Nutrição e crescimento de microrganismos
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Nutrição e crescimento de microrganismos
NUTRIÇÃO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS Microbiologia FFI 0751 Profa. Dra. Ilana Camargo 1 Nutrição e cultivo dos microrganismos Crescimento microbiano Fases de crescimento Medidas do crescimento Fatores necessários para o crescimento Fatores físicos Fatores químicos Relações dos microrganismos com o oxigênio Nutrientes macronutrientes micronutrientes Meio de cultura 2 1 Metabolismo e crescimento das bactérias Aminoácidos Obter ou Sintetizar Carboidratos Lipídios Em geral, as bactérias necessitam de uma fonte de carbono e nitrogênio, uma fonte de energia, água e vários íons para seu crescimento. 3 Fatores necessários para o crescimento Fatores físicos: temperatura, pH, pressão osmótica Crescimento microbiano* * Crescimento microbiano: em microbiologia, refere-se ao aumento do número de células. Fatores químicos: fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oligoelementos, oxigênio, fatores orgânicos de crescimento (vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas). 4 2 Crescimento microbiano • É o aumento no número de células. • Importante seu conhecimento para o desenvolvimento, por exemplo, de métodos de controle. • Depende de reações químicas • As principais reações de síntese celular são reações de polimerização que originam as macromoléculas a partir de monômeros. • Acúmulo de macromoléculas no citoplasma novas estruturas Parede celular Membrana citoplasmática flagelos... Reação de transpeptidação Glicolase – sintetiza ligações glicosídicas 5 Hiramatsu, The Lancet, 2001. Crescimento microbiano • Fissão binária: modo mais comum de reprodução bacteriana • Outros modos: brotamento (Hyphomicrobium) Células natatórias (expansivas) Formação de roseta 6 http://marjanbiology.mihanblog.com/post/156 3 Crescimento microbiano Células natatórias (expansivas) Pedúnculo 7 Crescimento microbiano Fissão Binária MinC FtsZ MinD ZipA FtsA ? MinE 8 4 Crescimento microbiano Fissão Binária Cromossomo, cópias de ribossomos complexos macromoleculares, monômeros e íons inorgânicos Cromossomo, cópias de ribossomos complexos macromoleculares, monômeros e íons inorgânicos Tempo que demora para ocorrer = tempo de geração 9 Crescimento microbiano Fissão Binária •Proteínas Fts: formam o divisomo, ‘aparelho’ de divisão da célula (Filamento termossensível). •Divisomo: acredita-se que coordena a síntese da nova membrana citoplasmática e da parede celular em ambas as direções – célula alongada. Contraste de fase Coloração do nucleoide Coloração específica para FstZ •Término da síntese de DNA é o ‘sinal’ para a formação do anel FtsZ, que fica no espaço entre os nucleóides duplicados. O anel FtsZ e a divisão celular. (a) Visão em corte de um bacilo, com o anel FtsZ. (b) Ciclo celular de E. coli, mostrando o surgimento e o desaparecimento do anel FtsZ. Madigan et al., 2004. 10 5 Crescimento microbiano Divisão celular Anel FtsZ é formado no espaço entre os nucleoides duplicados, em uma posição central facilitada pelas proteínas MinC, MinD e MinE. Proteínas Min migram de um pólo ao outro da célula impedindo a formação do anel nos pólos. MinE desloca MinC e D FstZ sofre despolimerização promovendo a invaginação dos componentes da parede para formar o septo e separar as células filhas 11 Crescimento microbiano Ação das penicilinas!! 12 6 Crescimento microbiano Divisão celular Resumo das proteínas envolvidas na divisão, na localização da produção da parede celular e na manutenção da forma celular 13 Crescimento microbiano Divisão celular – Padrões de crescimento de parede celular 14 7 Crescimento microbiano Divisão e forma celular Archaea Proteínas do tipo MreB e FtsZ Há fortes paralelos entre os processos de divisão celular e determinantes morfológicos de todos os procariotos. 