentes,
antes de ser transferida para os cultivares locais e passar por todo o processo de multiplicação,
certificação e registro, até chegar ao agricultor e este dar início ao plantio.
A cadeia produtiva da semente envolve inventores e obtentores, multiplicadores, produtores e
comerciantes de sementes e agricultores. A qualidade das sementes é estabelecida pela legislação e
pelas agências de certificação de sementes, que garantem ao comprador sementes dentro dos
padrões.
PATENTES E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA
No Brasil, a produção de mudas e sementes oriundas do melhoramento clássico está regulada pela Lei
de Proteção de Cultivares (n.º 9.456/97); o produtor rural que compra uma semente paga pelo
germoplasma desse cultivar.
A inserção de um transgene é considerada um evento e demanda a aprovação das autoridades
correspondentes. Em 2010, estimava-se que o processo de inserção de um evento demorava 13 anos,
a um custo de 136 milhões de dólares.
A patente é uma forma de proteção da inovação tecnológica, regulada pela Lei da Propriedade
Industrial (n.º 9.279/96) que, além de lucro, permite à empresa o ressarcimento do investimento e o
financiamento de novas pesquisas. O produtor rural que compra uma semente geneticamente
modificada paga pelo germoplasma e pela propriedade intelectual do produto. Organismos vivos não
podem ser patenteados.
----------------FIGURA 13.4. Os elos que integram a cadeia produtiva da semente
Estado (Institutos de pesquisa, universidades)
Inventores / Obtentores
Empresas nacionais (sociedades, cooperativas e empresas
familiares)
Empresas internacionais
Multiplicadores
Diversa estrutura empresarial
Produtores e comerciantes
Diversa estrutura empresarial
Agricultores
.
174
O produtor rural pode pagar os royalties ou taxa tecnológica (TT) na compra da semente. Quando as
sementes biotecnológicas não têm as limitações dos híbridos, ele pode optar por guardar legalmente
parte do produto da safra para o próximo plantio, pagando um percentual antes da entrega na moega.
Se ele não salvar as sementes de acordo com a lei, será cobrado na entrega do grão.
As patentes têm uma duração limitada; entre as que já expiraram estão a do herbicida Roundup
(2000) e a da primeira variedade RR1 de soja RoundupReady (2015). Algumas organizações se
manifestaram a favor de uma versão pública sem royalties, algo assim como um genérico (Open Source
Seed Iniciative), mas a inovação está nas mãos das empresas produtoras de sementes, que logo lançam
no mercado produtos cada vez mais eficientes, para substituir os que perderam a proteção.
A novidade no mercado são as plantas “piramidadas”, que combinam vários eventos, tais como a
tolerância a dois herbicidas, a tolerância à herbicida e a resistência a insetos, ou a resistência a dois
tipos de insetos, um que ataca a raiz e outro a parte superior da planta.
Seu número aumenta a cada dia. A soja RR2 Bt, que reúne a tolerância à herbicida e a resistência a
insetos, substituiu a soja RR1. O milho Genuity SmartStaxTM (Monsanto, DowAgroSciences), por
exemplo, reúne oito genes para o controle de pragas acima e abaixo do solo, e a tolerância a herbicidas
para o controle de plantas daninhas. Na África, o projeto WEMA (do inglês, Water Efficiency for Africa)
espera dispor, em 2017, de um milho Bt com eventos piramidados de resistência a insetos e tolerância
à sequia.
A ADOÇÃO DOS CULTIVOS BIOTECNOLÓGICOS NO MUNDO
Em 1996, Estados Unidos, China, Argentina, Canadá e Austrália iniciaram o cultivo de PGMs em 1,7
milhão de hectares.
O International Service for the Aquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA) é uma organização
internacional que divulga anualmente os dados correspondentes à adoção dos cultivos biotecnológicos
no mundo. Segundo o ISAAA, em 2015, 28 países semearam com PGMs uma superfície de 179,7
milhões de hectares, liderados por Estados Unidos, Brasil, Argentina, Índia e Canadá.
Dos 28 países que semearam PGMs, 8 são industrializados e 20 em vias de desenvolvimento. Dentre
os países que não permitem o cultivo de PGMs, 39 os importam (Tabela 16.1). O traço dominante foi
a tolerância à herbicida e os principais cultivos soja, milho, algodão e canola, seguidos por beterraba
sacarina, alfafa e papaia.
Mais de 90% dos 18 milhões de agricultores que plantaram sementes biotecnológicas são pequenos
produtores rurais, especialmente na China, na Índia, nas Filipinas e na África do Sul. Os cultivos
biotecnológicos possibilitaram o aumento da produção agrícola e melhoraram as condições
econômicas desses agricultores.
Nos países onde a mão de obra agrícola está constituída principalmente por mulheres, os cultivos
biotecnológicos melhoraram suas condições de vida, ao permitir que elas dedicassem mais tempo ao
cuidado das crianças ou a outras atividades. Os problemas de saúde causados pela contaminação
ambiental com agrotóxicos diminuíram em função de uma redução de 14% na aplicação de inseticidas,
sendo que em alguns casos essa diminuição teria chegado a 50% (China, Argentina).
Com a liberação da comercialização do arroz Bt na China e do feijão resistente a vírus no Brasil,
inicia-se uma nova etapa que contempla as principais fontes de alimento locais. Encontram-se em
andamento vários estudos, sobre o grão de bico na África, a berinjela na Índia, o milho resistente à
seca nos Estados Unidos e na África subsaariana.
OS ESTADOS UNIDOS E A UNIÃO EUROPEIA
Nos Estados Unidos, três agências controlam e regulamentam o uso das novas tecnologias genéticas:
USDA (United States Department of Agriculture), EPA (Environmental Protection Agency) e FDA (Food
175
http://bteduc.com
and Drug Administration). Embora a resistência aos cultivos transgênicos seja muito baixa, sendo
plenamente adotados desde 1996, cresce em alguns estados um movimento de oposição que pede a
rotulagem.
Na União Europeia, a resistência às PGMs é muito alta. Em 1999, uma moratória suspendeu o
cultivo de novas variedades transgênicas, assim como a comercialização de seus produtos. Não atingiu
algumas variedades autorizadas anteriormente para cultivo, importação ou utilização na produção de
alimentos ou de rações.
Em 2003 foram estabelecidas normas de rotulagem e de rastreamento de traços transgênicos e
com a implantação de diretrizes para o cultivo de plantas transgênicas, de maneira a minimizar a
contaminação dos campos de cultivos orgânicos e convencionais.
Recentemente o Conselho da União Europeia estabeleceu que cada Estado poderá interditar um
cultivo geneticamente modificado com base em considerações éticas ou socioeconômicas, sem
invocar argumentos científicos. Apesar da hostilidade das autoridades do Conselho Europeu, há um
bom número de organizações favoráveis ao cultivo de plantas geneticamente modificadas: 33 no Reino
Unido, 23 na Itália, 16 na Espanha e 11 na Alemanha.
ISRAEL
Israel não assinou o Protocolo de Cartagena e não restringe a importação de PGMs nem de seus
derivados. Desenvolve pesquisas biotecnológicas sobre tomate, batata, eucalipto, soja, algodão,
milho, morango, banana e flores. Os testes de campo devem ser autorizados pelo PPIS (do inglês, Plant
Protection and Inspection Services of Israel).
Encontra-se em preparação uma regulamentação que exige a rotulagem dos produtos com mais de
0,9% de ingredientes derivados de PGMs. Os produtos sem DNA ou proteína derivada de uma OGNM
não serão rotulados.
OS PAÍSES DE AMÉRICA LATINA
Na América Latina (Brasil, Argentina, Paraguai, Uruguai, Bolívia, Colômbia, Chile, Costa Rica, Cuba e
Honduras), os principais cultivos biotecnológicos são a soja, o milho e o algodão (Tabela 16.1). Embora
o desenvolvimento das sementes dependa geralmente do setor privado, em vários países (Argentina,
Brasil, México, Colômbia) o setor público começou a gerar suas próprias variedades, respondendo à
demanda local.
Na Argentina, os primeiros exemplos são a soja tolerante à sequia da empresa Indear e a batata
resistente à vírus, desenvolvida pela Tecnoplant, uma empresa do grupo Sidus. No Brasil, o feijão
resistente a vírus desenvolvido pela Embrapa, e a soja tolerante ao glufosinato, fruto de uma
colaboração entre a Embrapa e a Basf.
Os países da América Latina contam com uma comunidade acadêmica de alto nível científico e
tecnológico, ativa nas universidades e nos centros de pesquisa, com empresas de tradição histórica na
difusão da tecnologia agropecuária e, em vários casos, com condições econômicas limitadas pelas
sucessivas crises políticas. Em ambos os países, numerosas empresas privadas ocupam lugares de
destaque em diferentes setores do mercado biotecnológico. A existência de convênios e programas
de intercâmbio científico tende a elevar o nível das atividades científicas e tecnológicas.
Ao longo dos primeiros quinze anos de implantação das novas tecnologias agrícolas, cada país seguiu
sua própria trajetória até estabelecer as normas legais que garantem o progresso em condições
seguras.
ÁFRICA SUBSAARIANA
O desenvolvimento da agricultura africana permitiria reduzir a pobreza e aumentar a segurança dos
alimentos. Até o momento, África do Sul, Burkina Faso e Sudão comercializam o algodão resistente a
insetos e a soja e o milho tolerantes ao glifosato. Em Burkina Faso, Quênia, Moçambique, Nigéria,
176
África do Sul, Tanzânia e Uganda a comunidade científica conta com o apoio de organizações
internacionais para desenvolver cultivos de interesse local: milho, batata-doce, mandioca, arroz, sorgo
e banana. Os traços principais são a resistência a pragas, a tolerância à sequia e à salinidade e outras
condições, como a biofortificação em vitamina A, zinco e ferro.
Contudo, existem dificuldades devido à pressão cultural da União Europeia e, também, à falta de
regulamentações locais que possibilitem avançar nos testes de campo.
CHINA
Com uma população de mais de 1,3 bilhão de habitantes e graves problemas ambientais, a China estará
investindo 4 bilhões de dólares em biotecnologia, até 2020.
A China é o maior importador de alimentos do mundo, de modo que parte das pesquisas está
relacionada com o arroz, o milho, o trigo e a soja. Em relação ao meio ambiente, a adoção do algodão
BT por 70% dos agricultores permitiu em 5 a 8 anos a redução do uso de pesticidas em 50 a 60 %.
AS NOVAS TECNOLOGIAS
Nos últimos 20 anos, diferentes países tiveram uma atitude que variou entre a rejeição absoluta e a
aceitação dos cultivos geneticamente modificados. Atualmente, 271 organizações e instituições
científicas reconhecem a segurança dos cultivos geneticamente modificados e seus benefícios
potenciais.
Tanto o setor público como o setor privado de vários países têm capacidade para utilizar a
tecnologia em benefício da sociedade, colocando no mercado cultivos adaptados às condições locais,
uma vez satisfeitos os requerimentos e as regulamentações determinados pelas autoridades
competentes.
As novas tecnologias de edição gênica já estão sendo usadas: na China, para obter um trigo
resistente a fungo e um arroz mais produtivo; no Reino Unido, para produzir uma variedade de cevada
resistente à seca. O primeiro produto comercializado é a SU Canola, resistente ao herbicida
sulfoniltiouréia. Contudo, ainda é cedo para prever qual será o destino das novas variedades, porque
sua implantação depende do processo regulatório a ser adotado.
-------------TABELA 16.1. As plantas geneticamente modificadas no mundo (Dados do ISAAA, março de 2016)
A. Os cultivos de plantas geneticamente modificadas
Abóbora (Cucurbita pepo), Alfafa (Medicago sativa), Algodão (Gossypium hirsutum L.), Ameixa (Prunus domestica), Arroz
(Oryza sativa L.), Batata (Solanum tuberosum L.), Berinjela (Solanum melongena), Beterraba sacarina (Beta vulgaris), Canade-açúcar (Saccharum sp), Canola argentina (Brassica napus), Canola polonesa (Brassica rapa), Chicória (Cichorium intybus),
Choupo (Populus sp.), Cravo (Dianthus caryophyllus), Eucalipto (Eucalyptus sp.), Feijão (Phaseolus vulgaris), Grama Creeping
Bentgrass (Agrostis stolonifera), Linho (Linum usitatissumum L.), Maçã (Malus x Domestica), Melão (Cucumis melo), Milho
(Zea mays L.), Papaia (Carica papaya), Petúnia (Petunia hybrida), Pimentão doce (Capsicum annuum), Rosa (Rosa hybrida),
Soja (Glycine max L.), Tabaco (Nicotiana tabacum L.), Tomate (Lycopersicon esculentum), Trigo (Triticum aestivum).
B. Países que pararam de plantar cultivos geneticamente modificados
Países
(N0 de eventos aprovados)
Egito (1)
Indonésia (15)
Irã (1)
União Europeia*** (86)
Cultivos geneticamente modificados
Milho.
Cana de açúcar, milho, soja.
Arroz.
Algodão, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, soja.
(***) Bulgária, França, Alemanha, Polônia, Suécia
177
http://bteduc.com
C. Países que plantam cultivos geneticamente modificados.
Países
África do Sul (67)
Argentina (40)
Austrália (107)
Bangladesh (1)
Bolívia (1)
Brasil (50)
Burkina Faso (1)
Canadá (165)
Chile (3)
China (60)
Colômbia (73)
Costa Rica (15)
Cuba (1)
Estados Unidos de América
(190)
Filipinas (88)
Honduras (8)
Índia (11)
México (158)
Myanmar (1)
Paquistão (2)
Paraguai (20)
Sudão (1)
União Europeia*(86)
Uruguai (17)
Vietnã (6)
Algodão, arroz, canola argentina, milho, soja.
Algodão, milho, soja.
Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, rosa, soja, trigo.
Berinjela.
Soja.
Algodão, eucalipto, feijão, milho, soja.
Algodão.
Abóbora, alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, canola polonesa, linho,
maçã, milho, papaia, soja, tomate.
Canola argentina, milho, soja.
Algodão, arroz, beterraba sacarina, canola argentina, choupo, milho, papaia, petúnia, pimentão doce,
soja, tomate.
Algodão, arroz, beterraba sacarina, cravo, linho, milho, rosa, soja, trigo.
Algodão, soja.
Milho.
Abóbora, alfafa, algodão, ameixa, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, chicória, grama,
linho, maçã, melão, milho, papaia, rosa, soja, tabaco, tomate, trigo.
Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja.
Arroz, milho.
Algodão, soja.
Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja, trigo.
Algodão.
Algodão.
Algodão, milho, soja.
Algodão.
Milho, soja.
Milho.
(*) Espanha, Portugal, República Tcheca, Romênia, Eslováquia
D. Países que importam cultivos geneticamente modificados
Países
Coreia do Sul (138)
Federação Russa (23)
Japão (214)
Malásia (22)
Noruega (11)
Nova Zelândia (92)
Panamá (1)
Singapura (24)
Suiça (4)
Tailândia (15)
Taiwan (117)
Turquia (32)
União Europeia**(86)
Alfafa, algodão, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja.
Arroz, batata, beterraba sacarina, milho, soja.
Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, papaia, rosa, soja.
Cravo, milho, soja.
Cravo.
Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja, trigo.
Milho.
Alfafa, algodão, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja.
Milho, soja.
Milho, soja.
Algodão, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja.
Milho, soja.
(**) Áustria, Bélgica, Croácia, Chipre, Dinamarca, Estônia, Finlândia, Grécia, Hungria, Irlanda, Itália, Letônia, Lituânia, Luxemburgo, Malta,
Países Baixos, Eslovênia, Reino Unido
.
178
C A P Í T U L O 14
BIOTECNOLOGIA
E CRIAÇÃO DE ANIMAIS
Das 148 espécies conhecidas de mamíferos terrestres, onívoros ou herbívoros, que alcançam um peso
de 45 kg, somente 14 foram domesticadas. Em relação às restantes, o fracasso costuma ser atribuído
a seis razões: uma dieta que o homem não pode ministrar; crescimento lento e espaçado (elefantes e
gorilas); tendências agressivas (ursos e rinocerontes); relutância a se reproduzir em cativeiro (pandas,
guepardos); falta de estruturas de liderança (antílope); tendência ao pânico em lugares fechados ou
em presença de um predador (gazelas).
Seja como for, a criação de animais para a alimentação está limitada a um pequeno número de
espécies de mamíferos, ruminantes (bovinos, ovinos, caprinos) e monogástricos (suínos, coelhos e
aves), de peixes, de crustáceos e de mariscos. Também se criam animais para a prática de esportes
(cavalos) e como companhia (gatos, cachorros, pássaros, peixes).
Os grandes estabelecimentos agrícolas praticam a cultura extensiva de gado (bovino, ovino,
caprino) em pradarias e pastagens, enquanto os menores tendem a investir em culturas intensivas de
altos rendimentos (gado leiteiro, aves, suínos e peixes), que degradam o ambiente.
A produção agrícola depende também de fatores econômicos e sociais. À medida que melhora o
nível de vida da população, mudam os padrões de consumo e, consequentemente, a atividade
agropecuária. Estima-se que, entre 1993 e 2020, os países em desenvolvimento duplicarão o consumo
de carne. Pequenas empresas familiares serão substituídas por outras de produção intensiva,
orientadas a satisfazer o mercado urbano; a criação de aves e suínos aumentará em detrimento da
criação de ruminantes. Essas mudanças exigirão maior eficiência na seleção, no gerenciamento das
empresas e nos cuidados com a alimentação e a saúde dos animais.
Nos países desenvolvidos, o objetivo primordial é aumentar, ou manter, a quantidade de produtos
(leite, ovos, carne e lã) e, simultaneamente, diminuir os custos. Em relação aos métodos produtivos,
isso significa reduzir o número de animais, o trabalho humano e o impacto causado pelas doenças.
As biotecnologias inserem-se tanto na alimentação, como na conservação da saúde dos animais,
possibilitando também o controle da reprodução e a aceleração da seleção genética. Perspectivas
novas surgem com a utilização dos animais como biorreatores, para a produção de fármacos.
http://bteduc.com
A NUTRIÇÃO DOS ANIMAIS
A NECESSIDADE DE RAÇÕES
A criação e engorda de gado de corte nas pastagens é possível em países com grandes extensões
territoriais, tais como a Argentina, a Austrália, o Brasil e a Nova Zelândia. O alimento básico do gado é
o capim, que cresce de maneira desigual ao longo das quatro estações do ano. Nos períodos em que
falta capim deve-se suplementar a dieta do rebanho com feno (forragem dessecada), silagem
(forragem e grãos fermentados), grãos, concentrados e/ou resíduos agroindustriais.
À medida que a agricultura invade as áreas de pastagem, a pecuária adota os regimes de
semiconfinamento ou confinamento, estabelecendo como objetivo primordial o aumento da
produtividade (gado leiteiro, aves e suínos). Parte dos cultivos de cereais (milho) e de leguminosas
(tortas de soja, algodão, colza e girassol) é utilizada como ração, para suprir as necessidades proteicas
e energéticas dos animais, sendo necessários de 3 a 10 kg de grãos para obter 1 kg de carne.
Como o valor nutricional dos grãos é variável, acrescentam-se às rações alguns complementos
nutritivos. Vários produtos industrializados fornecem um conteúdo de nutrientes equilibrado para as
necessidades dos animais, em função de sua espécie, sua idade etc.
DE LIEBIG À VACA LOUCA
Os suplementos nutritivos proteicos foram introduzidos em fins do século XIX. Em 1865, Liebig
inventou um procedimento industrial para transformar os restos dos animais em extrato e farinha de
carne. O primeiro era vendido como complemento para a alimentação humana; a segunda era utilizada
para fortificar as rações animais. Bem antes da Segunda Guerra Mundial, as rações dos ruminantes dos
países desenvolvidos incluíam farinha de carne, em uma proporção de 2 a 5%.
Até 1973, a Europa importava grãos para as rações animais. Quando condições climáticas adversas
causaram uma grande quebra da safra de soja, os Estados Unidos embargaram o grão disponível, para
garantir suas necessidades internas. Sem grãos como fonte proteica das rações, a única opção que
restou aos europeus foi a farinha de carne. Na tentativa de baratear ao máximo os custos das rações,
deixou-se de extrair a gordura com solvente e modificaram-se as condições de esterilização.
A inclusão de restos de animais doentes, inicialmente ovelhas com scrapie, uma doença esporádica,
conhecida no Reino Unido desde 1732, pode ter contaminado as vacas e provocado o surto da doença
da vaca louca, uma variante da doença de Creutzfeldt-Jakob que afeta o homem, causando-lhe danos
neurológicos graves. Esta variante ataca as pessoas jovens e se manifesta mais rapidamente.
Em 1988, a farinha de carne foi proibida na alimentação do gado bovino e ovino. A epidemia exigiu
o sacrifício de boa parte dos rebanhos, no Reino Unido e outros países da Europa, colocando em
discussão a composição das rações animais e mostrando a necessidade de aumentar a quantidade e a
qualidade dos suprimentos de grãos e de plantas forrageiras.
VARIAÇÕES SOBRE A COMPOSIÇÃO DAS RAÇÕES
Além da farinha de carne, outros produtos já foram utilizados como suplemento proteico, entre eles o
leite desnatado em pó e a farinha de pescado, que hoje está sendo abandonada devido ao aumento
do preço, resultante da pesca excessiva e da diminuição dos cardumes.
Como fonte alternativa de proteínas, a biomassa microbiana seca tem dado bons resultados.
Denominada SCP (do inglês, single cell protein), a proteína unicelular pode ser obtida de diversas
fontes. As leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, são um subproduto nas destilarias de álcool;
outras, como Candida utilis ou Torula, se multiplicam sobre os efluentes das indústrias de papel ou de
180
BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS
laticínios. A bactéria Methylophilus methylotropus cresce sobre metanol, obtido a partir do gás do Mar
do Norte, originando uma SCP que é comercializada, no Reino Unido, sob o nome de Pruteen.
O acréscimo de enzimas (proteases, celulases, amilases etc.) tende a aumentar a digestibilidade das
rações. Uma dieta baseada em grãos tem o inconveniente de introduzir fósforo e outros nutrientes,
complexados ao ácido fítico. No caso dos ruminantes, a flora microbiana do sistema digestório
consegue disponibilizar parte do fósforo, mas isso não ocorre nos animais monogástricos como os
suínos, as aves e, inclusive, o homem. Os fitatos impedem a assimilação do fósforo, porém, a adição
da enzima fitase na ração melhora a assimilação dos nutrientes e diminui a quantidade de fósforo
excretado no ambiente, que é uma das causas da eutrofização dos cursos de água.
A adição de antibióticos visa proteger as rações da ação bacteriana. Já a adição de probióticos
procura modificar o ambiente gastrintestinal, estimulando a multiplicação de certos tipos bacterianos
em detrimento de outros.
A fitase é produzida por fermentação microbiana e, na Europa, é obrigatório adicioná-la às rações.
O mercado global de fitase é de, aproximadamente, 500 milhões de dólares, 40% do qual situado na
China.
AS RAÇÕES TRANSGÊNICAS
A União Europeia exige o etiquetado de toda ração contendo mais de 0,9% de um Organismo
Geneticamente Modificado aprovado previamente, mas não considera necessário rotular os alimentos
provenientes de animais alimentados com rações geneticamente modificadas (carne, ovos, leite).
O escândalo da “vaca louca”, seguido pelo caso dos frangos contaminados com dioxina, mostrou o
descaso dos produtores europeus em relação às rações animais. Isso explica a repercussão de alguns
trabalhos (A. Pusztai, 1998; G-E. Séralini, 2012), declarando ter encontrado alterações do sistema
imune ou formação de tumores em ratos alimentados com batatas ou milho transgênico. Esses
trabalhos foram totalmente desqualificados pela comunidade científica, mas ainda são citados como
“prova” do perigo das rações e dos alimentos transgênicos.
As rações representam até 70% dos custos da criação de animais. Por ser um dos gargalos da
produção agrícola, toda tentativa de baratear as rações costuma ser assimilada rapidamente. Contudo,
devido aos escândalos precedentes e à desconfiança da população, a introdução de plantas
geneticamente modificadas teve que ser analisada cuidadosamente, em diversos tipos de animais. Não
foram encontrados sinais de toxicidade da soja, da ervilha, do lupino, do algodão e da batata em ratos
nem da colza em coelhos. As características das carcaças, dos tecidos e das carnes não mudaram em
animais que receberam alimentos transgênicos.
Numerosos estudos, desenvolvidos em instituições de pesquisa e universidades, mostraram que,
tanto em relação à composição química, como à digestibilidade e ao valor nutritivo, as plantas
biotecnológicas disponíveis são substancialmente equivalentes às convencionais (não transgênicas).
Organizações internacionais como FAO/WHO (Food and Agriculture Organization e World Health
Organization) consideram, desde 1991, que a ingestão de DNA é segura, independentemente de ser
sua fonte transgênica ou não. As organizações norte-americanas FDA (Food and Drug Agency), em
1992, e EPA (Environmental Protection Agency), em 2000, manifestaram-se no mesmo sentido.
Segundo a FASS (Federation of Animal Science Societies), as rações são digeridas normalmente
pelos animais estudados, sem que sejam detectados ácidos nucleicos ou proteínas de origem
transgênica na carne, no leite ou nos ovos. Este era um resultado esperado, porque, em função dos
conhecimentos sobre digestão e absorção, tanto as proteínas como o DNA são degradados durante o
processo digestivo.
Em alguns casos, em que as plantas têm as propriedades agronômicas modificadas, como, por
exemplo, o milho resistente a insetos (milho-bt), verifica-se uma redução substancial de micotoxinas.
181
http://bteduc.com
Estas são muito perigosas, para os animais que ingerem os grãos contaminados, porque causam
hemorragias, danos no fígado e nos rins, diarreias e câncer. Ao diminuir os ataques de insetos, há
menos lesões que possibilitem a infecção e o crescimento dos fungos. Em consequência, o milho
transgênico melhora a qualidade do alimento e a saúde animal, especialmente dos monogástricos,
mais sensíveis as micotoxinas que os ruminantes.
A aprovação do milho com fitase (Academia de Ciências Agrícolas da China, Origin Agritech Ltda.)
representa um marco importantíssimo para a China.
Estão sendo estudadas plantas com maior digestibilidade, como uma alfafa transgênica com menos
lignina. Por outro lado, o melhoramento das plantas forrageiras também abre perspectivas
interessantes. Observou-se, por exemplo, aumento de peso e bom crescimento da lã em ovelhas
alimentadas com lupino transformado geneticamente, para sintetizar uma proteína de girassol com
alto conteúdo de metionina.
O MELHORAMENTO GENÉTICO DO GADO
Existem hoje mais de 5.000 raças de gado, resultantes de muitos anos de adaptação a diferentes
condições ambientais. O melhoramento genético visa três objetivos fundamentais: aumentar a
eficiência da conversão do alimento para incrementar a taxa de crescimento corporal; acrescer a
produtividade (leite, ovos); modificar a composição da carcaça, aumentando a quantidade de proteína
(carne e leite), em detrimento da gordura.
Diferentemente da área de melhoramento vegetal em que, através da venda anual de sementes,
as grandes empresas conseguem recuperar rapidamente seus investimentos; a área de melhoramento
animal tem um retorno mais lento porque existem períodos maiores entre uma geração e outra.
Muitas das características selecionadas em animais mostram uma variação contínua, que, em vez
de responder a um gene único, resulta da contribuição de vários genes (herança poligênica ou
quantitativa). Se estiverem situados em cromossomos diferentes, a seleção dos genes de interesse
acarretará genes vizinhos, que podem ser desfavoráveis.
Os frangos do tipo broiler, por exemplo, têm-se transformado em um alimento comum e barato,
em contraste com anos atrás. Selecionados por 50 gerações, esses frangos crescem quatro ou cinco
vezes mais rápido que seus antepassados. Mas, no caminho, apareceram alguns efeitos deletérios, tais
como o aumento do teor de gorduras, a fertilidade baixa e a presença de anormalidades esqueléticas.
Por outro lado, galinhas selecionadas como poedeiras desenvolveram osteoporose, ao desviar o
cálcio do esqueleto para a construção da casca dos ovos. E os perus desenvolveram um tamanho tal
que não conseguem acasalar sem riscos, sendo necessário proceder à inseminação artificial. A seleção
assistida por marcadores moleculares obteve um grande sucesso na área, justamente por amenizar a
dificuldade de se lidar com traços multigênicos.
Ciclos de vida mais longos tornam mais lenta a recuperação dos investimentos de modo que, a
exceção da produção de frangos, o setor resulta menos atrativo para as grandes empresas privadas. A
distribuição do material genético se encontra nas mãos dos pecuaristas e de pequenos
empreendimentos privados, responsáveis por mais de 80% da pesquisa e desenvolvimento na área
agropecuária dos países desenvolvidos.
O CONTROLE DA REPRODUÇÃO
O controle da reprodução dos animais permite a expansão rápida dos estoques, reduzindo os custos
de transporte de animais. O processo começa com a seleção dos pais (reprodutores e matrizes),
escolhidos pelas suas características genéticas, relativas à produtividade e à saúde (Figura 15.1).
182
Desde meados do século XX, pratica-se a inseminação artificial no gado bovino, ovino, caprino, porcino
e em aves (perus, frangos). A técnica é mais utilizada com o gado de leite que com o de corte, porque
o preço por cabeça é mais alto. Complementa-se a inseminação artificial com a sexagem prévia do
sêmen, a fim de escolher os espermatozoides que poderão dar origem a fêmeas.
O sêmen colhido de um reprodutor é introduzido no útero das matrizes. Considerando que uma
única ejaculação de um touro produz aproximadamente 100 doses de sêmen, que um animal chega a
produzir 4.000 doses por ano e que a eficiência da inseminação chega a 50%, o método permite obter
aproximadamente 2.000 crias por reprodutor ao ano.
O desenvolvimento das técnicas de criopreservação permite utilizar tanto o sêmen fresco como o
congelado, possibilitando, também, a conservação da biodiversidade de raças em perigo de extinção.
Uma dose de sêmen custa a partir de 15 reais e, se for de qualidade comprovada, 20 reais. O touro
Bandido, que teve uma exitosa participação em uma novela de televisão e morreu prematuramente,
deixou sêmen congelado. Dele descendem os touros Zangão, Matador e Carrancudo, que participam
em festas de rodeio por todo o Brasil.
Normalmente, uma vaca produz uma cria por ano. Tratada com hormônios para induzir uma
superovulação e inseminada artificialmente, essa vaca poderá gerar simultaneamente cinco embriões,
que serão colhidos mediante a lavagem do útero e transferidos a uma vaca receptora. A
criopreservação garante que 25 a 50% dos embriões congelados possam originar animais vivos. Como
o processo todo (superovulação + inseminação + transferência dos embriões) pode ser repetido quatro
vezes por ano, apesar de algumas limitações técnicas, uma vaca parirá 10 crias por ano.
-------------FIGURA 14.1. O Controle da reprodução em bovinos
O controle da reprodução dos animais domésticos depende de diversas técnicas (superovulação, inseminação artificial, coleta
de ovócitos ou de embriões, criopreservação, transplante de embriões).
Vaca doadora
Touro reprodutor
Vaca doadora
Ovários obtidos
nos matadouros
Superovulação
Sêmen
Congelamento
Inseminação artificial
Superovulação
Coleta dos
ovócitos
Coleta dos
ovócitos
Fecundação in vitro
Coleta dos embriões
Desenvolvimento in vitro dos embriões
Testes genéticos
Congelamento
Transplante
Vacas receptoras
Transplante
Vacas receptoras
183
http://bteduc.com
Outra variante consiste em extrair os ovócitos das vacas superovuladas, ou dos ovários de animais
sacrificados, procedendo a uma fecundação artificial, antes de reimplantar os embriões nas vacas
receptoras. O número de embriões também pode ser aumentado por bipartição, por
micromanipulação do blastócito com 64 a 128 células. A aplicação de testes genéticos nos pais e nos
embriões, antes de ser reimplantados, permite uma seleção apurada da descendência.
Sendo a produção de alimentos um dos objetivos fundamentais da atividade agropecuária, os
modificadores metabólicos são utilizados tanto para incrementar a produção, como para modificar a
relação entre carne e gordura, e, assim, diminuir o desperdício.
AS NOVAS TECNOLOGIAS
MARCADORES MOLECULARES E SELEÇÃO GENÔMICA
O estudo do genoma dos animais domésticos fornece informações para a seleção de alguns caracteres.
Em relação aos monogênicos, o processo seletivo oferece poucas dificuldades, especialmente se o
gene responsável por uma característica de interesse estiver estreitamente associado a um
determinado marcador, que possa ser detectado facilmente por técnicas moleculares. O processo se
complica com os caracteres poligênicos, porque devem correlacionar-se os principais genes que
participam na variação do traço escolhido, e as sequências não funcionais que, distribuídas ao longo
do genoma, irão cumprir o rol de marcadores moleculares.
Centenas de marcadores foram identificados em diferentes espécies. Trata-se de SNPs e de
sequências curtas de DNA repetidas um número variável de vezes (mini ou microssatélites), que são
transmitidas de uma geração a outra e podem ser identificadas por eletroforese. Além de facilitar a
seleção, os marcadores permitem a determinação do parentesco (pedigree) e a identificação dos
animais, tanto no campo como nos produtos derivados.
Já foram sequenciados vários genomas de animais domésticos: frango (Gallus gallus), porco (Sus
scrofa), cachorro (Canus familiaris), vaca (Bos taurus), cavalo (Equus caballus), gato (Felis catus), coelho
(Oryctolagus cuniculus), peru-selvagem (Meleagris gallopavo), dromedário (Camelus dromedarius),
abelha (Apis melífera), ovelha (Ovis aries), peixe-zebra (Danius raris) etc.
À medida que um genoma é completado, as técnicas eletroforéticas são substituídas por chips de
DNA (microarrays). O sequenciamento do genoma cria uma quantidade extraordinária de dados,
correlacionando marcadores e características fenotípicas. Com essa informação, estabelecem-se
equações preditivas para os cruzamentos seletivos, substituindo a seleção por marcadores pela
seleção genômica.
A CLONAGEM
Em 1975, J. Gurdon (Prêmio Nobel de Medicina 2012) mostrou que, transferindo um núcleo de girino
a um ovócito anucleado de rã, gerava-se um girino normal e, após a metamorfose, uma rã adulta. O
sucesso do experimento diminuía notavelmente quando o núcleo era extraído de células
diferenciadas.
No Instituto Roslin (Escócia), Ian Wilmut tentou transferir o núcleo de uma célula de glândula
mamária de ovelha Finn Dorset a um ovócito receptor anucleado de uma ovelha Scottish Blackface. O
embrião resultante seria implantado em uma ovelha Scottish Blackface. Depois de 277 tentativas
frustradas, nasceu uma ovelha Finn Dorset, Dolly (1977-2003), o primeiro animal obtido por
transferência nuclear (Figura 14.2). Fenômeno midiático, Dolly desenvolveu um tumor no pulmão,
sendo sacrificada depois de desenvolver artrite em uma pata e de mostrar sinais de envelhecimento
precoce.
184
As dificuldades técnicas estão, principalmente, na estimulação do citoplasma receptor e na
coordenação entre a atividade citoplasmática e a nuclear. Quando a reprogramação celular é
incompleta, observam-se fenômenos epigenéticos que abrangem o DNA, a cromatina e a inativação
do cromossomo X. Como resultante de efeitos aleatórios e de influências ambientais, os animais
clonados não são totalmente idênticos.
Por outro lado, os problemas de saúde são mais frequentes em clones, porque a gestação é mais
demorada e o tamanho do recém-nascido é maior. As taxas de mortandade perinatal aumentam, assim
como o número de malformações congênitas.
A clonagem é utilizada com os animais fundadores, principalmente bovinos e suínos, porque são os
únicos em que os benefícios justificam o custo do procedimento. Alguns exemplos são ilustrativos: Bull
86 Squared, um clone de um animal resistente à brucelose, salmonelose e tuberculose; Annabell Zeta,
uma vaca da raça Holstein recordista da produção de manteiga, clonada com sucesso por apresentar
problemas de fertilidade; Second Chance, nascido depois de 189 tentativas de clonagem de Chance,
um touro que participou de rodeios e filmes.
A tecnologia está sendo desenvolvida também na Argentina e no Brasil. Ciruelito é um clone de
Ciruelo, grande campeão da raça Brangus. Lenda e Glória da Embrapa descendem de Vitória, uma vaca
da raça Simental, nascida por transferência nuclear; Porã e Potira descendem, via bipartição
embrionária, de uma vaca da raça bovina Junqueira, em alto risco de extinção; também zebuínos foram
clonados. Em ambos os países existem empresas privadas especializadas na clonagem comercial de
bovinos (BioSidus, ARG Natural Beef; Vitrogen, Geneal) em empreendimentos ligados a universidades
ou institutos de pesquisa agronômica.
De um modo geral, a clonagem é utilizada para animais de elite, doentes ou acidentados,
estimando-se o preço de um bezerro clonado, nos Estados Unidos, em redor de 20.000 dólares. Ainda
pode demorar vários anos até que o preço se torne interessante para o melhoramento direto na
pecuária.
-------------FIGURA 14.2. Dolly, um clone obtido por transferência nuclear
Ovelha Finn Dorset
Ovelha Scottish Blackface
Cultivo de células
de glândula mamária
Extração do glóbulo polar e dos
cromossomos do ovócito
Transferência nuclear
Ativação elétrica e fusão
Implantação do embrião em uma
ovelha Scottish Blackface
Nasce Dolly (Finn Dorset)
185
http://bteduc.com
Diferente dos bovinos, os equinos nasceriam mais saudáveis. Em 2003, a mula Joy of Idaho foi o
primeiro clone de um híbrido de uma égua e um jumento. No mesmo ano e depois de 847 tentativas,
nasceu na Itália a égua Prometea, gerada a partir de uma célula somática materna, o que a torna ao
mesmo tempo filha e irmã gêmea de sua mãe. Em 2005 obtiveram-se os primeiros clones de um cavalo
de corrida (Pieraz Cryozootech) e de um cavalo de salto (Paris-Texas). Recentemente, nasceu na
Argentina BS Ñandubay, clone de Ñandubay, um cavalo crioulo (Halitus, BioSidus). No Brasil, as potras
Branca e Neve foram obtidas por bipartição embrionária. Observe-se que a inseminação artificial e os
tratamentos de fertilidade estão proibidos em cavalos de corrida, puros-sangues.
Contudo, as possibilidades da clonagem vão além do aumento da taxa de fertilidade de animais
elite e da conservação de animais com características interessantes. A clonagem pode ser utilizada
para a conservação de espécies raras e em risco de extinção, para a criação de rebanhos homogêneos
que facilitem trabalhos de pesquisa e para a propagação rápida de alguns organismos transgênicos.
A TRANSGÊNESE
Na década de 1980, a transferência de um gene codificador de hormônio de crescimento humano
originou ratos duas vezes maiores. Quando repetida a experiência com porcos, obteve-se o Beltsville
pig, um animal que apresentou problemas variados: dificuldades respiratórias, artrite, letargia etc. O
experimento suscitou vários questionamentos éticos em relação ao tratamento infligido aos animais.
De um modo geral, salvo em peixes, a transgênese do hormônio de crescimento (GH, do inglês growth
hormone e GHFR, do inglês growth hormone factor releasing) nos animais domésticos revelou-se
problemática.
Um caso interessante pelos benefícios que poderia trazer para o meio ambiente é o do Enviropig
(Universidade de Guelph, Canada), um porco portador de um gene bacteriano codificador de fitase.
Secretada na saliva, a enzima reduz em 40% a concentração de fósforo no esterco. Por falta de apoio
financeiro e sem a aprovação das autoridades pertinentes, em 2012, o projeto teve que ser
descontinuado, e os porcos, sacrificados.
A partir de 1988 começaram a ser produzidos vacas, cabras, coelhos, ovelhas, frangos, porcos e
peixes transgênicos. As novas tecnologias de edição gênica poderão modificar a velocidade do
processo. No entanto, a comercialização de animais transgênicos ou seus produtos seguirá avançando
lentamente, não só pelos altos custos, como pelo tempo demandado para responder ao processo
regulatório e pela resistência eventual dos consumidores.
Experiências de transgênese visam melhorar a qualidade do leite de vaca, modificando as proteínas
(leite humanizado para lactantes) ou reduzindo a lactose (para as pessoas com intolerância). Na Nova
Zelândia e nos Estados Unidos vêm sendo obtidas vacas que produzem mais caseína no leite, uma
propriedade interessante para a indústria de queijos.
Algumas tentativas também foram feitas em relação à produção de fibras animais: ovelhas
transgênicas que não precisassem de determinados suplementos de aminoácidos na dieta;
modificação da estrutura das fibras de lã e de caxemira para facilitar o tingimento e diminuir o
encolhimento; alteração das propriedades da seda. A partir de uma proteína de aranha, sintetizada
por uma cabra transgênica, se desenvolveu e patenteou o BiosteelTM, um produto muito resistente
que pode ter diversos usos, inclusive militares.
Uma das maiores preocupações existentes é o risco de escapamento de um animal transgênico, e
a consequente possibilidade de difundir o transgene nas populações naturais. O risco depende de
algumas características do animal, especialmente a mobilidade, a capacidade de escapar do cativeiro
e a de voltar ao estado selvagem (Tabela 14.1). Outros fatores adicionais que devem ser considerados
em uma simulação de risco são a viabilidade juvenil, a idade de amadurecimento sexual, a fertilidade
do macho, a fecundidade da fêmea, a viabilidade do adulto etc.
186
TABELA 14.1. O risco de escapamento de um animal transgênico
ESPÉCIE
MOBILIDADE
CAPACIDADE DE VOLTAR
AO ESTADO SELVAGEM
CAPACIDADE DE ESCAPAR
DO CONFINAMENTO
Camundongos
Alta
Alta
Alta
Peixes
Alta
Alta
Alta
Insetos
Alta
Alta
Alta
Porcos
Baixa
Alta
Moderada
Aves
Baixa
Baixa
Baixa
Vacas
Baixa
Baixa
Baixa
--------------
AS NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO GÊNICA
A ablação dos chifres de animais criados em confinamento é um procedimento cruento que visa evitar
ferimentos do própio animal e do pessoal que os cuida. Algumas raças de gado estão desprovistas de
chifres, mas as etapas necessárias para introduzir esse carácter por cruzamento e seleção reduz a
qualidade da cria. Uma das primeiras aplicações da tecnologia CRISPR (do inglês, Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats) visa a obtenção de touros sem chifres.
Outras aplicações previstas abrangem o melhoramento genético de mascotes (peixes, cachorros) e
a marcação de ovos de galinha, possibilitando a sexagem dos embriões e sua inclusão na cadeia
alimentícia ou na produção de vacinas.
A AQUICULTURA
Os principais países produtores de peixes, mariscos e crustáceos por aquicultura são a Noruega, o
Chile, o Canadá, os Estados Unidos, o Reino Unido, a Nova Zelândia e os países asiáticos.
O desenvolvimento da aquicultura parece uma alternativa razoável para a produção de alimentos
porque, em função da pesca desmedida, os estoques de peixes nos mares e oceanos têm diminuído
assustadoramente. No entanto, do ponto de vista ecológico, ainda subsistem dúvidas em relação à
aquicultura. Alguns peixes não exigem nenhuma complementação da ração, como as carpas e tilápias.
Já o camarão e o salmão são criados com rações que incluem farinha de peixe. Quais seriam as
vantagens da aquicultura se for necessário extrair peixe para a preparação das rações?
A criação de peixes e mariscos é uma atividade empresarial que cria empregos, demanda poucos
insumos e gera um produto de alto valor agregado. Contudo, alguns problemas subsistem, como a
distância dos mercados de destino e a contaminação das águas costeiras, que dificulta a criação de
mariscos filtradores de plâncton, favorecendo o florescimento das algas. O gerenciamento destas
variáveis, nas fazendas de salmão, dá um retorno econômico importante para a Noruega, o Chile o
Canadá e os Estados Unidos.
No entanto, como as águas e os invernos canadenses são muito mais frios que os chilenos, onde o
salmão pode ser criado o ano inteiro, os produtores canadenses e norte-americanos se interessaram
por um salmão resistente ao frio e de crescimento rápido. Dentro desse contexto, a empresa
AquaBounty transferiu para o salmão do Atlântico um cassete de expressão, denominado
AquAdvantageTM, com dois genes codificadores de uma proteína anticongelamento e um hormônio de
crescimento do salmão do Pacífico (Figura 14.3). O peixe cresce rapidamente em condições comerciais,
187
http://bteduc.com
alcançando o tamanho equivalente ao de um salmão convencional em menos tempo (18 meses em
vez de 24 ou 30).
Para alguns especialistas, existiria o risco de invasão e substituição dos salmões naturais pelos
transgênicos, ou a introdução de genes de valor adaptativo, inicialmente maior que os das populações
selvagens, mas cujo valor diminuiria a médio prazo, levando a espécie à extinção (genes troianos). A
empresa AquaBounty considera esses riscos sob controle, em função da condição triploide dos
salmões GM AquAdvantage, que garante a esterilidade de 98,9% dos peixes e das condições
ambientais desfavoráveis em Prince Edwards Island (Canadá), onde serão produzidos os ovos.
Segundo o Protocolo de Cartagena, os peixes transgênicos devem ser criados exclusivamente em
contenção. Por isso, a exploração comercial de salmões transgênicos não poderá ser feita como até
agora, em jaulas marinhas; eles terão que crescer confinados em fazendas dentro do território, de
maneira a diminuir os riscos de escapamento. AquaBounty planeja desenvolver o processo no Panamá,
em regiões de altitude, com temperatura adequada e rios desfavoráveis para a sobrevivência do
salmão. A aprovação, em 2015, do FDA (Food and Drug Administration), da liberação comercial do
salmão AquAdvantage o torna o primeiro animal transgênico a entrar no mercado.
Estima-se que atualmente existam umas 30 variedades de peixes transgênicos em laboratórios de
diferentes lugares. Tilápias e carpas transgênicas se encontram em vias de aprovação em Cuba e na
China, respectivamente. Também estão sendo desenvolvidos camarões e mariscos desprovidos da
proteína responsável por 80% das alergias e uma truta com mais ácidos graxos Ômega 3.
--------------
FIGURA 14.3. O salmão transgênico AquAdvantage (Aquabounty Technologies)
Salmão do Pacífico (Chinook)
Oncorhynchus tshawytscha
Gene codificador
de hormônio de crescimento
Enguia do nordeste do Atlântico
Zoarces americanos
Gene codificador de
proteínas anticongelamento
Salmão do Atlântico (Salmo salar)
Alcança o tamanho definitivo em
18 meses, em vez de 24 a 30.
Criado em contenção
(Protocolo de Cartagena).
Triploidia (esterilidade de 98,9%)
188
Salmão AquAdvantage
(AquaBounty Technologies)
A SAÚDE DOS ANIMAIS
OS MODIFICADORES METABÓLICOS
Os hormônios são modificadores metabólicos que estimulam o crescimento, em bezerros e porcos, e
a produção de leite, em vacas. Os mais usados são os hormônios bST (somatropina bovina) e pST
(somatropina porcina), produzidos a partir de microrganismos transformados por engenharia genética.
Sua utilização gerou polêmicas, sendo proibidos em alguns países da Europa, mas permitidos em 19
países, entre os quais a Argentina, o México e o Brasil.
RESISTÊNCIA A DOENÇAS
A seleção genética de animais resistentes às doenças é uma forma de reduzir o prejuízo que elas
causam, estimado em 10 a 20% da produção. No Reino Unido, a resistência ao scrapie, por exemplo,
se tornou uma condição indispensável para a entrada de qualquer ovino em um programa de
melhoramento. Outra possibilidade interessante é a obtenção de bovinos resistentes à vaca louca, à
mastite e à brucelose.
O mapeamento do genoma dos animais domésticos facilita a tarefa de selecionar animais
resistentes a doenças, tais como frangos resistentes à doença de Marek e à salmonelose. Várias
pesquisas estão direcionadas à introdução de genes que confiram resistência a doenças que afetam o
gado, como a tripanossomíase ou a aftosa.
O porco africano é resistente ao vírus da febre suína, enquanto o porco europeu é sensível ao vírus.
Como eles não cruzam, os métodos clássicos de melhoramento tiveram que ser descartados. O
Instituto Roslin (Reino Unido) obteve porcos europeus resistentes ao vírus da febre suína africana,
alterando uma única base do genoma, mediante as novas ferramentas de edição gênica (ZFNs,
TALENs). A modificação esteve baseada na comparação entre os genomas de ambos os porcos.
PREVENÇÃO E TRATAMENTO
Na área agropecuária, a defesa sanitária envolve o controle de vacinas e o diagnóstico de doenças,
víricas (febre aftosa, peste suína) e bacterianas (tuberculose, brucelose, botulismo). Devido a sua
importância econômica, essas atividades exigem condições de trabalho estritas em laboratórios com
elevado nível de biossegurança (NB3, NB4).
Os principais produtos desenvolvidos para a saúde animal são vacinas, kits de diagnóstico,
tratamentos (antibióticos, antiparasitários) e suplementos (hormônios). Estes produtos são
necessários porque as práticas intensivas ou semi-intensivas favorecem a transmissão de doenças
entre os animais.
Existem numerosas vacinas contra as doenças dos animais; muitas pesquisas se direcionam
atualmente para a elaboração de vacinas de subunidades de antígeno em plantas modificadas
geneticamente, que possam ser administradas na ração. Também está sendo desenvolvida uma vacina
para imunizar os animais contra um hormônio reprodutivo (GnRH ou gonadotrophin-release
hormone), sendo esta uma alternativa para a castração de touros e porcos.
As análises de DNA possibilitam a tipificação dos agentes patogênicos e os estudos epidemiológicos.
Os ensaios imunoenzimáticos são utilizados para o diagnóstico de várias patologias e também para o
reconhecimento de diversos tipos de contaminação nos produtos (Salmonella, Escherichia coli,
Listeria).
A produção de medicamentos visa umas 200 doenças animais diferentes. As indústrias de saúde
investem aproximadamente US$ 400 milhões por ano em pesquisa e desenvolvimento, mas, de um
189
http://bteduc.com
modo geral, a saúde animal movimenta muito menos dinheiro que a saúde humana. Salvo em relação
aos animais de estimação, o mercado de saúde animal cresce lentamente. Algumas experiências em
andamento são a produção de anticorpos monoclonais para a artrite reumatoide no leite de
ruminantes, ou a síntese de um antibiótico de amplo espectro por vacas leiteiras, a fim de diminuir a
incidência de mastite por Staphylococus aureus.
Na América Latina, numerosas empresas do setor privado elaboram medicamentos, vacinas e
testes diagnósticos dirigidos à saúde animal. Entre as principais: Biogénesis e Bagó (Argentina), Vallée
(Brasil), BiosChile (Chile), Laverlam (Colômbia), IASA (México), Laboratórios Santa Elena (Uruguai).
Cuba se destaca pela vacina contra o carrapato, que é vendida em vários países da América Latina.
A aquicultura abre um espaço para as empresas que desenvolvem testes de diagnóstico e vacinas
para os patógenos que afetam as fazendas, como a argentina Tecnovax S.A. e as chilenas Recalcine e
AquaGestión, que desenvolveram uma vacina contra o vírus da anemia infecciosa do salmão.
Em relação à febre aftosa, uma endemia que afeta a produção de carne e de leite, novas vacinas
mais eficientes e fáceis de aplicar são indispensáveis nas regiões em que a doença não foi totalmente
erradicada e em que aparecem surtos eventuais: Argentina, Brasil, Colômbia, México, Paraguai e
Uruguai.
Do ponto de vista comercial, as vacinas DIVA (do inglês, differentiating infected from vaccinated
animals) são especialmente interessantes porque permitem distinguir animais infectados de animais
vacinados. Estuda-se também a substituição da vacina atual de vírus inativado, por alfafa transgênica
que expresse algumas proteínas do vírus da aftosa (plant-pharming).
Tecnologias avançadas são habitualmente aplicadas na produção de vacinas veterinárias. Até o
início de 2016, 20 vacinas geneticamente modificadas foram liberadas no Brasil pela CTNBio (Comissão
Técnica Nacional de Biossegurança).
NOVAS UTILIZAÇÕES DOS ANIMAIS DOMÉSTICOS
MODELOS DE ESTUDO PARA DOENÇAS HUMANAS
A transgênese é utilizada em vários animais (ratos, camundongos, coelhos e macacos), para transferir
características que permitem sua utilização como modelo de doenças humanas.
O primeiro modelo foi obtido em 1988, ao se transplantar tecidos do sistema imune extraídos de
um feto humano a camundongos geneticamente imunodeficientes; os animais adquiriram um sistema
imune humano. No mesmo ano, obtivera-se o oncomouse, um camundongo com um gene para câncer
de mama que permite testar tanto o efeito carcinogênico de algumas substâncias como a ação
terapêutica de outras. Com este camundongo, a Universidade de Harvard recebeu a primeira patente
para um animal transgênico.
A partir desse momento vários animais foram redesenhados para servir como modelo; coelhos com
diferentes genes para lipoproteínas humanas constituem linhagens sensíveis ou resistentes a regimes
ricos em colesterol; camundongos modificados geneticamente possibilitam os estudos sobre epilepsia,
obesidade; mapeamento genético de doenças neuropsiquiátricas em cachorros etc.
Mediante as novas técnicas de edição gênica (TALENs), o Instituto Roslin obteve, recentemente,
um modelo animal (porco) para o estudo da arterioesclerose. Foram alterados os genes codificadores
dos receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDL), sem os quais essa fração do colesterol se
acumula no sangue, causando a doença.
Alguns animais domésticos constituem um reservatório de doenças e as transmitem ao homem.
Preservar a saúde dos animais diminui o risco de contágio. Deste modo, uma vacina contra a
leishmaniose canina desenvolvida recentemente no Brasil visa a cortar a corrente de transmissão da
doença do cachorro ao homem.
190
XENOTRANSPLANTES
O porco é considerado o fornecedor ideal de órgãos para transplante, porque o tamanho e a função
destes são equivalentes aos dos humanos. Válvulas de porco substituem já as válvulas cardíacas
humanas, depois de eliminar todas as células de porco. A rejeição a um órgão transplantado poderia
ser evitada por knock out ou pelas novas técnicas de edição gênica, do gene da α 1,3galactosiltransferase (α1,3 GalT). Contudo, restaria um dos maiores riscos dos xenotransplantes, que
é a transmissão de vírus de uma espécie a outra.
OS ANIMAIS COMO BIORREATORES
As proteínas terapêuticas incluem hormônios, anticorpos, fatores de crescimento e fatores de
coagulação. Os genes codificadores de várias delas já foram transferidos a microrganismos. Porém,
devido à necessidade de modificações pós-traducionais, algumas proteínas só podem ser sintetizadas
em células animais, cultivadas em biorreatores. Contudo, a quantidade de proteína produzida é muito
pequena e os custos operacionais muito altos.
Uma alternativa é a transformação genética de um animal para convertê-lo em um biorreator que
expresse a proteína de interesse no leite, no sangue, na urina ou nos ovos. De fato, precisa-se de 2 a 3
vezes menos capital inicial, e o custo da proteína recombinante cai entre cinco e dez vezes.
Obviamente, a eleição de uma ou outra tecnologia dependerá da demanda do mercado e da dosagem
requerida. A aprovação de um produto demanda os testes clínicos correspondentes e normas
regulatórias são estritas e demoradas.
Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e PPL Therapeutics
anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgênica para o gene codificador do fator IX, uma
