do arquivo - Programas de Pós

Dissertação
ESTUDO DO EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE ÔMEGA-3 NA
ATIVAÇÃO DO HOMING DE CÉLULAS-TRONCO EM RATOS
Luiza Halmenschlager
INSTITUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL
FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Cardiologia
ESTUDO DO EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE ÔMEGA-3 NA
ATIVAÇÃO DO HOMING DE CÉLULAS-TRONCO EM RATOS
Autora: Luiza Halmenschlager
Orientadora: Dra. Melissa Medeiros Markoski
Dissertação submetida como requisito para
obtenção do grau de mestre ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
Área de concentração: Cardiologia da
Fundação Universitária de Cardiologia
Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre, 2013
H194e
Halmenschlager, Luiza
Estudo do efeito da suplementação de ômega-3 na ativação do
homing de células-tronco em ratos/ Luiza Halmenschlager;
orientação [por] Melissa Medeiros Markoski - Porto Alegre,
2013.
86f; tab.
Dissertação (Mestrado) - Instituto de Cardiologia do Rio
Grande do Sul / Fundação Universitária de Cardiologia Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013.
1.Ácido graxo ω-3.2.SHR.3.Wistar Kyoto.4. Homing celular.
5.Hipertensão Arterial Sistêmica.I. Melissa Medeiros Markoski.
II.Título.
CDU: 602.9:591.81
Bibliotecária Responsável: Marlene Tavares Sodré da Silva
CRB 10/1850
Aos meus pais, Maria Leopoldina e Mário José, que
sempre acreditaram na minha trajetória de estudo.
A vocês dedico este trabalho.
IV
AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS, por me iluminar com sua força suprema me fortalecendo a
cada dia e permitindo que enfrentasse todos os obstáculos.
Aos meus pais, Mário José Halmenschlager e Maria Leopoldina, pelo apoio
incondicional em todas as etapas de minha vida.
Ao meu irmão Carlos Augusto que sempre me incentivou a estudar e pelo
exemplo de dedicação ao trabalho.
Ao meu amor Márcio, pelo incentivo e compreensão em todos os momentos
necessários, por ter tido paciência ao longo dessa trajetória.
A minha querida orientadora, Dra. Profa. Melissa Medeiros Markoski, pela
honra de convívio, pela clareza de pensamentos, por todos os ensinamentos, paciência e
estímulo à execução desta tese. Sem a orientação de você nada disso seria possível.
Muito obrigada!
A Lucinara Dadda Dias, pelo acolhimento no laboratório, por toda a
disponibilidade, auxílio e força. Muito obrigada!
A Graziela Hünning Pinto e Thiago Rodrigues Peres, pelo total auxílio no LEA
(Laboratório de Experimentação Animal), pela amizade e carinho.
Aos profissionais e colegas do LEA, veterinária Dra. Luiza Macedo, bióloga
Marta Speck, pelo apoio e contribuição com os animais.
Ao colega Ariel Silveira, pelo auxílio e disponibilidade na análise dos dados dos
animais. Obrigada pela contribuição no trabalho.
A Rafaela Paris Feijó, pelo auxílio com os animais durante a pesquisa. Obrigada
pela ajuda!
V
Aos colegas pós-graduandos do Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular
do Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul, Bruna Eibel, Carine Ghem, Grasiele
Sauser, Melissa Kritochek da Silva, Dra. Paula Rohr, pela ajuda, dedicação e carinho.
A colega nutricionista Luciana Dresseno, por te me incentivado na parte prática
da pesquisa. Obrigada pela amizade e força!
Ao colega, Matheus Becker, pelo importante auxílio nos laboratório.
A secretária do Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular, Ludmila
Markoski, pela gentileza e alegria.
Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação em Ciências da Saúde /
Cardiologia, pelo auxílio na viabilização desta tese.
Todos os professores, pelos conhecimentos transmitidos.
Aos amigos, que souberam entender os momentos de angústia e ausência e que
estiveram ao meu lado nas horas necessárias. Obrigada pela paciência!
Todos os colegas, ex-colegas e amigos do IC-FUC, em especial, a Camila Brum
e Tatiana Brito, pelo apoio e amizade.
Ao Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul / Fundação Universitária de
Cardiologia (IC-FUC) por me acolher durante tantos anos e por proporcionar agradável
local de estudo e pesquisa.
Ao Fundo de Apoio à Pesquisa do Instituto de Cardiologia do RS (IC-RS) à
FAPICC - Fundo de Apoio do Instituto de Cardiologia / Fundação Universitária de
Cardiologia à Ciência e Cultura, CAPES, pelo apoio financeiro.
Todos que, de forma direta e indireta, contribuíram para realização desse
trabalho. Muito obrigada! Valeu!
VI
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................................1
BASE TEÓRICA..........................................................................................................................3
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................4
2. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E DIETA...................................................................7
2.1. HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA ........................................................................7
2.2. DIETA E HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA.......................................................10
3. ÁCIDOS GRAXOS................................................................................................................14
3.1. ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA ............................................................................................14
3.1.1. Ácidos Graxos Ômega-3...........................................................................................15
3.1.1.1. Óleo de Peixe........................................................................................................17
3.2. METABOLISMO................................................................................................................18
3.3. PADRÕES NUTRICIONAIS............................................................................................ 19
4. INFLUÊNCIA DO ÔMEGA-3 NA PATOFISIOLOGIA CARDIOVASCULAR.............22
4.1. BREVE HISTÓRICO.........................................................................................................22
4.2. EFEITOS NO ORGANISMO.............................................................................................24
4.2.1. Efeitos Anti-inflamatórios........................................................................................25
4.2.1.1. Efeitos na Função Endotelial..............................................................................25
4.2.1.2. Efeitos na Inibição da Agregação de Plaquetas..................................................26
4.2.1.3. Efeitos na Redução da Pressão Arterial..............................................................27
4.2.1.4. Efeitos nas Dislipidemias.....................................................................................28
5. O PAPEL DOS ÁCIDOS GRAXOS NA REGENERAÇÃO TECIDUAL........................30
6. CÉLULAS-TRONCO............................................................................................................33
6.1. DEFINIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO...................................................................................33
7. HOMING DE CÉLULAS-TRONCO....................................................................................39
7.1. DEFINIÇÃO DE HOMING................................................................................................39
VII
7.2. FATOR 1 DERIVADO DE ESTROMA (SDF-1)...............................................................40
7.3. RECEPTOR 4 DE QUIMIOCINAS DA FAMÍLIA CXC..................................................42
8. JUSTIFICATIVA....................................................................................................................43
9. OBJETIVO..............................................................................................................................44
9.1. OBJETIVO GERAL...........................................................................................................44
9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................................44
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA BASE TEÓRICA..........................................45
11. ARTIGO................................................................................................................................55
RESUMO.....................................................................................................................................57
INTRODUÇÃO............................................................................................................................58
MÉTODOS...................................................................................................................................60
ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................................................................65
RESULTADOS.............................................................................................................................66
DISCUSSÃO................................................................................................................................69
REFERÊNCIAS...........................................................................................................................74
LISTA DE LEGENDAS...............................................................................................................77
TABELAS....................................................................................................................................80
12. ANEXOS................................................................................................................................86
12.1. CERTIFICADO DE ANÁLISE DO CONTROLE DA QUALIDADE............................86
VIII
1
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico
AGPI-CL - Ácido Graxo Poli-insaturado de Cadeia Longa
AHA – Associação Americana do Coração (do inglês; American Heart
Association)
BMMC - células mononucleares da medula óssea (do inglês, Bone Marrow
Mononuclear Cells)
CRNI – do inglês; Canadian Recommended Nutrient Intake
CXCR-4 – Receptor 4 de quimiocinas da família CXC
DAC – Doença Arterial Coronariana
DASH – do inglês; Dietary Approachs to Stop Hypertension
DCV – Doenças Cardiovasculares
DHA – Ácido Docosahexaenóico
EPA- Ácido eicosapentaenóico
FDA – do inglês; U.S Food and Drug Administration
FOSHU – Alimentos para uso específico de saúde (do inglês; Foods for
Specified Health Use)
GISSI – Gruppo Italiano per ló Studio della Sopravivenza nell Infarto
Miocardico Prevenzione
GRAS – Segura para consumo humano (do inglês; Generally recognized as
safe)
GRKs – Receptor Quinase Acoplado a Proteína G
HAS – Hipertensão Arterial Sistêmica
HIF-1 – Fator de Transcrição Induzível por Hipóxia
hMSC – Célula-Tronco Mesenquimal Humana
HNF – do inglês; Hepatocyte Nuclear Factor Kappa B
HSC – Células-Tronco Hematopoéticas (do inglês; Hematopoietic Stem Cells)
IL-1 – Interleucina 1
IL-8 – Interleucina 8
2
ISSFAL – Sociedade Internacional para Estudos de Ácidos Graxos e Lipídios
(do inglês; International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids)
JELIS - Effects of eicosapentaenoic acid on major coronary events in
hypercholesterolaemic patients
LDL - colesterol - Lipoproteínas de Baixa Densidade
LPL – lipoproteína lípase (do inglês, lipoprotein lipase)
MO – Medula Óssea
MSC – Células-Tronco Mesenquimais (do inglês; Mesenchymal Stem Cells)
MUFA – Ácidos Graxos Monoinsaturados (do inglês; Monounsaturated Fatty
Acids)
NCEP/ATP III – Programa Nacional de Educação em Colesterol (do inglês;
National Cholesterol Education Program/Adult Treatment Panel III)
OMS – Organização Mundial de Saúde
PA – Pressão arterial
PPR-α – do inglês; Peroxime Proliferator Actived Alpha
PUFA – Ácidos Graxos Poli-insaturados (do inglês; Poly Insaturated Fatty
Acids)
SDF-1 – Fator-1 Derivado de Estroma (do inglês; Stromal Derived Factor-1)
SHR – Ratos Espontaneamente Hipertensos (do inglês; Spontaneously
Hypertensive Rats)
SREBP – do ingles; Sterol Regulatory Element-binding Proteins
Wistar Kyoto (WKY) – Ratos Wistar Kyoto (do inglês, Wistar Kyoto rats)
3
BASE TEÓRICA
4
1. INTRODUÇÃO
As Doenças Cardiovasculares (DCV) são uma das principais causas de
morbidade e mortalidade, e múltiplos estudos epidemiológicos associam a composição
da dieta aos principais fatores de risco. A Organização Mundial de Saúde (OMS)
reiterou recentemente que o consumo de dietas inadequadas, juntamente com a
inatividade física, está entre os dez principais fatores determinantes de mortalidade1. A
Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) e as dislipidemias, entre outros fatores de risco,
são as que mais contribuem para esse quadro, além de estarem associados a várias
causas de doenças crônicas não transmissíveis, são considerados uma das causas mais
importantes de redução da qualidade e expectativa de vida2. Atualmente, já é bem
documentado que as DCV podem ser prevenidas e controladas por um estilo de vida
saudável.
Na última década, progressos significativos nas técnicas de biologia molecular e
celular revolucionaram abordagens na Ciência da Nutrição com fins de melhora de
qualidade de vida e tratamento de doenças. Isto tem estimulando os pesquisadores a
examinarem o papel dos ácidos graxos ômega-3 (ω-3) em relação a uma série de
doenças, particularmente as DCV. Os ácidos graxos ω-3 são uma classe essencial de
ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) encontrados principalmente no óleo de peixe. É
consenso científico de que é necessário aumentar a concentração de ácidos graxos ω-3
na dieta habitual.
O aumento das evidências sugere que os ácidos graxos ω-3 apresentam um papel
protetor nas doenças coronarianas e suas complicações, pois, metabolicamente, eles
diminuem a produção hepática de triacilglicerol e apoliproteina B (apo-B), os principais
constituintes lipídicos e proteicos das VLDL (lipoproteínas de densidade muito baixa)3.
5
Entre os efeitos fisiológicos humanos, decorrentes do consumo dos ácidos
graxos ω-3, destaca-se pela capacidade de produzir efeitos fisiológicos e/ou
metabólicos, atuando na prevenção e/ou tratamento de doenças como, HAS4, artrite5,
diabetes6, psoríase7 e câncer8. Assim, para atingir as recomendações indicadas em
termos de ácidos graxos, são necessárias modificações na alimentação, incluindo dieta
balanceada com o aumento no consumo de ácidos graxos da série ω-3.
Com base no exposto acima, o estudo se propôs a analisar as questões referentes
ao processo fisiológico denominado homing celular de células-tronco em ratos,
principalmente sobre o efeito cardioprotetor dos ácidos graxos ω-3. Homing é o
processo pelo qual, interações moleculares fazem que as células, atraídas por sinais
específicos, implantem-se em um nicho tecidual adequado9,10. Uma das principais
moléculas envolvidas com o homing de células-tronco é o Fator 1 derivado de estroma
(SDF-1 - Stromal Derived Factor-1), uma proteína essencial para a mobilização das
células-tronco11. O SDF-1 e seu receptor CXCR-4 (Receptor 4 de quimiocinas da
família CXC) são funcionalmente expressos em uma infinidade de tecidos e de tipos
celulares, incluindo os diferentes subtipos de leucócitos, as células progenitoras
hematopoéticas e células não hematopoéticas, tais como as células endoteliais ou
epiteliais12,13. Considerando a importância do eixo SDF-1 – CXCR-4 como mecanismo
fundamental para a permanência das células-tronco em um órgão, a expressão de SDF-1
por órgãos lesionados, desempenharia um papel preponderante no homing dessas
células, visando à regeneração tecidual. Ao incrementar localmente a concentração de
SDF-1, as células migrariam na direção do fator, portanto, chegariam ao órgão com a
injúria.
6
Levando em consideração que as DCV e, entre elas, a HAS, são responsáveis
por uma das principais taxas de mortalidade mundial, predominando em diversos
grupos populacionais, é válido examinar o papel da suplementação com ácidos graxos
ω-3 na ativação do homing de células-tronco e sua relação com a fisiopatologia da
hipertensão.
