Avaliação Prospectiva das Concentrações de
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Avaliação Prospectiva das Concentrações de
Clinical Chemistry 59:3 Endocrinologia e Metabolismo 557–565 (2013) Prospective Evaluation of B-type Natriuretic Peptide Concentrations and the Risk of Type 2 Diabetes in Women Brendan M. Everett,1,2* Nancy R. Cook,1 Daniel I. Chasman,1 Maria C. Magnone,3 Maria Bobadilla,3 Nader Rifai,4 Paul M Ridker,1,2 and Aruna D. Pradhan1,5 Avaliação Prospectiva das Concentrações de Peptídeos Natriuréticos do tipo B e o Risco de Diabetes Tipo 2 nas Mulheres Brendan M. Everett1,2,*, Nancy R. Cook1, Daniel I. Chasman1, Maria C. Magnone3, Maria Bobadilla3, Nader Rifai4, Paul M Ridker1,2 and Aruna D. Pradhan1,5 1 Division of Preventive Medicine, 2 Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA; 3 F. Hoffman-La Roche, Pharma, Metabolic and Vascular Diseases, Basel, Switzerland; 4 Division of Laboratory Medicine, Department of Pathology, Children's Hospital, Boston, MA; 5 Division of Cardiovascular Medicine, VA Boston Medical Center, Boston, MA. * Envie correspondência para esse autor para: Brendan M. Everett, Division of Preventive Medicine, Brigham and Women's Hospital, 900 Commonwealth Ave., Boston, MA 02115. Fax 617-232-3541; e-mail: [email protected]. Abstrato FUNDAMENTOS: Dados animais sugerem que os peptídeos natriuréticos desempenham um importante papel no metabolismo da energia, contudo estudos prospectivos que avaliam uma relação entre esses peptídeos e diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) nos humanos são poucos e os resultados são conflitantes. MÉTODOS: Nós usamos uma abordagem prospectiva de grupos de casos (n = 491 T2DM casos, n = 561 subgrupo de referência) dentro do Estudo da Saúde das Mulheres para avaliar as concentrações da porção N terminal de peptídeos natriuréticos tipo pro B (NT-proBNP) e o risco de T2DM incidente. Nós também testamos associações entre 4 variantes comuns nos genes A e B dos peptídeos natriuréticos (NPPA e NPPB) e concentrações de NT-proBNP (n = 458) e T2DM incidente (n = 1372 casos entre 22 607 mulheres). RESULTADOS: Os indivíduos dos casos tiveram um índice de massa corpórea média mais alto (29.4 vs 25.0 kg/m2, P < 0.001) e concentrações de NT-proBNP mais baixas (faixa interquartil) [46.8 ng/L (26.1–83.2) contra 66.7 ng/L (39.3–124.7), P < 0.001]. Em riscos proporcionais os modelos se ajustam para fatores de risco estabelecidos para diabetes, mulheres no quartil mais alto da concentração NT-proBNP (≥117.4 ng/L) tiveram uma redução de 49% no risco de T2DM [coeficiente de risco (HR) 0.51, 0.30–0.86, P = 0.01] relativo àqueles no quartil mais baixo. Duas das 4 variantes testadas no NPPA e NPPB (rs632793, rs198389) estavam associadas com elevadas concentrações de NT-proBNP e risco reduzido de T2DM. Por exemplo, cada cópia do alelo menor do rs632793 estava associada com elevado NT-proBNP [β (SE) = 0.201 (0.063), P < 0.01] e risco reduzido de T2DM (HR 0.91, 0.84–0.989, P = 0.026). CONCLUSÕES: Concentrações de NTproBNP que estão altas, mas ainda dentro do Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) intervalo de referência, estão associadas com risco reduzido de diabetes incidente nas mulheres e apoiam um papel favorável para os peptídeos natriuréticos na prevenção do T2DM. Os papéis dos peptídeos natriuréticos em promover a vasodilatação e a natriurese são bem conhecidos (1, 2), e testes tanto para a forma ativa do peptídeo natriurético do tipo B (BNP)6 quanto para o fragmento aminoterminal inativo do peptídeo (NT-proBNP) ganharam larga aceitação como ferramentas para o diagnóstico da insuficiência cardíaca no cenário do tratamento agudo (3, 4). Peptídeos natriuréticos do tipo B também desempenham um importante papel na regulação da lipólise nos adipócitos (5, 6), e vários estudos epidemiológicos cruzados têm relatado associações inversas entre concentrações de BNP e índice de massa corpórea (BMI), concentrações de glicose, medidas de resistência à insulina, e o número de componentes da síndrome metabólica (7–9). Entretanto, estudos prospectivos da relação entre concentrações de BNP e diabetes mellitus do tipo 2 incidente (T2DM) são escassos e inconsistentes (10–12). Para melhor entender os possíveis efeitos metabólicos do sistema dos peptídeos natriuréticos, nós primeiro medimos as concentrações de linha de base do NT-proBNP e vários outros marcadores plasmáticos do metabolismo e da inflamação em mulheres saudáveis de meia idade e mais velhas registradas no Estudo da Saúde das Mulheres (WHS) (13). Nós então examinamos as correlações entre esses biomarcadores e as concentrações de NTproBNP e testamos para evidência da associação entre concentrações de NT-proBNP e T2DM incidente num estudo prospectivo de grupos de casos de mulheres do WHS. Nós também conduzimos uma série de análises para determinar se variantes genéticas comuns previamente relatadas se associam com concentrações de NT-proBNP e T2DM Endocrinologia e Metabolismo demonstrou evidência semelhante de associação em nosso grupo de mulheres. Materiais e Métodos PARTICIPANTES DO ESTUDO Participantes do estudo foram registradas no WHS, ensaio clínico randomizado fatorial 2 x 2 