proteína fundamental para a coagulação sanguínea e que falta nos hemofílicos. Muitos produtos estão
sendo desenvolvidos atualmente no leite (vacas, cabras, ovelhas, porcos) e nos ovos (aves). Em relação
ao fator IX humano, por exemplo, porcos transgênicos excretam a proteína no leite em quantidade
250 a 1.000 vezes maior do que se consegue em biorreatores microbianos. Bastariam algumas
centenas de animais para suprir as necessidades de toda a população.
Testes clínicos de vários medicamentos encontram-se em andamento. Na Escócia, PPL Therapeutics
Ltd. cria 200 ovelhas produtoras de AAT (-1-antitripsina), uma substância que se encontra em testes
clínicos para o tratamento de enfisema hereditário e fibrose cística. Nos Paises Baixos, Pharming BV
obteve vacas produtoras de lactoferrina humana, uma proteína com propriedades antimicrobianas.
Na Argentina, BioSidus mantém um tambo farmacéutico com duas dinastias de vacas: Pampa,
produtora de hormônio de crescimento, e Patagonia, produtora de insulina. No Brasil, a Universidade
do Ceará mantém um rebanho de cabras transgênicas de raça Canindé que secreta no leite o fator de
estimulação de colônias de granulócitos humanos (hG-CSF).
Hematech Inc. mantém um rebanho em que os genes bovinos foram removidos (knock out) e
substituídos (knock in) por genes humanos. Uma vez imunizados, os animais produzem anticorpos
policlonais humanos que podem ser utilizados para combater infecções, assistir a pessoas com o
sistema imune comprometido ou tratar doenças autoimunes (artrite reumatoide). Anticorpos
humanos (Origen Therapeutics) e interferon (AviGenics) também são produzidos em ovos de aves
transgênicas.
A empresa GTC Biotherapeutics produz mais de 60 proteínas terapêuticas diferentes no leite de
cabras e vacas.Com a liberação de ATryn, uma antitrombina com propriedades anti-inflamatórias e
anticoagulantes, na Europa (2006) e nos Estados Unidos (2009), esperava-se uma modificação no
mercado de fatores de coagulação recombinantes. Porém, as promessas não se confirmaram. Só em
dezembro de 2015, o FDA aprovou a liberação comercial do medicamento Kanuma (sebepilase alfa),
191
http://bteduc.com
de Alexion Pharmaceuticals, para o tratamento de uma doença lisossômica. A enzima é produzida nos
ovos de galinhas geneticamente modificadas.
Outros produtos estão sendo preparados para fazer frente a um eventual surto de bioterrorismo
como, por exemplo, anticorpos humanos contra antraz, varíola e botulismo em vacas transgênicas
(TransOva), ou antídotos contra as armas químicas como o gás Sarin em cabras (Nexia).
Todas estas aplicações exigem o respeito a normas de segurança estritas. Parece fundamental
extremar os cuidados com a eliminação das carcaças e evitar o escapamento de animais transgênicos
para produtos medicinais, assim como a entrada acidental de seus produtos na cadeia dos alimentos.
O MARCO CONCEITUAL DOS TRÊS Rs
O uso de animais em experimentos tem suscitado numerosos debates, em função do sofrimento que
se lhes infringe e da dificuldade em se transpor ao ser humano a informação obtida nessas pesquisas.
Estima-se em 115 milhões o número de animais utilizados por ano em pesquisas científicas entre
roedores (83,5%), primatas (0,15%), gatos (0,06%) e cães (0,24%).
Em 1959, Russell e Burch estabeleceram um marco conceitual conhecido hoje como “os três Rs”
(do inglês replacement, reduction and refinement). No momento atual, a ciência não tem como
prescindir dos testes em animais em algum momento do desenvolvimento de novos medicamentos e
de outras pesquisas. Contudo, os Rs deram início a uma reflexão ética em relação aos animais (Tabela
14.2).
Admite-se hoje que nem tudo o que é tecnicamente possível deve ser permitido, cabendo aos
Comitês de Ética das instituições de pesquisa discutir este aspecto em relação aos projetos que
envolvem seres vivos, a fim de evitar o conflito entre o bem dos seres humanos e o dos animais.
Nos últimos anos tem-se desenvolvido numerosas iniciativas para substituir ou reduzir o número
de animais no ensino, especialmente na formação de pesquisadores e técnicos. Em bancos de dados
como NORINA (A Norwegian Inventory of Alternatives) encontram-se numerosas alternativas para
substituir as dissecções e outras práticas que envolvam procedimentos com animais.
Contudo, nem sempre os maus-tratos decorrem dos procedimentos experimentais, também
podem ser genéticos. Um exemplo significativo é o da raça bovina Belgian Blue, que apresenta um
crescimento muscular extraordinário devido a uma mutação no gene codificador da miosina. A carne
é macia e com muito pouca gordura, mas devido à largura reduzida do canal pélvico e ao grande
tamanho dos bezerros, o nascimento só é possível por cesárea. Alguns países, como a Dinamarca,
pedem a extinção desta raça.
-------------TABELA 14.2. Significado e alcance dos três Rs (do inglês replacement, reduction, refinement)
R
SIGNIFICADO
EXEMPLOS
1
Substituir
Substituição de animais vertebrados conscientes por seres inscientes ou por métodos in vitro.
2
Reduzir
Redução do número de animais necessário para a pesquisa mediante desenhos experimentais
mais apurados estatisticamente.
3
Refinar
Minimizar ao máximo o desconforto ou o sofrimento dos animais.
192
OS ANIMAIS DE ESTIMAÇÃO
O bem-estar dos animais domésticos é uma responsabilidade do homem, que deve lhes dar qualidade
de vida e minimizar o sofrimento e a dor. Entre estes, os bichinhos de estimação constituem um grupo
à parte. Submetidos a processos seletivos diversos, eles experimentam algumas consequências
negativas como a surdez, que atinge quase 10% dos dálmatas. Os cachorros, aliás, carregam 300
condições genéticas recessivas das quais 250 foram descritas também no homem.
Em 2015, estimaram-se em mais de 14 bilhões de dólares os gastos em produtos de saúde para os
pets norte-americanos. Trata-se de vacinas (raiva, hepatite, leucemia felina etc.) e medicamentos
(artrite, parasitas, alergias, problemas dentários, doenças cardíacas, falência renal, ansiedade de
separação, síndrome de disfunção cognitiva etc.).
O mercado também é propício para a clonagem dos animais de estimação. Algumas empresas já
estão envolvidas com a tecnologia, que até agora parece ser mais fácil em relação aos gatos que aos
cachorros.
O desenvolvimento de Night Pearls, um peixe transgênico que brilha no escuro, custou US$ 2,9
milhões. Inicialmente desenhado para monitorar a qualidade da água, este peixe se transformou em
mascote. Existem variedades com fluorescência verde, vermelha e com uma combinação das duas
cores, a um preço de US$ 17,40, no lançamento em Taiwan (2003).
193
C A P Í T U L O 15
BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS
OS ALIMENTOS FERMENTADOS
As fermentações foram descobertas empiricamente por diversos povos, em diferentes momentos
históricos. Assimiladas rapidamente pelo homem, suas duas vantages fundamentais eram a
preservação dos alimentos e a eliminação das substâncias tóxicas de alguns grãos.
Os processos fermentativos desenvolveram-se de modo artesanal até a segunda metade do século
XIX, quando as descobertas científicas sobre os microrganismos e as enzimas possibilitaram o
desenvolvimento da indústria de alimentos, que soube se apropriar de todas as ciências afins
(microbiologia, bioquímica, engenharia química, automação etc.).
Os alimentos fermentados constituem hoje a terceira parte da dieta humana. Seja por facilitar a
assimilação dos nutrientes, seja por apresentar menos substâncias tóxicas, esses alimentos entram na
categoria dos denominados alimentos funcionais, isto é, alimentos que provêm benefícios extras, além
dos que seriam esperados em função de sua composição.
Afora os produtos de panificação, as bebidas alcoólicas e os laticínios, existem muitos outros tipos
de alimentos fermentados. Alguns são de origem animal (pescado, embutidos e presuntos), mas a
maioria é de origem vegetal, tanto no Ocidente (chucrute, picles, azeitonas, café, cacau, chá) como no
Oriente (shoyu, misó, tempeh, kimchi etc.) e na África (gari, kokonte ou lafun, agbelima, togwa, kenkey
etc.).
O PÃO
A arte da panificação surgiu em diferentes lugares, entre 7000 e 5000 a.C. Os primeiros pães eram
umas bolachas planas, de cereais moídos e água, cozidas sobre pedras quentes. Logo deve ter sido
observado que, deixando a massa em repouso por um tempo, melhorava-se a textura e a
digestibilidade dos pães. O passo seguinte ocorreu, provavelmente, ao observar o crescimento do pão
quando se juntava, à massa recém-preparada, uma pequena parte da massa crua da preparação
anterior (“massa ácida” ou “pé de massa”). Este procedimento já era conhecido por egípcios e hebreus,
5 mil anos atrás.
Os estudos microbiológicos atuais indicam a coexistência, no “pé de massa”, de bactérias lácticas e
leveduras. As enzimas presentes no grão catalisam a transformação do amido em açúcares, que são
transformados em ácido láctico, pelas bactérias, e em etanol pelas leveduras. Devido à liberação de
CO2, formam-se bolhas que conferem porosidade e leveza à massa. Além de acelerar o crescimento, a
preparação de um “pé de massa” permite a seleção e o enriquecimento dos microrganismos dos
cereais.
FIGURA 15.1. A panificação
A massa também pode levar outros ingredientes, tais como gordura, açúcar, leite em pó, ovos, mel, xaropes, frutas,
especiarias etc.
Farinhas
Água
Leveduras
Enzimas
Outros Aditivos
Mistura dos ingredientes
Fermentação principal
Divisão da massa
Boleamento
Fermentação secundária
Moldagem
Fermentação final
Cozimento
Resfriamento
Corte em fatias
Embalagem e distribuição
--------------
Durante muitos séculos, a preparação do pão envolvia, necessariamente, o processo natural de
fermentação, de modo que cada padeiro tinha que preparar seu “pé de massa”. A passagem do
procedimento artesanal à panificação industrial ocorreu em 1876, nos Estados Unidos, com a produção
e venda de cubos de levedura prensada, mediante um processo patenteado pelos imigrantes austrohúngaros Charles e Max Fleischmann.
Atualmente, comercializam-se três tipos de fermento biológico (levedura Saccharomyces
cerevisiae) para a panificação: o fermento prensado ativo, com 68-72% de umidade, que requer
refrigeração durante o armazenamento e dura entre três e cinco semanas; o fermento seco não ativo,
que se conserva mais tempo e não exige refrigeração, mas deve ser hidratado antes de usar; e o
fermento ativo instantâneo, que não requer hidratação e pode ser adicionado diretamente aos
ingredientes secos.
Neste campo, as inovações não são bem aceitas. Na década de 1990, comercializaram-se no Reino
Unido linhagens obtidas por engenharia genética. Apesar de fermentar o pão rapidamente, facilitando
a vida e o sono dos padeiros, o seu uso foi logo descontinuado, principalmente devido à pouca
aceitação dos consumidores.
Apesar de alguns padeiros conservarem a prática da fermentação natural, os processos artesanais
estão desaparecendo, substituídos pela tecnologia da panificação industrial. Prepara-se a massa
misturando farinhas de um ou mais tipos, água, leveduras e diversos aditivos: emulsificadores, agentes
oxidantes e redutores, enzimas (e -amilases, hemicelulases, lipases etc.) e aceleradores da
fermentação.
195
http://bteduc.com
O processo fermentativo envolve várias etapas, durante as quais o CO2 liberado forma bolhas que,
retidas na massa, aumentam seu volume. Entre uma e outra etapa, a massa é dividida e boleada,
facilitando a redistribuição dos ingredientes e o desenvolvimento das características organolépticas. A
moldagem visa o alinhamento das fibras proteicas do glúten. Durante a cocção, a mistura etanol-água
se transforma em vapor, e a crosta adquire uma cor dourada. A seguir, os pães são cortados e
embalados (Figura 15.1).
O VINHO
A VINIFICAÇÃO
O vinho é uma bebida proveniente da fermentação alcoólica da uva, originada no norte da África e na
Europa, por volta de 3000 a.C. Durante o amadurecimento da uva, várias espécies microbianas se
sucedem, primeiro transformando os açúcares em etanol e, posteriormente, o etanol em ácido
acético. Considerando que o destino natural da uva é o vinagre, a arte da vinificação representa um
ganho tecnológico indiscutível.
A uva é composta por água (86%), açúcares fermentescíveis (12%) e moléculas diversas (2%). Retirase o sumo espremendo ou prensando a polpa, sendo frequente o agregado de enzimas de maceração
(pectinases, celulases e hemicelulases) para melhorar o rendimento.
O agente biológico da fermentação alcoólica é a levedura Saccharomyces ellipsoidea, que se
encontra na pele da uva. Salvo na produção artesanal, a fermentação não depende das leveduras
naturais da uva; a indústria vitivinícola conta com um leque amplo de linhagens, selecionadas para
favorecer o processo fermentativo.
Na vinificação, monitora-se cuidadosamente a fermentação alcoólica, até a conclusão do processo.
Procede-se então a duas trafegas, entre as quais ocorre uma segunda fermentação, denominada
fermentação malolática. Esta etapa, que é uma das mais complexas na elaboração dos tintos, se deve
à ação de bactérias lácticas, como Oenococcus oeni, que transformam o ácido málico (diácido) em
ácido láctico (monoácido). Em consequência da fermentação malolática, a acidez do vinho diminui e
aparecem as primeiras modificações aromáticas. Posteriormente, o vinho é clarificado e colocado para
envelhecer em tonéis ou garrafas, até o total desenvolvimento do buquê.
A obtenção de um vinho tinto ou branco depende basicamente do tipo de uva e do procedimento
seguido (Figura 15.2). Se quisermos obter vinho branco, utilizaremos uvas brancas ou tintas sem a pele
ou casca que as recobre. As uvas tintas com pele originam vinhos tintos, porque esta libera compostos
fenólicos (antocianinas, flavonas, taninos).
O CULTIVO DA VIDEIRA
Existem diferentes espécies de videiras. A Vitis vinifera fornece os vinhos mais finos, enquanto a Vitis
labrusca, a Vitis ripari e outras variedades mais rústicas da própria Vitis vinifera são utilizadas para a
elaboração de vinhos comuns. Para cada cultivo, existe uma combinação de solo e clima ideais,
denominada terroir, sem a qual dificilmente se obterão os melhores resultados.
Alguns vinhos resultam da mistura de uvas diferentes, sendo chamados vinhos genéricos ou de
corte. Os que são elaborados a partir de uma única variedade denominam-se varietais. Esta categoria
inclui nomes como Pinot Noir, Chardonnay e Pinot Blanc (vinhos de Borgonha), Cabernet-Sauvignon
(vinhos de Bordeaux), Alvarinho (vinhos de Portugal e Galícia), Tempranillo (vinho da ribeira do Douro),
Sangiovese (vinhos de Chianti) e Zinfendel (vinhos da Califórnia). Observe-se que, dependendo do
processo utilizado para a elaboração do vinho, a partir de uma variedade de uva como a Pinot Noir
poderão ser obtidos vinhos tão diferentes como um Borgonha ou um Champanhe.
Em 2007, um grupo franco-italiano completou o mapa do genoma da Vitis vinifera, variedade Pinot
196
Noir. A informação abrange mais de 30.000 genes, muitos dos quais respondem pelos aromas e
sabores dos vinhos, e outros regulam a quantidade de resveratrol, uma molécula que diminui os níveis
de colesterol. Os estudos genômicos abrem numerosas perspectivas para os viticultores. Uma
aplicação importante é o monitoramento da maduração da fruta, mediante arrays de marcadores
moleculares, possibilitando a escolha do momento adequado para a vindima.
-------------FIGURA 15.2. A vinificação
Vinificação em tinto
O mosto obtido por esmagamento da uva tinta passa para a cuba de fermentação, uma vez corrigidas a acidez e a quantidade
de açúcar. Depois da primeira fermentação (fermentação alcoólica), separa-se, por trasfega, o mosto da borra. Inicia-se a
segunda fermentação (fermentação malolática). Depois de clarificado, o vinho deve aguardar dois anos até estabilizar e ser
engarrafado. Os vinhos rosados ou rosés são obtidos seguindo um procedimento semelhante, mas deixando macerar durante
menos tempo o mosto com as cascas de uva. Também é possível consegui-los misturando vinhos brancos e tintos.
Vinificação em branco
O mosto é obtido por esmagamento de uva branca ou de uva tinta sem casca, sem permitir a maceração. Salvo em alguns
vinhos brancos de Borgonha, evita-se a fermentação malolática. Os vinhos espumantes (Champagne, Cava, Prosecco) passam
por uma segunda fermentação alcoólica na garrafa.
Uva tinta
Desengaçamento e esmagamento
Uva branca
Desengaçamento e esmagamento
Maceração
Inoculação
Fermentação alcoólica
Inoculação
Fermentação malolática
Clarificação
Clarificação
Envelhecimento
Engarrafamento
Engarrafamento
Vinho tinto
Vinho branco
197
http://bteduc.com
O cultivo da videira é uma tarefa complexa que exige tratamentos, enxertos e podas. Os viticultores
praticam a multiplicação vegetativa das videiras, o que garante uma qualidade constante, porém
aumenta a susceptibilidade da plantação aos patógenos. Espera-se que os estudos genômicos
permitam identificar e selecionar genes de resistência a algumas das enfermidades que afetam as
videiras.
A transferência de genes de resistência de uma variedade a outra é vista com muita desconfiança
pelos produtores, porque o rótulo de varietal é parte da estratégia de vendas dos vinhos de qualidade.
Contudo, alguns produtores consideram aceitável a transferência de genes de videiras rústicas para
plantas de elite, com o objetivo de melhorar a produção.
Com a entrada no mercado internacional de países menos apegados às tradições (Estados Unidos,
Chile, Argentina, Brasil, África do Sul, Austrália etc.), pode ser que as novas tecnologias genômicas se
apliquem na produção de plantas resistentes a doenças e pragas.
O ROL DA LEVEDURA NA VINIFICAÇÃO
Embora as propriedades organolépticas dos vinhos dependam basicamente do cultivar escolhido, as
enzimas da uva e as atividades metabólicas microbianas cumprem, também, um papel importante.
A transformação do mosto em vinho envolve inúmeras reações químicas, desenvolvidas por
leveduras e bactérias lácticas. Com o mapeamento do genoma de ambos os microrganismos, e a
construção de microarrays adequados, estas reações poderão vir a ser bem conhecidas e controladas.
Existe a tendência, na indústria moderna, de substituir as leveduras selvagens por leveduras
enológicas selecionadas. Contudo, alguns produtores consideram que estas últimas massificam a
qualidade do vinho, preferindo utilizar as leveduras nativas e obter assim um produto original
qualitativamente diferente dos outros. Bancos de leveduras nativas facilitam a preservação da
biodiversidade.
Recentemente, duas linhagens de leveduras geneticamente modificadas fizeram sua entrada na
indústria de vinhos dos Estados Unidos e Canadá. Trata-se da levedura ML01, que realiza ambas as
fermentações (alcoólica e malolática), evitando a produção de histaminas e da levedura ECMo01 que
degrada a ureia, impedindo a formação de uma substância carcinogênica.
A CERVEJA
As bebidas fermentadas representam uma opção saudável, na falta de água ou no caso de ela estar
contaminada. Todos os povos elaboraram alguma bebida fermentada a partir dos elementos de seu
entorno, fossem grãos, frutas, raízes, caules ou folhas.
Em 4000 a.C, os habitantes das margens dos rios Tigre e Eufrates (Mesopotâmia) preparavam 20
variedades de cerveja a partir de um procedimento bem simples. Esmigalhava-se o pão de cevada em
um recipiente com água açucarada e, uma vez concluída a fermentação, a bebida era filtrada e
transvasada a outro recipiente.
Os procedimentos melhoraram a partir do século VII, quando os frades introduziram algumas
inovações, como incluir diferentes tipos de ervas, uma prática que culminou com a adição de lúpulo,
no século XI. A descoberta da técnica de fermentação baixa, no século XIV, deu maior estabilidade à
bebida. Os trabalhos de Pasteur e o progresso da Microbiologia permitiram, no século XIX, o
desenvolvimento de uma poderosa indústria, cuja produção mundial supera os 1.000 milhões de
hectolitros por ano.
A fabricação da cerveja começa com a maltagem, um processo em que os grãos de cevada
germinados são secados e moídos. O malte assim obtido contém as enzimas desenvolvidas durante a
germinação, capazes de catalisar a transformação do amido em açúcares fermentescíveis (Figura 15.3).
Este processo é indispensável porque, não tendo amilases, as leveduras não fermentam o amido.
198
Na brasagem o malte é misturado com água, possibilitando a digestão do amido por ação enzimática.
Mais tarde o mosto é filtrado e fervido, sendo então acrescentadas as flores de lúpulo (Humulus
lupulus, da família das Canabináceas) que, além de ter uma ação antisséptica, conferem à bebida seu
sabor amargo característico.
A maltagem e a brasagem são atividades prévias à fermentação alcoólica, que será conduzida por
leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Sacharomyces carlbergiensis). Os processos mais tradicionais
utilizam leveduras que se acumulam no topo da cuba, originando as cervejas do tipo ale, com menos
de 4% de álcool. Contudo, existem outras leveduras que sedimentam no fundo, gerando as cervejas
de tipo lager, com mais de 6% de álcool. Uma vez concluída a fermentação do mosto, este recebe os
tratamentos finais que consistem em maturação, clarificação, carbonatação, pasteurização e
engarrafamento.
No momento, a tecnologia do DNA-recombinante se limita a transformações com genes do mesmo
gênero (Saccharomyces), visando conseguir linhagens mais eficientes em relação ao processo
fermentativo, adequadas à cevada e ao lúpulo de diferentes regiões do mundo. Até o momento, essas
linhagens não são utilizadas comercialmente.
-------------FIGURA 15.3. As etapas da produção de cerveja.
Cevada
Maltagem
(Maceração, germinação secagem e moagem do malte)
Malte
Brasagem
(Mistura, filtração e fervura do mosto)
Mosto
Cerveja
Acabamento
(Amadurecimento, pasteurização e engarrafamento)
Comercialização
--------------
OS QUEIJOS E IOGURTES
A PRODUÇÃO DE LATICÍNIOS
As raízes da produção de laticínios remontam ao ano 3000 a.C. (Oriente Médio), quando o homem
comprovara que o leite mudava de consistência e de sabor ao azedar. O soro podia ser consumido
fresco, e a adição de sal ao coágulo o conservava por mais tempo. Em torno de 2.000 a.C., a utilização
de estômagos de cabras e de ovelhas, como recipientes para o leite, permitiu obter queijos mais
199
http://bteduc.com
sólidos e robustos. Mais tarde, os romanos introduziram extratos de plantas, como o figo, para
coagular o leite.
A explicação destes fenômenos é simples. As bactérias que normalmente se encontram no úbere
dos animais contaminam o leite, proliferando e formando ácido láctico. Nesse meio ácido, as proteínas
precipitam, separando-se do soro. A coagulação também ocorre em presença das enzimas renina e
pepsina, da mucosa estomacal, e da ficina, do figo. Hoje, a produção mundial de leite fermentado
(iogurte, coalhada, quefir etc.) é de três milhões de toneladas por ano, enquanto a de queijos chega a
15 milhões de toneladas por ano (Figura 15.4 A).
Várias espécies bacterianas podem fermentar o leite: Streptococcus thermofilus, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus lactis, Bifidobacterium bifidum etc. A maioria dos
produtos vendidos como “leite fermentado” contém um número alto de microrganismos vivos; sendo
consumidos como probióticos, para prevenir o desenvolvimento de outros microrganismos
indesejáveis ou patogênicos no tubo digestivo.
Todos os queijos passam por três etapas: a coagulação, o dessoramento e a maturação (Figura 15.4
B). No entanto, a tecnologia de produção de queijos permite uma série de variações, que se traduz em
mais de 400 tipos diferentes. Algumas dessas variações são a origem do leite (vaca, cabra, ovelha,
búfalo), o agente da coagulação (calor, enzimas, bactérias lácticas ou ambas), a umidade e consistência
(mole, semiduro, duro e muito duro) e a maturação. Muitos países aceitam 35 variedades, definidas
por regras internacionais.
O ROL DE MICRORGANISMOS E ENZIMAS
A produção de queijos envolve a acidificação do meio pelas bactérias lácticas, geralmente Lactococcus
lactis e Streptococcus thermophilus. O coalho, uma substância extraída do estômago de bezerros, foi
utilizado, durante séculos, como agente da coagulação enzimática, mas sua obtenção ficou cada vez
mais cara e difícil.
Para estabilizar a produção, e satisfazer a maior demanda pelos produtos lácteos, transferiu-se o
gene da renina a uma bactéria (Escherichia coli) e, mais tarde, a uma levedura (Kluyveromyces) e um
mofo (Aspergillus). Além da enzima produzida (quimosina) ser mais pura que a renina, os suplementos
são constantes, aumentando a eficiência da produção de laticínios e diminuindo os custos.
O desenvolvimento de bactérias e fungos durante a maturação confere suas características típicas
a alguns queijos como, por exemplo, a presença de olhaduras produzidas por Propionabacterium no
Gruyère, ou de um manto branco de Penicillium no Camembert e no Brie ou, ainda, as estrias azuis de
Penicillium no Gorgonzola ou no Roquefort.
O melhoramento de bactérias lácticas visa a obtenção de linhagens mais estáveis, resistentes aos
vírus bacteriófagos, e produtoras de bacteriocinas, que são substâncias com atividade antimicrobiana.
Linhagens capazes de liberar mais rapidamente suas enzimas poderiam acelerar o processo de
formação de aromas. Com o mapeamento do genoma, espera-se uma intensificação das pesquisas
nessa direção.
O sequenciamento de várias linhagens de Streptococcus thermophilus, na década de 2000, revelou
a presença de sequências CRISPR, relacionadas com a infecção por bacteriófagos, sugerindo a
existência de um mecanismo de defesa bacteriano. Exposta a um vírus, a bactéria integra algumas de
suas sequências gênicas; em um contato posterior essas sequências servirão como guia para a
destruição de qualquer DNA semelhante. O trabalho fora iniciado na empresa Danisco, posteriormente
adquirida por DuPont, que acumula várias patentes. A edição gênica é a técnica mais recente
disponível para conseguir a resistência das bactérias da indústria de laticínios aos bacteriófagos, uma
ameaça que causa grandes perdas.
200
FIGURA 15.4. A produção de laticínios
A. Iogurte tradicional e iogurte batido. As variações dependem de acréscimos (açúcar, frutas etc.) e de modificações de
consistência (cremoso, firme, batido).
Leite + leite em pó (+ açúcar)
Pasteurização
Inoculação com lactobacilos
Preenchimento das embalagens
Fermentação láctica
Resfriamento
Agitação (+ adição de frutas)
Preenchimento das embalagens
Iogurte tradicional
Iogurte batido
Comercialização
Comercialização
B. Queijo. Os agentes biológicos intervêm nas etapas de coagulação e na maturação de alguns produtos.
Leite
Pasteurização
Inoculação com lactobacilos, coalho ou enzimas e adição de CaCl 2
Coagulação
Dessoramento
Enformagem, prensagem, viragem e salga
Inoculação com fungos e/ou bactérias
Maturação
Embalagem e comercialização
201
http://bteduc.com
A PROTEÍNA DE CÉLULA ÚNICA
Em um sentido amplo, o termo SCP (do inglês single cell protein) se refere à proteína bruta ou refinada,
originada pelo crescimento de bactérias, algas, fungos ou mofos. De fato, os microrganismos são muito
mais produtivos que os animais de criação. Enquanto uma vaca produz 200 g de proteína por dia, os
microrganismos, teoricamente, podem produzir 25 toneladas, no mesmo tempo e em condições
ideais.
Nas décadas de 1960 e 1970, especulava-se com a utilização de derivados do petróleo como
matéria-prima para o crescimento microbiano, mas, com a crise dos anos 1980, a ideia de um “bife de
petróleo” foi abandonada. Atualmente utilizam-se como substrato os excedentes e os restos agrícolas
ou industriais, e a maioria dos processos visa o enriquecimento de rações animais.
A introdução de proteína microbiana na alimentação humana demanda um processo extra de
purificação, por ter um conteúdo de ácido úrico muito alto. Contudo, a empresa Ranks Hovis
McDougall (RHM) conseguiu um produto, denominado Quorn, adaptado para a nutrição humana,
utilizando o fungo Fusarium graminearum. Comercializado no Reino Unido, o alimento apresenta um
alto teor proteico (45%), uma composição em aminoácidos parecida com a da carne de vaca, um alto
conteúdo de fibras e uma quantidade aceitável de ácidos nucleicos (1%). Por não ter cheiro ou sabor,
o produto pode ser utilizado como substituto de peixe, frango ou carne. A semelhança dependeria do
comprimento das fibras.
OS ADITIVOS
OS DIVERSOS TIPOS
A adição de algumas substâncias nos alimentos tem diversos objetivos como, por exemplo, conserválos por mais tempo (antibióticos, ácido acético, ácido láctico, etanol), complementar seu valor nutritivo
(vitaminas, aminoácidos) ou mudar a consistência (gomas e enzimas). Os aditivos também são usados
para melhorar a cor e o flavor, um termo que abarca o aroma, o sabor e a textura. Apesar da má fama
que os acompanha, só uma em 6.000 pessoas apresenta alergia e intolerância aos aditivos, um número
baixo, considerando que uma pessoa em 50 é alérgica ou intolerante a algum alimento.
Os principais aditivos utilizados pela indústria de alimentos são os ácidos cítrico e láctico, alguns
corantes naturais (-caroteno, riboflavina), flavorizantes (monoglutamato de sódio, extrato de
levedura, aromas), gomas espessantes (xantana, gelana, dextrana), antioxidantes (-caroteno),
vitaminas (B2, B12, Biotina), enzimas e antibióticos. Alguns desses aditivos são obtidos em culturas de
células vegetais. Outros têm uma origem microbiana, sendo utilizadas linhagens de microrganismos
geneticamente modificados para sua produção industrial.
Vimos, anteriormente, o importante rol desempenhado por algumas enzimas na produção de
alimentos e bebidas por fermentação. Falta destacar o uso da lactase na elaboração do leite
deslactosado, um produto dirigido às pessoas com intolerância à lactose. E da pectinase, que, junto
com celulases e amilases, facilita a extração do suco de frutas retido na pectina, sendo também
utilizada na clarificação do suco.
Finalmente, entre os antibióticos usados para conservar alimentos, citaremos a Nisina (INS234),
que inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas em queijos, salsichas e produtos cozidos de
origem avícola, e também a Natamicina ou Pimaricina (INS235), utilizada como conservante na
superfície de produtos cárneos embutidos.
202
FIGURA 15.5. A produção de xarope de frutose
A hidrólise e a sacarificação do amido produzem glicose; esta é transformada em frutose pela enzima glicose-isomerase,
imobilizada em um biorreator.
Amido de milho, batata ou trigo
Amilases e glicoamilases
Hidrólise e sacarificação
Glicose
Isomerização
(Invertase imobilizada)
Frutose
--------------
OS ADOÇANTES
Outro caso interessante é o dos adoçantes. O aspartame (ácido aspártico e fenilalanina) é consumido
para limitar a ingestão de calorias, e o xilitol, para diminuir a incidência de cáries dentárias. Outros,
como o xarope de glicose ou de frutose, substituem o açúcar na indústria de alimentos.
A hidrólise ácida ou enzimática (-amilase e glicoamilase) do amido do milho produz xaropes de
maltose e de glicose. Já a ação enzimática da lactase sobre o soro das indústrias de laticínios origina
um xarope de dextrose (glicose, galactose). Uma vez refinados e concentrados, esses xaropes podem
ser usados como ingredientes na elaboração de produtos alimentícios (biscoitos, sorvetes etc.).
O poder adoçante da glicose é menor que o da frutose, mas a transformação enzimática (invertase
ou glicose isomerase) transforma uma em outra (Figura 15.5). O resultado é um xarope (42% de
frutose, 52% de glicose), que pode ser concentrado por métodos cromatográficos, até alcançar um
teor de 90% de frutose. A indústria de refrigerantes substitui a sacarose pelo xarope de frutose, com
uma concentração de 55%, obtido mediante a mistura dos dois tipos.
O processo começou a ser estudado na década de 1960, sendo o custo da glicose-isomerase o
principal fator limitante da tecnologia. Com o desenvolvimento das técnicas de imobilização
enzimática, o processo tornou-se econômico, possibilitando o uso do amido proveniente de cereais
excedentes, mas, por outro lado, prejudicou os países produtores de açúcar, que viram diminuir a
demanda por este produto.
O descobrimento de um gene microbiano capaz de transformar a sacarose em cadeias curtas de
frutose (fructanos), com o mesmo gosto e desprovidas de calorias, indica que novos produtos poderão
entrar em breve no mercado de adoçantes.
OS ALIMENTOS BIOFORTIFICADOS
Combate-se a fome de uma população dando-lhe acesso aos alimentos. Contudo, a falta total de
alimentos é, hoje, um fenômeno menos frequente que a desnutrição, por carência de determinados
nutrientes na dieta. Descrita magistralmente por Josué de Castro, na década de 1950, essa fome
203
http://bteduc.com
parcial, ou fome oculta, ainda afeta mais da metade da população mundial, fundamentalmente
mulheres e crianças, sendo a causa de diversas doenças.
Segundo a Organização Mundial da Saúde, o ferro, o zinco e a vitamina A são as principais
deficiências nutricionais dos países em desenvolvimento. A estratégia tradicional consiste em
suplementar os alimentos industrializados com os nutrientes correspondentes. Existem outras
possibilidades, tais como a fertilização dos solos e, consequentemente, o enriquecimento das culturas
de base.
Contudo, o melhoramento genético parece ser a estratégia mais promissora para aumentar as
concentrações de nutrientes nas culturas de base (arroz, milho, trigo, feijão, mandioca e batata-doce).
A engenharia genética pareceria, a priori, a via mais rápida para fortificar os alimentos. Porém, os
empecilhos legais encontrados pelo arroz com provitamina A (Golden Rice), que conta com mais de 10
anos pronto sem ter sido comercializado, desestimulam a escolha dessa tecnologia.
Na biofortificação dos cultivos são utilizadas outras tecnologias com base biológica. Nos Bancos de
Germoplasma do CGIAR já foram encontradas variedades de feijão com maior conteúdo de ferro, de
arroz e trigo com altos níveis de zinco, de mandioca, milho e batata-doce ricos em vitamina A etc. As
novas técnicas de análise genética de traços quantitativos e, especialmente, a seleção assistida por
marcadores moleculares facilitam o melhoramento genético das culturas de base.
As novas variedades deverão ser altamente produtivas e contar com os nutrientes desejados.
Espera-se que contem com a aceitação das populações necessitadas e, também, que os nutrientes
sejam assimilados de maneira a melhorar sua condição nutricional.
A biofortificação de alimentos é um programa internacional desenvolvido por HarvestPlus (CGIAR),
um consórcio de instituições de pesquisa e agências de desenvolvimento que age especialmente na
América Latina e na África. No Brasil, a Embrapa Agroindústria de Alimentos participa com o projeto
BioFORT, tendo já desenvolvido variedades biofortificadas de feijão e milho. Os primeiros testes estão
sendo realizados em Sergipe.
SEGURANÇA ALIMENTAR
A noção de segurança alimentar está baseada na tradição, de modo que é inevitável que, com o
desenvolvimento de uma moderna indústria de alimentos, surjam alguns questionamentos.
Atualmente, utilizam-se linhagens microbianas selecionadas (starters) para iniciar as fermentações;
ao acabar o processo fermentativo, essas linhagens permanecem no meio, como os lactobacilos dos
iogurtes, ou são eliminadas por calor ou filtração, como as leveduras do pão e da cerveja.
Apesar de ter passado por uma série de processos seletivos, que as torna muito diferentes
geneticamente das linhagens selvagens, as linhagens starters são bem conhecidas e não representam
risco algum para a saúde. Classificadas pelas agências internacionais como GRAS (do inglês, generally
recognized as safe), essas linhagens são as únicas permitidas na produção de alimentos.
Não existem normas explícitas sobre o que seria um OGM food-grade, isto é, um microrganismo
transgênico que possa ser utilizado na indústria de alimentos. Alguns aspetos de biossegurança teriam
que ser considerados. Um deles seria evitar ou eliminar qualquer gene de resistência a antibióticos
que tivesse sido introduzido como marcador seletivo na transferência gênica. O outro diz respeito aos
organismos doadores de genes, esboçando-se diferentes critérios.
Segundo um critério estrito, para poder ser considerado food grade, um OGM deveria conter
exclusivamente DNA da mesma espécie (cisgênico), aceitando-se a presença de pequenos fragmentos
sintéticos de DNA, sempre que não codifiquem DNA ou RNA, na construção gênica. Em outros termos,
a tecnologia do DNA-recombinante utilizaria microrganismos de diferentes linhagens da mesma
espécie.
204
Atualmente, tem obtido aceitação um critério mais amplo, permitindo a inclusão de DNA de outros
microrganismos alimentares, sob a condição de estes pertencerem ao mesmo grupo de
microrganismos que participam no processo como, por exemplo, a transferência de genes das
bactérias maloláticas para as leveduras da vinificação.
A aceitação de OGMs nos alimentos depende das regulamentações de cada país, bem menos
flexíveis na Europa que nos Estados Unidos e no Canadá, onde recentemente fora colocada no
mercado uma linhagem de Lactococcus, geneticamente modificada e considerada GRAS.
As enzimas cumprem um importante papel em várias das indústrias de alimentos (produção de
pães, biscoitos, laticínios, sucos de frutas, bebidas alcoólicas, derivados do amido e de proteínas).
Atualmente, mais de 30 enzimas diferentes são utilizadas no processamento de alimentos.
A primeira enzima sintetizada por um microrganismo transgênico foi a quimosina, utilizada há anos
na produção de queijos, como substituto da renina de origem animal. Hoje, aproximadamente 80%
dos queijos são elaborados com quimosina, sendo aceitos pelos consumidores lactovegetarianos.
Os microrganismos utilizados para a síntese de enzimas food-grade são organismos pertencentes à
categoria GRAS, bem conhecidos e altamente produtivos, aos quais foram transferidos os genes de
interesse, mediante engenharia genética. Esses OGMs não estão presentes na preparação final que,
depois de purificada, contém exclusivamente a enzima. Essa modalidade produtiva garante à indústria
de alimentos várias enzimas seguras e de baixo custo, entre proteases, amilases, lipases, lactases,
pectinases, glicose-oxidase, invertases etc.
A esse respeito, pareceria haver um consenso amplo, incluindo a Comissão Europeia, que considera
que os aditivos (corantes, aromas e flavorizantes), só devem ser rotulados como sendo de origem
transgênica se o produto final tiver DNA ou proteína de origem recombinante.
A mais alta autoridade internacional sobre os alimentos é o Codex Alimentarius, uma comissão de
FAO/WHO, reconhecida por 169 países. Esta Comissão se encarrega de estabelecer uma metodologia
que permite analisar a segurança alimentar em relação aos produtos derivados de microrganismos
geneticamente modificados
205
C A P Í T U L O 16
BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS
Será transgênico? Quantas vezes temos escutado essa pergunta, imbuída de desconfiança? A resposta
nem sempre é fácil porque o termo “transgênico” é aplicado, no dia a dia, com distinto sentido e em
contextos diferentes, aos alimentos geneticamente modificados (AGMs).
Mesmo aprovados pelas autoridades correspondentes, poucos AGMs são consumidos
diretamente: o milho, a batata inglesa e a berinjela resistentes a insetos, o feijão e a papaia resistentes
a vírus e o salmão de crescimento rápido. Os cultivos transgênicos biofortificados, como o arroz com
vitamina A (arroz dourado), ainda não foram aprovados.
-------------FIGURA 16.1. O que é um transgênico?
(1) Feijão resistente a vírus, milho resistente a insetos, salmão de crescimento rápido; (2) Frango; (3) Queijos, Aspartame;
(4) Arroz dourado; (5) Óleo de soja; (6) Biscoitos e mistura para bolos.
1. Plantas e/ou animais
transgênicos, consumidos como
alimento
2. Animais alimentados com rações
preparadas com cultivos
transgênicos
3. Aditivos (conservantes, adoçantes,
modificadores de consistência,
complementos, enzimas etc.)
produzidos por microrganismos
transgênicos.
5. Produtos industrializados,
derivados de um cultivo
transgênico
6. Produtos industrializados, contendo
ingredientes provenientes de cultivos
transgênicos
4. Cultivos biofortificados
(transgênicos)
A maioria das rações dos animais de criação contém soja e milho transgênicos, isto é, tolerantes a
herbicidas e/ou resistentes a insetos. Sua aceitação é cada vez mais ampla, simplesmente porque a
quantidade de milho e soja convencional não é suficiente para alimentar os animais de criação.
O óleo de soja, utilizado na culinária, é extraído do grão de soja geneticamente modificado, sendo
considerado transgênico apesar de não conter DNA. Os alimentos industrializados podem conter
alguns componentes de origem transgênica (soja, milho), assim como substâncias produzidas por
microrganismos geneticamente modificados (enzimas, aditivos etc.).
Contudo, para a maioria das pessoas, as diferenças entre esses alimentos permanecem confusas e
o termo “transgênico” muitas vezes é utilizado em forma pejorativa (Figura 16.1).
A ENTRADA DOS TRANSGÊNICOS NA CADEIA ALIMENTAR
Basta olhar com atenção as naturezas-mortas dos quadros de pintores de séculos passados para
comprovar que os produtos expostos nas prateleiras dos supermercados pouco têm a ver com os
vegetais e animais de outrora.
Sem conhecimento nenhum das leis da hereditariedade, o homem selecionou as variedades que
lhe pareceram mais interessantes, por serem plantas mais produtivas, ter frutos mais saborosos etc.
Em princípios do século XX, a Genética deu embasamento científico ao melhoramento vegetal e animal
e, a partir da década de 1940, utilizaram-se a radiação e as substâncias mutagênicas para obter novas
variedades vegetais, com mais apelo para produtores e consumidores.
A seguinte revolução genética ocorreu na década de 1990, com a primeira onda de plantas
geneticamente modificadas: milho, soja, algodão e canola. Com traços de tolerância a herbicidas e/ou
de resistência a insetos e infecções virais, essas plantas mais produtivas geram mais lucros, sendo
aceitas rapidamente pelos produtores agrícolas de vários países.
Embora em alguns casos, como o milho, as novas tecnologias diminuíram as contaminações por
fungos e melhoraram a qualidade da matéria-prima, a percepção dos consumidores não identificou
vantagens diretas. Isso poderia explicar, em parte, a adoção de uma atitude negativa em relação aos
organismos geneticamente modificados.
MELHORANDO A CONSERVAÇÃO
Para despertar o interesse do consumidor seria necessário fornecer-lhe produto com qualidades que
o beneficiem diretamente, tais como uma melhor conservação dos frutos. Uma dessas tentativas foi a
produção de um tomate com maior durabilidade na prateleira.
O tomate amolece com o tempo, tendo que ser colhido ainda verde e transportado rapidamente
até o lugar de comercialização, onde a maturação é induzida com etileno. Inativando a enzima
responsável pelo amolecimento do fruto, o fruto permanece mais tempo na planta, ganhando cor e
sabor.
Gerado por tecnologia anti-sense, o primeiro AGM foi o tomate FlavSavr (Calgene Inc.), liberado
nos Estados Unidos em 1994 e descontinuado pouco tempo depois, devido a seu custo. Mais tarde,
outro tomate de maturação lenta ocupou esse nicho de mercado. Diferentemente do FlavSavr, este
tomate, que não é transgênico, teve uma expansão muito rápida, sendo comercializado em vários
países com diferentes nomes.
Dos AGMs que são consumidos diretamente, poucos foram comercializados: o milho resistente a
insetos (em numerosos países), a batata e a berinjela resistentes a insetos (esta última em Bangladesh)
e a papaia resistente a vírus, que, na década de 1980, salvara da falência os produtores do Havaí. Nos
Estados Unidos, já entraram no mercado as maçãs Arctic Granny e Arctic Golden (Okanagan Specialty
Fruits Inc.). Nas duas variedades foi silenciado o gene codificador da enzima polifenol oxidase, que
207
http://bteduc.com
causa o escurecimento das maçãs. Outro produto aprovado é a batata Innate (J.R.Simplot), uma marca
que se aplica a cinco variedades, geneticamente modificadas, para resistir ao míldio e formar menos
acrilamida na fritura.
MELHORANDO AS PROPRIEDADES INDUSTRIAIS
Outra forma de interessar o consumidor é melhorando algumas das propriedades dos alimentos
industriais: óleo de canola de composição adequada às frituras; trigo com características especiais para
a panificação; ou batata com mais amido para absorver menos gordura ao fritar.
Contudo, nem sempre a tentativa esteve acompanhada de sucesso. Um tomate com mais pectina,
desenvolvido por Zeneca Plant Science, a partir de variações genéticas detectadas em cultura de
tecidos, chegou a ser comercializado no Reino Unido, na década de 1990. Esse tomate era utilizado na
preparação de massa ou purê de tomate, com menos consumo de energia e menor necessidade de
aditivos (espessantes) que o fruto tradicional. O produto resultava mais econômico, para a indústria e
o consumidor, sendo vendido pela rede Sainsbury com bastante aceitação. No auge da campanha
contra os ALMs (Frankenfoods), o produto teve que ser retirado do mercado.
Recentemente aprovado nos Estados Unidos, o salmão AquAdvantage de crescimento rápido
poderia encontrar menos aceitação entre os consumidores que entre os aquicultores de outros países,
potenciais compradores de alevinos.
MELHORANDO AS CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS
Uma terceira forma de chegar ao consumidor seria mediante produtos com melhores características
nutricionais: carne e leite com menos gordura, soja e batata com mais proteína, canola com vitamina
A, milho com metionina, mandioca e batata sem toxinas, camarão e amendoim sem substâncias
alergênicas etc.
Também seriam bem-vindos alimentos com melhores propriedades organolépticas, tais como
pimentões e melões com mais aroma, ou cebolas que não façam chorar. O consumidor também
poderia ser atraído por alimentos com componentes biologicamente ativos, como os antioxidantes do
chá verde ou as substâncias capazes de diminuir o colesterol do alho e da cebola.
Contudo, os casos analisados a seguir indicam que o problema pode ser muito mais complexo.
O arroz é uma planta que não produz vitamina A. Na Ásia, onde este constitui a base da
alimentação, a deficiência vitamínica mata 1 milhão de pessoas por ano e causa cegueira irreversível
em outras 500.000. Um grupo de pesquisadores, liderado por I. Potrykus, obteve, na Suíça, mediante
a transferência de genes do narciso, um arroz (Golden Rice) com a capacidade de sintetizar o ßcaroteno, que é um precursor da vitamina A.
O projeto, que interessa mais os pobres que os ricos, contou com subvenções privadas, e várias das
grandes corporações cederam as suas patentes. Apesar de estar pronto desde 1999, o Golden Rice
ainda não chegou ao mercado, tais os empecilhos legais encontrados pelos grupos contrários aos
transgênicos, que adiam sua distribuição. Se o arroz dourado tivesse sido obtido por vias
convencionais, estaria no mercado desde 2003.
Bem diferente é o caso da soja Vistive® (Monsanto), que reúne um traço transferido por técnicas
de melhoramento convencionais (baixo teor de ácido linolênico) e um traço de origem transgênica
(tolerância ao herbicida Roundup). Com 60% menos de gordura saturada, o produto representa um
passo adiante na prevenção de doenças cardiovasculares e de altos níveis de colesterol. Lançado no
mercado norte-americano em 2005, empresas como Kellog e Cargill o utilizaram logo na preparação
de alimentos com melhor qualidade nutricional. Por se tratar de um nicho promissor, outras
variedades com alterações no tipo de ácidos graxos estão a caminho (Soymega™, com mais Ômega 3).
208
A FAVOR OU CONTRA?
O homem não se alimenta exclusivamente por motivos fisiológicos. Escolhem-se os alimentos em
função da satisfação sensorial, emocional e afetiva que se espera obter, sendo determinante o peso
das considerações econômicas. A seleção dos alimentos ocorre dentro de uma tradição sociocultural,
que inclui a noção do que é saudável, um conceito mal definido e cambiante.
Por essas razões, a pergunta do título banaliza uma questão complexa e reflete a falta de consenso
sobre o tema. Seja qual for a resposta, ela estará atrelada ao momento histórico que vivemos e às
nossas concepções políticas, econômicas e sociais. Nossa atitude depende da confiança depositada no
conhecimento científico e no progresso tecnológico, em função da qual os novos alimentos serão
vistos como produtos interessantes ou como uma ameaça.
Apesar da subjetividade que rodeia a questão, alguns dados precisos ajudam a compreender
melhor a origem e os alcances da polêmica. Em 1996, culmina na Europa a crise da “vaca louca”. Em
1997, a União Europeia aprova o milho resistente à broca de Novartis, portador de um gene marcador
de resistência a ampicilina. Em 1999, estoura na Bélgica o escândalo dos frangos contaminados por
dioxinas. No mesmo ano, A. Pusztai faz uma comunicação mediática sobre a toxicidade de batatas
transgênicas (não comerciais) em ratos, que nunca foram confirmadas. Seja como for, a percepção
pública é de insegurança alimentar, possibilitando a formação de uma oposição feroz.
De um lado, estavam as empresas de biotecnologia, ligadas a poderosos conglomerados
multinacionais e com interesses econômicos muito bem definidos. Do outro, as redes de distribuição
de alimentos (Carrefour, Mark & Spencer), associadas aos ambientalistas (Greenpeace, Friends of
Earth) e aos produtores agrícolas (Confédération Paysanne). Com uma bem-sucedida campanha de
marketing (“não queremos frankenfood”), essas redes aproveitaram a oportunidade para impulsionar
seus próprios produtos e lançar suas próprias marcas.
Sem argumentações baseadas em princípios científicos, a discussão acirrou o enfrentamento entre
partidários e oponentes dos AGMs. Os termos progressista e reacionário foram usados
indiscriminadamente por ambos os grupos, esquecendo que o dissenso e a discussão fazem parte das
sociedades democráticas. Infelizmente, nessa campanha, queimaram-se comércios, laboratórios de
pesquisa e campos com cultivos experimentais.
Os fatos continuam sendo preocupantes porque, se nos países ricos da União Europeia não faltam
alimentos, e a escolha de uma tecnologia pode depender de considerações econômicas ou ideológicas,
nos países mais pobres, a adoção ou rejeição de uma tecnologia é uma decisão que pode ter
gravíssimas consequências para sua população, condenando-a inclusive à fome. Na Zâmbia (2002) e
em Angola (2004), os governos rejeitaram o milho, enviado como ajuda humanitária para alimentar a
população, argumentando que era transgênico. Outros países africanos também chegaram a proibir a
importação de AGM (Malaui, Moçambique e Zimbábue).
O QUE O CONSUMIDOR PRECISA SABER
A NOÇÃO DE SEGURANÇA
A noção de segurança alimentar costuma ser bastante flexível. Quando introduzida na Europa, a batata
foi vista como um alimento perigoso. A pasteurização do leite teve opositores ferrenhos,
argumentando que alteraria a qualidade de um alimento saudável. O amendoim é considerado seguro,
mas pode não sê-lo se estiver contaminado com fungos. Muitas pessoas são alérgicas ao kiwi,
introduzido recentemente no Ocidente. Algumas pessoas continuam ingerindo gorduras em
quantidade, mesmo sabendo que são perigosas.
209
http://bteduc.com
Todos os AGMs comercializados atualmente foram devidamente analisados, e aprovados, no país de
origem. Milhões de consumidores os consomem há duas décadas, entre norte-americanos,
canadenses, sul-africanos, brasileiros, argentinos e chineses. E vários Comitês Científicos, Prêmios
Nobel, Academias de Ciências e organizações internacionais concluíram que os AGMs disponíveis são
tão seguros quanto os alimentos tradicionais.
Porém, frente a uma intensa propaganda e recebendo opiniões contraditórias, o consumidor
consciente acaba sentindo-se inseguro sobre várias questões.
A INGESTÃO DE DNA
A ingestão de DNA, per se, não é perigosa. Este é um componente de nossos alimentos: um tomate
tem 7mg de DNA, uma banana, 50 mg, e um sanduíche, 60 mg. Esse DNA é digerido normalmente,
junto com os outros componentes dos alimentos.
Em relação ao AGM, calcula-se que uma vaca de 600 kg consumindo uma ração composta por milho
geneticamente modificado, ingeriria 600 mg de DNA por dia, dos quais 1,5 mg seria DNA
recombinante, o que corresponde a 0,00024% do DNA ingerido diariamente na ração, uma proporção
muito baixa.
Até o momento, não há evidência alguma de transferência do DNA ingerido ao homem. Alguns
fragmentos muito pequenos e degradados de DNA podem ser encontrados no plasma sanguíneo e no
espaço intercelular. Denominado cfDNA (do inglês, cell-free DNA), sua origem são as células dos
alimentos digeridos no intestino e as células mortas dos tecidos em redor. Esses pequenos fragmentos
do cfDNA não entram nas células; se isso acontecesse, ter-se-iam encontrado sequências de nossos
alimentos integradas no genoma.
OS MARCADORES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS
Tampouco temos evidências de transferência in vivo do DNA ingerido aos microrganismos do intestino.
Porém, os estudos in vitro indicam que, mesmo em uma frequência extremamente baixa, essa
transferência poderia ocorrer.
Apesar de sabermos que, se uma bactéria tivesse se tornado resistente, sua implantação no trato
digestório só poderia ocorrer na presença do antibiótico como agente seletivo, a utilização de
marcadores de resistência a antibióticos no transgene é uma crítica razoável (Figura 16.2).
-------------FIGURA 16.2. A estrutura de um transgene
Para garantir a seleção e a expressão da sequência codificadora que será transferida, deve-se construir em redor uma
estrutura complexa que, além de um promotor e uma sequência terminal, inclui um gene marcador.
Gene marcador
210
Promotor
Transgene
Sequência terminal
Geralmente, os marcadores utilizados são antibióticos sem uso clínico, e para os quais já se encontrou
resistência nas bactérias intestinais, de maneira que a transferência do marcador não mudaria a
situação. Considerando que já existe a tecnologia apropriada, a recomendação das agências
internacionais é de substituir ou eliminar esse tipo de marcadores. Alguns produtos, como o milho
MON810 (YieldGard, Monsanto) e o milho LY038 (Renessen LLC), já não levam marcadores seletivos.
A COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Em relação aos produtos comercializados, o AGM tem a mesma composição química e o mesmo valor
nutritivo que o alimento convencional equivalente. No caso de um AGM que sintetize uma vitamina
extra, por exemplo, a situação é diferente e não pode ser considerado igual ao alimento convencional,
sendo necessários estudos adicionais.
A PRODUÇÃO DE TOXINAS
Outra preocupação diz respeito à produção eventual de toxinas. Sabe-se que, para sua defesa, as
plantas sintetizam substâncias químicas que podem ser tóxicas para o homem ou os animais. Uma
delas é a toxina do Bacillus thuringiensis que, por ser prejudicial para os insetos e inócua para o
homem, é utilizada sem problemas nas lavouras orgânicas, há mais de 50 anos.
