Mário Cunha - IPO de Lisboa

Transcrição

Introdução as Técnicas de Biologia
Molecular em Virologia
Mário Cunha
Obj ti
Objectivos
Introdução ao PCR em Tempo Real
Colheita e manipulação de amostras
Diagnóstico Molecular em Microbiologia
Análise e Tratamento de Dados
`
`
`
`
2
1º Curso de Virologia Molecular em
Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
Biologia Molecular em Microbiologia:
`
`
`
Detecção Indirecta vs Detecção Directa do agente
M t i l Genético:
Material
G éti
`
`
`
Charles De Gaulle: 1958
`
`
3
DNA
RNA
Reune 12 cientistas
R
i i
d
de topo e concede
d a cada
d um 5 min
i para lhe
lh
explicar qual a area cientifica que teria um investimento reforçado
Em 1958,
1958 foi a Biologia Molecular a escolhida
Vírus
Ví
Dmitri Ivanovskyy ((1864-1920):
)
`
`
`
Um dos Fundadores da Virologia
1892: Descobriu que o agente responsável pela
doença de mosaico de tabaco passava através
dos filtros capazes de reter bactérias
Martinus Willem Beijerinck
j
((1851 – 1931):
)
`
`
`
Um dos Fundadores da Virologia
Em 1898, ele fez descobertas semelhantes mas
sugeriu que o patogeneo responsavel era
diferente
Principais
p Provas:
`
`
`
`
4
Agente de reduzido tamanho
Apenas replica no hospedeiro, não o faz no
meio
Passa nos filtros de 0,2 μm
Vírus
Ví
Quando lhe p
perguntaram
g
oq
que era um
Virus, ele respondeu com um Truismo:
“A virus is a virus”
André Lwoff: Prémio Nobel da Medicina em 1965.
5
O que é um vírus?
“A virus is a piece of bad news wrapped up in protein”
Sir Peter Medawar –Nobel Prize 1960
6
Vírus
Ví
1901
Yellow Fever Virus
(1st Human Virus)
1911
Rous Sarcoma Virus
7
1903
Rabies Virus
1915
Bacteriophages
1906
Variola
Virus
1908
Chicken
Leukemia Virus,
Virus
Poliovirus
1906
Influenza Virus
O que é um vírus?
í
?
Historia da Virologia:
`
`
8
http://www.utmb.edu/virusimages/
Vírus
Ví
Vírus
`
`
Toxina ou veneno liquido (Latim)
Apresentam as seguinte propriedades:
`
`
`
`
`
`
Um vírus é parasita intracelular obrigatório
O material genético pode ser DNA ou RNA
É este material genético que entra na célula hospedeira e é
responsável no direccionamento da maquinaria celular para a
produção de novas partículas virais – Viriões
E
Estes
viriões
i iõ são
ã produzidos
d id na célula
él l hospedeira
h
d i a partir
i da
d
“montagem” das diferentes unidades codificadas pelo material
genético
Os novos viriões produzidos na célula hospedeira transportam o
material genético para outra célula hospedeira ou organismo, de
modo a dando inicio a um novo ciclo infeccioso
Vírus: eles não crescem, eles não se dividem, apenas replicam
`
9
Vírus
Ví
10
Vírus
Ví
•
Mimivirus:
• O maior vírus
conhecido!
• Tamanho: 750 nm
• Codifica 1018 genes
• Hosp:
p amiba
11
Vírus
Ví
`
Classificação:
`
`
`
12
Em 1962, André Lwoff, Robert Horne e Paul Tournier foram os
primeiros a desenvolver a primeira metodologia para classificar
os vírus, baseada no sistema hierárquico de Lineu
Este sistema baseia a classificação em filo,
filo classe,
classe ordem,
ordem família,
família
género e espécie
Os vírus era agrupados de acordo com as propriedades
partilhadas (e não as dos seus hospedeiros) e o tipo de ácido
nucleico que constitui o seu genoma
Vírus
Ví
13
Vírus
Ví
14
Vírus
Ví
15
Vírus
Ví
`
Classificação dos Vírus:
`
`
`
Mais tarde, foi criado o Comité Internacional de
Taxonomia de Vírus ((International Committee on
Taxonomy of Viruses)
No entanto, os vírus não eram classificados com
base no filo
f ou classe, uma vez que o reduzido
tamanho do genoma dificulta e muito a
determinação do ancestral para alem da Ordem
As 4 principais características para classificar os
vírus são:
`
`
`
`
16
Natureza do ácido nucleico do virião: DNA e RNA
Simetria (cápside)
Presença/ Ausência de envelope (lípidos)
Dimensão do Virião e da Cápside
Vírus
Ví
`
Naa cclassificação
ass cação actual
actua (2011),
( 0 ), o ICTV