7
2. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E DIETA
2.1. HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA
As Doenças Cardiovasculares (DCV) são responsáveis pela maior taxa de
morbidade e mortalidade na maioria dos países, despertando interesse especial por
atingirem grandes contingentes populacionais, além de representarem elevados custos
sociais e econômicos. Estima-se que, no mundo todo, haverá um aumento expressivo
nas taxas de mortalidade por DCV, passando de 16,7 milhões no ano de 2.002 para 23,3
milhões em 2.03014. A maior longevidade associada a um estilo de vida com maior
exposição a fatores de risco para as DCV são considerados as principais razões deste
incremento14.
Relatórios da OMS revelam que as DCV foram responsáveis por cerca de 30%
de todas as mortes que ocorreram no mundo, o que corresponde a quase 15 milhões de
óbitos por ano, sendo que a maioria (9 milhões) é proveniente dos países em
desenvolvimento15. Esses dados reforçam a importância das DCV, exigindo a adoção de
medidas preventivas primárias e secundárias efetivas.
Do ponto de vista etiológico, a HAS é apontada como o fator de risco mais
significativo para as DCV, pois cerca de 80% das mortes por acidente vascular cerebral
(AVC) e de 40% dos óbitos por doença isquêmica cardíaca resultam de HAS. A doença
hipertensiva por si só responde diretamente a cerca de 5% dos óbitos dentro do grupo
das DCV2.
A HAS é definida como uma patologia de caráter multifatorial caracterizada por
níveis elevados e sustentados de pressão arterial (PA), mais precisamente pressão
sistólica maior ou igual a 140 mm Hg e pressão diastólica maior ou igual a 90 mm Hg16.
Associa-se frequentemente a alterações funcionais e/ou estruturais dos órgãos-alvo
8
(coração, encéfalo, rins e vasos sanguíneos) e a alterações metabólicas, com
consequente aumento do risco de eventos cardiovasculares fatais e não fatais17,18.
Nos últimos anos, a prevalência tem crescido e baixas taxas de controle têm sido
registradas, resultando em um dos mais preocupantes problemas de saúde pública no
nosso país. No Rio Grande do Sul dados de prevalência de HAS mostram tendência à
elevação19,20. Em Porto Alegre, a incidência de novos casos é de 39/1000 pessoas-ano e
elevando-se para 59/1000 pessoas-ano entre pré-hipertensos, indicando que 80% deles
tornar-se-ão hipertensos em 10 anos21.
A OMS estima que cerca de três quartos dos pacientes hipertensos não atingem
valores ótimos de pressão arterial22. Na sua etiologia estão implicados a idade, a
genética, o gênero e a etnia, denominados de fatores de risco não modificáveis. Já os
fatores ambientais são passíveis de intervenção e assim permitem tanto a prevenção da
HAS quanto a promoção do seu controle23.
Os principais fatores de risco para as DCV, conforme os dados epidemiológicos,
apontam que a probabilidade de um indivíduo de 50 anos, sem exposição a fatores de
risco conhecidos, desenvolver um evento coronariano é de 6% em 10 anos; enquanto
que um indivíduo de 60 anos passa a ter a probabilidade de 9% para desenvolver o
mesmo evento24.
É necessário o entendimento dos fatores de risco para HAS para compreender a
melhor maneira de controlar e tratar a pressão arterial25. No estudo de Framingham,
dentre os indivíduos com hipertensão arterial, os eventos cardiovasculares ocorreram
com maior frequência na presença de pelo menos dois fatores de risco, demonstrando
que o risco de eventos é proporcional à associação dos fatores de risco26,27.
A contribuição de fatores genéticos para a gênese da HAS está bem estabelecida
na população28. Até o momento, não existem, variantes genéticas que possam ser
9
utilizadas para predizer o risco individual de se desenvolver HAS29. E embora o quadro
geral de fatores de risco que determinam o aumento da pressão arterial ao longo do
tempo esteja bem estabelecido, os mecanismos que envolvem esse aumento e aqueles
que tentam compensá-lo, ainda não estão totalmente esclarecidos. Assim, animais de
pequeno porte, especialmente ratos e camundongos, vêm sendo utilizados como
modelos que envolvem os processos da HAS30-32.
Ratos espontaneamente hipertensos (“Spontaneously Hypertensive Rats” - SHR)
mimetizam a HAS de humanos em vários aspectos. Estes modelos animais
desenvolvem HAS entre a 8ª e 12ª semana de vida, o que decorre do aumento da
atividade simpática e remodelamento anatômico do sistema cardíaco, principalmente,
hipertrofia ventricular esquerda30,31. Isto por sua vez também, contribui para o aumento
da PA e o aumento da resistência vascular periférica (RVP), através do espessamento da
parede dos vasos31. A grande vantagem de utilização do modelo SHR é a forma pela
qual a HAS se estabelece: espontânea e sistêmica. Estas características são importantes
para estudos que tenham a HAS como doença poligênica e não como fator isolado da
hipertensão. Além dessa característica, a PA nesse modelo experimental possui aumento
gradativo com passar da idade, e evolui com dano em órgão-alvo30,31,33, conforme
ocorre em humanos.
Alguns dos aspectos fisiopatológicos que correlacionam a HAS e dislipidemias,
por exemplo, estão relacionados à disfunção endotelial34. De acordo com Carvalho e
colaboradores (2001)35, a aderência e a migração de leucócitos circulantes para camada
íntima é um mecanismo que desencadeia o início da aterogênese. Quando relacionada à
insuficiência cardíaca (IC), com função sistólica preservada, a HAS é compreendida
como uma síndrome complexa, com um componente periférico, a vasculatura arterial, e
10
um componente central, o miocárdio (vaso-miócito-interstício), acometidos frente a
alguns estímulos agressores, provenientes do próprio quadro de HAS36.
A presença de um ou mais fatores de risco implica em maior chance de
desenvolver a doença, logo a redução da morbidade e mortalidade por DCV deve estar
direcionada na promoção de atitudes que visem mudanças nos fatores de risco
modificáveis. Dentre as medidas utilizadas para reduzir os fatores de risco para as DCV,
a intervenção dietoterápica configura-se como uma opção de grande valia, sendo de
baixo custo e de fácil acesso à população, quando compara aos orçamentos dos
tratamentos com fármacos dependentes de alta tecnologia.
2.2. DIETA E HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA
A importância da dieta e de outros fatores de estilo de vida no controle da HAS
vem sendo enfatizada nas últimas décadas37. A partir de 1960, proliferaram programas
de intervenção, principalmente nos países desenvolvidos, onde a mortalidade por DCV
era bastante expressiva. Nesse período, várias pesquisas foram voltadas à busca de
indicadores de aterogenicidade de dietas, a partir de seus conteúdos energéticos, teores
de colesterol e dos ácidos graxos saturados e insaturados38. Vários ensaios aleatorizados
demonstraram que intervenções alimentares adequadas podem diminuir39 ou prevenir
significativamente
o
aparecimento
de
diversas
doenças
crônicas
não
transmissíveis40,41,42.
O estudo Interheart43 identificou três padrões alimentares distintos após avaliar a
dieta de indivíduos de 52 países, denominados, respectivamente, dieta oriental (rica em
proteínas vegetais), dieta ocidental (rica em gordura), e dieta prudente (rica em frutas e
hortaliças). Observou-se um aumento de risco para o infarto agudo do miocárdio (IAM)
11
de aproximadamente 30% na população que segue a dieta ocidental. Associação inversa
foi obtida com o consumo de dieta denominada prudente.
Outra pesquisa, relacionando a associação da ingestão de nutrientes e HAS em
brasileiros descendentes de japoneses encontraram que o total de lipídios da dieta é um
fator de risco para as DCV. Destaque foi dado aos ácidos graxos ω-3 que tiveram
relação negativa com a HAS44. De acordo com Brady e colaboradores (2004)45,
verificaram que o desequilíbrio entre as quantidades de ômega-6 (ω-6) e ω-3, teve
grande relevância na prevalência da HAS em sua população de estudo.
Criado por Ancel Keys, na década de 50, o termo “Dieta do Mediterrâneo”,
refere-se ao padrão alimentar típico dos povos da região do Mar Mediterrâneo. Em
1945, o pesquisador Keys, quando iniciou seus estudos na região, constatou que a
população desta região, apesar de consumirem grande quantidade de gordura (35% a
40% do total de calorias diárias), de forma semelhante aos países ocidentais,
apresentavam baixa incidência de DCV46. Logo, verificou que a Dieta Mediterrânea era
rica em vegetais em grandes quantidades (frutas, legumes, hortaliças, pães e cereais
integrais), peixe e frango (carne vermelha ocasional), vinho tinto, regularmente, com
moderação, às refeições, laticínios (iogurte e queijo, principalmente) e gorduras,
representadas por nozes e óleo de oliva em abundância. Estes achados serviram de base
para o tão conhecido Estudo de Lyon, ensaio clínico randomizado (ECR) de prevenção
secundária para testar a influência de uma alimentação tipo Dieta do Mediterrâneo na
evolução de pacientes após um IAM47. O estudo havia sido planejado para cinco anos,
porém o Comitê de Ética da pesquisa Lyon interrompeu o estudo, após 27 meses devido
ao benefício observado no grupo experimental, com diminuição de 70% na mortalidade
global, principalmente por redução da mortalidade coronária. Esse primeiro relato foi
feito por Lorgeril e demais pesquisadores, no Lancet, em 199447. Após quatro anos, uma
12
análise mostrou que o efeito protetor persistia e com boa aderência dos pacientes ao
padrão dietético mediterrâneo48. Um dos ECR de prevenção primária randomizou 180
pacientes (99 homens e 81 mulheres), portadores de síndrome metabólica, de acordo
com os critérios do Programa Nacional de Educação em Colesterol (National
Cholesterol Education Program / Adult Treatment Panel III), para 2 grupos, 90 no grupo
intervenção com uma Dieta Tipo Mediterrânea, e 90 no grupo controle, com uma dieta
prudente (gorduras < 30% das calorias totais). Após 2 anos, o grupo Dieta do
Mediterrâneo, comparado ao grupo controle, apresentou redução significativa da
concentração plasmática dos marcadores inflamatórios (Proteína C Reativa, p = 0,01;
interleucina 6, p = 0,04). O grupo da Dieta do Mediterrâneo também apresentou redução
da resistência insulínica (p < 0,001) e melhora da função endotelial (p < 0,001). Ao final
do estudo, 40 pacientes, desse grupo, ainda apresentaram critérios de síndrome
metabólica, enquanto no grupo controle, 78 pacientes49. Os ácidos graxos ω-3 de origem
animal e vegetal, assim como os ácidos graxos monoinsaturados, principalmente do
óleo de oliva, como também das oleaginosas, são componentes importantes da dieta
mediterrânea e, de modo provável, participam da base protetora desse cardápio. As
evidências disponíveis, portanto, indicam que a dieta, visando à prevenção de doenças
cardiovasculares, deve incluir alimentos ricos em ácidos graxos poli-insaturados ω-3 e
monoinsaturados.
A dieta preconizada pelo estudo DASH (Dietary Approachs to Stop
Hypertension - DASH) mostrou benefícios no controle da pressão arterial, inclusive em
pacientes fazendo uso de anti-hipertensivos. Este plano alimentar enfatiza o consumo de
frutas, verduras, alimentos integrais, leite e derivados desnatados; quantidade reduzida
de gorduras saturadas e colesterol, maior quantidade de fibras, potássio, cálcio e
magnésio50. Associada à redução no consumo de sal, mostra benefícios ainda mais
13
evidentes, sendo, portanto, fortemente recomendada para hipertensos50. Compõe-se de
quatro a cinco porções de frutas, quatro a cinco porções de vegetais e duas a três
porções de laticínios desnatados por dia, com menos de 25% de gordura51. Este cardápio
equilibra macro e micro nutrientes de uma maneira considerada ideal para redução
expressiva dos níveis de pressão arterial, pois é composta de produtos com baixa
quantidade de gordura, como principalmente peixe, frango, carnes vermelhas magras e
laticínios magros. Logo, visando à diminuição do consumo de gordura saturada,
colesterol e o aumento do aporte de proteína e cálcio é possível também aumentar o
nível de gorduras poli-insaturadas. Além disso, para otimizar o efeito da alimentação
sobre a pressão arterial é recomendado reduzir a ingestão de sal (cloreto de sódio –
NaCl); controlar o peso corporal; consumir quantidades adequadas de potássio, cálcio e
magnésio e a ingestão moderada de bebidas alcoólicas52.
Atualmente, um dos enfoques da intervenção dietoterápica é justamente a
utilização de alimentos funcionais, definidos pela American Dietetic Association (ADA)
como alimentos que vão além das necessidades nutricionais básicas. De acordo com
esse conceito, alimento funcional foi definido como todo alimento processado, contendo
ingredientes que auxiliam funções específicas do organismo além de serem nutritivos,
sendo definidos em 1991, como “Alimentos para uso específico de saúde” (Foods for
Specified Health Use - FOSHU)53. Os ácidos graxos poli-insaturados da série ômega-3
estão entre os alimentos funcionais bastante pesquisados em termos de saúde
cardiovascular e dentro dessa classe, encontra-se o óleo de peixe rico em ω-353.
14
3. ÁCIDOS GRAXOS
3.1. ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA
Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos que geralmente apresentam uma cadeia
carbônica longa, não ramificada, com o número par de átomos de carbono. De acordo
com o número de átomos de carbono, os ácidos graxos classificam-se: ácidos graxos de
cadeia curta (4 – 6 carbonos); ácidos graxos de cadeia média (8-12 carbonos), ácidos
graxos de cadeia longa (14-18 carbonos), ácidos graxos de cadeia muito longa (20
carbonos ou mais)54,55. Classificam-se em ácidos graxos saturados (AGS) ou ácidos
graxos insaturados, sendo que, os ácidos graxos insaturados são subdivididos nas
categorias monoinsaturadas (AGMI) ou MUFA (Monounsaturated Fatty Acids) (uma
única dupla ligação) ou PUFA (Poly Insaturated Fatty Acids - PUFA) do tipo ômega-3
(ω-3), comumente referenciado ácido graxo poli-insaturado (com duas ou mais duplas
ligações dupla), sendo essenciais para funções metabólicas e estruturais nas células54-56.