Normalmente, a presença de uma toxina é investigada mediante ensaios biológicos em diversas
espécies de animais, alimentados durante um tempo com o produto transgênico. Os ensaios são
complementados com estudos de anatomia patológica. A avaliação toxicológica dos AGMs
comercializados não detectou efeitos adversos.
A PRODUÇÃO DE ALÉRGENOS
As alergias alimentares caracterizam-se pela hipersensibilidade a uma ou mais proteínas, que
desencadeiam reações diversas, tais como urticária, vômito ou diarreia. Sua incidência é de 1-2% em
adultos e 5% em crianças, sendo provocadas principalmente por trigo, leite de vaca, ovos, peixe,
amendoim e soja.
A transgênese ou a edição de genes poderão vir a melhorar a qualidade dos alimentos, se forem
utilizadas como ferramentas para eliminar substâncias sabidamente alergênicas dos alimentos. Mas
não é essa a preocupação do consumidor; seu o temor é que o transgene sintetize alguma proteína
capaz de desencadear alergias.
Uma mesma proteína pode ser inócua para uma pessoa e alergênica para outra, sendo impossível
prever o efeito que ela terá em uma terceira. Entretanto, sabendo que alguns alimentos são mais
alergênicos que outros, deve-se ter cuidado em relação à origem do transgene. Um projeto citado
frequentemente é o da transferência à soja de um gene da castanha-do-pará, com o objetivo de
melhorar suas qualidades nutritivas. Porém, frente à possibilidade de induzir reações alérgicas, em
pessoas sensíveis à castanha-do-pará, o projeto foi descontinuado sem que essa soja saísse do
laboratório.
É sabido que o risco de uma proteína ser alergênica aumenta se esta apresentar determinadas
sequências de aminoácidos, se ela se degradar lentamente no tubo digestivo ou se permanecer estável
durante o processamento industrial. Estas características são passíveis de estudos, havendo diretrizes
internacionalmente aceitas para a avaliação de alergenicidade. Complementa-se a informação
mediante análises laboratoriais com os anticorpos de pessoas sensibilizadas e, também, mediante
testes em animais, capazes de desenvolver alergias aos mesmos tipos de alimentos que os seres
humanos.
211
http://bteduc.com
Em 2000, o milho Star Link (2000), liberado nos Estados Unidos para compor rações animais,
contaminou tortillas e tacos destinados ao consumo humano. Nenhuma das denúncias de alergia à
proteína correspondente fora confirmada, mas restou uma lição bem clara em relação à
biossegurança: não se pode liberar um cultivo para ração se este for inadequado para seres humanos.
O risco de alergenicidade dos AGMs comercializados até agora não é maior que o dos alimentos
convencionais. Observe-se que esses alimentos passaram por testes que nunca foram aplicados no
arroz, no milho, na batata ou no kiwi, uma fruta introduzida recentemente no Ocidente e que provou
ser altamente alergênica.
O RISCO DE CÂNCER
Recentemente, o pesquisador francês G-E. Séralini (2012) noticiou ter detectado tumores em ratos
alimentados com milho geneticamente modificado. Devido a erros no desenho experimental e ao uso
de uma linhagem de ratos, especialmente selecionada para o desenvolvimento de tumores, o artigo
de Séralini teve que ser retirado, em 2013, da revista Food and Chemical Toxicology. Em 2014, o
trabalho de Séralini foi publicado novamente em outra revista (Environmental Sciences Europe).
O posicionamento prévio de Séralini em relação aos transgênicos, assim como sua relação com
organizações interessadas economicamente no banimento dos ALMs, são públicos. É lamentável que,
mesmo totalmente desqualificados pela comunidade científica, esses trabalhos sejam citados como
“prova” do perigo das rações e dos alimentos transgênicos.
A UTILIZAÇÃO DE UM PROMOTOR VIRAL (CaMV)
Na construção de um transgene, colocam-se sequências promotoras para determinar quando, onde e
como irá se expressar a proteína codificada. Alguns pesquisadores manifestaram sua preocupação com
a utilização do promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), considerando que sua
transferência horizontal de uma planta transgênica às células do aparelho digestório poderia ativar
outros genes não virais (oncogenes).
Essa preocupação não tem maiores fundamentos, dado que o promotor CaMV é detectado em 14
a 25% da produção de canola, de couve-flor e de repolho convencionais, sendo ingerido pelo homem
em quantidades consideráveis, faz décadas, e sem nenhum efeito reconhecido.
OUTROS EFEITOS
A inserção de várias cópias gênicas em diferentes lugares do genoma poderia gerar a ativação ou
desativação de outros genes, gerando no organismo geneticamente modificado algum tipo de
alteração que não fora previsto. Até agora, não fora registrado nenhum efeito deste tipo nos produtos
comercializados, e os avanços tecnológicos (sequenciamento, microarrays) permitem excluir essa
possibilidade.
PERSPECTIVA HISTÓRICA
Nem os alimentos convencionais, incluídos os orgânicos, nem os que foram obtidos por por radiação
ou técnicas genéticas clássicas passam por uma avaliação de risco antes de ser oferecidos ao
consumidor. Só os AGMs que chegaram a nossa mesa foram devidamente analisados pelas
autoridades correspondentes e trilhões de refeições consumidas por milhões de pessoas em diferentes
países, durante duas décadas, incluíram algum componente transgênico, sem que fosse registrado um
único incidente.
212
COMO GARANTIR A SEGURANÇA ALIMENTAR?
O PRINCÍPIO DE EQUIVALÊNCIA SUBSTANCIAL
Antes de comercializar um alimento transgênico, avaliam-se os riscos que este apresenta para os seres
humanos, os animais e o ambiente.
Assim como não há cidade segura, há cidades mais seguras que outras. O conceito de segurança se
estabelece sempre em relação a algum marco de referência. Quando se trata de segurança alimentar,
o referencial é o alimento já conhecido e consumido habitualmente. Por isso, antes de chegar ao
mercado, os aditivos, os conservantes e os corantes convencionais novos estão sujeitos à aprovação.
Assim como qualquer novo ingrediente de origem biotecnológica.
Um alimento originado por biotecnologia moderna é tão seguro para o consumo quanto um
alimento que tenha a mesma composição, as mesmas características nutritivas e um histórico de uso
seguro. Esse é o denominado princípio de equivalência substancial, admitido por numerosas
organizações internacionais como FAO (Food and Agriculture Organization), WHO (World Health
Organization), OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), ILSI (International
Life Science Institute). O princípio dá toda a importância ao produto final e não à tecnologia aplicada
para sua obtenção.
A AVALIAÇÃO DE RISCOS
Não é possível dizer que “todos os alimentos transgênicos são seguros”, nem se “este alimento
transgênico é seguro”. Só podemos afirmar que “os alimentos transgênicos podem ser seguros ou
não”, e que “determinado alimento transgênico é tão seguro quanto o seu equivalente”. A análise terá
que ser feita caso a caso.
Por exemplo, o amido de uma batata resistente a vírus é idêntico ao amido de uma batata qualquer.
Porque o amido é um carboidrato purificado, sem DNA nem proteína da planta da qual foi extraído. O
mesmo raciocínio pode ser feito em relação ao óleo de canola ou de soja. Já no caso da torta de soja
ou da espiga de milho, os genes inseridos sintetizam proteínas, e ambos se encontram no produto
final, por conseguinte, deve-se analisar se estes podem ter algum efeito no organismo que os ingere.
Todos os parâmetros anteriormente citados terão que ser avaliados: a construção do transgene, os
efeitos devidos à presença do transgene (eventualmente, substâncias tóxicas ou alergênicas), o valor
nutritivo e, também, os efeitos não previstos devidos à presença do transgene. E como em dois
organismos, o mesmo gene pode ser inserido em diferentes lugares e de diferentes modos, cada
evento deverá ser analisado separadamente.
Essa metodologia, denominada análise de risco de alimentos geneticamente modificados para a
saúde humana, garante que o alimento, e quaisquer substâncias que resultem da modificação
genética, seja tão seguro quanto seu análogo convencional.
A ROTULAGEM DOS ALIMENTOS
Não há no momento um consenso em relação aos rótulos: em alguns países não há nenhuma
regulamentação, em outros se adota o rotulado voluntário ou se estabelecem normas rígidas.
Nos Estados Unidos, o sistema está baseado na responsabilidade da indústria e na avaliação de
várias agências federais, cabendo à FDA (US Food and Drug Administration) a avaliação da segurança
alimentar das novas variedades (vegetais, laticínios, peixes, frutos de mar e aditivos) e à USDA (US
Department of Agriculture) a regulação dos produtos cárneos e avícolas, além dos testes de campo de
todas as plantas geneticamente modificadas. Tendo a responsabilidade pelo uso de pesticidas
213
http://bteduc.com
químicos, corresponde à EPA (Environmental Protection Agency) a aprovação das plantas
geneticamente resistentes a pragas.
Aproximadamente 20 das variedades transgênicas cultivadas estão autorizadas para o consumo
humano, nos Estados Unidos. Não são rotuladas, a menos que o valor nutricional do alimento tenha
sido alterado, como no caso do óleo Vistive, ou se tiver sido incorporada alguma substância capaz de
produzir alergias. A experiência de mais de uma década de consumo de alimentos transgênicos
confirma que estes são equivalentes aos alimentos convencionais. Apesar de alguns grupos ativistas
terem manifestado sua oposição aos alimentos transgênicos, isto não tem afetado a estabilidade do
sistema de avaliação.
Assim como nos Estados Unidos, na Argentina e no Canadá a rotulagem não é obrigatória.
Na União Europeia, rege o princípio de precaução. Como o que importa é o processo seguido na
produção do alimento, a legislação de 2004 manda rotular todos os produtos de origem transgênica,
destinados à alimentação humana ou animal. A regulamentação é extensiva a cantinas e restaurantes.
Também é obrigatório o rótulo nos alimentos que contenham mais de 0,9% de material geneticamente
modificado, incluindo rações, óleos vegetais, sementes etc.
Por outro lado, a legislação europeia considera que, sendo auxiliares de transformação, não há
necessidade de rotular alimentos e bebidas preparados com substâncias produzidas por OGM, se estes
ou seus resíduos não estiverem presentes no produto final. Tampouco são rotulados os produtos
provenientes de animais alimentados com rações transgênicas (carne, leite, ovos) nem o mel de
abelhas alimentadas com néctar de flores de plantas transgênicas.
Japão, Coreia do Sul e Rússia rotulam os alimentos a partir de um limite percentual de 5%.
O objetivo destas medidas é garantir a escolha do consumidor e a rastreabilidade dos transgenes
ao longo da cadeia alimentar. O rótulo indica "este alimento contém organismos geneticamente
modificados" ou "produzido a partir de (nome do organismo) geneticamente modificado".
No Brasil, o Decreto 4.680 (24/4/2003) determina que, a partir de abril 2004, todos os produtos
com mais de 1% de ingredientes transgênicos sejam rotulados, com um símbolo específico de tamanho
maior a 1 cm2, um triângulo com uma letra T inserida dentro (Figura 16.3).
RÓTULO E INFORMAÇÃO
Quando se trata de escolher entre dois alimentos, basta recorrer à nossa percepção sensorial ou,
ainda, à nossa experiência pessoal. Nenhuma das duas permite reconhecer a presença de ingredientes
transgênicos, ou de origem transgênica, nos alimentos. Em função da resistência de alguns grupos de
consumidores, a rotulagem pareceria a saída mais lógica para informar de maneira honesta, exata e
completa sobre os produtos das prateleiras.
-------------FIGURA 16.3. O símbolo de transgênico adotado no Brasil.
214
Vimos no Capítulo 13 que os produtores de sementes comerciais admitem como aceitável uma
contaminação de 1% entre as variedades convencionais. Essa contaminação também é inevitável,
quando coexistem plantações transgênicas e convencionais. Por conseguinte, o limite de 1% redefine
o nível de pureza de um ingrediente de origem vegetal, admitindo-se que todo valor inferior a esse
limite pode ser o resultado de uma contaminação acidental.
Sendo assim, o consumidor pode comprar um produto com mais de 1% de ingredientes
transgênicos ou um produto convencional cuja composição conta mais de 99% de ingredientes não
transgênicos. Em outras palavras, o rótulo não garante ao consumidor a ausência de transgênicos.
Finalmente, cabe refletir sobre o significado de um rótulo para a maioria dos consumidores, e se a
escolha entre um produto e outro não dependerá essencialmente do preço e do marketing. Somente
o processo educativo pode dar à população os elementos básicos para formar uma opinião informada
e responsável e fazer suas escolhas.
O RASTREAMENTO DE UM TRANSGENE
Em um mundo globalizado, a variedade de regulamentos e de modalidades de rotulagem é um fator
de complicação das transações comerciais, em que a qualidade de um produto pode ter que ser
definida em relação à presença ou ausência de um transgene.
A aceitação dos transgênicos varia de um país para outro e, também, entre diversos grupos de
consumidores. Por isso é importante contar com formas de rastreamento como a técnica da PCR
(reação em cadeia da polimerase), que pode ser aplicada em diferentes modalidades:
o Testes qualitativos, para reconhecer a presença ou ausência do transgene.
o Testes semiquantitativos, em que a presença ou ausência do transgene é determinada em função
de um limite como 1%, por exemplo.
o Testes quantitativos, que fornecem informação sobre a quantidade do transgene por comparação
com amostras de referência com concentrações conhecidas. A técnica permite identificar DNA
exógeno em uma quantidade de 0,1% (1 grama em 1 quilograma), mas algumas variantes
extremamente sensíveis reconhecem a presença de 0,001% do transgene.
Observe-se que, para aplicar estes testes, se precisa de informação sobre as sequências do transgene.
Uma forma de simplificá-los seria a inclusão, em todas as construções genéticas, de uma sequência
conhecida. Esta funcionaria como uma etiqueta molecular, facilitando a identificação de qualquer
transgene.
Por outro lado, nem sempre a PCR é informativa. Em amostras de grãos ou alimentos processados,
o DNA pode estar quase totalmente degradado. Nesse caso, é necessário saber quais as
transformações que o produto sofreu e estabelecer protocolos adequados. Existem métodos
imunológicos (Western Blot, ELISA) que permitem detectar a proteína sintetizada pelo transgene e,
eventualmente, estimar a quantidade presente. Contudo, o custo de todos esses testes será pago pelo
consumidor.
215
C A P Í T U L O 17
BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS
AS DOENÇAS INFECCIOSAS
O desenvolvimento da agricultura aumentou a disponibilidade de alimentos, sustentando populações
mais densas e sedentárias. O contato com os animais domesticados, por favorecer a evolução e a
passagem dos germes ao homem, estaria na origem de doenças como a varíola, o sarampo, a
coqueluche, a tuberculose e a gripe.
Uma vacina é um produto destinado a estimular o sistema imune, de maneira a prevenir ou
controlar uma infecção. No século XIX, mais de 80% das crianças morriam de doença antes dos 10 anos
de idade. Hoje, programas de vacinação sistemática as imunizam contra tuberculose, hepatite B,
poliomielite, difteria, tétano, coqueluche, meningite, sarampo, rubéola, caxumba e infecções por
rotavírus e pneumococos.
Nos dois séculos que nos separam de Jenner, o descobridor da primeira vacina antivariólica, temos
alcançado o sucesso na prevenção de um bom número de doenças infecciosas. A vacinação chega às
crianças e aos grupos de pessoas sujeitos a maiores riscos, como as mulheres (sarampo e rubéola), os
maiores de 60 anos (gripe, pneumonias) e os profissionais de saúde (hepatite B, antraz). Também
resguarda os residentes em determinadas áreas e os viajantes (febre amarela). A vacinação dos
animais os protege das doenças e quebra o elo de transmissão ao homem.
A melhora das condições econômicas de uma população repercute na saúde da mesma e,
inversamente, a diminuição da incidência de doenças com suas sequelas de invalidez ou morte
prematura dá às pessoas a possibilidade de melhorar suas condições de vida. O custo de implantação
de um sistema de vacinações é baixo, porque a proteção atinge não só a pessoa que as recebe como
as que entram em contato com ela.
Em uma variante do velho ditado “prevenir é melhor que curar”, a WHO (Organização Mundial da
Saúde; do inglês, World Health Organization) ressalta que o maior impacto na área de saúde é
conseguido com água limpa e vacinas. Lamentavelmente, ainda morrem anualmente dois milhões de
crianças de doenças porque as vacinas existentes não chegam até elas, devido aos conflitos armados
e à dificuldade de acesso aos centros de saúde. E ainda não temos vacinas para doenças como a
tuberculose, a malária ou o HIV/AIDS.
A AQUISIÇÃO DE IMUNIDADE
Um antígeno é uma substância que estimula a produção de proteínas específicas (anticorpos) capazes
de se ligar a ele. Microrganismos infecciosos, suas moléculas e substâncias químicas são antígenos,
assim como as células de um organismo transplantadas a outro, o pólen, pelos de animais e certos
alimentos nas pessoas sensibilizadas.
No primeiro contato com um antígeno, o organismo reage com uma resposta imunológica primária de
intensidade baixa e curta duração, acompanhada de alguns sintomas como febre, dor de cabeça,
erupção cutânea. Essa primeira resposta facilita a eliminação do antígeno estranho e a produção de
células de memória. Em um segundo contato, a resposta imunológica envolverá numerosas células e
moléculas e será rápida, intensa e duradoura (Figura 17.1).
Todo patógeno é um antígeno estranho e, como tal, será detectado pelo sistema imune quando
penetrar no organismo. A resposta envolverá uma ação humoral e uma ação mediada por células,
coordenadas por diversos componentes do sistema imunológico. As duas formas de ação dependem
das características do ataque do patógeno: o pneumococo se multiplica nos pulmões, o bacilo do
tétano produz uma toxina letal, o bacilo de Koch e todos os vírus parasitam as células.
No caso de uma bactéria ou de uma toxina, os anticorpos específicos produzidos pelos linfócitos B
reconhecem os microrganismos ou as toxinas circulantes, dando início a sua destruição. Os vírus e
algumas bactérias demandam outro tipo de combate, porque, ao invadir as células, ficam protegidos
dos anticorpos. A célula infectada será destruída pelos linfócitos T matadores (também chamados Tc,
do inglês T citotoxic), que reconhecem uma combinação das proteínas celulares com algumas
proteínas do invasor, expostas na superfície celular.
Tanto a ação humoral como a ação mediada por células dependem da participação dos linfócitos
auxiliadores Ta, também chamados Th (do inglês, T helpers), que reconhecem o antígeno e produzem
moléculas que estimulam a proliferação das células B e T. Finalizada a resposta primária, algumas
células de memória (B, T) permanecerão no sistema, possibilitando a aceleração dos mecanismos de
defesa em ocasião de um segundo contato com o antígeno (Figura 17.2).
-------------FIGURA 17.1. As respostas primária e secundária do organismo
Intensidade da
resposta imune
Semanas
1
Primeiro contato com o
patógeno (antígeno)
2
3
4
5
6
7
8
Segundo contato com o
patógeno (antígeno)
217
http://bteduc.com
Uma vacina é um produto destinado a ensinar o sistema imune a reconhecer determinado patógeno
e impedi-lo de desencadear uma infecção ou uma doença. A vacina prepara os mecanismos de defesa,
em previsão de um segundo contato, desta vez com o patógeno original.
A vacinação estabelece o primeiro contato do organismo com um patógeno que, estando
incapacitado para causar a doença, conserva sua identidade molecular e a capacidade de induzir uma
resposta imune. As vacinas estimulam a imunidade humoral, a imunidade mediada por células ou,
preferentemente, ambas ao mesmo tempo.
-------------FIGURA 17.2. A memória imunológica
Antígeno
Detectado por células que ativam
os diferentes tipos de linfócitos
Linfócitos T citotóxicos
Linfócitos T auxiliadores
Linfócitos B
Síntese de
anticorpos
Células de memória
Eliminam as células infectadas
Neutralizam ou marcam o antígeno
dando início a sua eliminação
--------------
OS DIFERENTES TIPOS DE VACINAS
AS VACINAS TRADICIONAIS OU DE PRIMEIRA GERAÇÃO
AS VACINAS DE PATÓGENOS VIVOS ATENUADOS
Nestas vacinas, os patógenos vivos são cultivados em diferentes meios e/ou passam por vários
tratamentos físicos (temperatura, pressão e pH), de modo a selecionar mutantes que, apesar de ter
perdido a patogenicidade, conservem a capacidade de induzir uma resposta imune intensa e
duradoura, que envolva ambas as vias, a humoral e a celular.
Estas vacinas são muito eficientes já que, salvo em caso de imunização por via oral, basta uma única
dose para obter a imunidade desejada. Contudo, elas apresentam alguns inconvenientes. Além de
serem inadequadas para as pessoas imunodeprimidas, existe o risco de uma forma atenuada reverter
para uma forma ativa. Outra desvantagem é a necessidade de conservá-las refrigeradas, mantendo
uma cadeia de frio.
Utilizam-se na prevenção de doenças de origem viral, como a febre amarela, o sarampo, a rubéola,
a caxumba e a poliomielite (Sabin ou OPV, do inglês oral polio vaccine). A vacina contra a tuberculose
é a única preparada com uma bactéria viva, o bacilo de Calmette-Guérin ou BCG.
218
AS VACINAS DE PATÓGENOS MORTOS E DE TOXOIDES
Estas vacinas incluem microrganismos mortos ou toxinas inativadas (toxoides) por procedimentos
físicos ou químicos. Conferem uma resposta imune de tipo humoral pouco intensa ou duradoura, pelo
que se devem administrar várias doses e, mais tarde, manter a imunidade com doses de reforço.
Requerem, também, a introdução de substâncias coadjuvantes para estimular a resposta imune.
Apesar de ser estáveis e não depender da cadeia do frio, estas vacinas devem ser modificadas
frequentemente para se adaptar aos sorotipos bacterianos patogênicos, que são muito variáveis. Além
de vacinas de toxoides contra a difteria e o tétano, existem vacinas de microrganismos mortos contra
a cólera, a gripe, a hepatite A, a peste, a poliomielite (vacina Salk) e a raiva.
AS NOVAS VACINAS OU DE SEGUNDA GERAÇÃO
A chegada da engenharia genética revolucionou o campo das vacinas ao permitir a produção de
antígenos de tipo proteico em microrganismos transformados, que podem ser cultivados sem riscos
em um fermentador (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Picchia pastoris).
Devem-se à tecnologia do DNA recombinante (Figura 17.3), as vacinas contra a hepatite B (HBV) e
contra o papiloma humano (HPV). Outro benefício é o desenvolvimento de vacinas veterinárias DIVA
(do inglês, Differentiate Infected from Vaccinates Animals), que permitem distinguir um animal
vacinado de outro doente.
AS VACINAS DE SUBUNIDADES DE ANTÍGENOS
Nestas vacinas se colocam, em vez do microrganismo todo, só um a 20 antígenos da superfície celular,
capazes de induzir a resposta imune. Demandam um longo trabalho de pesquisa prévia para
determinar quais os melhores antígenos (subunidades) que deverão ser incluídos na vacina e precisam
de substâncias coadjuvantes para estimular a imunidade.
Por não levar mais que fragmentos do microrganismo, estas vacinas não apresentam os riscos das
vacinas de microrganismos vivos e independem da cadeia do frio. Existem vacinas de subunidades
contra a influenza ou gripe, a doença de Lyme, a hepatite B, a coqueluche e a pneumonia.
-------------FIGURA 17.3. A utilização da tecnologia do DNA-recombinante na vacina contra a hepatite B
Vírus HBV
Gene codificador do
antígeno de
superfície HBsAg
Síntese do
antígeno
Vacina
Levedura
Levedura transformada
219
http://bteduc.com
AS VACINAS CONJUGADAS
Alguns microrganismos (pneumococos, meningococos) protegem-se com uma cápsula de
polissacarídeos, que dificulta sua identificação pelo sistema imune, ainda imaturo, de uma criança. As
novas tecnologias possibilitam a associação de um toxoide às subunidades de polissacarídeo, de
maneira a estimular a resposta imune e o reconhecimento dos antígenos capsulares.
Estas vacinas de antígenos conjugados são utilizadas na imunização contra o Haemophilus
influenzae B (meningite) e o Streptococcus pneumoniae ou pneumococo. As vacinas contra este último
devem ser modificadas frequentemente, adicionando outros antígenos capsulares das mais de 80
linhagens que causam pneumonia em seres humanos.
AS VACINAS VETORIZADAS
Outro tipo interessante de vacinas são as vetorizadas, em que o gene codificador do antígeno é
transferido a um microrganismo inócuo (bactéria ou vírus) que age como vetor. Ao infetar o
hospedeiro, ele se multiplica e começa a produzir o antígeno, induzindo uma resposta imune contra o
patógeno. Com uma vacina deste tipo imunizam-se as raposas, atualmente um dos principais elos na
transmissão de raiva na Europa.
Em um segundo tipo de vacinas vetorizadas, o vetor não se multiplica no hospedeiro. Agindo como
uma seringa molecular, ele introduz, na célula, o gene codificador do antígeno. Um vetor deste tipo, o
canarypox, que se multiplica em aves, exclusivamente, é utilizado na vacinação contra as doenças de
Marek e Gumboro. Existem 12 vacinas vetorizadas para uso veterinário, mas nenhuma aprovada para
uso humano.
A ÚLTIMA GERAÇÃO
A tecnologia mais promissora parece ser a das vacinas genéticas, também denominadas vacinas de
DNA nu. Estas consistem de um plasmídeo com uma construção gênica que inclui o gene codificador
do antígeno. Injetado diretamente no músculo, o DNA irá penetrar nas células dendríticas,
apresentadoras de antígeno. Estas migrarão até os órgãos linfoides, onde sintetizarão o antígeno,
estimulando uma resposta imune de tipo celular que permitirá imunizar o hospedeiro.
Esta tecnologia teria uma vantagem fundamental, por ser um método genérico que facilita o
desenvolvimento e produção de novas vacinas (Figura 17.4). Estas poderão ser elaboradas
substituindo um gene por outro no cassete de expressão gênica, o que diminuiria os custos e o tempo
necessário para responder a uma emergência sanitária. Também se poderia conseguir uma
supervacina com vários genes codificadores de antígenos, capaz de imunizar o organismo contra várias
doenças simultaneamente. Por outro lado, as vacinas de DNA estimulam ambas as respostas, humoral
e mediada por células.
Na área veterinária, já foram aprovadas nos Estados Unidos vacinas de DNA contra o vírus IHNV,
causante da necrose hematopoiética em trutas e salmões; contra o vírus da doença do oeste do Nilo,
que ataca os equinos; contra o melanoma canino e para terapia gênica relacionada à liberação
hormonal do fator de crescimento em suínos.
Na área humana, ainda em fase experimental ou em testes clínicos, se encontram em andamento
várias vacinas deste tipo contra HIV/AIDS, malária, herpes, tuberculose, hepatite B, influenza, rotavírus
etc.
220
FIGURA 17.4. Os diferentes tipos de vacinas
Tipos de vacinas
V. patogênico
V. relacionado
V. atenuado
V. morto
Subunidades
Recombinante
Transfecção
Linfócitos
BeT
Doença e recuperação
Imunidade adquirida
(espontânea)
Imunidade adquirida
(artificial)
--------------
A PRODUÇÃO DE VACINAS
PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
Para chegar a ser comercializada, uma vacina deve cumprir etapas sucessivas de pesquisa,
desenvolvimento e operações industriais, que podem demandar em média 12 anos de trabalho e
investimento.
A etapa exploratória tem uma duração de 2 a 4 anos e se inicia nas bancadas de um laboratório de
pesquisa, onde serão identificados os antígenos naturais ou sintéticos que podem prevenir ou tratar
uma doença.
Segue uma etapa pré-clínica de 1 a 2 anos de duração, que pode envolver pesquisadores de uma
indústria privada. Os experimentos são realizados em cultivos de células ou de tecidos e, a seguir, com
animais de laboratório (camundongos, cobaias e/ou macacos). Depois de comprovar sua capacidade
de imunizar um ser vivo, seleciona-se o melhor candidato vacinal. Os estudos também permitem obter
uma estimativa sobre a dose a ser aplicada em etapas posteriores e a forma de administrar a vacina.
A primeira fase dos estudos clínicos em seres humanos inicia-se em um grupo de 20 a 80 voluntários
adultos e deve ser realizada no pais de produção da vacina, mesmo quando o produto não se destine
a essa população. Os participantes são monitorados bem de perto, a fim de verificar a segurança
221
http://bteduc.com
(toxicidade e farmacocinética) do candidato vacinal. Se a vacina for desenhada para crianças, os testes
devem ser iniciados com adultos e jovens.
A segunda fase envolve 80 a 300 pessoas e inclui alguns indivíduos da população alvo, isto é,
pertencentes aos grupos de risco de contrair a doença. Nesta fase os testes incluem um grupo placebo
e visam estudar a imunogenicidade e o efeito protetor da vacina (fase 2 a), isto é, sua eficácia por
exposição com inóculos padronizados do agente infeccioso. Também se avalia a relação dose-resposta
e sua eficácia por exposição natural à infecção em áreas de transmissão (fase 2b), assim como o melhor
calendário de vacinações e a forma de aplicação.
A terceira fase, que envolve milhares de pessoas, testa a eficácia do candidato vacinal em proteger
os indivíduos vacinados contra a doença e a ausência de fatores adversos que possam ter sido
inadvertidos em ensaios com uma amostra menor de pessoas. Testes randomizados, aplicados em
duplo-cego, permitem comparar o efeito da vacina experimental e o de um placebo, seja este uma
solução salina, outra vacina ou qualquer outra substância.
A duração total das três fases correspondentes aos estudos clínicos é de 6 a 8 anos para as vacinas
humanas. Se os resultados dos estudos clínicos não forem satisfatórios, será necessária a realização
de estudos adicionais, chegando, eventualmente, a interromper os estudos clínicos e proceder à
escolha de outro candidato vacinal. Contudo, uma vez comprovado que a vacina é segura e eficiente,
a indústria farmacêutica poderá solicitar aos órgãos competentes a licença para comercializar o
produto. Esta etapa dura de 12 a 18 meses.
A liberação da vacina marca o início do processo de manufatura e da fase de vigilância
farmacológica, um monitoramento amplo e rigoroso que coleta toda informação sobre algum efeito
adverso que possa ocorrer. Em 1999, por exemplo, uma primeira vacina contra o rotavírus teve que
ser retirada do mercado em consequência de alguns casos de intussuscepção relacionados com sua
aplicação.
As vacinas veterinárias passam pelas mesmas etapas, mas as exigências são menores. É possível
simplificar os testes com animais de laboratório e testar o candidato vacinal no animal para o qual é
destinado o produto. O número de indivíduos necessários para os testes clínicos também é menor.
O MARCO ÉTICO
As pesquisas com seres humanos e, por conseguinte, todos os testes clínicos, devem ser desenvolvidos
dentro do marco ético elaborado pelo tribunal de Nuremberg, por ocasião do julgamento de 20
médicos condenados como criminosos de guerra, devido aos brutais experimentos realizados com
prisioneiros durante a Segunda Guerra Mundial.
Segundo o Código de Nuremberg (1949), os experimentos em seres humanos devem visar o bem
da sociedade e ser levados a cabo por pessoas cientificamente qualificadas. Os participantes receberão
todas as explicações necessárias, antes de dar livremente o seu consentimento. As experiências serão
a continuação de outras que, realizadas em modelos animais, permitam prever um resultado tal que
justifique a inclusão de testes em seres humanos. O sofrimento mental e físico será evitado, e as
pessoas receberão proteção em caso de ocorrer algum efeito adverso.
Nos testes clínicos de avaliação de uma nova vacina, as pessoas participam voluntariamente e são
informadas sobre os riscos e benefícios de sua participação. Contudo, discute-se a validação do
consentimento informado quando os testes são realizados em populações de escassos recursos, com
baixos níveis de instrução.
222
OPERAÇÕES INDUSTRIAIS
Na produção de vacinas, cada lote da vacina deve passar por controles estritos, a fim de garantir a
qualidade e manter a credibilidade não só da indústria, mas da própria vacinação. Aplicada
correntemente em vários países, a vacina Salk de vírus inativados é considerada hoje uma das vacinas
mais seguras. Porém, um problema na fabricação da vacina no Laboratório Cutter (Estados Unidos)
causou a inativação incompleta de algumas partículas virais e, duas semanas depois de liberada, em
1954, induziu 260 casos de pólio e 10 mortes.
Uma vacina deve reunir várias qualidades, principalmente eficiência, pureza, segurança e baixo
custo. O processo industrial varia em função do microrganismo utilizado e responde a critérios estritos
de qualidade (BPL ou Boas Práticas de Laboratório; BPF ou Boas Práticas de Fabricação). Atualmente,
o controle de qualidade ocupa 70% do tempo dedicado à produção de uma vacina.
As bactérias multiplicam-se em biorreatores, em condições que dependem da produtividade do
próprio processo fermentativo e do tratamento posterior, para a extração de antígenos ou de toxoides.
Vacinas antibacterianas podem ser preparadas em grandes quantidades, com equipamento
relativamente simples.
As proteínas recombinantes de vírus ou bactérias são produzidas em biorreatores, por leveduras,
ou em cultivos celulares. Ao processo de extração seguem-se várias operações de purificação por
técnicas complexas (ultrafiltração, cromatografia em coluna etc.).
Os vírus, parasitas obrigatórios, precisam de células para se multiplicar. Tradicionalmente, utilizamse pele de bezerro e ovos de galinha, mas a tendência atual é substituí-los por culturas celulares que
possibilitem o desenvolvimento de vacinas virais para uso humano (poliomielite, sarampo, rubéola,
influenza, caxumba, raiva) e veterinário (febre aftosa, raiva, encefalite equina, doença de Mareck e de
Newcastle etc.).
Além do antígeno, na formulação de uma vacina incluem-se outras substâncias: os adjuvantes, que
permitem dosagens menores por serem capazes de estimular a resposta imune; os estabilizantes, que
impedem as alterações devidas ao calor, à luz ou à umidade; os conservantes, nos frascos com doses
múltiplas.
Uma das tendências atuais na administração de vacinas é a redução do número de doses por
imunização simultânea, em uma mesma injeção, para várias doenças (tríplice viral ou tríplice
bacteriana). Também se dá preferência a sistemas que diminuam a necessidade de refrigeração, que
representa 15% dos custos dos programas de vacinação.
Outras novidades virão da procura de novas formas de aplicação para substituir o uso de seringas,
tais como pistolas, géis, adesivos cutâneos, cápsulas, tabletes, inaladores e sprays nasais. Estes últimos
começaram a ser utilizados na aplicação de vacinas contra a gripe (FluMist, nos Estados Unidos;
NasVax, em Israel). As vacinas orais têm importantes aplicações na área veterinária.
Plantas e animais transgênicos produtores de antígenos poderão revolucionar alguns aspectos da
produção de vacinas. A ideia de ter vacinas “comestíveis” e de poder vacinar as crianças com uma
banana em vez de uma injeção é muito sedutora. Contudo, alguns problemas de segurança exigem
atenção, como, por exemplo, o risco de se misturar bananas-vacina e bananas-alimento,
contaminando os alimentos ou dificultando o reconhecimento de um medicamento como tal.
Provavelmente, os antígenos serão extraídos e administrados em tabletes ou cápsulas.
Em 2005, Dow AgroSciences registrou nos Estados Unidos uma vacina para a doença de Newcastle em
aves, produzida na planta aquática Lemna. Encontra-se em andamento uma nova vacina contra a febre
amarela em plantas de tabaco, em um centro a ser implantado no Ceará, pela Fundação Oswaldo Cruz
(Fiocruz) em parceria com instituições dos Estados Unidos.
223
http://bteduc.com
O MERCADO DAS VACINAS
A produção de vacinas é uma atividade menos rentável que a produção de medicamentos. Contudo, a
chegada das novas tecnologias com base biológica despertou novamente o interesse do setor
farmacêutico. Atualmente, cinco grandes empresas (Merck, Pfizer, Sanofi-Pasteur, GlaxoSmithKline e
Novartis) concentram de 80% a 90% do mercado global de vacinas humanas, estimado em US$ 61
bilhões em 2020. O resto está ocupado por 200 a 250 empresas que desenvolvem mais de 600
produtos.
O processo de desenvolvimento de uma nova vacina leva em média 12 anos, a um custo que pode
variar entre US$ 300 milhões e US$ 1 bilhão. Alguns produtos, como a vacina antimeningococo Prevnar
(Pfizer), atingiram níveis de vendas que superam o bilhão de dólares anuais.
Estima-se que o mercado aumentará significativamente nos próximos anos, em função do
crescimento do setor adulto e, fundamentalmente, das vacinas terapêuticas, que serão analisadas no
Capítulo 20. Também aquecerão o mercado produtos novos, tais como as vacinas para a gripe
(influenza) e as vacinas que protejam o turista (febre amarela, dengue) ou diminuam o abuso de drogas
(nicotina).
Em meio a numerosas crises econômicas, vários países latino-americanos descuidaram de suas
estruturas científicas e tecnológicas e passaram a importar as vacinas necessárias para a população.
No entanto, e por diferentes motivos, depois de várias décadas de retração na área de produção de
vacinas, esta começa a ser considerada novamente uma área estratégica.
Para os países em desenvolvimento, o estímulo à produção nacional de vacinas é parte das
obrigações frente a sua população. Em termos de saúde pública, trata-se de um setor que não pode
ser negligenciado e no qual é preciso manter independência.
Alguns países, como Brasil, China e Índia, contam com instituições de pesquisa e desenvolvimento
para a produção de imunobiológicos, sendo frequentes as parcerias com as grandes empresas
farmacêuticas. Fundações privadas, como a Bill & Melinda Gates Foundation, fornecem fundos em prol
de melhores e novas vacinas, que protejam as crianças das doenças. Para organizações internacionais
como a WHO, a vacina é a mais simples das medidas preventivas possíveis na área de saúde.
Nos próximos anos, haverá progressos na preparação das vacinas preventivas e no
desenvolvimento de produtos novos, como as vacinas terapêuticas. Entretanto, esperam-se vacinas
novas ou melhores contra as doenças que afetam um número altíssimo de pessoas, tais como
HIV/AIDS, malária, dengue e tuberculose.
UM SETOR ESTRATÉGICO PARA A SOCIEDADE
No Brasil, onde existe uma tradição de mais de um século na produção de imunobiológicos (vacinas,
soros, hemoderivados e reativos para diagnóstico), as vendas chegam a US$ 600 milhões por ano, o
que representa 3% do mercado da indústria farmacêutica.
Até a década de 1960, muitas vacinas humanas e veterinárias eram fabricadas no país. A perda da
autossuficiência criou uma situação crítica quando, em inícios da década de 1980, uma multinacional
retirou-se do mercado, deixando a população em risco de ficar sem vacina tríplice, soros antitóxicos e
antiofídicos. Evidenciou-se nessa ocasião que a sociedade deve ter o acesso garantido às vacinas.
O Programa de Autossuficiência Nacional de Imunobiológicos (PASNI) de 1985 reverteu essa situação,
mediante uma estratégia de substituição das importações que estimulou a modernização das
instalações e a incorporação de novas tecnologias em cinco dos laboratórios oficiais: Instituto Butantan
(SP), Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Biomanguinhos, Fiocruz, RJ), Instituto Vital Brazil
(IVB,RJ), Instituto de Tecnologia do Paraná (Tecpar, PR), Fundação Ezequiel Dias (Funed, MG).
224
Atualmente, o Brasil produz 75% das vacinas que são distribuídas pelo serviço público, a metade delas
produzida pelo Butantan (Tabela 17.1). Várias vacinas estão sendo desenvolvidas em parcerias entre
as instituições citadas ou com laboratórios estrangeiros (Sanofi-Pasteur, GlaxoSmithKline, Instituto
Finlay etc.). Algumas das vacinas resultantes desses convênios protegem a população de sarampo,
caxumba e rubéola (tríplice viral), influenza, rotavírus, raiva (cultivo do vírus em células Vero) etc.
Os diferentes acordos de cooperação internacional entre os países latino-americanos também
terão uma importância fundamental para o desenvolvimento de políticas de saúde pública que
garantam à população o acesso às vacinas.
-------------TABELA 17.1. A produção de vacinas no Brasil
INSTITUIÇÃO
VACINAS
Instituto Butantan
Dupla, Infantil DT (difteria e tétano)
Dupla, Adulto dT (difteria e tétano)
Tríplice DTP (difteria, tétano e coqueluche ou pertussis)
Hepatite B recombinante
Influenza sazonal trivalente
Raiva (VR/VERO)
HPV, em parceria com a MSD (Merck)
Hepatite A, em parceria com a MSD (Merck)
dTpa (difteria, tétano e coqueluche ou pertussis), para gestantes, em parceria
com GSK (GlaxoSmithKline)
Laboratório BioManguinhos
Poliomielite inativada (VIP) e oral (VOP)
Tríplice viral (sarampo, caxumba e rubéola)
Tetravalente viral (catapora, sarampo, caxumba e rubéola)
HIB (meningite e pneumonia)
Tetravalente viral HIB, DTP (Difteria, tétano, coqueluche ou pertussis e HIB)
Pneumocócica -10 valente
Febre amarela
Rotavírus humano, em parceria com GSK (GlaxoSmithKline)
Tecpar
Antirrábica de uso veterinário e humano (PV-BHK)
Fundação Ataulfo de Paiva
Antituberculose (BCG)
Fundação Ezequiel Dias
Vacina meningocócica C
AS VACINAS E A ERRADICAÇÃO DA DOENÇA
Dispomos hoje de vacinas para numerosas doenças que afetaram a humanidade durante séculos. De
um modo geral, elas protegem 80% a 95% das pessoas imunizadas, com baixíssimas frequências de
efeitos adversos. O calendário de imunizações depende das autoridades nacionais e, em vários países,
a vacinação não é obrigatória.
225
http://bteduc.com
O impacto das vacinas na morbidade infantil relega ao passado algumas das temíveis doenças que
assolaram o século XX: difteria, coqueluche, tétano, poliomielite, meningite, caxumba, sarampo,
rubéola, varicela). Lamentavelmente, alguns setores da sociedade se recusam a aceitar o óbvio.
Um dos ataques mais desonesto às vacinas foi a publicação em uma revista científica de um artigo
relacionando-as com o autismo. A revista teve que se retratar e o trabalho foi declarado fraudulento
pelo Conselho Geral de Medicina do Reino Unido (2011). Organizações como o CDC (do inglês, Centers
for Disease Control and Prevention), o Instituto de Medicina da Academia Nacional de Ciências (Estados
Unidos) e o Serviço Nacional de Saúde (Reino Unido) não encontraram relação entre as vacinas e o
autismo.
Em algumas comunidades, a resistência às vacinas subsiste por motivos culturais, religiosos ou
políticos. Algumas das razões invocadas são: intromissão na liberdade individual, desafio à vontade
divina, degradação dos costumes ou interferência no desenvolvimento nacional. Algumas
comunidades descuidam da prevenção quando a doença passa um tempo sem se manifestar,
favorecendo, assim, a reaparição epidêmica da doença.
O impacto das vacinas pode relegar ao passado algumas das temíveis doenças que assolaram a
humanidade, porém, isso não significa que tenham sido totalmente erradicadas. As vacinas
mostraram-se eficazes para erradicar mundialmente a varíola e reduzir enormemente o número de
casos de poliomielite, na maioria dos países. Em relação à gripe, ainda não há uma vacina capaz de
estimular a imunidade a todas as linhagens do patógeno.
A VARÍOLA
A varíola é uma doença eruptiva contagiosa, transmitida por um poxvírus. A incubação dura de 7 a 17
dias; os sintomas principais são febre alta, fadiga e uma erupção de vesículas em todo o corpo. A
mortandade é de 30%, e os sobreviventes conservam lesões características.
A varíola teria sido levada até a Índia por mercadores do Egito, onde vitimara o faraó Ramsés V. A
doença se alastrou até a China (século I) e o Japão (século VI), retornando mais tarde ao Oriente Médio
e alcançando a Europa com os Cruzados (século XI-XII). A varíola não fazia distinção entre camponeses,
burgueses ou nobres, cobrando vidas de humildes e poderosos, como o rei da França Luís XV.
Quem adoece uma vez e se recupera, não adoece uma segunda vez; essa observação deu lugar à
primeira estratégia de combate à varíola. No Oriente (Índia e China, século XI), inoculavam-se as
pessoas sadias com o pus das vesículas de doentes com uma forma benigna da varíola. A maioria das
pessoas inoculadas manifestava uma doença leve e ficava protegida pelo resto de sua vida. A varíola
regrediu entre os povos que praticavam a variolização, embora 1% a 2% das pessoas inoculadas
morresse ao desenvolver a doença em sua forma mais grave.
Em 1520, com a chegada ao México de um escravo contaminado, a varíola entrou no continente
americano. O convívio de vários séculos com a doença desenvolveu nos europeus alguma forma de
resistência, mas, para as populações ameríndias, o contato com um germe novo significou o extermínio
de 95% de seus integrantes, em menos de 200 anos.
No século XVIII, a prática da variolização foi introduzida na Inglaterra. Um inoculador, o médico
Edward Jenner, observou que as ordenhadeiras nunca desenvolviam a varíola. Segundo uma crença
popular, essa resistência era consequência da contaminação com a varíola das vacas (variola vacum
ou vacina), uma doença inofensiva que se manifesta por pústulas no úbere das vacas. Em 1796, Jenner
inoculou a variola vacum em uma criança e, poucos dias mais tarde, a varíola humana; a criança não
adoeceu. A partir dessa experiência, a vacinação se estendeu rapidamente por toda Europa.
No Brasil, a vacinação foi introduzida em 1840 pelo Barão de Barbacena. Porém, quando, em 1904,
sendo Oswaldo Cruz o Diretor Geral de Saúde Pública, o governo decretou a vacinação obrigatória, a
resistência se manifestou no Rio de Janeiro sob a forma de motins, estourando uma revolta que
226
obrigou o governo a rever a medida. Contudo, a população terminou aceitando a vacinação depois da
violenta epidemia de varíola de 1908, que teve 10 mil casos diagnosticados.
Apesar dos surtos terem-se espaçado, 300 milhões de pessoas morreram de varíola no século XX.
Na década de 1970, a WHO substituiu a vacinação em massa por uma campanha de erradicação em
anel. A estratégia consiste em isolar os pacientes cada vez que um caso novo é detectado, e vacinar
rapidamente todas as pessoas que tiveram algum contato com o doente. Como a vacina tem um efeito
muito rápido, os resultados foram extraordinários. Contudo, por ocasião de um surto havido na
Iugoslávia (1972), foi necessário complementar as medidas com uma vacinação em massa. O último
caso de varíola registrado ocorreu na Somália em 1977.
Uma vez confirmada a erradicação da varíola em 1979, o vírus da varíola começou a ser eliminado
dos laboratórios para evitar acidentes como o ocorrido um ano antes, quando o escapamento do vírus
de um laboratório da Universidade de Birmingham (Reino Unido) causou a morte de duas pessoas.
Preventivamente, dois estoques virais foram conservados, um deles no CDC (Center for Disease Control
and Prevention, Atlanta, Estados Unidos), o outro no VECTRO (Instituto para Preparações Virais,
Moscou, Rússia). Apesar de estar prevista sua destruição no ano 2000, esta não ocorreu.
Ninguém pode afirmar que não existe algum estoque de vírus em algum lugar, e a mera
possibilidade de um ato de terrorismo é assustadora. Em caso de um surto de varíola, os médicos
teriam dificuldades em diagnosticar uma doença que hoje está restrita aos livros. A população deixou
de ser vacinada em fins da década de 1970, de modo que boa parte da população nunca foi imunizada;
sem doses de reforço, o restante pode ter perdido a imunidade. Por outro lado, a validade de um
pequeno estoque de vacinas que sobrou de décadas atrás está comprometida, e a aplicação da vacina
contraindicada em pessoas com eczemas ou imunodeprimidas, muito mais frequentes que no início
do século XX.
Mesmo tendo erradicado a varíola, precisaríamos de vacinas antivariólicas eficientes e seguras,
formuladas com tecnologia recente. Algumas já se encontrariam na etapa dos estudos clínicos.
A POLIOMIELITE
A poliomielite ou paralisia infantil é uma doença causada por um picornavírus (poliovírus), transmitido
pela água. O período de incubação é de 4 a 35 dias, e 10% das pessoas infectadas desenvolvem os
seguintes sintomas: febre, fadiga, dor de cabeça, vômitos, constipação ou diarreia, rigidez na nuca e
dor nas extremidades.
Em 1% dos casos, o vírus da poliomielite passa do intestino para a corrente sanguínea e invade o
sistema nervoso central, onde se multiplica, destruindo os neurônios motores. As pessoas afetadas
desenvolvem a forma paralítica da doença, e, se o vírus se alojar no bulbo, os pacientes precisarão de
ajuda mecânica para respirar. A doença pode deixar sequelas motoras permanentes (SPP ou síndrome
post-pólio).
Apesar de haver evidências da doença no Antigo Egito, os primeiros surtos epidêmicos ocorreram
em fins do século XIX. Em 1908, confirmou-se que a poliomielite é uma doença infecciosa. Na primeira
metade do século XX, as epidemias deixaram numerosas vítimas, principalmente entre as crianças,
mas também entre os adultos como, por exemplo, Franklin Delano Roosevelt, presidente dos Estados
Unidos.
As melhores condições higiênicas do século XX diminuíram o contato prematuro da população com o
vírus, suspeitando-se que a exposição de um grupo vulnerável ao vírus, em idade escolar, foi um dos
fatores desencadeante dos surtos. Na década de 1950, a doença era aterradora. Quando aparecia a
pólio, as escolas fechavam e as crianças eram privadas do contato entre elas, permanecendo isoladas
e trancadas em casa, até o perigo passar.
227
http://bteduc.com
A descoberta de uma vacina teve uma repercussão extraordinária. Em 1954, começou a ser aplicada a
vacina de vírus inativados de Jonas Salk (IPV, do inglês, injetable polio vaccine), elaborada com três
tipos de poliovírus, cultivados em rim de macaco, e inativada com formalina. Em 1963, houve uma
segunda opção, a vacina de vírus atenuados de Albert Sabin (OPV, do inglês oral polio vaccine).
Modificações nos processos produtivos aumentaram significativamente a eficiência de ambas as
vacinas.
Ambas têm vantagens e desvantagens. Para ser aplicada, a IPV demanda agulhas e seringas
estéreis, um procedimento mais caro e complicado que a ingestão das gotas da OPV. Em contrapartida,
por ser uma vacina de vírus atenuados, a OPV exige a manutenção da rede de frio, o que a IPV dispensa.
Do ponto de vista da eficiência, a OPV confere uma imunidade mais ampla porque abrange a
mucosa digestiva, impedindo a entrada do vírus selvagem no organismo e a infecção das células
nervosas. Contudo, como o vírus atenuado da vacina, eliminado nas fezes, permanece no ambiente, a
OPV acaba por atingir outras pessoas, afetando os não vacinados e os imunodeprimidos presentes no
entorno. Por isso, alguns países preferem a IPV e outros a OPV.
Novas vacinas estão sendo pesquisadas como, por exemplo, uma que leva o gene codificador de
uma proteína do capsídeo viral, inserido em Escherichia coli. A síntese dessa proteína por uma bactéria,
que coloniza normalmente o intestino, possibilitaria a imunização do hospedeiro.
Quando em 1992-1993, nos Países Baixos, um surto da doença atingiu um grupo que se opõe à
vacinação por motivos religiosos, verificou-se que o vírus selvagem continua presente no ambiente.
Em 2000, a pólio reapareceu no Haiti e na República Dominicana. Na ocasião, revelou-se que o vírus
atenuado pode reverter a sua forma patogênica, de modo que, mesmo tendo desaparecido a doença,
a vacinação terá que ser mantida. Em 2004, com a aparição de um novo surto de pólio em países do
oeste africano, confirmou-se que o objetivo ainda se encontra distante.
Apesar do sucesso alcançado pela vacinação, a erradicação da doença parece ser bem mais difícil
do que o esperado. Em 2015, a pólio ainda era endêmica no Paquistão e no Afeganistão, e alguns surtos
ocorreram em Madagascar, Guiné e Ucrânia. Alguns países são vulneráveis, por estar situados em
regiões onde as campanhas de vacinação são complexas e muitas vezes interrompidas por conflitos
bélicos, corrupção e/ou superstição (Camarões, Guiné Equatorial, Etiópia, Iraque, Nigéria, Somália,
Sudão do Sul e a República Árabe Síria).
A INFLUENZA
A influenza ou gripe é uma doença transmitida por um ortomixovírus (influenzavírus) e apresenta os
seguintes sintomas: febre, dores musculares, garganta inflamada, fadiga e dor de cabeça. O material
genético é RNA que está rodeado por um capsídeo proteico e um envelope, derivado da membrana
celular do hospedeiro. O RNA confere a seu portador uma enorme variabilidade porque, diferente do
DNA, os erros de replicação não são reparados por nenhum mecanismo celular.
Em função das proteínas do capsídeo, classificam-se os influenzavírus em três grupos: A, B, e C. Os
vírus dos grupos B e C infetam exclusivamente seres humanos e não causam epidemias. Os vírus da
influenza da categoria A são os mais perigosos, porque se multiplicam tanto no homem como em
outras espécies (aves, suínos, cachorros, cavalos, focas, baleias). As variantes de duas proteínas do
envelope, a hemaglutinina (HÁ) e a neuraminidase (NA), são utilizadas para identificar os diferentes
subtipos da categoria A: H1N1, H5N1 etc.
Ao pular de uma espécie a outra, a recombinação do material genético de diferente origem origina
vírus com características novas. Basta que esse vírus infecte o homem e sofra uma mutação que
possibilite a transmissão pessoa a pessoa para desencadear uma pandemia.
Ao longo do século XX, várias pandemias de gripe assolaram a terra. Em 1918, um surto de gripe
sobreveio na Espanha, espalhando-se pelo mundo e causando a morte de 40 a 70 milhões de pessoas.
228
O vírus H1N1 da gripe espanhola circulou durante várias décadas, embora tenha perdido parte de sua
patogenicidade a partir de 1920.
Em 1957, uma segunda pandemia originou-se na China. A gripe asiática (H2N2) causou a morte de
2 milhões de pessoas. Poucos anos mais tarde, em 1968, o subtipo H3N2 apareceu em Hong Kong e
alastrou-se pelo mundo, deixando 47 mil mortos.
A gripe aviária (H5N1) surgiu na Ásia, em 1997. Embora a transmissão tenha sempre ocorrido no
sentido ave-ave e ave-homem, milhares de aves foram sacrificadas durante os surtos de 2003 e 2004,
devido ao temor de uma mutação que possibilitasse a transmissão do homem ao homem. A aparição
do subtipo H5N1 demandou a modificação dos métodos tradicionais de produção de vacinas em
embriões de galinha. Transferindo a informação genética relevante do vírus para um vírus de
laboratório, obteve-se um protótipo viral, codificador dos antígenos correspondentes ao H5N1 que
pode crescer em embriões de galinha.
A gripe A (H1N1) ou gripe suína apareceu no México em 2009. Diferentemente das variantes
anteriores, esta causou mais vítimas entre os jovens e as mulheres grávidas. A resistência dos mais
velhos poderia ser explicada por um contato prévio com vírus de tipo H1N1, que circularam por um
tempo na população.
A existência de medicamentos antivirais contribuiu para o controle da pandemia. A rápida
mobilização das autoridades nacionais e internacionais, assim como das empresas farmacêuticas, foi
