Biodiversidade de espécies toxigênicas de Aspergillus em

Marta H. Taniwaki
Espécies Fúngicas nos Alimentos
Brasil tem uma grande biodiversidade de fungos.
Espécies fúngicas mais comuns nos alimentos:
Aspergillus
Penicillium
Fusarium
Alternaria
Principais micotoxinas e fungos nos
alimentos brasileiros
Aflatoxinas: espécies de Aspergillus section Flavi
Ocratoxina A: espécies de A. section Circumdati e A.
section Nigri
Fumonisinas: espécies de Fusarium, A.niger, A.
welwitschiae
Desoxinivalenol: espécies de Fusarium
Classificação das micotoxinas
Cancerígenas: aflatoxinas, esterigmatocistina, ácido
ciclopiazônico
Mutagênica: aflatoxinas
Hepatotóxicas: aflatoxinas
Nefrotóxicas: ocratoxina A
Toxidez das micotoxinas
Substâncias
tóxicas
DL 50
(mg/kg)
Animal
(via oral)
Aflatoxina B1
0,56
Rato
Patulina
700
Camundongo
Ocratoxina A
3,0
Marreco
36
Rato
500
Rato
Cianeto de
potássio
Arseniato de
chumbo
Morfologia
Fisiologia
Extrolitos
Espécies
DNA
Separação em gênero e/ou espécies:
Morfologia: cor das colônias, tamanho e formato dos conídios,
presença de esclerócios, caracteres microscópicos
Fisiologia: temperatura de crescimento, atividade de água, resistência
a compostos químicos
Quimio-taxonomia: produção de extrolitos (piranonigrina, nafto
pironas, asperazina, ácido secalônico, antifumicina, aflavininas,
micotoxinas e outros)
Técnicas moleculares (sequências do DNA, região ITS, b – tubulina,
calmodulina, métodos de fingerprints e outros)
Projetos de Pesquisa- ITAL
Minas
Gerais
Amendoim
Café
Cacau
Castanha doBrasil
Frutas secas
65
60
23
53
14 10 7 5
18
4
3 3
2 2
167
2081
Aspergillus sp.
Eurotium sp.
Penicillium sp.
Fusarium sp.
Hifomiceto
Paecilomyces sp.
Mycelia sterilia
Dematiaceo
Phoma sp.
Alternaria sp.
Rhizopus sp.
Syncephalastrum sp.
Absidia sp.
Cladosporium sp.
Chaetomium sp.
Nigrosposra sp.
Aspergillus section Flavi
784
1276
Aspergillus section Nigri
Others
456
21
Aspergillus section Circumdati
861
Total dos isolados
900
800
700
469
600
500
396
295
400
300
200
54
100
0
Brazil nut
Cocoa
Coffee
Peanuts
Dry fruits
Aspergillus section Nigri
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Brazil nut
Cocoa
Coffee
Peanuts
Dry fruits
Aspergillus section Flavi
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Brazil nut
Cocoa
Coffee
Peanuts
Dry fruits
Aspergillus section Circumdati
25
20
15
10
5
0
Brazil nut
Cocoa
Coffee
Peanuts
Dry fruits
2
2
16
15
14
2
7 7 642
9
10
2 1
1
11
172
18
29
51
156
Aspergillus flavus
A. section Nigri
A. section Flavi
Fusarium sp.
Mycelia sterilia
Hifomiceto
Paecilomyces sp.
Eurotium chevalieri
Phoma sp.
Dematiaceo
Alternaria sp.
Aspergillus parasiticus
Aspergillus tamarii
Rhizopus sp.
Absidia sp.
Chaetomium sp.
Penicillim sp.
Aspergillus caelatus
A. niger
Cladosporium sp.
Nigrosposra sp.
23
13
10
98
1 1 1
1
2
1 11
7 44 3 2 2
Aspergillus tamarii
Aspergillus flavus
149
Eurotium chevalieri
Aspergillus section Flavi
Aspergillus section Nigri
35
Penicillium roqueforti
Hifomiceto
Eurotium rubrum
Paecilomyces sp.
Penicillium citrinum
Eurotium sp.
71
Penicillium sp.
82
Aspergillus niger
Aspergillus caelatus
Aspergillus section Nigri
Fusarium sp.
Hifomiceto
Aspergillus niger
Eurotium sp.
Aspergillus section Circundati
Eurotium rubrum
Penicillium brevicompactum
Aspergillus section Flavi
Aspergillus westerdijkiae
Penicillium sp.
Cladosporium sp.