C define
e e 6 ordens:
o e s:
`
`
`
`
`
`
`
`
`
Caudovirales
Herpesvirales
p
Mononegavirales,
Nidovirales,
Picornavirales
Tymovirales.
Foi proposta uma sétima
é
ordem: Ligamenvirales
O ICTV não distingue formalmente entre subespescies, tipos
e isolados
i l d
No total, temos 6 ordens, 87 famílias, 19 subfamílias, 349
géneros cerca de 2,284
géneros,
2 284 espécies e mais de 3000 tipos sem
classificação
17
Vírus
Ví
`
Classificação de Vírus:
Classificação de Baltimore
`
`
Desenvolvida por David
Baltimore, Prémio Nobel
Medicina(1975)
Baseada no mRNA
http://www.virology.ws/2009/08/07/how-viruses-are-classified/
p
gy
18
Vírus
Ví
`
A Classificação de Baltimore implica que:
`
`
19
Todos os genomas vírus têm de produzir mRNA que possa ser
lido pelos ribossomas do hospedeiro
7 Tipos de Genomas:
A Classificação original não incluía um
tipo de genoma: dsDNA com RT da
família Hepadnaviridae
Vírus
Ví
1º Cu
urso de Virrologia Mo
olecular em
m
Oncolo
ogia - 26 e 27 Nove
embro 2012
20
Vírus
Ví
`
DNA
`
dsDNA (I)
`
`
`
`
RNA
`
Adenovirus
Herpesvirus
Poxvirus
`
`
Parvovirus
`
`
`
Orthomyxovirus
Rhabdovirus
ss(+)RNA with DNA
intermediate (VI)
`
21
Picornavirus
Pic
rna ir s
Togavirus
ss( )RNA (V)
ss(-)RNA
`
He adna ir s
Hepadnavirus
Reovirus
ss(+)RNA (IV)
`
Gapped ds DNA (VII)
`
dsRNA (III)
`
ssDNA (II)
`
`
`
Retrovirus
I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
Ácidos Nucleicos:
`
`
`
`
22
Friedrich Miescher (1860)
Ri h d Alt
Richard
Altmann (1889)
Albrecht Kossel, Prémio Nobel Medicina
1910 (descoberta
(d
b t d
das bases
b
e pentoses
t
dos ácidos nucleícos)
Ph bi Levine
Phoebis
L i e Walter
W lt JJacobs
b (1909)
(1909):
estrutura do nucleótido
I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
James Watson e Francis Crick:
`
`
23
A estrutura final da molécula de DNA foi proposta por estes
dois cientistas em 1953
Ganharam o Prémio Nobel Medicina em 1962
I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
Rosalind Franklin:
`
`
Difração do raio-X
raio X para
determinação da estrutura da
molécula do DNA
Dogma Central
D
C t l da
d Biologia
Bi l i
Molecular (Crick, 1957)
`
24
DNA -> mRNA -> Proteina
E t t
Estrutura
C
Cadeia
d i dupla
d l DNA
Adenosina:
•Açucar (pentose):
•Base: Adenina
•Grupo Fosfato
25
Introdução Biologia Molecular
Á
Ácidos
Nucleícos: DNA vs RNA
26
Ligações
g ç
p
por p
pontes de Hidrogénio
g
entre cadeias complementares
I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
Replicação:
`
`
`
27
Ocorre na divisão celular
É realizada pelo enzima DNA Polimerase
E
Extensão:
ã 5’ – 3’
D t Di
Det.
Directa
t vs Indirecta
I di t
`
Detecção Directa e
Indirecta agente:
`
`
28
Até a década de 1970, a
descoberta de vírus era
realizada com base na Cultura
Células e posterior
identificação por Microscopia
Eletrónica
Em 1971, foram desenvolvidos
os imunoensaios (EIA ou
ELISA), por Eva Engvall, Anton
Schuurs, Peter Perlmann e
Bauke van Weemen
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
`
`
Primeiro trabalho p
publicado em 1971,, ppor Kleppe
pp e
colaboradores
Só com a descoberta,
descoberta em 1976,
1976 da Taq Polimerase,
Polimerase uma
DNA Polimerase isolada de uma bacteria termofila,
Thermus aquaticus,
aquaticus capaz de aguentar as elevadas
temperaturas necessárias a desnaturação da dupla cadeia,
é que estavam criadas as condições para a invenção do
PCR
29
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
•
Invenção do PCR atribuida a Kary Mullis,
em 1983:
`
`
•
Trabalhava na Cetus Corp, equipa
multidisciplinar
"Beginning with a single molecule of the
genetic material DNA, the PCR can generate
100 billion
billi similar
i il molecules
l l in
i an afternoon.
ft
The reaction is easy to execute. It requires
no more than a test tube,, a few simple
p
reagents, and a source of heat.“
Kary Mullis:
`
Recebeu o Prémio Nobel Quimica em 1993