decisiva para a obtenção de uma vacina adequada. Contudo, algumas fraquezas foram expostas. Uma
delas é a dificuldade de produzir rapidamente uma vacina, dado que, para obter 300 milhões de doses
de vacina, são necessários 900 milhões de ovos embrionados. Em caso de urgência, a produção em
cultivos celulares resultaria mais rápida.
Mutação do RNA e recombinação de RNAs de diferente origem são as duas estratégias que explicam
a enorme variabilidade do vírus da influenza e justificam a necessidade de mudar continuamente os
antígenos da vacina. O candidato vacinal de hoje pode ser inócuo amanhã, sendo difícil prever contra
quais antígenos do vírus dirigir a vacina. Por isso, as vacinas contra a gripe são preparadas anualmente,
escolhendo as linhagens que se supõe que causarão a próxima epidemia.
TUBERCULOSE, MALÁRIA E HIV/AIDS
Ainda não temos vacinas para a tuberculose, a malária ou o HIV/AIDS, três doenças que causam um
elevado número de mortes.
A malária é uma doença causada por um protozoário (Gênero Plasmodium), transmitido através da
picada de um mosquito (Gênero Anopheles). O decréscimo da incidência global da doença em 37%, e
da mortalidade em 60%, observado a partir do ano 2000, deve ser atribuído à prevenção e ao
tratamento dos doentes. No entanto, em 2015 registraram-se no mundo inteiro 214 milhões de casos.
A maior dificuldade no desenho de uma vacina contra a malária reside no complexo ciclo do
parasita, que se reproduz na glândula salivar do mosquito, se desloca na corrente sanguínea do
hospedeiro, se replica no fígado e infecta as hemácias para multiplicar-se novamente. As vacinas em
andamento, dirigidas a uma única etapa da vida do parasita, só conseguem imunizar parte das crianças
vacinadas. Para ser eficiente, a vacina teria que combater o parasita em cada etapa do ciclo.
Uma possibilidade engenhosa, em fase laboratorial, propõe induzir, no homem, anticorpos contra a
forma do parasita que reside nas glândulas salivares do mosquito. Na picada, o Anopheles ingeriria os
anticorpos, e estes bloqueariam a reprodução do parasita.
A tuberculose é uma doença causada pelo bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis),
transmitido pelo ar. O declínio de 47% de casos, observado entre 1990 e 2015, deve ser atribuído aos
melhores métodos de diagnóstico e tratamento. No entanto, em 2014, registraram-se 9,6 milhões de
casos.
229
http://bteduc.com
Nos alvéolos pulmonares, as bactérias são fagocitadas pelos macrófagos, dentro dos quais elas se
multiplicam lentamente, sem ser destruídas. Em algumas pessoas, a infecção permanece latente, em
outras se manifesta com diferentes graus de gravidade.
A vacina existente utiliza o bacilo atenuado BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) para induzir imunidade
ao bacilo de Koch. A vacina é eficiente em crianças pequenas, mas não imuniza crianças mais velhas
ou adultos. Por outro lado, a eficácia da vacina diminui nas regiões perto do Equador, onde há
numerosas infecções por micobactérias aparentadas. As pesquisas atuais visam entender melhor a
imunidade no adulto e as características hereditárias que tornam as pessoas mais susceptíveis.
Por enquanto, a mais insidiosa das três doenças é a HIV/AIDS, porque destrói a capacidade do
sistema imune de responder a infecções oportunistas. Os primeiros casos apareceram em 1981 e se
estenderam rapidamente pela população. Em 2013, 35 milhões de pessoas viviam com HIV/AIDS e 1,5
milhão de pessoas morreram de doenças ligadas a AIDS.
A maior parte das novas contaminações ocorre nos países em desenvolvimento, especialmente o
sul da África e a Ásia. No rasto da HIV/AIDS (e da adição a drogas injetáveis), a tuberculose reaparece
com germes resistentes aos medicamentos.
Apesar das medidas preventivas e dos grandes progressos alcançados no tratamento da HIV/AIDS,
o ideal seria encontrar uma vacina. As dificuldades são enormes porque, para ativar a resposta imune,
devem-se ativar as células T auxiliadoras que a coordenam, e são justamente estas as que o vírus
destrói. Como geralmente o vírus penetra no organismo por via anal ou vaginal, permanecendo um
tempo na corrente sanguínea antes de invadir as células, a vacina deveria estimular ambas as vias, a
humoral e a celular, e se estender às mucosas.
Na luta contra o HIV/AIDS, diversas estratégias são possíveis; uma delas seria impedir a invasão do
organismo pelo vírus, a outra, ajudar o organismo a impedir a progressão e/ou a transmissão da
doença. A falta de um modelo animal adequado e as frequentes mutações do vírus complicam a tarefa.
Embora os resultados obtidos até agora tenham sido decepcionantes, estão sendo realizados os
estudos clínicos correspondentes a vacinas de subunidades, de vetores virais recombinantes e de DNA.
A AMEAÇA DAS DOENÇAS EMERGENTES
À medida que eliminamos ou controlamos doenças, outras novas emergem e algumas das antigas
reaparecem. Os microrganismos adquirem resistência aos medicamentos, e a destruição de habitats
naturais deixa o homem a mercê de agentes infecciosos com os quais não teve contato prévio. O
crescimento da população e sua concentração em zonas urbanas, as mudanças climáticas, o
incremento das viagens internacionais e do comércio, assim como as mudanças comportamentais, são
outros fatores determinantes para a dispersão de agentes infecciosos.
Alguns exemplos de doenças emergentes são a gripe espanhola, a hepatite B, as febres
hemorrágicas (Junín, Lassa, Marburg, Ebola etc.), a doença de Lyme, a BSE (encefalopatia
espongiforme bovina), a doença dos Legionários, o HIV/AIDS, a Escherichia coli 0157:H7, a doença do
vírus do Nilo ocidental, o SARS (do inglês, severe acute respiratory), o MERS (do inglês, middle east
respiratory sindrome) e a dengue. Várias dessas doenças contam com testes diagnósticos, e, para
algumas, já temos vacinas (hepatite B, doença de Lyme). Testes clínicos em seres humanos estão sendo
realizados com vacinas contra HIV/AIDS, malária, dengue, cólera etc.
Entre 2013 e 2016, uma epidemia de Ebola devastou a África ocidental, afetando Guiné, Libéria e
Serra Leoa, e alastrando-se até o Senegal, a Nigéria e o Mali. O vírus de Ebola é comum na região, e
embora sua forma de transmissão ao homem ainda não tenha sido totalmente esclarecida, sabe-se
que envolve vários animais da região (chimpanzés, gorilas e morcegos).
As mudanças evolutivas do vírus parecem ter influído menos na gravidade da epidemia que as
condições sociais e culturais existentes: infraestrutura destruída por décadas de guerras civis;
230
dificuldade das equipes médicas em distinguir entre diversas infecções com sintomas parecidos;
práticas religiosas de sepultamento dos doentes facilitando o contágio.
Mais de 28 mil casos e 11 mil mortes abalaram a já comprometida estrutura social e econômica dos
países afetados. Os surtos que ocorreram nos Estados Unidos e na Europa, originados por pessoal das
equipes médicas transferido para tratamento em seus países de origem, foram rapidamente
controlados. Também a Nigéria conseguiu controlar um surto incipiente, utilizando a estrutura
sanitária criada, com o apoio de organizações internacionais, para a erradicação da pólio.
Nenhum país está preparado para a emergência de uma doença desconhecida. No entanto, a
epidemia de Ebola deixa duas lições: a necessidade de contar com testes de diagnóstico rápidos e a
obrigação moral de manter em alerta uma infraestrutura sanitária sólida; as vacinas serão de utilidade
mais adiante, em ocasião do próximo surto.
Atualmente, vários países de América Latina (Brasil, Colômbia) enfrentam uma epidemia de
dengue, chikungunya e zika, três doenças de origem viral transmitidas por mosquitos do gênero Aedes
(A. aegypti e A. albopictus), transmissores, também, da febre amarela. Existe uma vacina para a febre
amarela e encontram-se adiantadas duas vacinas contra a dengue (Sanofi-Pasteur e Butantan).
Os fatores determinantes da emergência dessas doenças são as mudanças climáticas, a abertura
de rotas comerciais, as viagens internacionais e, fundamentalmente, a falta de saneamento básico,
porque facilitam a dispersão e a proliferação do mosquito nas áreas urbanas. Sistemas de atendimento
médico precários e falta de testes de diagnóstico agravam a situação da região.
A aparição de numerosos casos de microcefalia, atribuídos ao vírus zika, exige uma resposta rápida,
mas qual? Uma vacina demora em chegar, e por muito que se queira apressar, não há como diminuir
o tempo necessário para fazer os testes clínicos pertinentes e produzir o número de doses necessárias.
O caminho parece ser impedir a multiplicação do mosquito, e várias formas foram descritas no Capítulo
11.
BIOTERRORISMO E BIOSSEGURIDADE
Esporos disseminados pelos correios causaram um surto de antraz, logo depois do atentado às torres
do World Trade Center (Estados Unidos, setembro de 2001), alertando o mundo sobre a ameaça de
bioterrorismo.
Não foi a primeira vez que foram utilizadas armas biológicas. Os romanos usavam animais mortos
para infectar os poços de seus inimigos. Antes de levantar o sítio à cidadela de Kaffa (Crimeia, 1346),
o exército tártaro de Janibeg catapultou para dentro das muralhas os mortos de peste, iniciando uma
terrível epidemia que se difundiu na Europa e dizimou a população. Na América (do Sul e do Norte),
os colonizadores exterminaram tribos indígenas com cobertores contaminados com varíola, deixados
como presente. Em 1941, durante o conflito sino-japonês, o exército do Japão disseminou a peste
bubônica no norte da China, em cinco ocasiões.
Estima-se que uma dúzia de países teria armas biológicas de destruição em massa, envolvendo
aproximadamente 70 agentes infecciosos. Atualmente, ou em curto prazo, existem vacinas para alguns
deles (Bacillus anthracis, Clostridium botulinicum, Yersinia pestis, Francisella tulariensis, varíola e
hantavírus). Entretanto, de um ponto de vista científico, sanitário ou financeiro, a vacinação poderia
não ser o método de combate mais eficiente. Por isso, boa parte do esforço antiterrorista está sendo
orientado atualmente para o melhoramento de diagnósticos e a procura de novos medicamentos
antivirais e antibacterianos.
Outro motivo de preocupação está na quantidade de informação referente ao genoma de
patógenos disponível nos bancos de dados públicos, porque existe o temor que esse conhecimento
possa ser utilizado para elaborar armas biológicas.
231
http://bteduc.com
Em 2002, um grupo de pesquisadores americanos mostrou que partículas infecciosas sintéticas de
poliovírus podem ser obtidas a partir da sequência genômica disponível na Internet. Esses
pesquisadores sintetizaram alguns fragmentos de DNA e encomendaram outros a empresas
especializadas. Juntando os pedaços, eles construíram uma molécula de DNA de 7.500 pares de bases.
Depois de transcrever a informação e colocar o RNA em um meio com componentes celulares, eles
obtiveram partículas virais. Recentemente, outro grupo de pesquisadores utilizou o mesmo método
para sintetizar o vírus da gripe espanhola.
No fim do ano 2011, pesquisadores holandeses e norte-americanos noticiaram ter conseguido
manipular o vírus H5N1 em laboratório, tornando-o facilmente transmissível em seres humanos. O
trabalho, que poderia servir tanto para elaborar uma vacina como para criar uma arma letal, levanta
o problema da liberação dos dados da pesquisa que, normalmente, são compartilhados por
pesquisadores de todos os países.
O perigo do bioterrorismo não deve ser subestimado. Biosseguridade é uma nova disciplina que
lida com a utilização inadequada do conhecimento biológico e, particularmente, com as pesquisas
consideradas de uso duplo, que podem ser utilizadas para o bem ou para o mal.
232
C A P Í T U L O 18
BIOTECNOLOGIA E SAÚDE
OS TESTES DIAGNÓSTICOS
O conhecimento e a experiência do médico são determinantes no reconhecimento dos sintomas de
uma doença. O diagnóstico será estabelecido a partir de vários elementos, tais como a história clínica
do paciente, a anamnese, os exames físicos e uma bateria de análises e/ou testes laboratoriais.
Solicitados pelo médico, para monitorar o estado de saúde do paciente, os testes de rastreio
identificam fatores químicos, microbianos ou genéticos que possam causar uma doença ou estar
associados a ela. Constituem uma rotina que varia dependendo do sexo e da idade do paciente. Os
resultados serão avaliados em relação a um conjunto de valores considerados normais e remetidos ao
médico como uma fonte objetiva de informação.
Geralmente realizados em amostras de sangue e de urina, o objetivo desses testes é detectar
qualquer disfunção, seja para induzir mudanças no estilo de vida do paciente e/ou para iniciar um
tratamento. Como exemplos, o hemograma, a análise de urina, o lipidograma, a identificação do
antígeno prostático para diagnóstico de câncer etc.
Qualquer negligência relativa à adoção dos testes adequados pode ter consequências graves para
a saúde pública. Em 1985, embora a empresa Abbott já tivesse no mercado um teste de rastreio do
vírus HIV nas doações de sangue, a França preferiu aguardar o lançamento de um teste francês. Em
poucos meses, 297 dos pacientes transfundidos foram contaminados e três ministros de Estado
tiveram que comparecer na Justiça e responder pelo incidente.
Inserida nas áreas veterinárias e médicas, a indústria de diagnósticos in vitro cresce rapidamente
no setor de diagnósticos moleculares (doenças infecciosas e cardiovasculares, oncologia e
farmacogenética), acompanhando as demandas dos mercados da América Latina, do Leste Europeu,
do Oriente Médio e do Leste Asiático.
AS TENDÊNCIAS ATUAIS
A maior parte dos testes diagnósticos é realizada hoje com alta tecnologia, reunindo em ambientes
automatizados diversos reagentes, instrumentos analíticos e produtos acessórios de controle de
qualidade. Em consequência, as análises clínicas estão se concentrando em umas poucas empresas,
com suficiente poder econômico para tratar um volume grande de amostras que justifique a utilização
de sistemas robotizados.
http://bteduc.com
Em outra vertente mercadológica, kits relativamente simples permitem o diagnóstico de gravidez e o
monitoramento de algumas condições crônicas, como a diabete, sendo vendidos nas farmácias ou via
Internet. Comercializado recentemente, outro tipo de kit informa os clientes interessados sobre sua
ancestralidade e predisposição a várias doenças.
DISPOSITIVOS MINIATURIZADOS
A construção de biochips, dispositivos miniaturizados de arrays moleculares de proteínas, anticorpos
ou ácidos nucleicos, estimulou o desenvolvimento de várias plataformas comerciais que
revolucionaram o setor de testes de diagnóstico. Essa tendência se vê acentuada com a chegada de
materiais e dispositivos em escala nanométrica.
O desenvolvimento da tecnologia microfluídica permitiu miniaturizar os ensaios em dispositivos
que realizam automaticamente todas as etapas do protocolo. Um biochip microfluídico típico pode
reunir, em um único dispositivo, um procedimento complexo: extração da amostra, separação
eletroforética, coloração/descoloração e identificação.
Os biochips microfluídicos ou lab-on-a-chip (LOC) permitem obter resultados rapidamente, no
consultório médico, no hospital (emergência, unidade de terapia intensiva), em algum lugar isolado ou
em uma emergência de biosseguridade, sem precisar recorrer ao laboratório (Figura 18.1). O lab-ona-chip demanda uma intervenção humana mínima, dando um resultado preciso que pode ser
arquivado facilmente.
-------------FIGURA 18.1. Imagens comerciais de alguns dispositivos miniaturizados utilizados em testes diagnósticos
A. Lab-on-a-chip de Agilent (lab-on-a-chip-loc-243049.jpg (http://www.directindustry.com).
B. Chip de DNA para diagnóstico de Toshiba (http://www.toshiba.co.jp/rdc/rd/fields/06_t29_e.htm).
C. Gene chip de Affymetrix (http://www.pgbeautygroomingscience.com).
A
234
B
C
BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS
O QUE É UM BOM TESTE
As técnicas bioquímicas, imunológicas e genéticas ocupam um lugar preponderante no setor de
diagnósticos, porque reúnem várias qualidades que são indispensáveis: sensibilidade, especificidade,
exatidão e reprodutibilidade (Tabela 18.1).
Apesar ser aplicadas também na área ambiental (análise de solos, qualidade da água) e na indústria
de alimentos (detecção de contaminantes nos alimentos ou nas matérias-primas), neste capítulo nos
limitaremos a analisar sua utilização na área de saúde.
-------------TABELA 18.1. As qualidades de um bom teste de diagnóstico.
QUALIDADE
DEFINIÇÃO
Sensibilidade
Probabilidade de dar um resultado positivo quando a condição está presente.
Especificidade
Probabilidade de dar um resultado negativo quando a condição não está presente.
Exatidão
Dar o mesmo valor que o obtido com outro método.
Reprodutibilidade
Em se tratando de um teste quantitativo, dar sempre o mesmo valor na mesma amostra.
--------------
AS TÉCNICAS COM BASE BIOQUÍMICA
As técnicas clássicas de identificação microbiana estão sendo substituídas, desde a década de 1970,
por sistemas miniaturizados. Nos sistemas API da empresa Biomérieux, por exemplo, uma suspensão
de microrganismos é adicionada a uma galeria de minitubos contendo os reagentes necessários para
desenvolver diferentes reações químicas. Após a incubação, a análise dos resultados possibilita a
identificação do microrganismo (Figura 18.2).
Diversos tipos de galerias conseguem identificar quase todas as bactérias e leveduras de interesse
clínico. Além de ser mais seguros, o sucesso desses dispositivos se deve à redução da quantidade de
reagentes e do trabalho laboratorial, dois fatores que incidem nos custos.
Na clínica médica, o combate à infecção depende da seleção de um antibiótico adequado. Os
métodos tradicionais de elaboração de um antibiograma, para identificar os antibióticos aos quais o
patógeno é sensível, demandam um lapso de 24 a 48 horas que pode ser fatal para o paciente. Os
primeiros ensaios, com biochips microfluídicos portáveis, permitiriam obter o antibiograma de um
patógeno com menor gasto de reagentes e em menos tempo (2 a 4 horas). Espera-se que esses
dispositivos estejam disponíveis em curto prazo.
-------------FIGURA 18.2. Imagem comercial dos sistemas API de Biomérieux
(http://www.tgw1916.net/Tests/api.html).
235
http://bteduc.com
AS TÉCNICAS COM BASE IMUNOLÓGICA
Baseadas nas reações de aglutinação e precipitação entre um antígeno e o anticorpo específico, as
técnicas imunológicas receberam grande impulso com a descoberta e o desenvolvimento da
tecnologia de hibridomas.
Apesar de ser complexa, demorada e cara, a tecnologia de hibridomas abastece os laboratórios
com reagentes standard, específicos e sensíveis. Associados a moléculas radiativas ou fluorescentes,
os anticorpos monoclonais detectam os antígenos específicos em células, tecidos, soros e corridas
eletroforéticas (imunofluorescência, radioimunoensaio, Western Blot etc.). Utilizam-se também para
separar diferentes populações celulares (CellSorter) e localizar tumores.
Em outro tipo de testes, os anticorpos estão acoplados a enzimas que formam um produto colorido
em presença do substrato (ELISA, do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Esses testes
detectam e quantificam tanto a concentração de anticorpos em infecções ou doenças autoimunes,
como a de antígenos, sejam hormônios, marcadores cancerosos, alérgenos em alimentos e na poeira
caseira, toxinas alimentares, esteroides usados ilicitamente por atletas, drogas como a cocaína e os
opiáceos etc. (Figura 18.3).
-------------FIGURA 18.3. O método direto e indireto de um teste positivo de ELISA.
MÉTODO DIRETO
MÉTODO INDIRETO
O anticorpo é fixado na placa de microtitulação.
O antígeno é fixado na placa de microtitulação.
Coloca-se uma amostra de sangue como fonte de antígeno.
Este se fixa nos anticorpos. Retira-se o excesso por lavado.
Coloca-se uma amostra de soro como fonte de anticorpos.
Estes se fixam no antígeno. Retira-se o excesso por lavado.
Acrescentam-se anticorpos ligados a uma enzima E, que se
fixam no antígeno. Retira-se o excesso por lavado.
Acrescentam-se
anticorpos
específicos
para
a
imunoglobulina humana, ligados a uma enzima E, que se
fixam nos anticorpos do soro, fixados previamente no
antígeno. Retira-se o excesso por lavado.
Adiciona-se o substrato da enzima, formando-se um
produto colorido P.
Adiciona-se o substrato da enzima, formando-se um
produto colorido P.
A cor é proporcional à quantidade de antígeno no sangue.
A cor é proporcional à quantidade de anticorpos no soro.
236
AS TÉCNICAS COM BASE GENÉTICA
O acúmulo de conhecimento sobre o genoma humano favorece a utilização das tecnologias genéticas
para o diagnóstico clínico. Os estudos cromossômicos evoluíram notavelmente com a utilização de
sondas de DNA acopladas a moléculas fluorescentes (SKY, do inglês spectral karyotyping). O
computador transforma a imagem microscópica em outra de cores brilhantes bem definidas,
facilitando a identificação dos pares cromossômicos e de pequenas translocações (Figura 18.4 A).
Sondas específicas também possibilitam a localização de sequências gênicas nas células (FISH, do
inglês fluorescence in situ hibridization, ASO, do inglês Allele-specific oligonucleotide) e nos fragmentos
de ácidos nucleicos, previamente separados por eletroforese em gel (Southern Blot, Fingerprint).
Contudo, a grande estrela continua sendo a reação em cadeia da polimerase ou PCR (do inglês,
polymerase chain reaction), uma tecnologia que amplifica quantidades ínfimas de DNA, facilitando as
análises posteriores (Figura 18.4 B). Na área clínica, a PCR é aplicada na identificação de patógenos e
na pesquisa de variações genéticas nos pacientes.
A versatilidade da técnica tem dado origem a procedimentos bem diversificados, alguns dos quais
integrados em microdispositivos do tipo Lab-on-a-chip. Pode-se monitorar a reação de amplificação
com anticorpos fluorescentes, eliminando os estudos complementares de eletroforese posteriores e
obtendo os resultados “em tempo real”.
Os biochips de DNA encontraram aplicações em áreas tão diversas como meio ambiente,
epidemiologia, controle de qualidade de alimentos etc. Na área de saúde, a tecnologia é utilizada com
diferentes objetivos: identificar um patógeno, descobrir quais os genes ativados em um tecido;
comparar as sequências de dois alelos; encontrar o medicamento adequado para um paciente; prever
o risco de uma pessoa se for exposta a uma substância X. Os dispositivos miniaturizados facilitam,
também, a escolha de tratamentos farmacológicos adequados ao perfil do paciente, o diagnóstico do
câncer e das doenças cardíacas e neuropsiquiátricas.
Por ser portáveis, robustos e relativamente baratos, os dispositivos miniaturizados com diferentes
painéis de genes têm um espaço garantido no setor de testes diagnósticos. No entanto, a chegada das
novas tecnologias de sequenciamento de DNA, que permitem analisar o genoma todo, abre um novo
espaço para o diagnóstico genético.
-------------FIGURA 18.4: As técnicas com base genética
A. Imagem mostrando a identificação dos 46 pares de cromossomos
humanos mediante a técnica de SKY, segundo o National Human Genome
Research Institute (http://www.genome.gov).
B.
Imagem comercial de um termociclador para a reação em cadeia da
polimerase, de Applied Biosystems (http://appliedbiosystems.com).
237
http://bteduc.com
O DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS INFECCIOSAS
A evolução de uma doença é detida com o diagnóstico, seguido de tratamento. Nos países
desenvolvidos, e em alguns setores dos países em desenvolvimento, os novos testes de diagnóstico se
encontram disponíveis para a população. Contudo, essa não é a realidade dos países mais pobres, sem
acesso a uma tecnologia que exige conhecimentos, material e equipamentos especializados. Nesses
países, uma das principais causas de mortalidade continuam sendo as doenças infecciosas, como
HIV/AIDS, tuberculose e malária.
O diagnóstico de HIV está baseado no reconhecimento da proteína p24 do vírus e na presença de
anticorpos detectados mediante os testes ELISA ou Western Blot, que atualmente podem ser
combinados em um só. Uma vez diagnosticada a infecção por HIV, acompanha-se a evolução mediante
a medição da carga viral, por PCR quantitativa, e a contagem de células CD4. Dependendo dos
resultados, dá-se início ao tratamento.
Em alguns países, encontram-se à venda kits para diagnóstico de HIV/AIDS, mas sua utilização
individual está muito limitada pela dificuldade de enfrentar o diagnóstico sem um apoio psicológico
adequado. Também é difícil, para o leigo, lidar com os conceitos de “falso positivo” ou “falso negativo”.
No entanto, os testes de diagnóstico rápido são uma ferramenta preciosa em mãos de pessoal
treinado.
O diagnóstico da tuberculose envolve várias etapas, lentas e trabalhosas. Descoberta a infecção
latente pela reação à tuberculina, os estudos posteriores exigem radiografias, observações
microscópicas e cultivos microbianos. Testes mais recentes identificam rapidamente os anticorpos no
sangue, pelo teste ELISA, e o Mycobacterium tuberculosis na amostra de esputo, com sondas genéticas,
mas sua difusão é limitada pelo custo.
O diagnóstico de malária depende de observações clínicas confirmadas por microscopia, uma
técnica relativamente econômica, mas que exige pessoal treinado. Apesar da existência de testes
genéticos, os testes imunológicos rápidos resultam mais convenientes nas regiões remotas, sem
laboratórios ou equipamentos apropriados. Além de mais econômicos, facilitam a escolha do
tratamento, porque diferenciam o Plasmodium falciparum, resistente à cloroquina, de outras espécies
que podem causar a doença e são sensíveis ao medicamento.
Os países emergentes precisam de testes de diagnóstico rápidos e baratos, adaptados às tantas
outras doenças que os afligem (leischmaniose, leptospirose, dengue, chikungunya, zika, infecções por
rotavírus, doença de Chagas etc.). Para acompanhar a evolução das doenças emergentes, a grande
inovação seria complementar os testes de diagnóstico laboratoriais com outros, mais simples e
rápidos, realizados com microdispositivos portáveis.
A TIPIFICAÇÃO DE TECIDOS
SANGUE
A tipificação das hemácias classifica as pessoas em quatro grupos para os marcadores ABO (A, B, AB e
O) e dois para o sistema Rh (Rh+ e Rh-). A caracterização rotineira deste último durante a gravidez
permite tomar medidas em caso de incompatibilidade sanguínea mãe-feto. Também se tipificam os
sistemas ABO e Rh antes de uma transfusão sanguínea, uma intervenção salva-vidas em pacientes que
sofreram uma hemorragia (acidente, cirurgia, doenças digestivas etc.), ou que apresentam um quadro
de anemia séria (quimioterapia, câncer, doenças hematológicas).
A tipificação dos antígenos ABO e Rh da superfície das hemácias nem sempre é suficiente, porque
existem vários outros sistemas de grupos sanguíneos capazes de desencadear uma reação de
238
incompatibilidade. Em pacientes com um passado de gravidez ou de transfusão prévia, os anticorpos
a esses sistemas são pesquisados no soro com kits de hemácias específicas.
-------------FIGURA 18.5. O sistema HLA
C. A herança dos haplótipos.
O CROMOSSOMO 6
D.
CRUZAMENTO
Reação mista ou “cross-matching”. Colocam-se em contato as células do doador com o soro do receptor, em presença
de complemento. Se as células do doador ficam intactas, há compatibilidade.
TRANSPLANTE INCOMPATÍVEL
Células
do doador
Soro
do receptor
Complemento
Lise
TRANSPLANTE COMPATÍVEL
Células
do doador
Soro
do receptor
Complemento
Células intactas
239
http://bteduc.com
A palavra final corresponde aos testes de compatibilidade, em que se coloca o soro do receptor em
presença das hemácias do doador. Indispensáveis na rotina de um banco de sangue, esses testes
personalizados são realizados por pessoal médico ou técnico.
Nos centros hospitalares que processam um número alto de amostras de sangue, os testes
sorológicos clássicos em tubos de vidro estão sendo substituídos por novas tecnologias, em estações
de trabalho automatizadas. Os Gel Tests para tipificação de hemácias estão baseados na centrifugação
controlada das hemácias em um gel de dextrana-acrilamida.
Entre suas vantagens está a possibilidade de trabalhar com numerosas amostras de pequeno
volume, a eliminação da etapa de lavados e a obtenção de resultados estáveis. Se for necessário, os
dados poderão ser analisados posteriormente e reavaliados por um supervisor.
Também se utilizam técnicas cromatográficas como a ACT (do inglês affinity column technology),
para identificar subclasses de imunoglobulinas em hemácias sensibilizadas, e placas de microtitulação,
para pesquisa de anticorpos.
OUTROS TECIDOS E ÓRGÃOS
A rejeição de um órgão transplantado deve-se à incompatibilidade entre os tecidos do doador e do
receptor. Além dos antígenos do grupo sanguíneo (ABO), existem outros marcadores de identidade
que também se expressam nas células de um organismo, como os antígenos leucocitários do sistema
HLA (do inglês, human leucocyte antigen). O sistema imune os utiliza para diferenciar as células que
fazem parte do organismo (“eu”) das que não pertencem a ele (“não eu”).
Os antígenos do sistema HLA são codificados por um conjunto de genes estreitamente ligados,
localizados no cromossomo 6. Os genes A, B e C determinam os antígenos de classe I, presentes em
todas as células, salvo as hemácias. Já o locus D determina outros três antígenos (DR, DQ e DP),
denominados de Classe II, que são encontrados em algumas células (macrófagos, monócitos, células
dendríticas e células endoteliais). Os de maior importância clínica são os antígenos de classe I,
codificados pelos alelos de A e B, e os de classe II, relativos a DR.
A herança do sistema HLA segue um padrão de codominância, ou seja, ambos os alelos se
expressam nas células. Quando uma pessoa é caracterizada como HLA - A1 A3 B8 B14 DR2 DR10, isto
significa que, em um cromossomo, leva os alelos A1 B8 DR2 herdados de um dos genitores, e, no outro,
A3 B14 DR10, herdados do outro. Por estarem estreitamente ligados, esses genes são transmitidos em
blocos, denominados haplótipos (Figura 18.5 A).
Como esses genes contam com mais de 450 alelos, seria possível ter milhões de combinações que
dariam a cada indivíduo uma identidade única. Contudo, alguns haplótipos são mais frequentes que
outros, especialmente em diferentes grupos raciais.
Os testes de histocompatibilidade são prévios a um transplante de rim ou de células-tronco
hematopoiéticas. Para selecionar os pares doador-receptor histocompatíveis, identificam-se os
antígenos celulares de ambos mediante painéis de anticorpos e instrumentação laboratorial. Utilizase também a PCR para caracterizar os genes HLA-DP do doador e do receptor.
Como gravidezes, transplantes anteriores ou transfusões podem originar, no receptor, anticorpos
contra o órgão a transplantar, a verificação da compatibilidade é fundamental. O teste para prevenir
a rejeição é a reação mista ou cross-matching, em que se coloca o soro do receptor em contato com
as células do doador, em presença de complemento. Se houver compatibilidade, as células do doador
ficarão intactas; em caso de incompatibilidade, haverá lise celular (Figura 18.5 B).
Os testes de histocompatibilidade também são utilizados no diagnóstico de doenças autoimunes.
240
O DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS
AS LIMITAÇÕES DOS TESTES
As doenças de origem genética representam um grupo heterogêneo de patologias que obedecem a
causas diversas: alterações no número e na estrutura dos cromossomos, ação de um gene
determinando a síntese de uma proteína ou sua ausência, ação de vários genes interagindo com
fatores ambientais, tais como o fumo, a dieta, o estresse etc. (Tabela 18.2).
O diagnóstico das doenças monogênicas está baseado em observações clínicas e testes
laboratoriais (metabolismo, cromossomos, DNA). A localização e o sequenciamento dos genes
responsáveis pelas principais doenças monogênicas possibilitaram o desenvolvimento de testes
genéticos. Contudo, esses testes apresentam algumas limitações, devidas à própria heterogeneidade
do determinismo genético:
o Algumas mutações são inócuas para a saúde do portador (polimorfismos).
o Mutações em genes diferentes podem causar a mesma doença.
o Mutações diferentes dentro de um mesmo gene podem causar a mesma doença.
o Mutações diferentes dentro do mesmo gene podem causar doenças parecidas, com prognóstico
diferente (benigno ou grave).
Um teste genético pode não detectar todas as mutações capazes de causar uma doença. Por outro
lado, sua sensibilidade depende da inclusão da informação mais recente, resultante da pesquisa
genética.
Também existem doenças genéticas que aparecem em uma família devido a mutações em algum
gene ainda desconhecido, de modo que não é possível sua identificação. O caso não será resolvido, a
menos que se encontre uma ligação com outro gene próximo e bem conhecido, que funcionará como
um marcador. A transmissão do gene marcador permitirá inferir o modo de transmissão do gene
desconhecido.
Nessa linha de investigação, um estudo desenvolvido por 50 grupos de pesquisa (Wellcome Trust
Case Control Consortium) identificou recentemente 24 regiões do genoma humano fortemente
relacionadas com 7 doenças diferentes (Doença de Crohn, diabete tipo 1 e 2, doença cardiovascular,
hipertensão, artrite reumatoide e doença bipolar).
Outro problema de difícil solução é a análise do determinismo genético de doenças que apresentam
um padrão de herança complexo, em que diversos fatores ambientais interagem com vários genes. A
no ser que se encontre um gene que tenha um efeito muito maior dos restantes, os testes genéticos
serão de difícil elaboração.
A presença de determinados alelos, como BRCA1 e BRCA2, está associada a uma predisposição
familiar ao câncer de mama (Figura 18.6). Porém, esses alelos não são detectados na maioria dos
outros casos da mesma doença. Em outros termos, nem todas as doenças de origem genética são
familiares, podendo aparecer devido a mutações ou alterações cromossômicas ocorridas ao longo da
vida.
AS ESTRATÉGIAS SEGUIDAS
Apesar de suas limitações, os testes genéticos representam um avanço significativo do ponto de vista
médico e individual. Aplicados em qualquer momento da vida de uma pessoa, respondem a diferentes
objetivos.
241
http://bteduc.com
OS TESTES GENÉTICOS NO ADULTO
No adulto, os testes genéticos são feitos a partir de alguma evidência clínica, para confirmar ou
descartar um diagnóstico. Realizam-se também para prever se uma pessoa que não apresenta
sintomas irá desenvolver uma doença da qual já existem casos na família (doença de Huntington,
doença de Alzheimer), ou para detectar a presença de algumas mutações gênicas associadas à
predisposição a alguma doença.
O RASTREIO DE PORTADORES
O rastreio de portadores é realizado quando um casal planeja ter filhos e deseja saber se tem ou não
um determinado alelo. Geralmente, é solicitado quando há casos de doença na família ou quando o
casal pertence a uma população em que a frequência da doença é alta. Nas famílias afetadas, os testes
genéticos identificam os indivíduos portadores de um gene ou de uma alteração cromossômica que
possa trazer problemas para eles ou para sua descendência.
Rastreio de portadores e aconselhamento genético são duas medidas que conseguiram diminuir a
incidência de várias doenças em algumas comunidades norte-americanas: a anemia falciforme entre
os afro-americanos, a doença de Tay-Sachs entre os judeus askenazim, a fibrose cística entre os
irlandeses.
O DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL
O diagnóstico pré-natal é realizado quando há algum risco ou indício de doença genética no feto. Por
exemplo, uma concentração elevada de -fetoproteína no sangue materno, entre a 15a e a 20a semana
de gravidez, indica a possibilidade de o feto apresentar anomalias, como a síndrome de Down. Nesse
caso, a mãe poderá ser aconselhada a fazer uma amniocentese, extraindo-se uma pequena quantidade
de líquido amniótico e estudando as células do feto para confirmar ou excluir vários diagnósticos.
Também poderá optar por uma biópsia de vilosidades coriônicas, em que se retiram algumas células
da placenta (córion) para análise.
Em uma fecundação in vitro, o diagnóstico pré-natal pode preceder a implantação do embrião. Após
três divisões celulares, quando o embrião se encontra num estado de oito células, uma delas é
removida para a determinação do sexo e das características genéticas. O procedimento não causa dano
ao embrião.
O RASTREIO NO RECÉM-NASCIDO
O rastreio de erros inatos do metabolismo no recém-nascido possibilita o tratamento de algumas
condições hereditárias, evitando danos e lesões irreparáveis. Aproximadamente 5% das crianças
nascem com problemas congênitos ou hereditários, alguns dos quais podem ser previstos mediante
testes genéticos de rastreio.
A partir da década de 1960, diminuíram as deficiências mentais causadas pela fenilcetonúria, graças
à implantação do Teste de Guthrie ou “do pezinho”, que mede a quantidade de fenilalanina no sangue.
Uma técnica nova, derivada da espectrometria de massa, é capaz de detectar 20 transtornos
metabólicos em um único teste.
242
TABELA 18.2. Algumas das mais de 8.000 doenças genéticas descritas
Nas doenças monogênicas, a transmissão mostra um padrão claro de herança nem sempre fácil de evidenciar nas doenças
esporádicas ou multifatoriais. Nestas, a genética tem um rol importante, mas nem sempre suficiente para, por exemplo,
determinar a manifestação dos sintomas.
TIPO DE DOENÇAS
HERANÇA
EXEMPLO
Cromossômicas
Esporádica
Síndrome de Down, síndrome de Turner, síndrome de
Klinefelter.
Mitocondriais
Materna
Síndrome MERRF, síndrome MELAS, doença de Leigh
(NARP), doença de Leber.
Autossômica recessiva
Fibrose cística, fenilcetonúria, anemia falciforme, doença
de Tay-Sachs, talassemias.
Autossômica dominante
Hipercolesterolemia familiar, doença de Huntington, rim
policístico, neurofibromatose, acondroplasia.
Recessiva ligada ao X
Hemofilias, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de
Lesch-Nyan, síndrome do X frágil.
Dominante ligada ao X
Síndrome de Rett.
Contribuição genética variável;
influência de fatores ambientais
Malformações congênitas (palato fendido, defeitos do
tubo neural).
Monogênicas
Multifatoriais
Câncer (intestino, mama, ovário, próstata e melanoma).
Doenças cardiovasculares (hipertensão arterial, pressão
alta,
alguns
casos
de
doença
cardíaca,
hipercolesterolemia).
Doenças metabólicas (Diabetes, gota).
Doenças neurológicas e/ou psiquiátricas (Alzheimer em
idade avançada, esquizofrenia, doença bipolar).
Doenças musculoesqueléticas
reumáticos, osteoporose).
(artrite,
transtornos
Doenças dermatológicas (psoríase, eczema).
Doenças respiratórias (asma, alergias, enfisema).
--------------
DIAGNÓSTICO PREVENTIVO E PREDITIVO
Ao associar um gene a uma doença, os testes genéticos permitem iniciar um tratamento que trate os
sintomas ou retarde sua aparição (hemofilia, distrofia muscular de Becker-Duchenne, fibrose cística
etc.). Contudo, quando se trata de uma doença para a qual não existe nem cura nem alívio, a existência
de um teste de diagnóstico pode exigir escolhas muito complexas.
Consideremos, por exemplo, a Coreia de Huntington, uma doença autossômica dominante de difícil
tratamento e que se manifesta tardiamente. A decisão de fazer o teste depende da pessoa interessada,
mas atinge seus familiares, porque o diagnóstico pode ser informativo sobre a constituição genética
dos outros integrantes da família. Outro exemplo é o da transmissão familiar da doença de Alzheimer,
em que algumas pessoas querem saber se vão a desenvolver os sintomas e outras preferem não saber.
Os avanços tecnológicos recentes abrem caminho para o estudo das doenças que resultam da
interação de fatores genéticos e ambientais. Já não se trata de prever uma doença, mas de calcular
qual a probabilidade de vir a desenvolvê-la. A função de um diagnóstico preditivo é de dar ao paciente
243
http://bteduc.com
a possibilidade de fazer escolhas saudáveis, modificando seu modo de vida e aumentando a vigilância
frente a determinados sintomas. Hoje existem testes de predisposição a doenças cardiovasculares e a
vários tipos de câncer. E estão sendo desenvolvidos testes preditivos de resposta a medicamentos.
A predição tem suas limitações. Por exemplo, as mulheres com o gene BRCA1 têm 80% de chances
de desenvolver câncer de mama aos 65 anos de idade; um risco considerado alto, mas sem certeza
absoluta (Figura 18.6). Graças ao diagnóstico preditivo, elas poderão aumentar as medidas
preventivas, isto é, mamografias, controles médicos etc.; outras, como a atriz Angelina Jolie, optarão
por uma mastectomia e a extirpação de ovários. Contudo, do ponto de vista preventivo, a
predisposição familiar responde só por 5 a 10% dos casos de câncer, os 90 a 95% restantes devem-se
a mutações adquiridas ao longo da vida.
-------------FIGURA 18.6. O uso de arrays no diagnóstico de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2
Compara-se o padrão obtido na hibridização dos fragmentos de DNA marcados de uma paciente e os de um controle normal.
A hibridização de ambos DNAs, do DNA da paciente ou do DNA do controle com as sondas, detectada por varredura (scanner),
é sinalizada com cores diferentes em uma imagem computadorizada.
Tecido da paciente
Tecido controle
Extração de mRNA
Extração de mRNA
Preparação de cDNA
(transcriptase reversa)
Preparação de cDNA
(transcriptase reversa)
Amplificação do DNA e marcação com uma
substância fluorescente
Amplificação do DNA e marcação com
outra substância fluorescente
Mistura de ambos os cDNAs marcados
Hibridização com as sondas fixadas na placa do microarray e rinsagem
Varredura e leitura
Diagnóstico
Os pontos verdes e vermelhos identificam, respectivamente, os sítios de hibridização de cada um dos DNAs testados.
Os pontos amarelos identificam os sítios de hibridização de ambas as amostras, os pontos pretos, os de nenhuma das duas
amostras.
244
Um caso muito controverso é o da empresa 23andMe, com sedes nos Estados Unidos e no Reino Unido.
Mediante 199 dólares e uma amostra de saliva, acondicionada em um kit especialmente preparado e
enviado pelo correio, a empresa informa o cliente sobre sua ancestralidade e algumas características
gênicas que poderiam passar a sua descendência. Apesar de ser uma informação pouco relevante e
sem utilidade para a maioria das pessoas, a empresa tem sucesso comercial.
Calcula-se que, em 20 anos, nos países desenvolvidos, a expansão do mercado dos testes genéticos
possibilitará tratamentos de saúde pré-sintomáticos. Quantos desses testes serão necessários?
Quantas pessoas estarão dispostas a mudar seu estilo de vida em função de uma estimativa de risco?
Quantas pessoas se sentirão erroneamente seguras em relação ao estilo de vida que adotarem?
A implementação da medicina preditiva deve ser analisada criteriosamente por todos os setores da
sociedade. Quem controlará a aplicação dos testes genéticos? Como garantir que a decisão de se
submeter a um teste obedeça exclusivamente a uma escolha pessoal? Como seria armazenada essa
informação e com quem seria compartilhada? Seria possível formar uma subclasse de indivíduos sem
seguros de saúde nem empregos, discriminados em função de seus genes?
AS PATENTES
Nos Estados Unidos, até 2013, uma patente outorgava direitos sobre uma sequência de DNA ou um
gene a quem os identificara pela primeira vez. O indivíduo ou a empresa que obteve a patente podia
determinar, durante 20 anos, como essa sequência ou esse gene seriam usados em atividades de
pesquisa ou em testes clínicos.
Nessa data, e em ocasião do julgamento dos direitos da empresa Myriad sobre os genes BRCA1 e
BRCA2, a Corte Suprema de Justiça revogou todas as patentes anteriores, disponibilizando mais de 4
mil genes. Os juízes argumentaram que, por ser um produto da natureza, um gene não poderia ser
patenteado; em contraposição, o cDNA poderia ser patenteado, porque é um produto elaborado pelo
homem e não se encontra na natureza.
No Brasil, não são patenteáveis as sequencias de nucleotídeos isolados de organismos vivos
naturais. Contudo, o cDNA pode ser patenteado sempre que seja diferente do DNA codificador, com
base nos requisitos de novidade, atividade inventiva e aplicação industrial.
O ESPORTE
Na Olimpíada de Roma (1960), o atleta etíope Abebe Bikila ganhou a maratona correndo descalço. Um
fato dessa magnitude desafia a estrutura do esporte. Treinamento? Sem dúvida. Predisposição
genética? Hoje sabe-se que a aptidão para atividades de força ou de resistência está relacionada com
a estrutura das fibras musculares e da proteína codificada pelo gene ACTN3.
Teria a ancestralidade alguma relação com a subida ao pódio? Os atletas do leste africano brilham
nas maratonas, os do norte e oeste africano nas corridas de velocidade, os asiáticos nas provas de
levantamento de peso, os chineses na ginástica etc. Baseado nos dados coletados em numerosos
atletas de destaque em diferentes modalidades, o próximo passo poderia ser a utilização de
marcadores genéticos para selecionar atletas e direcioná-los para a modalidade esportiva considerada
mais adequada.
O determinismo genético pode, eventualmente, mostrar uma predisposição a certo tipo de
esporte, mas não define quem levará as medalhas: a vontade de ganhar, os fatores culturais e um
treinamento intenso parecem ser decisivos.
245
http://bteduc.com
A PRÁTICA FORENSE
Com exceção dos gêmeos idênticos, nenhuma pessoa é geneticamente idêntica à outra. Durante quase
um século, a identificação das pessoas dependeu das impressões digitais e, apesar das enormes
dificuldades em encontrar uma quantidade suficiente de material em estado de conservação
adequado, muitos crimes foram resolvidos graças a estudos bioquímicos e imunológicos.
A análise do DNA para a identificação das pessoas é utilizada desde a década de 1980, quando A.
Jeffreys idealizou a técnica do Fingerprint, estabelecendo uma relação única entre um indivíduo e sua
sequência gênica. A identificação recorre a pequenas sequências não codificadoras dispersas no DNA,
denominadas VNTRs ou vinters (do inglês, variable-number tandem repeats). Essas sequências
polimórficas repetem-se um número de vezes que pode variar de um cromossomo ao seu homólogo,
de modo que os fragmentos de restrição terão tamanhos diferentes.
Sondas genéticas específicas identificam até 20 tipos diferentes de sequências VNTRs. No gel de
eletroforese aparecerá um padrão de bandas individual, parecido com os códigos de barras usados no
comércio. Como a probabilidade de duas pessoas escolhidas ao acaso terem o mesmo perfil de DNA é
menor a um em um trilhão, o resultado é praticamente único para cada indivíduo.
Na determinação da paternidade, os estudos de grupos sanguíneos e de proteínas do soro têm sido
complementados ou substituídos pelos testes de DNA, que se transformaram no eixo de várias
investigações muito comentadas na mídia. No Brasil, o jogador de futebol Pelé teve que reconhecer a
paternidade de Sandra Regina, e o menino Pedrinho, sequestrado na maternidade logo após seu
nascimento pôde, anos mais tarde, reencontrar sua verdadeira família.
Apesar das críticas levantadas em relação às possibilidades de erros laboratoriais devidos à
contaminação de amostras, ao risco da participação de pessoal treinado inadequadamente e às
dificuldades de interpretar estatisticamente os dados, em poucos anos a análise de DNA se
transformou em uma ferramenta indispensável na prática forense.
Nos Estados Unidos, uma mancha de sêmem no vestido azul de uma estagiária se transformou em
uma peça essencial para solicitar o impeachment do presidente Clinton.
Depois de anos de mistérios e rumores, os cadáveres enterrados em uma fossa comum perto de
Jekaterinburg foram reconhecidos, em 1994, como sendo os do tzar Nicolau II, sua família e servidores,
assassinados durante a Revolução Russa (1918). Em 2012, a descoberta dos ossos do rei Ricardo III sob
um estacionamento e a análise do cromossomo Y, transmitido de pai a filho, levantou dúvidas sobre a
legitimidade da linha dos Plantagenetas ao trono da Inglaterra.
Em 1992, os ossos encontrados, anos antes, em uma tumba no Brasil, foram identificados como
pertencentes ao comandante do campo de extermínio de Auschwitz, Joseph Mengele, um dos homens
mais procurados após a Segunda Guerra Mundial. Determinadas variantes gênicas foram decisivas
para a sobrevivência, com 200 calorias diárias, dos defensores do sítio de Leningrado.
A análise de DNA é a única forma de reconhecer as vítimas de catástrofes, conflitos bélicos e
atentados como o do World Trade Center (Nova York, 2001) ou da estação de Madri (2004). E, anos
mais tarde, de seu instigador, Osama Bin Laden.
Quando as amostras estão muito degradadas, analisa-se o DNA mitocondrial. Transmitido por via
materna, esse DNA conta com uma região muito variável, apta para identificar pessoas e esclarecer
laços de parentesco. Entre 1976 e 1985, o regime militar que governou a Argentina exterminou 9 mil
a 30 mil pessoas (desaparecidas). Muitas crianças pequenas, separadas de suas famílias, foram
entregues para adoção. A comparação entre o seu DNA e o de suas avós maternas possibilitou a muitos
filhos de desaparecidos recuperar sua identidade verdadeira.
246
C A P Í T U L O 19
A INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS
A origem da farmácia é atribuída a Galeno (século II), um médico romano que utilizava preparações
medicinais para tentar reestabelecer o equilíbrio destruído pela doença. Durante a Idade Média,
conservou-se seu legado, a denominada “farmácia galênica”, em conventos e monastérios. No século
XVI, o médico e alquimista suíço Paracelso formulou dois conceitos fundamentais: existe um remédio
específico para cada doença e qualquer remédio pode ser tóxico, dependendo da dose.
No século XVIII, o desenvolvimento da química na Europa resgatou do medievo algumas técnicas,
como a destilação e a extração com solventes. A química orgânica nasceu na primeira metade do
século XIX e, na mesma época, fundaram-se os primeiros laboratórios farmacêuticos. Rapidamente, os
métodos artesanais foram substituídos por sistemas de produção industrial.
Ao longo do século XX, gerou-se um setor que compreende os fabricantes de diversas categorias
de medicamentos (de marca, genéricos e de venda liberada), além de empresas que elaboram
produtos novos e outras que desenvolvem pesquisas, geralmente terceirizadas.
O mercado mundial de medicamentos movimenta mais de um trilhão de dólares por ano. Os
medicamentos mais vendidos são os oncológicos, os agentes respiratórios, os reguladores de lipídios,
os antidiabéticos e os antipsicóticos.
Apesar das empresas farmacêuticas dedicarem algumas pesquisas às doenças tropicais dos países
em desenvolvimento, ainda faltam medicamentos adequados para a malária, a doença de Chagas,
a doença do sono, a leishmaniose, a filariose, o dengue e a esquistossomose. Só 3% dos medicamentos
desenvolvidos entre 1975 e 1999 foram dedicados ao tratamento das doenças negligenciadas, e a
metade fora incentivada pela Organização Mundial da Saúde.
O controle da produção de medicamentos depende das grandes corporações multinacionais, que
evoluem em contínuos ciclos de fusão, consolidação e expansão. Por ser extremamente competitivo e
dinâmico, o setor é capaz de absorver rapidamente os avanços científicos e tecnológicos. Na disputa
por um mercado em crescimento, destacam-se como empresas líderes: Pfizer (Estados Unidos),
Novartis (Suíça), SanofiAventisPasteur (França), Roche Holding (Suiça), Merck & Co (Estados Unidos),
GlaxoSmithKline (Reino Unido), Amgen (Estados Unidos), AstraZeneca (Reino Unido), Eli Lilly & Co
(Estados Unidos) e Abbott Laboratories (Estados Unidos).
Apesar do número de medicamentos novos colocados no mercado ter diminuído nos últimos anos,
o número de compostos em testes pré-clínicos ou clínicos aumentou. A estrutura do setor poderá ser
reorganizada nos próximos anos, em função da chegada de novas tecnologias robóticas, informáticas
e biológicas.
http://bteduc.com
O DESENVOLVIMENTO DE UM MEDICAMENTO NOVO
A procura por um medicamento novo começa com estudos laboratoriais e testes em animais,
destinados a selecionar algumas moléculas seguras e com a atividade biológica procurada. Na indústria
cosmética, os testes em animais tendem a ser substituídos por testes em cultivos celulares e, na
indústria farmacêutica, começam a ser realizados testes em micro-órgãos de 3 a 4 milímetros, criados
a partir de células-tronco.
No final da fase pré-clínica, elabora-se o pedido de patente das moléculas consideradas
promissoras e solicita-se a aprovação das autoridades correspondentes para dar início aos testes
clínicos em seres humanos.
Uma vez aprovado o pedido, a primeira fase de testes visa o acompanhamento farmacocinético da
molécula em questão em 20 a 100 voluntários sadios, nos quais são realizados os primeiros estudos
de segurança e dosagem. A segunda fase analisa a eficiência do produto e detecta efeitos colaterais
em 100 a 500 pacientes voluntários. Na terceira fase monitoram-se as reações adversas ao uso
prolongado do medicamento em mil a 5 mil pacientes voluntários.
As 3 fases de testes clínicos podem levar de 4 a 8 anos. O medicamento só poderá ser
comercializado após a aprovação das autoridades, sendo necessária uma fase posterior de vigilância
farmacológica, porque alguns efeitos secundários de baixa frequência só podem ser evidenciados em
amostras numerosas. Muitos medicamentos não conseguem superar essa quarta fase, e houve casos
em que um produto teve que ser retirado do mercado. É o caso do Vioxx (Merck), um medicamento
comercializado para o tratamento da artrite e das dores articulares, descontinuado por aumentar o
risco de ataques cardíacos e derrames.
A indústria sustenta numerosas atividades de pesquisa e desenvolvimento de produtos novos. Das
5 mil a 10 mil substâncias que passam o crivo de uma primeira triagem, só uma chegará ao mercado,
em um processo que leva de 10 a 15 anos, a um custo mínimo estimado em 1 bilhão de dólares. O
retorno do investimento é garantido pelos lucros e por um sistema de patentes válido por 20 anos
(Figura 19.1).
PATENTES, GENÉRICOS E BIOSSIMILARES
A patente sobre um medicamento confere à empresa que o desenvolveu o direito de exclusividade
sobre sua comercialização durante 20 anos. Além de sustentar os custos de pesquisa e
desenvolvimento de um medicamento, boa parte do orçamento das empresas farmacêuticas está
dedicado a propaganda e marketing de seus produtos. Ao vencer a patente de um medicamento, este
se torna de domínio público, sendo copiado e comercializado como medicamento genérico por um
preço 30 a 50% menor.
Esse medicamento que entra no mercado é uma molécula sintética com seu nome genérico
(paracetamol, por exemplo) e sem o nome comercial (Tylenol). Com o mesmo princípio ativo e a
mesma dose que o medicamento de referência, os produtos genéricos causam efeitos terapêuticos
semelhantes. No Brasil, para ser comercializados, precisam da aprovação da Anvisa nos testes de
qualidade.
Em relação aos biofármacos, o medicamento produzido após o vencimento da patente é