Dematiaceo
Eurotium chevalieri
Aspergillus fumigatus
Aspergillus ochraceus
Eurotium herariorum
Aspergillus caelatus
Aspergillus carbonarius
Aspergillus tamarii
Penicillium paxilli
17 10
85
63
8
4
4
1 11 1 1 1 1
1
1
Aspergillus tamarii
255
Aspergillus caelatus
Aspergillus section Nigri
Aspergillus section Flavi
Aspergillus flavus
Aspergillus nomius
154
Eurotium sp.
Penicillium sp.
Eurotium chevalieri
Penicillium citrinum
221
164
Syncephalastrum sp.
Absidia sp.
Aspergillus clavatus
3
2
2
1
Aspergillus section Nigri
Eurotium sp.
Hifomiceto
Aspergillus section Flavi
Dematiaceo
50
600
570
Afla 500
Afla B+
411
Afla B+G+
400
OTA OTA +
300
204
200
100
148
10693
67
76
61
24
157
4
20
44
6
8 6 0
2 2 0
24
0
15
0
0 0 0
23
0
Castanha do
Brasil
Cacau
Café
Tâmara
Amendoim
Uva passa
3
A. niger
A. carbonarius
A. luchuensis
A. ibericus
A. aculeatus
A. tubingensis
A. westerdijkiae
A. ochraceus
A. melleus
A. flavus
A. nomius
A. bombycis
A. bertholletius
A. caelatus
A.pseudotamarii
A. parasiticus
A. tamarii
A
E
B
F
C
G
D
H
Aspergillus caelatus. (A) CYA 25°C, (B) CYA 25°C reverse, (C) MEA 25°C, (D) MEA 25°C
reverse, (E) CYA 37°C, (F) CYA 37°C reverse, (G) AFPA 25°C, (H) AFPA 25°C reverse.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Aspergillus flavus. (A) CYA 25°C, (B) CYA 25°C reverse, (C) MEA 25°C, (D) MEA
25°C reverse, (E) CYA 37°C, (F) CYA 37°C reverse, (G) CYA 42°C, (H) CYA 42°C
reverse, (I) AFPA 25°C, (J) AFPA 25°C reverse.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Aspergillus parasiticus. (A) CYA 25°C, (B) CYA 25°C reverse, (C) MEA 25°C, (D) MEA
25°C reverse, (E) CYA 37°C, (F) CYA 37°C reverse, (G) CYA 42°C, (H) CYA 42°C
reverse, (I) AFPA 25°C, (J) AFPA 25°C reverse.
Nº ITAL
Section
Localização
Substrato
466; 479
Nigri
São Paulo – BR
Café
325
Nigri
Espanha
Frutas Secas
461
Nigri
Argentina
Frutas Secas
1248
Nigri
Bahia – BR
Cacau
166; 457; 460; 517
Nigri
Argentina
Frutas Secas
263; 277; 313; 319; 326; 503
Nigri
Espanha
Frutas Secas
403
Nigri
EUA
Frutas Secas
501
Nigri
México
Frutas Secas
353; 354; 356; 363
Nigri
Turquia
Frutas Secas
264; 1001; 1250; 1633
Nigri
Bahia – BR
Cacau
594*; 596*; 671; 672; 687; 714
Nigri
Amazonas – BR
Castanha do Brasil
160
Nigri
Amazonas – BR
Castanha do Brasil
877; 922; 1280; 1326
Nigri
Para – BR
Castanha do Brasil
1529
Nigri
Bahia – BR
Cacau
1209; 1212
Nigri
Para – BR
Castanha do Brasil
1509; 1531
Nigri
Bahia – BR
Cacau
365
Nigri
Para – BR
Castanha do Brasil
392; 791; 1150; 1160; 1161; 1375; 2153
Nigri
Bahia – BR
Cacau
526
Nigri
Argentina
Frutas Secas
1214; 1297; 1327; 1328; 1329; 1334; 1460; 1461
Nigri
Para – BR
Castanha do Brasil
1336
Nigri
Para – BR
Castanha do Brasil
Identificação por
Metabólitos
Resultado dos Principais Extrólitos Extraídos
A.foetidus
Positivo: Asparizina; Piranonigrina A; Nafto-γPirononas
e Antafumionisinas; Negativo: Ocratoxina A.
A. tubingensis
Positivo: Funalenona; Piranonigrina A; CAR;
Nafto-γ- Pirononas; Variável: Ocratoxina A;
Asparazina Tensidol B; NOE; DERH; Malformina.
A.acidus
Positivo: Tensidol B; Piranonigrina A; Nafto-γPirononas; Funalenona; Váriavel: DERH;
Negativo: Ocratoxina A.
