metodi rapidi ed efficienti per l`estrazione di oli minerali

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metodi rapidi ed efficienti per l`estrazione di oli minerali
Metodi rapidi ed efficienti per l’estrazione di oli
minerali (MO) da imballaggi di cartone e alimenti
Sabrina Moret, Marianna Scolaro, Laura Barp,
Giorgia Purcaro, Lanfranco S. Conte
Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università degli Studi di Udine,
Via Sondrio 2A, 33100, Udine, Italia
26-28 giugno 2013
Desenzano del Garda
[email protected]
Oli minerali (MO)
Prodotti ottenuti dalla distillazione
frazionata e raffinazione del petrolio
Si tratta di miscele complesse di idrocarburi che non possono essere separati
individualmente e che danno tipici tracciati cromatografici caratterizzati dalla
presenza di “colline” di picchi non risolti.
E’ importante distinguere:
 MOSH (mineral oil saturated hydrocarbons) che comprendono idrocarburi
lineari e ciclici (n-alcani, isoalcani e cicloalcani).
 MOAH (mineral oil aromatic hydrocarbons) principalmente con 1-4 anelli,
alchilati
Tossicità degli oli minerali
La tossicità dei MOSH dipende dalla distribuzione dei PM.
Si accumulano in tessuti animali, latte e grasso umano.
A dosi comprese tra 0,01-20 mg/kg p.c. causano lo sviluppo di granulomi al
fegato e lesioni ai linfonodi mesenterici in ratti Fisher 344.
JECFA 2002
Oli minerali media e bassa viscosità (classe III)
tADI 0,01 mg/kg p.c.
SML (Specific Migration Limit)  0,6 mg/kg alimento
(60 kg p.c. e 1 kg/giorno)
JECFA 2012 : ritirata tADI per mancanza di dati
Opinione EFSA 2012:
• La presenza di oli minerali negli alimenti ha molteplici fonti
• Sono necessari ulteriori studi per valutare potenziale accumulo e tossicità MOSH
• Non dovrebbero essere presenti MOAH negli alimenti
Limiti di legge
Nel 2008 UE stabilisce un limite di 50 mg/kg per olio girasole ucraino
BMELV
Maggio 2011: bozza ordinanza con limiti per MOSH e MOAH
migrati da imballaggi e altri materiali a contatto con alimenti prodotti con
carta riciclata:
MOSH C10-C25: < 0.6 mg/kg di alimento
MOAH C10-25: <0.15 mg/kg (non rilevabile)
Maggio 2013: nuova bozza ordinanza da applicare ad alimenti
confezionati in carta/cartone riciclato (no carta/cartone vergine)
• MOAH C10-25 non devono essere trasferiti agli alimenti
• Non viene specificato un limite
• Viene indicata necessità utilizzare materiali barriera
Oli minerali (MO)
MOSH e MOAH
presentano tracciati
cromatografici con
“colline” di picchi non
risolti nello stesso
range di volatilità
MOSH
MOAH
MOAH (15-25% dei MOSH): comprendono sospetti cancerogeni e genotossici
Possibili interferenti: olefine naturalmente presenti nel campione, POSH, PAO
MOSH rilevanti ai fini della migrazione in fase gassosa: C10-C25
MOSH rilevanti da un punto di vista tossicologico: C16-C35
BfR: tADI 12 mg/persona/giorno per MOSH C10-C16
Principali fonti di contaminazione
• Oli minerali “food grade” trovano largo impiego nell’industria alimentare
(ingredienti, agenti anti-polvere, agenti distacco, lubrificanti, agenti
rivestimento per frutta, vegetali formaggi, etc.)
• Contaminazione ambientale: scarichi di autoviecoli (olio motore
incombusto), riscaldamento domestico, uso di alcuni pesticidi, raccolta
meccanizzata sono responsabile di contaminazione di fondo di vegetali e
prodotti derivati
Attenzione recentemente focalizzata su possibile migrazione da imballaggi in
cartone riciclato ad alimenti secchi in essi confezionati
Determinazione analitica
• MOSH e MOAH dello stesso intervallo di volatilità co-eluiscono da colonna GC
• Necessaria pre-separazione MOSH/MOAH prima dell’analisi GC
• Disponibili a questo scopo metodi off-line e on-line
ESTRAZIONE
Opzionale
(dipende da matrice,
sensibilità richesta)
PRE-ARRICCHIMENTO
Rimozione materiale interferente
PURIFICAZIONE (rimozione del grasso)
Frazionamento MOSH e MOAH
LC-GC-FID OFF-LINE
SPE-GC-FID OFF-LINE
LC-GC-FID ON-LINE
DEPT. FOOD
SCIENCE, UNIVERSITY
OFITALY
UDINE, ITALY
UNIVERSITY
OF UDINE,
Metodo LC-GC on-line
LC-GC 9000
Metodo LC-GC on-line “veloce”
MetodoBarpLC-GC
on-line
“veloce”
et al., J. Sep.