denominado biossimilar, porque é sintetizado por um agente biológico e porque o processo de
obtenção pode não ser o mesmo. Sua atividade deve ser avaliada em ensaios bioquímicos,
imunológicos e biológicos in vivo e só pode ser considerado biossimilar se apresentar a mesma
qualidade, eficácia e segurança do produto original de referência. No Brasil, para ser comercializados,
os medicamentos biossimilares também precisam da aprovação da Anvisa nos testes de qualidade. Em
248
BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS
2015, o Remsima® (infliximabe) foi o primeiro anticorpo monoclonal aprovado para uso no país, depois
de demonstrada sua similaridade com o produto biológico inovador Remicade® (infliximabe).
A distribuição de genéricos e biossimilares na rede pública de saúde representa, em qualquer país,
uma economia considerável. A produção de sete antivirais genéricos para o tratamento de HIV/Aids
por Farmanguinhos, e a preferência destes sobre os medicamentos de marca, para sua compra e
distribuição na rede pública de saúde, representaram para o Brasil uma economia de mais de US$ 400
milhões por ano.
Admite-se que, em alguns casos, como situações de emergências nacionais, circunstâncias de
extrema urgência e práticas anticompetitivas, o uso de uma patente sem a autorização do detentor do
direito seja justificado. Esta salvaguarda se encontra no Acordo sobre Aspectos dos Direitos de
Propriedade Intelectual Relacionados ao Comércio (TRIPS Agreement), da Organização Mundial do
Comércio, vigente desde 1995. O artigo 31 assinala que o uso da patente sem autorização estaria
justificado se tivessem sido feitos os esforços para sua utilização em condições comerciais razoáveis.
Quando da ameaça terrorista de antraz, os Estados Unidos cogitaram quebrar a patente do
antibiótico Cipro. Nos países em desenvolvimento, o acesso aos medicamentos é considerado um
direito fundamental dos pacientes de HIV/Aids, porém, apesar das longas discussões no marco da
Organização Mundial de Comércio, milhões de pessoas morrem anualmente por falta desses
medicamentos.
--------------
FIGURA 19.1. As etapas do desenvolvimento de um medicamento
Descoberta
Fase pré-clínica
5.000
compostos
5 compostos
0
2
4
6
8
Testes clínicos
10
12
1 composto
14
16
Início das pesquisas. Estudos laboratoriais e testes em animais para
avaliar a atividade biológica e a segurança.
Pedido de patente (3 a 4 anos).
Pedido de aprovação para dar início aos testes em seres humanos.
Fase I. Acompanhamento farmacocinético e primeiros estudos sobre
segurança e dosagem em 20 a 100 voluntários sadios (1 a 2 anos).
Fase II. Eficiência e efeitos colaterais em 100 a 500 pacientes
voluntários (2 anos).
Fase III. Monitoramento das reações ao uso prolongado do
medicamento em 1.000 a 5.000 pacientes voluntários (3 a 4 anos).
Processo de aprovação do novo medicamento (1 a 2 anos)
Fase IV. Vigilância farmacológica
18
Procedimentos
administrativos
20
Vencimento da patente
22
24
Genéricos
Anos
249
http://bteduc.com
OS PRINCÍPIOS ATIVOS DAS PLANTAS
O CASO DA ASPIRINA
Devido a seu poder de curar febres e acalmar dores, a casca do salgueiro (Salix Alba) era utilizada, já
no século XVIII, na preparação de poções medicamentosas. O princípio ativo é a salicilina, da qual foi
extraído o ácido salicílico. Em 1874, fundou-se a primeira empresa para sintetizar quimicamente o
ácido salicílico, uma substância que é capaz de aliviar eficazmente a dor, mas tem um gosto amargo
muito desagradável e causa problemas estomacais.
Por acetilação do ácido salicílico, o químico Felix Hoffman obteve o ácido acetilsalicílico, um
produto com menos efeitos colaterais que começou a ser comercializado em 1900 pela Bayer, sob o
nome de aspirina (Figura 19.2). Vendem-se hoje, aproximadamente, 10 bilhões de comprimidos por
ano.
Embora a aspirina alcançasse uma popularização extraordinária, o seu modo de ação permaneceu
desconhecido por muito tempo. Isso não impediu que fosse utilizada pelos astronautas durante o
primeiro voo à lua da nave Apolo, em 1969.
Dois anos mais tarde, descobriu-se que a ligação entre o ácido acetilsalicílico e algumas enzimas
dificulta a síntese de prostaglandinas, um grupo de substâncias que tornam os nervos mais sensíveis à
dor e são produzidas naturalmente durante as infecções ou na ocasião de ferimentos. Por impedir a
agregação das plaquetas, a aspirina também ajuda a prevenir problemas de coagulação sanguínea e
ataques cardíacos.
-------------FIGURA 19.2: A fórmula da aspirina
COOH
Ácido salicílico
COOH
Ácido acetilsalicílico
OH
O-CO-CH3
--------------
OS FITOTERÁPICOS
Até o momento, os estudos etnobotânicos identificaram mais de 50 mil espécies de plantas medicinais.
Muitas delas representam a única fonte de tratamento acessível para a população mais pobre.
Também são utilizadas por outra parcela da população, adepta das medicinas alternativas e do
consumo de medicamentos fitoterápicos tradicionais, considerados mais suaves e com menos efeitos
colaterais. Nessa corrente de pensamento, o “natural” é percebido como bom, admitindo-se que o
extrato vegetal seria mais eficiente que alguma de suas partes, entre as quais se encontra o princípio
biologicamente ativo.
Os fitoterápicos são produtos relativamente baratos, de venda livre e com poucas oportunidades
de patentes. Contudo, sua eficácia depende das condições de cultivo das plantas, porque a síntese das
substâncias ativas depende do solo, da estação e até do momento do dia. Outras limitações
250
importantes são a falta de conhecimento sobre os efeitos secundários, a ausência de estudos clínicos
em grande escala e a carência de controles de qualidade estritos.
A promoção da medicina tradicional pela WHO (do inglês, World Health Organization), enunciada
na declaração de Alma-Ata (1978) sobre a atenção primária a saúde, marca uma mudança de atitude
em relação aos fitoterápicos. A partir de 1990, o uso dos fitoterápicos aumentou significativamente,
estimando-se que o mercado global seja de US$ 62 bilhões por ano.
Com a publicação de um manual relativo ao controle de qualidade dos materiais extraídos das
plantas medicinais (WHO, 1998) e o estabelecimento de diretrizes gerais sobre metodologias de
pesquisa e avaliação das medicinas tradicionais (WHO, 2000), o mercado dos fitoterápicos entrou em
uma nova etapa.
AS TENDÊNCIAS RECENTES
Em uma linha totalmente diferente perfilam-se as grandes empresas de produtos farmacêuticos. A
descoberta recente de algumas substâncias antitumorais (taxol, vinblastina, vincristina etc.) de origem
vegetal estimulou a procura por princípios ativos em plantas, animais e microrganismos,
especialmente em regiões de grande biodiversidade.
Contudo, as opiniões não são unânimes em relação a possíveis e eventuais descobertas de
moléculas com aplicações terapêuticas. Algumas empresas farmacêuticas consideram que, em quase
duzentos anos de prospecção, já teriam sido descobertos praticamente todos os princípios ativos de
interesse e preferem passar ao desenho de medicamentos por química combinatória e modelos
computacionais. Outras ponderam que é na diversidade dos microrganismos e das plantas que devem
ser procuradas novas moléculas, porque ainda existiriam numerosas fontes de princípios ativos
desconhecidos na flora tão diversa como mal estudada de muitas regiões.
Recentemente, verificaram-se mudanças enormes no campo da pesquisa de produtos naturais,
graças à disponibilidade de tecnologias baseadas na robótica e na automação dos ensaios biológicos.
Em plena revolução cultural, a medicina chinesa obteve um antimalárico, a artemisina ou quinghaosu,
a partir de um extrato vegetal. Contudo, em 2000, sua produção por biologia sintética reduziu o custo
do tratamento a menos de 1 dólar.
A análise das substâncias químicas (alcaloides, terpenos, esteroides, glicosídeos etc.) presentes em
uma planta ou em seu extrato depende de técnicas analíticas automatizadas e de bancos de dados nos
quais armazenar as informações (Chemical Fingerprint). Os estudos quimioinformáticos estabelecem
correlações entre estrutura e atividade através de métodos estatísticos.
Uma vez identificado um princípio ativo, suas características farmacológicas poderão ser
melhoradas mediante transformações químicas, chegando-se a substituir uma molécula natural por
outra sintética equivalente ou ligeiramente modificada. A robotização permite realizar ensaios de
atividade biológica de até 200 mil produtos por dia em sistemas de alto rendimento (HTS, do inglês,
high throughput screening).
A IMPORTÂNCIA DE UM MARCO LEGAL
Nos países que contam com uma biodiversidade importante, discute-se como desenvolver os estudos
de bioprospecção e qual o papel que deveria ser desempenhado pelas instituições, nacionais e
estrangeiras, e pelas empresas farmacêuticas. O risco de biopirataria é real. No século XIX, plantas de
seringueira foram levadas de modo sub-reptício da Amazônia à Malásia. O captopril, um medicamento
derivado do veneno da cobra Bothrops, é hoje importado pelo Brasil em uma versão sintética.
Na Costa Rica, o InBio (Instituto Nacional de Biodiversidade) negociou, a partir de 1991, acordos de
bioprospecção no valor de US$ 1 milhão com a Merck e, mais tarde, com outras empresas
251
http://bteduc.com
farmacêuticas. Esses acordos contribuíram para aumentar a capacitação do país desde vários pontos
de vista: científico, tecnológico e institucional. No entanto, apesar de ter encontrado várias moléculas
promissoras, até o momento nenhuma delas originou um medicamento novo.
Aproximadamente na mesma época teve início um programa de prospecção de agentes bioativos
em terras áridas da América Latina. As numerosas críticas levantadas por estas e outras iniciativas,
como o convênio Novartis-Fundação Bio-Amazônia (2000), mostram as dificuldades em estabelecer
normas de trabalho dentro do marco legal para a proteção da biodiversidade, respeitando a
Convenção da Diversidade Biológica (1992) e os acordos posteriores.
Um exemplo recente refere-se às possíveis aplicações da sabara (Guiera senegalensis), uma planta
do Sahel, tradicionalmente utilizada pelo povo Dogon (Mali). Pesquisadores franceses isolaram um
princípio ativo (Guieranon B) que mostrara atividade anticancerosa nos testes pré-clínicos, registraram
a patente e planejam desenvolver um medicamento. Até o momento não foi contemplada nenhuma
compensação para o povo Dogon.
AS SUBSTÂNCIAS ANTIBIÓTICAS
O CASO DA PENICILINA
Até a Segunda Guerra Mundial, as únicas armas disponíveis no combate às infecções eram umas
poucas vacinas e antitoxinas. No início do século XX fora descoberto, no laboratório de Paul Ehrlich,
um derivado do arsênico para o tratamento da sífilis. Comercializado em 1910 pela empresa Hoechst,
o Salvarsan resultou em um terrível fracasso por duas razões: era tóxico e devia ser injetado, em uma
época em que não existiam seringas. Os primeiros inibidores do crescimento microbiano bemsucedidos foram as “sulfas”, derivados da sulfonamida, no final da década de 1930.
Em 1928, o bacteriologista Alexander Fleming observou a ausência de crescimento bacteriano em
um cultivo de estafilococos contaminado por um fungo. Depois de isolar, cultivar e identificar o fungo
como Penicillium notatum, Fleming conseguiu extrair a penicilina, uma substância antimicrobiana
eficaz quando testada em animais. Esse resultado não teve repercussão alguma na comunidade
científica, e, durante quase 10 anos, Fleming tentou infrutiferamente obter penicilina em estado puro.
Em 1940, nos laboratórios da Universidade de Oxford, H. Florey e E. Chain obtiveram um sal sódico
de penicilina que teve um efeito extraordinário nos primeiros ensaios clínicos (Figura 19.3). Contudo,
a quantidade disponível era pequena para uso terapêutico e, em plena Segunda Guerra Mundial
(1941), Florey e Chain transferiram-se para Peoria (Illinois, Estados Unidos), com o objetivo de iniciar
uma produção em grande escala.
-------------FIGURA 19.3. A fórmula da penicilina
Na fórmula da penicilina pode-se observar um anel -lactâmico e uma cadeia
lateral (R). Algumas bactérias sintetizam -lactamases, enzimas que, ao destruir
o anel correspondente, desativam as penicilinas naturais. Modificando a cadeia
lateral, obtiveram-se as penicilinas semissintéticas, resistentes a essas enzimas.
252
Dois fatores possibilitaram a produção industrial de penicilina. O primeiro, a descoberta em um melão
podre de uma linhagem de Penicillium chrysogenum capaz de produzir 200 vezes mais penicilina que
a linhagem original. O segundo, a substituição do cultivo em garrafas pelo cultivo submerso em
biorreatores, com capacidade entre 40 mil e 200 mil litros, possibilitando um aumento na
produtividade que passou de 50 a 100 mg/l.
A participação da indústria farmacêutica (Pfizer, Merck) foi decisiva para o sucesso do
empreendimento. Em 1944, as forças aliadas dispuseram de suficiente penicilina para o tratamento
dos soldados feridos na invasão da Europa.
OS LIMITES AO USO DE ANTIBIÓTICOS
O sucesso da penicilina estimulou a procura de microrganismos produtores de antibióticos no solo, um
ambiente muito competitivo, onde um antimicrobiano confere uma vantagem seletiva. Assim,
descobriram-se a actinomicina, a neomicina e a estreptomicina, o primeiro antibiótico eficiente para
o tratamento da tuberculose. Um pouco mais tarde entraram no mercado alguns antibióticos de amplo
espectro, como o cloranfenicol, a aureomicina e a terramicina.
Paralelamente, a indústria aperfeiçoou os métodos de extração e de purificação e as pesquisas
sobre formas moleculares alternativas mais eficientes. Alguns antibióticos de origem natural, como a
penicilina e o cloranfenicol, podem ser sintetizados e/ou modificados quimicamente.
A descoberta de outros antibióticos (eritromicina, vancomicina, ampicilina, meticilina,
cefalosporina) possibilitou a cura de doentes e feridos para os quais, meio século atrás, a medicina não
tinha tratamento. Contudo, o tempo mostrou o outro lado da moeda. O uso indiscriminado de
antibióticos, na clínica médica e nas criações de animais, favoreceu a aparição de linhagens resistentes,
que se espalharam rapidamente.
Os antibióticos agem de diversos modos, mas sempre tendo como alvos algumas poucas funções
vitais da célula bacteriana, tais como a síntese da parede celular, dos ácidos nucleicos, das proteínas
ou do ácido fólico. Para cada alvo atingido, aparece uma forma específica de resistência. O anel lactâmico das penicilinas e cefalosporinas, por exemplo, é desativado pelas bactérias produtoras de lactamases. Uma modificação do sítio-alvo no ribossomo acaba com a inibição da síntese proteica pela
estreptomicina. Basta uma alteração da permeabilidade celular para que a tetraciclina seja bombeada
para fora das células. E a transferência horizontal de plasmídeos entre microrganismos pode
disseminar a resistência múltipla às drogas.
De fato, se quisermos manter alguma vantagem sobre as bactérias, nessa corrida sem fim entre a
utilização de antibióticos e a aparição de microrganismos resistentes, novos medicamentos terão que
ser descobertos.
A NECESSIDADE DE INOVAÇÃO
Existem muitas substâncias com propriedades antibióticas, mas poucas são interessantes do ponto de
vista clínico. As principais classes de antibióticos foram descobertas entre 1940 e 1962. Depois de
várias décadas sem grandes inovações nesse campo, foram descobertas as oxazolidinonas, moléculas
bloqueadoras da síntese de proteínas bacterianas (Tabela 19.1).
Em mais de 40 anos, nenhum antibiótico novo contra bactérias Gram negativas chegou ao mercado.
Estima-se que, em 2050, os microrganismos multirresistentes a antibióticos poderiam causar a morte
de 10 milhões de pessoas por ano e perdas econômicas de 100 trilhões de dólares.
253
http://bteduc.com
TABELA 19.1. A linha do tempo de entrada dos antibióticos e antibacterianos no mercado
ANTIBIÓTICOS E ANTIBACTERIANOS
Introdução
Sulfonamidas (Sulfas)
1936
β-lactâmicos
1940
Cloranfenicol, Tetraciclinas
1949
Aminoglicosídeos
1950
Macrolídeos
1952
Quinolonas, estreptograminas
1962
Oxazolidinonas
2000
Lipopeptídeos
2003
Glicilciclinas
2005
Mutilinas
2007
--------------
Devido às dificuldades encontradas em descobrir moléculas novas, e para contornar a aparição de
resistência, a indústria investiu nas chamadas me-too-Drugs, isto é, substâncias iguais com pequenas
modificações químicas. Por outro lado, o vencimento de muitas das patentes possibilitou o
aparecimento das formas genéricas de alguns dos antibióticos mais difundidos, como o Augmentin
(amoxacilina/clavulanato) ou o Cipro (ciproflaxin). Os antibióticos representam 65% do mercado de
medicamentos anti-infecciosos, que inclui também os antivirais e os antifúngicos.
Nos últimos anos, muitas empresas abandonaram o mercado para atender o setor, bem mais
lucrativo, das doenças crônicas. Não obstante, cinco das maiores ainda continuam produzindo
antibióticos: Abbott, Novartis, AstraZeneca, Merck, Pfizer e Johnson & Johnson. Outras firmas novas
ocuparam o espaço vacante, como Basilea Pharmaceutica, que lançou o Ceftobiprole, uma
cefalosporina de quinta geração, eficaz contra os MRSA (do inglês, meticillin-resistent Staphylococcus
aureus) e outros supermicróbios.
Atualmente, existem várias estratégias para o desenvolvimento de novos antibióticos. Sistemas
robotizados para triagem de alto desempenho (HTS, high-throughput screening) podem testar a
atividade inibitória do crescimento de microrganismos em centenas de compostos ou extratos
naturais. Ou pesquisar os peptídeos naturais, produzidos por seres vivos terrestres e marinhos, e
incrementar sua ação antibiótica mediante alterações na estrutura molecular. E, também, investigar a
atividade antimicrobiana de peptídeos sintéticos, construídos por química combinatória.
Procura-se algum alvo, no metabolismo bacteriano, que impeça a infecção. Os novos métodos in
silico possibilitam a triagem de estruturas moleculares relacionadas com uma atividade biológica
determinada, assim como a utilização dos dados genômicos para identificar um alvo medicamentoso.
O desenho de produtos novos estaria ligado à genômica comparativa e funcional dos
microrganismos, uma área capaz de esclarecer a função dos genes e de mostrar quais os alvos que
poderiam ser atacados. Centenas de genomas bacterianos já têm sido sequenciados. Estima-se que os
antibióticos baseados na genômica estejam disponíveis na próxima década.
O caminho está sendo trilhado por algumas pequenas empresas biotecnológicas, apesar da
dificuldade em enfrentar a etapa dos testes clínicos, que demandam inversões estimadas em 150 a
200 milhões de dólares, valores altíssimos que só podem ser cobertos pelas grandes empresas
farmacêuticas.
254
AS PRIMEIRAS MOLÉCULAS TERAPÊUTICAS
O CASO DA INSULINA
A insulina é um mensageiro químico (hormônio), produzido no pâncreas, que regula o metabolismo
do açúcar (glicose) no corpo. (Figura 19.4). A destruição das células  do pâncreas pelo sistema imune
causa uma deficiência na produção de insulina, um aumento no nível de glicose no sangue e sua
excreção na urina.
As complicações resultantes incluem nefropatias, retinopatias, neuropatias e doenças
cardiovasculares. O quadro descreve o diabetes mellitus tipo 1, ou diabetes juvenil, uma doença que
ataca crianças e adolescentes, conhecida há séculos e que hoje pode ser tratada.
Existe outra forma da doença, diabete tipo 2, devida à redução do número de receptores de insulina
nas células musculares e adiposas. O paciente não responde adequadamente à insulina ou não a
produz em quantidade suficiente.
Esta forma costuma se manifestar em pessoas mais velhas, com sobrepeso, inativas e com uma
história familiar. O tratamento envolve dieta e exercícios moderados, além de medicamentos, entre
os quais, eventualmente, a insulina.
Em 1920, F. Banting comprovou o efeito hipoglicemiante de extratos de pâncreas de cachorro e,
logo depois, deu-se início à comercialização de insulina extraída de pâncreas bovinos e porcinos. Essas
insulinas animais salvaram numerosas vidas, mas, por diferir da insulina humana em alguns
aminoácidos, acabavam provocando reações alérgicas.
Do ponto de vista da estrutura química, as diferenças são pequenas. A molécula de insulina humana
consta de 51 aminoácidos, distribuídos em duas cadeias unidas entre si por pontes bissulfeto. A
insulina bovina difere da humana nas posições 8 e 10 da cadeia A e na posição 30 da cadeia B, mas a
insulina porcina só difere na posição 30 da cadeia B (Figura 19.4 A).
O tamanho da molécula de insulina torna a síntese química economicamente inviável (Figura 19.4
A). Contudo, basta substituir um aminoácido (alanina) por outro (treonina) na extremidade de uma
das cadeias da insulina suína para que a sequência molecular seja igual à da insulina humana. Esta
insulina semissintética representou um enorme progresso em relação às insulinas animais.
A tecnologia do DNA recombinante revolucionou a produção de insulina humana, possibilitando a
síntese em microrganismos geneticamente modificados: primeiro em Escherichia coli (Eli Lilly, 1982),
mais tarde em leveduras (Novo, 1987). Por ser um produto mais estável e de melhor qualidade que os
anteriores existentes no mercado, a insulina recombinante representa um dos primeiros e indiscutíveis
sucessos da biotecnologia (Figura 19.4 B).
A SUBSTITUIÇÃO DO PRODUTO NATURAL
Seja por influência de fatores genéticos, ambientais ou culturais, ou também pela existência de
melhores métodos de diagnóstico, milhões de pessoas no mundo inteiro dependem hoje de injeções
regulares de insulina. A incidência da diabete de tipo 2 está aumentando em crianças e adolescentes,
em alguns grupos étnicos que adotaram modos de vida e de alimentação diferente e, também, nas
populações urbanas de migrantes. Em 2025, o número de diabéticos poderia chegar a 300 milhões.
Nos próximos anos, o mercado passará por reformulações, ao expirar algumas patentes e serem
disponibilizadas insulinas não injetáveis, administradas oralmente ou por inalação. Algumas inovações,
como o grau de pureza e o tempo de reação, são de grande importância para a eficácia do tratamento.
255
http://bteduc.com
FIGURA 19.4. A insulina humana
C. A molécula de insulina
Cadeia B
Cadeia A
D. A síntese da insulina
a) A síntese in vivo da insulina nas células pancreáticas
Peptídeo-sinal
Tradução
mRNA de insulina
Remoção do sinal e
união das cadeias A e B
Molécula precursora
Remoção
da cadeia C
Pró-insulina
Insulina
b) A síntese em Escherichia coli (1982)
Um organismo procarionte é incapaz de realizar modificações pós-traducionais. É possível sintetizar pró-insulina para
transformá-la enzimaticamente em insulina, ou sintetizar cada uma das cadeias em separado e associá-las mais tarde, como
ilustrado no esquema.
Síntese da cadeia A
Inserção no plasmídeo
e clonagem em E.coli
Síntese da cadeia B
Extração da cadeia proteica A
União química das
cadeias A e B
Insulina
Inserção no plasmídeo
e clonagem em E.coli
256
Extração da cadeia proteica B
Em 2001, a Novo Nordisk absorveu a área de produção da Biobrás, uma empresa brasileira que durante
mais de 20 anos abasteceu de insulina grande parte do mercado latino-americano. Uma parceria entre
a Fundação Oswaldo Cruz e a empresa Biomm, que conservou a patente para a insulina humana
desenvolvida anteriormente pela Biobrás, poderá colocar a insulina no mercado e distribuí-la no SUS
(Sistema único de Saúde), a partir de 2017.
Atualmente, a produção de insulina humana recombinante se concentra em três grandes
conglomerados farmacêuticos: Eli Lilly, Novo Nordisk e Sanofi.
AS PROTEÍNAS RECOMBINANTES
AS BASES TECNOLÓGICAS
As proteínas de uso terapêutico têm um tamanho 100 vezes maior que o das moléculas presentes nos
medicamentos convencionais. Sua produção seria inviável sem a tecnologia do DNA-recombinante,
porque os métodos extrativos fornecem quantidades mínimas que nunca chegariam a satisfazer a
demanda do mercado.
A rápida incorporação das novas tecnologias nos métodos de produção facilitou, já na década de
1980, a obtenção de insulina e de interferon mediante bactérias e leveduras modificadas
geneticamente, cultivadas em biorreatores. Mais tarde, os microrganismos foram substituídos em
alguns processos por células animais que, apesar de mais difíceis de cultivar, são capazes de levar a
cabo as modificações pós-traducionais indispensáveis.
Com o objetivo de aumentar a produtividade e diminuir os custos, foram construídos plantas e
animais transgênicos (vacas, cabras, ovelhas etc.) para uma centena de proteínas de tipo
recombinante, muitas das quais se encontram já na fase de testes clínicos. O primeiro anticoagulante
extraído do leite de uma cabra transgênica entrou no mercado em 2009 (Atryn, GTC Biotherapeutics).
O medicamento ZMapp (Mapp Biopharmaceuticals), para tratamento de Ebola, reúne 3 anticorpos
monoclonais humanizados, produzidos em folhas de tabaco. Ainda em fase experimental, teve sucesso
quando utilizado emergencialmente para tratar pessoal de saúde contaminado por ocasião da
epidemia que assolou vários países africanos.
A hostilidade da sociedade, em relação às plantas e animais transgênicos, não existe quando se
trata de produzir medicamentos. O princípio de equivalência, contencioso no setor de agroalimentos,
é totalmente aceito em relação aos novos medicamentos. Uma atitude contraditória que incita à
reflexão.
OS PRODUTOS E SUAS UTILIZAÇÕES
Além da insulina recombinante, um dos primeiros produtos obtidos por engenharia genética foi o
interferon (IFN), uma proteína que interfere na replicação de vírus, bactérias e células tumorais.
Existem vários tipos e são utilizados no tratamento de câncer, esclerose múltipla, hepatite B e C.
As proteínas terapêuticas de origem recombinante cumprem diversas funções (Tabela 19.2).
Algumas substituem ou complementam moléculas naturais, tais como hormônios, interferones,
interleucinas, fatores estimuladores do crescimento celular, fatores de coagulação sanguínea,
enzimas. Outras são produtos especialmente desenhados para cumprir uma função medicamentosa:
trombolíticos (tPA ou fator ativador de plasminogênio, estreptoquinase, uroquinase), anticorpos
monoclonais e antígenos bacterianos para vacinas.
Utilizam-se fundamentalmente nas áreas de hematologia, oncologia, diabetes e endocrinologia,
artrite, inflamação, doenças imunes e doenças genéticas lisossômicas (Gaucher, Hurler, Fabry, Pompe).
257
http://bteduc.com
Proximamente estarão vencendo as patentes de várias moléculas: -interferon, insulina humana,
hormônio de crescimento, vacina contra a hepatite B etc. Dado o custo que os novos medicamentos
representam para os sistemas de saúde, cogita-se a produção de genéricos de várias proteínas
terapêuticas.
OS MEDICAMENTOS PERSONALIZADOS
A FARMACOGENÔMICA
O mapeamento do genoma foi o primeiro passo para o desenvolvimento de novos produtos e ações
terapêuticas, um terreno onde se firma a farmacogenômica, uma disciplina nova que visa identificar
as diferenças genéticas associadas a diversas doenças.
Os seres humanos compartilham 99,9% do genoma, de modo que as variações entre eles devem
ser procuradas no 0,1% restante, isto é, entre os 30 milhões de polimorfismos de um único nucleotídeo
ou SNPs (do inglês, single nucleotide polymorphisms). Trata-se de variações de uma base a cada 1.000
nucleotídeos, distribuídas ao longo do genoma. As mais interessantes são as que ocorrem dentro de
um gene ou em uma região reguladora.
Sabendo que dois pontos que se encontram muito próximos no cromossomo tenderão a ser
transmitidos juntos, pode-se dividir o cromossomo em blocos de aproximadamente 10 mil bases
(haplótipos) e caracterizá-los por alguns dos SNPs de cada bloco. Esse era o objetivo do International
HapMap, recentemente concluído e baseado no genoma de pessoas de origem europeia, asiática e
africana.
A importância do mapeamento do genoma foi claramente percebida pelas empresas
farmacêuticas. Antes de se completar, algumas das grandes empresas farmacêuticas (Glaxo Wellcome,
Novartis) começaram a compilar informações sobre genes associados a doenças e a localizar SNPs em
alguns genes previamente selecionados. Essas informações serão complementadas com os dados
obtidos mediante os novos métodos de sequenciamento.
Em 1999, a empresa americana deCode obteve, por 200 milhões de dólares, a exclusividade para
elaborar um gigantesco banco de dados com os registros de saúde, as genealogias e os perfis de DNA
dos habitantes da Islândia. O objetivo principal era o estudo das doenças no contexto históricoevolutivo de uma população homogênea dos 270 mil habitantes da ilha, povoada mil anos atrás pelos
viquingues e com poucos contatos externos posteriores.
O projeto suscitou controvérsia. Um acordo da deCode com a Hoffmann-La Roche visava identificar
os genes responsáveis por várias doenças. No caso de serem obtidos resultados positivos, os
habitantes de Islândia teriam direito, por cinco anos, à gratuidade nos medicamentos desenvolvidos.
Em função dos problemas éticos e legais, levantados oportunamente, a empresa enfrentou algumas
dificuldades na construção de seu banco de dados de 140.000 islandeses.
Apesar de ter descoberto uma dezena de alvos medicamentosos, entre os quais proteínas
envolvidas em doença cardíaca, osteoporose e esquizofrenia, a empresa não obteve resultados
suficientemente rápidos para satisfazer os seus investidores. Em bancarrota, a empresa acabou sendo
vendida, sendo atualmente propriedade da Amgen Decode Genetics. Devido a impedimentos legais,
os dados e as amostras biológicas não puderam ser vendidos e permanecem na Islândia.
A empresa conta hoje com dados parciais de 150 mil pessoas voluntárias e com o sequenciamento
de 10 mil genomas que, associados aos registros de saúde, permitiram inferir quais os riscos de
determinadas variantes gênicas. Contudo, em função de uma condição de sigilo contratual, a empresa
não pode transmitir aos voluntários a informação sobre quais os seus riscos de doença.
Existem outros projetos na mesma linha de investigação, tais como Estonian Genome (Estonia),
Galileo Genomics (Canadá), Oxagen (Inglaterra), Rockefeller University (Micronésia), UK.Bank
258
(Inglaterra). Wellcome Trust Case Control Consortium encontrou 24 associações a 7 doenças (Crohn,
diabetes 1 e 2, doença cardiovascular, hipertensão, artrite reumatoide e transtorno bipolar).
A FARMACOGENÉTICA
Outra disciplina nova é a farmacogenética, que investiga as diferenças genéticas em uma população
que permitem prever diferentes respostas a um medicamento. Receadas por médicos e pacientes, as
reações adversas são temidas pela indústria farmacêutica, que se protege mediante bulas
cuidadosamente redigidas. Nos Estados Unidos, as reações adversas causam 100 mil mortes e 2
milhões de hospitalizações por ano.
Os medicamentos passam por várias fases de estudos clínicos antes de chegar ao mercado.
Contudo, as pessoas não reagem do mesmo modo a um medicamento, que pode ser eficiente para
uns e tóxico para outros.
Aproximadamente 60% dos medicamentos são metabolizados por uma família de enzimas
(citocromo P450). Algumas pessoas os degradam rapidamente, outras não, dependendo de suas
características enzimáticas individuais. Sabendo a qual dos dois grupos pertence um paciente, podese determinar qual a dose do anticoagulante que lhe deverá ser administrada, minimizando os efeitos
adversos.
Associando marcadores genéticos a respostas diferenciais a medicamentos, pode-se dividir a
população em subgrupos e oferecer um tratamento “personalizado”. Atualmente, antes de iniciar um
tratamento de câncer de mama com a herceptina, deve-se realizar um teste genético na paciente para
saber se o medicamento se ajusta, ou não, ao seu caso. Em pacientes HIV positivos, procura-se
determinar a presença do alelo HLA-B*5701 antes de iniciar o tratamento com abacavir, porque os
portadores desse alelo podem ser hipersensíveis ao medicamento. Aprovado pela FDA, o Bidil é um
medicamento para doença cardiovascular, destinado exclusivamente aos pacientes afroamericanos.
O desenvolvimento da farmacogenética dará aos pacientes mais chances de receber a medicação
adequada e na dose certa. Por outro lado, as empresas farmacêuticas poderão escolher seus
voluntários para os testes clínicos no subgrupo apropriado, evitando que um produto novo seja
descartado por falta de resposta adequada. No futuro, em vez de um único produto campeão de
vendas, as empresas farmacêuticas poderão oferecer medicamentos diferentes, cada um dos quais
respondendo às expectativas de um tipo de consumidor.
AS DOENÇAS ÓRFÃS
Uma doença é considerara rara, ou órfã, quando atinge um número pequeno de pessoas. Existem
aproximadamente 7 mil tipos de doenças raras, 80% de origem genética, que afetam 350 milhões de
pessoas. Para a indústria, a menos que receba algumas compensações, qualquer doença que afete
menos de 200 mil pessoas é desinteressante, em termos de pesquisa e desenvolvimento de
medicamentos.
Nos Estados Unidos, o Orphan Drug Act (1983) garante incentivos financeiros às empresas
farmacêuticas que desenvolvam produtos para essas doenças. Também garante que, durante sete
anos, nenhum medicamento equivalente será aprovado, a não ser que se trate de outro que lhe seja
superior. Legislações equivalentes foram promulgadas em outros países (Japão, 1993; Austrália, 1998;
Cingapura, 1999; União Europeia, 2000).
Abre-se assim um campo no qual as empresas de biotecnologia se inserem com sucesso, já que
seus produtos visam doenças de origem genética, envolvendo alterações de receptores celulares,
enzimas e proteínas estruturais. Em 2015, a metade dos medicamentos aprovados correspondia a
doenças órfãs e, atualmente, mais de 560 encontram-se em desenvolvimento.
259
http://bteduc.com
TABELA 19.2. Alguns biofármacos de interesse médico
Fonte: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21, nº8, em Porque Biotecnologia, Cuaderno n049
PRODUTO
INDICACÃO TERAPÊUTICA
FATORES DE COAGULAÇÃO
Fator VIII
Hemofilia A
Fator IX
Hemofilia B
Fator VIIa
Certas formas de hemofilia
ANTICOAGULANTES
Fator ativador de plasminogênio
Infarto de miocárdio
Fator ativador de plasminogênio
Infarto de miocárdio
Hirudina
Trombocitopenia e prevenção de trombose
HORMÔNIOS
Insulina
Diabete
Hormônio de crescimento
Deficiência do hormônio em crianças, acromegalia, síndrome de Turner
Hormônio folículo-estimulante
Infertilidade, anovulação e superovulação
Hormônio paratiróideo
Osteoporose
Gonadotrofina coriônica
Reprodução assistida
Tirotrofina
Detecção /tratamento de câncer de tireoide
Hormônio luteinizante
Algumas formas de infertilidade
Calcitonina
Doença de Paget
Glucagon
Hipoglicemia
FATORES HEMATOPOIÉTICOS
Eritropoietina (EPO)
Anemia
Fator estimulante de colônias de
granulócitos/macrófagos (GM-CSF)
Neutropenia, transplante autólogo de medula
INTERFERON E INTERLEUCINAS
Interferon alfa (IFN alfa)
Hepatite B e C, diferentes tipos de câncer
Interferon beta (IFN beta)
Esclerose múltipla
Interferon gamma (IFN gamma 1b)
Granulomatose crônica
Interleucina 2 (IL-2)
Câncer de rim
VACINAS
Hepatite B
Imunização contra a hepatite B
Hepatite A
Imunização contra a hepatite A
Doença de Lyme
Imunização contra a doença de Lyme
ANTICORPOS MONOCLONAIS RECOMBINANTES
Anti-IgE (recombinante)
Asma
Anti-TNF (recombinante)
Artrite reumatoide
Anti-IL2
Prevenção da rejeição aguda do transplante de rim
OUTROS PRODUTOS RECOMBINANTES
Proteína morfogênica do osso-2
Fratura de tíbia
Galactosidase
Doença de Fabry (deficiência de α-galactosidase)
Iaronidase
Mucopolissacaridose
Proteína C
Sepse severa
β-glucocerebrosidase
Doença de Gaucher
DNAse
Fibrose cística
260
Dada a demora e as dificuldades inerentes ao lançamento de um medicamento novo, as doenças órfãs
representam um filão economicamente interessante, tanto para as pequenas como para as grandes
empresas. Além de receber mais rapidamente a aprovação das autoridades, o grupo-alvo é integrado
com pacientes diagnosticados e não tratados, dispostos a aceitar o uso de um medicamento. Se a
resposta dos pacientes for favorável, as possibilidades de lucro aumentam consideravelmente.
E do ponto de vista dos pacientes? Consideremos o caso de Kalideco, de Vertex Pharmaceuticals,
que rende aproximadamente 300 mil dólares por ano. Trata-se de uma medicação para fibrose cística
muito eficiente para os pacientes com uma mutação em G551D, presente em 4% dos 70 mil casos de
fibrose cística, mas ineficiente em pacientes com a mutação em F508, que afeta 50% dos casos
existentes.
O MERCADO DOS BIOMEDICAMENTOS
A TENDÊNCIA GERAL
Estima-se que o mercado global de produtos biotecnológicos represente pouco mais da décima parte
do mercado farmacêutico mundial. Mais de 300 proteínas recombinantes aprovadas e muitas outras
em testes clínicos indicam um mercado em crescimento, do qual o setor mais dinâmico é o dos
anticorpos monoclonais. Vários desses biofármacos, líderes de vendas, destinam-se aos tratamentos
oncológicos, de artrite e de outras doenças imunes e inflamatórias. (Tabela 19.3). Contudo, existe pelo
menos um que permite a obtenção de imagens, e outro em que a molécula se encontra acoplada a
uma toxina que destrói a célula cancerosa.
Em função dos avanços nos estudos genômicos, muitos outros biofármacos, visando uma centena
de doenças, serão descobertos e patenteados nos próximos anos. Os imensos bancos de dados e as
técnicas de triagem assistidas por computador permitirão diminuir o tempo necessário para os estudos
experimentais. Os principais alvos de uma centena de doenças dos mais de 900 medicamentos que se
encontram em desenvolvimento são o câncer (37%), as doenças infecciosas (vacinas, 15%), doenças
autoimunes (8%) e doenças cardiovasculares (6%).
Do consumo mundial de medicamentos, 88% correspondem a um bloco de regiões formado por
América do Norte (49%), Europa (28%) e Japão (11%). Como a população destes países está
envelhecendo, os principais alvos para o desenvolvimento de medicamentos novos são as doenças
cardiovasculares, o câncer, as alterações respiratórias e as que afetam a qualidade de vida
(osteoporose, artrite, doenças de Parkinson e de Alzheimer).
A maioria das grandes corporações está instalada nos Estados Unidos, onde, além de seu principal
mercado, encontram uma legislação favorável. Na América Latina, o setor está dominado pelas
empresas internacionais e, salvo algumas exceções (Bio Sidus, ProBioMed, Heber Biotec), há poucos
investimentos na pesquisa e no desenvolvimento de novos produtos.
O custo dos medicamentos depende em grande parte dos investimentos da indústria farmacêutica
em pesquisa e desenvolvimento de novos produtos. O tempo e o custo de desenvolvimento de um
medicamento dependem da duração dos testes clínicos e do uso da tecnologia (robótica,
bioinformática, química combinatória, triagem de compostos biológicos em alta velocidade, biochips
e microarrays).
Em 2014, as principais empresas produtoras de proteínas terapêuticas foram Roche Holding (Suiça),
Gilead Sciences (Estados Unidos), Amgen (Estados Unidos), Biogen (Estados Unidos), Celgene (Estados
Unidos), Shire (Reino Unido), CSL (Estados Unidos), Crifols (Espanha), UCB (Bélgica) e Novo Nordisk
(Dinamarca). Estima-se que, em 2020, a metade dos 100 medicamentos mais vendidos seja
biotecnológica.
261
http://bteduc.com
TABELA 19.3. Os medicamentos biológicos mais lucrativos em 2014 (Statista, Phrma)
TRATAMENTO
NOME COMERCIAL
(Nome genérico)
Artrite reumatoide e doenças
relacionadas
HUMIRA (Adalimumab)
Abbott / 12.543
REMICADE (Infliximab)
Johnson & Johnson / 9.240
RITUXAN (Rituximab)
Biogen Idec / 8.678
ENBREL (Etarnecept)
Amgen / 8.538
Diabete
LANTUS (Insulina Humana)
Sanofi / 7.279
Diversos tipos de câncer
AVASTIN (Bevazizumab)
Roche / 6.957
HERCEPTIN (Trastuzumab)
Roche / 6.793
NEULASTA (Pegfilgastrin)
Amgen / 5.857
REVLIMID (lenalidomide)
Celgene / 4.980
GLEEVEC (Imatinib)
Novartis / 4.695
VELCADE (Bortezomibe)
Takeda/J&J / 1766
Pneumonia meningocóccica
PREVNAR (Vacina)
Pfizer/ 4.464
Esclerose múltipla
AVONEX (α e β Interferon)
Biogen Idec / 3.013
REBIF (β interferon)
Merck / 2.414
SOLIRIS (Eculizumab)
Alexion Pharmaceuticals / 2.225
ADVATE (Fator VIII)
Baxter / 2.083
Doenças hematológicas
EMPRESAS / VENDAS (MILHÕES DE DÓLARES)
--------------
Para as grandes empresas farmacêuticas, uma medida do sucesso significa conseguir um medicamento
que alcance um valor de vendas de 1 bilhão de dólares (blockbusters). Em 2014, os maiores lucros
corresponderam aos medicamentos destinados ao tratamento de artrite e doenças relacionadas,
diversos tipos de câncer, diabete, esclerose múltipla e uma vacina antimeningocóccica (Tabela 19.3).
No mesmo ano, dos dez medicamentos melhor colocados, 6 eram anticorpos monoclonais.
AMÉRICA LATINA
Na América Latina existe uma indústria farmacêutica que fabrica medicamentos para consumo interno
e para exportação, destacando-se Argentina, Brasil, Cuba e México. Os principais produtos
biotecnológicos são os anticoagulantes (eritropoietina), os hormônios, os interferones (α e β) e os
fatores estimuladores do crescimento celular.
A Argentina conta com um setor farmacêutico sólido e competitivo. Várias proteínas
recombinantes são produzidas localmente, por três empresas biotecnológicas nacionais (Bio Sidus, PCgen, Zelltek) que vendem seus produtos através de suas empresas farmacêuticas correspondentes
(Sidus, Pablo Cassará) e os exportam para diversos países de Ásia, Oriente e América Latina. Uma
empresa estrangeira, Sanofi, produz vacinas contra a hepatite B.
262
Bio Sidus obteve sucesso com seu tambo farmacéutico, pequenos rebanhos de vacas transgênicas
produtoras de hormônio de crescimento, de insulina ou de leite maternizado, um empreendimento
que irá sem dúvida lhe garantir uma posição de destaque no setor produtivo. O Laboratório Pablo
Cassará é outra empresa tradicional que proximamente irá colocar no mercado uma nova vacina em
duas doses contra a hepatite B e, recentemente, obteve uma enzima recombinante capaz de reparar
as lesões causadas pela exposição aos raios X. Ambas as empresas distribuem seus produtos no Brasil.
Diferente da Argentina, no Brasil as empresas públicas como Farmanguinhos e Instituto Butantã
tem um papel determinante na produção de medicamentos, destacando-se respectivamente na
produção de retrovirais e eritropoietina. Contudo, depende-se ainda da importação de biofármacos,
alguns dos quais são distribuídos pelo Sistema Único de Saúde (eritropoietina, imunoglucerase,
infliximab, interferon, somatotropina recombinante humana). Acordos de transferência de tecnologia,
envolvendo laboratórios nacionais (públicos e privados) e estrangeiros, visam reverter essa
dependência.
México é produtor de medicamentos de alta tecnologia (antibióticos, antiinflamatórios,
tratamentos contra o câncer). A empresa ProBioMed tem desenvolvido com o setor universitário uma
dezena de proteínas recombinantes (anticoagulantes, interferones, fatores estimuladores do
crescimento celular) para uso interno e exportação para outros países de América Central e América
do Sul. Outros laboratórios (Instituto Bioclón, grupo Silanes) têm se destacado na produção de
antitoxinas.
Cuba tem registrados numerosos produtos biotecnológicos, desenvolvidos por Centros de Pesquisa
(Centro de Inmunología Molecular, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Centro Nacional de
Biopreparados e Instituto Finlay) e comercializados por empresas farmacêuticas associadas (Heber
Biotec, CIMAB etc.). Hoje Cuba produz vacinas, moléculas terapêuticas e vários sistemas de
imunodiagnóstico. Esses produtos renderam aproximadamente 900 patentes no exterior e são
exportados para 40 países. Assim como o níquel, o tabaco e o açúcar, a biotecnologia é um dos
principais produtos de exportação da ilha.
263
C A P Í T U L O 20
OS NOVOS TRATAMENTOS
A APROVAÇÃO DE UM TRATAMENTO EXPERIMENTAL
Assim como qualquer medicamento novo, um tratamento passa por várias etapas antes de se instituir
como prática médica. Os estudos pré-clínicos iniciais incluem as pesquisas relativas a lesões ou doença,
em testes laboratoriais e experimentação em animais, desenvolvidas em universidades ou empresas e
financiadas com dinheiro público e/ou privado.
Os resultados são revisados, publicados e repetidos numerosas vezes pela comunidade científica,
até que, em função da quantidade de informação reunida, pareça razoável estender o procedimento
ao ser humano.
O novo tratamento será considerado experimental quando utilize medicamentos, vacinas, testes
diagnósticos, aparelhos ou técnicas que sejam, ainda, objeto de investigações em seres humanos.
Solicita-se então, por meio de um processo formal, uma autorização para dar início aos testes clínicos,
que fornecerão informações sobre a segurança, a eficácia e os efeitos colaterais desse tratamento.
Os ensaios ou testes clínicos seguem desenhos experimentais rigorosos e controles severos para
garantir a confiabilidade dos estudos. Abrangem um número pequeno de participantes, que deverão
assinar previamente um termo de consentimento informado, reconhecendo estarem cientes das
opções de tratamento e dos riscos, assim como de seus direitos e responsabilidades.
Durante os testes clínicos, o tratamento experimental pode se revelar melhor ou pior que os já
existentes. Se os resultados forem satisfatórios, será solicitada a aprovação da agência reguladora
correspondente (FDA, US Food and Drug Administration, nos Estados Unidos; EMA, European Medical
Agency, na União Europeia; Anvisa, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no Brasil; Anmat,
Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, na Argentina).
Uma vez autorizado, o tratamento experimental passa a ser uma prática médica de uso geral, mas
continuará a ser objeto de vigilância para monitorar efeitos negativos que só possam ser detectados
em uma população maior.
BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / NOVOS TRATAMENTOS
OS TRANSPLANTES
OS TRANSPLANTES DE ÓRGÃOS
Em 1899, a primeira tentativa de transplante de rim de um cachorro a outro causou a morte do
receptor, mostrando que o fenômeno de rejeição seria o principal obstáculo aos transplantes de
órgãos. Uma exceção é a córnea, cujo primeiro transplante bem-sucedido realizara-se em 1905.
O primeiro transplante de coração, realizado pelo cirurgião Christian Barnard (África do Sul, 1967),
teve uma repercussão enorme nos meios de comunicação. O mundo inteiro acompanhou os
comunicados médicos emitidos na Cidade do Cabo, até a morte do paciente, 18 dias mais tarde.
Durante vários anos, os problemas de rejeição pareceram intransponíveis.
Na década de 1980, a melhoria das técnicas cirúrgicas, a caracterização dos antígenos dos tecidos
e a descoberta dos primeiros medicamentos imunossupressores (ciclosporinas) revolucionaram os
transplantes, que se tornaram uma intervenção rotineira. Hoje, em centros médicos de todos os países
são substituídos, com sucesso, diversos órgãos e tecidos: coração, rim, fígado, pulmão, intestino, timo,
córneas, medula óssea, pele, pâncreas, válvulas cardíacas, veias etc.
A relação entre o doador e o receptor simplifica, ou dificulta, o procedimento. Não há rejeição no
isotransplante, em que a transferência de um ovário ou de um rim é feita de um indivíduo a seu gêmeo
idêntico; nem no autotransplante, em que se substitui uma artéria coronária por uma safena do
mesmo indivíduo, ou um fragmento de pele danificado por outro. Contudo, o alotransplante, em que
um órgão é transferido a outro indivíduo, requer a supressão do sistema imune, para que o organismo
possa aceitar uma parte “non-self”. Caso contrário, o órgão será rejeitado e, também, o órgão poderá
rejeitar o hospedeiro.
OS XENOTRANSPLANTES
À dificuldade em achar um doador compatível se soma a de encontrar doadores, já que o número de
doações é insuficiente em relação à demanda. Uma alternativa seria o xenotransplante, isto é, a
transferência de um órgão de um animal ao homem.
Devido ao tamanho e a estrutura de seus órgãos, o porco parece o animal mais indicado. Já em
1902, ligara-se o rim de uma paciente a um porco, em uma experiência que resultou fatal. Hoje é
sabido que, devido à presença nas células suínas de um tipo de molécula (-1-3-galactose), ausente
em primatas, a não ser que sejam aplicadas doses maciças de medicamentos imunossupressores,
ocorrerá um fenômeno de rejeição violento.
Em 2002, duas empresas (PPL Therapeutics e Immerge Bio Therapeutics) anunciaram a clonagem
de porcos com o gene da -1-3-galactose desativado, por knockout duplo. Esses porcos poderiam vir
a ser uma fonte de órgãos, para transplantes temporários em seres humanos, eliminando o perigo da
rejeição aguda. Porém, não se evitaria o processo lento de rejeição que seria desencadeado pelas
proteínas suínas. Existe outra objeção aos xenotransplantes, que é o risco de introduzir retrovírus de
outras espécies em seres humanos, com resultados imprevisíveis.
O encapsulado das células animais em uma matriz inerte que as isole e, ao mesmo tempo, deixe
passar os nutrientes e produtos celulares, poderia evitar a rejeição. Este procedimento foi utilizado
recentemente em pacientes diabéticos, que receberam células suínas encapsuladas e passaram a
secretar insulina. E em uma centena de pacientes de câncer, para a secreção de moléculas que
aliviassem a dor.
265
http://bteduc.com
A ENGENHARIA DE TECIDOS
A engenharia de tecidos, uma área que visa a substituição de órgãos e tecidos, ocupa uma interface
existente entre a biologia celular, a medicina, a bioquímica e a bioengenharia.
O cultivo de pele in vitro é utilizado rotineiramente para reparar as lesões causadas por
queimaduras. Um pequeno fragmento de pele, isolado do próprio paciente, é o bastante para, em três
semanas, formar uma superfície 50 vezes maior. Amolda-se a nova pele a uma superfície
biodegradável para evitar que rasgue quando aplicada no paciente. O procedimento se adapta ao
tratamento de queimaduras e de lesões de difícil cicatrização.
A biomimética consegue reparar in vivo o tecido ósseo, utilizando como molde um polímero, para
onde migram e se expandem as células regenerativas internas. A tecnologia se aplica na reparação de
fraturas e de lesões causadas por doença periodontal, assim como a reconstrução da cartilagem das
articulações.
Recentemente, transplantou-se com sucesso uma traqueia, construída com células-tronco do
próprio paciente cultivadas sobre um molde poroso. Talvez seja esse o primeiro passo na construção
in vitro de estruturas tridimensionais análogas aos órgãos.
As estruturas mecânicas com poucos tipos celulares diferentes parecem mais fáceis de construir
que órgãos complexos, como um rim ou um pulmão. Uma técnica promissora contempla a eliminação
das células animais até deixar uma estrutura inerte que seria repovoada com células-tronco. Essa
estrutura também poderia ser obtida por impressão em 3D.
Do ponto de vista experimental, um dos avanços mais importantes é o crescimento in vitro de
organoides a partir de células-tronco. Pode-se, por exemplo, transformar uma célula da pele em iPSC
(do inglês, induced pluripotent stem cells), diferenciá-la em neurônio e cultivar uma estrutura análoga
a um cérebro, comparável ao de um feto com um trimestre de desenvolvimento.
AS TERAPIAS CELULARES
As células-tronco multipotentes são as responsáveis pelo crescimento e a reparação dos tecidos.
Presentes em tecidos adultos, conservam a capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares, em
resposta a estímulos adequados.
As células-tronco hematopoiéticas encontram-se em frequências baixíssimas na medula óssea
(1:10.000 a 1:15.000) e no sangue periférico (1:100.000). Embora não apresentem características
morfológicas que as distingam das outras células, a presença de marcadores moleculares específicos
na membrana permite separá-las e introduzi-las mais tarde na mesma pessoa ou em outra que seja
compatível. O procedimento possibilita a regeneração dos elementos sanguíneos no tratamento de
leucemias e de linfomas, de doenças hereditárias hematológicas e na recuperação dos pacientes que
receberam quimioterapia.
Numerosos bancos de sangue, públicos e privados, oferecem um serviço de armazenamento de
sangue de cordão umbilical que asseguraria a recuperação de células-tronco hematopoiéticas, em caso
de necessidade. Como a probabilidade de uma pessoa vir a precisar de suas próprias células é
baixíssima (1/100.000), a existência de grandes bancos públicos representa a garantia de encontrar
doadores compatíveis. Até o momento, o único produto terapêutico aprovado para o tratamento de
doenças do sistema hematopoiético é o Hemacord, do New York Blood Center.
A presença de células multipotentes em tecidos e órgãos explica o sucesso alcançado em outros
tratamentos. A capacidade regenerativa das células-tronco adultas permite a cicatrização de
queimaduras, a substituição de células da córnea, a regeneração de osso e cartilagem, o tratamento
da artrite e a reparação de fraturas.
266
Terapias experimentais para a regeneração do miocárdio de doentes cardíacos tiveram resultados
promissores. Encontram-se em andamento numerosos ensaios clínicos de terapias com células-tronco
para diabetes, derrame, esclerose amiotrófica lateral e regeneração da medula espinal.
FRAUDES E DESATINOS
No início da década de 2000, a perspectiva de utilizar células-tronco embrionárias nas pesquisas
parecia uma via promissora. Em 2004, um grupo sul-coreano anunciou avanços na direção da clonagem
terapêutica com a obtenção de linhagens de células-tronco embrionárias a partir de um embrião
humano clonado. Essas linhagens poderiam ser utilizadas na regeneração de órgãos lesionados, sem
problemas de rejeição e, eventualmente, depois de ter passado por uma terapia gênica (Figura 20.1).
Quando se descobriu que os resultados eram fraudulentos, e o trabalho realizado em condições
éticas inadmissíveis, a comunidade científica ficou abalada. Afortunadamente, a obtenção das células
iPSC abriu perspectivas menos conflitivas, e as pesquisas foram orientadas em outra direção.
Por outro lado, no fim de 2002, a seita dos raelianos anunciou na mídia o nascimento de vários
bebês humanos clonados. Eles teriam usado a técnica de transferência nuclear para gerar indivíduos
geneticamente idênticos ao doador. Considerando as dificuldades técnicas a falta de provas
apresentadas, concluiu-se que o anúncio não passaria de um golpe publicitário. A clonagem
reprodutiva é considerada um crime contra a humanidade e, por enquanto, restringida ao domínio da
fantasia e da ficção científica.
Outro efeito perverso do entusiasmo com as terapias celulares é a proliferação do turismo médico
atrás das promessas de curas milagrosas. Recentemente, um garoto israelense com ataxiatelangiectasia desenvolveu um tumor cerebral depois de um tratamento com células-tronco fetais
realizado na Rússia. Os estudos com marcadores celulares mostraram que, na origem do tumor,
estavam as células implantadas.
-------------FIGURA 20.1. O princípio da clonagem terapêutica, uma forma de gerar células-tronco embrionárias com a
informação genética do doador do núcleo
Paciente
Célula
saudável
Transferência nuclear
Ovócito
Fusão
celular
Embrião
Ovócito
anucleado
Infusão
Células-tronco
diferenciadas
Células-tronco