A família ômega de ácidos graxos apresenta essa denominação devido à posição
metila na molécula ácido graxo, correspondendo à distância entre o radical metila
terminal e a primeira dupla ligação da molécula (ligação ômega). Os principais
representantes desse grupo são: ω-3 (ácido α-linolênico), ω-6 (α-linoléico e ácido
araquidônico ou AA) e ω-9 (ácido oléico). Os ácidos graxos da série ω-3 apresentam o
maior comprimento de cadeia e são altamente poli-insaturados55.
Em humanos, os ácidos α-linolênico (ALA) e os ácidos α-linoléico (LA), são
necessários para manter, sob condições normais, as membranas celulares, as funções
cerebrais e a transmissão de impulsos nervosos. Também participam da transferência do
oxigênio atmosférico para o plasma sanguíneo, da síntese da hemoglobina e da divisão
celular57,58. São considerados essenciais para os mamíferos, pois são precursores
15
necessários para a síntese de outros ácidos e precisam ser obtidos por meio da dieta.
Uma vez ingeridos eles podem ser convertidos em outros ácidos graxos poli-insaturados
como o Ácido Eicosapentaenóico, EPA (22:5, ω-3); Ácido Docosahexaenóico, DHA
(22:6, ω- 3); e Ácido Araquidônico, AA (20:4, ω-6)59.
O ALA permite a formação de dois importantes ácidos graxos de cadeia longa:
EPA e DHA. O EPA relaciona-se principalmente com a proteção da saúde
cardiovascular, e o DHA é considerado fundamental para o desenvolvimento do cérebro
e sistema visual, associado à saúde materno infantil60. O ácido EPA e o AA, também
podem ser incorporados aos fosfolipídios, mas os ácidos graxos EPA têm maior
afinidade para tal, melhorando a permeabilidade e a fluidez da membrana celular61.
Estão presentes em peixes, como, por exemplo, salmão, arenque, bacalhau e cavala e
seu alto conteúdo de EPA e DHA, no pescado, é consequência do consumo do
fitoplâncton pelos mesmos. O fitoplâncton é, por excelência, rico em AGPI da série ω-3,
sendo que seu conteúdo varia em função da sua disponibilidade, localização e estação
do ano62.
As plantas terrestres e aquáticas (marinhas) são as principais fontes de AGE. Os
ácidos graxos LA, podem ser encontrados em grande abundância nas sementes de
plantas oleaginosas, principalmente nos óleos de soja, milho, girassol e nas castanhas57.
Já as principais fontes dos graxos ácidos ALA são os óleos de peixe, algas, plantas e
animais marinhos.
3.1.1. Ácidos Graxos Ômega-3
Os ácidos graxos essenciais ω-3 são caracterizados pela presença de uma dupla
ligação no carbono 3. Há dois subgrupos de ω-3, um derivado de óleos vegetais,
compostos por 18 átomos de carbono e três duplas ligações, denominado ácido α-
16
linolênico, e outro subgrupo derivado dos óleos de peixe, composto em sua maioria de
EPA e o DHA. Estes são considerados uma classe essencial de ácidos graxos poliinsaturados derivados principalmente de óleo de peixe63,64. Nos peixes, as maiores
concentrações encontram-se nos marinhos que são provenientes de água frias e
profundas, com quantidade considerável de ácido graxo ω-364 (Tabela 1).
Tabela 1 – Principais fontes alimentares de ácidos graxos ω-3
FONTE
Gramas de ω-3 em 100g de alimento
Cavala
1,8 - 5,3
Sardinha
1,5 – 2,5
Arenque
1,2-3,1
Salmão
1,0 – 2,0
Atum
0,5 – 1,6
Camarão
0,2 – 0,4
Lagosta
0,3 – 0,4
Bacalhau
0,2 – 0,3
Fonte: Adaptado de Schmidit (2001)
A tabela informa as fontes ricas de ω-3 que são encontradas em peixes de águas frias como o salmão e o
atum.
O interesse pelo estudo acerca dos ácidos graxos ω-3 surgiu em 1970, pela
observação de que esquimós da Groenlândia apresentavam baixa incidência de doença
coronariana, maior tempo de sangramento e menor concentrações de lipídios e
lipoproteínas plasmáticas65. Verificou-se que as alterações não eram relacionadas a
fatores genéticos, mas ambientais, provavelmente relacionado ao alto consumo de
peixe,
hábito
diário
daquela
população.
Os
posteriormente em estudo do tipo coorte no Japão65.
resultados
foram
confirmados
17
Hoje, devido os efeitos benéficos sobre a ingestão de PUFA ω-3, as autoridades
de saúde e alimentação, recomendam aumentar a ingestão de ácidos graxos ω-3, seja
pelas vias convencionais, tais como o aumento de produtos marinhos (principalmente
peixes), ou através do desenvolvimento e consumo de alimentos enriquecidos. Outra
alternativa, para suplementar a ingestão de ácidos graxos ω-3 na alimentação é através
de consumo direto de produtos, que contenham o ácido EPA e / ou DHA, já na forma de
concentrados (cápsulas, emulsões de óleos marinhos e de azeites vegetais, ou
preparados que contenham esses ácidos graxos)66. Vários benefícios são relatados sobre
a ingestão dos ácidos graxos poli-insaturados ômega-3, sob a forma de alimentos fontes
ou óleo de peixe, que passou a ser consumido em maior abundância, estando
relacionado com a prevenção e tratamento de enfermidades cardiovasculares67.
3.1.1.1. Óleo de Peixe
Diversas pesquisas estão focadas na modificação de óleos e gorduras para a
obtenção de produtos que aliem propriedades funcionais e/ou de saúde, bem como
propriedades tecnológicas que permitam sua utilização nas linhas de processamento68,69.
Os óleos marinhos estão presentes na carne de peixes “gordos”, no fígado de
peixes “magros” e na camada de gordura de mamíferos marinhos70. O método
tradicional para a obtenção de óleo de peixe é conhecido como processo úmido, que
envolve as etapas de cozimento, prensagem e centrifugação da matéria prima71,72. Após
sua obtenção, o óleo bruto deve ser refinado para consumo humano71,73, sendo
reconhecido como Generally recognized as Safe (GRAS) pelo U.S. Food and Drug
Administration (FDA)72.
Os óleos de peixe refinados e desodorizados consistem principalmente de
triacilgliceróis com uma complexa composição em ácidos graxos (saturados, mono e
18
poli-insaturados) e alto teor de vitaminas, em especial a vitamina A70,73,74. A deficiência
de EPA e DHA na dieta, como em decorrência do baixo consumo de peixe, pode ser
suprida pela ingestão de óleo de peixe, ou ainda de suplementos ou alimentos
enriquecidos com estes ácidos graxos da série ω-375,76.
Hoje, com a “moda” das dietas e a busca de estilo de vida mais saudável a
ingestão de ácidos graxos ω-3 é utilizada para a redução de peso77, uma vez, que os
indivíduos com excesso de peso têm baixo controle da glicemia, do diabetes e do
colesterol elevado, são favorecidos pelo consumo de ácidos graxos essenciais. Os
isómeros do ácido linoléico conjugado (ALC16 ou CLA16, conjugated linolenic acid),
com propriedades anti-cancerígenas, são muito
estudados quanto ao seu efeito na
redução da adiposidade e da sensibilidade em relação à insulina humana; controle da
função imunológica e, ainda, dos marcadores de aterosclerose, da diabetes e de risco de
obesidade78.
O óleo de peixe encapsulado possui vantagens com relação à estabilidade física,
química e facilidade de ingestão quando comparado com a forma não encapsulada. A
cápsula é uma apresentação farmacêutica formada por um envoltório de gelatina ou
celulose que protegem o óleo da oxidação e deterioração. Outro benefício é a facilidade
de administração e transporte do produto pelo consumidor79.
3.2. METABOLISMO
Cada família de ω-3 e ω-6 origina-se de um ácido graxo precursor específico, o
qual é convertido em outros ácidos graxos da mesma série, através de sucessivas
reações enzimáticas, onde ocorre adição de novos carbonos e insaturações da cadeia
original80. Todos os mamíferos podem sintetizar ácidos graxos a partir de moléculas de
acetil-CoA. O produto final da enzima ácido-graxo-sintetase é o ácido palmítico, que
19
pode ser modificado para a forma de ácido esteárico. Há pouca necessidade de síntese
de ácidos graxos saturados para indivíduos que vivem no Ocidente, pois a dieta
normalmente fornece as quantidades necessárias desse nutriente. Entretanto, as
membranas celulares necessitam de ácidos graxos insaturados para manterem sua
estrutura, fluidez e função. Portanto, existe um mecanismo para introdução de duplas
ligações. Esta enzima resulta na conversão de ácido esteárico para ácido ω-9.
Plantas diferentes dos animais podem inserir duplas ligações existentes na
posição C-9 e o agrupamento metil terminal da cadeia de carbonos. Um delta-12dessaturase converte o ácido oléico em ácido linoléico. Muitas plantas marinhas,
especialmente algas unicelulares no fitoplâncton, também executam aumento da cadeia,
e, assim, a dessaturação do ácido α-linolênico gera o ácido graxo poli-insaturado ω-3,
com 20 e 22 carbonos e 5 ou 6 duplas ligações. É a formação desses ácidos graxos poliinsaturados ω-3 de cadeia longa por algas marinhas e sua transferência por meio de
cadeia alimentar que promovem a abundância dos ácidos EPA e DHA em alguns óleos
de peixes marinhos, os quais são biologicamente mais potentes em relação ao ácido αlinolênico81,82,83.
3.3. PADRÕES NUTRICIONAIS
Países como Canadá, Suíça, Reino Unido, Austrália e Japão, assim como a
World Health Organization (WHO), têm feito recomendações formais baseadas no
consumo de dieta contendo ácidos graxos ω-3. Recomendações típicas estão em torno
de 0,3 a 0,5 g/dia de EPA + DHA e 0,8 a 1,1 g/dia de ácido α-linolênico84. O Canadian
Recommended Nutrient Intake (CRNI) definiu a ingestão diária recomendada para
ácidos graxos da série ω-3 em 0,5% de energia total da dieta84.
20
A Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição (SBAN) recomenda que os
ácidos graxos ω-3 compreendam entre 10 a 20 % dos ácidos graxos poli-insaturados do
total energético da dieta85. Já as recomendações da Associação Americana do Coração
(American Heart Association – AHA), sugerem o consumo de 0,5 g/dia a 1,8 g/dia de
EPA+DHA ou o consumo de 2,5 g/dia a 3 g/dia de ω-386.
Segundo a IV Diretriz Brasileira de Dislipidemia87, a ingestão de altas doses (4 a
10g/dia) dos ácidos graxos ω-3 reduzem os triglicerídeos e aumentam, discretamente, o
colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade), podendo, entretanto aumentar também
o LDL (lipoproteína de baixa densidade). Em portadores de DAC, a suplementação de 1
g/dia de ω-3 reduziu em 10 % os eventos cardiovasculares (morte, IAM, AVC). Por
outro lado, as doses de PUFA ω-3 capazes de trazer benefícios na redução da PA variam
de 2 g a 6 g/dia, com uma média de 3,7 g/dia88,89. Melhorias na função vascular foram
obtidas por cápsulas contendo 1 g a 4 g/dia de ácidos graxos ω-3, em indivíduos
saudáveis, hipercolesterolêmicos, portadores de falência coronária crônica127 e em
adolescentes obesos90.
A Sociedade Internacional para Estudos de Ácidos Graxos e Lipídios
(International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids - ISSFAL) é uma
sociedade de cientistas, profissionais da saúde, administradores e educadores que vem
discutindo e estabelecendo padrões de ingestão para indivíduos saudáveis e doentes91.
Esta sociedade sugere a quantidade de 0,65 g/dia de DHA e mais 1 g/dia de ácido αlinolênico. Por outro lado, as novas recomendações da AHA, são: a) os indivíduos
adultos devem consumir pescado pelo menos 2 vezes por semana; b) para pacientes com
enfermidade coronária, as recomendações de consumo são de 1g/dia de EPA+DHA
procedente de óleo
de pescado
ou suplementos;
c) para pacientes
com
hipertrigliceridemia se recomenda a suplementação de 2 a 4 g/dia de EPA + DHA, a fim
21
de diminuir em 20 - 40% os níveis de triglicerídeos no plasma86. Enfim, as
recomendações atuais (250 - 500 mg/dia) para a prevenção primária de doenças
coronarianas e manutenção da saúde cardiovascular representam duas a quatro porções
por semana de peixes ricos nestes ácidos (Tabela 2)87,92.
Tabela 2 – Recomendação (g/dia) de ácido α-linolênico (ω-3)
IDADE (ANOS)
SEXO
ÔMEGA-3 (g/dia)
0-1
Masculino e Feminino
0,5
1-3
Masculino e Feminino
0,7
4-8
Masculino e Feminino
0,9
9-13
Masculino
1,2
9-13
Feminino
1,0
>14
Masculino
1,6
>14
Feminino
1,1
Gestantes
1,4
Lactentes
1,3
Fonte: Institute of Medicine (2002)
A tabela descreve as quantidades recomendadas para o consumo do α-linolênico de acordo com a idade e
sexo.
22
4. INFLUÊNCIA DO ÔMEGA-3 NA PATOFISIOLOGIA CARDIOVASCULAR
4.1. BREVE HISTÓRICO
O interesse no estudo dos ácidos graxos surgiu desde o século XIX, onde Vogel,
em 1847, foi o primeiro investigador a detectar a presença de colesterol nas placas de
ateroma84. No Século XX, em 1972, depois de observar que os esquimós apresentavam
baixa incidência de DCV, apesar de sua dieta conter um teor elevado de gordura, Bang e
Dyerberg sugeriram pela primeira vez, que os ácidos graxos da série ω-3 reduziam o
risco de desenvolvimento de tais doenças84. Desde então, há cerca de 50 anos, vem
sendo dada maior atenção ao papel da alimentação no desenvolvimento de doenças
crônicas não transmissíveis, sendo os lipídios o maior foco88.