15 Crescimento microbiano Divisão e forma celular – procariotos x eucariotos Procariotos MreB Estruturalmente relacionada com Eucariotos Actina FtsZ Tubulina Crescentina Queratina 16 8 Crescimento populacional O aumento do número de células também pode ser medido pelo aumento da massa microbiana Taxa de crescimento: variação de número de células ou da massa celular por unidade de tempo; Geração: intervalo em que uma célula origina duas novas; Tempo de geração: tempo necessário para que uma população dobre de número (Tempo de duplicação); 17 Crescimento populacional progressão geométrica de quociente 2 Coordenadas logarítmicas Coordenadas aritméticas Conversão do número de células de uma população em uma expressão logarítmica desse número. Representação gráfica logarítmica (linha pontilhada) e aritmética (linha contínua) da curva de crescimento de uma população 18em fase de crescimento exponencial. 9 Crescimento populacional O padrão de aumento populacional, em que o número de células é duplicado a cada período de tempo, é denominado crescimento exponencial. Escala aritmética: difícil de obter informações sobre a taxa de crescimento Construir Gráficos semilogarítmicos 19 Tempo de geração •Tempo de Geração: intervalo de tempo em que uma célula origina duas novas células ou tempo necessário para uma população dobrar de número. Muitas das bactérias estudadas apresentam tg de 1 a 3 h (pode variar de 10 min a >24h). • Tg de E. coli = 20 min • 20 gerações (~7 horas), 1 célula torna-se em > 1 milhão de células! •Tg pode ser influenciado pelas condições de cultivo (tipo de meio, temperatura, etc.). 20 10 Tempo de geração •Há uma relação entre o número de células inicialmente presentes em uma cultura e o número presente após algum tempo de crescimento exponencial N=No.2n log N = log N0 + n log2 n = (log N - log N0) / log 2 n= log N – log No /0,301 n= 3,3 (logN – log N0) onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações. tg = t/n onde tg= tempo de geração, t= tempo de crescimento (horas ou minutos de crescimento exponencial) e n= número de gerações, como determinado acima. 21 Taxa de crescimento* É o número de gerações formadas, por unidade de tempo, de uma cultura em crescimento exponencial ou variação no número ou massa por unidade de tempo. Constante de taxa de crescimento K = ln2/tg = 0,693/tg (h-1) *Esse termo também é descrito como a velocidade de crescimento específico e representado por m. No caso anterior K = 0,693/0,5 =1,386 22 11 Fases do crescimento de uma população Curva de crescimento típica de uma população bacteriana, a partir de uma cultura em batelada* (Madigan et al., 2004). * Cultura que se desenvolve em um volume fixo de meio de cultura. 23 Fases do crescimento de uma população Contagem do número de células ao longo do período de incubação pelo método a ser mostrado a seguir!! 24 12 Fases do crescimento de uma população 25 Fases do crescimento de uma população Curva de crescimento típica de uma população bacteriana, a partir de uma cultura em batelada* (Madigan et al., 2004). * Cultura que se desenvolve em um volume fixo de meio de cultura. 26 13 Fases do crescimento LAG • Pouca ou ausência de divisão celular. • Síntese enzimática e de moléculas variadas. • Pode ser curta ou longa, dependendo das condições fisiológicas do inóculo. • Aumento na quantidade de proteínas, no peso seco e no tamanho celular 27 Fases do crescimento EXPONENCIAL OU Log • Crescimento exponencial das células – Tempo de Geração constante – linha reta no gráfico. • Fase que as células estão mais “saudáveis” – utilizadas para estudos enzimáticos e de outros componentes celulares. • Taxa de crescimento exponencial (número de gerações por unidade de tempo) de uma população pode ser influenciada pelas condições de cultivo, por exemplo. 