recuperadas
267
http://bteduc.com
O desenvolvimento de um tratamento novo é um processo lento que se desenvolve em etapas bem
definidas, com histórias de fracasso e de sucesso. Não existem milagres; do laboratório até a prática
médica, muitos pequenos passos são necessários.
AS IMUNOTERAPIAS
O PROGRESSO
Na segunda metade do século XIX, E. Von Behring e S. Kitasato estabeleceram as bases da
imunoterapia. O soro de um animal infectado com uma toxina diftérica inativada (antitoxina),
administrado em outro animal que fora inoculado previamente com toxina diftérica, provocava uma
reação imune, imediata, passiva e de curta duração. Estabelecidos os princípios da soroterapia, ela
constitui ainda hoje a principal arma de defesa disponível, contra os venenos de cobras e outros
animais peçonhentos.
O progresso da engenharia genética facilitou a produção de proteínas e, consequentemente, de
outras terapias biológicas baseadas na utilização do sistema imune no combate às doenças. No
paciente de câncer, por exemplo, a atividade imunológica é reforçada com moléculas proteicas,
moduladoras da comunicação celular (citoquinas), tais como o -interferon e a interleuquina IL-2. A
produção de elementos sanguíneos, afetada pelos tratamentos quimioterápicos e/ou radioterápicos,
é incrementada por fatores proteicos, como a eritropoietina ou o fator estimulador de colônias.
OS ANTICORPOS MONOCLONAIS
A chegada da tecnologia de hibridomas despertou grandes esperanças, imaginando que os anticorpos
monoclonais cumpririam a função da mítica “bala mágica”, no reconhecimento do alvo. Contudo,
depois do muromonab CD3 (Orthoclone OK3), um anticorpo monoclonal que reduz a resposta imune
para evitar a rejeição aos transplantes, passaram-se vários anos antes que algum outro produto
recebesse a aprovação das agências reguladoras. Frustrando as expectativas, o sucesso chegou antes
no campo das análises clínicas que no âmbito terapêutico.
A razão para o impasse era técnica. Produzidos com células de roedores, os anticorpos monoclonais
eram reconhecidos como non-self pelos seres humanos, o que desencadeava uma resposta imune. A
modificação e, eventualmente, a substituição de partes da molécula murina gerou moléculas
“quiméricas”, “humanizadas” e, mais tarde, “humanas”, em linhagens microbianas ou em animais
transgênicos. Uma vez solucionado esse problema, os anticorpos monoclonais conseguiram entrar no
mercado terapêutico.
Diversos produtos estão disponíveis para a prevenção de infecções virais, bloqueio de IgE (asma
alérgico), inibição de inflamações (artrite reumatoide, doença de Crohn, psoríase), tratamento de
esclerose múltipla e outras doenças autoimunes (lúpus), diversos tipos de câncer etc. Alguns estão
associados a uma substância citotóxica (gemtuzumab ozogamicin – Mylotarg®, de Wyeth), ou a um
radioisótopo (Y-ibritumomab tiuxetan – Zevalin®, de Spectrum Pharmaceuticals).
Aprovado pelo FDA em 2014, o Blyncito (Amgem), primeiro medicamento para o tratamento de
leucemia linfoblástica, está baseado em um produto de especificidade dupla. Trata-se de uma proteína
formada por dois anticorpos monoclonais, um deles reconhece a célula T-killer e o outro a célula-alvo.
Essa estrutura direciona as células T-citotóxicas para as células tumorales, nem sempre reconhecidas
como alvo pelas células de defesa.
Vários anticorpos monoclonais de uso terapêutico são blockbusters. Estima-se que o mercado global
chegue a 125 bilhões de dólares em 2020, com 70 produtos disponíveis. No momento, o principal
entrave à popularização das terapias biológicas é o preço dos produtos. Consideremos o caso do
268
Herceptin® (trastuzumab), que reconhece e inativa o receptor de um fator de crescimento, presente
em algumas células tumorais. Até o momento, é o único anticorpo monoclonal eficiente no combate
aos tumores sólidos, mas o custo anual de um tratamento com Herceptin® varia entre 70 mil e 100 mil
dólares.
O DESAFIO DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA
Nos capilares sanguíneos do cérebro, a densidade das células endoteliais é tão alta que impede a
passagem de 95% das substâncias presentes na circulação. Forma-se uma barreira permeável para os
nutrientes celulares básicos, porém intransponível para moléculas grandes, como as proteínas
medicamentosas.
Contudo, algumas estratégias podem dar resultado. Por exemplo, no caso da esclerose múltipla, a
inflamação crônica permite a passagem dos macrófagos e das células T, que destroem a bainha de
mielina. Essa falha, própria da doença, facilita a entrada do Tysabri (natalizumab), um anticorpo para
o tratamento da doença.
O desafio da barreira hematoencefálica é também uma limitação para o tratamento da doença de
Alzheimer. A empresa Genentech pesquisa uma proteína formada por dois anticorpos; um deles
reconhece o receptor de transferrina, que permitirá transpor a barreira; o outro inibe a enzima
secretase, indispensável para sintetizar a proteína β-amiloide característica da doença. Em diferentes
etapas de desenvolvimento, outras estratégias parecem promissoras no combate à doença de
Parkinson e aos tumores cerebrais.
O CÂNCER
UMA DOENÇA DE ORIGEM GENÉTICA
A palavra câncer designa mais de 100 doenças que afetam uma a cada oito pessoas e se desenvolvem
em qualquer órgão do corpo. As células cancerosas evadem os sinais de controle da divisão celular,
dividindo-se indefinidamente sem chegar a se diferenciar. Com a perda de alguns receptores da
membrana celular, essas células se separam das células vizinhas espalhando-se pelo corpo.
A transformação de uma célula normal em cancerosa depende de dois tipos de genes. Um deles,
reúne genes que codificam proteínas estimuladoras da divisão celular, inibindo a diferenciação e
detendo a apoptose ou “suicídio” celular. Uma mutação que os transforme em oncogenes aumentará
a síntese dessas proteínas, induzindo as células a se multiplicar indefinidamente. O outro é o grupo
dos genes supressores de tumor que, normalmente, estimulam a autodestruição das células que
sofreram mutação. Esses genes encontram-se alterados ou ausentes nas células cancerosas.
Nas células, as mutações geram “antígenos específicos do tumor” como, por exemplo, as proteínas
anormais dos genes ras e p53, a elevação significativa da quantidade da enzima tirosinase ou a
reaparição das proteínas oncofetais (alfafetoproteína e antígeno carcinoembriogênico). Embora
alguns desses “antígenos específicos do tumor” se expressem exclusivamente no tumor de um único
indivíduo, outros aparecem nas células tumorais da maioria dos indivíduos afetados por determinado
tipo de tumor. Em genes que não estão envolvidos diretamente com a formação tumoral, as mutações
podem originar “antígenos associados ao tumor”, que são utilizados como biomarcadores.
As mutações são ocasionadas por fatores ambientais (agentes químicos, radiação, vírus) ou
genéticos (hereditários ou adquiridos ao longo da vida). Quase sempre ocorrem nas células somáticas,
mas também acontecem nas células germinais; algumas são pontuais, outras envolvem rearranjos
cromossômicos; e várias são necessárias para que a célula adquira as características cancerosas.
269
http://bteduc.com
Embora o processo possa levar mais de 50 anos, as mutações herdadas (predisposição) possibilitarão
um desenvolvimento prematuro do câncer (Figura 20.2).
AS TERAPIAS BIOLÓGICAS
As terapias biológicas são complementares aos tratamentos clássicos do câncer, que continuam sendo
a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia. Algumas reforçam a atividade imunológica, através de
mensageiros químicos que estabelecem a comunicação entre as células do sistema imune (interferon, interleuquina IL-2). Outras são administradas a pacientes que passaram por quimioterapias
ou sofrem de imunodeficiência, para estimular a proliferação das células sanguíneas (eritropoietina).
A construção de nanodispositivos, como lipossomos e nanopartículas magnéticas, permitiria dirigir
os medicamentos até as células-alvo. Também em fase experimental, outra possibilidade é o bloqueio
mediante um inibidor da glutaminase (CB-839, de Calithera Biosciences) da síntese de ácido glutâmico,
que a célula cancerosa consome em um ritmo muito maior.
OS VIRUS ONCOLÍTICOS
Outra via complementar para o tratamento do câncer seria o uso de vírus oncolíticos, geneticamente
modificados de modo a infectar e destruir as células cancerosas. Na construção desses vírus, eliminamse os genes que os tornam patogênicos e alteram-se as proteínas de superfície para que reconheçam,
exclusivamente, os receptores de membrana da célula cancerosa.
Aprovado pela FDA em 2015, encontra-se prestes a entrar no mercado o T-Vec (Talimogene
laherparepvec, de Amgen), um vírus herpes simplex 1 modificado para o tratamento de melanoma
que expressa o gene produtor de GMCSF (do inglês, granulocyte-macrophage colony-stimulating fator)
para ativar o sistema imune do paciente.
-------------FIGURA 20.2. A transformação de uma célula normal em cancerosa por mutação (câncer de cólon).
Célula normal
1a mutação (gene APC)
2a mutação (gene ras)
3a mutação (gene DCC)
4a mutação (gene p53)
Célula cancerosa
270
AS VACINAS TERAPÊUTICAS
As vacinas profiláticas são aplicadas em indivíduos saudáveis, para a prevenção de doenças. Dentro
dessa linha, existem vacinas contra alguns dos agentes virais que, sabidamente, estão relacionados
com o desenvolvimento do câncer. Trata-se das vacinas contra o vírus da hepatite B (VHB), associado
ao câncer de fígado, e contra o papilomavírus (VPH), responsável por 70% dos cânceres de útero
(Gardasil®, de Merck; Cevarix®, de GlaxoSmithKline). Essas vacinas cumprem uma ação profilática.
Uma das primeiras terapias complementares do câncer, ainda usada atualmente, é a inoculação
com a vacina BCG (bacilo de Calmette e Guérin), para estimular no paciente uma reação imunológica
de tipo celular, que se estende às células cancerosas.
Diferente das vacinas profiláticas, as vacinas terapêuticas visam o tratamento dos indivíduos que já
estão doentes. O seu objetivo é estimular diretamente a resposta imune do organismo, para que este
possa eliminar as células cancerosas. Um dos principais problemas reside na escolha dos antígenos que
deveriam entrar na composição da vacina, pois se alguns são comuns a vários tipos de células
cancerosas, outros só aparecem em cânceres específicos. A vacina ideal teria que ser eficaz em
qualquer paciente com um determinado tipo de câncer.
-------------FIGURA 20.3. O tratamento com sipuleucel-T (Provenge®).
A. Extração das células dendríticas
Leucoferese (3 horas)
Células dendríticas
B. Incubação das células com Provenge®
2 a 3 dias
Células dendríticas que incorporaram
o antígeno tumoral PAP-GM-CSF
Células dendríticas
+ Provenge® (PAP-GM-CSF)
C. Reinfusão das células modificadas no paciente (3 vezes com 2 semanas de intervalo)
Estímulo da resposta das células-T contra o antígeno tumoral
PAP-GM-CSF e, consequentemente, contra as células cancerosas
271
http://bteduc.com
Uma possibilidade seria a elaboração de vacinas de tumores, com células cancerosas enfraquecidas ou
mortas. Provenientes do mesmo paciente ou de algum outro, essas células expressariam antígenos
associados a um tumor, estimulando a resposta imune.
Outra estratégia seria a aplicação direta de antígenos sintéticos, específicos ou associados ao tumor.
Contudo, as vacinas de antígenos conseguem uma resposta imunológica mais fraca que as vacinas de
vetores (vírus, DNA nu). Um vetor viral modificado poderia infectar exclusivamente as células
cancerosas, levando moléculas moduladoras da resposta imune, ou enzimas capazes de transformar
uma droga inativa em ativa.
Uma variante de vacina terapêutica envolve o estímulo ex vivo das células imunes de modo a que
estas reconheçam o antígeno tumoral (Figura 20.3). Essa estratégia deu origem à primeira vacina
terapêutica (sipuleucel-T ou Provenge®, de Dendreon) contra o câncer de próstata hormonorefratário,
autorizada pelo FDA, nos Estados Unidos, em 2010.
O sipuleucel-T é uma proteína de fusão entre uma enzima específica das células prostáticas cancerosas
(PAP, do inglês prostatic alcaline phosphatase) e um modulador da resposta imune (GM-CSF, do inglês
granulocytes and macrophages colony stimulating factor). O tratamento, que deve ser adaptado a
cada paciente, começa com a extração das células apresentadoras do antígeno do doente, segue com
a incorporação in vitro dos antígenos tumorais e encerra-se com a reinfusão das células modificadas
no paciente.
O empreendimento, no qual a empresa Dendreon investiu 1 bilhão de dólares, não teve os
resultados esperados devido tanto à complexidade tecnológica, como aos custos de um tratamento
personalizado, estimado em 93 mil dólares. Em bancarrota, Dendreon foi comprada por outra
empresa, Valeant. Embora o sipuleuncel não tenha dados os resultados esperados, abriu um caminho
para o tratamento potencial de outras variedades de câncer mediante outras vacinas terapêuticas.
AS TERAPIAS GÊNICAS
TERAPIA SOMÁTICA E GERMINAL
Um dos objetivos das terapias gênicas é a inativação de um gene, inibindo sua expressão ou
interferindo com o produto gênico. Outro, mais complexo, é a substituição de um gene inativo por
uma cópia funcional, que se expresse e sintetize uma proteína ausente.
As terapias gênicas pretendem modificar, exclusivamente, as células somáticas de um indivíduo,
sem que essa modificação seja transmitida à geração seguinte. Assim como em um transplante
transfere-se um órgão ou um tecido, na terapia somática se transfere um gene, e o efeito se limita ao
indivíduo que o recebe (Figura 20.4).
Do mesmo modo que em relação a qualquer tipo de terapia experimental, as objeções giram em
torno da utilização de uma tecnologia ainda imperfeita, envolvendo riscos e da qual se desconhecem
os efeitos a longo prazo. Contudo, o que suscita mais controvérsia é uma eventual transferência de
genes às células germinais, porque as modificações seriam transmitidas à descendência.
Qualquer tentativa de modificação da linhagem germinal permitiria a eugenia, isto é, a seleção
genética à procura de um “genótipo ideal”. Dentro desta ótica, quais os caracteres que seriam
considerados saudáveis? E por quem? A história do século XX, com sua sequela de horrores
(esterilização de deficientes e doentes mentais nos Estados Unidos, persecuções na Alemanha nazista
etc.) mostra que devem ser tomados todos os cuidados para impedir a discriminação genética e a
implantação de uma sociedade arbitrária.
272
OS ALTOS E BAIXOS DE UMA TECNOLOGIA
As primeiras experiências de terapia gênica foram realizadas em 1980, por Martin Cline, nos Estados
Unidos. Além de fracassar, essas tentativas despertaram uma reação contrária unânime: os estudos
experimentais prévios eram insuficientes, e a realização do procedimento não estava autorizada pelo
comitê de ética correspondente. O episódio motivou o estabelecimento de regras estritas para este
tipo de tratamento.
A primeira terapia gênica foi autorizada, em 1990, nos Estados Unidos, para o tratamento de
Imunodeficiência Severa Combinada (SCID, do inglês severe combined immunodeficiency), uma doença
em que a falta da enzima ADA (desaminase de adenosina) bloqueia um caminho metabólico, causando
o acúmulo de uma substância que destrói os linfócitos e, consequentemente, a imunidade do paciente.
As crianças com SCID, ou “crianças-bolha”, sofrem continuamente de infecções e têm uma
expectativa de vida curta. O tratamento habitual contempla a administração de enzimas, mas os
pacientes acabam desenvolvendo alergias aos componentes do produto injetado. Para essas crianças,
a única perspectiva restante é um transplante de medula óssea, com a condição de encontrar um
doador compatível.
A terapia gênica aprovada consistia na extração de linfócitos do sangue, sua modificação genética
in vitro por transferência de um gene normal de ADA e a reinfusão dos linfócitos modificados na
circulação sanguínea do paciente. Aplicou-se o procedimento em uma menina, Ashanti da Silva, e ela
melhorou significativamente.
Porém, como os linfócitos têm um período de vida curto, o procedimento teve que ser repetido
periodicamente, durante dois anos. Algumas células modificadas sobreviviam e produziam ADA, mas
a quantidade era insuficiente e Ashanti nunca pôde prescindir totalmente do tratamento enzimático
complementar. O problema persistiu em estudos posteriores, e nenhum dos pacientes tratados pôde
abandonar o tratamento alternativo com a enzima.
-------------FIGURA 20.4: O princípio da terapia gênica.
Cópias de um gene normal,
previamente clonado em bactérias
Inserção em um vetor
Lipossomo
Vírus
Introdução do gene normal nas células de uma
pessoa portadora de uma doença genética
Pulmão
Músculo
Fígado
Cultivo de células
(medula óssea)
Reimplantação
273
http://bteduc.com
Uma tragédia esfriou o interesse pelas pesquisas nesta área. Em 1999, Jesse Gelsinger, um jovem de
18 anos afetado por uma deficiência de OTC (ornitina transcarbamilase), que se apresentara como
voluntário para um tratamento de terapia gênica na Universidade da Pensilvânia, morreu de uma
reação imunológica adversa ao vetor utilizado, um adenovírus.
Em 2000, na França, a terapia gênica de uma variante de imunodeficiência (SCID-X1) pareceu
alcançar sucesso em nove de dez crianças tratadas. Contudo, outra tragédia aconteceu quando o vetor
viral se inseriu em um lugar não esperado, inativando um gene supressor de tumor. Quatro das
crianças desenvolveram leucemia e uma delas morreu.
Dois anos mais tarde, renovaram-se as esperanças dos pacientes de SCID e seus familiares com o
descobrimento de uma nova técnica de remoção parcial da medula óssea, que permite o
desenvolvimento de células-tronco e sua modificação genética. Em 2002, Salsabil, uma menina
palestina de dois anos de idade recebeu o tratamento em Israel. A terapia restaurou a atividade da
desaminase de adenosina e Salsabil cresce saudável.
Uma terapia que envolve a modificação genética ex vivo de células-tronco é um tratamento
personalizado complexo. Os empreendimentos para doenças de baixa frequência entram na categoria
de tratamentos/medicamentos órfãos, garantindo incentivos financeiros às empresas farmacêuticas.
OS RESULTADOS ALCANÇADOS
Do mesmo modo que em relação a qualquer tipo de terapia experimental, as objeções se centram na
utilização de uma tecnologia ainda imperfeita, que envolve riscos e da qual se desconhecem os efeitos
a longo prazo. As dificuldades são grandes, porque além de transferir um gene a uma determinada
célula de certo tecido, o gene deve funcionar adequadamente e de forma duradoura.
Os dois grandes gargalos ainda são a necessidade de vetores seguros e de procedimentos eficientes.
No entanto, algumas tentativas foram exitosas, como na terapia gênica da amaurose congênita de
Leber, uma doença degenerativa da retina que cega as crianças afetadas. A origem é uma mutação no
gene RPE65, que metaboliza uma forma de vitamina A e condiciona o bom funcionamento de cones e
bastonetes.
O vetor escolhido é o vírus AAV (do inglês, adeno-associated virus), que não estimula uma reação
imune. A terapia começa injetando diretamente na retina o vírus modificado; o gene exógeno penetra
em 15 a 20% das células do epitélio pigmentado da retina, na camada nutritiva situada embaixo das
células visuais. As crianças que receberam o tratamento recuperaram, em diferentes graus, a
sensibilidade à luz.
O olho é um órgão mais fácil de atingir e os oculistas estão familiarizados com os procedimentos,
por isso não é de estranhar que os primeiros tratamentos disponíveis visem doenças ligadas à visão,
como o LentiVector para a degeneração macular, e outros para a doença de Stargardt, a síndrome de
Usher e a rejeição ao transplante de córnea.
Em outras áreas, muitos dos numerosos estudos em vias de realização fracassam nas fases I e II dos
testes clínicos. No entanto, aguardam-se resultados positivos em relação a síndromes genéticas
(hemofilia, talassemia, Huntington, Duchenne, fibrose cística, SCID) e infecções virais (HIV/AIDS), além
de avanços nos estudos sobre doenças cardiovasculares, neurológicas e oncológicas.
O progresso das terapias gênicas levanta também algumas inquietudes em relação ao esporte. Em
1998, uma equipe inteira de ciclistas foi eliminada do Tour de France devido ao uso indevido da
eritropoietina, que aumenta o número de hemácias. O incidente determinou a criação da World AntiDoping Agency.
No momento, existe um produto comercial disponível no mercado, desenvolvido e autorizado na
China, em 2004. A Gendicina® (Shenzhen SiBiono GeneTech). Trata-se de um adenovírus com o gene
274
supressor de tumores p53, utilizado no tratamento do carcinoma de células escamosas de cabeça e
pescoço.
A FIV TRIPARENTAL
As mitocôndrias são as organelas citoplasmáticas responsáveis pela respiração celular e a obtenção de
energia. A transmissão de uma geração a outra ocorre por via materna, de modo que todos os filhos/as
recebem as mitocôndrias de sua mãe. Mutações nesse genoma mitocondrial de 37 genes determinam
várias doenças musculoesqueléticas, metabólicas e neurodegenerativas.
Em 2015, o Reino Unido aprovou uma lei autorizando as clínicas de fertilidade a realizar o
procedimento denominado TP IVF (do inglês, Three Parent In Vitro Fertilization), para substituir as
mitocôndrias com genes associados a doenças.
Durante o procedimento, o núcleo celular de um ovócito da mãe afetada será removido e
transferido ao ovócito anucleado de outra mulher. Com o núcleo materno e o citoplasma e as
mitocôndrias saudáveis de uma doadora, o ovócito reconstruído será fertilizado com o esperma
paterno e reimplantado na mãe. A criança nascerá com o DNA de três pessoas, duas mulheres e um
homem.
AS PROMESSAS DO RNA
Ao longo dos últimos trinta anos descobriram-se vários mecanismos de silenciamento gênico,
baseados nos diversos tipos de RNA e suas propriedades (Figura 20.5). As principais vantagens das
terapias de RNA seriam sua especificidade e o custo relativamente baixo, mas ainda enfrentam
algumas dificuldades para aplicar o tratamento no lugar certo, em uma concentração eficaz que
garanta, também, a durabilidade do efeito.
AS RIBOZIMAS
As ribozimas são moléculas de RNA, com propriedades catalíticas, que cortam outras moléculas de
RNA que apresentem em sua sequência alguns nucleotídeos complementares. Sua descoberta teve
uma importância extraordinária porque deu origem a uma teoria sobre os primórdios da vida, em um
mundo de RNA. Numerosas pesquisas foram desenvolvidas com ribozimas, seja para inativar um gene
ou para tentar inibir a replicação do HIV em células infectadas. Apesar de laboratorialmente bemsucedidos, nenhum produto entrou até agora no mercado.
A TECNOLOGIA ANTI-SENSE
Também trouxe grande expectativa a tecnologia anti-sense, que utiliza o mecanismo de transcrição
para inativar um gene. Normalmente, o RNA transcrito é complementar a um dos filamentos de DNA.
Colocando um promotor no outro filamento, a transcrição ocorrerá em sentido contrário e se formará
um asRNA (anti-sense RNA). A associação dos dois RNAs complementares (sense e anti-sense) forma
uma molécula de dois filamentos que não conseguirá se unir ao ribossomo.
A tecnologia anti-sense tornou possível o desenvolvimento de um medicamento para o tratamento
de infecções oculares por citomegalovírus em pacientes com HIV/AIDS. O formivirsen (Vitravene®, de
Isis Pharmaceuticals) foi autorizado em 1998 pelo FDA, nos Estados Unidos. Outro medicamento antisense que está no mercado, desde 2013, para tratamento de hipercolesterolemia familiar é o Kynamro
(Mipomersen, de Isis Pharmaceuticals) que visa a apoliproteína B, um componente-chave do LDL
colesterol.
A maior dificuldade para desenvolver este tipo de medicamentos reside na dificuldade de chegar
com o medicamento até o alvo correspondente, que os torna pouco eficazes.
275
http://bteduc.com
FIGURA 20.5: As tecnologias de silenciamento gênico.
A. As ribozimas
Ribozima
RNA
RNA clivado
B. O RNA anti-sense
Síntese de proteínas
Inibição da síntese proteica por RNA anti-sense
Transcrição
DNA
Transcrição
Transcrição
mRNA
mRNA
mRNA
Tradução
mRNA
RNA anti-sense
Não há tradução
C. O RNA interferente
Pequeno RNA interferente (siRNA)
mRNA
dsRNA
(RNA de dois filamentos)
Complexo enzimático
Clivagem do mRNA
Fragmentos de RNA
Exterior
276
Membrana
celular
Citoplasma
O RNA INTERFERENTE
O fundamento da tecnologia do RNA interferente (iRNA) é a introdução, na célula, de uma sequência
de RNA complementar a aquela que se deseja silenciar; a molécula de RNA formada, com dois
filamentos, será destruída pela maquinaria celular.
Essa tecnologia constitui uma ferramenta de laboratório poderosa para entender a função dos
genes e a regulação da expressão gênica. As pesquisas laboratoriais têm dado informações
valiosíssimas sobre genômica funcional. Elas abriram novas perspectivas no tratamento de infecções
virais e esclareceram diversos aspectos de várias doenças genéticas e neurológicas. Em relação ao
câncer, elas permitiram a inativação in vitro de moléculas associadas à patologia e à progressão da
doença humana.
Antes de superar a fase experimental e chegar à clínica médica, alguns problemas terão que ser
resolvidos, como a maneira de introduzir o ácido nucleico na célula e controlar seu raio de ação, para
que a interferência seja restringida à molécula-alvo. Apesar do sucesso alcançado nos estudos in vitro,
a tecnologia do iRNA ainda precisa melhorar suas qualidades de eficiência, segurança e confiabilidade.
Considera-se que os tecidos que poderiam ser mais facilmente tratados seriam o olho, a pele, as
membranas mucosas e os tumores locais. Ainda em fase clínica, os testes mais avançados
correspondem ao tratamento da degeneração macular e da infecção pelo vírus respiratório sincicial.
OS miRNAs
Diferente dos RNA antisense e do iRNA, que são sintetizados no laboratório e aplicados no paciente
para diminuir ou impedir a formação de uma proteína associada à doença, os microRNAs são um tipo
de RNA de duplo filamento, sintetizado pela própria célula para regular a expressão gênica. Em muitas
doenças, o paciente sintetiza muito ou pouco miRNA. Alguns produtos encontram-se nas fases iniciais
dos testes clínicos.
A EDIÇÃO GÊNICA
Baseada no fenômeno natural de quebra e reparação do DNA, a tecnologia de edição gênica utiliza o
sistema CRISPR (do inglês, clustered regularly interspaced short palindromic repeats), associado ao
complexo enzimático Cas, para cortar qualquer sequência de DNA no lugar desejado e gerar mutações
de ponto, deleções ou inserções.
As primeiras tentativas planejam a modificação in vitro de células de sangue periférico ou medula
e sua reimplantação no paciente (Intellia Therapeutics, CRISPR Therapeutics). Outras aplicações
contemplam o combate à hepatite C e às contaminações por fungos. Ainda em fase experimental, a
transferência de CRISPR/CAS 9 com um vírus AAV, para impedir a expressão de 3 genes no cérebro de
camundongos (Editas Medicine).
Em 2015, pesquisadores chineses anunciaram ter aplicado a tecnologia CRISPR/Cas9 para modificar
geneticamente embriões não viáveis. No Reino Unido, um grupo de pesquisadores aguarda a
autorização das autoridades para tentar a transferência de genes a embriões supranumerários das
clínicas de fertilização assistida. Esses embriões seriam posteriormente descartados. O tema é
controverso, porque possibilita o design de bebês e abre a porta para a eugenia, afetando a evolução
das futuras gerações de maneira imprevisível.
277
C A P Í T U L O 21
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A biotecnologia é uma área baseada no conhecimento, com uma plataforma tecnológica que gera
múltiplas aplicações em campos muito diversos. Nos capítulos anteriores revisamos seus fundamentos
e seu impacto na sociedade, destacando alguns exemplos de empreendimentos latino-americanos
bem-sucedidos: o desenvolvimento do setor agropecuário e da indústria de medicamentos da
Argentina, a plataforma genômica e a produção de vacinas no Brasil, o alcance da biomineração no
Chile, o sucesso da experiência de Cuba etc.
Apesar das dificuldades econômicas e políticas, essas experiências foram possíveis porque se
cumpriu a condição fundamental de contar com instituições competentes, uma massa crítica de
pesquisadores e pessoal técnico treinado. Em alguns casos, estas existiam previamente, em outros,
elas foram criadas.
O avanço tecnológico é irreversível. Em todos os seus níveis, a educação tem um papel fundamental
na formação dos quadros profissionais e na difusão dos conhecimentos básicos indispensáveis, que
permitirão avaliar adequadamente os benefícios dessa tecnologia e estabelecer as normas para sua
utilização.
As previsões futuras dependem das regulamentações existentes e do projeto político e social de
cada país. No entanto, não se pode descartar a influência das circunstâncias que nos rodeiam:
mudanças climáticas, necessidade de aumentar a produção de alimentos, conflitos bélicos, migrações,
doenças emergentes etc. Também são determinantes os aspectos culturais e a influência da percepção
pública.
Várias são as incógnitas que nos cercam:
o Como estimular o interesse das novas gerações pelo conhecimento científico e tecnológico?
o Como impedir o aumento do distanciamento científico e tecnológico entre os países desenvolvidos
e os países em desenvolvimento?
o Como a privatização da pesquisa científica e tecnológica irá alterar a transparência do processo de
aquisição e divulgação do conhecimento?
o Como passar da pesquisa científica ao desenvolvimento tecnológico de um produto ou de um
serviço?
o Como incubar e agrupar as empresas que estão dando os seus primeiros passos?
CONSIDERAÇÕES FINAIS
o Como manter a comunicação e a transferência de conhecimentos entre os países em
desenvolvimento?
o Como evitar a manipulação da opinião pública?
o Como assegurar que os benefícios das biotecnologias cheguem aos povos mais desfavorecidos?
o Como conciliar a cultura de segurança e o desenvolvimento de novas tecnologias?
o Como lidar com as pesquisas de uso duplo, que podem ser usadas tanto para o bem como para o
mal?
o Como inserir as novas tecnologias em um contexto que garanta o respeito aos princípios éticos
fundamentais de nossa sociedade?
Para estas perguntas não há uma única resposta. Discussão e consenso são fundamentais.
Rio de Janeiro, maio de 2016.
279
BIBLIOGRAFIA
CAPÍTULO 1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
ACCESS EXCELLENCE (THE NATIONAL HEALTH MUSEUM). Biotechnology Timelines. http://www.accessexcellence.com
AGÊNCIA DA FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP) http://www.agencia.fapesp.br/
ALCAMO I.E. DNA Technology: The awesome skill. Dubuque, Wm.C.Brown Publishers, 1996.
ANCIÃES W. , CASSIOLATO J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), 1985.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE EMPRESAS DE BIOTECNOLOGIA (ABRABI). http://www.abrabi.org.br
BIOPLANET. http://www.bioplanet.net
BIOTEACH http://bioteach.ubc.ca
BIOTECHNOLOGY INDUSTRY ORGANIZATION (BIO). http://www.bio.org
BIOTECNOLOGIA, CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO. http://www.biotecnologia.com.br
BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO. http://www.bteduc.bio.br
BISANG R. et al. (Coord.). Las Empresas de Biotecnología en Argentina. Documento de Trabajo N01. Universidad Nacional de General
Sarmiento, Universidad Nacional de Quilmes y Centro de Estudios Urbanos y Regionales, 2005.
BORÉM A , DOS SANTOS F.R. Biotecnologia Simplificada. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, Minas Gerais, 2001.
BUD R. The Uses of Life: a History of Biotechnology. Cambridge, Cambridge University Press, 1993.
BULL A.T. et al. Biotechnologie: Tendances et Perspectives Internationales. Organisation de Coopération et de Développement
Economiques (OCDE), 1982.
CANISIO BINSFELD P. (Org.) Fundamentos Técnicos e o Sistema Nacional de Biossegurança em Biotecnologia.Rio de Janeiro, Editora
Interciência,2015.
CARLSON R.H. Biology is Technology.Cambridge, Harvard University Press, 2010.
CATEDRA DE BIOTECNOLOGIA, BIODIVERSIDAD, DERECHO. http://www.biotech.bioetica.org
CENTRO VIRTUAL DE BIOTECNOLOGIA PARA LAS AMERICAS. http://www.ibt.unam.mx/virtual.cgi
CHECKBIOTECH. http://www.checkbiotech.org
CONSEJO ARGENTINO PARA LA INFORMACIÓN Y EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGÍA (ARGENBIO).
http://www.argenbio.org/h/inicio/index.php
CONSEJO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Y TÉCNICAS (CONICET). Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología.
http://www.conicet.gov.ar
CONSELHO DE INFORMAÇÕES SOBRE BIOTECNOLOGIA (CIB). http://www.cib.org.br
COUNCIL FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION (CBI). http://whybiotech.com
DASILVA E.J. et al. Biotechnology and the developing world. EJB Electronic Journal of Biotechnology 5(1), 15/04/2002.
http://www.ejb.org/content/vol5/issue1/full/1
De ROSNAY J. Biotechnologies et Bio-industrie; Document annexe au rapport "Sciences de la vie et Société" présenté para F.Gros,
F.Jacob et P. Royer à Monsieur le Président de la République.Seuil, La Documentation française, 1979.
DELLACHA J. Interacción en Argentina de los sectores público y privado en el área de Biotecnología. http://www.foarbi.org.ar
DIAZ A. , GOLOMBEK (Org.) ADN: 50 años no es nada. Buenos Aires, Siglo XXI Editores Argentina, 2004.
______ Bio…Qué? Biotecnología, el futuro llegó hace rato. Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2005.
DOELLE H. W. Biotechnology and Human Development in Developing Countries.
www.ejbiotechnology.info/content/vol4/issue3/issues/02/
EIBE (EUROPEAN INITIATIVE FOR BIOTECHNOLOGY EDUCATION). Biotechnology: Past and Present (Unit 17), 1999.
http://www.rdg.ac.uk/NCBE/
ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY (EJB). http://www.ejb.org
FORO ARGENTINO DE BIOTECNOLOGÍA. http://www.foarbi.org.ar
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE GRANADA. Biotecnología y Sociedad.
http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/biotecno.htm
LEMAUX P. What is Biotechnology. http://ucbiotech.org/resources/biotech/slides/biotech.html
MALAJOVICH, M. A. BIOtecnologia; Editora Axcell Books do Brasil, Rio de Janeiro, 2004
_______________ Biotecnología. Universidad Nacional de Quilmes Editorial, Bernal, 2006
NATURE. http://nature.com
OFFICE OF TECHNOLOGY ASSESSMENT (OTA). Commercial Biotechnology, an International Analysis. Washington, US-Congress, 1984
ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT (OECD). Policy Brief: Modern Biotechnology and the OECD,
1999. http://www.oecd.org/ehs/icgb
PETRUSANSKY C. Aspecto económico de la Biotecnología en Argentina: un enfoque actualizado. Trabajo presentado en la XXI
Asamblea Nacional de Graduados en Ciencias Económicas, 2005. http://www.foarbi.org.ar/ppal/documentos.php
PORQUE BIOTECNOLOGIA. http://www.porquebiotecnologia.com.ar
POWNALL I.E. An internacional political economic view of the biotechnology industry. EJB Electronic Journal of Biotechnology 3(2),
15/08/2000. http://www.ejb.org/content/vol3/issue2/full/7
PRENTIS S. Biotechnology: A New Industrial Revolution, New York, George Braziller, Inc., 1984.
RIFKIN J. El siglo de la Biotecnología. Barcelona, 1998, Crítica/Marcombo.
ROSEN M. Biotech industry reaches midpoint in 50-year maturation cycle. Wisconsin Technology Network http://wistechnology.com.
SASSON A. Biotechnologies and Development. Paris, Unesco, 1988.
SASSON A. Biotechnologies in Developing countries: present and future. Paris, Unesco, 2000.
SCIENCE AND DEVELOPMENT NETWORK (SciDevNet) http://www.scidev.net
SCIENCE. http://www.science.org
SISTEMA DE INFORMACION ESPECIALIZADA DE BIOTECNOLOGIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DE COLOMBIA
http://www.colciencias.gov.co/simbiosis/
BIBLIOGRAFIA
51. SUBSECRETARÍA DE LA PEQUEÑA Y MEDIANA EMPRESA Y DESARROLLO NACIONAL. Biotecnología. Serie de Estudios Sectoriales. Enero
2005. http://www.proargentina.gov.ar
52. THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR BIOINDUSTRIES (EUROPA Bio) http://www.europabio.org/
53. VERÁSTEGUI J. (Org.) La Biotecnología en América Latina: Panorama al año 2002. CamBioTec, IDRC; Ottawa, 2003.
http://concytec.gob.pe/cambiotec.
54. WALKER M. Is modifying genes playing God? 18/03/2004. http://www.checkbiotech.org
55. WARNER S. Biotech takes on new industries. The Scientist 19(4):45, 2005.
http://www.the-scientist.com/article/display/15291/.
56. FINARDI F., MACEDO L. e COLLI W. Biotecnologia: ciências em colaboração, 2015.
http://cib.org.br/em-dia-com-a-ciencia/biotecnologia-ciencias-em-colaboracao/
CAPÍTULOS 2, 3, 4, 6 e 7
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
ALMEIDA LIMA U. (Coord.) Biotecnologia Industrial. Processos Fermentativos e Enzimáticos. Vol.3. São Paulo, Editora Edgar Blucher
Ltda., 2001.
AMABIS J.M. , MARTHO G.R. Fundamentos da Biologia Moderna, 3a Edição. São Paulo, Editora Moderna, 2002.
AMERICAN CANCER SOCIETY. Monoclonal antibody therapy. http://www.cancer.org
AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY. http://www.asmusa.org/edusrc/resources.htm
ASSOCIAÇÃO NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA (ANBIO) http://www.anbio.org.br
ASSOCIAÇÃO NACIONAL DE PRODUTORES DE INOCULANTES AGRÍCOLAS (ANPIA). A evolução da produção de inoculantes no Brasil.
http://www.anpii.org.br/site/conteudo/artigo/1,0,33
BALANDRIN, M. F.et al. Natural plant chemicals: Sources of industrial and medicinal materials. Science 228: 1154-60, 1985.
BASIRO D. Immunology, London, The Biochemical Society, 1994.
BERG J.M. et al. Biochemistry, 5th Edition. New York, W.H.Feeman, 2002.
BERNOT A. LÁnalyse des Génomes. 2 Edição. Paris, Dunod, 1999.
BIOTECHNOLOGY AND BIOLOGICAL SCIENCES REASEARCH COUNCIL (BBSRC). http://www.bbsrc.ac.uk
BON E.P.S , PEREIRA Jr. N. Tecnologia Enzimática. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999.
BON E.P.S et al. Enzimas em biotecnologia. Rio de Janeiro, Interciência, 2008.
BORZANI W. et al. (Coord.) Biotecnologia. Engenharia Bioquímica. Vol.3. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 1975.
BOURGAUD F. et al. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science 161: 839-851, 2001.
BROCK T.D., MADIGAN M.T. Biology of Micoorganisms. New Jersey, Ed. Prentice-Hall International, 1988.
BULLOCK J., KRISTIANSEN B. Basic Biotechnology. London, Academic Press, 1987.
CALLEGARI J.P. Feu vert sur les microalgues. Biofutur: 2, 1989.
CALVA-CALVA G. et al. Plantas como biorreactores para la producción de biomoléculas y la remocion de xenobióticos. XXX Aniversario
de Biotecnología y Bioingenieria. Avance y perspectiva n0 21, 2002.
CAMPBELL N. Biology, 4th Edition. California, The Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc., 1996.
CAMPBELL N. , J.Reece. Biology, 8th Edition. California, The Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc., 2008.
CAREY N. The epigenetics revolution. London, Icon Books, 2011.
CENTER FOR GENETICS AND SOCIETY. http://www.genetics-and-society.org
CONTROL DISEASE CENTER (CDC). Summary of recommended biosafety levels for infectious agents. http://www.cdc.gov
COOPER G.M. La Célula. Madrid, Marban Libros S.L., 2002.
DEFURIA D.M. Plant Cell Culture Technology. http://www.agbiotechnet.com/nabc/nabc8/contents_8.asp
DEPALMA A. Cell Culture Scale Up Made Easier. Drug Discovery , Development. http://www.ddmag.com
DODDS J.H E ROBERTS L.W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge, Cambridge University Press, 1995.
EDWARDS D., BATLEY J. Plant bioinformatics: from genome to phenome. Trends in Biotechnology 22:5, 2004.
EMERY N., GERIN P. De la cellule aux cellules en culture: Comment cultiver les cellules animales. Biofutur 184, 1998.
FRANCIS A.L. Pharmers Market, 2000. http://www.the-scientist.com/yr2000/may/profile_000501.html
FRANTZ S. In vivo we trust, 2003. http://www.nature.com/drugdisc/nj/articles/nrd1127.html
GALLAGHER R., PERKEL J.M. Seven cheers for technology. The Scientist 19 (16): 6, 2005.
GELLON G. El Huevo y la Gallina. Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004.
GENOMES ON LINE DATABASE. http://www.genomesonline.org/gold.cgi
GLOBAL KNOWLEDGE CENTER ON CROP BIOTECHNOLOGY. Microbial Fermentation Pocket n0 20. http://www.isaaa.org/kc/
GROSBRAS M.H. La cellule. La Recherche 288, 1996.
HALVORSON H.O. et al. Marine biotechnology opportunities for Latin America. EJB Electronic Journal of Biotechnology Vol. 4 (2), 2003.
http://www.ejbiotechnology.info/content/vol4/issue2/issues/03/index.html
HARVARD´S BIOTECHNOLOGY CLUB. http://www.thebiotechclub.org
HENDERSON M. 50 Genetic Ideas. London, Quercus, 2008.
HERTZBERG R.P. , POPE AJ. High Throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin.Chem.Biol. 4 (4): 445-451,
2000.
KESHAVARZ T. Fermentation (Industrial): Control of Fermentation Conditions. Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology,
1999. http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/readings.html.
KIMBALL´S BIOLOGY PAGES http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/w/welcome.html.
KINDO Y. L’affaire Lyssenko ou la pseudo-science au pouvoir. http://www.contretemps.eu/interventions/affaire-lyssenko-pseudoscience-pouvoir
KIRKHAM S. The omic explosion: a brief history of -ome. The Biochemist, 25(1): 6, 2003. http://www.biochemist.org.
KITCHEN CULTURE. http://www.turbonet.com
LARPENT-GOURGAUD M, SANGLIER J.J. Biotechnologies, Principes et Méthodes. Paris, Doin Editeurs, 1992.
LEHNINGER A.L. Princípios de Bioquímica. São Paulo, Ed.Sarvier, 1989.
LINENBERG R.D. The many dimensions of plant tissue culture research. Tissue culture of woody plants. Care and handling of
micropropagated plants. http://www. aggie-horticulture.tamu.edu/tisscult/ pltissue/pltissue.html
LUCAS R. Monoclonal Antibodies: production and applications. NCBE Newsletter / spring 1989.
MADDEN D. Genes in the wash. NCBE Newsletter / spring 1991.
281
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
_________. In a jam and out of a juice. NCBE Newsletter / winter, 1991.
MADIGAN M.T, et al. Microbiologia de Brock. São Paulo, Pearson Prentice Hall, 2004.
MANTELL S.H. et al. Princípios de biotecnologia em plantas. Sociedade Brasileira de Genética, 1994.
MENEZES T.J.B. Microbiologia Industrial. In Tratado de Microbiologia. Vol.1. São Paulo, Ed. Manole Ltda, 1988.
MICROBIOLOGY ON-LINE. http://www.microbiologyonline.org.uk
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Portaria 1914 do 9 de agosto de 2011.
MISAWA M. Plant Tissue Culture: An alternative for production of useful metabolites. FAO Agricultural Services Bulletin n0 108, 1994.
http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e00.htm#con
MORROW K.J. Seeded by weeds. The Scientist, May 1, 2015.
NATIONAL BIOLOGY INFRASTRUCTURE INFORMATION. http://www. nbii.gov/discipline/botany/index.html.
NATIONAL INSTITUTE OF GENERAL MEDICAL SCIENCES (NIGMS). Inside the Cell .
http://.www.nigms.nih.gov/news/science_ed/life.html
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH). Stem cells: a primer. http://www.nih.gov.
NATIONAL STEM CELL FOUNDATION OF AUSTRALIA http://www.stemcellfoundation.net.au/
NATURE. Tissue Engineering, 2000. http://biotech.nature.com.
NOVO NORDISK. A ação das Enzimas. Dinamarca, Novo Nordisk A/S, 1995.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE (OMS) Manual de segurança biológica no laboratório, terceira edição. Genebra, 2004.
ORIVE G., et al. Controversies over stem cell research. Trends in Biotechnology 21:3, 2003.
PAWAR P. A et al. Fermentation (Industrial): Recovery of metabolites. Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999.
http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/readings.html.
PELCZAR M.J. et al. Microbiologia, Conceitos e Aplicações. São Paulo, MAKRON Books do Brasil, 1997.
PIERIK R.L.M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1990.
PIRES AUGUSTO E.F., SIMÕES OLIVEIRA M. Processos com células animais. En Biotecnologia Industrial. Processos Fermentativos e
enzimáticos. Vol3. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda, 2001.
PITTSBURG TISSUE ENGENEERING INITIATIVE. About Tissue Engeneering. http://www.ptei.org/about_te/index.html
PLAYFAIR J. H.L. Imunology at a glance. 6º Edition. Blackwell Science, 1996.
REVISTA BIOTECNOLOGIA, CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO. http://www.biotecnologia.com.br
RIDLEY M. Genoma. La autobiografía de una especie en 23 cromossomas. Madrid, Grupo Santillana de Ediciones, 2000.
RYAN J. A. Introduction to Animal Cell Culture – Technical Bulletin- Corning,
2008.http://www.level.com.tw/html/ezcatfiles/vipweb20/img/img/20297/intro_animal_cell_culture.pdf
SABLOWSKI R. Stem cells in plantas and animals. Nature Education, 2010.
SANCHEZ S. Ecology and Industrial Microbiology. Microbial diversity – The bright and promising future of microbial manufacturing.
Current Opinion on Microbiology 8: 229-233, 2005.
SCHINDLE l. et al. Understanding the Immune System, 2001. http://newscenter.cancer.gov/sciencebehind/uis/uishome.htm
SCHLOSS P.D., HANDELSMAN J. Biotechnological prospects from metagenomics. Current Opinion on Microbiology 14: 303-310, 2003.
SCHMIDELL W. et al. (Org.). Biotecnologia Industrial. Engenharia Bioquímica. Vol.2. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
SCIENCE IN THE REAL WORLD: MICROBES IN ACTION. http://www.umsl.edu.
SCRIBAN R. Coord. Biotecnologia. São Paulo, Ed. Manole, Ltda, 1985.
SIGMA ALDRICH. Fundamental techniques in cell culture: A Laboratory Handbook, 2003. http://www.sigmaaldrich.com.
SKLOOT R. A vida imortal de Henrietta Lacks.São Paulo, Companhia das Letras, 2011.
STEM CELL WEB FOCUS http://www.nature.com/nature/stemcells.
STREIT W.R., SCHMITZ R.A. Metagenomics, the key to uncultured microbes. Current Opinion on Microbiology 7: 492-498, 2004.
SULSTON J., FERRY G. El hilo común de la humanidad. Madrid, Siglo XXI de España Editores, 2003.
TAUBES G. Antibody Drug Revival. Technology Review, 2002. http://www.technologyreview.com
TEIXEIRA P., VALLE S. Riscos biológicos em laboratório de pesquisa. In Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar, Ed. Fiocruz, Rio
de Janeiro,1996
TEXAS HORTICULTURE PROGRAM. http://aggie-horticulture.tamu.edu
THE BIG PICTURE BOOK OF VIRUS. http://www.tulane.edu.
THE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE. Your world, Biotechnology and you: Tissue Engineering. Vol 7:1, 1997.
THE MICROBIAL WORLD. http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/
THE SCIENTIST MAGAZINE. http://www.the-scientist.com/
THE WELLCOME TRUST. New Biology and Society: beyond the genome. Labnotes 2, 2000.http://www.wellcome.ac.uk
TORRES A.C. et al. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Vol.1. Brasília, Embrapa-CBAB, 1998.
UNIVERSIDADE DO ALGARVE. Algas; aspectos gerais, aplicações tecnológicas e uso comercial. http://www.maralto.com/biologia/algas.shtml
UNIVERSITY OF WISCONSIN-MADISON. Embryonic stem cells. http://www.news.wisc.edu/packages/stemcells/index.html
VIRTUAL MUSEUM OF BACTERIA. http://www.bacteriamuseum.org
WALKER G. Fermentation (Industrial): Media for Industrial Fermentations. Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999.
http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/readings.html
WELCOME TO THE WORLD OF ALGAE. http://www.botany.uwc.ac.za/algae
WYMER P.E.O. Enzymes and their role in Biotechnology. London, The Biochemical Society, London.
YEE J. Turning Somatic cells into Pluripotent Stem cells. Nature Education 3(9): 25
YUSSUF C. Fermentation (Industrial): Basic Considerations. Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, 1999.
http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/readings.html
WEITZ J.S. , S.W.WILHELM An Ocean of Viruses The Scientist 1/07/2013
CAPÍTULOS 5, 8 e 9
1.
2.
3.
http://bteduc.com
ACCESS EXCELLENCE (THE NATIONAL HEALTH MUSEUM). http://www.accessexcellence.com
ABEDON S.T. Bacterial ‘immunity’ against bacteriophagesBacteriophage 1; 2(1): 50–54, 2012.
ALCAMO I.E. DNA Technology: The awesome skill. Dubuque, Wm.C.Brown Publishers, 1996.
282
BIBLIOGRAFIA
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
BARINAGA M. Asilomar, vingt-cinq ans après. La Recherche 332, 2000. http://www.larecherche.fr/idees/livres/asilomar-vingt-cinqans-apres-01-06-2000-86943
BENTO FARAH S. DNA, Segredos e Mistérios. São Paulo, Sarvier Ed., 1997.
____________. DNA, Segredos e Mistérios. São Paulo, Sarvier Ed., 2008.
BIOTECHNOLOGY AUSTRALIA. The tools of gene technology. http://www.biotechnology.au
BIOTECHNOLOGY ONLINE. http://www.biotechnology.gov.au/biotechnologyOnline/index.htm
BORZANI W. et al. (Org.). Biotecnologia Industrial. Fundamentos Vol.1. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
BROCK T.D., MADIGAN M.T. Biology of Micoorganisms. New Jersey, Ed. Prentice-Hall International, 1988.
BRUSH M. Making sense of microchip array data, 2001. http://www.the-scientist.com/yr2001/apr/profile_010430.html
BRYCE C.F.A, PACINI D. The structure and function of nucleic acids. The Biochemical Society, London, 1998.
CAPALBO D. M.F. Novas tecnologias de modificação genética- Importãncia e consequências para os processos regulatórios. ILSI Brasil
Notícias Outubro a dezembro 2014.
CARROLL D , R.A.CHARO. The social oportunities and Challenges of genome editing. Genome Biology 16 :242, 2015.
CONSTANS A. The Microarray in Functional Genomics and Proteomics. The Scientist vol 17:3, 2003. http://www.thescientist.com/yr2003/feb/lcprofile_030210.html
__________. State of the microarray: challenges and concerns with microarrays. The Scientist. http://www.thescientist.com/yr2003/feb/lcprofile_030210.html.
COOPER G.M. La Célula. Madrid, Marban Libros S.L., 2002.
Da SILVEIRA J.M.F.J. et al (Org.). Biotecnologia e Recursos Genéticos; Desafios e Oportunidades para o Brasil. Campinas, Instituto de
Economia/FINEP, 2004.
DE WEERDT S.E. What´s a genome? 2001. http://www.celera.com.
DIXON B. Genetics and the Undestanding of Life. Birmingham, XVIIth International Congress of Genetics, 1993.
DOE HUMAN GENOME PROGRAM. http://www.er.doe.gov/production/oher/hug_top.html
DOLAN DNA LEARNING CENTER / COLD SPRING HARBOR LABORATORY. http:// www.dnalc.org
ENQUIST L.W. Virology in the 21st Century. Microbe, 4:7, 2009
EXPLORATORIUM. http://www.exploratorium.org
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO. Genética molecular e tecnologia do DNA-recombinante.
http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila.php
GENECOPOEIA http://www.genecopoeia.com/CHUA J. A buyer's guide to DNA and RNA prep kits. The Scientist 18:3, 2004.
GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER, University of Utah. http://learn.genetics.utah.edu
GENETICS EDUCATION CENTER, University of Kansas Medical Center. http://www.kumc.edu
GWYNNE P., HEEBNER G. Laboratory instrumentation and robotics, 2000. http://www.sciencemag.org/feature/emarket/benchtop/labl.shl
____________________. Technologies in dna chips and microarrays I, 2001. http://www.sciencemag.org/feature/emarket/benchtop/dnamicro.shl
HOUDEBINE L.M. La transgénèse animale et ses applications. INRA Prod.Anim. 11(1), 81-94, 1998.
HUMAN GENOME PROJECT INFORMATION. http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html
KEASLING J. The promise of synthetic biology. The Bridge 35:18–21, 2005.
KIMBALL´S BIOLOGY PAGES. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/
KORNBERG A. La Hélice de Oro. Buenos Aires, Universidad Nacional de Quilmes Ediciones, 1995.
LARPENT-GOURGAUD M., SANGLIER J.J. Biotechnologies, Principes et Méthodes. Paris, Doin Editeurs, 1992.
LEWIS R. Human Genetics: Concepts and applications. 4th Ed. New York, The Mc Graw Hill Higher Education, 2001.
MADDEN D. Essential genetic engeneering. Newsletter n0 9, NCSB, Reading, 1990.
MELCHER u. Molecular Genetics Techniques, 2001. http://unige.ch/sciences/biochimie/edelstein/geneframe/
MIT TECHNOLOGY REVIEW http://www.technologyreview.com/
MOORE P. Recombinant DNA Technology. London, Biochemical Society, 1994.
NATIONAL CENTRE FOR HUMAN GENOME RESEARCH (NCHGR). http://www.nchgr.nih.gov
NATIONAL HEALTH GENETICS RESEARCH INSTITUTE (nhgri). Fact Sheets. http://www.genome.gov/10000202
NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
NATURE. http://www.nature.com
NEW SCIENTIST. http://www.newscientist.com
NICHOLL D.S.T. An Introduction to Genetic Engeneering. Cambridge, Cambridge University Press, 1994.
NIH OFFICE OF SCIENCE EDUCATION. DNA chips: a genetics lab in the palm of your hand. Snapshots of Science and Medicine Vol.1 N0
2. http://science-education.nih.gov/snapshots
NYMAN M. GMO or not GMO? New techniques put the legislation on trial. Bioscience-explained 8:1, 2014.
OLIVEIRA DOS SANTOS A.J. Animais transgênicos e nocautes: soluções para muitos enigmas. Ciência Hoje, 25: 146, 1999.
PIETSZSCH J. Understanding the RNAissance, 2003. http://nature.com/horizon/rna/background/understanding.html
POWLEDGE T. The Polymerase Chain Reaction, 2002. http://www.faseb.org/opar/bloodsupply/pcr.html
PRENTIS S. Biotechnology: a new industrial revolution. New York, George Braziller, Inc., 1984.
SCHENBERG A.C. Elementos de Engenharia Genética. In Biotecnologia Industrial. Fundamentos. Vol. 1. São Paulo, Editora Edgar
Blucher Ltda, 2001.
SCIENCE DAILY. https://www.sciencedaily.com
SHI, L. DNA Microarray (genome chip), 2002. http://www.gene-chips.com/
SUZUKI D. et al. Introdução à Genética. 4º ed. Rio de Janeiro, Ed. Guanabara-Koogan, 1992.
THE ECONOMIST. The age of the red pen. Aug 22nd, 2015 http://www.economist.com/news/briefing/21661799-it-now-easy-editgenomes-plants-animals-and-humans-age-red-pen
THE WELLCOME TRUST. Unveiling the Human Genome / Wellcome News 4, 2001. http://www.welcome.ac.uk
TOELL A. A CRISPR look at genome editing. Genetic Engineering , Biotechnology News 35:9, 2015.
UNIVERSITY OF ARIZONA. http://www.arizona.edu
UNIVERSITY OF BUFFALO. Genomic Analysis – DNA fingerprinting, 2002. http://www.biology.buffalo.edu/courses/bio129/nov19.html
283
http://bteduc.com
66. UNIVERSITY OF WASHINGTON. Southern Blot. http://www.biology.washington.edu/fingerprint/blot.html
67. WHITE B. Southerns, Northerns, Westerns, Cloning: “Molecular Searching” Techniques. Winding your way through DNA. 1995.
http://www.mit.edu:8001/esgbio/rdna/rdna.html
68. WINSTEAD E. The Evolving Art of Arrays, 2000. http://www.celera.com/genomics/news/articles/09_00/evolving_arrays.cfm
CAPITULOS 10 e 11
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
ACEVEDO F. Present and future of bioleaching in developing countries. EJB - Electronic Journal of Biotechnology Vol.5:2, 2002
http://www.ejb.org/contrnt/vol5/issue2/issues/01/index.html
AGROBIO Colombia. www.agrobio.org
ALGAE BIOMASS ORGANIZATION http://algaebiomass.org/
ALMEIDA LIMA U. et al. (Org.) Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos. Vol. 3. São Paulo, Editora Edgar Blucher
Ed. Ltda, 2001.
ANCIÃES W., CASSIOLATO J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial. CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento
Tecnológico, 1985.
ANDRADE G. Biotecnologia e meio Ambiente. http://www.cib.org.br
ASIAN SCIENTIST MAGAZINE www.asianscientist.com
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CELULOSE E PAPEL (Bracelpa). bracelpa.org.br