Na década de 60, em decorrência dos efeitos aterogênicos causados pelo
consumo elevado de lipídios saturados, preconizou-se a substituição de grande parte dos
ácidos graxos saturados da dieta, por ácidos graxos poli-insaturados93. Resultados de
alguns estudos clínicos feitos, na última década, também apontaram a necessidade de
diminuir a razão de ω-6 / ω-3 nas dietas modernas. Estima-se que a razão ω-6 / ω-3 na
dieta das pessoas que viveram no período que antecedeu a industrialização, estava em
torno de 1:1 a 2:1, devido ao consumo abundante de vegetais e de alimentos de origem
marinha, contendo ácidos graxos poli-insaturados ω-3. Com a industrialização, ocorreu
um aumento progressivo dessa razão, devido, principalmente, ao consumo de gorduras
saturadas, a produção de óleos e grãos que contém ω-6 e a redução no consumo de
frutas e verduras. Ao mesmo tempo, houve considerável redução do consumo de ácidos
graxos poli-insaturados ω-3 na alimentação que está relacionada ao aparecimento de
diversas patologias, como as DCV94.
23
A intervenção dietética clássica recomendada pela AHA através do Programa
Nacional de Educação em Colesterol (NCEP/ATP III – National Cholesterol Education
Program / Adult Treatment Panel III) faz acentuada indicação da utilização de alimentos
com propriedades funcionais, como o ω-395. Pesquisadores relataram que os ácidos
graxos ω-3 são hábeis em modificar a produção de eicosanóides, alterar a expressão
gênica, metabolismo energético, função de prevenção secundária de eventos
cardiovasculares no qual se comparam os efeitos de ingestão diária de cápsulas de ω-3,
vitamina E ou ambos – o GISSI Prevention Study96. Nesse estudo, verificou-se que
apenas o ácido graxo ω-3 conferiu proteção cardiovascular, obtida em tempo
relativamente curto sem alterar os lipídios no plasma96.
Grandes ensaios clínicos como o Diet and Reinfarction Trial, (DART)97 e o
Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravivenza nell Infarto Miocardico Prevenzione
(GISSI)98 mostraram claros benefícios dos ácidos graxos ω-3 na redução da mortalidade
total (29%)99 e morte súbita.
No ensaio Alpha Omega, porções de margarina
proporcionaram um consumo médio adicional de EPA – DHA de aproximadamente 400
mg por dia100. Os resultados mais significativos comumente usados nestes ensaios
foram os principais eventos cardiovasculares, o DCV fatal, o DAC fatal e a morte
súbita. Os efeitos mais importantes foram observados no ensaio GISSI-P para pacientes
que sobreviveram a um IAM recente. Nestes ensaios, uma quantidade adicional de
EPA–DHA de 900 mg por dia reduziu significantemente o DCV fatal em 30%, o DAC
fatal em 35% e a morte súbita em 45%96. Já, no ensaio GISSI-HF, onde foram incluídos
pacientes com falha cardíaca, o DCV fatal foi significantemente reduzido em 10%, a
morte súbita não significantemente em 7% e as primeiras admissões hospitalares para
arritmias ventriculares significantemente em 28%101. Já o ensaio JELIS mostrou que um
consumo adicional de 1800mg de EPA por dia reduziu somente os principais eventos
24
coronários (DAC fatal e não fatal, angina instável, intervenção coronária percutânea e
revascularização do miocárdio arterial coronário)102.
4.2. EFEITOS NO ORGANISMO
Os efeitos protetores e os processos metabólicos dos ácidos graxos ω-3/óleo de
peixe são extensivamente investigados e considerados área ativa para pesquisas.
Em 2005, em um simpósio, diferentes especialidades médicas se reuniram para
discutirem evidências e experiências sobre os ácidos graxos ω-3. Além da redução do
risco cardiovascular foram apresentados os benefícios na gestação, no desenvolvimento
visual e cognitivo na infância, na prevenção da demência senil e da doença de
Alzheimer, na redução de mecanismos pró-inflamatórios (beneficiando portadores da
Síndrome Metabólica e doenças reumáticas). Uma das expressões criadas pelo grupo de
especialistas é a de que os ácidos graxos ω-3 parecem ser importantes “from womb to
tomb”, ou seja, “do útero à sepultura”103. Nesse evento, o pesquisador Breslow
demonstrou que os possíveis mecanismos que promovem a redução do risco
cardiovascular estão relacionados a propriedades antiarrítmicas, anti-hipertensivas,
redutoras dos níveis de triglicerídeos, estimuladoras da função endotelial, redutoras da
agregação plaquetária e dos mecanismos pró-inflamatórios103. Hoje é sabido que o uso
de ω-3 na dieta tem efeitos protetores na função cardiovascular, reduzindo os níveis
pressóricos, diminuindo a RVP, melhorando a função endotelial e diminuindo a
viscosidade sanguínea104. Sugerem-se ainda, efeitos positivos sobre o perfil de lipídios
plasmáticos e da viscosidade sérica e plasmática, como a função das plaquetas, algumas
das quais mediadas por eicosanóides105.
25
4.2.1. Efeitos Anti-inflamatórios
Evidências clínicas e experimentais sugerem que a suplementação com óleo de
peixe, rico em ω-3, tem propriedades anti-inflamatórias e exerce um importante papel
na função vascular tendo a capacidade de reduzir os eventos cardiovasculares106. Os
ácidos graxos ω-3 reduzem o conteúdo de AA nos fosfolipídios das membranas em
plaquetas, células endoteliais e células inflamatórias, com a diminuição na produção de
mediadores pró-inflamatórios, derivados do AA, incluindo prostaglandina (PG)-E2,
tromboxano (TX)-B2, leucotrieno (LT)-B4, ácido hidroxieicosatetraenoico (5-HETE) e
LT-E4106. A suplementação com EPA e DHA também sugere um efeito protetor no
coração através da melhoria da função mitocondrial e da eficiência da geração de
ATP106. Este efeito pode ser devido a alterações na composição dos fosfolipídios da
membrana mitocondrial e à melhor eficiência da geração de ATP106. Estudos
experimentais em modelos animais, os ácidos graxos ω-3 inibiram a produção de
interleucina 1 (IL – 1) e fator de necrose tumoral alfa (TNF – α)107,108, duas citocinas
pró-inflamatórias. Outro efeito do ω-3, mais especificamente o EPA e DHA, é a possível
modificação da composição dos ácidos graxos em corações de ratos, modificando, em
seguida, a permeabilidade do receptor de membrana da célula e assim influenciando a
função cardíaca108.
4.2.1.1. Efeitos na Função Endotelial
A disfunção endotelial está implicada na gênese da aterosclerose e de outras
doenças crônicas como a HAS, a dislipidemia e a síndrome metabólica, por promover
inflamação, trombose, rigidez arterial e redução da regulação do tônus e o fluxo arterial.
Sabe-se que a HAS é um fator de risco bem estabelecido para a doença cardiovascular,
caracterizada pela disfunção endolelial109. Um mecanismo proposto corresponde à
26
regulação do tônus vasomotor e da excreção renal de sódio, explicado em parte pela
competição com os ácidos graxos poli-insaturados ω-6 pelas enzimas metabólicas e pelo
decréscimo na produção de eicosanóides pró-infamatórios (em especial o tromboxano
A2 ou TXA2)110. Recentemente, um pequeno número de estudos publicados em
pacientes
com
desordens
cardiovasculares,
especialmente
em
indivíduos
hipercolesterolêmicos, aponta uma significativa melhora da função endotelial, avaliada
pela dilatação mediada pelo fluxo, com suplementação dos ácidos graxos poliinsaturados ω-3111.
Resultados em tratamentos a longo prazo, com óleos de peixe mostraram
aumento do relaxamento dependente do endotélio das artérias coronárias normais em
suínos112, pelos quais o EPA, é o responsável pela elevação113. Este efeito, também foi
notado em microvasos coronários suínos114, assim como, o relaxamento dependente do
endotélio das artérias coronárias hipercolesterolêmicas e ateroscleróticas suínas115 e das
veias femorais116. O EPA aumenta o relaxamento dependente do endotélio pelo óxido
nítrico (NO), bem como pelo fator hiperpolarizante derivado do endotélio117. O NO,
também inibe a agregação e a adesão de plaquetas, a adesão de leucócitos e pequena
proliferação celular dos músculos.
4.2.1.2. Efeitos na Inibição da Agregação de Plaquetas
Os ácidos graxos ω-3 diminuem o risco de trombose pela inibição da agregação
de plaquetas. É importante ressaltar que os ácidos graxos ω-3 inibem a síntese de
plaquetas TXA2 e agem como antagonistas do receptor pró-agregador TXA2 / PG H2
nas plaquetas humanas in vitro118. Estudos sugerem que os ácidos graxos ω-3 possuem
efeitos favoráveis sobre a vasculatura, diminuindo a vasoconstrição e a tendência para a
coagulação119. Portanto, a ingestão de peixe ou óleo de peixe, neste sentido, resulta em
27
diminuição das concentrações de TXA2; diminuição da formação de LBTB4, que é um
indutor da resposta inflamatória e agente quimiotático para leucócitos; aumento da
concentração de tromboxana (TXA3), que induz fracamente a agregação plaquetária e a
vasoconstrição; aumento das concentrações de PGI3, que é um importante vasodilatador
e inibidor da agregação plaquetária; aumento da concentração de LTB5, que é
considerado um fraco agente indutor de inflamação e com baixa ação quimiotática119.
4.2.1.3. Efeitos na Redução da Pressão Arterial
A intensidade da redução da pressão arterial depende do grau da HAS (mais
eficaz na HAS leve), nível de ingestão de sódio e a dose administrada, particularmente
de DHA. O mecanismo de ação mais provável é o desvio da produção de eicosanóides
da série 2, derivados do AA, para a série 3, derivados do EPA120. Em consequência, o
balanço prostaciclina / tromboxano é desviado para uma atividade mais vasodilatadora e
de antiagregação plaquetária. Independente da magnitude da redução da pressão arterial
é sugerido que os ácidos graxos da série ω-3 protegem diretamente os órgãos-alvo
lesionados pela HAS leve. Entretanto, não há relatos da eficácia em HAS moderada e
grave120.
Pesquisadores121, em meta-análise, observaram que o consumo diária de 7,7 g de
ω-3 resultou em uma queda na PA sistólica de 4 mm Hg e uma redução de 3 mm Hg na
pressão diastólica, em , comparação a pressão inicial. Os autores também relataram que
a ingestão de 4,8 g de ω-3 diariamente foi responsável pela diminuição de 3 mm Hg na
pressão sistólica e 1,5 mm Hg na pressão diastólica, quando comparado a pressão
arterial do início da pesquisa122. Outros estudos, em animais, ratos hipertensos tiveram a
dieta suplementada com PUFA ω-3, onde foi observado um decréscimo significativo na
pressão sanguínea (- 20 mm Hg) após 10 semanas. Os resultados reforçaram o efeito
28
anti-hipertensivo dessa categoria de lipídeos e chamaram a atenção para a abordagem de
suas propriedades farmacológicas nas recomendações nutricionais para prevenção de
DCV123.
4.2.1.4. Efeitos nas Dislipidemias
Os ácidos graxos ω-3 relacionam-se à redução moderada de trigliceridemia por
diminuírem a atividade de diacil-glicerol acetil-transferase, enzima implicada na síntese
hepática de triglicerídeos, diminuindo a secreção hepática de VLDL124. Além disso, pelo
fato de estarem envolvidos em importantes vias regulatórias transcricionais, aumentam
o PPAR-α (peroxisome proliferator-activated alpha), envolvido na síntese da
lipoproteína lípase (LPL)125. Os ácidos graxos ω-3 também atuam, no núcleo, na
regulação de genes envolvidos na lipogênese, incluindo o PPAR, conjuntamente com
receptores nucleares e fatores de transcrição, como HNF (hepatocyte nuclear factorkappa B)126. Dessa forma, aumentam a oxidação de ácidos graxos por meio de ativação
do PPAR-α ou por reduzir a atividade do SREBP (sterol regulatory element-binding
proteins). É ainda destacado que o óleo de peixe pode reduzir a concentração plasmática
de triglicerídeos, possivelmente por reduzir sua síntese de triglicerídeos pelo fígado127.
Além disso, o óleo de peixe aumentaria a atividade da LPL, acelerando o catabolismo
da VLDL e dos quilomícrons, contribuindo para a diminuição da trigliceridemia pósprandial128.
Pesquisadores129, alimentaram grupos distintos de ratos com ração comercial
(Nuvilab® com 4% de lipídios) adicionadas de óleo de peixe (15%), com ração
comercial adicionada de óleo de soja (15 %) ou com ração comercial adicionadas de
óleo de soja + óleo de peixe (15 % na proporção de 5:1). Após um período de 8 semanas
foi observado que o grupo que recebeu apenas a dieta rica em óleo de peixe apresentou
29
uma menor concentração plasmática de lipídios totais, colesterol total e HDL em relação
a todos os outros grupos. Já os animais alimentados com a dieta rica em óleo de peixe e
de soja demonstraram um aumento no colesterol HDL em relação aos grupos controle e
óleo de peixe e uma menor relação entre colesterol total: HDL quando comparados aos
demais grupos. Em outro estudo desenvolvido com animais130, ratos foram submetidos à
dieta rica em ω-3 (6,5%) + gordura saturada (13%), perfazendo no total 19,5% de
lipídeos. Os animais submetidos à dieta rica em ω-3 mostraram concentrações
plasmáticas de TGL (75%), colesterol total (20%) e fosfolipídios (40%), mais baixas
quando comparados aos submetidos à dieta rica em gordura saturada, avaliados em
estado pós-prandial.
30
5.
O
PAPEL
DOS
ÁCIDOS
GRAXOS
POLI-INSATURADOS
NA
REGENERAÇÃO TECIDUAL
Os ácidos graxos poli-insaturados podem originar prostaglandinas, leucotrienos
e tromboxanos que apresentam atividades biológicas importantes131. Os ácidos graxos
geram precursores de moléculas pro e anti-inflamatórias que podem interferir na
fisiologia de doenças crônicas e em processos inflamatórios.
Nos últimos anos, há evidências da ação modulatória de ácidos graxos na função
de diversos tipos celulares e seus efeitos estão relacionados à alteração da fluidez da
membrana celular131,132; ação como segundo mensageiros133; ação mediada por PPAR,
melhora da produção endotelial de óxido nítrico, inibição da ativação de leucócitos e
produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6 e TNF-α134; prevenção da
agregação plaquetária e regulação do comprimento dos telômeros135.