A.aculeatinus
Positivo: Neoxalina; Ácido Secalonico D e F e
Aculeacinas; Negativo: Ocratoxina A.
A.aculeatus
Positivo: Glabrinol; Neoxalina; Ácido Secalônico D
e F; Negativo: Ocratoxina A.
A.carbonarius
Positivo: CAR; DERH; Xantomegnina;
Piranonigrina A; Nafto-γ- Pirononas e Ocratoxina
A; Variável: NOE.
A.ibericus
Positivo: Funalenona; Asparazina; Piranonigrina A
e Nafto-γ- Pirononas; Negativo: Ocratoxina A.
A.neoniger
Positivo: Funalenona; Kotanina; Tensidol B;
Piranonigrina A e Ocratoxina A.
Nº ITAL
Section
Localização
Substrato
177; 180; 424; 425; 426; 429; 431; 437;
447
Nigri
Argentina
Frutas Secas
152
Nigri
Chile
Frutas Secas
318; 331
Nigri
Espanha
Frutas Secas
402
Nigri
EUA
Frutas Secas
500
Nigri
México
Frutas Secas
490; 491; 498
Nigri
Tunísia
Frutas Secas
246; 249; 250; 253
Nigri
Turquia
Frutas Secas
632; 777; 1113; 1121; 1240; 1242; 1244;
1246; 1469
Nigri
Bahia – BR
Cacau
157; 159*; 162*; 163*; 237; 238; 1001
Nigri
Amazonas – BR
Castanha do Brasil
911; 937A; 1206; 1276; 1278; 1330; 1331;
1332; 1333; 1335; 1337; 1338; 1339; 1340;
1341; 1342; 1344; 1345 até 1371; 1382;
1398; 1399; 1400; 1402; 1403; 1459; 1462
Nigri
Para – BR
Castanha do Brasil
118
Circumdati
São Paulo – BR
Café
130; 134
Circumdati
Minas Gerais – BR
Café
93; 94; 1524
Circumdati
Bahia – BR
Cacau
70; 72; 74
Circumdati
São Paulo – BR
Café
116; 124
Circumdati
Minas Gerais – BR
Café
27B; 151; 201A; 547; 549; 1673
Circumdati
Bahia – BR
Cacau
150; 201B
Circumdati
Bahia - BR
Cacau
262; 7155; 7157; 7179; 7180; 7189; 7191
até 7193; 7195; 7196; 7197
Flavi
Amazonas – BR
Castanha do Brasil
1784; 1875
Flavi
Para – BR
Castanha do Brasil
246
Flavi
Amazonas – BR
Castanha do Brasil
Identificação por
Metabólitos
Resultado dos Principais Extrólitos Extraídos
A.niger
Positivo: Tensidol B; Piranonigrina A; Nafto-γPirononas; Funalenona e DEDO; Variável: NOE;
Orlandina; Ocratoxina A; Kotanina; DERH e CAR.
A.westerdijkiae
Positivo: Ácido Penicílico; Xantomegninas;
Viomelleína; Aspergamidas A e B;
Vioxantinas; Melleína; Ocratoxina A e
Circundatinas A e B; Variável: Aspirona.
A. melleus
Positivo: Xantomegninas; Viomelleína; Aspergamida A
; Vioxantina, Ost e Melleína; Variável: Ocratoxina A;
Ácido Aspergílico; Aspergamida B.
A. ochraceus
Positivo: Xantomegninas; Viomelleina; Aspergamida
A; Vioxantina; An-Aspergamidas e Melleína; Variável:
Ocratoxina A; Aspergamida B e Aspirona.
A.bertholletius
Positivo: Ácido Kójico; Ácido Ciclopiazonico; Negativo:
Aflatoxinas.
A.bombycis
Positivo: Ácido Kójico; Aflatoxina B1 e G1; Acido
Tenuazônico; Acido Aspergílico.
Berthollethia excelsa
Toxigenic species
Nº of isolates
% aflatoxin
producers
Variation
(%)
Fungi in general
8,016
0 – 100
A. flavus
1,212
46 (B)
0 – 100
A. nomius
1,235
100 (B + G)
0 – 96
A. arachidicola
5
100 (B +G)
0-2
A. bombycis
2
100 (B +G)
0-2
A. caelatus
810
0
0 – 100
A. pseudotamarii
10
100 (B1)
0-4
Other Aspergillus section Flavi
51
50 (B +G , B)
0-8
Calderari, T.O.; Iamanaka, B.T.; Frisvad, J.C.; Pitt, J.I.; Sartori, D.; Pereira, J.L.; Fungaro, M.H.P. Taniwaki, M.H. 2013. The
biodiversity of Aspergillus section Flavi in brazil nuts: from rainforest to consumer. International Journal of Food
Microbiology, 160: 267-272.