28 14 Fases do crescimento ESTACIONÁRIA • Não há crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem (crescimento críptico). • Síntese de vários metabólitos secundários (antibióticos e algumas enzimas). Também pode ocorrer a esporulação das bactérias. • • Alterações de fenótipo por quorum sensing (processo de comunicação celular mediado pela densidade populacional). Causas: esgotamento de nutrientes essenciais, acúmulo de produtos de excreção em concentrações inibitórias, alterações no pH. 29 Fases do crescimento MORTE OU DECLÍNIO • Número de células mortas excede o de células vivas. • Na maioria dos casos, a taxa de morte é inferior à taxa de crescimento exponencial. • A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viáveis cai lentamente. Em alguns casos há a lise celular. 30 15 Fases do crescimento de uma população Há maior aumento de tamanho do que de número de viáveis Na fase de declínio/morte algumas podem sofrer lise e diminuir levemente a DO! Quando se conta viáveis a “queda” na reta é mais acentuada! 31 http://web2.mendelu.cz/af_291_projekty2/vseo/stranka.php?kod=4638 Cultura contínua: quimiostato •Sistema de fluxo ao qual um volume constante de meio fresco é continuamente adicionado, sendo o mesmo volume de meio removido. •Equilíbrio do sistema (steadystate): quando o número de células e a quantidade de nutrientes permanece constante. 32 16 Medidas do crescimento microbiano contagens de viáveis Diretas contagens de células totais Medidas do crescimento microbiano Indiretas verificação da turbidez 33 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem em placa Contagem das células viáveis Parte de três princípios: -Cada colônia é originada de uma única bactéria -Inóculo original é sempre homogêneo -Não existe agregação de células Desvantagem: precisa de um período de incubação (24h) 24 horas 34 17 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem de viáveis Primeiro passo: diluição seriada Como a cultura pode ter um número elevado de células, ao semear 100uL desta cultura na superfície de um meio sólido em placa, poderá haver fusão das colônias dificultando a contagem do número de colônias. 10-1 10-2 10-3 ... 35 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem de viáveis Segundo passo: inoculação / semeadura Método de semeadura por Profundidade (pour plate) Método de semeadura por espalhamento Até secar!! Métodos de semeadura em placa para contagem de bactérias viáveis. 36 18 Contagem de viáveis Segundo passo: inoculação / semeadura 37 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem em placa após diluição seriada Procedimento de contagem de viáveis por meio de diluições em série da amostra e o método de semeadura em profundidade (pour plate). Madigan et al., 2004. Intervalo ideal para contagem: 30 a 300 unidades formadoras de colônias (UFC). Resultado:“UFC/mL da cultura original” Dificulta contagem, Contagem errônea devido à saturação que impede o crescimento de algumas colônias 38 19 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem de viáveis Contagem em placa 1 L de água 9 UFC/L de amostra 39 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem em placa Contagem de bactérias utilizando o método de filtração. MEV de superfície de membrana de filtro com bactérias (esquerda). Membrana em placa de Petri, mergulhada em meio líquido Endo, seletivo para Gram negativo (direita). . Tortora et al., 2005 40 20 Medidas diretas do crescimento microbiano Contagem microscópica direta, utilizando a câmara de contagem Petroff-Hausser. Tortora et al., 2005. 41 Anomalia da contagem de placas Contagens microscópicas diretas de amostras revelam muito mais organismos que aqueles recuperados em placas de qualquer meio de cultura. ? No microscópio há a contagem de células viáveis e mortas Solo e água – existem microrganismos que não crescem em cultura Diferentes microrganismos necessitam de diferentes exigências nutricionais e de condições de crescimento diferentes Mesmo que use diferentes meios de cultura, não é garantido que contará todos os microrganismos presentes! 