A suplementação oral com ω-3 do óleo de peixe em indivíduos saudáveis
decresce a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-2136, e IL-1 em monócitos
isolados e o TNF-α136. Também, promove a formação da prostaglandina E137,
estimuladora da liberação de somatotropina137. Em adição, as informações atuais
relacionam
o
desempenho
de
atividades
aeróbias
devido
às
propriedades
vasodilatadoras desse ácido graxo poli-insaturado, melhorando o fluxo de oxigênio (O2)
e nutrientes para os tecidos musculares durante o exercício físico138. Estudos
epidemiológicos com população de esquimós da Groenlândia139, bem como
investigações em nutrição clínica137,140 e pesquisas laboratoriais com citocinas e
eicosainóides131, 134, têm mostrado que o ω-3 exibe atividades anti-inflamatórias141.
Outros estudos demonstram que os ácidos graxos essenciais, contribuem para o
processo de reparação tecidual. O ácido linoléico exerce um importante papel
31
quimiotático para macrófagos, sendo fundamental na expressão de componentes do
sistema fibrinolítico (regulação da produção de colagenase); contribui com a produção
de metalo-proteínas, induzindo a granulação e podendo acelerar o processo de
cicatrização142. Foi observado que o ácido linoléico é capaz de inibir o crescimento de
Staphylococcus aureus, alterando as sínteses de proteínas, parede celular, ácidos
nucléicos e membranas celulares durante a divisão143.
O ácido linolênico é importante no transporte de gorduras, favorece a
manutenção da integridade da barreira de permeabilidade epidérmica e acelera os
processos cicatriciais. Age como modulador da membrana celular protegendo a lesão e
agindo como imunógeno local, restaurador tecidual (por promover quimiotaxia e
angiogênese, pela manutenção do meio úmido e aceleração do processo de granulação
tecidual), regula a permeabilidade da barreira de água da pele e proporciona a nutrição
celular local143,144. Também há evidências que ácidos graxos podem interferir no
processo de regeneração do músculo esquelético145.
Os ácidos graxos essenciais são considerados indispensáveis na síntese de
prostaglandinas e proteínas e são responsáveis pelo processo de regeneração das células,
mecanismos de defesa e processos fisiológicos e bioquímicos relacionados à
regeneração dos tecidos. Hoje são muito utilizadas as pomadas e óleos cicatrizantes que
apresentam em sua composição a associação de triglicerídeos de cadeia média e ácidos
graxos essenciais para estimular a nutrição celular, a regeneração tecidual e a velocidade
de cicatrização das feridas146,147.
Nas últimas décadas, apesar de grandes avanços verificados, não há total
compreensão dos diversos fatores e fenômenos envolvidos no processo de regeneração
de tecidos. Mas sabe-se que as principais células efetoras destes processos são as
32
células-tronco. E, neste sentido percebe-se a escassez de estudos sobre a influência de
ácidos graxos ω-3 sobre estas células e nestes processos.
33
6. CÉLULAS-TRONCO
6.1. DEFINIÇÃO E CLASSIFICAÇÃO
As células-tronco possuem capacidade de auto-renovação, ou seja, são capazes
de se multiplicar, mantendo seu estado indiferenciado, proporcionando uma reposição
ativa de sua população de maneira constante nos tecidos, além disso, também podem se
diferenciar em diversos tipos celulares148. O grau de plasticidade (a diferenciação em
linhagens celulares) está diretamente ligado a sua origem: as do zigoto, possuem
capacidade totipotente; as embrionárias, pluripotente; e as adultas, multipotente. Desta
forma, acredita-se que células-tronco adultas, que estão presentes nos diferentes tecidos,
tenham papel regenerativo quando estes sofrem uma lesão ou injúria149,150. O
mecanismo pelo qual as células-tronco conseguem realizar esta dupla função
(diferenciação mantendo uma reserva de células indiferenciadas) ainda não está
completamente elucidado, embora alguns aspectos importantes já sejam conhecidos. Por
exemplo, estudos utilizando tecnologia de análise genética com microchips
(microarrays) têm permitido, baseados no padrão de expressão gênica destas células,
identificar algumas características básicas responsáveis pela manutenção do estado
indiferenciado, que incluiriam a capacidade de responder ao hormônio do crescimento e
à trombina, a integração com a matriz extracelular via integrina α6-β1, a alta resistência
ao estresse através do aumento da expressão de enzimas de reparo de DNA, entre
outras151.
As células-tronco embrionárias são derivadas de estágios iniciais do
desenvolvimento do embrião152,153 enquanto que as células-tronco fetais são tipos
celulares primitivos do feto que podem dar origem a vários órgãos do corpo149,150,151. As
células-tronco embrionárias são isoladas a partir da massa interna de blastócitos e
34
apresentam capacidade de auto-renovação e são células pluripotentes. As células-tronco
adultas ocorrem em diferentes tecidos, como na medula óssea e nos diversos órgãos, e
conservam a capacidade de se auto-replicarem e de se diferenciarem em tipos celulares
do tecido de origem durante todo o desenvolvimento do organismo154-158. A utilização
de células-tronco embrionárias na terapêutica, no entanto, envolve problemas éticos e,
mais ainda, seu potencial carcinogênico é um sério fator de risco para complicações
clínicas159.
Embora de potencial clonogênico menor, as populações de células-tronco
adultas podem auxiliar processos em que o uso de células embrionárias é
impossibilitado. Em adição, diversos estudos mostraram que células-tronco adultas
possuem grande plasticidade podendo gerar outro tipos celulares, sendo então
denominadas multipotentes conforme já mencionado160-162 (Figura 1). Algumas
populações de células-tronco adultas, como as células-tronco mesenquimais (do inglês,
Mesenchymal Stem Cells, MSC), possuem um maior potencial de diferenciação que não
se limita a apenas ao tecido de onde é originada163.
Uma das principais fontes de células-tronco adultas é a medula óssea. A medula
óssea fornece as chamadas células mononucleares da medula óssea (do inglês, Bone
Marrow Mononuclear Cells, BMMC), que contém duas populações distintas de célulastronco: as células-tronco hematopoiéticas (HSC, do inglês Hematopoietic Stem Cells),
responsáveis pelo desenvolvimento de linhagens de células sanguíneas, incluindo
leucócitos, hemácias e plaquetas164 e as MSC, que são células estromais, que podem se
auto-renovar e possuem a capacidade de dar origem principalmente a osteoblastos,
condrócitos, adipócitos165,166,167, músculo esquelético164, músculo cardíaco, células
endoteliais, hepatócitos, neurônios, oligodendrócitos e astrócinos165,166,167.
35
Figura 1. Representação esquemática da plasticidade das células-tronco derivadas de medula
óssea. (Fonte: http://stemcells.nih.gov)
As BMMC foram precursoras da utilização das células-tronco adultas em
protocolos clínicos. Posteriormente, as MSC, em função de sua versatilidade de
diferenciação e de sua poderosa potencialidade, além de sua facilidade de cultivo in
vitro estão sendo mais visadas na aplicação clínica. Além da medula óssea, as MSC
podem ser encontradas em diversos tecidos como coração, fígado, músculos, pâncreas,
cérebro, cartilagens, ossos, tendões, vasos, no tecido adiposo e no cordão umbilical168.
As células estromais da medula óssea foram primeiramente descritas como
células progenitoras ósseas, presentes em sua fração estroma. Outras pesquisas
subsequentes demonstraram que essas células possuíam a capacidade de se diferenciar
em linhagens celulares mesodérmicas, incluindo condrócitos, osteoblastos, adipócitos e
36
mioblastos. Caplan, em 1991, com base nessa capacidade de diferenciação em
multilinhagens, introduziu o termo MSC169.
As MSC representam uma rara subpopulação das células-tronco da medula óssea
(<0,01% das células mononucleares da medula óssea) que podem ser expandidas
mitoticamente em meio de cultura, em condições apropriadas. Em decorrência da
facilidade em se dividir e proliferar, conclui-se que as MSC seriam as células
responsáveis pela manutenção e renovação dos tecidos mesenquimais adultos, incluindo
o músculo cardíaco170. Logo, até o presente momento, essas células representam a fonte
mais promissora para a regeneração e reparo de diversos tecidos celulares.
A observação de que as MSC derivadas da medula óssea poderiam ser ativadas
com o objetivo de secretar citocinas e fatores de crescimento, e assim também
participando da regulação do sistema imune, corrobora com a ideia de que a principal
função das MSC seria atuar na reposição fisiológica celular do tecido mesenquimal171.
Essa observação sugere que as MSC poderiam ser utilizadas de forma terapêutica como
células alogênicas, também chamadas “células universais”, ou seja, células capazes de
atuar no interior de qualquer hospedeiro172.
As MSC podem ser facilmente isoladas e rapidamente expandidas ex vivo,
tornando-as alvos terapêuticos interessantes na regeneração tecidual. E, neste contexto,
sua atuação na restauração de tecido miocárdico defeituoso ocorre por meio de diversos
mecanismos. No principal deles, desencadeado após o transplante, essas células iniciam
a produção de fatores de crescimento reparadores, objetivando reparação de fragmentos
teciduais danificados172. Por fim, essas células são capazes de contribuir para a criação
de um ambiente favorável ao reparo de tecido cardíaco endógeno. Por esses motivos, as
MSC foram identificadas como promissoras no tratamento de diversas afecções
37
cardiovasculares que tenham como denominador comum o prejuízo ao tecido
cardíaco172.
A ampliação do uso das MSC e a posterior comparação dos resultados obtidos
em diferentes grupos mostrou falta de especificidade e padronização dos marcadores
moleculares dessas células. A fim de solucionar tal problema, a Sociedade Internacional
de Terapia Celular (International Society for Cellular Therapy) propôs três critérios
básicos para que se possa definir uma célula como sendo MSC. Assim, as MSC podem
ser: 1) plástico-aderentes, caso mantidas em condições básicas de cultura; 2) positivas
para os marcadores de superfície CD105, CD73 e CD90 e negativas para CD45, CD34,
CD14 e CD11b; e 3) capazes de se diferenciar em fibroblastos, osteoblastos, adipócitos
e condroblastos quando expostas in vitro às linhagens correspondentes condições que
favoreçam estas diferenciações173.
Devido à possibilidade de diferenciação in vitro, atualmente, têm sido utilizadas
com bastante otimismo na medicina regenerativa e engenharia tecidual, como o
desenvolvimento de células musculares, regeneração hepática e formação de células do
sistema nervoso central (SNC)174. Aliado à possibilidade de ser possível isolar e
diferenciar as MSC em cultura, o uso em estudos clínicos e pré-clínicos tem
demonstrado seu alto poder terapêutico174.
Para futuras terapias celulares, as células “ideais” devem ser de fácil acesso,
imunologicamente inertes, capazes de se expandir rapidamente em cultura, sobreviver
por longos períodos e capazes de se integrarem ao tecido hospedeiro170,175. Neste
contexto, as MSC desempenham muito bem este papel, pois podem ser facilmente
obtidas através de aspiração da medula óssea176 e expansão in vitro. A partir de vários
tecidos, incluindo a medula, as MSC podem migrar até o miocárdio lesionado e
diferenciarem-se em cardiomiócitos177, ou através de fatores parácrinos, integrar o
38
miocárdio e auxiliar na regeneração tecidual177. Entretanto todos estes mecanismos
dependem de uma capacidade das células migrarem ao nicho e a subsequente fixação ao
tecido alvo (homing).
39
7. HOMING DE CÉLULAS-TRONCO
7.1. DEFINIÇÃO DE HOMING
O homing é o processo pelo qual, células são atraídas por gradientes
quimoatrativos, desencadeados por quimiocinas e outras moléculas produzidas em
respostas fisio-patológicas por vias sinalizadoras específicas de células lesionadas ou
apoptóticas, cuja resposta é ativar mecanismos de migração, proliferação e
diferenciação para que estas células possam se implantar em um nicho
adequado178,179,180. O homing de células-tronco para o local da lesão de um órgão adulto
é um processo complexo, sequencial e fisiologicamente organizado para o recrutamento
de células. Citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e moléculas de adesão, são
sinalizadores fundamentais para a mobilização das células-tronco, tanto da medula
óssea, como as residentes teciduais, para circulação via corrente sanguínea,
transmigração e adesão no órgão lesionado181. Para que esse processo seja efetivo, é
imprescindível que não haja interrupção em nenhuma das etapas relacionadas. Neste
processo, uma das principais moléculas envolvidas com o homing de células-tronco é o
Fator-1 derivado de estroma (Stromal Derived Factor-1, SDF-1 ou também conhecido
como CXCL-12), que aumenta a adesão e transmigração de células progenitoras,
principalmente as circulantes pró-angiogênicas e células-tronco hematopoéticas182,183. O
homing de células progenitoras é o processo fisiológico que ocorre em todos os tecidos
para a reposição de células. Em processos patológicos cardíacos, tanto em IAM quanto
em doenças crônicas184, há uma alta liberação desta quimiocina (Figura 2).
40
Figura 2. Homing de células-tronco para o coração durante o infarto do miocárdio. As principais
etapas desse processo envolvem a mobilização de células-tronco da medula óssea, seguida da
migração dessas células através do sistema circulatório sanguíneo e a adesão no miocárdio sob
sinalização quimioatrativa frente a um processo isquêmico185.
7.2. FATOR 1 DERIVADO DE ESTROMA (SDF-1)
O SDF-1 e seu receptor, Receptor 4 de quimiocinas da família CXC (CXCR-4)
são expressos em uma infinidade de tecidos e tipos celulares, incluindo os diferentes
subtipos de leucócitos, as células progenitoras hematopoéticas e células nãohematopoéticas, tais como células endoteliais, epiteliais e outras186. O SDF-1 liga-se
especificamente a um receptor de transmembrana, o CXCR-4, acoplado à proteína G,
cuja interação resulta na ativação de vias de sinalização para quimiotaxia de diversos
tipos celulares como linfócitos, neurônios e células germinais187,188. O CXCR-4, assim
como, os receptores beta-adrenérgicos, também sofre regulação da subunidade quinase
41
acoplada à proteína G (Receptor Quinase Acoplado a Proteína G - GRKs), que inibem a
proteína G, dessensibilizando também esta classe de receptores188.
A quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR-4 foram identificados como o eixo
central de sinalização que regula o homing das células progenitoras do músculo liso na
parede de vasos lesionados189, sendo também citados, como essenciais para a
cardiogênese, hematopoiese e vasculogênese durante o desenvolvimento embrionário,
além do envolvimento na quimiotaxia de subconjuntos de leucócitos e células
endoteliais190. Em condições de privação de oxigênio (hipóxia), a expressão do gene do
SDF-1 é regulada pelo fator de transcrição induzível por hipóxia-1 (HIF-1), resultando
em seletiva expressão in vivo desta proteína no tecido isquêmico com proporcionalidade
direta em relação à redução de oxigênio191. O HIF-1 regula positivamente a expressão
do SDF-1, que aumenta a adesão, migração e homing de células progenitoras CXCR-4+
circulantes no tecido isquêmico.
O recrutamento de células-tronco por SDF-1 foi estabelecido com observações
de que a expressão é seletiva nos tecidos lesionados e correlacionada ao recrutamento
de células adultas na regeneração tecidual184,192,193. Assim, as células administradas por
estas vias, poderiam ser atraídas até o local da lesão devido à presença de citocinas,
como, por exemplo, SDF-1, liberado pelo tecido lesionado. Células mesenquimais
expressando o receptor CXCR-4 seriam atraídas seletivamente para o nicho, em
resposta ao SDF-1, demonstrando que esta molécula atua como fator quimiotático.
Dados de Ghadge e colaboradores (2010)194,195, em um estudo sobre IAM,
indicam que o aumento nos níveis de SDF-1 em órgãos inflamados ou lesionados,
estimula o recrutamento de células para o local da lesão, que proporcionam ao tecido
reparo e regeneração e têm efeitos parácrinos positivos na sobrevivência dos
cardiomiócitos e função cardíaca. Além disso, a utilização de SDF-1 como tratamento
42
resulta em diminuição do tamanho da área de infarto e aumento na resistência ao dano
hipóxico e à morte celular por apoptose195. Estes resultados indicam que a permanência
da proteína SDF-1 em locais de lesão pode representar uma nova estratégia terapêutica
para promover a reparação do miocárdio195,196.
7.3. RECEPTOR 4 DE QUIMIOCINAS DA FAMÍLIA CXC (CXCR-4)
As quimiocinas constituem uma superfamília de pequenas proteínas (8 – 14
KDa), da qual participam de mais de cinqüenta proteínas que exercem a sua ação via
interação com receptores específicos197. São subdivididas em quatro famílias: CXC, CC,
XC e CX3C, dependendo do posicionamento do resíduo de cisteína no N-terminal da
molécula protéica. Nestas moléculas, “C” representa resíduos de cisteína e “X” é a
designação para outro resíduo de aminoácido.
A ligação das quimiocinas aos seus respectivos receptores acoplados à proteína
G e presentes na membrana plasmática de células alvo, leva à reorganização do
citoesqueleto e adesão a células endoteliais levando à migração destas células198. Esta
reação provoca adesão de leucócitos aos sítios específicos nos vasos sanguíneos e faz
com estes ultrapassem a barreira do tecido, migrando para outros órgãos199,200. Logo, as
células-tronco CXCR-4+ são ativadas através do ligante SDF-1(CXCL12), o qual foi
secretado pelas células estromais da medula óssea que desencadeiam a interação de
moléculas de adesão, conferindo firme adesão entre as células-tronco e as células
estromais. As células que possuem o receptor CXCR-4 na membrana celular migram
para o local onde o SDF-1 está presente.
43
8. JUSTIFICATIVA
Diversos estudos em modelos animais demonstram os efeitos benéficos dos
ácidos graxos ω-3 sobre a função cardiovascular.
É muito válida a abordagem nutricional aliada à biologia molecular, para a
identificação de substâncias e seu efeito cardioprotetivo. Neste contexto, não se sabe se
há influência, dos ácidos graxos ω-3 sobre o homing de células-tronco.
Há tratamento que estimulam a capacidade do homing, porém o processo é
dificultado em pacientes com cardiopatias, em decorrência da resposta provocada pela
HAS, IAM, IC, etc. Contudo, as MSC participam da reposição celular em uma
variedade de tecidos, sendo capazes de promover a redução ou recuperação de áreas
lesionadas. No momento em que essas células são induzidas por quimiocinas, como o
SDF-1, estas ativam o receptor de membrana CXCR-4 e são capazes de realizar
migração, proliferação, diferenciação e fixação no tecido-alvo, caracterizando esse
mecanismo. Logo, baseado nessas considerações, é válido analisar os efeitos da
suplementação de dieta com ácidos graxos ω-3 na ativação do homing de células-tronco
em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos (Wistar Kyoto, WKY).
44
9. OJETIVOS
9.1. OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos da suplementação de dieta com ácidos graxos ômega-3 na
ativação do homing de células-tronco em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e
normotensos (Wistar Kyoto – WKY).
9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Analisar os efeitos da suplementação com ω-3 sobre o peso corporal e
tecidual em animais normotensos e hipertensos.
b) Analisar a influência da dieta rica em ω-3 sobre os marcadores metabólicos,
como o colesterol total, colesterol HDL e triglicerídeos nos animais.
c) Analisar a ativação sistêmica de SDF-1 em ratos normotensos e hipertensos
em resposta à dieta com ω-3 ou não.
d) Analisar a ativação do receptor de SDF-1, CXCR-4, em diferentes tecidos dos
ratos submetidos ou não à dieta.
e) Comparar o efeito agudo x efeito crônico da suplementação com ω-3 na
ativação do homing em ratos submetidos ou não à dieta.
45
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55
ARTIGO
56
Ômega-3 induz homing celular de forma aguda em ratos normotensos
e cronicamente em hipertensos
Luiza Halmenschlager, Melissa Medeiros Markoski*
*Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular, Laboratório de Experimentação
Animal, Serviço de Medicina Experimental, Instituto de Cardiologia/Fundação
Universitária de Cardiologia (ICFUC), Porto Alegre, RS, Brasil.
Autor Correspondente
Melissa Medeiros Markoski
Avenida Princesa Isabel, 370 - Porto Alegre/RS, Brasil. CEP: 90620-001.
[email protected], [email protected]
Telefone: (51) 3230-3600 Fax: (51) 3217-2035
57
RESUMO
Entre as doenças cardiovasculares, a hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma
das patologias que afeta um alto número de pessoas e que pode levar a quadros de
insuficiência cardíaca. Sabe-se que alimentos funcionais, como os que contêm ácidos
graxos ômega-3 ( -3), possuem propriedades cardioprotetivas. Entretanto, não se
conhecem os potenciais efeitos sobre a influência das dietas contendo
-3 na
modulação de lipídeos e processos pato-fisiológicos em decorrência da HAS. Neste
estudo, avaliamos o efeito da suplementação dietética aguda e crônica de
-3 no
metabolismo de lipídeos e na regeneração cardíaca, em especial no eixo SDF-1/CXCR4, responsável pelo mecanismo de ativação, proliferação e diferenciação de célulastronco, o homing celular, em ratos normotensos e hipertensos. Participaram do estudo
32 ratos machos Wistar Kyoto (WKY) e 32 Ratos Espontaneamente Hipertensos (SHR),
distribuídos em 8 grupos (n = 8), que receberam ou não administração orogástrica de 1g
de
-3 durante 24h, 72h ou 2 semanas. Foram coletadas amostras de sangue dos
animais (basal e pós-tratamento) para a análise de marcadores metabólicos por ensaio
colorimétrico e do SDF-1 sistêmico por ELISA. Ao final dos tratamentos, os animais
foram eutanasiados e os tecidos (coração, cérebro, pulmão, fígado, rins, gordura e
medula óssea) foram coletados para ganho de peso da massa tecidual e o coração foi
submetido à análise da expressão do receptor de SDF-1, o CXCR-4, por Western Blot.
Nossos resultados mostraram que o
-3 influenciou na redução do peso corporal
(p=0,015) nos ratos SHR e na redução de massa tecidual, principalmente cardíaca, tanto
em animais normotensos (p=0,004) como hipertensos (p=0,06); na diminuição dos
níveis sistêmicos de colesterol (p=0,005) e triglicerídeos (p=0,04) nos animais SHR; e
principalmente na ativação do eixo SDF-1/CXCR-4, de forma aguda nos animais WKY
(p=0,04 para a correlação) e tardia nos SHR (p=0,04 para o CXCR-4 após 72 horas).
58
Assim, a dieta com o ácido graxo -3 modula a expressão de marcadores metabólicos e
fatores envolvidos com regeneração cardíaca tanto de forma aguda como crônica em
animais normotensos e hipertensos.
Palavras-chave: ácido graxo
-3, SHR, Wistar Kyoto, homing celular, Hipertensão
Arterial Sistêmica
INTRODUÇÃO
A crescente incidência das doenças cardiovasculares (DCV) originou uma busca
incessante pelos fatores de risco relacionados ao seu desenvolvimento. A hipertensão
arterial sistêmica (HAS) é o principal fator de risco de morte entre as doenças não
transmissíveis, mostrando uma relação direta e positiva com o risco cardiovascular1,2.
Este fator, considerado uma condição clínica associada à alta morbidade e mortalidade3,
necessita interação de intervenção farmacológica e tratamento não farmacológico4.
A Organização Mundial de Saúde, nas “Recomendações para Prevenção de
Doenças Cardiovasculares”5, aponta que o consumo de peixes e óleos de peixes está
associado com a diminuição do risco cardiovascular. Vários benefícios dos fatores
dietéticos citados pela Organização Mundial de Saúde6 como favoráveis na diminuição
do risco cardiovascular estão presentes no padrão dietético denominado Dieta
Mediterrânea.
Nos últimos anos, muitos estudos demonstram que as dietas contendo ácidos
graxos poli-insaturados do tipo ômega-3 (ω-3) atuam evitando doenças cardíacas
através de uma variedade de ações como a prevenção de arritmias, geração de
59
prostanóides e leucotrienos com ações anti-inflamatórias, inibição da síntese de
citocinas que aumentam a inflamação e promovem a formação de plaquetas7,8. Além
disso, os ω-3 influenciam no metabolismo dos eicosanóides, na expressão gênica e na
comunicação intercelular, pois a composição dos ácidos graxos poli-insaturados das
membranas celulares depende, em grande parte, da quantidade ingerida na dieta9.
Entretanto, ainda não se sabe o papel dos ω-3 na medicina regenerativa, principalmente,
no que tange o processo de migração, proliferação, diferenciação e fixação de célulastronco, denominado homing celular.
Células-tronco são células indiferenciadas, cujas principais características,
tornando-as extremamente interessantes para possível aplicação terapêutica, são sua
capacidade de autorrenovação, ou seja, são capazes de se multiplicar, mantendo seu
estado indiferenciado, proporcionando uma reposição ativa de sua população de
maneira constante nos tecidos; e, mais interessante ainda, sua capacidade de se
diferenciar em diversos tipos celulares10. Desta forma, acredita-se que células-tronco
adultas, presentes nos diferentes tecidos, tenham papel regenerativo quando estes
sofrem uma lesão ou injúria11,12. A quimiocina Fator 1 derivado de estroma (SDF-1 Stromal Derived Factor-1), secretada em situações de estresse tecidual, e seu receptor
CXCR-4 (Receptor 4 de quimiocinas da família CXC), expresso na superfície das
células-tronco que respondem a essa situação de estresse, são os elementos principais
envolvidos no homing celular13.
A expressão e liberação de SDF-1 por tecidos lesionados, formando um
gradiente alostérico positivo, faz com que as células progenitoras, provenientes da
medula óssea ou de locais residentes específicos nos diferentes órgãos14, migrem na
direção do fator, portanto, se estabelecendo no nicho da injúria. E, fisiologicamente, o
eixo SDF-1/CXCR-4 também é responsável pela organogênese e reposição de células
60
apoptóticas ou senescentes em tecidos saudáveis15. Ambos os processos sofrem
influência dietética.
Assim, este trabalho propõe a investigação dos efeitos de substâncias
cardioprotetivas ou alimentos funcionais, como os ácidos graxos ω-3, sobre a ativação
do homing de células-tronco, precisamente através da expressão de SDF-1 e do seu
receptor CXCR-4. Para analisar a influência do ω-3 em processos patológicos foram
utilizados ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e, para situações fisiológicas, os
ratos normotensos da linhagem Wistar-Kyoto (WKY). Os animais foram submetidos a
diferentes períodos de dieta.
MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os procedimentos adotados durante os experimentos envolvendo animais
estão de acordo com o National Institute of Health Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals16 e pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
O projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Cardiologia do
Rio Grande do Sul em 20 de outubro de 2010, sob protocolo UP Nº 4503/10.
Grupos amostrais e tratamentos
Foram utilizados 32 ratos Wistar-Kyoto (WKY) e 32 ratos espontaneamente
hipertensos (“Spontaneously Hypertensive Rats”, SHR) machos com 90 dias de idade,
provenientes do Biotério de Criação da Fundação Estadual de Produção em Pesquisa em
Saúde (FEPPS), Porto Alegre, Brasil. Os ratos permaneceram acondicionados em
gaiolas de plástico com grades de aço em ambiente com temperatura de 22-24°C, com
ciclo claro/escuro de 12 horas e consumo ad libtum de água e ração comercial para ratos
(Nuvilab®), cuja composição, por peso, possui: 19,0 % de proteína, 56,0 % de
61
carboidrato; 3,5 % de lipídeos; 4,5 % de celulose; 5,0 % de vitaminas e minerais;
totalizando 17,03 kJ/g. Para a dieta com ω-3, os animais receberam, além da ração e da
água, um tratamento suplementar de 1 g de ω-3 (cápsulas adquiridas em farmácia de
manipulação, Confiare), contendo 180 mg de EPA e 120 mg de DHA, administrado por
via orogástrica, todos os dias na mesma hora, durante 24 h (efeito agudo), 72 h (efeito
pré-crônico) ou 14 dias (efeito crônico). Esta dosagem foi compatível e relativizada com
a quantidade de ingestão do que está contido em peixes, recomendada a seres
humanos17, 18, 19. Foram utilizados 8 animais por grupo, distribuídos em Grupo Controle
WKY (G0K) e Grupo Controle SHR (G0S), animais que receberam apenas água por
administração orogástrica; Grupo 24 h WKY (G24K) e Grupo 24 h SHR (G24S),
animais que receberam a suplementação com ω-3 apenas 1 vez e depois de 24 horas
foram sacrificados; Grupo 72 h WKY (G72K) e Grupo 72 h SHR (G72S), ratos que
receberam 3 doses de suplementação com ω-3 e foram sacrificados após o período; e
Grupo 2 semanas WKY (G2sK) e Grupo 2 semanas SHR (G2sS), animais que
receberam suplementação de ω-3 durante 14 dias e foram sacrificados após o período.