duplo cego placebo controlado da aspirina e da vitamina E na prevenção da doença cardiovascular e do câncer entre 39 876 profissionais femininas da saúde com idade de 45 anos e mais velhas (13). A inscrição começou em 1992, participantes estavam livres de doença cardiovascular no início do estudo, e um total de 28 345 mulheres forneceu uma amostra sanguínea no início do estudo. Entre essas, 19 871 (70.1%) estavam em jejum na hora da coleta da amostra. Essas amostras foram centrifugadas e armazenadas em nitrogênio líquido até análise laboratorial. A porção randomizada do estudo foi completada em Março de 2004, e mulheres foram convidadas a participar de acompanhamento de observação contínuo. Participantes têm sido acompanhadas continuamente para doença cardiovascular incidente e T2DM. Três diferentes subgrupos de participantes do WHS foram identificados para análises do NT-proBNP e T2DM incidente, variação genética comum e concentrações de NT-proBNP, e variação genética comum e T2DM incidente são componentes desse estudo. ASSOCIAÇÃO PROSPECTIVA DO NT-proBNP E DO T2DM Para a análise prospectiva das concentrações de NT-proBNP e T2DM incidente, todos os indivíduos foram selecionados dentre mulheres sem diabetes diagnosticada no início do estudo [ausência de auto relato de T2DM e hemoglobina A1c (Hb A1c) <6.5%] e com amostras adequadas de sangue em jejum no início do estudo. Nós criamos um estudo de grupos de casos primeiro selecionando uma Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) amostra aleatória de casos de T2DM incidente (n = 491) dentre todo o grupo do WHS. Casos foram definidos como participantes não diabéticas do WHS que forneceram amostras de sangue no início do estudo e subsequentemente desenvolveram T2DM recentemente diagnosticado. Um subgrupo selecionado aleatoriamente de mulheres com amostras disponíveis de sangue foi então escolhido como um grupo de risco de referência (n = 561). A técnica de amostragem excluiu mulheres com T2DM no início do estudo, contudo mulheres que desenvolveram T2DM durante o acompanhamento foram escolhidas para inclusão no subgrupo de referência. Por acaso, 50 dessas mulheres foram selecionadas para o subgrupo de referência, de modo que o grupo caso-coorte incluía 491 casos de T2DM incidente e 511 não casos. A seleção do subgrupo de referência foi estratificada por raça/etnia (branco contra não branco) assim como idade (camadas de 5 anos ) para combinar aproximadamente a distribuição entre os casos de T2DM (incluídos nesse estudo) assim como um grupo separado de casos de doença cardiovascular incidente (não incluídos nesse estudo). VARIANTES COMUNS NO NPPANPPB E NAS CONCENTRAÇÕES DE NT-proBNP Para validar associações anteriormente relatadas entre as variantes genéticas comuns nos genes precursores dos peptídeos natriuréticos A (NPPA)7 e nos genes precursores dos peptídeos natriuréticos B (NPPB) e no NT-proBNP, nós usamos dados de mulheres selecionadas para o subgrupo de referência que também tiveram genotipagem realizada como parte do mais amplo Estudo da Saúde do Genoma das Mulheres, que é um subgrupo das mulheres inscritas no WHS. O Estudo da Saúde do Genoma das Mulheres inclui >25 000 mulheres com dados disponíveis de genotipagem. O estudo é descrito em detalhe Endocrinologia e Metabolismo em outra parte (14). Das 561 mulheres selecionadas para inclusão no subgrupo de referência para esse estudo, 458 eram de descendência Européia e tinham tanto informação de genotipagem quanto concentrações de NT-proBNP disponívies. VARIANTES COMUNS NO NPPANPPB E NA T2DM INCIDENTE Para testar se a variação comum no NPPA e NPPB estava associada com T2DM incidente no WHS e no Estudo da Saúde do Genoma das Mulheres, nós identificamos todas as mulheres de descendência Européia com informação de genotipagem que tinham Hb A1c <6.5% e não tinham um diagnóstico clínico de T2DM no início do estudo. No total, havia 22 607 mulheres nesse grupo com 1372 casos de T2DM incidente. VERIFICAÇÃO DE T2DM T2DM incidente foi identificado de uma maneira idêntica para todas as participantes do WHS e nesse estudo. Possíveis casos de T2DM incidente foram inicialmente identificados por auto relato em questionários anuais que perguntavam se e quando a participante tinha sido diagnosticada com T2DM desde o início do estudo. Casos auto relatados foram então confirmados por entrevistas por telefone administradas por médicos usando os critérios diagnósticos da Associação Americana de Diabetes (15) ou um questionário suplementar auto administrado. Num estudo de validação, a confirmação baseada tanto na entrevista quanto no questionário suplementar produziu valores preditivos positivos >90% em comparação com a revisão dos prontuários (16). Em particular, o valor preditivo positivo do questionário suplementar era de 99% (95% CI 97%– 100%). Em geral, em 95% de todos os eventos auto relatados de T2DM, informação suficiente para confirmação ou desconfirmação do endpoint foi obtido, e apenas casos confirmados foram usados nessa análise. Já Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) que a prevalência do T2DM não diagnosticado entre adultos Americanos de meia idade é tão alta, e visto que essa análise foi criada para