Sci. (in press)
"Reference
Method"
"Fast Method"
Improvement
Run Time
35 min
23 min
- 12 min or 34%
C6 volume
8 mL
5 mL
- 3 mL or 23%
Cl2CH2 volume
4.5 mL
4.5 mL
=
“Fast Method”: 2.6 samples/h  62 samples/24h
“Reference Method”: 1.7 samples/h  40 samples/24h
Metodi SPE-GC off-line
Metodo SPE-GC off-line
Moret, et al., J. Chromatogr. A 2012, 1243, 1-5
250uL sample
1mL C6
(dead volume)
1,5 mL C6 + 0,5mL C6/CH2Cl2 (1:1)
MOSH
0,5mL C6/CH2Cl2 (1:1)
1g silvered silica
packed and
conditioned
7mL C6/CH2Cl2 (1:1)
MOAH
reconcentration
MOSH
MOAH
LVI – GC- FID
Estrazione
Metodi tradizionali
• Estrazione classica con solvente
• Idrolisi acida
• Saponificazione
Metodi innovativi
• Saponificazione assistita con le microonde (MAS)
• Estrazione assistita con le microonde (MAE)
• Estrazione liquida ad alta P e T (PLE)
Estrazione classica con solvente di MO dal cartone
Metodo SE (Lorenzini et al., 2010)
1 g cartone (tagliato in
piccoli pezzi) + IS
+ 10 mL esano/etanolo
(1:1)
(2h at T amb)
3 mL estratto
+ 6 mL H2O
Vortex
Centifugazione
Iniezione
Lorenzini et al. 2010
Sample preparation
On-line LC-GC
Results
MOSH
MOSH
PLE
Mineral oil in
food packaging
(cardboard, paper)
22 cycles
cycles
1 cycle
cycle++wash
wash
1
PUMP
FID
1°
cycle
1 cycle
2°cycle
cycle
2°
3°cycle
3° cycle
HPLC
HRGC
MOAH
MOAH
22 cycles
cycles
2° cycle
cycle
2°
3°cycle
3° cycle
cycle ++wash
1 cycle
wash
1°
cycle
1 cycle
DEPT. FOOD SCIENCE, UNIVERSITY OF UDINE, ITALY
Pressurized liquid extraction (PLE)
In cella da 10 mL:
2 barrette di acciaio (2 mL)
+ 1 g campione in strisce + IS
PLE
estratto pronto
per l’iniezione
Speed extractor (Buchi)
Metodo PLE cartone
Condizioni testate
Condizioni testate:
• cella di estrazione: 10 mL
• solvente di estrazione: esano, esano/
etanolo (1/1), etanolo (1-2 cicli)
• temperatura estrazione: 30-50-60-100 °C
• pressione: 100 bar
• pre-riscaldamento: 1 min
• tempo di estrazione: 5-10 min
• scarico solvente: 2 min
• lavaggio con solvente: no
• flush con azoto: 1 min
Lo SpeedExtractor permette di processare
fino a 6 campioni in parallelo
Metodo PLE cartone
Test di recupero su n-alcani e standard interni
area
Riferimento:
Iniezione diretta in LC-GC
Flush 1’:
Iniezione LC-GC dopo PLE (60 °C x 5’,
100 bar, flush con azoto 1’)
1400
1200
1000
800
REFERENCE
600
FLUSH 1'
400
200
Standard interni e di verifica:
MOSH C11
CyCy (cicloesil cicloesano)
C13
CHO (colestano)
MOAH
5B (n-pentil benzene
1MN (1-metilnaftalene)
2MN (1-metilnaftalene)
TBB (tri-ter-butil benzene)
0
C10 C12 C14 C16 C18 C20 C22 C24 C26 C28 C30 C32 C34 C36 C38 C40
area
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
REFERENCE
FLUSH 1'
C11
CyCy
C13
Cho
5B
1-MN
2-MN
TBB
Con un flush di azoto di 1 min (necessario a scaricare solvente residuo dalla cella)
non si osservano perdite né di n-alcani più volatili, né di standard interni.
Ottimizzazione metodo PLE cartone
Scelta del solvente di estrazione
Testati 3 diversi solventi
(1 ciclo, 60°C, 5 min):
• esano
• etanolo
• esano/etanolo (1:1)
Non si osservano differenze apprezzabili
per MOSH<C24 e per MOAH.