Os animais foram pesados todos os dias do tratamento e passaram por coleta sanguínea
no pré-tratamento (100 uL por punção de cauda), sob anestesia com 50 mL x kg–1 de
cetamina e 20 ml x kg–1 de xilasina, 0,2 mL/100 g, e, após, no momento da eutanásia (2
mL por punção cardíaca), também sob anestesia (mesma descrita anteriormente). Os
animais foram eutanasiados no momento da punção cardíaca e os tecidos foram
coletados (conforme descrito a seguir). Os ensaios biológicos foram realizados de
acordo com o Guia de Uso e Cuidados com Animais Laboratoriais do COBEA.
Coleta de materiais biológicos
62
Após as coletas de sangue dos animais submetidos à suplementação com ω-3
nos períodos de 24 h, 72 h e 14 dias (ou 2 semanas), as amostras foram centrifugadas a
2.000 rpm durante 10 minutos para separação dos plasmas. As amostras do plasma
foram aliquotadas em microtubos de 1,5 mL e armazenadas sob refrigeração de - 20º C
para as análises de marcadores metabólicos e testes imunoenzimáticos.
Após eutanásia, procedeu-se à retirada dos tecidos na seguinte ordem: coração,
cérebro, pulmão, fígado, rins, medula óssea (do interior do fêmur) e gordura epididimal.
Os tecidos foram imediatamente pesados, transferidos para criotubos e submersos em
nitrogênio (N2) líquido. Após congelamento, as amostras foram transferidas e
armazenadas em ultrafreezer a - 80º C.
Análise bioquímica dos marcadores metabólicos
As avaliações das dosagens bioquímicas de Colesterol Total (COL),
lipoproteínas de alta densidade (HDL) e triglicerídeos (TGL) foram feitas por método
colorimétrico (precipitação com ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésio) utilizandose kits comerciais (Labtest Diagnóstica S/A), através de espectrofotometria. As análises
seguiram as recomendações dos protocolos dos diferentes kits, adaptados para volumes
menores, a serem utilizados em microplacas de 96 poços. Brevemente, as amostras e
controles (positivo e negativo) eram misturados em soluções-tampão (1/10), incubados
a 37º C durante 10 minutos e submetidos à leitura óptica a ~500 nm para análise da
absorbância (OD) no espectrofotômetro (Spectramax M2e, Molecular Devices). As
quantificações foram obtidas através de cálculo de comparação ao padrão (Excel,
Microsoft). Os dados foram expressos em miligramas por decilitro (mg/dL). Foram
também calculadas as frequências das variações relativas (percentuais) entre o pré e
pós-tratamento.
63
Homogeneização dos Tecidos dos Animais
O tecido cardíaco dos animais foi homogeneizado conforme a adaptação de Mori
e cols. (2008)20. Após maceração inicial em homogeneizador mecânico (Polytron,
Marconi), durante 2 min, com 1 mL de tampão (7,4 pH, 0,6057 mmol/l Tris-base,
Invitrogen, 0,18612 mmol/l EDTA, Invitrogen, e 42,79 mmol/l sacarose, Synth), em
recipiente contendo gelo, as amostras eram adicionadas de mais 4 mL (correspondendo
a proporção 1:6, peso:volume) de tampão e misturadas durante mais 2 min. As amostras
homogeneizadas eram transferidas para tubos de 50 mL e centrifugadas a 1.700 rpm,
durante 10 min a 4º C. O sobrenadante (~3 mL) era coletado e ao sedimento, era
adicionado mais 1 mL de tampão. As amostras eram ressupendidas e centrifugadas nas
condições descritas anteriormente. O sobrenadante era novamente coletado e misturado
ao prévio. Os extratos proteicos totais, solubilizados em tampão e separados em 3 a 4
alíquotas (em tubos de 1,5 mL), eram armazenados a -20º C até o uso.
Análise da expressão de SDF-1α e CXCR-4
Os níveis sistêmicos de SDF-1, isoforma alfa (SDF-1α), foram determinados
pelo ensaio imunoenzimático de ELISA (do inglês, Enzyme Linked Immunosorbent
Assay) através do uso de kit comercial (Cusabio) utilizado em conformidade com as
instruções do fabricante. Após ensaio, as densidades ópticas (absorbâncias) foram
mensuradas em espectrofotômetro (Spectramax M2e, Molecular Devices) à temperatura
de 25º C, com redução de background. As quantificações foram obtidas através de
regressão linear de 4 parâmetros (Excel, Microsoft). Os dados foram expressos em
picogramas de proteínas por mililitro (pg/mL).
Os extratos proteicos teciduais tiveram sua quantificação mensurada pelo
método colorimétrico de Bradford21 utilizando-se reagente (Bio-Rad) para intercalação
64
de azul de coomassie, com aquisição de absorbância em espectrofotômetro (Spectramax
M2e, Molecular Devices) e cálculo de concentração amostral final obtido através de
regressão linear de 4 parâmetros (Excel, Microsoft). Amostras contendo 100 ug de
extrato proteico total, solubilizadas em tampão NuPage (Invitrogen) e desnaturadas
previamente por 5 min de incubação à 100º C, foram separadas em gel desnaturante de
poliacrilamida (acrilamida/bis-acrilamida, 30:1, peso:peso, Invitrogen) a concentração
de 12% em cuba de eletroforese preenchida com tampão contendo 0,25 M de Tris-base
(Invitrogen), 1.92 M de glicina (Invitrogen) e 1% (peso:volume) de dodecil sulfato de
sódio (SDS, Invitrogen). As proteínas foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose Hybond ECL (GE Healthcare) em sistema semi-seco (Amersham
Biosciences), na presença do mesmo tampão, acrescido de 20% (volume:volume) de
metanol (Merck), durante 3 h, à 100 mA em temperatura ambiente.
Após a transferência, as membranas foram coradas com vermelho Ponceau22,
fotografadas e lavadas em tampão salina-fosfato (PBS) 1X para remoção do corante.
Para bloqueio de ligações inespecíficas, as membranas foram incubadas durante 1 h
com solução de 5 % de caseína (leite em pó desnatado) em PBS 1X, pH 7,4 (bloto). A
reação com o anticorpo anti-CXCR-4 (Santa Cruz Biotech) procedeu-se com a
incubação da membrana com 100 mg de anticorpo/20 mL de bloto durante 16 h a 4º C, e
uma incubação adicional de 3 h à temperatura de 37º C sob agitação. Como anticorpo
secundário, conjugado com peroxidase, foi utilizado um anti-IgG de coelho (Millipore)
em titulação de 1:5.000. Entre as incubações com os anticorpos, as membranas foram
lavadas de 5 a 10 vezes em tampão PBS 1X acrescido de 0,05% (volume:volume) de
Tween 20 (Merck). Para revelação da quimioluminescência, as membranas foram
incubadas por 3 min em solução contendo luminol e peróxido de hidrogênio (kit ECL,
GE Healthcare). As membranas foram então expostas a filme de raios X (Ge
65
Healthcare) durante 1 min, 5 min, 15 min, 30 min ou 2 h em ambiente escuro. Os filmes
foram digitalizados e, juntamente com as fotografias das colorações com Ponceau,
submetidos à quantificação das imagens por densitometria óptica com o software de
domínio público Scion Image. Os resultados obtidos foram expressos como unidades
arbitárias (AU/μg proteína) e relacionados entre si (filme x coloração Ponceau), com o
volume de amostra total, peso do tecido e peso do animal.
Análise estatística
O nível de significância usado foi 5% para todos os testes realizados. A
normalidade da distribuição dos dados foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov
e/ou Shapiro-Wilk. Os dados com distribuição normal estão representados como médias
e desvio-padrão. Já os que não se enquadram ao critério de normalidade, foram
expressos por mediana e intervalo interquartil. Os resultados obtidos foram comparados
através de testes t Student, Mann-Whitney, Kruskall Wallis e Student-Newman-Keuls e,
quando significativos, foram analisados em pós-testes específicos. As correlações foram
analisadas pelo Coeficiente de Correlação de Spearman. Os programas utilizados foram
o BioEstat versão 5.3 e o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versão 21.
66
RESULTADOS
As características gerais dos animais, quanto a pesos e dosagens de marcadores
metabólicos, podem ser visualizadas na Tabela 1 e nas Figuras 1, 2 e 3. Primeiramente,
foram analisadas as diferenças entre as médias e variações percentuais dos pesos
corporais dos animais normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) ao longo do tratamento
com o ácido graxo
-3 ou água (Figura 1). Os animais WKY mostraram-se sempre
menos pesados do que os SHR (p=0,007) e, frente à suplementação dietética com ω-3,
nas primeiras 24 h, os ratos hipertensos apresentaram variação menor (redução de peso)
em relação aos normotensos (p=0,015). O grupo controle, que recebeu água, mostrou
alta variação (aumento de peso) após 2 semanas (p=0,007).
A influência do
-3 também foi avaliada para os pesos dos diferentes tecidos
coletados dos grupos animais (Figura 2). Animais normotensos apresentaram menores
valores de peso do tecido cardíaco (p=0,004) e renal (p=0,026), respectivamente sob a
dieta aguda e crônica com
-3 em relação ao controle água (Figura 2A). O mesmo
ocorreu com os animais hipertensos (Figura 2B), onde a influência do ácido graxo
causou redução do peso dos tecidos cardíaco (p=0,06) e hepático (p=0,033) após 2
semanas de tratamento em relação ao grupo controle.
Quanto às dosagens bioquímicas dos principais parâmetros metabólicos (COL,
HDL e TGL), os animais normotensos e hipertensos apresentaram redução significativa
para a maioria das dosagens após a dieta suplementada com ω-3 em relação ao controle
água (Tabela 1, Figura 3). Os animais normotensos apresentaram comportamento
diferenciado para os níveis de COL, mostrando queda nos momentos iniciais (24 h) e
depois de 2 semanas de dieta, enquanto que o HDL só teve diminuição após 72 h de
tratamento, efeito que não perdurou após as 2 semanas de administração do ácido graxo.
Os níveis de TGL não variaram nestes animais. Os ratos hipertensos tiveram redução
67
dos níveis de COL e HDL nos momentos iniciais (24 e 72 h), mas este comportamento
não se manteve depois de dieta crônica (2 semanas) com o ω-3. Os níveis de TGL
mostraram-se reduzidos em todos os tempos de suplementação dietética nos animais
SHR. As variações entre o pré e pós-tratamento com ω-3 também foram analisadas e
estão demonstradas na Figura 3. Ilustrando os resultados da Tabela 1, nos ratos WKY, o
uso de ω-3 por 72 h mostrou variação maior dos níveis de COL e HDL (Figura 3A). Os
animais hipertensos mostraram variação percentual menor para os três marcadores ao
longo de toda a dieta, tanto aguda quanto crônica (Figura 3B).
Para analisar se os animais normotensos e hipertensos apresentam uma ativação
diferenciada de homing de células-tronco, influenciada pelo ω-3, tanto de forma aguda
ou crônica, os ratos foram testados quando à expressão do receptor CXCR-4 no tecido
cardíaco e na liberação sistêmica da quimiocina SDF-1α (Figuras 4 e 5). As quantidades
totais de proteína CXCR-4 expressas nas células potencialmente progenitoras cardíacas
foi variável entre os animais (normotensos X hipertensos) nos diferentes tempos de
suplementação dietética com ω-3 (Figura 4). Os animais WKY mostraram alta
expressão do receptor (p=0,002) no tecido cardíaco nas 24 h iniciais após a
suplementação, e um declínio após este tempo (Figura 4A). Os ratos hipertensos, em
contraste, apresentaram expressão crescente dos níveis proteicos de CXCR-4 (p=0,04),
sendo mais elevada após 72 h de dieta com ω-3 (Figura 4B). A quimiocina SDF-1,
isoforma α, também mostrou oscilação de sua expressão e liberação sistêmica entre os
animais nos diferentes tempos de tratamento com ω-3 (p=0,017, Figura 5). Os ratos
WKY tiveram redução inicial da produção de SDF-1α, devida à administração do ω-3,
mas um retorno à expressão basal, mais elevada, após 2 semanas de administração do
ácido graxo. Novamente, para os animais SHR, o resultado foi o oposto: houve alta
liberação da quimiocina após 72 h de dieta com ω-3 e uma pequena queda da expressão,
68
após as 2 semanas de tratamento. Desta forma, verificou-se que após 72 h de
administração do ω-3, entre os diferentes animais, a produção da quimiocina foi
contrastante (p=0,005), sendo muito elevada nos animais hipertensos.
Quando os níveis de expressão de CXCR-4 no coração e a liberação de SDF-1α
foram comparados entre os diferentes grupos de animais e tempos de suplementação
dietética, verificou-se que houve uma correlação positiva significativa (p=0,037) entre
as duas moléculas principais envolvidas com o homing celular nos animais WKY após
as primeiras 24 h de tratamento. Embora os comportamentos entre CXCR-4 e SDF-1
tenham sido similares nos animais hipertensos, estes dados não apresentaram
significância positiva.
Estes dados demonstram que a dieta com ω-3 influencia o ganho/perda de peso,
os padrões metabólicos e a ativação de homing celular tanto nos animais normotensos
como nos hipertensos, de forma aguda e crônica. Interessantemente, após a
suplementação dietética, os ratos WKY tiveram uma modulação negativa da liberação
de SDF-1, mas positiva da expressão do receptor CXCR-4, na indução de homing
inicial, que não foi mantida ao longo de toda a dieta enquanto que os animais SHR
tiveram uma ativação tardia de ambas as moléculas após a administração do ácido
graxo.