investigar o papel do NT-proBNP como um determinante de doença futura, nós limitamos nossa amostra a indivíduos com uma linha de base Hb A1c <6.5%. ANÁLISE LABORATORIAL Plasma NT-proBNP foi medido usando-se um teste de imunoensaio de eletroquimioluminescência fornecido pela Roche Diagnostics. O teste possui variabilidade dia-adia em concentrações de 175, 434, e 6781 ng/L de 3.2%, 2.4%, e 2.2%, respectivamente. Além do NT-proBNP, amostras plasmáticas foram medidas para insulina, leptina, resistina, interleucina-6, ácidos graxos livres, colesterol LDL oxidado, creatinina, Hb A1c, colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicerídeos, proteína C reativa de alta sensibilidade (hsCRP), e molécula de adesão intercelular solúvel 1 num laboratório central certificado pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão, e Sangue/CDC e Programa de Prevenção da Padronização dos Lipídios. Detalhes dos testes usados e medidas da variação do dia-a-dia estão disponíveis sob pedido. Amostras de DNA foram genotipadas dentro da tecnologia Infinium II da Illumina (painel humano HAP300) como anteriormente descrito (14). Todas as amostras eram obrigadas a ter genotipagem bem sucedida usando o software BeadStudio v. 3.3 (Illumina) para pelo menos 98% dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). SNPs com taxas de chamadas <90% e amostras com percentagem de genótipos ausentes >2% ou que se desviaram de equilíbrio Hardy-Weinberg foram removidos da análise. Nós identificamos 4 polimorfismos de nucleotídeo único (rs198358, rs5068, rs632793, e rs198389) que tinham estado associados com concentrações de NT-proBNP, concentrações de peptídeos natriuréticos atriais, ou aspectos Endocrinologia e Metabolismo da síndrome metabólica e/ou T2DM na literatura (10, 17–20). rs198358 foi diretamente genotipado com 99.25% de sucesso. A dose estimada de alelos no rs5068, rs632793, e rs198389 foi imputada usando o programa MACH 1.0.16. (http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/ma ch/index.html) e dados do HapMap (21–23). Pontuações da qualidade da imputação variaram de 0.962 (rs632793) até 0.998 (rs5068). ANÁLISE ESTATÍSTICA Associação prospectiva do NT-proBNP e do T2DM. Dados para esse componente do estudo foram analisados como um estudo de grupos de casos usando-se ponderação apropriada das observações (24, 25). Visto que a amostragem foi estratificada por raça/etnia e idade, nós usamos ponderação específica. (26). Características da população em geral foram estimadas usando-se ponderações iguais ao inverso das probabilidades de inclusão na amostra do subgrupo usando a abordagem da ponderação de Horvitz–Thompson no Proc SurveyMeans no SAS 9.2 (24, 27). Frequências brutas e valores médios [faixa interquartil (IQR)] das características bioquímicas e clínicas do início do estudo foram comparadas usando-se χ2 e testes de soma de classificação Wilcoxon. Frequências populacionais estimadas das variávies categóricas foram comparadas usando-se o teste Rao–Scott χ2 no Proc SurveyFreq no SAS 9.2. Médias populacionais estimadas para variáveis contínuas nos casos e subgrupo foram comparadas usando-se regressão linear ponderada no Proc SurveyReg no SAS 9.2. Associações entre NT-proBNP e outros marcadores metabólicos séricos, incluindo Hb A1c, creatinina, taxa de filtração glomerular estimada (eGFR), insulina, grelina e adiponectina foram computados no subgrupo usando-se coeficientes de correlação Spearman. Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Concentrações de NT-proBNP foram divididas em quartis crescentes baseados na distribuição no subgrupo de referência de mulheres não diabéticas. Modelos de risco proporcionais Cox ajustados para o tamanho da amostra ponderada (28) foram usados para calcular coeficientes de risco ajustados (HRs) e 95% CIs para T2DM incidente de acordo com o quartil crescente do NTproBNP, com o quartil mais baixo escolhido como a categoria de referência. Testes para tendência através dos quartis do NT-proBNP foram calculados usando-se um grupo variável indicador para o valor médio de cada quartil do NT-proBNP. Nós também avaliamos a associação entre NT-proBNP e diabetes incidente modelados por incremento 1SD na escala logarítmica transformada. Mulheres sem informação completa para todas as covariáveis incluídas nos modelos multivariáveis foram excluídas daquelas análises. Um número máximo de 27 mulheres foi excluída da análise primária por causa da falta de informação de covariáveis. Visto que os resultados da análise primária descritos acima sugeriram a possibilidade de um efeito limite, nós conduzimos uma análise exploratória na qual nós analisamos várias concentrações de NT-proBNP como possíveis pontos de corte dicotômicos para associação com T2DM. A análise primária sugeriu que o percentil de 75% (117.4 ng/L) seria um possível ponto de corte; nós então selecionamos o valor do NT-proBNP correspondente aos percentis de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, e 90% da distribuição do NT-proBNP no subgrupo de referência. O risco de T2DM para mulheres com valores em ou acima de cada limite foi comparado com um grupo de referência composto de mulheres com valores NTproBNP < percentil de 