Il minore potere estraente dell’etanolo nei
confronti di MO basso bollenti, osservata
per il metodo Lorenzini non viene
confermata con il metodo PLE
possibilità di utilizzare solo esano (no
post trattamento campione)
Hexane/ethanol (1:1)
ethanol
hexane
Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252
Ottimizzazione metodo PLE cartone
Scelta del solvente di estrazione
In figura sono riportati i
tracciati LC-GC ottenuti
estraendo un campione di
cartoncino riciclato non
stampato (viola) e stampato
(blu) con solo esano e con
miscela esano/etanolo (1:1).
I 2 solventi mostrano
selettività comparabili.
Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252
Ottimizzazione metodo PLE cartone
Effetto temperatura e tempo di estrazione
MOAH
MOSH
60-70 °C
60-70 °C
30 °C
30 °C
Le rese di estrazione (1 ciclo, esano, 5 min, 100 bar) aumentano con la T
passando da 30°C a 60°C (a 30°C vengono estratti circa 80% dei MOH presenti).
Non si osservano ulteriori incrementi della resa di estrazione tra 60°C e 70°C.
Non si osservano differenze apprezzabili aumentando tempo di estrazione da 5 a
10 min.
Ottimizzazione metodo PLE cartone
Numero cicli di estrazione e recupero
Testati 4 cartoncini diversi di cui 2 dello stesso tipo ma diverso spessore:
1 ciclo estrazione  recuperi MOSH compresi tra 76 e 100%
2 cicli estrazione  recuperi praticamente quantitativi per tutti e 4 i campioni.
Le rese di estrazione con 1 ciclo sono
influenzate dallo spessore del
cartoncino.
La figura mostra i tracciati LC-GC
ottenuti per un campione con 2 cicli
consecutivi (blu), 1 ciclo (viola), 2° ciclo
separato (verde), 3° ciclo separato
(marrone), 1 ciclo + lavaggio con esano
(nero).
MOSH
MOSH
22 cycles
cycles
1 cycle
cycle++wash
wash
1
1°
cycle
1 cycle
2°cycle
cycle
2°
3°cycle
3° cycle
MOAH
MOAH
22 cycles
cycles
Per ottenere rese quantitative e
indipendenti dal tipo di cartoncino sono
necessari 2 cicli di estrazione
2° cycle
cycle
2°
3°cycle
3° cycle
cycle ++wash
1 cycle
wash
1°
cycle
1 cycle
Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252
Ottimizzazione metodo PLE cartone
Ripetibilità (n=8)
MOSH
MOAH
RSD<5% sia per MOSH che per MOAH (8 repliche effettuate su campione
cartone riciclato non stampato)
Metodo PLE cartone
Confronto con metodo SE
I profili LC-GC ottenuti
con PLE ottimizzato
risultano perfettamente
sovrapponibili a quelli
ottenuti con metodo SE
(Lorenzini et al., 2010)
Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252
Metodo PLE cartone
Applicazione metodo PLE e confronto con metodo SE
Moret et al. Talanta 115 (2013) 246-252
Metodo PLE cartone
Condizioni ottimizzate
Vantaggi metodo PLE:
• minor manipolazione campione, risparmio tempo (6 campioni in
parallelo in meno di 30 min)
• non è necessario alcun post-trattamento dell’estratto prima
dell’iniezione
Estrazione da alimenti secchi a basso contenuto
di grasso confezionati in imballaggi di cartone
• I MO migrati dall’imballaggio tendono a rimanere in superficie per cui risultano
facilmente estraibili con solvente apolare
• la contaminazione pre-esistente (che può avere diverse origini) risulta più
fortemente inclusa nella matrice e quindi più difficilmente estraibile (necessità di
utilizzare idonea miscela di solventi)
Sono stati ottimizzati 2 metodi PLE
1) PLE-A: per estrazione MO migrati dall’
imballaggio
2) PLE-B per estrazione MO totali da diverse
fonti di contaminazione
Metodo PLE-A (MO migrati dal packaging)
Preparazione del campione
Pastina, riso o altri cereali in grani (circa 8 g) vengono caricati direttamente
in cella di estrazione da 10 mL cell (non si utilizzano agenti disperdenti).
Pasta di formato più grande deve essere ridotta in pezzi grossolani.