69
DISCUSSÃO
O presente estudo evidenciou os efeitos da suplementação de dieta com ácidos
graxos
-3 na ativação do homing de células-tronco em ratos SHR e WKY, como
também as variações de peso corporal, tecidual e a liberação sistêmica de COL, HDL e
TGL, sob influência do tratamento com ω-3. Os ratos normotensos e hipertensos
apresentaram respostas diferenciadas frente aos diferentes tempos de dieta com o ácido
graxo.
Primeiramente, foi demonstrada a influência da dieta sobre a variação do peso
corporal. Embora os animais tenham apresentado ganho de peso, fisiológico em razão
ao crescimento corporal normal e, de acordo com as linhagens, onde animais WKY
mostraram-se sempre menos pesados do que os SHR, foi demonstrado que o ω-3 causou
redução significativa do peso nos animais tratados. O tratamento com o ácido graxo
também foi capaz de reduzir o peso de alguns tecidos, como coração, fígado e rins, em
relação ao controle que recebeu suplementação com água. Freeman e cols. (1994)23, em
estudo sobre a variação de peso corporal e do coração em ratos obesos, observaram que
existe redução da massa miocárdica correlacionada, com a perda de peso corporal, o que
foi confirmado, no nosso estudo. Além disso, tem sido postulado que dietas ricas em
ácidos graxos ω-3 podem diminuir a síntese de lipídios e auxiliar em tratamentos para a
redução de gordura corporal ou obesidade24 e influenciar o sistema imune25.
O tipo de gordura da dieta influencia funções metabólicas e leva a mudanças no
peso e/ou na composição corporal, ainda que não haja ingestão hiperenergética18. No
entanto, muitas controvérsias são encontradas na literatura na relação entre a
composição lipídica da dieta. Estudos recentes sugerem que os ácidos graxos ω-3
serviriam como controladores da expressão de genes envolvidos no metabolismo
lipídico e na adipogênese, por serem mediadores importantes na expressão gênica,
70
atuando via receptores proliferadores e ativadores de peroxissomos celulares (PPAR)26.
Na literatura, muitas hipóteses sobre o mecanismo pelo qual os ácidos graxos
poli-insaturados são responsáveis pela diminuição das concentrações de COL estão
sendo consideradas no sentido de serem responsáveis pelo aumento da excreção do
marcador sob a forma de ácidos biliares, redistribuindo dessa forma as concentrações no
soro e tecidos, ou pelo aumento dos receptores de Coleterol-LDL no fígado, levando a
uma diminuição na sua concentração plasmática27. Também é apontado que os ácidos
graxos ω-3 são capazes de inibir a síntese de triglicerídeos no fígado17 e/ou acelerar o
catabolismo de Coleterol-VLDL e quilomícrons pelo aumento da enzima Lipase
lipoprotéica (LPL)28,29.
Para alguns pesquisadores30, o ω-3 apresenta efeito hipocolesterolemiante,
sugerindo que a diminuição dos níveis de COL, tanto em animais normotensos como
hipertensos, quando comparados ao grupo água, é devida ao consumo desse tipo de
ácido graxo altamente insaturado. Em adição, pesquisas sobre a atividade enzimática da
LPL demonstraram que a proteína está mais ativa em animais que recebem fontes
alimentares ricas em ácidos graxos insaturados, principalmente da série ω-331,32. E,
entretanto, a atividade da enzima está reduzida no tecido adiposo33.
Os ácidos graxos poli-insaturados têm sido relacionados também com efeitos
hipotrigliceridêmicos, os quais se devem à redução da atividade de enzimas ligadas à
síntese de ácidos graxos, como Ácido-graxo Sintase, Glicose-6-fosfato Desidrogenase e
Lipase Triacilglicerol34 e com o aumento da atividade da enzima Carnitina-palmitoil
Transferase, relacionada com a oxidação dos ácidos graxos35. Diniz e colaboradores
(2004)19 avaliaram os efeitos da dieta rica em ácidos graxos saturados (25%) e ácidos
graxos poli-insaturados (25%) no metabolismo e sua relação com o estresse oxidativo
de ratos Wistar e verificaram que os animais tratados com ácidos poli-insaturados
71
apresentaram menores concentrações de TGL, COL, LDL e relação COL:HDL. Com
relação aos níveis reduzidos de TGL nos animais hipertensos, alguns autores têm
sugerido que dietas ricas em óleo de peixe podem reduzir as concentrações plasmáticas
de triglicerídeos tanto em pessoas ou animais com hipertrigliceridemia36 quanto em
normolipidêmicos37,38.
Segundo Margolin39, o EPA possui ação na prevenção de doenças
cardiovasculares e hipertensão arterial, já o DHA tem a capacidade de reduzir a taxa de
triglicerídeos, além de ser importante no desenvolvimento da função visual e cerebral.
Além disso, outros estudos que avaliaram o efeito do EPA e DHA sobre o perfil lipídico
demonstraram, de modo geral, redução de VLDL e da trigliceridemia40, de
apolipoproteínas e consequente aumento da LPL29. O metabolismo lipídico e
lipoproteico altera-se de forma significativa como consumo regular de pescado e
suplementação nutricional com ácido graxo ω-3, sendo que doses inferiores a 2 g/dia
são suficientes para produzirem tais efeitos41,42. Assim, as quantidades de ω-3 utilizadas
neste estudo foram capazes de influenciar positivamente o metabolismo de lipídeos, o
que, para seres humanos, pode ser benéfico na prevenção e tratamento complementar de
doenças cardiovasculares como a HAS.
A dieta suplementada com ω-3 também foi avaliada sobre a ativação do homing
celular em animais normotensos e hipertensos. A fase aguda da dieta foi capaz de
induzir maior expressão do eixo SDF-1/CXCR-4 nos animais WKY que, mediante a
falta de sinalização cooperativa, proveniente principalmente de resposta inflamatória,
estresse oxidativo e hipóxia, não foram capazes de manter, mesmo sob influência do
ácido graxo, este efeito até a fase crônica. O oposto ocorreu nos animais SHR, que por
apresentarem uma sinalização que propicia a expressão de quimiocinas para melhora da
72
resposta anti-injúria, foram capazes de ativar o homing principalmente durante a
manutenção tardia da suplementação com o ω-3.
A quimiocina SDF-1 é primeiramente expressa em altos níveis pelas células do
estroma da medula óssea43 e diversos estudos têm sido realizados verificando a ação
deste ligante e seu receptor CXCR-4 sobre a regeneração tecidual44,45. O eixo é expresso
em vários tecidos e órgãos atuando na reposição celular tanto fisiológica como sob
injúria ou lesão46,47,48. No tecido cardíaco, o aumento nos níveis de SDF-1 estimula o
recrutamento de células para o local da lesão, que proporcionam ao tecido reparo e
regeneração e têm efeitos parácrinos positivos na sobrevivência dos cardiomiócitos e
função cardíaca49.
Em doenças cardiovasculares, principalmente as que envolvem infarto do
miocárdico e processos isquêmicos, é sabido que atividade do eixo SDF-1/CXCR-4 está
aumentada, principalmente para atuar na promoção da regeneração cardíaca45,50. Nosso
estudo é um dos primeiros que mostra que há uma relação também com a HAS e,
principalmente, que pode ser modulada através de dieta com alimentos funcionais.
Recentemente, foi verificado que o SDF-1 é um importante regulador do sistema
simpático e da função hemodinâmica em situações normais e/ou pato-fisiológicas, e que
pode modular a ativação neural e humoral na insuficiência cardíaca51, que é a principal
patologia decorrente de HAS crônica. O ω-3 foi capaz de sustentar a expressão da
molécula durante todo o período de dieta nos animais hipertensos, provavelmente
através da manutenção de vias de sinalização comuns que levam à liberação de SDF-1.
Fato é que no metabolismo de lipídeos, o ω-3 é capaz de ativar fatores de transcrição
como os PPAR52, que são indutores de ativação de resposta imune e, por consequência,
do próprio SDF-1.
73
Os benefícios da ingestão de ácidos graxos poli-insaturados da série ω-3, sob a
forma de alimentos-fontes como o óleo de peixe, já estão bem relacionados com a
prevenção e tratamento de enfermidades cardiovasculares. Entretanto, os mecanismos
que envolvem os efeitos de substâncias cardioprotetivas ou alimentos funcionais sobre a
ativação do homing de células-tronco ainda carecem de muitos estudos. Estudos
adicionais são necessários para que se esclareçam como mais profundidade os
mecanismos de ativação. Diferentes modelos experimentais podem fornecer mais
informações para um melhor entendimento das particularidades que afetam o homing
celular na patofisiologia. Uma vez que estes mecanismos, juntamente com o uso de
fatores nutricionais, estiverem melhor estabelecidos, eles poderão contribuir para o
planejamento de novas ações preventivas e terapêuticas.
AGÊNCIAS FINANCIADORAS
FAPICC - Fundo de Apoio do Instituto de Cardiologia/Fundação Universitária de
Cardiologia à Ciência e Cultura.
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Programa de
Cooperação Acadêmico (Procad).
CONFLITO DE INTERESSES
O presente estudo foi elaborado e conduzido de forma independente, com o apoio
financeiro de agências já referidas (FAPICC e CAPES) não havendo conflitos de
interesses.
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77
LISTA DE LEGENDAS
Tabela 1. Médias das dosagens bioquímicas (Colesterol, Colesterol-HDL e
Triglicerídeos) dos animais normotensos (WKY) e hipertensos (SHR) com dieta
suplementada com 1mg/animal de ω-3 durante intervalos de tempo de 24 e 72 h ou
2 semanas ou com água (controle).
Figura 1. Análise da variação do peso corporal de animais normotensos e
hipertensos ao longo da suplementação dietética com
-3. Os plots representam as
medianas das variações percentuais (+ para aumento;- para redução) ao final da
suplementação de 24 h, 72 h, 2 semanas com ω-3 ou água para os animais WKY (A) e
SHR (B). Nos ratos WKY (A), os grupos tratados por 24 h e 72 h (*) tiveram variação
menor quando comparados ao controle (p=0,046; p=0,0006); o grupo de 72 h (§)
também mostrou variação menor em relação ao grupo tratado por duas semanas
(p=0,002). Os animais SHR (B) também apresentaram variação menor de peso corporal
entre os grupos tratados por 24 h e 72 h (*) quando comparados ao controle água
(p<0,0001; p=0,0003) e entre estes mesmos grupos (§) e o tratado com ω-3 durante 2
semanas (p=0,006; p=0,02). O valor em itálico representa o peso médio dos animais
(em g) após o determinado tempo de administração do ácido graxo.
Figura 2. Análise da variação do peso de tecidos dos animais normotensos e
hipertensos ao longo da suplementação dietética com
-3. (A) Os ratos WKY
tratados nas primeiras 24 h com o ácido graxo mostraram massa do tecido cardíaco
menor em relação à do grupo controle (p=0,005); os rins mostraram-se também mais
pesados no grupo água mesmo após 2 semanas de tratamento com o -3 (p=0,03). (B)
78
Animais SHR tiveram redução de peso dos tecidos cardíaco (p=0,06) e hepático
(p=0,033) após 2 semanas de tratamento em relação ao grupo controle.
Figura 3. Análise da variação relativa dos parâmetros metabólicos Colesterol,
Colesterol-HDL e Triglicerídeos entre o pré e o pós-tratamento com ω-3. (A) Ratos
WKY tiveram variação percentual diferencial para os níveis de COL e HDL entre 72 h e
2 semanas de tratamento com ω-3 (COL p=0,003; HDL p=0,007) e entre o grupo que
recebeu dieta por 2 semanas em comparação ao que recebeu apenas água (COL
p=0,017; HDL p=0,002). (B) Animais SHR mostraram variação percentual significativa
para os níveis de COL e HDL entre o controle (água) e administração aguda de 24 h
(COL p=0,001; HDL p=0,011) e após a administração crônica de 2 semanas (COL
p=0,005; HDL p=0,016) de ω-3. Os níveis de TGL também mostraram variação
significativa neste grupo entre o tempo de 72h e ao longo de 2 semanas de dieta com ω3 (p=0,006) e entre a dieta crônica e o controle água (p=0,049).
Figura 4. Análise da expressão de CXCR-4 no tecido cardíaco de ratos
normotensos e hipertensos que receberam suplementação dietética com ω-3. (A)
Ratos WKY apresentaram alta expressão do receptor na fase mais inicial da dieta (24 h),
retornando aos valores basais ao longo das 2 semanas de tratamento. (B) Os animais
SHR mostraram níveis crescentes da proteína durante todo o período de dieta com o
ácido graxo. As linhas indicam os tempos onde a expressão de CXCR-4 sofreu variação
maior.
Figura 5. Análise da liberação sistêmica de SDF-1α em ratos normotensos e
hipertensos que receberam suplementação dietética com ω-3. Plasmas de animais
79
WKY e SHR foram coletados em estado basal e após diferentes intervalos de tempo (24
e 72 h, 1 e 2 semanas) de administração de 1 mg/animal de ω-3 e após 2 semanas com
água. As amostras foram ensaiadas por ELISA e as colunas representam as médias das
dosagens, quantificadas por curva de regressão linear nos respectivos intervalos e
analisadas por teste ANOVA com pós-teste de Bonferroni. Os dados apresentaram
distribuição normal (p=0,036, Shapiro-Wilk). (*) Indicação das diferenças significativas
entre os animais WKY quando comparados ao tratamento controle com água (p=0,035 e
p=0,025, respectivamente); (ⱡ ) Diferença entre os animais SHR com 72 h de
suplementação com ω-3 quando comparados ao estado basal (p=0,044) e após 2
semanas de dieta (p=0,045).
80
TABELA 1.
81
Figura 1.
A
*
*§
B
*§
*§
279,5
24h -3
275,1
72h -3
301,8
2 sem. -3
286,6
2 sem. água
82
Figura 2.
A
24h -3
72h -3
2 sem -3
2 sem água
B
24h -3
72h -3
2 sem -3
2 sem água
83
Figura 3.
A
B
84
Figura 4.
A
P=0,004
P=0,001
B
P=0,048
85
Figura 5.
ⱡ
*
*
86
12. ANEXOS
12.1. CERTIFICADO DE ANÁLISE DO CONTROLE DA QUALIDADE
87