50% usando-se modelos de risco proporcionais Cox como descrito para a análise primária. Nós também realizamos análises de sensibilidade que censuraram mulheres quando elas desenvol- Endocrinologia e Metabolismo veram doença cardiovascular (n = 14) ou insuficiência cardíaca congestiva (n = 8) ou antes de desenvolver diabetes ou no fim do acompanhamento. Todas as análises foram realizadas usando-se SAS 9.1 ou 9.2 para Unix. Variantes comuns nas concentrações de NPPA-NPPB e de NT-proBNP. Modelos de regressão linear ajustados por idade, BMI, pressão arterial sistólica, e critérios de seleção de indivíduos (T2DM prevalente, T2DM incidente, doença cardiovascular incidente, tanto a doença cardiovascular incidente quanto o T2DM, ou subgrupo) foram usados para testar a evidência de associação entre rs198358, rs5068, rs632793, e rs198389 e concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas naturais no subgrupo de referência. Cada SNP foi testado para evidência de associação com BMI, pressão arterial sistólica, e concentração de insulina em jejum. Evidência para desvio de um modo aditivo de herança foi avaliada incluindo-se um prazo para testar a não linearidade no modelo de regressão linear. Variantes comuns no NPPA-NPPB e na T2DM Incidente. Modelos de risco proporcionais Cox foram construídos para testar a evidência de associação entre rs198358, rs5068, rs632793, e rs198389 e T2DM incidente. Modelos foram ajustados por idade, BMI, (BMI)2, uso da terapia hormonal, histórico familiar de diabetes, exercício pelo menos uma vez por semana, e consumo de álcool pelo menos 1 drink por dia. Cada SNP foi testado para evidência de associação com BMI, uso da terepia hormonal, histórico familiar de diabetes, exercício e consumo de álcool. Evidência para desvio de um modo aditivo de herança foi avaliada incluindo-se um prazo para testar a não linearidade no modelo de regressão de riscos proporcionais. Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Resultados ASSOCIAÇÃO PROSPECTIVA DO NT-proBNP E DO T2DM Características do início do estudo das mulheres que subsequentemente desenvolveram T2DM e as mulheres selecionadas para inclusão no subgrupo de referência, tanto nas análises brutas quanto após reponderar a amostragem a partir da população maior do WHS, são mostradas na Tabela 1. Como previsto, tanto na análise bruta quanto na reponderada, mulheres que desenvolveram Endocrinologia e Metabolismo T2DM tinham BMI e pressão arterial mais altos, eram mais prováveis de ter histórico familiar de diabetes, consumiam álcool e se exercitavam menos frequentemente, e tinham insulina de jejum e concentrações de hsCRP mais altas (cada P < 0.0001). Tanto na análise bruta quanto na reponderada, as concentrações de NT-proBNP eram mais baixas entre as mulheres que subsequentemente desenvolveram T2DM (cada P < 0.001). A duração média (IQR) do acompanhamento para todas as mulheres incluídas na amostra dos casos dos grupos foi de 13.4 (7.7–11.6) anos. Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Endocrinologia e Metabolismo Tabela 1. Comparações das características de início de estudo dos casos de T2DM e o subgrupo aleatório, na amostra e reponderado para o grupo total do WHSa Bruto Reponderado para População Características de início de estudo Casos de Subgrupo de Subgrupo de P Casos de Diabetes P Diabetes Referência Referência n 491 561 1228 19 277 Idade, anos 53.3 (49.0–59.8) 56.7 (50.9–64.2) <0.0001 53.6 (49.3–59.7) 53.5 (49.2–59.3) 0.53 Raça branca 450 (92) 516 (92) 0.37 1134 (92.4) 18468 (95.8) 2 BMI, kg/m 29.4 (25.8–33.9) 25.6 (23.0–28.3) <0.0001 9.6 (26.0–33.9) 25.6 (22.9–28.3) <0.0001 Pressão arterial, mmHg 135 (125–145) 125 (115–135) <0.0001 135 (125–145) 125 (115–135) <0.0001 Fumo corrente 63 (12.9) 56 (10.0) 0.18 159 (12.9) 1999 (10.4) 0.29 Histórico familiar de diabetes 208 (42.4) 158 (28.2) <0.0001 520 (42.3) 5178 (26.9) <0.0001 Consumo de álcool ≥1 drink por dia 27 (5.5) 45 (8.0) 0.06 361 (29.4) 7749 (40.2) 0.0001 Exercício ≥1 vez por semana 159 (32.4) 259 (46.2) <0.0001 399 (32.5) 8991 (46.6) <0.0001 Uso da terapia hormonal 209 (42.7) 242 (43.3) 0.6 533 (43.5) 8379 (43.6) 0.8 Uso randomizado de aspirina 248 (50.5) 275 (49.0) 0.66 617 (50.2) 9312 (48.3) 0.41 eGFR, mL · min−1 · (1.73 m2)−1 Hb A1c, % Insulina de jejum, μIU/mL hsCRP, mg/L NT-proBNP, ng/L ln(NT-proBNP) a Dados são médio (IQR) ou n (%). 112.5 (92.4–141.7) 5.3 (5.1–5.5) 12.5 (8.4–18.9) 4.0 (2.2–7.0) 46.8 (26.1–83.2) 3.9 (3.3–4.4) 92.6 (7584–110.6) 5.0 (4.9–5.2) 6.8 (4.4–10.7) 2.2 (0.9–4.6) 65.2 (37.8–117.4) 4.2 (3.7–4.8) <0.0001 112.7 (92.6–141.7) <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 5.3 (5.1–5.5) 12.5 (8.4–18.8) 4.1 (2.3–7.0) 46.9 (26.4–83.1) 3.9 (3.3–4.4) 96.1 (80.5–115.7) 5.0 (4.8–5.2) 6.9 (4.3–10.7) 2.1 (0.9–4.5) 58.7 (35.2–103.5) 4.1 (3.6–4.6) <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.001 Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Endocrinologia e Metabolismo Correlações entre concentrações de início de estudo do NT-proBNP e biomarcadores inflamatórios, lipídicos, metabólicos e antropométricos de início de estudo no subgrupo de referência são mostradas na Tabela 2. Na análise não ajustada, idade (0.37), insulina (−0.25) e leptina (−0.18) parecem estar pelo menos tão intimamente correlacinadas com as concentrações de NT-proBNP quanto os outros correlatos conhecidos, incluindo BMI (−0.17), pressão arterial (0.06), e eGFR (−0.20). Após ajuste por idade, e por idade e BMI, correlações entre NT-proBNP e insulina persistiram (−0.25 e −0.18, respectivamente). Nem Hb A1c e nem qualquer um dos biomarcadores inflamatórios mostrou qualquer correlação importante com NTproBNP. Tabela 2. Correlações Spearman entre NT-proBNP e outros biomarcadores metabólicos no subgrupo de referência, uma subamostra representativa do WHS. Ajustado por Ajustado por Não ajustado Idade Idade e BMI Característica ou Biomarcador ρ P ρ P ρ P Idade, anos 0.371 <0.0001 2 BMI, kg/m −0.165 <0.0001 −0.185 <0.0001 Pressão arterial sistólica, mmHg 0.059 0.17 −0.044 0.3 0.025 0.57 Biomarcadores metabólicos Insulina, μIU/mL −0.245 <0.0001 −0.248 <0.0001 −0.180 <0.0001 Hb A1c, % −0.039 0.36 −0.106 0.01 −0.069 0.1 0.051 −0.177 −0.033 −0.014 −0.195 0.23 <0.0001 0.43 0.74 <0.0001 0.051 −0.178 −0.073 −0.054 −0.048 0.23 <0.0001 0.08 0.2 0.26 −0.015 −0.070 −0.051 −0.052 0.07 0.72 0.1 0.23 0.22 0.1 Colesterol total, mg/dL −0.130 0.002 −0.209 <0.0001 −0.196 <0.0001 Colesterol LDL, mg/dL −0.151 0.0004 −0.228 <0.0001 −0.202 <0.0001 Colesterol LDL Oxidado −0.027 0.52 −0.087 0.04 −0.054 0.21 Colesterol HDL, mg/dL 0.143 0.0007 0.132 0.002 0.07 0.1 Triglicerídeos, mg/dL −0.110 0.009 −0.148 0.0005 −0.098 0.02 0.031 0.46 −0.048 0.26 −0.022 0.61 0.016 0.076 0.7 0.07 −0.026 −0.009 0.54 0.83 0.05 0.047 0.24 0.27 0.006 0.89 −0.090 0.03 −0.061 0.15 Grelina, pg/mL Leptina, ng/mL Resistina, ng/mL Creatinina, mg/dL eGFR, mL · min−1 · (1.73 m2)−1 Biomarcadores lipídicos Ácidos graxos livres mEq/L Biomarcadores inflamatórios hsCRP, mg/L IL-6, pg/mL Molécula de adesão intracelular solúvel 1, ng/mL Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Endocrinologia e Metabolismo O risco de T2DM incidente de acordo com os quartis crescentes das concentrações de NT-proBNP é mostrado na Tabela 3. Em modelos ajustados por idade e raça, concentrações crescentes de NT-proBNP estavam associadas com um reduzido risco de T2DM incidente para quartis 2–4 comparados com quartil 1. Após ajuste por BMI, as reduções observadas no risco de T2DM foram atenuadas nos quartis 2–4, contudo permaneceram estatisticamente significativas para a categoria mais alta em comparação com a mais baixa do NT-proBNP (HR 0.54, 95% CI 0.33–0.89, P = 0.015). Essa relação persistiu após ajuste para eGFR, uso da terapia hormonal, histórico familiar de diabetes, atividade física, e consumo de álcool (HR 0.51, 95% CI 0.30–0.86, P = 0.011) e foi atenuada por ajuste adicional para as concentrações de insulina do início do estudo (HR 0.58, 95% CI 0.35–0.97, P = 0.039). Nós observamos uma redução de 20% no risco de T2DM incidente por aumento unitário 1SD nas concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas em modelos plenamente ajustados (Tabela 3, Modelo 4; HR 0.80, 95% CI 0.67–0.96, P = 0.016). Essa estimativa de ponto não mudou substancialmente quando Hb A1c foi adicionada ao modelo (HR 0.80, 95% CI 0.65–0.99, P = 0.044). Nenhuma mudança significativa nas estimativas de risco foi notada após ajuste adicional para hsCRP ou após a substituição das medidas alternativas de adiposidade (circunferência da cintura, circunferência do quadril, ou coeficiente cintura/quadril) para BMI em modelos ajustados (dados não mostrados ). Tabela 3. Risco de diabetes incidente de acordo com a concentração de início de estudo do NT-proBNP.a Modelo Faixa NT-proBNP, ng/L Modelo 1 Quartil 1 Quartil 2 Quartil 3 Quartil 4 <37.4 37.4 to <64.2 64.2 to <117.0 ≥117.4 1 0.56 (0.40–0.78) 0.61 (0.43–0.85) 0.40 (0.27–0.60) 0.0006 0.004 <0.0001 0.84 (0.56–1.26) 0.93 (0.61–1.42) 0.54 (0.33–0.89) 0.4 0.75 0.015 0.88 (0.58–1.34) 0.97 (0.62–1.51) 0.51 (0.30–0.86) 0.56 0.89 0.011 0.96 (0.63–1.47) 0.99 (0.63–1.56) 0.58 (0.35–0.97) 0.86 0.97 0.039 valor P Modelo 2 1 valor P Modelo 3 1 valor P Modelo 4 valor P 1 Os resultados da análise categórica sugeriram a possibilidade de um efeito limite, no qual apenas mulheres com as mais altas concentrações de NT-proBNP estavam com reduzido risco de T2DM. Numa análise exploratória, nós examinamos o risco de T2DM incidente para mulheres com concentrações de NT-proBNP com ou acima dos tendência P <0.001 Por 1 unidade b SD 0.68 (0.58–0.79) <0.001 0.047 0.79 (0.67–0.94) 0.007 0.041 0.78 (0.65–0.93) 0.006 0.1 0.80 (0.67–0.96) 0.016 percentils de 55% até 90%, usando mulheres com concentrações de NT-proBNP < percentil de 50% (<65.2 ng/L) como o grupo de referência (Fig. 1). Como pode ser visto, a associação com T2DM incidente é estatisticamente significativa para pontos de corte do NT-proBNP do percentil de 75% e mais alta. Por exemplo, mulheres com concentra- Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) ções de NT-proBNP ≥ percentil de 75% (117.4 ng/L) estavam em risco 47% menor de T2DM (HR 0.53, 95% CI 0.33–0.86, P = 0.009) do que aqueleas com concentrações de NT-proBNP abaixo da média após ajuste para todos os confundidores exceto insulina. Ajuste adicional para insulina não alterou substancialmente os resultados (HR 0.58, 95% CI 0.36–0.93, P = 