Condizioni testate
• Solvente di estrazione: esano (1-2 cicli)
• Temperatura di estrazione: 80-100-120 °C
• Pressione: 100 bar
• “Heat up”: 1 min
• Tempo di estrazione (hold time): 5-10 min
• Scarico: 2 min
• Lavaggio con solvente: no - si (2 mL/min x 180’’)
• Lavaggio con azoto: 2 min
Metodo PLE-A
Ottimizzazione dei parametri di estrazione
Non si osservano differenze di estrazione
significative al variare della temperatura
(80-100-120°C) e del tempo di estrazione
(5-10 min).
I recuperi ottenuti con 1 ciclo di
estrazione (5 min a100 °C) non
sono quantitativi.
Un lavaggio con esano effettuato
alle fine dell’estrazione permette
di ottenere recuperi praticamente
quantitativi
Pasta semola dopo 3
mesi di contatto con
cartone riciclato
Metodo PLE-A
1 ciclo esano +
lavaggio con
solvente
2° ciclo di
estrazione
Tracciati LC-GC ottenuti a 80, 100 and 120 °C for 5
min e a 100 °C for 10 min (1 ciclo)
Metodo PLE-A
(Ripetibilità n=6)
MOSH
MOAH
RSD<5%
Sopraposizione di 6 repliche di analisi dello stesso campione di pasta dopo contatto (9
mesi) con cartone riciclato
Metodo PLE-A
Condizioni ottimizzate metodo PLE-A
Speed Extractor E-916 (6 positions)
Temperature
100 °C
Pressure
100 bar
Cells (volume)
10 mL
Solvent
hexane
Cycles (number)
1
- Heat up
1 min
- Hold time
5 min
- Discharge
2 min
Flush with solvent
180’’ at 2 mL min-1
Flush with gas (N2)
1 min
Total solvent consumption
13 mL
Total extraction time
< 20 min (wash included)
Moret et al., 2013 (submitted)
Il metodo PLE-A permette
estrazione quantitativa degli
idrocarburi migrati
dall’imballaggio ad alimenti
secchi a basso contenuto di
grasso (pasta semola, riso,
cereali in grani).
L’estratto può essere iniettato
direttamente previa eventuale
centrifugazione
Per ottenere estrazioni
quantitative di MOSH e MOAH
da campioni di pasta
all’uovo è necessario allungare
i tempi di estrazione
Estrazione di MO totali
L’estrazione di MO totali dagli alimenti può risultare più o meno difficoltosa in
funzione della natura dell’alimento
Metodi disponibili a questo scopo:
 Metodo Biedermann-Brem e Grob (2010): trattamento con acqua calda (1h a 80°C)
seguito da estrazione con etanolo (1h) e poi con esano (overnight)  lavaggio
estratti combinati con acqua (applicata a pasta)
 Idrolisi acida (applicata a latte in polvere)
 Saponificazione (tradizionale)
Questi metodi richiedono lunghi tempi di estrazione ed elevati consumi di
solvente
La PLE rappresenta una interessante alternativa
Metodo PLE-B (MO totali)
Preparazione del campione:
Campione finemente macinato. La cella di estrazione viene riempita (dal
basso) con un letto di sabbia (5 g), 2 g di campione mescolato a sabbia (6
g), addizionato con IS e riempito di sabbia lasciando in testa alla cella un
volume vuoto di circa 1 mL.
Condizioni testate
• Solvente di estrazione: esano, etanolo, acetone, esano/etanolo (1:1),
esano/acetone (1-2-3 cicli)
• temperatura di estrazione: 100-120 °C
• Pressione: 100 bar
• Heat up: 1 min
• tempo di estrazione: 5-10 min
• Scarico: 2 min
• Lavaggio con solvente: si/no
• Flush con azoto: 2 min
Metodo PLE-B (MO totali)
Scelta del solvente di estrazione
hexane/ethanol (1:1)
hexane
acetone
hexane/acetone (1:1)
8
12 min
Moret et al, 2013 (submitted)
La miscela esano/etanolo da le rese di estrazione più elevate.
Metodo PLE-B (MO totali)
Temperatura di estrazione
100 -120°C
150°C
A 150 °C si osserva un imbrunimento del campione e una leggera
diminuzione della resa di estrazione.
Metodo PLE-B (MO totali)
Numero cicli ed efficienza di estrazione
1° cycle
2° cycle
3° cycle
8
12 min
Moret et al, 2013 (submitted)
4
Per ottenere rese quantitative è necessario effettuare 2 cicli di estrazione.