42 21 Medidas diretas do crescimento microbiano Número mais provável Quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para eliminar totalmente o crescimento nos tubos contendo meio de cultura Utilizado para contar microrganismos que não crescem em meios sólidos 43 Medidas diretas do crescimento microbiano Método do número mais provável (NMP). À esquerda, série de diluições do método. À direita, tabela do NMP que permite calcular o número estatisticamente provável de bactérias presentes na amostra. O índice de 110 NMP/100mL indica que 95% das amostras de água que apresentam esse resultado contém entre 40 – 300 UFC Tortora et al., 2005. 44 22 Medidas do crescimento microbiano contagens de viáveis Diretas contagens de células totais Medidas do crescimento microbiano Indiretas verificação da turbidez 45 Medidas indiretas do crescimento microbiano Espectrofotômetro 46 23 Medidas indiretas do crescimento microbiano Medidas turbidimétricas do crescimento microbiano por espectrofotômetro ou fotômetro. Madigan et al., 2004. 47 Medidas indiretas do crescimento microbiano (b) Curva de crescimento típica, obtida em unidades Klett ou densidade óptica (DO), de dois organismos que apresentam diferentes velocidades de crescimento. Qual organismo está crescendo mais rapidamente ?(calcule o n, tg e m). (c) Relação entre o número de células, ou peso seco, e as medidas de turbidez. 48 24 Fatores necessários para o crescimento Fatores físicos: temperatura, pH, pressão osmótica Crescimento microbiano* Fatores químicos: fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oligoelementos, oxigênio, fatores orgânicos de crescimento (vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas). * Crescimento microbiano: em microbiologia, refere-se ao aumento no número de células. 49 Fatores que influenciam a atividade enzimática: 1. Temperatura: A altas temperaturas, as enzimas sofrem desnaturação e perdem suas propriedades catalíticas; A baixas temperaturas, a taxa de reação diminui; 2. pH: pH no qual a atividade enzimática é máxima é conhecido como pH ótimo. 3. Concentração do substrato: Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta com o aumento da concentração do substrato. 50 25 Efeito da temperatura na taxa de crescimento (Madigan et al., 2004). Taxa de crescimento = variação do número de células ou da massa celular por unidade de tempo Temperaturas cardeais: mínima, ótima e máxima (variáveis nos diferentes microrganismos) 51 Temperatura • Temperatura de crescimento pode ser mínima, ótima e máxima. Maioria cresce em um intervalo de 30oC entre mínima e máxima. • Psicrófilos: profundezas de oceanos e regiões polares (algas clorofíceas e diatomáceas). • Mesófilos: Temperatura ótima entre 25 e 40oC. Maioria das bactérias. • Termófilos Temperatura entre 45 e 80oC. Fontes termais, camadas superiores de solos que sofrem intensa radiação solar, esterco e silo em fermentação. • Hipertermófilos: Temperatura ótima superior à 80oC. Fontes termais, como as do Parque Yellowstone. Principalmente membros de Archaea. Relação da temperatura com as taxas de crescimento. As temperaturas ótimas de cada organismo estão indicadas. (Madigan et al., 2004). 52 26 Adaptações moleculares à psicrofilia: • Enzimas ativas em baixas temperaturas apresentam maior quantidade de estruturas secundárias em alfa-hélice (estrutura mais flexível). • Conteúdo elevado de ácidos graxos insaturados, que auxilia na manutenção do estado semi-fluido. Obs.: Adição de crioprotetores (glicerol 10%) ao meio ajuda na preservação de culturas em baixas temperaturas (-70 a 196oC). Adaptações moleculares à termofilia: • Lipídeos da membrana ricos em ácidos graxos saturados – geram ambientes altamente hidrofóbicos colaborando para estabilidade da membrana citoplasmática. • Proteínas termoestáveis tendem a formar núcleos altamente hidrofóbicos, diminuindo a tendência ao desdobramento. • DNA girase reversa em Archaea: promove um superenovelamento positivo do DNA, mais termoestável. • Outras proteínas termoestáveis ajudam a manter a dupla fita do DNA unida. • Membrana citoplasmática em monocamada lipídica nas Archaea (estruturalmente mais 53 resistente que a bicamada). pH pH ótimo de crescimento refere-se ao pH do meio externo; o pH intracelular deve permanecer próximo à neutralidade. •Maior parte das bactérias cresce entre pH 6,5 e 7,5. •Acidófilos: muitos fungos (pH ótimo em torno de 5 ou inferior), vários gêneros de Archaea. •Alcalifílicos: muitas espécies de Bacillus e algumas arquéias (que também são halofílicas). • Adição de sais de fosfato (KH2PO4) em meios de cultura funcionam como tampão para neutralizar, por exemplo, ácidos produzidos por bactérias em crescimento. A escala de pH. (Fonte: Madigan et al., 2004). 