0.024). Fig. 1. Risco relativo ajustado de T2DM incidente calculado para uma faixa de possíveis pontos de corte para NT-proBNP. Possíveis pontos de corte foram escolhidos baseados na distribuição das concentrações de NT-proBNP no subgrupo de referência. O risco de diabetes incidente é calculado para mulheres com concentrações de NTproBNP no ou acima do valor indicado comparado com mulheres com concentrações de NT-proBNP < percentil de 50% (65.2 ng/L). HRs e 95% dos CIs são ajustados por idade, raça, BMI (kg/m2), eGFR, uso da terapia hormonal, histórico familiar de diabetes, exercício pelo menos uma vez por semana, e consumo de álcool de 1 drink ou mais por dia. Ajuste adicional para concentrações de insulina de início de estudo não alterou os resultados substancialmente (dados não mostrados). * Adjusted relative risk of incident type 2 diabetes = risco relativo ajustado de diabetes tipo 2 incidente * NT-proBNP threshold percentile (ng/L) = percentil do limite do NT-proBNP (ng/L) Endocrinologia e Metabolismo * 50th = 50% Nós não observamos qualquer evidência de interação estatística entre as concentrações de NT-proBNP acima ou abaixo desse limite e da categoria do WHO do BMI (<25, 25 to <30, 30+ kg/m2), histórico familiar de diabetes, pressão arterial sistólica, ou idade acima ou abaixo de 53 anos (a média no estudo populacional). Numa análise de sensibilidade, nós construímos modelos de risco proporcionais separados que censuraram as mulheres quando elas desenvolveram ou doença cardiovascular incidente ou insuficiência cardíaca congestiva. Nossos resultados permaneceram inalterados. VARIANTES COMUNS NAS CONCENTRAÇÕES DE NPPANPPB E DE NT-proBNP Os resultados para o teste de associação entre SNPs rs198358, rs5068, rs632793, e rs198389 são mostrados na Tabela 4. Como pode ser visto, nós observamos evidência estatisticamente significativa de associação entre concentrações de NT-proBNP de início de estudo logarítmicas transformadas e rs632792 e rs198389. Cada cópia do alelo menor em cada SNP aumentou as concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas em 0.2012 e 0.1860 unidades SD, respectivamente. Nenhuma evidência estatisticamente significativa de desvio de um modo aditivo de herança foi detectada para qualquer um dos SNPs. Embora nenhum dos SNPs estivesse significativamente relacionado com pressão arterial, nós não detectamos uma associação estatisticamente significativa entre BMI e rs632792 [β (SE) por 1 kg/m2 de aumento no BMI = −0.69682 (0.33556), P = 0.038] e rs198389 [−0.66137 (0.32973), P = 0.046]. Incluindo um prazo de interação entre cada SNP e BMI em modelos de regressão linear das concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas que não melhorou o ajuste do modelo. Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Endocrinologia e Metabolismo Tabela 4. Associação de variantes comuns na região NPPA-NPPB com concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas.a Frequência do Associaçãob c Alelo MePontuação da alelo menor SNP Cromossomo Posição nor/Maior Qualidade β (SE) P 0.0829 1 11826663 C/T 0.236 N/A 0.228 rs198358d (0.0680) −0.0035 rs5068 1 11828561 G/A 0.059 0.998 0.978 (0.1255) 0.2012 rs632793 1 11833264 G/A 0.409 0.962 0.0015 (0.0631) 0.1860 rs198389 1 11841858 G/A 0.427 0.987 0.0029 (0.0620) a Para cada um dos SNPs, o menor valor P foi visto quando um modo aditivo (em vez do dominante) de herança foi suposto. b Associação por alelo com 1SD de mudança em concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas, ajustadas por idade, BMI, e pressão arterial sistólica. A concentração média (SD) de NT-proBNP logarítmica transformada no subgrupo de referência é 4.254 (0.821). c Nas participantes de descendência Européia com informação de genotipagem disponível e concentrações de NT-proBNP. rs198358 foi diretamente genotipado; informação de genotipagem para os SNPs restantes foi imputada. d Teste de associação usou genótipos diretamente medidos. Os resultados não diferiram quando genótipos ausentes no rs198358 (n = 1, or 0.22%) foram substituídos com a dose estimada de genótipo imputada. Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) VARIANTES COMUNS NO NPPANPPB E NO T2DM INCIDENTE Quando cada um dos 4 SNPs foi testado para evidência de associação com o T2DM incidente em modelos Cox ajustados (n = 22607 com 1372 casos de T2DM incidente), nós observamos evidência de associação tanto para rs632793 quanto para rs198389. O coeficiente de risco por alelo para T2DM foi 0.91 (95% CI 0.84–0.989; P = 0.026) para rs632793 e 0.92 (95% CI 0.85–0.995; P = 0.036) para rs198389. O efeito dos SNPs ou no rs632793 ou no rs198389 sobre o risco de T2DM é consistente com a direção de seu efeito sobre as concentrações de NT-proBNP. Entretanto, nós não observamos associação estatisticamente significativa nem para o rs198358 (por alelo HR 0.94, 95% CI 0.86–1.03, P = 0.18) e nem para o rs5068 (por alelo HR 0.98, 95% CI 0.83–1.16, P = 0.84). Nenhuma evidência estatisticamente significativa de desvio de um modo aditivo de herança foi detectada para qualquer um dos SNPs, e nenhuma associação significativa com BMI, histórico familiar de diabetes, exercício, uso da terapia hormonal, ou consumo de álcool