Toxigenic species
Extrolites other than aflatoxins
GenBank Number
Flavimin, cyclopiazonic acid (CPA), paspaline, a
versicolorin, O-methylsterigmatocystin
JX157586
Aflavinin, kojic acid
JX157589
Aflavinin, kojic acid, mevinolin, miyakamides,
tenuazonic acid
JX157587
A. bombycis
Not analysed
JX157588
A. caelatus
Kojic acid, tenuazonic acid, specific alkaloids (same
as in A. pseudotamarii)
JX157591
A. pseudotamarii
Aflavinin, kojic acid, specific alkaloids (same as in A.
caelatus)
JX157592
A. flavus
A. nomius
A. arachidicola
Nº de amostras/
nº de amostras
positivas
Média de
aflatoxinas
(µg/kg)
Nível de
aflatoxinas
(µg/kg)
Floresta Amazônica
56/8
0.70
<LOD – 18.10
Processamento antes da seleção
21/8
8.04
<LOD – 80.63
Processamento após seleção
19/8
0.14
<LOD – 0.91
Mercados (Região Amazônica)
53/15
6.26
<LOD – 151.14
Supermercados (São Paulo)
12/9
0.24
<LOD – 0.98
Origem
Um total de 407 amostras foram analisadas
870 isolados pertencentes à 3 espécies de Aspergillus
A. niger foi o fungo mais comum (550 isolados) embora somente
3% foram produtores de OTA
A. westerdijkiae também foi comum (270 isolados); 75% foram
toxigênicos
A. carbonarius não foi comum (54 isolados); 75% foram
toxigênicos.
Taniwaki, M.H.; Pitt, J.I.; Teixeira, A.A. &
Iamanaka, B.T. 2003. The source of ochratoxin
A in Brazilian coffee and its formation in
relation to processing methods. International
Journal of Food Microbiology, 82 (2): 173-179.
Níveis de ocratoxina A no café em vários estádios de produção
Nível
(ug/kg)
Estádio de produção
(Nº de amostras)
Média
Cerejas do pé (6)
< 0,2
< 0,2 – 0,4
Passas do pé (16)
< 0,2
< 0,2
Secos do solo (25)
2,0
< 0,2 – 37
Terreiro (40)
2,1
< 0,2 – 48
Tulha (48)
3,4
< 0,2 – 109
Frequência de ocorrência
Fermentacao
Secagem
80
70
60
%
50
40
30
20
10
0
Espécie
Estocagem
Aspergillus sp.
№ of isolates
Toxin production
A. carbonarius (OTA)
97
100 %
A. niger
208
4.8 %
A. ochraceus e espécies
relacionadas (OTA)
10
100 %
A. flavus (AFB)
604
64 %
A. parasiticus (AFBG)
212
100 %
3
100 %
A. nomius (AFBG)
Copetti, M.V.; Iamanaka, B.T.; Pereira, J.L.; Fungaro, M.H. & Taniwaki, M.H. 2011. Aflatoxigenic fungi
and aflatoxin in cocoa. International Journal of Food Microbiology, 148: 141-144.
Copetti, M.V.; Pereira, J.L.; Iamanaka, B.T.; Pitt, J.I. & Taniwaki, M.H. 2010. Ochratoxigenic fungi and
ochratoxin a in cocoa during farm processing. International Journal of Food Microbiology, 143: 67-70.