30
http://www.karymullis.com/
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti

Diferentes passos do PCR:
y
y
y
Desnaturação da cadeia dupla (94-96ºC)
Ligação dos primers (Annealing,
(Annealing a 65
65ºC)
C)
Elongação (Taq Polimerase, 72ºC)

Necessário equipamento especifico (diferentes temperaturas)
31
50º
A. Double
strand DNA
96º
B. Denature
50º
C. Anneal
primers
Taq
72º
32
D. Polymerase
binds
Taq
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
33
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
34
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
`
`
Detecção do produto amplificado é realizada por gel
Corantes:
`
`
`
`
`
Brometo EEtidio
B
d (20 ng DNA)
SYBR Green
Tampão de Carga (Loading Buffer)
Aplicação de corrente eléctrica
Marcador de peso molecular
35
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
36
R
Reverse
T
Transcription
i ti
PCR
`
Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction: RT-PCR
`
`
`
`
37
Variante da Técnica de PCR
Aplicada quando se pretende determinar a presença de RNA
O RNA é convertido em DNA complementar ou cDNA,
através da acção de um enzima –Transcriptase Reversa
Uma vez obtido o cDNA, segue-se o PCR normal
AAAAA
RT TTTTT
AAAAA
RT
TTTTT
AAAAA RT
TTTTT
Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription
38
Oligo dT primer is
bound to mRNA
Reverse
transcriptase
(RT) copies first
cDNA strand
Reverse
transcriptase
g
and
digests
displaces mRNA
and copies
second strand of
cDNA
Double
D
bl
strand
cDNA
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
39
PCR Tempo
T
R
Reall
•
Limitações
Li
it õ da
d Detecção
D t ã d
de produtos
d t de
d PCR através
t é de
d
Gel de agarose (PCR Convencional):
•
•
•
•
•
•
•
•
40
Baixa
B
i P
Precisão
iã
Baixa sensibilidade
Gama mais curta < 2 logs
Baixa resolução
Sem automatização
Discriminação unicamente com base no tamanho fragmento
Resultados não são expressos numericamente
A coloração com Brometo Etidio não é muito precisa em
termos quantitativos
PCR Tempo
T
R
Reall
`
História:
`
Primeiros artigos na década
d 1990:
de
1990
`
`
41
Higuchi et al, 1992
H id ett al,1996
Heid
l 1996
42
PCR Tempo
T
R
Reall

Monitorização da fluorescência emitida durante a reacção
de PCR como consequência da formação de fragmentos
de DNA em cada ciclo de PCR, por oposição à detecção
na fase final do PCR:
y
y
y
43
Detecção em tempo real do aumento de fluorescência
Nã há necessidade
Não
id d d
de detectar
d
o produto
d
amplificado
lifi d atraves
de gel
T d a análise
Toda
áli é realizada
li d atraves de
d software
f
PCR Tempo
T
R
Reall

Vantagens
a tage s PCR
C em
e Tempo
e po Real:
ea :
y
y
y
y
y
y
y
y
y
44
Não é influenciado por amplificação inespecifica
Amplificação
p
pode
p
ser monitorizada em Tempo
p Real
Não há necessidade de processamento pós PCR (dimimuição do
risco de contaminações)
R d (30 min. a 2 horas)
Rapidez
h
)
Maior Gama dinâmica (aumentos de 1010)
Re er menor
Requer
men r quantidade
antidade de DNA/RNA
Confirmação de amplificação específica através da Curva de
Dissociação
ssoc ação ((Melting
t g Curve)
Cu v )
Equipamento garante maior especificidade, sensibilidade e
reprodutibilidade
Não é mais caro que o PCR tradicional, excepto aquisição de
equipamento
PCR Tempo
T
R
Reall
`
Desvantagens do PCR em Tempo Real:
`
`
45
Implementação requer capacidades técnicas especificas
Custo do equipamento
`
`
`
`
`
`
LCR
TMA
NASBA
bDNA
Microarrays
Sequenciação
46