foram notados. Discussão Nessas análises prospectivas, nós relatamos uma associação estatisticamente robusta entre concentrações de NT-proBNP e o risco de diabetes incidente numa população de mulheres inicialmente saudáveis com risco comum para T2DM. Nós observamos uma redução de quase 50% no risco de diabetes tipo 2 entre mulheres com concentrações de NT-proBNP >117 ng/L (o percentil de 75%), uma concentração que está tanto bem dentro do intervalo de referência quanto é rotineiramente observada na prática clínica. Esse risco reduzido não pode ser atribuído à insuficiência cardíaca congestiva interveni- Endocrinologia e Metabolismo ente ou doença cardíaca coronária que ocorre durante o acompanhamento. Além disso, enquanto nós observávamos as esperadas associações entre as concentrações de NTproBNP e idade e BMI, nós também observamos uma relação inversa entre NTproBNP e insulina de jejum que persistiu após o ajuste por idade e BMI. Nós também confirmamos associações anteriormente relatadas entre variação comum no gene NPPA-NPPB e nas concentrações de NTproBNP, e uma associação entre 2 SNPs no NPPA-NPPB e no T2DM incidente em mulheres inicialmente saudáveis. A direção desses efeitos era consistente com os dados que nós relatamos aqui para a associação entre plasma NT-proBNP e o risco de T2DM incidente. Esses dados, tomados juntos, dão apoio à hipótese de que peptídeos natriuréticos estão causalmente envolvidos no desenvolvimento da resistência à insulina e no diabetes clínico. A magnitude da redução dos riscos observada é consistente com aquilo observado por Pfister et al. (10) no grupo EPICNorfolk, que relatou uma redução de 21% no risco ajustado de T2DM incidente por aumento de 1 unidade SD nas concentrações de NT-proBNP logarítmicas transformadas (HR 0.79, 95% CI 0.64–0.97, P = 0.02). Naquele mesmo relatório (10), Pfister et al. realizaram uma análise de randomização Mendeliana que apoia um papel causal para peptídeos natriuréticos no desenvolvimento do T2DM. Nossas observações apoiam aquela conclusão, e sugerem que alterações nas concentrações de NT-proBNP precedem o diagnóstico clínico de diabetes em muitos anos. Outros estudos prospectivos relataram resultados semelhantes, com um estudo relatando associações significativas entre concentrações de peptídeos natriuréticos do tipo B, concentrações de NTproBNP, e concentrações de peptídeos na- Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) triuréticos atriais mid regionais e T2DM incidente (11) e outro relatando uma associação significativa para peptídeo natriurético atrial mid regional contudo não NT-proBNP (12). Estudos cruzados também relataram associações inversas entre peptídeos natriuréticos e características da síndrome metabólica (7–9). Nosso estudo prospectivo se soma a esse trabalho anteriormente publicado por intimamente examinar as relações entre NTproBNP e hormônios com importantes funções metabólicas, incluindo insulina, leptina, e grelina. Nós observamos uma modesta correlação inversa entre concentrações de NT-proBNP e de insulina de jejum que era independente do BMI e parecia ser mais forte do que sua correlação com a pressão arterial, um determinante tradicionalmente aceito das concentrações de peptídeos natriuréticos. Em nosso estudo, a relação entre NT-proBNP e T2DM incidente é independente tanto do BMI quanto das concentrações de insulina de jejum, apoiando a hipótese de que alterações nas concentrações de NT-proBNP contribuem para o risco de T2DM via um diferente mecanismo biológico ou com diferente tempo do que as alterações na sensibilidade da insulina ou obesidade. Nós também fomos capazes de replicar os resultados de vários estudos genéticos que relataram associações significativas entre variação comum no gene NPPA-NPPB e nas concentrações de NT-proBNP, pressão arterial, e T2DM prevalente (17–20). Nossos resultados são amplamente consistentes com aqueles achados anteriormente publicados, visto que 3 dos 4 SNPs anteriormente relatados se associam com concentrações de NT-proBNP eles também estavam associados com as concentrações de NT-proBNP em nosso grupo. O quarto, rs5068, mostrou uma associção menos consistente com as concentrações de BNP (19, 20). Nós tam- Endocrinologia e Metabolismo bém replicamos associações cruzadas anteriormente publicadas entre variação no NPPA-NPPB e no T2DM prevalente (17, 18). Em nossa análise prospectiva de 1372 casos de T2DM incidente, nós observamos uma associação estatisticamente significativa entre dois SNPs intimamente ligados [rs632793 e rs198389, r2 = 0.874 e D′ =1.00 nas participantes de descendência Européia incluídas em 1000 Genomas (29)] no gene NPPA-NPPB e no T2DM. Uma possível ligação causal entre peptídeos natriuréticos e T2DM é apoiada por evidência de modelos experimentais de camundongos de expressão alterada de peptídeos natriuréticos. Em recente trabalho de Miyashita et al. (30), camundongos transgênicos que expressaram BNP a níveis >100 vezes o normal eram mais magros, eram resistentes aos efeitos de uma dieta rica em gordura sobre o ganho de peso e resistência à insulina, e tinham gordura corpórea total mais baixa e elevado consumo de oxigênio. Esses efeitos foram mediados por elevada biogênese