Prove effettuate in triplice su 3 campioni con diversi profili di contaminazione
hanno evidenziato recuperi superiori al 95%
Metodo PLE-B (MO totali)
Confronto metodo PLE-B – estrazione classica con solvente
PLE method B
hexane/ethanol 1:1
soaking with hot water +
ethanol extraction (1h)
hexane extraction overnight
hexane extraction
overnight
4
Moret et al., 2013 (submitted)
8
12
16 min
Il metodo PLE-B da risultati confrontabili a quelli ottenuti con metodo
proposto da Biedermann-Brem e Grob, e permette di ridurre tempi di analisi,
consumo di solventi e manipolazione campione
Metodo PLE-B (MO totali)
Ripetibilità
6 repliche effettuate con il metodo ottimizzato su 2 campioni con diverso livello di
contaminazione pre-esistente: livello basso (0.8 mg/kg) e livello alto (13.7 mg/kg)
hanno evidenziato una buona ripetibilità (RSD< 6%)
0.8 mg/kg
13.7 mg/kg
Metodo PLE-B
Condizioni ottimizzate metodo PLE-B
Speed Extractor E-916 (6 positions)
Temperature
100 °C
Pressure
100 bar
Cells (volume)
10 mL
Solvent
Hexane/ethanol 1:1 (v/v)
Cycles (number)
2
- Heat up
1 min
- Hold time
5 min
- Discharge
2 min
Flush with solvent
no
Flush with gas (N2)
1 min
Total solvent consumption
15 mL
Total extraction time
28 min
Moret et al., 2013 (submitted)
Post-trattamento campione
L’estratto raccolto in vial (da 60
mL) viene addizionato di acqua
per allontanare l’etanolo. Una
sosta di 15-20 min a -20 °C
permette di evitare la
centrifugazione per separare la
fase esano (che può essere
iniettata direttamente o previa
concentrazione)
Esempio di applicazione metodo PLE cartone
e metodo PLE-A
MOSH
MOAH
3 diversi alimenti, stesso formato (riso, riso parboiled, pastina semola) a contatto
con 2 diversi cartoni (6 settimane a T ambiente)  livelli di migrazione comparabili
per le 2 tipologie di riso, sensibilmente più bassi per pastina semola
Esempio di applicazione combinata dei metodi
PLE-A e PLE-B
PLE-Ain ecampioni
PLE-B (1)
pasta semola
PLE A
PLE A
a
b
MOSH
MOAH
Migrated from
packaging
T9
PLE-B estrae MO totali
T1
T9
T1
T0
T0
PLE B (total contamination)
c
PLE B after PLE A
d
MOSH
T9
MOSH
Pre-existing
contamination
T1
T9 T1
T0
4
Moret et al., 2013 (submitted)
8
PLE-A permette di
estrarre selettivamente
MO migrati da
packaging
T0
12
8
12 min
Applicando in
successione PLE-A e
PLE-B (su campione
previamente macinato)
è possibile evidenziare
contaminazione preesistente anche in
presenza di
contaminazione da
imballaggio
Estrazione con le microonde
Estrazione con le microonde
Microwave Assisted
Saponification (MAS)
5g campione macinato
+ 10 mL KOH in CH3OH
+ 10 mL esano
Microwave Assisted
Extraction (MAE)
5g campione macinato
+ 10 mL esano/etanolo 1:1
120 °C x 20 min
Lavaggio con acqua
dell’estratto esanico
LC-GC-FID on-line
SPE GC-FID off-line
H (2 cicli) - 20 LUGLIO
Confronto metodi: PLE-B / MAS / MAE
in campioni di pasta di semola
PLE-B
MAS
MAE
Applicazione
Applicazionemetodo
metodoMAS
MASaacampioni
campionicon
conelevato
elevato
contenuto
contenutodidigrasso
grasso
Latte in polvere
Omogenizzato al formaggio
Biscotto 1
Il metodo MAS rappresenta
la scelta migliore per
l’estrazione di MO da
alimenti ad elevato
contenuto di grasso.
Biscotto 2
Migliorano limiti di
rilevabilità, si allungano i
tempi di vita delle colonne
Conclusioni
 L’estrazione degli analiti dal campione rappresenta una fase
importante della determinazione analitica e va opportunamente
ottimizzata in funzione della natura della matrice e delle finalità da
raggiungere
 Recentemente sono stati sviluppati diversi metodi di estrazione
basati sull’impiego di tecniche innovative (PLE, MAE, MAS)
 In particolare sono stati sviluppati e applicati un metodo PLE per
estrazione MOSH e MOAH da carta e cartone, un metodo PLE per
estrazione selettiva di MOSH e MOAH da alimenti secchi a basso
contenuto di grasso, un metodo PLE per l’estrazione MOSH e
MOAH totali e un metodo MAS particolarmente idoneo al trattamento
di campioni con un elevato contenuto di grasso
Grazie per l’attenzione
UNIVERSITY OF UDINE, ITALY

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