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE QUIMICA FINA (ABRIFINA) http://www.abrifina.org.br
ATLAS R.M , T.C.HAZEN. Oil Biodegradation and bioremediation: a tale of the two worst spills in U.S.History. Environ.Sci.Technol.2011,
45, 6709-6715
AVELLAR L.H.N. et al. Geração de eletricidade com biogás de esgoto: uma realidade.
http://www.biotecnologia.com.br/bio29/geração.html
BADGER P.C. Ethanol from cellulose: a general review. In J.Janick , A.Whipkey (Org.) Trends in new crops and new uses. Alexandria,
ASHS Press, 2002.
BANCO MUNDIAL. El problema de la administración de residuos sólidos (SWM). http://bancomundial.org.ar/lfg/gas_expo2005_es.htm
BANCO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO E SOCIAL (BNDES), CENTRO DE GESTÃO E ESTUDOS ESTRATÉGICOS. Bioetanol
de cana-de-açúcar – Energia para o desenvolvimento sustentável. Rio de Janeiro, 2008. http://www.bioetanoldecana.org
BELGO BIOTECH. Bioprocesses. http://www.belgobiotech.be
BHATTACHARYYA B.C. , R.BANERJEE. Environmental biotechnology. New Delhi, Oxford University Press, 2007.
BIODIESLBR.COM. http://www.biodieselbr.com/biodiesel/biodiesel.htm
BIOFUELS BIODIGEST. http:// biofuelsdigest.com
BIOPLANET. http://www.bioplanet.net
BIOPORTAL BIOPOLYMERS AND BIOPLASTICS. http://www.bioportal.gc.ca
BIOTECHNOLOGY AND BIOLOGICAL SCIENCES RESEARCH COUNCIL (BBSRC). http://www.bbsrc.ac.uk
BIOTECHNOLOGY AND INDUSTRY ORGANIZATION (BIO). Industrial and environmental applications. http://www.bio.org
____________________________________________. Guide to Biotechnology, 2008.
BIOTIMES. http://www.biotimes.com
BIO-WISE – BIOTECHNOLOGY AT WORK. http://www.dti.gov.uk/biowise
BON E.P.S., PEREIRA Jr N. Tecnologia Enzimática. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999.
_________. et al. Enzimas em biotecnologia. Rio de Janeiro, Interciência, 2008.
BORÉM A., DOS SANTOS F.R. Biotecnologia Simplificada. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, Minas Gerais, 2001.
BTHEK BIOTECNOLOGIA. http://www.bthek.com.br
BUD R. The Uses of Life: a history of Biotechnology. Cambridge, Cambridge University Press, 1993.
BULL A.T. et al. Biotechnologie: Tendances et perspectives internationales. Organisation de Coopération et de Développement
Economiques (OCDE), 1982.
BULLOCK J., KRISTIANSEN B. Basic Biotechnology. London, Academic Press, 1987.
CAMPOS FERREIRA O. Avaliação preliminar do potencial de produção de etanol da cana de açúcar, 2002.
http://ecen.com/eee34/limites_alcool.htm
CARSON r. Primavera silenciosa.São Paulo, Editora Gaia, 2010
CASES I.,V.de LORENZO. Genetically modified organisms for the environment: stories of success and failure and what we have learned
from them. International Microbiology 8: 213-222 , 2005
CECAE - Disque tecnologia da Universidade de São Paulo. Biodigestores. http://www.cecae.usp.br/Aprotec/respostas/RESP64.htm
CENTRO NACIONAL DE REFERÊNCIA EM BIOMASSA (CENBIO). http://www.cenbio.org.br
CEVALLOS D. De gas invernadero a estrella de mercado. http://www.tierramerica.net/2004/1218/articulo.shtml
CHECKBIOTECH http://www.checkbiotech.org
CHU S. , ARUN MAJUMDAR Opportunities and challenges for a sustainable energy future Nature :488 294-303, 2012
CLAYTON M. Now, bioengineered trees are taking root. 10/03/2005 . http://www.checkbiotech.org
COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL (CETESB). A produção mais limpa no setor sucroalcooleiro. Câmara
Ambiental do Setor Sucroalcooleiro. http://www.cetesb.sp.gov.br
_________________________________________________________. Opções para tratamento de esgotos de pequenas comunidades.
São Paulo, Secretaria do Meio Ambiente, 1990.
CORPORACIÓN NACIONAL DEL COBRE DE CHILE (CODELCO) http://www.codelco.com
COUNCIL OF THE EUROPEAN UNION. A Knowledge-based-Bio-economy in 2030. En route to the knowledge-based bio-economy.
Cologne paper, 2007. http://www.bioeconomy.net
DE ARAÚJO S.C. A inoculação de leguminosas. http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio03/3hp_2.asp
DE LORENZO V. Systems biology approaches to bioremediation Current opinion in Biotechnology 2008 19:579-589
DELLOMONACO C. et al. The path to next generation biofuels: successes and challenges in the era of synthetic biology. Microbial cell
factories 9:3, 2010. http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/3
DEMAIN A.L. The business of biotechnology. Industrial Biotechnology 3:3, 2007
284
BIBLIOGRAFIA
52. DI CIERO L. Biocombustíveis baseados em hidrocarbonetos via fermentação.
http://www.ie.ufrj.br/images/infosucro/Apresentacao_Amyris.pdf
53. DI CIERO L., AMARAL W. Árvores geneticamente modificadas na silvicultura intensiva. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento 29: 9298
54. EL FANTROUSSI S, AGATHOS S.N. Is bioaugmentation a feasible strategy for pollutant removal and site remediation? Current Opinion in
Microbiology 8: 268-275, 2005.
55. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). http://www.epa.gov
56. EUROPABIO. White Biotechnology: Gateway to a more Sustainable Future. http://www.europabio.org
57. EUROPEAN BIOPLASTICS. Bioplastics at a glance. Http://www.european-bioplastics.org
58. EUROPEAN COMISSION. Biofuels in the European Union – A vision for 2030 and beyond. Final report of the Biofuels Research Advisory
Council, Bruxelas, 2006.
59. EUROPEAN FEDERATION OF BIOTECHNOLOGY. Environmental Biotechnology. Task Group on Public Perceptions of Biotechnology;
Briefing Paper 4, 1999.
60. EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY ORGANIZATION (EMBO). White biotechnology. EMBO Reports 4:9, 2003
61. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO). Lucha biológica contra la langosta.
http://www.fao.org/Newsroom/es/focus/2006/1000345/index.html .
62. _____________________________________________________________ Biofuels: prospects, risks and opportunities. Roma, 2008.
http://www. fao.org
63. FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP). http://www.fapesp.br
64. FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO (FAPERJ). http://www.faperj.br
65. FUTURAGENE www.futuragene.com
66. GALPERIN M.Y., A.J.M.BAKER. Environmental Biotechnology. From biofouling to bioremediation: the good, the bad and the vague.
Current Opinion in Microbiology 15:167-169 (2004)
67. GENETIC ENGINEERING , BIOTECHNOLOGY NEWS www.genengnews.com
68. GOLDENBERG J. Support Report for THE BRAZILIAN ENERGY INITIATIVE. WORLD SUMMIT ON SUSTAINABLE GOUVEIA F. Bioetanol
combustível brasileiro: economicamente sustentável? ComCiência- SBPC/Labjor 10/10/2013
69. DEVELOPMENT. Johannesburg, South Africa, 26 August to 4 September 2002.
70. GOLDENBERG J. The Brazilian biofuels industry. Biotechnology for biofuels 1:6, 2008.
71. GRAINGER J., BRINKMAN F. Biotechnology and the environment. Unit 16. European Initiative for Biotechnology Education (EIBE), 2000.
72. GRANT B. Future oil. The Scientist 23:2, 2009
73. GRANT W.D., LONG P.E. Microbiologia ambiental. Zaragoza, Editorial Acribia S A, 1989.
74. GREER C.W. et al. Genomics technologies for environmental science. Environmental Science and Technology 35:17, 2001.
75. GUPTA M.N. , S. RAGHAVA. Relevance of chemistry to white biotechnology. Chemical Central Journal 1:17, 2007
76. HARRIS P. Beginners Guide To Biogas. The University of Adelaide.
http://www.roseworthy.adelaide.edu.au/~pharris/biogas/beginners.html
77. HENRIKSON R. Biofuels from Algae? How ventures can harvest from the third great algae boom, 2009. http://www.spirulina.com
78. HILBERT J.A. Biomasa. La columna del especialista http://www.oni.escuelas.edu.ar/2004/GCBA/444/bio/bio_029.htm
79. HOLDING K. Finding promise in white rot. 05/05/2004 www.biomedcentral.com/news/
80. INDUSTRIAL AND ENVIRONMENTAL BIOTECHNOLOGY: IMPLICATIONS FOR TRADE AND DEVELOPMENT. Informal note by the UNCTAD
secretariat. http://r0.unctad.org/trade_env/docsbio/note.PDF.
81. INDUSTRY AND ENVIRONMENT. http://www.unep.fr/media/review/ie_home.htm
82. INSTITUTO OSWALDO CRUZ Como a Wolbacchia atua no controle da dengue. http://www.fiocruz.br
83. INTERNATIONAL SERVICE FOR THE ACQUISITION OF AGRI-BIOTECH APPLICATIONS (ISAAA). Biotech plants for bioremediation. Pocket
25. http://www.isaaa.org/resources/publications/pocketk/25/default.asp
84. JENKINS T. et al. Plants: Biofactories for a sustainable future? Phil.Trans.R.Soc.A 369:1826-1839, 2011
85. JEREZ GUEVARA C. ¿Has oído hablar de biolixiviación? http://explora.cl/otros/biotec/biolixi.html
86. KEASLING J. Synthetic Biology: from drugs to bugs and fuels http://pt.slideshare.net/mlscf2009/09-ceomeeting-final-talk
87. LARPENT-GOURGAUD M., SANGLIER J.J. Biotechnologies, Principes et Méthodes. Paris, Doin Editeurs, 1992.
88. LEHMAN V. Bioremediation: a solution for polluted soils in the south? Biotechnology and Development Monitor 34, 1998.
89. LEMOS M V F. Novas tecnologias: controle biológico por Bacillus thuringiensis. http://www.biotecnology.com.br/bio/hp_5.htm
90. LEUNG M. Bioremediation: Techniques for cleaning up a mess. Bio Teach Journal 2: 18-22, 2004
91. LEVY M. Tópicos em Química Fina. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda, 1987.
92. LIFE SCIENCE online review on the enzyme market. Http:// www.lifescience-online.com
93. LIPPEL SANTÁNNA JR, G. Produção de enzimas microbianas. In Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos. Vol.3.
São Paulo, Editora Edgar Blucher Ed. Ltda, 2001.
94. LORENZ P., H. ZINKE. White biotechnology: differences in US and EU approaches? Trends in Biotechnology 23:12, 2005.
95. LORENZO V. de. Cleaning up polluted environments: how microbes can help. Research on safety of genetically modified organisms – a
review of results. European Comission. http://ec.europa.eu/research/quality-of-life/gmo/05-bioremediation/05-intro.htm
96. MALAJOVICH, M. A. BIOtecnologia; Editora Axcell Books do Brasil, Rio de Janeiro, 2004
97. _______________ Biotecnología. Universidad Nacional de Quilmes Editorial, Bernal, 2006
98. MARTIN R. At a crossroads, Biofuels seek a new path forward. MIT technological review
99. MINISTÉRIO DO DESENVOLVIMENTO, INDÚSTRIA E COMÉRCIO EXTERIOR. Papel e celulose.
http://www.desenvolvimento.gov.br/arquivo/sdp/proAcao/forCompetitividade/impZonLivComercio/ 12papelceluloseresumo.pdf
100.NATIONAL SCIENCE AND TECHNOLOGY COUNCIL (NSTC). Biotechnology for the 21st century: new horizons. 3. Opportunities in
Environmental Biotechnology. Biotechnology Research Subcommittee, 1995. http://www.nal.usda.gov/bic/bio21/
101.NOTICIASDOT.COM. Argentinos inventan sistema biológico para eliminar pilas usadas. 16/09/2003 http:// www.noticias.dot
102.NOVOZYMES. Discover the magic of enzymes. http://www.novozymes.com
103.NSTC (NATIONAL SCIENCE AND TECHNOLOGY COUNCIL). Biotechnology for the 21st century: new horizons. 3. Opportunities in
Environmental Biotechnology. Biotechnology Research Subcommittee, 1995. http://www.nal.usda.gov/bic/bio21/
104.OECD OBSERVER. Biotechnology and industry: a union of promise, 1/3/1999. http://www.oecdobserver.org
105. OFFICE OF TECHNOLOGY ASSESSMENT, U.S. CONGRESS (OTA). The Chemical Industry. Biotechnology in a global economy. Chapter 7.
Washington, DC: U.S. Government, OTA-BA-494, October 1991 http://wws.princeton.edu/cgibin/byteserv.prl/~ota/disk1/1991/9110/911002.pdf
285
http://bteduc.com
106. ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT (OECD). Industrial Sustainability through Biotechnology, 2001
http://www1.oecd.org/publications/e-book/9301061e.pdf
107. ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT (OECD) / INTERNATIONAL ENERGY AGENCY (IEA). From 1st to 2nd
generation Biofuel Technologies. November 2008.
108. PACKAGING DIGEST STAFF. Bioplastic industry defies economic crisis. Packaging Digest, 11/2/2010.
www.packagingdigest.com/.../448926-Bioplastic_industry_defies_economic_crisis.php
109. PANIAGUA-MICHEL J., A. ROSALES. Marine Bioremediation – A sustainable Biotechnology of Petroleum Hydrocarbons Biodegradation
in Coastal and marine Environments. J. Bioremed Biode 6: 273
110. PARK Y. K. Produção de enzimas industriais de origem animal. In Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos.
Vol.3. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ed. Ltda, 2001.
111. ________. Produção de enzimas industriais de origem vegetal. In Biotecnologia industrial. Processos fermentativos e enzimáticos.
Vol.3. São Paulo, Editora Edgar Blucher Ed.Ltda, 2001.
112. PASTER M. et al. Industrial bioproducts: today and tomorrow. Energetics incorporated. Columbia, Maryland 2003
113. PELLON J.R. La Ingenieria Genética y sus aplicaciones. Zaragoza, Editorial Acribia, S A, 1986.
114. PERALTA-YAHIA P. et al. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature: 488, 320-, 2012
115. PETROBRAS. www.petrobras.com.br
116. PLANT BIOTECHNOLOGY INSTITUTE – NATIONAL RESEARCH COUNCIL CANADÁ (PBI). The environment: Plants and Microrganisms to
control Pollution, 9/1998.
117. PORTAL DO BIODIESEL. http://www.biodiesel.gov.br/
118. PORTAL NOVA CANA.www.novacana.com
119. PRENTIS S. Biotechnology: A New Industrial Revolution. New York, George Braziller, Inc., 1984.
120. PROGRAMA NACIONAL DE USO DO BIODIESEL http://www.biodiesel.gov.br/
121. RAVENSTIJN J. The state of the art on bioplastics, 1/2010. http://beheer.lifetecvision.com/upload/Report/Summary/f8ee23e0-f44642fa-b26c-fa689fa8754b.pdf
122. REDBIO/FAO. Biotechnology: biofuels http://www.redbio.org/newsredbio.asp?id=231
123. REHM H.-J., G. REED. Microorganisms and Bioremediation. In Biotechnology, Vol. 11b (Second Edition) WILEY-VCH Verlag GmbH,
2000. http://www.wiley-vch.de/books/biotech/pdf/v11b_gene.pdf
124. REVISTA EXAME. Uma nova corrida do ouro. 04/06/2004. http://www.cib.org.br
125. REVISTA MINERIA CHILENA. http://www.editec.cl/mchilena/
126. RIESE J. White Biotechnology. McKinsey , Company Press Briefing, 2009
127. ROBERTHENRIKSON BLOG. https://roberthenrikson.wordpress.com/tag/robert-henrikson/
128. ROBINSON D. , N. MEDLOCK. Diamond v. Chakrabarty: a retrospective on 25 years of Biotech patents. Intellectual Property ,
Technology Law Journal 17:10, 2005
129. ROYAL BELGIAN ACADEMY COUNCIL OF APPLIED SCIENCE. Industrial biotechnology and sustainable chemistry. Bruxelles, 1/2004.
http://www.massey.ac.nz/~ychisti/IndBiotech.pdf
130. ROYAL DSM N.V. Industrial (White) Biotechnology DSM. Position document on industrial biotechnology in Europe and the
Netherlands. http://www.europabio.org/positions/DSM-WB.pdf
131. RYAN G , MAYFIELD S.P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature 488: 329-335, 2012
132. SASSON A. Industrial and Environmental Biotechnology: achievements, prospects and perceptions. UNU-IAS Report, 2005.
www.ias.unu.edu
133. SAVIOTTI P.P. Biotechnology. A report for the key technologies expert group appointed by the European Commission, 2005
134. SARROH B. et al. Up-to date insight on industrial enzymes applications and Global market. J.Bioprocess Biotechniq S4: 002, 2012
135. SCHACHTER B. Slimy business-the biotechnology of biofilms. Nature Biotechnology 21 (4) 361-364
136. SCHMIDT M , V. de LORENZO. Synthetic constructs in/for the environment: Maniging the interplay between natural na engineering
Biology. FEBS Letters 586 (2012) 2199-2206
137. SCRAGG A .Biotecnologia Medioambiental. Zaragoza, Editorial Acribia S A, 1999.
138. SOLÉ R. Bioengineering the biosphere? 2015 Ecol. Complex.22 40-49 http://arxiv.org/pdf/1410.8708.pdf
139. . http://www.emagazine.com/magazine/growing-solutions-to-radioactive-waste
140. SOLLOD A, PROULX D. Global Contamination, Wildlife Health and Biotechnology, 1998.
http://biotech.icmb.utexas.edu/pages/wildlife.html
141. SORIMA NETO J. et al. A revolução da cana. Revista Época 24/10/2005 http://revistaepoca.globo.com/Epoca/0,6993,EPT10579253771,00.html
142. STANFORD ENCYCLOPEDIA OF PHILOSOPHY. Environmental Ethics. http://plato.stanford.edu/entries/ethics-environmental
143. SUTHERLAND I. A sticky business; microbial polysaccharides: current products and future trends. Microbiology Today 29(5):70-71,
2002
144. TEIXEIRA ALVES R. Controle biológico de insetos-praga na agropecuária do Brasil. Portal do Agronegócio, 28/08/2009.
http://www.portaldoagronegocio.com.br/conteudo.php?id=31940
145. THE COUNCIL FOR CHEMICAL RESEARCH .Technology Vision 2020: The U.S. Chemical Industry, 2002. http://www.ccrhq.org/vision/.
146. THE ENVIRONMENTAL MAGAZINEONLINE.Bioremediation: a genuine technology to remediate radionuclides from the environment
THE SCIENTIST MAGAZINE. www.the-scientist.com
147. U.S. DEPARTMENT OF ENERGY (DOE). Office of Biological and Environmental Research.
http://www.er.doe.gov/production/ober/ober_top.html
148. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). A Citizen’s Guide to Bioremediation.
http://www.epa.gov/swertio1/products/citguide/biorem.htm
149. U.S. GEOLOGICAL SURVEY. Bioremediation: Nature´s way to a cleaner environment. http://water.usgs.gov/wid/html/bioremed. html
150. UNIÃO DA AGROINDÚSTRIA CANAVIEIRA DE SÃO PAULO. http://www.única.com.br
151. UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA Biolixiviación y biorremediación. http://ar.geocities.com/biolixiviacion
152. UNIVERSITY OF PRINCETON. Bioremediation. http://www.princeton.edu/~chm333/2004/Bioremediation/index.html
153. US DEPARTMENT OF ENERGY. http:// www1eere.energy.gov
154. VAN DER LELIE D. et al. Assessing phytoremediation´s progress in the United States and Europe, ES , T 35, 446-52A, 2001.
155. VANHEMELRIJCK J. Biotechnology: based on life science – the invisible revolution. Cordia Opening Plenary, 2005.
http://www.europabio.org/documents/CORDIA2005speech.pdf
156. VAZOLLER R.F. Microbiologia e Saneamento ambiental. http://www.bdt.org.br/publicações/padct/bio/cap9/3/rosana.html
286
BIBLIOGRAFIA
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
VERSTRAETE W. Energy and the entropy business. Nature 17, Supplement 1999.
VIDALI M. Bioremediation. An overview. Pure Appl.Chem. 73:7, 2001
WALL L. Plantas, bacterias, hongos: mi mujer, el cocinero y su amante. Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2002.
WHITFIELD J. Vital signs, 2001. http://www.nature.com/nsu/010705/010705-2.html
WISEMAN A. Principios de biotecnología. Zaragoza, Editorial Acribia S A, 1986.
WRIGHT O. et al.Building-in biosafety for synthetic biology Microbiogy (2013), 159, 1221-1235
ZENDER A J. B., WULFF H. Business and the environment. Nature Biotechnology vol. 17 Supplement 1999. http://biotech.nature.com
CAPÍTULOS 12, 13 e 14
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
ACTION BIOSCIENCE. Biodiversity. http://www.actionbioscience.org/biodiversity/
ACTION GROUP ON EROSION, TECHNOLOGY AND CONCENTRATION (ETC GROUP) Oligopolio, Inc.Concentración del Poder
Corporativo: 2005. Communiqué; n0 91, 11-12/2005. http://www.etcgroup.org
ADAMS W.M. et al. Biodiversity conservation and the eradication of poverty. Science 306:1146-1149, 2004
AGBIOS. http://www.agbios.com/
AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY IN EUROPE (ABE). http://www.abeurope.info.
AGROBIO – MEXICO. http://www.agrobiomexico.org
AGROLINK. http://www.agrolink.com.br
ALCAMO I.E. DNA Technology: The awesome skill. Dubuque, Wm. C.Brown Publishers, 1996.
ALTMAN A. Biotechnology in the 21st century: the challenges ahead. EJB 2 (2),1999. http://www.ejb.org/content/vol2/issue2/full/1/
ALVES NUNES DODE M., RUMPF R. Produção in vitro de embriões na espécie bovina. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento n0 26,
2002.
AMÂNCIO M.C. Legislação de biossegurança no Brasil. http://www.cib.org.br
AMERICAN ASSOCIATION FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE www.aalas.org
ARGANDOÑA G. Vaccine could save Chile’s salmon industry millions. 26/10/2004. http://www.scidev.net
ASOCIACIÓN ARGENTINA DE PRODUCTORES EN SIEMBRA DIRECTA (AAPRESID). http://www.aapresid.com.ar
ASOCIACIÓN DE SEMILLEROS ARGENTINOS (ASA). http://www.asa.org.ar
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE SEMENTES E MUDAS. http://www.abrasem.com.br
ASSOCIAÇÃO NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA (ANBIO) http://www.anbio.org
ASSOCIATION FRANÇAISE DES BIOTECHNOLOGIES VÉGÉTALES (AFBV). http://www.biotechnologies-vegetales.com/
AZEVEDO V. Aplicações da Biotecnologia na área animal. http://www.cib.org.br
BARROS A.C.S.A. Produção de sementes na América do Sul. Revista Seed News IX:3, 2005
BAILEY R. et al. The Royal Institute of International Affairs - Chatham House On Trial: Agricultural Biotechnology in Africa (2014)
https://www.chathamhouse.org
BIOCERES http://www.bioceres.com.ar/
BIODIVERSITY HERITAGE LIBRARY http://library.si.edu/departments/biodiversity-heritage-library
BIOPLANET. www.bioplanet.net
BIOTECH KNOWLEDGE CENTER. http://www.biotechknowledge.com
BODANESE ZANETTINI M.H. , G. PASQUALI. Plantas transgênicas: uma nova ferramenta para o melhoramento genético vegetal.
Cartilha, UFRGS
BODNAR A. Risk Assessment and Mitigation of AquAdvantage Salmon. ISB News Report Special Issue. Agricultural and environmental
Biotechnology, 10/2010. http://www.aquabounty.com/documents/corporate/Risk_Assessment_Mitigation_of_AAS.PDF
BORÉM A. (Ed). Escape gênico e transgênicos. Viçosa, 2002. Http://www.cib.org.br
_________. Cultivares e genes. Biotecnologia, Ciência , Desenvolvimento 32 - janeiro-junho, 2004.
________ . Biotecnologia e meio ambiente. Viçosa, Editora Folha de Viçosa, 2005.
BORLAUG N. Is there enough food? 2000. http://www.whybiotech.com
BRADFORD K.J. Methods to maintain genetic purity of stocks. Publication 8189. University of California, Division of Agriculture and
Natural Resources, 2006. http://anrcatalog.ucdavis.edu
BRAUN R., AMMANN K. Biodiversity: the impact of biotechnology. Encyclopedia of Life support systems. Oxford, EOLSS Publishers,
2002. http://www.colby.edu/biology/BI131/Lab/Unesco-Biodiv-Biotech.pdf
BREINING g. In the race to save species GMOs are coming to nature
BROOKLYN BOTANICAL GARDEN. http://www.bbg.org
BURACHIK M. Seguridad de los Organismos Genéticamente Modificados: el caso de la soja GM en la Argentina. Soja y Nutrición, Serie
de Informes Especiales, ILSI Argentina, Vol.1, 2004
BURACHIK M. Sistema Regulatório argentino – Panorama Internacional. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Instituto Nacional
de Tecnología Agropecuaria, Buenos Aires, 2005. http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro/39_IX_2.pdf
BUTZEN, S. Preserving Bt effectiveness by managing insect resistance. Crop insights 11(20), 2002.
http://www.pioneer.com/usa/agronomy/corn/1120.htm
CABINET OFFICE. Weighing up the costs and benefices of GM crops, 2003. http://www.strategy.gov.uk
CAMPBELL,N.A. Biology. 8th Ed. San Francisco, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 2008.
CANOLA COUNCIL OF CANADA http://www.canola-council.org
CAPALBO D. et al. A Study of Stakeholder Views to Shape a Communication Strategy for GMO in Brazil. Front. Bioeng. Biotechnol.
3:179, 2015
CARPENTER J.E, GIANESSI L.P. Agriculturalbiotechnology: updated benefit estimates, National Center for Food and Agricultural Policy,
2001. http://www.ncfap.org
CASALE M.G. Aplicaciones de la soja en la tecnología alimentaria. Soja y Nutrición, Serie de Informes Especiales, ILSI Argentina, Vol 1,
2004
CASALS CIRER J. Biotecnología por la senda correcta. Bioplanet www.bioplanet.net
CAVITTE P. Une histoire de l'agriculture française. Bulletin de l'Association des Professeurs d'Histoire et de Géographie de
l'Enseignement Agricole Public. 2000-2001. http://www.educagri.fr/pedago/supports/histagri/sommaire.htm
287
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
http://bteduc.com
CECCATTI J. Resisting insects: shifting strategies in chemical control. Endeavour 28 (1), 2004
CENTRO DE INFORMAÇÃO EM SAÚDE SILVESTRE http://www.biodiversidade.ciss.fiocruz.br/
CENTER FOR ENVIRONMENTAL RISK ASSESSMENT (CERA) http://www.cera-gmc.org/
CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA. http://www.cipotato.org
CENTRO PARA AVALIAÇÃO DE RISCO AMBIENTAL (CERA). http://www.cera-gmc.org
CHANDLER S. Genetically Engineered Ornamental Plants: regulatory hurdles to commercialization ISB News Report, 08/2013
http://www.isb.vt.edu/news/2013/Aug/Chandler.pdf
CHEVASSUS-AU-LOUIS, N. La bataille non terminée de terminator. La Recherche 327:80-81, 2000.
CHILEBIO. www.chilebio.cl
COMISSÃO TÉCNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA (CTNBIO) http://bch.ctnbio.gov.br/
CONNER A.J. et al. The release of genetically modified crops into the environment. Part.II. Overview of ecological risk assessment. The
Plant Journal 33: 19-46, 2003.
CONSEJO ARGENTINO PARA LA INFORMACIÓN Y EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGÍA (ARGENBIO).
http://www.argenbio.org/h/inicio/index.php
CONSELHO DE INFORMAÇÕES SOBRE BIOTECNOLOGIA (CIB). http:www.cib.org.br
CONSULTATIVE GROUP ON INTERNATIONAL AGRICULTURAL RESEARCH (CGIAR). http://www.cgiar.org
CONVENTION ON BIOLOGICAL DIVERSITY. http://www.cbd.int/
COOK, J.R. Science-based risk assessment for the approval and use of plants in agricultural and other environments. In: Agricultural
biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology. Consultation group on international agricultural
research, 1999. http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/contents.htm
CORPORATE WATCH. GM crops industry overview, 2003 http://www.corporatewatch.org
COUNCIL FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION (CBI) Biotecnología agrícola en México. http://whybiotech.com/mexico.asp
COUNCIL FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Golden Rice: a background, 2001. http://www.whybiotech.com
CUBERO J.I. Panorâmica de la agricultura a comienzos del siglo XXI. En: La agricultura del siglo XX. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa
(1993).
DERBYSHIRE S.W.G. Time to abandon the three Rs. The Scientist 20:2 pag 23 http://www.the-scientist.com/2006/2/1/23/1/
DHLAMINI Z. The role of non-GM biotechnology in developing world agriculture. 12/02/2006 SciDevNet http://www.scidev.net
DIAMANTE A., IZQUIERDO J. Manejo y gestión de la Biotecnología Agrícola apropiada para pequeños productores: Estudio de caso:
Argentina. Buenos Aires, 2004. http://www.redbio.org
DIAMOND, J. Evolution, consequences and future of plant and animal domestication. Nature 418: 700-707, 2002
DIAZ A. Estudios sobre el sector agroalimentario. http://www.mecon.gov.ar/
DICKSON D. The case for science-based agriculture. 08/02/2006. SciDevNet. http://www.scidev.net
DUPONTPIONEER www.pioneersementes.com.br
ECHENIQUE V. et al (Ed) Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Buenos Aires, 2005
EGGEN A. The development and application of genomic selection as a new breeding paradigma. Animal Frontiers, 2:1, 2012.
ELLSTRAND N.C. Genetic Engineering and pollen flow. Publication 8182. University of California, Division of Agriculture and Natural
Resources, 2006. Http://anrcatalog.ucdavis.edu
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA (EMBRAPA) http://www.embrapa.br
ENVIRONMENTAL MEDIA SERVICES. http://www.ems.org
ESQUINAS-ALCAZAR J.T. La diversidad genética como material básico para el desarrollo agrícola. En: La agricultura del siglo XXI.
Madrid, Ediciones Mundi-Prensa (1993).
EUROPABIO. http://www.europabio.org
EVENSON R.E. From the green revolution to the gene revolution. In Economic and social issues in agricultural biotechnology. CAB
International, 2002.
FEDERATION OF ANIMAL SCIENCE SOCIETIES (FASS). http://www.fass.org/index.asp
FLETCHER G.L. et al. Transgenic salmon for culture and consumption. http://www-heb.pac.dfompo.gc.ca/congress/2002/Biochem/fletcher.pdf.
FLORIGENE. The world´s first molecular breeder. http://www.florigene.com.au
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. World agriculture: towards 2015 / 2030. Roma, FAO, 2003.
http://www.fao.org
FOOD STANDARDS AGENCY. www.food.gov.uk
FRENCH-CONSTANT R. et al. La genética y genômica de la resistência a insecticidas Revista Boletín Biológica 29-año 7- 2013
FUNDACIÓN ANTAMA fundacion-antama.org
FREW E. et al. The politics of plants. Food Sec.:1, 2009
FULTON M., GIANNAKAS K. Agricultural Biotechnology and industry structure. AgBioForum 4(2):137-151, 2001
GARCIA M.A. , ALTIERI M.A. Transgenic crops: implications for biodiversity and sustainable agriculture. Bulletin of Science, Technology
, Society 25:4, 2005
GAY, J.P. Le maïs. La Recherche 18 (187): 456-466
GENETIC EXPERT NEWS SERVICE (GENeS). geneticexperts.org
GENETIC LITERACY PROJECT https://www.geneticliteracyproject.org
GENETICALLY ENGINEERED ORGANISMS: PUBLIC ISSUES EDUCATION PROJECT.
http://www.geo-pie.cornell.edu/educators/educators.html
GENPEACE genpeace.blogspot.com
GEPTS P. Where did agriculture start? PLB143 - Lecture 10, 2002. http://agronomy.ucdavis.edu/gepts/pb143/lec10/pb143l10.htm
GM WATCH. http://gmwatch.org
GMO-COMPASS. http://www.gmo-compass.org/eng/home/
GMO SAFETY http://gmo-safety.eu
GOULD C. GM crops are compatible with sustainable agriculture. 08/02/2006. SciDevNet. http://www.scidev.net
GRAND VIEW RESEARCH http://www.grandviewresearch.com/press-release/global-commercial-seeds-market
GREENPEACE http://www.greenpeace.org
GROUPEMENT NATIONAL INTERPROFESSIONNEL DES SEMENCES ET PLANTS (GNIS) www.gnis.fr
GROUPEMENT NATIONAL INTERPROFESSIONNEL DES SEMENCES ET DES PLANTES (GNIS). Les OGM, une ambition pour lÉurope. Fiche
4: 6(1), 2003. http://www.gnis.fr
288
BIBLIOGRAFIA
108. HAILS, R.S. Assessing the risks associated with new agricultural practices. Nature 418: 685-687, 2002.
109. HARLANDER, S.K. The evolution of modern agriculture and its future with biotechnology. Journal of the American College of Nutrition,
21 (3): 161S - 165 S, 2002.
110. HERMAN R.A. , w.d.Price Unintended Compositional Changes in Genetically Modified (GM) Crops: 20 years of Research. J. Agric.Food
Chem (2013) 61:11695-11701
111. http://ensia.com/features/in-the-race-to-save-species-gmos-are-coming-to-nature/
112. LOMBARDO L. Genetic use restriction technologies. Good for seed companies and bad for farmers? Plant Biotechnology Journal 12 pp
995-1005, 2014.
113. HERNANDEZ-CUEVAS, C. Biotecnología y Emprendedorazgo. Bioplanet www.bioplanet.net
114. HUANG J. , Q.Wang. Agricultural Biotechnology Development and Policy in China. AGbIO Forum 5(4):122-135, 2002.
115. ILLINOIS FARM BUREAU. http://www.ilfb.org
116. INFOGM http://www.infogm.org/
117. INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRICOLE (INRA). http://www.inra.org.fr
118. INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA DE LAS PLANTAS (IBP). www.cuba.cu/ciencia/ibp/index.html
119. INSTITUTO DE DEFESA DO CONSUMIDOR (IDEC) http://www.idec.org.br
120. INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL MAMIRAUÁ. http://www.mamiraua.org.br
121. INSTITUTO NACIONAL DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA (INTA). http://www.inta.gov.ar
122. INTERNATIONAL FORUM ON GLOBALIZATION. Fast facts on the corporate consolidation of industrial agriculture. http://www.ifg.org
123. INTERNATIONAL LIFE SCIENCES INSTITUTE (ILSI Argentina). http://argentina.ilsi.org/
124. INTERNATIONAL LIFE SCIENCES INSTITUTE (ILSI Brasil). http://brasil.ilsi.org/
125. INTERNATIONAL SERVICE FOR THE AQUISITION OF OF AGRI-BIOTECH APPLICATIONS (ISAAA) www.isaaa.org
126. ITURBE-ORMAETXE I. et al. Wolbachia and the biological control of mosquito-borne disease. EMBO reports 12, 508–518, 2011
127. IZQUIERDO J., DE LA RIVA G. Plant biotechnology and Food security in Latin America and the Caribbean EJB Electronic Journal of
Biotechnology 3 (1), 2000.
128. KANNENBERG, L.W. Corn breeding in the 20th century, 1999. http://www.ontariocorn.org
129. KESAN J.P., Gallo A. A. Property rights and incentives to invest in seed varieties: governmental regulations in Argentina. AgBioForum,
8(2,3):118-126, 2005.
130. KOURILSKY P., VINEY G. Le principe de précaution. Paris, Éditions Odile Jacob, 2000.
131. LATOUR B. Principe de precaution. http://www.bruno-latour.fr/presse/presse_art/028-TECREV-BEBEAR-4.pdf
132. LEBUANEC B. A evolução da indústria sementeira durante os últimos 40 anos. Revista SEED News 12:4, 2008.
133. LEMAUX P. Genetically Engineered plants and foods: a scientist analysis of the issues (Part I). Ann. Rev.Plant Biol. 59:771-812, 2008.
134. ________. Agricultural Biotechnology: it’s past and future. Asilomar 25th Anniversary Meeting, 2000.
Http://ucbiotech.org/resources/biotech/talks/pipeline/asilomar.html
135. ________. How does Biotechnology differ from classical Genetic manipulation?
http://ucbiotech.org/resources/biotech/slides/02genetics/genetics.html
136. ________. Genetically Engineered plants and foods: a scientist analysis of the issues (Part II). Ann. Rev.Plant Biol. 60:511-559, 2009.
137. LEWCOK A. Down on the biopharm, 2007. http://www.in-pharmacologist.com/content/view/print/121943
140. MANTELL, S.H. et al. Princípios de biotecnologia em plantas. Sociedade Brasileira de Genética, 1994
141. MARTÍNEZ-GHERSA M.A., GHERSA C. Consecuencias de los recientes cambios agrícolas. Ciencia Hoy 15:87, 2005
142. MAYR E. Populações, espécies e evolução. São Paulo, Companhia Editora Nacional, 1977.
143. Mc HUGHEN A. Genetic Engineering and testing methodologies. Publication 8190. University of California, Division of Agriculture and
Natural Resources, 2006. http://anrcatalog.ucdavis.edu
144. McCALLA A.F., BROWN L.R. Feeding the developing world in the next millennium: a question of science? In: Agricultural
biotechnology and the poor: an international conference on biotechnology. Consultation group on international agricultural research,
1999. http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/contents.htm
145. MENDONÇA-HAGLER, L.C.S. 2001. Biodiversidade e Biossegurança. Biotecnologia Ciência, Desenvolvimento, 18. 16-22.
146. MISSISSIPPI STATE UNIVERSITY. Lessons on agribusiness in a global environment, 1998.
http://www.ais.msstate.edu/age/lessons.html
147. MIT TECHNOLOGY REVIEW. http://www.technologyreview.com
148. MONSANTO. http://www.monsanto.com
149. NATIONAL SUSTAINABLE AGRICULTURE INFORMATION SERVICE (NCAT). Transgenic crops. Http://www.attra.ncat.org
150. ODA R. Biodiversidade: a biotecnologia é prejudicial? http://www.anbiojovem.org.br/biosseg05.htm
151. _____, DA SILVA FAUSTINO, V. Criterios para la Evaluación de Riesgo de Los OVGMs. International Journal of Biosafety and
Biosecurity, North America, 1/10/2010. http://www.seer.ufu.br/index.php/intbiosafetybiosecurity/article/view/2268
152. OESTERHELD M. Los Cambios de la Agricultura Argentina y sus Consecuencias. Ciencia Hoy 15:87, 2005
153. OFICINA DE BIOTECNOLOGÍA (Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos. Biotecnología y Bioseguridad Agropecuaria en
la Argentina) http://www.sagpya.mecon.gov.ar/new/0-0/programas/biotecnologia/respuestas.php
154. OGM.ORG. http://www.ogm.org
155. OXITEC. www.oxitec.com
156. PAES DE ANDRADE P et al. Eucalipto transgênico: quais são, de fato, os riscos ao ambiente e a saúde?
2014http://genpeace.blogspot.com.br/2014/11/eucalipto-transgenico-quais-sao-de-fato.html
157. PAIXÃO, R.L. Experimentação animal: razões e emoções para uma ética. Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de Saúde Pública;
2001.
158. PANOS MEDIA BRIEF. Who decides? GM crops in the developing world. http://www.panos.org.uk/PDF/reports/gmdebate_brief.pdf.
159. PARISI C et al. The Global pipeline of GM crops out to 2020. Nature 34:1 pag 31-36, 2016
160. PATEL R.P et al. Protein Production. Drug Delivery Technology 7(4), 2007
161. PERSLEY G.J. Agricultural biotechnology and the poor: promethean science. In: Agricultural biotechnology and the poor: an
international conference on biotechnology. Consultation group on international agricultural research (1999).4
http://www.cgiar.org/biotech/rep0100/contents.htm
162. PERSLEY G.J _____ . Agricultural biotechnology: global challenges and emerging science. Agricultural biotechnology: country case
studies. CAB International, 2002. http://www.agrbiotech.org
289
http://bteduc.com
163. PEW INITIATIVE ON FOOD AND BIOTECHNOLOGY. Feeding the World. A look at biotechnology and world hunger. 2004.
http://www.pewagbiotech.org
164. PIERIK, R.L.M. Cultivo "in vitro" de las plantas superiores. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1990.
165. PORCEDDU E., TANZARELLA O.A. Perspectivas y papel de la mejora genética en la agricultura del siglo XXI. In: La agricultura del siglo
XXI. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa (1993).
166. PORTAL DE LA ACUICULTURA EN CHILE. http://www.aqua.cl/sitios.html
167. RAMANYANEYULU G.V. GM crops are not the answer to pest control. 08/02/2006. SciDevNet http://www.scidev.net
168. RAVEN P.H. Transgenes in Mexican maize: desirability or inevitability? PNAS 102(37) 13003-13004, 2005
169. RECH E. A agricultura familiar e a biotecnologia como contribuição para o avanço social e econômico. http://www.cib.org.br
170. RED DE COOPERACIÓN TÉCNICA EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL PARA AMERICA LATINA Y EL CARIBE (REDBIO FAO)
http://www.redbio.org/
171. REISS. M.J. et al. Improving Nature? The science and ethics of genetic enginering. Cambridge, Cambridge University Press, 1996.
172. RISCH O.A. O setor de floricultura e plantas ornamentais no Brasil e no mundo.
http://www.floresta.ufpbr.br~paisagem/plantas/mercado.htm
173. RIZZINI C.T., MORS W.B. Botânica econômica brasileira. 2a ed. Rio de Janeiro, Âmbito Cultural Edições Ltda., 1995.
174. ROSSET P.M. Transgenic crops to address third worlds hunger? Critical analysis. Bulletin of Science, Technology , Society 25(4), 2005.
175. RUBINSTEIN C. Criterios científicos para la evaluación de la bioseguridad de los organismos geneticamente modificados. In:
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Buenos Aires, 2005.
http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro/38_IX_1.pdf
176. RURAL ADVANCEMENT FUND INTERNATIONAL (RAFI). De donde vienen las semillas...Y adónde van? In: Mas allá de la revolución
verde (1987). Barcelona, Editora Lerna.
177. RURAL ADVANCEMENT FUND INTERNATIONAL (RAFI). De donde vienen las semillas...Y adónde van? In: Mas allá de la revolución
verde. Barcelona, Editora Lerna, 1987.
178. SANCHEZ M.A. Conflict of interests and evidence base for GM crops food. Nature Biotechnology 33, 135–137, 2015
179. SASSON A. Biotechnologies and development. Paris, Unesco, 1988.
180. ________. Food and Nutrition Biotechnology: achievements, prospects and perceptions. UNU-IAS Report, 2005. www.ias.unu.edu
181. SATORRE E. H. Cambios Tecnológicos en la Agricultura Argentina Actual. Ciencia Hoy 15(87), 2005.
182. SCHIFINO-WITTMANN et al. Poliploidia e seu impacto na origem e evolução das plantas silvestres e cultivadas. R. Bras. Agrociência
10(2), 2004.
183. SCIDEVNET. Dossier: Biodiversity. http://www.scidev.net
184. SCIENCE DAILY https://www.sciencedaily.com
185. SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, PESCA Y ALIMENTOS, MINISTERIO DE ECONOMÍA Y PRODUCCIÓN. Plan Estratégico 20052015 para el Desarrollo de la Biotecnología Agropecuaria. Buenos Aires, 2004. http://www.sagpya.mecon.gov.ar/new/00/programas/biotecnologia/pdf/PE.pdf
186. SEED WORLD. http://www.seedworld.com
187. SEEDNEWS http://www.seednews.inf.br/portugues/arquivo.shtml
188. SEQUEIRA DE OLIVEIRA PEREIRA M. Transgênese animal. Biotecnologia, Ciência e desenvolvimento.
http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio04/4_hp_16.asp
189. SERAGELDIN I. The challenge of poverty in the 21stcentury: the role of science. En: Agricultural biotechnology and the poor: an
international conference on biotechnology. Consultation group on international agricultural research, 1999.
190. ___________ et al. Promethean Science: Agricultural biotechnology, the environment and the poor. Consultative Group on
International Agriculture Science, 2000. http://www.cgiar.org
191. SHAPIRO B. Mammoth 2.0: will genome engineering resurrect extinct species? Genome Biology (2015) 16:228
192. SIJU E.N. et al. Wolbachia – biological control against dengue transmission. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences
Volume 4, Issue 05, 527-531, 2012.
193. SITE INTERMINISTERIEL SUR LES OGM http://www.ogm.gouv.fr
194. SNOW A. A. Transgenic crops – why gene flow matters. Nature Biotechnology, 20, 2002.
195. SOMMER S. ¿Por qué las vacas se volvieron locas? Buenos Aires, Editora Biblos, 2001.
196. SOURCE D’INFORMATION SUR LES ORGANISMES GÉNÉTIQUEMENT MODIFIÉS. http://www.ogm.gouv.qc.ca
197. STRAUGHAN, R. et al. Ethics, morality and crop biotechnology. Biotechnology and Biological Sciences Research Council, 1996.
198. SWAMINATHAN M.S. Genetic Engineering and Food Security: Ecological and Livelihood Issues. En: Agricultural biotechnology and the
poor: an international conference on biotechnology. Consultation group on international agricultural research, 1999.
199. TAMAYO G et al. Biodiversity for bioindustries in biotechnology and plant genetic resources: conservation and use. Biotechnology in
Agriculture Series, No.19, 1997. http://www.agbiotechnet.com/books/available.asp
200. TEICHERT PESKE S., TILLMANN M. A. A. Limites de Tolerância para Sementes Adventícias. Seeds news XII (5), 2009.
201. THE CONVENTION ON BIOLOGICAL DIVERSITY http://www.biodiv.org/default.shtml
202. THE GLYPHOSATE, WEEDS AND CROPS WEB SITE. http://www.glyphosateweedscrops.org/
203. THE INTERNATIONAL SERVICE FOR THE ACQUISITION OF AGRI-BIOTECH APPLICATIONS (ISAAA) http://www.isaaa.org/
204. THE WORLD FISH CENTER http://www.worldfishcenter.org
205. TRIGO E. et al. Los Transgénicos en la Agricultura Argentina. Buenos Aires, Libros Del Zorzal, 2002.
206. ______. Consecuencias Económicas de la transformación Agrícola. Ciencia Hoy 15:87, 2005.
207. UNITED NATIONS STRATEGIC PLAN FOR BIODIVERSITY 2011- 2020 https://www.cbd.int/2011-2020/learn/factsheets/
208. USDA. Global Agricultural Information Network. Israel, Agricultural Biotechnology Annual (2015)
209. VAL GIDDINGS L., JAFFE G. Codex alimentarius and the Biosafety protocol – Complement or conflit? 23/09/2004.
http://www.checkbiotech.org
210. ______________ et al. Suppressing Growth: How GMO opposition Hurts Developing Nations. Information Technology , Innovation
Foundation, February 2016
211.
VAN EENENNAAM A.L. Genetic engineering and animal feed. Genetic Engineering Fact Sheet 6, publication 8183. Division of
Agriculture and Natural Resources, University of California. http://anrcatalog.ucdavis.edu
212. __________________. What is the future of animal biotechnology. California Agriculture 60(3), 2006.
213. __________________. Marker-assisted selection in beef cattle.
290
BIBLIOGRAFIA
214. __________________. GMOs in animal agriculture: time to consider both costs and benefits in regulatory evaluations Journal of
Animal Science and Technology 4:37, 2013
215. __________________. , A.E.Young. Prevalence and Impacts of Genetically Engineered Feedstuffs on Livestock Populations. Journal of
Animal Science, 2014
216. VITAGLIANO J. C., VILLALPANDO F. A. Análisis de la Biotecnología en la Argentina. Foros nacionales de competitividad industrial de las
cadenas productivas, Secretaría de Industria, Comercio y PyME, Ministerio de Economia y Producción, 2003.
http://www.industria.gov.ar/foros/base_bio/documentos/coordinacion/analisis1.PDF
217. WILSON E.O. Naturalista. Editora Nova Fronteira, Rio de Janeiro, 1997.
218. WINKLER F. Acuicultura, mejoramiento genético y biotecnología. Bioplanet www.bioplanet.net
219. WOOD L. Total animal healthcare market estimated at $ 23 billion. 07/10/2004 http://www.checkbiotech.org
220. WORLD RESOURCES INSTITUTE. Agriculture and genetic diversity. http://www.wri.org/biodiv/agrigene.html
221. WURMAN GOTFRIT C.et al. La acuicultura commercial chilena: desafíos, oportunidades y metas hasta el 2020.
http://www.aqua.cl/revistas/n58/tit_1_esp.html
222. ZIPPEL K. Why do we need na Amphibian Ark? Action Bioscience, may 2007 http://www.actionbioscience.org/biodiversity/zippel.html
CAPÍTULOS 15 e 16
223. ACCESS EXCELLENCE (THE NATIONAL HEALTH MUSEUM). About Biotech: Biotech applied. http://www.accessexcellence.org
224. AFRICA VIEW http://africaview2014.blogspot.com.br/2014/02/where-we-are-in-biotechnology.html
225. AQUARONE et al. (Org.). Biotecnologia Industrial. Biotecnologia na produção de alimentos. Vol. 4. São Paulo, Editora Edgar Blucher
Ltda., 2001.
226. _________. Generalidades sobre bebidas alcoólicas. In: Biotecnologia Industrial Vol. 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
227. ASSOCIAÇÃO NACIONAL DE BIOSSEGURANÇA (ANBIO). http://www.anbio.org.br
228. AVERY D.T. FDA tests show genetically altered corn hasn´t triggered allergies. Dayton Daily News, 18/06/2001.
229. BEEVER, D.E., KEMP, C.F. Safety Issues Associated with the DNA in Animal Feed Derived from Genetically Modified Crops: A Review of
Scientific and Regulatory Procedures. Nutrition Abstracts and Reviews, Series B: Livestock Feeds and Feeding, 70(3): 1-8, 2000.
Http://www.biotech-info.net/BeeverKemp1.pdf
230. BERGER R. G. Fermented foods: Colours/flavours derived by fermentation. In: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology,
Online Version, 2000. http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
231. BIOPLANET. www.bioplanet.net
232. BIOTECHNOLOGY INDUSTRY ORGANIZATION (BIO) http://www.bio.org
233. BIOTECNOLOGIA, CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO. http://www.biotecnologia.com.br
234. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO. http://www.bteduc.bio.br
235. BISSON L.F. et al. The present and future of the international wine industry. Nature (418): 696-699, 2002.
236. BLANKE S. et al.Fatal attraction: the intuitive appeal of GMO opposition. Trends Plant Sci. 20(7), 2015
237. Food Safety and GMOs Consensus Document 11/2004 http://www.isaaa.org/kc/Publications/pdfs/documents/consensus_GB.pdf
238. BOSCH X. Genetic secrets of a good wine. The Scientist 5(1), 2004. http://www.the-scientist.com/2004/5/
239. BROOKES G., BARFOOT P. GM crops: The global economic and environmental impact; the first nine years 1996-2004. AgBioForum
8(2,3): 187-196, 2005.
240. CAMPBELL-PLATT G. Fermented foods: origins and applications. Em: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online
Version, 2000. Http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
241. CASTRO J. de. Géographie de la faim. Paris, Editions du Seuil, 1964.
242. CENTURY WINE. http://www.centurywine.8m.com/picture.html
243. CHAPLIN M. Enzyme technology, 2003. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.html
244. CHASSY B.M. Food safety evaluation of crops produced through Biotechnology. Journal of the American College of Nutrition, 21:3,
2002.
245. CHECKBIOTECH. http://www.checkbiotech.org
246. COHEN J.I. Poorer nations turn to publicly developed GM crops. Nature Biotechnology 23(1)27-33, 2005
247. CONSELHO DE INFORMAÇÕES SOBRE BIOTECNOLOGIA (CIB). http://www.cib.org.br
248. CONSTABLE A. et al. Histórico de utilização segura aplicado à avaliação de segurança de novos alimentos ou de alimentos derivados
de organismos geneticamente modificados. ILSI, 2008.
249. DÍAZ A. Biotecnología en Industrias de Alimentos. CEPAL, ONU, Buenos Aires, 2003.
250. DUVAL-IFLAH Y. Y a-t’il des risques liés à la consommation de produits frais contenat des bactéries transgéniques? En: Les OGM à
lÍNRA: OGM et alimentation, 1998. http://www.inra.gov.fr
251. ESTEVES VIEIRA L.G. Organismos geneticamente modificados: uma tecnologia controversa. Ciência Hoje 34 (203): 28-32, 2004.
252. EUROPEAN FEDERATION OF BIOTECHNOLOGY (EFB) Allergies from GM food. Task group on public perceptions of biotechnology, 2000.
http://www.efb-central.org/
253. EUROPEAN FOOD INFORMATION COUNCIL (EUFIC). http://www.eufic.org
254. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION (FAO). Food Processing, Summary Document.
http://www.fao.org/biotech/logs/C11/summary.htm
255. FOOD STANDARDS AGENCY. Genetic modification and food. http://www.food.gov.uk
256. FREEDMAN D.H. The truth about genetically modified food. Scientific American 309:3, 2013
257. GASTONE VENTURINI FILHO W., M. PASCOLI CEREDA. Cerveja. In: Biotecnologia Industrial Vol 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher
Ltda. 2001.
258. GENETIC LITERACY PROJECT https://www.geneticliteracyproject.orgAUER C.A. Tracking genes from seed to supermarket: techniques
and trends. Trends in Plant Science, 2003 / Biomednet.
259. GLOBAL KNOWLEDGE CENTER ON CROP BIOTECHNOLOGY. São alimentos derivados de cultivos transgênicos seguros?
http://www.isaaa.org
260. GMO-COMPASS. http://www.gmo-compass.org
261. GRANDI J.G. Leites fermentados. In: Biotecnologia Industrial, Vol. 4, São Paulo, Editora Edgar Blücher Ltda., 2001.
262. GREENBERG D., M.GRAHAM. Improving communication about new food technologies. Issues on Science and Technology, Summer
2000. http://www.nap.edu/issues/16.4/greenberg.htm
263. GREENPEACE. http://www.greenpeace.org
291
http://bteduc.com
264. GRENS K. There’s CRISPR in your yogurt. The Scientist Magazine http://www.thescientist.com/?articles.view/articleNo/41676/title/There-s-CRISPR-in-Your-Yogurt/
265. HAILS R., KINDERLERER J. The GM public debate: context and communication strategies. Nature Genetics (4): 819-825, 2003.
266. HARVESTPLUS. http:// www.harvestplus.org
267. HASHIZUME T. Tecnologia do vinho. In: Biotecnologia Industrial, Vol. 4, São Paulo, Editora Edgar Blücher Ltda., 2001.
268. HERMAN R.A. , PRICA W.D. Unintended Compositional Changes in Genetically Modified (GM) Crops: 20 years of research. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 64 (2), 2016
269. HOBAN T. Tacogate: there is barely a kernel of truth. Washington Post, 26/11/2000.
270. INTERNATIONAL LIFE SCIENCES INSTITUTE (ILSI). http://www.ilsi.org
271. INTERNATIONAL SERVICE FOR THE AQUISITION OF OF AGRI-BIOTECH APPLICATIONS (ISAAA) www.isaaa.org
272. January 1, 2015
273. JOHANSEN E. Challenges when transferring technology from Lactococcus laboratory strains to industrial strains. Genetics and
Molecular Research 2(1): 112-116, 2003.
274. JOHANSEN E. Genetic engeneering: modification of bacteria. In: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version,
2000. http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
275. KIMBRELL E. What is Codex Alimentarius? AgBioForum 3(4): 197-202, 2000.
276. KIU W., L. KOVACS Do we need to be concerned about genetically modified grapevine? Vineyard and vintage view 18(4), 2003.
277. KOUBA M. Qualité des produits biologiques dórigine animale. Productions animales (15) 161-169, 2002.
278. LA PLANÈTE-VIN / LE PRODIGE DU VIN. http://www.abrege.com/lpv/prodig.htm
279. LA RECHERCHE. Le risque alimentaire. Numéro spécial, Février 2001.
280. LAJOLO F. Alimentos transgênicos: riscos e benefícios. Ciência Hoje 34 (203): 36-37, 2004.
281. LAJOLO F.M., NUTI M.R. Transgênicos: Bases científicas de sua segurança. São Paulo, Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição,
2002.
282. LEMAUX P. G. Genetically engineered plants and foods: a scientist’s analysis of the issues (Part I). Annual Review of Plant Biology 59:
771-812, 2008.
283. LERAYER A. L. S. Biotecnologia na indústria de alimentos. http://www.cib.org.br.
284. LEVANON Y., OUVINHAS ROSSETINI S.M. Cacau. In: Biotecnologia Industrial Vol 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
285. LUCO R. et al. La acuicultura en Chile. http://bibliotecnica.upc.es/bib280/cursmari/parte3.pdf
288. MANSOUR M., BENNETT J.B. Codex Alimentarius, biotechnology and technical Barriers to trade. Agbioforum 3(4): 213-218, 2000
289. MARRIS E. Winning the wine war. http://www.bioedonline.org/news/news.cfm?art=1655
290. MILLS C. Could genetically modified foods be a new source of allergens? http://www.scidevnet
291. NATIONAL CENTRE FOR BIOTECHNOLOGY EDUCATION (NCBE). http://www.nvbe.reading.ac.uk/NCBE/GMFOOD/issues.html
292. NICOLIA A. et al. An overview of the last 10 years of genetically engineered crop safety research. Crit Rev Biotechnology, 2013
293. NIGAM P. Single cell protein: mycelial fungi. In: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000.
http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
294. NIGERIA BIOSUMMIT, 2015. http://www.bio.gov.ng/site/status-of-crop-biotechnology-in-africa/
295. NOVOZYMES http://www.novozymes.com
296. NUTTI M.R. A biofortificação como ferramenta para combate a deficiências em micronutrientes. Palestra no Workshop Internacional
de Biologia Médica (2005). Em www.cprm.gov.br/publique/media/Palestra10.pdf
297. ODA L.M. Alimentos transgênicos: riscos à saúde, 2001. http://www.mct.gov.br/ctnbiotec/leila.htm
298. OGM.org http://www.ogm.org
299. PARISI C. et al. The Global pipeline of GM crops out to 2020. Nature 34:1, 2016
300. PASCAL G. Comment évaluer la sécurité des aliments issus de plantes transgéniques? In: Les OGM à lÍNRA:
301. OGM et alimentation, 1998.
302. PASTORE G.M. Production and use of enzymes in food processing. Workshop – Industrial Enzymes for food production: Past, present
and future perspectives. Brasília, 2002 http://www.anbio.org
303. PERSLEY G.J. New genetics, food and agriculture: Scientific discoveries - Societal dilemmas. The Doyle Foundation for the International
Council of Science (ICSU), 2003. http://www.doylefoundation.org/icsu/ICSU_2003_20Full_20Report.pdf
304. PHILLIPS P.W.B., CORCKINDALE, D. Marketing GM foods: the way forward. AgBioForum, 5(3): 113-121, 2002.
305. PHILLIPS P.W.B., McNEILL, H. Labelling for GM foods: theory and practice. In: Market Development for genetically modified foods.
CAB International, 2002.
306. PLANT BIOTECHNOLOGY INSTITUTE (PIB). Biotechnology and Developing countries: the potential and the challenge. PBI Bulletin (2),
2004.
307. RIBEIRO E.P. Queijos. In: Biotecnologia Industrial Vol. 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
308. ROBERFROID M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? American Journal of Clinical Nutrition 71(suppl), 2000.
309. ROYAL COMMISSION ON GENETIC MODIFICATION. 17 popular myths about GM which were busted by the Royal Commission on
genetic modification, 2001. http://www.checkbiotech.org
310. SAN DIEGO CENTER FOR MOLECULAR AGRICULTURE (SDCMA). Foods from genetically modified crops. http://www.sdcma.org
311. SANDIR R. et al. Genetic engineering: modification of yeasts and moulds. In: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology,
Online Version, 2000. http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
312. SASSON A. Nourrir demain les hommes. Paris, Sextant / UNESCO, 1986.
313. ________. Food and Nutrition Biotechnology: achievements, prospects and perceptions. UNU-IAS Report, 2005. www.ias.unu.edu
314. SATO S. Alimentos orientais. In Biotecnologia Industrial Vol 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
315. SCIDEVNET. http://www.scidev.net
316. SINGHAL R.S, KULKARNI,P.R. Bread: bread from wheat flour. In: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version,
2000. http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
317. SITE INTERMINISTERIEL SUR LES OGM. http://www.ogm.gouv.fr
318. SYBESMA W. et al. Safe use of genetically modified lactic acid bacteria in food. Bridging the gap between consumers, green groups,
and industry. Electronic Journal of Biotechnology 9:4, 2006