mitocondrial através de uma via de sinalização cGMP ativada por peptídeos natriuréticos. Além disso, receptores de peptídeos natriuréticos estão expressos nas células β pancreáticas e modulam secreção de insulina estimulada pela glicose (31, 32). Embora nosso estudo seja prospectivo, a possibilidade de causalidade reversa não pode ser excluída. Em particular, nós observamos uma modesta correlação inversa entre concentrações de NT-proBNP e concentrações de insulina de jejum no início do estudo, e evidência fisiológica de resistência à insulina pode preceder os sinais clínicos de T2DM de 3–6 anos (33). Entretanto, o tempo médio para o diabetes clínico em nosso grupo foi de 8.2 anos, e a associação entre NT-proBNP e T2DM incidente era independente das concentrações de insulina, sugerindo que os 2 hormônios podem marcar diferentes processos patofisiológicos no ca- Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Endocrinologia e Metabolismo minho para o T2DM. Nós também observamos uma correlação inversa entre BMI e concentrações de NT-proBNP, como os outros observaram (9). Nossos dados prospectivos levantam a possibilidade de que a relação entre concentrações de peptídeos natriuréticos e o metabolismo alterado não é completamente mediada pela obesidade, embora vias biológicas sobrepostas sejam difíceis de excluir. Finalmente, nós não observamos atenuação da relação entre NT-proBNP e T2DM após ajuste para inflamação subclínica, que é um importante marcador de riscos para T2DM, sugerindo que os peptídeos natriuréticos agem para alterar o risco de T2DM por um mecanismo alternativo (34). Em conclusão, nós observamos uma redução de >40% no risco de diabetes tipo 2 incidente entre mulheres inicialmente saudáveis com concentraçõs de NT-proBNP >117 ng/L. Essa associção era independente de outros tradicionais fatores de risco para diabetes, incluindo BMI, função hepática, idade e concentrações de insulina de jejum. Nós também replicamos relatórios publicados de associações entre variação comum nos genes NPPA-NPPB e tanto nas concentrações de NT-proBNP quanto no risco de T2DM. Esses dados prospectivos oferecem forte apoio para a hipótese de que o sistema de peptídeos natriuréticos desempenha um importante papel no metabolismo do ácido graxo e da glicose e no desenvolvimento do diabetes tipo 2. Notas de Rodapé 6 Abreviações não padronizadas: BNP, Peptídeo natriurético do tipo B; NT-proBNP, amino-terminal pro-BNP; BMI, Índice de massa corpórea; T2DM, Diabetes mellitus tipo 2; WHS, Estudo da Saúde das Mulheres; Hb A1c, hemoglobina A1c; hsCRP, Proteína C reativa de alta sensibilidade; SNP, Polimorfismo de nucleotídeo único; IQR, Faixa interquartil; eGFR, Taxa de filtração glomerular estimada; HR, Coeficiente de risco. 7 Genes humanos: NPPA, Peptídeo natriurético A; NPPB, Peptídeo natriurético B. Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intellectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significativas para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores ou Potencias Conflitos de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de revelações dos autores. Revelações e/ou potenciais confltos de interesse: Emprego ou Liderança: D.I. Chasman, Brigham & Women's Hospital; M.C. Magnone, F. Hoffman-La Roche; M. Bobadilla, F. Hoffman-La Roche; N. Rifai, Clinical Chemistry, AACC. Clinical Chemistry 59:3 557–565 (2013) Endocrinologia e Metabolismo Consultor ou Papel Consultivo: Nada a declarar. Posse dos Valores: Nada a declarar. Honorários: Nada a declarar. Fundo de Pesquisas: Esse estudo foi apoiado por doações HL-043851, HL080467, e HL-099355 do Instituto Nacional do Sangue, Pulmão e Coração e CA-047988 do Instituto Nacional do Câncer, a Fundação Donald W. Reynolds (Las Vegas, NV), a Fundação Leducq (Paris, França), e a Fundação Doris Duke Charitable (New York, NY). Genotipagem foi fornecida por Amgen (Cambridge, MA). B.M. Everett (PI), a doação de investigador iniciado da Roche Diagnostics (medição das concentrações de NT-proBNP ), Doação do Desenvolvimento Cientista da Associação Cardíaca Americana (0835304N), e Prêmio de Descoberta do Brigham e do Conselho de Liderança Cardiovascular do Hospital das Mulheres; D.I. Chasman, NIH; M.C. Magnone, F. HoffmanLa Roche; M. Bobadilla, F. Hoffman-La Roche; P.M Ridker, doação de investigador iniciado da Roche Pharma (apoio para a construção do estudo dos grupos de casos). Testemunho Hábil: Nada a declarar. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Recebido para publicação em 1º de Agosto de 2012. Aceito para publicação em 27 de Novembro de 2012. © 2013 The American Association for Clinical Chemistry Referências 1. de Bold AJ, Borenstein HB, Veress AT, Sonnenberg H. A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats. Life Sci 1981;28:89–94. 2. Levin ER, Gardner DG, Samson WK. Natriuretic peptides. N Engl J Med 1998;339:321–8. 3. Maisel AS, Krishnaswamy P, Nowak RM, McCord J, Hollander JE, Duc P, et al. Rapid measurement of Btype natriuretic peptide in the emergency diagnosis of heart failure. N Engl J Med 2002;347:161–7. 4. Januzzi JL Jr., Camargo CA, Anwaruddin S, Baggish AL, Chen AA, Krauser DG, et al. 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