Stage
(+/total)
Before
fermentation(0/25)
Fermentation
(14/51)
Drying
(45/85)
Storage
(38/65)
<LOD
(<LOD)
0.05
(< LOD – 1.71)
0.26
(<LOD – 10.98)
0.25
(<LOD – 10.10)
0.99
0.99
0.81
0.67
A. carbonarius
-
2%
6%
9%
A. niger group
A. ochraceus
group
-
4%
17%
26%
-
-
6%
3%
OTA average
µg/kg
(range)
aw
LOD (Limit of detection of the method) = 0.01 µg/kg
Stage
(+/total)
Before fermentation
(0/25)
Fermentation
(2/51)
Drying
(11/85)
Storage
(3/65)
<LOD
(<LOD)
<LOD
(< LOD – 0.2)
0.12
(<LOD – 7.43)
<LOD
(<LOD – 0.14)
0.99
0.99
0.81
0.67
A. flavus
A. nomius
-
4%
-
38%
5%
32%
-
A.parasiticus
-
2%
24%
14%
Afla average
µg/kg
(range)
aw
LOD (Limit of detection of the method) = 0.01 µg/kg
Chocolate
(+/total)
Pó
(25/25)
Meio amargo
(25/25)
Ao leite
(25/25)
Branco
(23/25)
OTA µg/Kg
0,39
(0,03-0,92)
0,34
(0,09-0,87)
0,15
(0,08-0,45)
0,03
(<LOD – 0,05)
0,51
0,41
0,40
0,44
aw
LOD (Limite de detecção do método) = 0.01 µg/kg
Chocolate
(+/total)
Pó
(24/25)
Meio amargo
(25/25)
Ao leite
(18/25)
Branco
(5/25)
Afla µg/Kg
0,53
(<LOD-1,70)
0,34
(0,04-1,28)
0,08
(<LOD-0,32)
<LOD
(<LOD – 0,1)
0,51
0,41
0,40
0,44
aw
LOD (Limite de detecção do método) = 0.01 µg/kg
119 amostras (origem: Turquia, EUA, Irã, Argentina, Chile, Espanha)
• Uvas passas escuras
• Uvas passas claras
• Tâmaras
• Figo seco
• Ameixa seca
• Damasco
Uva passa escura
“O que os olhos não vêem o coração não sente”
Tâmaras
Dried fruits
Uvas passas escuras
(Irã, Argentina)
Uvas passas claras
(Irã, Argentina)
Ameixas secas
(Chile, Argentina)
Figos secos (Turquia)
Tamaras (Espanha,
Turquia)
A. ochraceus
A. niger
A. carbonarius
A. flavus
11(8)
269 (19)
5 (2)
-
-
5 (0)
-
9 (9)
5(5)
84 (27)
-
-
-
43 (11)
-
-
12(1)
95 (68)
-
-
Iamanaka, B.T.; Menezes, H.C.; Vicente, E.; Leite, R.S.F. & Taniwaki, M.H. 2007. Aflatoxigenic fungi and
aflatoxins occurrence in sultanas and dried figs commercialized in Brazil. Food Control, 18: 454-457
OTA
(ng/g)
Uva passa
escura (Irã,
Argentina)
Uva passa
clara (Irã,
Argentina)
Figo
(Turquia)
Tâmara
(Espanha,
Tunísia)
Ameixa
(Chile,
Argentina)
<0,13
1
10
1
18
19
0,13 - 5,0
11
10
13
2
1
5,1 - 10,0
4
-
2
-
-
10,1 - 20,0
3
2
-
-
20,1
-
-
-
-
>30,0 - 30,0
1
1
-
-
Média (ng/g)
5,7
5,4
<0,13
<0,13
Iamanaka et al., 2005
0,5
Amazonas: 2368 isolados
Pará: 3985 isolados
Rondônia: 214 isolados
Bahia: 1587 isolados
Mato Grosso: 10 isolados
Paraná: 70 isolados
Minas Gerais: 250 isolados
São Paulo: 1107 isolados
Turquia: 78 isolates
EUA: 13 isolates
Espanha: 93 isolates
Tunísia: 9 isolates
México: 3 isolates
Irã: 41 isolates
Brasil: 9591 isolates
Chile: 72 isolates
Argentina: 148 isolates
Espécies toxigênicas de Aspergillus foram encontradas em todos os
alimentos analisados.
A. section Nigri foi comum em: café, amendoim, castanha do brasil e
frutas secas.
A. section Flavi foi comum em: amendoim, castanha do brasil e cacau.
A. section Circumdati foi comum em: café.
Técnicas fisiológicas, morfológicas, moleculares e produção de metabólitos
foram efetivas para a identificação polifásica.
Discussion paper on ochratoxin A in coffee
Code of practice to prevent and reduce OTA in coffee
Discussion paper on ochratoxin A in cocoa
Discussion paper on aflatoxins in brazil nuts
Maximum levels of aflatoxins in brazil nuts
Maximum levels of aflatoxins in dried figs
Code of practice to prevent and reduce OTA in cocoa
Beatriz Iamanaka - ITAL
Thaiane Calderari – ITAL
Maristela Nascimento - ITAL
Larissa Ferranti – ITAL
Aline L. Souza – ITAL
Camila Possari – ITAL
Ligia Martins – ITAL
Aline von Hertwig – ITAL
Rachel Bertoldo - ITAL
John I. Pitt – CSIRO - Australia
Jens C. Frisvad – DTU – Denmark
Maria Helena P. Fungaro - UEL
Marina Copetti – UFSM