319. THE AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION. Biotechnology and the future of food. J Am Diet Assoc. 1995;95:1429-1432
320. THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR BIOINDUSTRIES (EUROPABIO) http://www.europabio.org
292
BIBLIOGRAFIA
321.
322.
323.
324.
325.
326.
327.
328.
329.
330.
331.
332.
333.
334.
THE GUARDIAN. www.theguardian.com
THE PEW INITIATIVE ON FOOD AND BIOTECHNOLOGY. http://www. pewagbiotech.org
THOMPSON L. Are bioengeneered foods safe? FDA consumer magazine, january-february 2000. http://www.fda.org
UNITED STATES FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). http://fda.gov
VITTI P. Pão. In: Biotecnologia Industrial Vol. 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
VITTOLO M. Aplicações das enzimas na tecnologia de alimentos. In: Biotecnologia Industrial Vol 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher
Ltda., 2001.
WAL J-M. Les aliments transgéniques néntraînent-ils pas des problèmes dállergie? In: Les OGM à lÍNRA: OGM et alimentation, 1998.
WALKER G.M. Microbiology of wine-making. In: Academic Press Encyclopedia of Food Microbiology, Online Version, 2000.
http://www.academicpress.com/companions/0122270703/
WINE INTERNATIONAL http://www.wineint.com/
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). 20 questions on genetically modified (GM) foods. http://www.who.int
________________________________. Modern food biotechnology, human health and development: an evidence-based study, 2005
http://www.who.int
________________________________. 20 questions on genetically modified foods
http://www.who.int/foodsafety/areas_work/food-technology/faq-genetically-modified-food/en/
ZANCANARO Jr. O. Vinagres. In: Biotecnologia Industrial Vol 4, São Paulo, Editora Edgar Blucher Ltda., 2001.
ZINNEN T.M. Wholesome, Holistic and Holy: Contoversies over Biotechnology and Food,
http://www.accessesxcellence.org/RC/AB/IE/wholesome.html
CAPÍTULOS 17, 18, 19 e 20
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
UK VACCINE INDUSTRY GROUP. http://www.uvig.org/faqsheets/index.asp
ABBOTT´S DIAGNOSTIC DIVISION. http://www.abbottdiagnostics.com
ABDULLA S. Phytotherapy – good science or big business? Nature Science Update, 1999.
http://www.nature.com/news/1999/990513/full/990513-8
ACCESS EXCELLENCE (THE NATIONAL HEALTH MUSEUM. http://www.accessexcellence.org
ACTION BIOSCIENCE. http://www.actionbioscience.org
ADAM D. GM cropped. Nature Science Update, 01/04/2000. http://www.nature.com/nsu/nsu_pf/000330/000330-6.html
ADAMS A. Cancer immunotherapy inches forward. The Scientist 18(14):37, 2004. AIDS: ETIOLOGIA, CLINICA, DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO. Testes diagnósticos.
http://www.aids.gov.br/assistencia/etiologia_diagnostico.htm
ALCAMO I.E. DNA Technology: The awesome skill. Dubuque, Wm. C. Brown Publishers, 1996.
ALDHOUS P. The bioweapon is in the post. NewScientist.com, 9/11/2005
http://www.newscientist.com/channel/opinion/mg18825252.900.html
ALONSO D.F., GÓMEZ D. ADN y cáncer: del origen de la enfermedad a su tratamiento. In: ADN, 50 años no es nada. Buenos Aires,
Siglo XXI Editores Argentina, 2004.
ALONSO D.F. El desafío del cangrejo. Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2002.
ALONSO D.F., GOMEZ D.E. Introducción a la Oncología Molecular. Bernal, Universidad Nacional de Quilmes, 1998.
ALZOGARAY R. A. Una Tumba para los Romanov. Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2004.
AMBION. http://www.ambion.com
AMEH S.J. et al. Current phytotherapy – A perspective on the science and regulation of herbal medicine. Journal of Medicinal Plants
Research 4(2): 72-81, 2010
AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRICS (Work Group on Cord Blood Banking). Cord Blood Banking for potential future transplantation:
subject review. Pediatrics 104:1: 116-118, 1999.
AMERICAN CANCER SOCIETY. Immunotherapy. http://www.cancer.org
AMERICAN CHEMICAL SOCIETY (ACS) The Pharmaceutical Century: ten decades of drug discovery, 2000. http://www.acs.org
AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION (AMA) Pharmacogenomics. http://www.ama-assn.org
ANILÓ G. et al. Las empresas de biotecnología en Argentina. Comisión Económica para América Latina y el Caribe (CEPAL), Naciones
Unidas, Santiago de Chile, 2011.
ANTLER C. Antisense RNA. http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/AntisenseRNA/
ANTONARAKIS S.E., BECKMANN S. Mendelian disorders deserve more attention. Nature Reviews Genetics 7, 2006
APPLIED BIOSYSTEMS. http://www.appliedbiosystems.com
ARGIBAY P. Medicina regenerativa y stem cells - De la terapia celular a la ingeniería de tejidos. Bernal, Universidad Nacional de
Quilmes, 2005.
ASSOCIATION OF REPRODUCTIVE HEALTH PROFESSIONALS. Human cloning and genetic modification: The basic science you need to
know. http://www.arhp.org/genetics/
AVENTIS PASTEUR – Erradication de la poliomyélite. http://www.polio-vaccine.com
AZEVEDO V., COSTA OLIVEIRA, S. Vacinas de DNA: o paradigma das vacinas gênicas. Biotecnologia, Ciência e desenvolvimento 5:5,
1998.
BAJORATH J. Integration of virtual and high –throughput screening. Nat Ver Drug Discov. 1(11): 882,894, 2002.
BAKER M. An overview of the not-so-distant past, and an outlook for the not-so-distant future. Nature Reports Stem Cells, 2009.
http://www.nature.com/stemcells/2009/0910/091022/full/stemcells.2009.132.html
BAMBINI S., RAPPUOLI R. The use of genomics in microbial vaccine development.Drug Discovery Today March 1, 2009.
BARRETT J.F. Can biotech deliver new antibiotics? Current Opinion in Microbiology 8:498-503, 2005.
BATES C. Nicotine vaccine tests launched. http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/1535852.stm
BENTO FARAH S. DNA, segredos e mistérios. São Paulo, Editora Sarvier, 2008.
BERGMAN K. A., GRAFF D. The global stem cell patent landscape: implications for efficient technology transfer and commercial
development. Nature Biotechnology 25:419-424, 2007.
BERNARD S. The 5 myths of pharmacogenomics. October 1, 2003. http://www.pharmexec.com
BIERMANN C.A, SARINSKY, G.B.. Xenotransplants. The American Biology Teacher (60) 1: 14-18, 1998.
BIOETHICS RESEARCH LIBRARY. Human Gene Therapy. http://www.bioethics.georgetown.edu
BIOMÉRIEUX. http://www.biomerieux.com
293
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
http://bteduc.com
BIONET. http://www.bionetonline.org
BIONEWs http://www.bionews.org.uk/home
BIOPOLITICAL TIMES www.biopoliticaltimes.org
BIOSENSORS AND BIOELECTRONIC 49 (2013) 118-125
BIOTECH PRIMER WEEKLY www.biotechprimer.com
BOURZAC K. Beating the big three. Nature 507, 2014 S4-S7 doi:10.1038/507S4a
BUTLER D. The Next Time. Nature 524, 6 august 2015
BIORESEARCH ONLINE. http://www.bioresearchonline.com
BIOWORLD TODAY. http://www.bioworld.com
BORÉM A, DOS SANTOS, F.R. Biotecnologia Simplificada. Universidade Federal de Viçosa. Viçosa, Minas Gerais, 2001.
BOROJEVIC R. Biotecnologia na área de saúde humana e animal: Bioengenharia e biomimética.
http://www.mct.gov.br/Temas/biotec/ Tendencias_Radovan_Final_.pdf
BRANCA M. The new new pharmacogenomics. Bio-ITWorld, 2002. http://www.bio-itworld.com/archive/090902/pharma.html
BREEKVELDT J., JONGERDEN J. Transgenic animals in Pharmaceutical production Biotechnology and Development monitor 36:19-22,
1998. http://www.biotech-monitor.nl/3609.htm
BRICKLEY P. The 21st Century war on cancer. The Scientist 17 Issue Supplement 2: S46, 2003. http://www.thescientist.com/article/display/14132/
BRINKMAN R.R. et al. Human monogenic disorders – a source of novel drug targets. Nature Reviews / Genetics 7(4):249-260, 2006.
BRITISH MEDICAL ASSOCIATION (BMA). BMA position on human cloning. http://www.bma.org.uk
BUSINESS COMMUNICATIONS COMPANY, INC. http://www.bccresearch.
BUSSINESS WEEK ONLINE. http://www.businessweek.com
CAMPOS DE CARVALHO A C. Células-tronco: a medicina do futuro.
http://www.educaçãopublica.rj.gov.br/biblioteca/biologi/bio10b.htm
CANCER REASEARCH UK. http://www.cancerhelp.org
CARDIFF AND VALE NHS. Trust Tissue typing. http://www.cardiffandvale.wales.nhs.uk
CASE C. Discover a new antibiotic. Strategies for success workshop, 1998. http://smccd.accounts/case/antibiotics
CASTANOTTO D., ROSSI J. J. The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nature 457:426-433, 2009.
CDF Compatibilidade HLA e transplantes. http://www.fhdf.gov.br
CENTER FOR GENETIS AND SOCIETY. http://www.genetics-and-society.org
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC). http://www.cdc.org
CENTRE FOR GENETICS EDUCATION. http://www.genetics.edu.au
CENTRO INFORMAÇÃO BIOTECNOLOGIA (CIB). http://www.cib.org.br
CHA A. E. With U.S. stem cell treatments limited, patients try other countries. The Washington Post 6/6/2010.
http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/2010/06/05/AR2010060502014.html
CHANDLER J. e LAGASSE E. Cancerous stem cells: deviant stem cells with cancer-causing misbehavior. Stem Cell Research , Therapy
1:13, 2010. http://www.stemcellres.com/content/1/2/13
CHAPMAN A.R et al. Stem cell Research and applications. Monitoring the frontiers of biomedical research. American Association for
the advancement of Science, 1999.
CHAPMAN T. Lab automation and robotics. Nature 421: 661-666, 2003.
CHARROW J. Tandem mass spectrometry in newborn screening. Genetics in Medicine (2) 4: 267-269, 2000.
CHERFAS J. Antibiotics explained. Biotechnology and Biological Sciences Researh Council, 1995.
CHILDREN’S HEALTH SYSTEM AND UNIVERSITY OF WASHINGTON (SEATTLE). GeneTests. Educational Materials: About Genetic
Services, 2003.
CHIN L., GRAY J.W. Translating insights from the cancer genome into clinical practice. Nature 452:553-63, 2008.
CICCARELLI F. D. The (r)evolution of cancer genetics. BMC Biology 8 (74), 2010. http://www.biomedcentral.com/1741-7007/8/74
CITÉ DES SCIENCES DE PARIS LA VILLETTE. Les médicaments génériques. http://www.citesciences.fr/actu/2001/03medicaments/html
CLARKE T. Malaria vaccine gets a boost. http://www.nature.com/nsu/nsu_pf/030519/030519-11.html
COCHLOVIUS B. et al. Therapeutic antibodies. Ameriucan Chemical Society. Modern Drug Discovery, October 2003.
CODNER D., DÍAZ A. Innovación y biotecnología en el sector salud de Argentina, 2011. http://ebookbrowse.com/codner-diaz-pdfd49553754
COHEN H. Gene therapy marches forward. The Scientist 16 (20), 2002.
COLLEGE OF BIOLOGICAL SCIENCES(CBS) After 15 million years, Sleping Beauty awakes.
http://www.cbs.umn.edu/lab_cbs/frontiers1_sleepingbeauty.html
COMCIÊNCIA. Os medicamentos anti-AIDS e a quebra de patentes. http://www.comciência.br
COMMITTEE ON THE BIOLOGICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS OF STEM CELL RESEARCH. Stem cells and the future of
regenerative medicine. The National Academies Press, 2002. Http://books.nap.edu/books/0309076307/html/index.html
CONSELHO REGIONAL DE FARMÁCIA DO RIO DE JANEIRO (CRFRJ). O terceiro milênio e a história da farmácia. http://www.crfrj.org.br/revista/42/12_42.html
CONSTANS A. Making medicine personal. http://www.the-scientist.com/yr2002/sep/1cprofile_020930.html
__________. A Body by science. The Scientist (19) 34, October 6, 2003.
CORPORATE WATCH. http://www.corporatewatch.org.uk
COUNCIL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY (CAST). Vaccine development using recombinant DNA technology. CAST
Issue paper 38, 2008.
DELAFLOR-WEISS E. , Chizhevsky V. Implementation of Gel Testing for Antibody Screening and Identification in a Community Hospital,
a 3-year Experience. Lab Med. 36:8 489-492,2005
DIAMOND j. Armas, Germes e aço. Os destinos das sociedades humanas.São Paulo, Editora Record, 2010
ECKER D.M. et al. The therapeutic monoclonal antibody Market. MAbs. Jan-Feb; 7(1): 9–14, 2015.
FRISCHKNECHT F. History of Biowarfare EMBO Rep. 2003 Jun; 4(Suppl 1): S47–S52, 2003
DAAR A S. et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nature Genetics 32: 229-232, 2002.
294
BIBLIOGRAFIA
98. DECODE GENETICS. http://www.decode.com
99. DEGOS L. Les Greffes dÓrganes. Paris, Flammarion, 1994.
100. DELUDE C.M., BOUGHMAN J. Genetic Research: mining for medical treasures. Breakthroughs in Bioscience, 2002.
http://www.faseb.org/opar/break/
101. DENNIS C. Special section on human genetics: the rough guide to the genome. Drug Discovery @ Nature. http://www.nature.com
102. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions. June 2001.
http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm
103. DESNOTTES J.F. Quels anti-bactériens pour après-demain. La Recherche 314: 70-73, 1998.
104. DIAMANTI-KANDARAKIS E. et al. Erythropoietin Abuse and Erythropoietin Gene Doping. Sports Med. 35(10), 2005.
105. DIAMOND J. Armas, germes e aço: os destinos das sociedades humanas. 2 Edição. Rio de Janeiro, Editora Record, 2001
106. DIÁRIO DA SAÚDE. http://www.diariodasaude.com.br
107. DÍAZ A. e CODNER D. Industria farmacéutica y biotecnología y acceso al conocimiento: un desafío para la Argentina. The Information
Society Project at Yale Law School, 2010. http://ebookbrowse.com/diaz-codner-doc-d39513680
108. DIMasi J.A. et al. The price of innovation: new estimates of drug development costs. Journal of Health Economics 22(2003)151-185
109. DINGLI D. e PACHECO J. M. Stochastic dynamics and the evolution of mutations in stem cells. BMC Biology 9:41, 2011.
110. DOHMAN H. Terapia Celular, entrevista concedida a Edmilson Silva. http://www.biotecnologia.com.br/bio29/entrevista.asp
111. DOWNWARD J. RNAi and Cancer Research. The path to cure? The Biochemist, 2004.
http://www.biochemist.org/bio/02605/0012/026050012.pdf
112. DOWNWY J. RNAi: The gentle art of shredding genes. National Institute for Medical Research. Mill Hill Essays.
http://www.nimr.mrc.ac.uk/millhillessays/2003/rnai/
113. DUFOUR V. DNA vaccines: new applications for veterinary medicine. Veterinary Sciences Tomorrow 2, 2001
114. ECONOMIST INTELLIGENCE UNIT. http://www.eiu.com/public/
115. EISENSTEIN M. Gene transfer: it’s all in the delivery. Nature Methods. http://www.nature.com
116. ELOIT M. Vaccins traditionnels et vaccins recombinants. INRA, Productions animales 11: 5-13, 1998.
117. EMANUELLI G., RIPOLL, G. Bases moleculares del cáncer: nuevas estrategias antitumorales. Serie Digital Ciencia y Tecnología,
Universidad Nacional de Quilmes. http://www.unq.edu.ar
118. EPSTEIN A. De cómo tratar una enfermedad grave utilizando vectores virales, sin necesariamente matar a los pacientes en el intento.
In: ADN, 50 años no es nada. Buenos Aires, Siglo XXI Editores Argentina, 2004.
119. ETHICAL, LEGAL AND SOCIAL IMPLICATIONS PROGRAM (ELSI). http://www.nhgri.nih.gov
120. EUROPEAN DIAGNOSTIC MANUFACTURERS ASSOCIATION (EDMA). http://www.edma-ivd.be
121. EUROPEAN FEDERATION OF PHARMACEUTICAL INDUSTRIES AND ASSOCIATIONS (EFPIA). http://www.efpia.org
122. EUROPEAN NANOTECHNOLOGY GATEWAY. http://www.nanoforum.org
123. EXTRACTA MOLÉCULAS NATURAIS. http://www.extracta.com.br
124. FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY (FASEB). Breakthroughs in bioscience, 2003.
http://www.faseb.org
125. FERRO BRICKS L. Vacina contra a poliomielite: um novo paradigma. Rev. paul. pediatr. 25:2, 2007
126. FIERCEBIOTECH. http://www.fiercebiotech.com
127. FIERCEDRUGDELIVERY. http://www.drugdelivery.com
128. FIERCEPHARMA MANUFACTURING. http://www.fiercepharmamanufacturing.com/
129. FIERCEPHARMA. http://www.fiercepharma.com
130. FIERCEVACCINES. http://www.fiercevaccines.com/
131. FISCHER A. e CAVAZZANA-CALVO M. Whither Gene Therapy? The Scientist 20(2), 2006.
132. FISHER WILSON J. 21st century antibiotics. The Scientist 16(5), 2002
133. FITZGERALD G.A. Anticipating change in drug development: the emerging era of translational medicine and therapeutics. Nature
Reviews/Drug Discovery 4, 2005.
134. FLIGHT C. Smallpox: eradicating the scourge. http://www.bbc.co.uk/history
135. FLOWER D.R. Vaccines in silico: the growth and powr of bioinformatics. The Biochemist (8): 17-20, 2004.
136. FOGARTY M. The reality of targeted therapies. The Scientist 16 (20), 14/10/02.
137. FRASER C.M., DANDO, M.R. Genomics and future biological weapons: the need for preventive action by the biomedical community.
Nature online, 2001. http://genetics.nature.com
138. FREDERICKSON R.M. A gene therapy primer. http://www.bio.com
139. FUNDAÇÃO ATAULFO DE PAIVA. Http://www.bcgfap.com.br
140. FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO (FAPESP). http://www.fapesp.org.br
141. FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ (FIOCRUZ) portal.fiocruz.br
142. GALLAGHER J. Acute myeloid leukaemia genes’ role discovered. BBC news 27/03/2011. http://www.bbc.com.uk/news/healthy12860969?print=true
143. GALLAGHER R. Vaccines are back. The Scientist 2005, 19(22):6.
144. GARMORY H.S et al. DNA vaccines: improving expression of antigens. Genetic vaccines and Therapy 1:2, 2003.
145. GARWIN W. et al. Issues in human genetics (Unit 4). European Initiative for Biotechnology Education. http://www.eibe.info/
146. GELDENHUYS W. et al. Optimizing the use of open-source software applications in drug discovery. Drug Discovery Today 11 (3/4),
2006.
147. GENETIC LITERACY PROJECT https://www.geneticliteracyproject.org/
148. GENESICA. http://www.genesica.com.ar
149. GENETIC ENGINEERING, BIOTECHNOLOGY NEWS. http://www.genengnews.com
150. GENETIC INTEREST GROUP. Genetic predisposition to common diseases. http://www.gig.org.uk/education4.htm
151. GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. http://gslc.genetics.utah.edu
152. GENETICS HOME REFERENCE. http://www.ghr.nlm.nih.gov
153. GENEWATCH UK . http://www.genewatch.org.
154. GENOMEWEB https://www.genomeweb.com/
155. GLOBAL BIODEFENSE http://globalbiodefense.com
156. GÖGEL S. et al. Progress and prospects: stem cells and neurological diseases. Gene Therapy 18, 2011.
157. GOMEZ D., ALONSO, D.F. Herramientas moleculares aplicadas al diagnóstico del cáncer. In: ADN, 50 años no es nada. Buenos Aires,
Siglo XXI Editores Argentina, 2004.
295
http://bteduc.com
158. GOMEZ, D. Avance en la investigación oncológica. http://www.perspectiva sur.com/nota3.htm
159. GOMEZ, D. Estrategias biotecnológicas para desafiar el cáncer. Entrevista; en Innovación en el campo de la Biotecnología, Informe
UNQ, octubre 2004. http://www.unq.edu.ar/servlet/ShowAttach?idAttach=4402
160. GOODWIN W. et al. DNA profiling: the forensic magic bullet. The Biochemical Society / Golden Jubilee, The Biochemist (4): 12-14,
2003.
161. GRAHAM S. Synthetic peptide may succeed where antibiotics have met with resistance. Scientific American.com, July 26, 2001.
http://www.sciam.com
162. GRAY N. Untying the Gordian knot, Pharmaceutical Executive, May 2005. http://www.pharmexec.com
163. GREY S. Genetic Engineering, Xenotransplantation, 2000. http://www.actionbioscience.org/biotech/grey.html
164. GRIMM D. e KAY A. Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time? J Clin Invest. 117(12): 3633-3641,
2007.
165. GRUPO EMPRESAS FARMACEUTICAS SIDUS. http//www.sidus.com.ar.
166. GUIDO R.V.C. et al. Planejamento de fármacos, biotecnologia e química medicinal: aplicações em doenças infecciosas. Estudos
Avançados 24(70): 81-98, 2010
167. GUIMARÃES PIMENTA C. O ambiente institucional da Biotecnologia voltada para a saúde humana no Brasil. Dissertação de mestrado.
Universidade de Brasília, Brasília – DF, 2008. http://www.unbcds.pro.br/publicacoes/CleilaGuimaraes.pdf
168. GWYNNE P., HEEBNER, G. Genomic revolution. Science, 26/01/2001. http://www.sciencemag.org/feature/emarket/benchtop/fungen.shl
169. HAJERI P. et al. siRNA: their potential as therapeutic agents – Part II. Methods of delivery. Drug Discovery Today 14:17-18, 2009.
http://www.drugdiscoverytoday.com
170. HARDIMAN G. Applications of microarrays and biochips in Pharmacogenomics. In: Quin Yang (Org.), Methods in Molecular Biology
448, Humana Press, 2008.
171. HARRELL E. The desperate need for new antibiotics. Time.com, 2009.
http://www.time.com/time/health/article/0,8599,1926853,00.html
172. HARVARD STEM CELL INSTITUTE. Stembook. http://www.stembook.org
173. HEALTH A TO Z. Tissue typing. http://www.healthatoz.com/healthatoz/Atoz/ency/tissue_typing.html
174. HENDERSON J.M. Bioterrrorism: are we prepared? http://www.actionbioscience.org
175. HIRCHLER. B. World’s top-selling drugs in 2014 vs 2010. Reuters, 2010. http://www.reuters.com/article/2010/04/13/roche-avastindrugs-idUSLDE63C0BC20100413
176. HISS H. Produção de vacinas. In: Biotecnologia Industrial Vol. 3: Processos fermentativos e enzimáticos, São Paulo, Editora Edgar
Blucher Ltda., 2001.
177. HISTORY OF BIOWARFARE. http://www.pbs.org/wgbh/nova/bioterror/hist_nf.html
178. HISTORY OF VACINES. http://history of vacines.org
179. HOFFMAN A. RNA interference therapies – A risky business? http://www.beremans.com/pdf/RNA_interference_
therapies_a_RISCy_business.pdf
180. HOLLAND C.A.,,KIECHLE F.L. Point-of-care molecular diagnostic systems – past, present and future. Current Opinion in Microbiology
2005, 8: 504-509.
181. HOLLON T. The biodefenders. Signals Magazine 15/06/2001. http://www.signalsmag.com
182. _______ . The current status of cancer treatment. The Scientist 17 Issue supplement 2:S34, 2003 Http://www.thescientist.com/article/display/14129/
183. HOMEDES N. Se puede hablar de políticas de genéricos en América Latina? RESPYN 5(1), 2004.
http://www.uanl.mx/publicaciones/respyn/v/1/editorial/
184. HOMMA, A História da Medicina: vacinas e soros nacionais. CREMESP / Revista Ser Médico – Edição 20 – Julho 2002
185. HORNSTEIN E. e SHOMRON N. Canalization of development by microRNAs. Nature Genetics 38:S20-4, 2006.
186. HOUDEBINE L. M. La production de médicaments par les OGM. Conférence donnée à Agropolis-Museum, 04/10/01
187. HUMAN GENOME PROJECT INFORMATION. Pharmacogenomics. http://www.ornl.gov
188. HUMAN GENOME RESOURCES. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
189. HUMPHRIES C. A Stem-Cell Therapy for Blindness. http://www.technologyreview.com
190. IMMUNECENTRA.L http://www.immunecentral.com
191. IMMUNOLOGY COURSE OUTLINE. http://pleiad.umdnj.edu/pathology_course/webpath/immunol/immunidx.htm
192. INDUSTRIE CANADA (DIRECTION GÉNÉRALE DES SCIENCES DE LA VIE). http://strategis.ic.gc.ca
193. INFORMATION ON CLINICAL TRIALS AND HUMAN RESEARCH. http://www.clinicaltrials.gov
194. INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA). Les applications de la biotechnologie, 2003. http://www.inapg.inra.fr
195. INSTITUTO BUTANTAN. http://www.butantan.gov.br
196. INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE PARANA (TECPAR). http://www.tecpar.br
197. INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNONOBIOLÓGICOS / BIOMANGUINHOS. http://www.bio.fiocruz.br
198. INSTITUTO DO MILÊNIO EM BIOENGENHARIA TECIDUAL. http://www.imbt.org.br
199. INSTITUTO LELOIR. http://www.leloir.org.ar
200. INSTITUTO NACIONAL DE BIODIVERSIDAD (INBIO). http://www.inbio.com
201. INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION (IDF). http://www.idf.org
202. INTERNATIONAL HAPMAP PROJECT. http://www.hapmap.org
203. INTRODUCTION TO LAB-ON-A-CHIP 2015: review, history na future http://www.elveflow.com/microfluidic-tutorials/microfluidicreviews-and-tutorials/introduction-to-lab-on-a-chip-2015-review-history-and-future/JACKSON P.D. e HARRINGTON J.J. Highthroughput target discovery using cell-based genetics. Drug Discovery Today 10(1): 53-60 2005
204. KANSAON M. Transplantes e respostas imunes. http://www.infomed.hpg2.ig.com.br/transplante.html
205. KELLAM P. Attacking pathogens through their hosts. Genome Biology 7, 2006.
206. KFOURY C. Therapeutic cloning: promises and issues. Mc Gill Journal of Medicine 10(2):112-120, 2007
207. KIATPONGSAN S. e SIPP D. Monitoring and Regulating Offshore Stem CellClinics.Science 20 (23):1564-5, 2009.
208. KIDSHEALTH. An introduction to genetics and genetic testing. http://www.kidshealth.org
209. KIMBALL´S BIOLOGY PAGES. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/
210. KOLATA G. Add Patience to a Leap of Faith to Discover Cancer Signatures. The New York Times, 18/07/2011.
http://www.newyorktimes.com
211. KRÜTZFELDT J. et al. Strategies to determine the biological function of microRNAs. Nature Genetics Supplement 38, 2006.
296
BIBLIOGRAFIA
212. KUSCHEL M. Lab-on-a-chip technology – Applications for Life Sciences. Agilent Technologies.
http://www.chem.agilent.com/Library/articlereprints/Public/59883035.pdf
213. LA RECHERCHE (DOSSIER). Les xénogreffes ont-elles um avenir? La Recherche 320: 57-68,1999
214. ____________________. Thérapie génique: une nouvelle frontière pour la recherche médicale. La Recherche 315: 51-66,1998.
215. LA VILLETTE / CITÉ DES SCIENCES ET DE L' INDUSTRIE http://www.cite-sciences.fr
216. LAB TESTS ONLINE. http://www.labtestsonline
217. LANDER A.D. The ‘stem cell’ concept: is it holding us back? Journal of Biology 8(8), 2009.
218. ________. The individuality of stem cells. BMC Biology 9:40, 2011.
219. LANZA R., ROSENTHAL N. The Stem cell challenge. Scientific American, 2004. http://www.sciam.com
220.
221.
222.
223.
224.
225.
226.
227.
228.
229.
230.
231.
232.
233.
234.
235.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
256.
257.
258.
259.
260.
261.
262.
263.
264.
265.
266.
267.
268.
269.
270.
271.
272.
LASHLEY F.R. Emerging infections diseases at the beginning of the 21st Century J Issues Nurs. 2006;11(1)
LAWSON M., A L. LAWSON. Investigating the antibiotic resistance problem. The American Biology Teacher (60) 6: 412-417, 1998.
LEADER B. et al. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nature Reviews / Drug Discovery 7:21-39, 2008.
LECLERC C. Des vaccins d’un nouveau type à lássaut du cancer. La Recherche 364:2003, 38-44.
LEMA M. Guerra biológica y bioterrorismo. Buenos Aires, Siglo XXI Editores, 2002.
LEMONICK M.D , PARK A. Vaccines stage a comeback. Time, 21/1/2002- 27/1/2002
http://www.time.com/time/covers/1101020121/vaccine.html
LESNEY M. Gene therapy. Modern Drug Discovery, January 2003: 23-27.
LEVINE M.M. Immunogenicity and efficacy of oral vaccines in developing countries: lessons from a live cholera vaccine. BMC Biology
8, 2010.
LEVITT M. The ethics and impact on behaviour of knowledge about one’s own genome. British Medicine Journal 319, 1999.
LEWIS R. Human genetics: Concepts and applications. 4th edition, New York: The McGraw Hill Higher Education, 2001.Home
diagnostic tests: the ultimate house call? http://www.fda.gov
_______ . DNA expression profiling: a new lens on cancer. The Scientist 17 Issue supplement 2: S22, 2003.
_______ . Genetic testing timeline. The Scientist, October 20, 2003.
_______ . Stem cells… An emerging portrait. The Scientist 19(13):14, 2005.
_______ . Vaccines: victims of their own success? The Scientist 18(14):15, 2004.
_______ . A practical Guide to the HapMap. The Scientist 01/02/2006. http://www.the-scientist.com/2006/2/1/68/1/
LINDEN, RAFAEL. Terapia gênica: o que é, o que não é e o que será. Estudos Avançados 24:70, 2010.
LINDASY M.A. Finding new Drug targets in the 21st centuryDRug Discovery Today !):23/24 (december 2005)
LITTLE S. Personalized medicine: seven keys to sucess. The Scientist 20(1):75, 2006.
LIU M.A , J.B.ULMER. Plasmid DNA technology. The Biochemist, 4 :21-24, 2003.
LOMBARDINO J.G. , LOWE III J.A. The role of the medicinal chemist in drug discovery – then and now. Nature Reviews / Drug
Discovery 3 (10) 853-862, 2004.
LOPEZ M. et al. Microarrays y biochips de DNA. Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica,
2002. http://www.gen-es.org/12_publicaciones/docs/pub_67_d.pdf
LUCENTINI J. Antibiotics Arms Race heats up. The Scientist 17(29), 2003.
LYALL S. A country unveils its gene pool and debate flares. The New York Times 16/02/1999. http://www.nytimes.com
LYNCH M. God’s signature: DNA profiling, the new gold standard in forensic science. Endeavour 27:2, 93-97, 2003
MAGGON K. Biotech segment: moving ahead of pharma industry, 2005.
http://www.expresspharmapulse.com/20050428/edit02.shtml
_______ . Rise of Biologicals. Pharmapulse 28/04/2005. http://www.expresspharmapulse.com/20042005/editorial02.shtml
MAHER B.A. Vaccines on trial: HIV. The Scientist 18(11), 2004. http:// www.the-scientist.com/article/display/14734/
MANCINELLI L. et al. Pharmacogenomics: the promise of personalized medicine. AAPS Pharmsci 2000; 2(1) article 4.
http://www.pharmsci.org/ScientificJournals/pharmsci/journal/4.html
MARSHALL S., G.ARENAS. Antimicrobial peptides: a natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied
biotechnology. Electronic Journal of Biotechnology 6(2), 2003.
MARTINS MENCK C.F. A nova grande promessa da inovação em fármacos: RNA interferência indo do laboratório para a clínica.
Estudos Avançados 24(70), 2010.
MARX G. Cuba cutting “world class” trail in biotechnology research 19/12/2005. http://www.checkbiotech.org
MATTHIJS G. et al. Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. European Journal of human genetics 24: 2-5, 2016
McCOOK A. Hwang faked results, says panel. The Scientist 23/12/2005. http://www.the-scientist.com
McMICHAEL A.J. Paleoclimate and bubonic plague: a forewarning of future risk? BMC Biology 2010, 8: 108
MEDICAL RESEARCH COUNCIL. Stem cell therapy. http://www.mrc.ac.uk
MEDLINE PLUS http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/medlineplus.html
MEDSCAPE www.medscape.com
MEEUSEN E.N.T et al. Current status of veterinary vaccines. Clinical Microbiology Reviews 20:3, 2007.
MENCK C. A nova grande promessa da inovação em fármacos: RNA interferência saindo do laboratório para a clínica. Estudos
Avançados 24:70, 2010.
MERCK http://www.merck.com
MILLER STACY K. Therapeutic Mabs: saving lives and making millions. The Scientist 19(3):17, 2004
MINGER, S. Stem cell research-Ethics and geography. The Biochemist 28(1), 2006.
MIT Technology Review. http://www.technologyreview.com
MITRA J. Pharmaceutical industries: do they prefer treatment to cure? The Biochemist, 6, 2005.
MOHAN R. et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing
MOIR D.T. et al. Genomics and antimicrobial drug discovery. Genomics and antimicrobial drug Discovery 43 (3): 439-446, 1999.
MOLECULAR THERAPY ORGANIZATION. http://www.moleculartherapy.org
MOREAUX C. Autour des biotechnologies: des enjeux sociaux, économique, éthiques. Pharmaceutiques n 67, 1999.
MOREIRA-FILHO C. A., VERJOVSKI-ALMEIDA S. Genoma Clínico. Biotecnologia, Ciência e desenvolvimento 3(16), 2000.
MOREL C.M. Neglected diseases: under-funded research and inadequate health interventions. EMBO reports 4, 2003.
MORENS D.M., FAUCI A.S. Emerging Infectious Diseases: Threats to Human Health and Global Stability. PLoS Pathog 9(7), 2013
297
273.
274.
275.
276.
277.
http://bteduc.com
MORSE S.S.Factors in the Emergence of Infectious Diseases. Vol. 1, No. 1 — Emerging Infectious Diseases, 1995
MUOTRI A. R. Células-tronco pluripotentes e doenças neurológicas. Estudos Avançados 24:70, 2010.
NATIONAL CANCER INSTITUTE. Understanding cancer series. http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer
________________________ . Cancer vaccines. http://www.cancer.gov
NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Pharmacogenomics factsheet.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/pharm.html
278. NATIONAL CENTRE FOR HUMAN GENOME RESEARCH. http://www.nchgr.nih.gov
279. NATIONAL HEALTH SYSTEM (NHS). Genetics. http://www.nhsdirect.nhs.uk
280. NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE https://www.genome.gov
281. NATIONAL INSTITUTE FOR GENERAL MEDICAL SCIENCES (NIGMS). Medicines by design: The Biological Revolution in Pharmacology,
2003. http://www.nigms.nih.gov
282. NATIONAL INSTITUTE OF ALLERGY AND INFECTIOUS DISEASES. http://www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx
283. NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH. Stem cells information, 2005. http://stemcells.nih.gov/info/basics/
284. __________________________. Medicines by Design. http://www.publications.nigms.nih.gov/medbydesign
285. NATIONAL INSTITUTE ON DRUG ABUSE (NIDA). Nicotine vaccine shows promise for combating, 1999 tobacco addiction.
http://www.drugabuse.gov/MedAdv/99/NR-1217.html
286. NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM. http://www.marrow.org/PATIENT/match_process.html
287. NATURE EDUCATION http://www.nature.com/scitable
288. NATURE GENOME GATEWAY. http://www.nature.com/genomics/links/
289. NATURE REVIEWS. RNAi collection, 2003. http://www.nature.com
290. NATURE. http://www.nature.com
291. NEW SCIENTIST. http://www.newscientist.com
292. NORRGARD K. Gene Therapy. Nature Education 1(1), 2008. http://www.nature.com/scitable/topicpage/gene-therapy-760
293. NOVO NORDISK. http://www.novonordisk.com
294. NUFFIELD COUNCIL ON BIOETHICS. Emerging biotechnologies: technology, choice and the public good, London
2012.http://www.nuffieldbioethics.org
295. O’CONNOR T.P. e CRYSTAL R.G. Genetic medicines: treatment strategies for hereditary disorders. Nature Genetics Reviews 7, 2006
296. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE). http://wwwoie.int
297. OGIHARA N. Drawing out Drugs. Modern Drug Discovery, September 2003.
298. OKITA K. e YAMANAKA S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. PLoS ONE 6(7), 2011.
299. OLIVEIRA DINIZ M., SOUZA FERREIRA L.C. Biotecnologia aplicada ao desenvolvimento de vacinas. Estudos Avançados 24(70), 2010.
300. OLIVEIRA W. A pele multiplicada e guardada em um banco, 2002. http://galileu.globo.com/edic/91/saude1.htm
301. ONLINE MENDELIAN INHERITANCE IN MAN. McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore,
MD) and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, MD), 2000.
http://www.ncbi.nlm.nih/gov/omim
302. OPTIMAL RAPID MALARIA TEST. http://www.malariatest.com
303. ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL. Biotechnology in the diagnosis of infectious disease
http://www.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/GUIDE_3.2_BIOTECH_DIAG_INF_DIS.pdf
304. ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT (OECD).Tests génétiques: espoirs et enjeux.
http://www.oecd.org/document/12/ 0,2340,en_2649_201185_2013644_119690_1_1_1,00.html
305. PAGON R.A Genetic testing: the clinical interface of the Human Genome Project. An approach for biology teachers.
http://www.genetests.org
306. PAK J.W. Immunotherapy Cancer Treatment. http://www.cancersupportivecare.com/immunotherapy.htm
307. PALATNIK-DE-SOUSA CB, SILVA-ANTUNES I, MORGADO AA, MENZ I, PALATNIK M, LAVOR C. Decrease of the incidence of human and
canine visceral leishmaniasis after dog vaccination with Leishmune® in Brazilian endemic areas. Vaccine 27:3505-12, 2009.
308. PALESE P. Influenza: old and new threats. Nature Medicine 10(12), 2004
309. PALLARITO K. Fueling the fires of RNA interference. The Scientist 2004, 18(17):18.
310. PAN R. Caenorhabditis elegans: The Heavyweight Champ of Gene Knockout Technology. Bioteach Journal 2, 2004.
311. PARMIANI G. et al. Universal and Stemness-Related Tumor Antigens: Potential Use in Cancer Immunotherapy. Clin. Cancer Res.13,
2007.
312. PARRY J. Froms SARS to avian flu: vaccines on the scene. The Scientist 19 (5): 34, 2005.
313. PAVLOU A.K., REICHERT, J.M. Recombinant protein therapeutics – success rates, market trends and values to 2010. Nature
Biotechnology News 6/12/2004. http://www.nature.com/news/2004/041206/pf/nbt1204-1513_pf.html
314. PAYNE D., TOMASZ, A. Antimicrobials. The challenge of antibiotic resistant bacterial pathogens: the medical need, the market and the
prospects for new antimicrobial agents. Current Opinion in Microbiology 2004, 7: 435-438.
315. PECORINO L. Stem cells for cell-based therapies. http://actionbioscience.org/biotech/pecorino2.html
316. PELCZAR M. J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicações Vol 2. Segunda Edição. São Paulo, Makron Books, 1996.
317. PENA S.D. A vida na era pós-genômica (entrevista). Jornal da ANBio (1): 5, Rio de Janeiro, 2002.
318. PENCHASZADEH V.B. Del genoma a la salud. In ADN, 50 años no es nada. Buenos Aires, Siglo XXI Editores Argentina, 2004.
319. PFIZER. http://www.pfizer.com
320. PHARMACEUTICAL RESEARCH AND MANUFACTURERS OF AMERICA (PHRMA). http://www.phrma.org
321. PHARMACORAMA. http://www.pharmacorama.com
322. PHILIPS T. Genetically modified organisms (GMOs): transgenic crops and recombinant DNA technology. Nature Education 1:1, 2008
323. PHRMA http://www.phrma.org/
324. PINCOCK, S. Gene doping at Torino? The Scientist, 2006. http://www.the-scientist.com/news/display/23101/
325. PITOSSI F., PODHAJCER O. Terapia génica. In ADN: 50 años no es nada. Buenos Aires, Siglo XXI Editores Argentina, 2004.
326. PITTSBURG TISSUE ENGINEERING INITIATIVE http://www.ptei.org
327. PLAYFAIR J. Infection and Immunity. London, Oxford University Press, 1995.
328. POLAK J. e HENCH L. Gene Therapy Progress and Prospects in Tissue Engineering. Gene Therapy 12:1.725–1.733, 2005.
329. POLASTRO E. ,LITTLE A.O. The future of Biogenerics http://www.contractpharma.com/issues/2001-10/view_features/the-future-ofbiogenerics. Contract Pharma Magazine 22/08/2005
330. POLIO ERADICATION. http://www.polioeradication.org
331. POLITI P.M. Vacunas en la terapia del cáncer, 03/2005. http://www.cancerteam.com.ar/poli150.html
298
BIBLIOGRAFIA
332. POLLACK A. Europe rejects genetically engineered drug, 25/02/2006. http://www.checkbiotech.org
333. _______ . Drugmakers’ Fever for the Power of RNA Interference Has Cooled. The New York Times, 2011.
http://www.nytimes.com/2011/02/08/science/08rna.html?pagewanted=all
334. PRESTON R. The bioweaponeers. The New Yorker, 09/03/1998.
335. _______ . The demon in the freezer. The New Yorker, 12/07/1999.
336. PROJAN S.J. Why is big Pharma getting out of antibacterial drug Discovery? Current opinion in Microbiology 6:1-4, 2003.
337. PRWB PRESS RELEASES. http://www.prweb.com
338. PUBLIC BROADCASTING SERVICES (PBS). History of biowarfare. http://www.pbs.org/wgbh/nova/bioterror/hist_nf.html
339. ________________________________.Making vaccines. http://www.pbs.org/wgbh/nova/bioterror/vaccines.html/
340. RABINOVITCH L. Saúde pública: situação atual e necessidade de pesquisa de controle biológico de vetores de importância para a
saúde pública. http://www.biotecnologia.com.br/bio01/1hp_14.asp
341. RAMACHANDRA R. Vaccines: the path to immunity. Evolutions 13:1, 2009
342. RANDERSON J. Scientists raise spectre of gene-modified athletes. New Scientist 2001 http://www.newscientist.com
343. RASKIN I. et al. Trends in Biotechnology (20) 12: 522-531
344. RAW I. Entrevista. http://www.drauziovarella.com.br
345. REICHERT J., PAVLOU A. Monoclonal antibodies market. Nature Reviews/ Drug discovery, 3: 383, 2004
346. REINACH F. O dilema das vacinas transgênicas. O Estado de São Paulo 30/11/2005.
347. REVISTA CAPITAL. Bienvenidos al Bio-Boom. Reportajes y entrevistas. Revista Capital 282, 13 a 26 de agosto, 2010.
348. REVISTA FAPESP. http://revistapesquisa.fapesp.br/
349. REVISTA RIOPHARMA. http://www.crf-rj.org.br/revista/index.htm
350. REZAIE R. et al. Brazilian health biotech – fostering crosstalk between public and private sectors. Nature Biotechnology 26:6, 2008.
351. RIBEIRO E., RICCI, M. Insulina, classificação. http://www.hu.usp.br/farmacia/BOLETIM_4_1999.htm
352. RID A. et al. Placebo use in vaccine trials: recommendations of a WHO expert panel. Vaccine, 2014; 32(37): 4708-4712
353. RILEY D.E. DNA testing: An introduction for non-scientists / an illustrated explanation.
http://www.scientific.org/tutorials/articles/riley/riley.html
354. RIOS S. Crearon una piel artificial que libera proteínas terapéuticas. http://wwwprodiversitas.bioetica.org/prensa39.htm
355. ROCKOFF J.D. , LOFTUS P. US clears first copycat biotech Drug, jolting sector. The Wall Street Journal
http://www.wsj.com/articles/fda-approves-first-biosimilar-drug-1425651840, 6/03/2015
356. ROBERTS P. Gene therapy’s fall and rise (again). The Scientist 18(18):22, 2004.
357. ROBEY R. Stem cell trial to treat blindness launched in US. Bio News 20/06/2011. http://www.bionews.org.uk/page_97335.asp
358. ROBINSON R. RNAi Therapeutics: How Likely, How Soon? PLoSBiol 2(1), 2004.
359. ROCHA, K.B. et al. Novas drogas e patentes. 02/2003. http://www.abifarma.com.br
360. ROCHE. http://www.roche.com
361. ROSLIN INSTITUTE. http://www.roslin.ac.uk
362. RUBIN L. e HASTON K.M. Stem cell biology and drug discovery. BMC Biology 9:42, 2011.
363. RUFFIÉ J. Naissance de la médecine prédictive. Paris, Editions Odile Jacob, 1993.
364. RUMSEY D.H. , D.J. CIESIELSKI. New protocols in serologic testing: a review of techniques to meet today´s challenges.
Immunohematology 16:4, 2000.
365. SAMSON C. Systems biology in the pharmaceutical industry. The Biochemist 6, 2005.
366. SANDEL M.J. Embryo ethics- The moral logic of stem-cell research. N.Engl.J.Med. 351(3):207, 2004.
367. SANGER INSTITUTE. El projecto HapMap. http://www.sanger.ac.uk/Users/mdc/hapmapes.html
368. SASSON A. Medical Biotechnology: achievements, prospects and perceptions. Tokyo, United Nations University Press, 2005.
369. SCANLON K.J. Anti-Genes siRNA, Ribozymes and Antisense. Current Pharmaceutical Biotechnology 5(5), 2004.
370. SCHATZMAYR H.G. Vacinas no limiar do século. http://www.biotecnologia.com.br/bio02/hp_14.asp
371. SCHATZMAYR H.G. Vacinas no limiar do século. http://www.biotecnologia.com.br/bio02/hp_14.asp
372. SCHIPANI V. Normal today, cancer tomorrow. The Scientist, 06/01/2011. http://www.the-scientist.com/news/print/57907
373. SCHMID P. New anti-infective drugs. http://agriculture.de/acms1/cong6/ws5bdrugs.htm
374. SCHMIDT C.W. Therapeutic interference. Modern Drug Discovery, July 2003 37-42.
375. SCIENCE , DECISION. Líndustrie des biotechnologies: biotechnologies et diagnostic medical. http://www.science-decision.net
376. SCIDEVNET http://www.scidev.net/global/health/spotlight/integrating-modern-traditional-medicine.html
377. SCIENCE DAILY https://www.sciencedaily.com/
378. SCIENCE NEWS FOCUS. Polio: the final assault? Science 303(3):1.960-1.971, 2004.
379. SCIENTIFIC AMERICAN www.scientificamerican.com
380. SCITABLE / NATURE EDUCATION. http://www.nature.com/scitable
381. SCOTT A. The human genome on a chip. BioMedCentral 03/10/2003. http://www.biomedcentral.com/news/20031003/07
382. SCOTT C. Angola rejects GM food aid. 2/04/2004. http://www. checkbiotech.org
383. SCUDELLARI M. The iPSC-ESC gap-Human cells reprogrammed into multipotent stem cells display fundamental differences from true
embryonic stem cells. The Scientist, 02/02/2011. http://www.the-scientist.com/news/print/57971/
384. SELLERS L.J. The year 2001 will stand out in any historical accounting. Pharmaceutical Executive, 5/2002.
385. ________. The push for generics. Pharmaceutical Executive, 10/2002.
386. SHINE B. Nicotine vaccines moves toward clinical trials. http://www.drugabuse.gov/NIDA_Notes/NNVol15N5/Vaccine.html
387. SHONE C. Protection against covert releases: preparing for the worst. The Biochemist (4): 23-25, 2004.
388. SIMON E. Human gene therapy: genes without frontiers? The American Biology Teacher 64(4): 264-270, 2002.
389. SINGER. E. Investing in Banks of Stem Cells. Technology Review, 18/06/2010. http://www.technologyreview.com/biomedicine/25632
390. _______ . Cell Transplants for Macular Degeneration.Technology Review, 23/06/2010.
http://www.technologyreview.com/biomedicine/25647/
391. _______ . Making Genomics Routine in Cancer Care. Technology Review, 08/07/2010.
http://www.technologyreview.in/biomedicine/37993/?mod=more
392. _______ . Patients Facing Blindness to Test Therapy with Stem Cells. Technology Review, 03/05/2011.
www.technologyreview.com/biomedicine/27040
393. ________. The return of vaccines. The Scientist 19(22), 2005.
394. SIPP D. Why unproven, risky medical practices elude legal restrictions. Nature Reports Stem Cells.
http://www.nature.com/stemcells/index.html
299
395.
396.
397.
398.
399.
400.
401.
402.
403.
404.
405.
406.
407.
408.
409.
410.
411.
412.
413.
414.
415.
416.
417.
418.
419.
420.
421.
422.
423.
424.
425.
426.
427.
428.
429.
430.
431.
432.
433.
434.
435.
436.
437.
438.
439.
440.
441.
442.
443.
444.
445.
446.
447.
448.
http://bteduc.com
SMITH A. Screening for drug Discovery Nature 118453-459, 2002.
_______, RENAUD R.C. Vaccines of the future. Nature (2): 767-768, 2003
SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES (SBD). http://www.diabetes.org.br
SOCIEDADE INTERNACIONAL PARA A PESQUISA COM CÉLULAS-TRONCO. Manual do paciente sobre terapias com Células-tronco.
www.ISSCR.org
SOLÈRE B. Immunologie. Paris, Presses Universitaires de France, 1997.
SOMIA, N. e VERMA, I. Gene Therapy: Trials and tribulations. Nature Reviews Genetics 1:91-99, 2000. http://www.nature.com
SOMMER S. De la Cigueña a la Probeta. Buenos Aires, Editora Planeta, 1994.
SOMMER S. Genética, clonación y bioética. Buenos Aires, Editora Biblos, 1998.
SPAR D. The business of stem cells. N.Engl.J.Med 351(3):211-213, 2004. http://www.nejm.org
SPENGLER JR et al. Perspectives on West Africa Ebola virus disease outbreak, 2013–2016. Emerg Infect Dis. 2016
http://dx.doi.org/10.32032/eid2206.150021
STANGLE-CASTOR N. The past, present and future of genetic testing for disease, 2000. http://www.office.com
STATISTA – The statistic Portal http://www.statista.com/
STEENHUYSEN J. Banking stem cells could save Japan nuclear workers. Reuters, 15/4/2011.
http://www.msnbc.msn.com/id/42599855/ns/42777244
STEIN L.D. The case for cloud computing in genome informatics. Genome Biology 2010, 11:207
STIX G. What clones? http://www.sciam.com 24/12/2001
STRATTON M. et al. The cancer genome. Nature 458:724-729, 2009.
http://www.nature.com/nature/journal/v458/n7239/full/nature07943.html
STRAUSBERG R. et al. Oncogenomics and the development of new cancer therapies. Nature 429:469-474, 2004.
http://www.nature.com/nature/journal/v429/n6990/full/nature02627.html
STROKES T. Human experiment guidelines reviewed. The Scientist News 13/01/2006. http://www.thescientist.com/news/display/22946/
SUAVINHO FERRO E. Biotecnologia translacional: hemopressina e outros peptídeos intracelulares. Estudos avançados 24(70), 2010.
SURADHAT S. Biotechnology in veterinary vaccine development. http://www.micro.vet.chula.ac.th/.../51-biotechnology-inveterinary-vaccine-development
TECHNOLOGY REVIEW. http://www.technologyreview.com/
TEIXEIRA D. Segundo Movimento. Terra 19/11/03. http://www.terra.com.br/istoedinheiro?/325/negocios/325_segundo
TEMPLE L. et al .Defining disease in the genomic era. Science 293: 807-808, 2001.
THE BIOCHEMICAL SOCIETY. Gene Therapy. The Biochemist 30(3), 2008
THE CITY OF NEW YORK, Department of Health, Tuberculosis Control Program. Diagnosis: rapid diagnostic tests for tuberculosis.
http://www.nyc.gov/health
THE GLOBAL ALLIANCE FOR VACCINES AND IMMUNIZATION (GAVI) http://www.vaccinealliance.org
THE INSTITUTE FOR GENOMIC RESEARCH (TIGR) http://www.tigr.org
THE INTERNATIONAL DEVELOPMENT RESEARCH CENTRE (IDRC). Assessing the benefits of bioprospecting in Latin America.
http://web.idrc.ca
THE INTERNATIONAL HAP MAP CONSORTIUM. A haplotype map of the human genome. Nature 437 (27): 1299-1320, 2005.
THE INTERNET PATHOLOGY LABORATORY FOR MEDICAL EDUCATION. Immunology Course Outline, Florida State University College of
Medicine. http://www.bibl.liu.se/etj2/webpath/immunol/immunidx.htm
THE NEW YORK TIMES www.nytimes.com
THE SCIENTIST. http://www.the-scientist.com
THE TISSUE ENGINEERING SHOW. http://ptei-brains.cfa.cmu.edu/grad/index.php
THE WELLCOME TRUST SANGER INSTITUTE. http://www.sanger.ac.uk
THE WELLCOME TRUST. http://www.wellcome.ac.uk
THE WHITAKER FOUNDATION. Tissue engineering. Annual report, 1995. http://www.whitaker.org/95_annual_report/tissue 95.html
THOMAS C. et al. Progress and Problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics 4, 2003.
THOMSON C.J. et al. Antibacterial research and development in the 21st century – an industrial perspective of the challenges. Current
Opinion in Microbiology 7: 445-450, 2004.
TREJO ESTRADA S.R. e RAMÍREZ LÓPEZ C. Situación de la Biotecnología en México y su factibilidad de desarrollo. Resumen Ejecutivo,
parte 2. Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada – IPN Unidad Tlaxcala, México.
http://www.economia.gob.mx/swb/es/economia/Biotecnologia
TREJO ESTRADA S.R. et al. Situación de la Biotecnología en el mundo. Resumen Ejecutivo, parte 1. Centro de Investigación en
Biotecnología Aplicada – IPN Unidad Tlaxcala, México. http://www.economia.gob.mx/swb/es/economia/Biotecnologia
TULP M., BOHLIN L. Unconventional natural sources for future drug discovery. DDT 9 (10), 2004.
TYER, D. Sanofi to research new types of antibiotics. Inpharm news 07/06/2011. http://www.inpharm.com/news/161747/sanofi-rib-xpharmaceuticals-antibiotics-research
U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA). Cellular and gene therapy. http://www.fda.gov
UK BIOCHEMISTRY SOCIETY. Biological Welfare. The Biochemist Vol. 26 Nº 2 April 2004.
UNICEF. Communiqué de presse: LÚNICEF affirme que lápprovisionnement em vaccins de lénfance est menacé.
http://www.unicef.org/french/newsline/pr/2002/02pr15capetownfr.htm
UNIVERSITY OF ROCHESTER. New “DNA chip” rapidly detects, identifies dangerous pathogens. Press releases.
http://www.rochester.edu.
UNIVERSITY OF WISCONSIN STEM CELL, REGENERATIVE MEDICINE CENTER. http://stemcells.wisc.edu/
VAISHNAW A. et al. A status report on RNAi therapeutics. Silence 1(14), 2010.
VASILEVA A. e JESSBERGER R. Precise hit: Adeno-Associated virus in gene targeting. Nature Reviews Microbiology 3:837-847, 2005.
VECTOR-BORNE DISEASES: Understanding the Environmental, Human Health, and Ecological Connections, Workshop Summary
http://www.nap.edu/catalog/11950.html
VEIGA JUNIOR V.F. et al. Plantas medicinais: cura segura? Quim. Nova Vol. 28(3):519-528,.2005.
VEIGA PEREIRA L. Clonagem: Fatos e Mitos. São Paulo, Editora Moderna, 2002.
VERITAS MEDICINE. Diabetes current tratment: overview. http://www.veritasmedicine.com
VETERINÁRIA ATUAL. http://www.veterinaria-atual.pt/homepage.aspx?menuid=1
300
BIBLIOGRAFIA
449. VEZINA, K. First Fully Synthetic Organ Transplant Saves Cancer Patient. Technology Reviews 8/7/2011.
http://www.technologyreview.com/biomedicine/38003/
450. VOELTER-MAHLKNECHT S., MAHLKNECHT, U. Darwinism and pharmacogenomics: from “one treatment fits all” to “selection of the
richest”. Trends in Molecular Medicine 10(4), 2004.
451. WADE N. Stem Cells May Be Key to Cancer. The New York Times, 21/02/2006.
http://www.newyorktimes.comwww.nytimes.com/2006/02/21/health/21canc.html
452. WALDVOGEL F.A. Infectious diseases in the 21st century: old challenges and new opportunities. Int J Infect Dis. 2004 Jan;8(1):5-12.
453. WALKER M. Is modifying genes playing God? 18/03/2004. http://www.checkbiotech.org
454. WALLIS G.The genetic basis of human disease. Manchester, The Biochemical Society, 1999.
455. WARNER S. The tribulations of clinical trials. The Scientist 18(8):20, 2004
456. WASI S. RNA interference: the next genetics revolution? Understanding the RNAissance. Nature, 05/2003.
457. WATERS R. Stem Cells From Own Eyes Restore Vision to Blinded Patients, Study Shows. Bloomerg 18/06/2010.
http://www.bloomberg.com/news/2010-06-18/blinded-patients-gain-sight-with-stem-cells-implanted-from-their-own-eyes.html
458. WEINER D.B., R.C.KENNEDY. Genetic Vaccines. Scientific American 799, 1999.
459. WELHAM M. J. Embryonic stem cells - Past, present and future. The Biochemist 28:1, 2006.
460. WHITEHEAD K. et al. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery 8:129-138, 2009.
461. WILLERTH S. M. e SAKIYAMA-ELBERT S.E. Combining stem cells and biometrial scaffolds for constructing tissues and cell delivery.
Stembook, 2008. http://www.stembook.org/node/450
462. WILLIAMS S. Young again - Niche cells can reverse the aging of stem cells. HHMI Bulletin, 05/2010.
463. WILLIS R.C. What is phase zero? The Scientist 19(20):38, 2005.
464. WINKLER K.E. Killing the messenger. Nature reviews /Drug Discovery 3:823-824, 2004.
465. WONG D. J. e CHANG H. Y. Skin tissue engineering. Stembook, 2009. http://www.stembook.org/node/582
466. WORLD HEALTH ORGANISATION (WHO). http://www.who.int
467. WULFKUHLE J et al. Proteomic applications for the early detection of cancer. Nature Reviews (3): 267-275, 2003.
468. YARRANTON G. The dawn of molecular medicine. MRC news 76, 1997.
469. YEE J. Turning Somatic Cells into Pluripotencial Stem Cells. Nature Education 3(9):25, 2010.
470. YOURGENOME http://www.yourgenome.org/
471. ZATZ M. Contribuições da Biologia Molecular para a compreensão e prevenção dos problemas genéticos. Ciência e Saúde Coletiva 7:1,
2002.
472. ZATZ M. O que é célula-tronco? Notícias, 2001. http://anbio.org.br/noticias/celula-tronco
473. ZIELINSKA, E. Building a better mouse. The Scientist 24(4):34, 2010.
474. ZILLI A Terapia Gênica. http://www.cib.org.br
301
Maria Antonia Malajovich é bióloga, com Licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade de Buenos Aires,
mestrado e doutorado em Genética pela UFRJ (Brasil). Foi bolsista da CAPES e
CNPq (Brasil), do Ministério das Relações Exteriores da França, da World ORT e
da Universidade das Nações Unidas (UNU-BIOLAC). Exerceu a docência na
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) e na Universidade ORT
Uruguay, onde é professora visitante.
Entre 1990 e 2015, desempenhou as funções de Professora e Coordenadora de
Ciências e de Biotecnologia no Instituto de Tecnologia ORT do Rio de Janeiro. Ao
longo de mais de vinte e cinco anos dedicados ao ensino científico e tecnológico,
ministrou cursos de Biotecnologia em vários países latino-americanos
(Argentina, Brasil, Peru, Uruguai e Venezuela).
Atua na área de Educação Científica e Tecnológica, com ênfase especial em Biotecnologia, sendo autora do
livro Biotecnologia publicado no Brasil (Axcell Books do Brasil, 2004) e na Argentina (Universidad de Quilmes
Editorial, 2006, 2012), de vários artigos e manuais de atividades práticas, do site Biotecnologia: Ensino e Divulgação e
de sua versão em espanhol.
Em 2008, recebeu o prêmio Beatrice Wand-Polak, outorgado por World ORT aos Professores que se destacam no
desenvolvimento de novos programas, materiais e tecnologias educacionais. Em 2011, foi homenageada pelo Dia
do Biólogo, na Assembleia Legislativa do Rio de Janeiro, em reconhecimento à sua dedicação em defesa da
Biodiversidade e do Meio Ambiente. Integra a direção científica da Associação Nacional de Biossegurança (ANBIO).
É membro da Comissão Técnica de Biotecnologia do Conselho Federal de Biologia (CFBio). Atualmente é Diretora
Científica na empresa ACTE- Treinamento e Desenvolvimento.

capítulo 1 - BioTecnologia

Transcrição

Documentos relacionados

Biotecnologia 2011 - BioTecnologia

Gabarito do volume III

Biologia

gabarito - Colégio Protágoras

Inovação e Regulação na Biotecnologia

- GEEIN - Grupo de Estudos em Economia Industrial

Curso completo em PDF

Câncer

Apresentação do PowerPoint

Aviso de Leilão – DOU - Prefeitura Municipal de Marituba

Nome do exame: Ataxia de Friedreich

Slides referente a ORIGEM DA VIDA

Prova - IESAM

30/08 Diárias dos Servidores, ref. dia 21/07/2

relatório de sustentabilidade 2015

diarias 05-2016 - Prefeitura Municipal de Faxinal do Soturno

TRICHOMONAS Taxonomia Família Trichomonadidae Subfamília

Propriedade Intelectual e Biotecnologia

informativo dcad 2016_1 final - Pró

Newsletter Life Science

Microbiologia dos Alimentos - A UFSCar

Clinical Case Studies Estudos de Casos Cl