54 27 Pressão osmótica Os microrganismos que tem necessidades específicas de NaCl para seu crescimento ótimo podem ser : • halófilos discretos: [ ] baixas – 1 a 6% • halófilos moderados: [ ] moderadas – 6 a 15% • halófilos extremos: [ ] altas – 15 a 30% Efeito da concentração do íon sódio no crescimento de microrganismos com diferentes tolerâncias ou necessidades de sal. 55 (Madigan et al., 2004). Pressão osmótica plasmólise Inibição do crescimento no momento em que a membrana plasmática se separa da parede celular. Preservação de alimentos!!! 56 28 Relações dos microrganismos com o oxigênio Aeróbios estritos ou obrigatórios Aeróbios Microaerófilos Aeróbios facultativos Obrigatórios Anaeróbios Aerotolerantes 57 Oxigênio • Formas tóxicas de oxigênio, todos subprodutos formados na redução do O2 a H2O durante a respiração: • ânion superóxido (O2-) • peróxido de hidrogênio (H2O2) • radical hidroxil (OH∙) Quatro reações de redução de O2 a água pela adição sequencial de elétrons. Todos os intermediários formados são reativos e tóxicos à célula, exceto a água. Madigan et al., 2004. 58 29 Para defesa algumas bactérias produzem algumas enzimas: -Superóxido desmutase (SOD): enzima produzida em bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas crescendo aerobiamente e anaeróbios aerotolerantes que neutraliza os radicais superóxidos livres (O2-) O2- + O2- + 2H+ H 2O 2 + O 2 59 -Catalase: O peróxido de hidrogênio (H2O2) produzido também é tóxico devido ao ânion peróxido (O22-)!!!! A enzima catalase neutraliza a ação deste ânion, convertendo o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio: 2H2O2 2H2O + O2 60 30 -Peroxidase: Outra enzima que neutraliza o peróxido de hidrogênio: H2O2 + H+ + NADH 2H2O +NAD+ Organismos anaeróbios obrigatórios não produzem nem catalase, nem superóxido dismutase. São super sensíveis ao oxigênio, provavelmente devido ao acúmulo de radicais livres. 61 Relações dos microrganismos com o oxigênio Microrganismos variam quanto suas necessidades ou tolerância ao oxigênio - Aeróbios – microrganismos capazes de utilizar o Oxigênio molecular, O2. (Ar contém 21% de O2) -Produzem mais energia a partir do uso de nutrientes. - Aeróbios estritos microrganismos que ou obrigatórios: necessitam de O2 São os para sua sobrevivência. 62 31 Relações dos microrganismos com o oxigênio - Microaerófilos Aeróbias necessitando de O 2, mas em concentrações menores do que a encontrada no ar. São sensíveis aos radicais superóxidos ou peróxidos, produzidos em concentrações letais quando em condições de altas concentrações de oxigênio. Condições ótimas em geral: 5% O2, 10% CO2 e 85% N2 63 Relações dos microrganismos com o oxigênio - Aeróbios facultativos Podem utilizar o O2 quando disponível, mas na sua ausência, são capazes de continuar seu crescimento através da respiração anaeróbia ou da fermentação. A eficiência na produção de energia diminui quando o O2 não está disponível. Exemplo: Escherichia coli Outras bactérias substituem o oxigênio, durante a respiração anaeróbia, por aceptores de elétrons como os íons nitrato. 64 32 Relações dos microrganismos com o oxigênio Alguns microrganismos não são capazes de respirar oxigênio: Anaeróbios Obrigatórios Aerotolerantes - Anaeróbios obrigatórios ou estritos São microrganismos que não utilizam o O2 para reações de produção de energia. O2 pode ser um produto danoso para muitos destes. Crescem com 2 a 8% O2 Exemplo: Gênero Clostridium = tétano e botulismo 65 Relações dos microrganismos com o oxigênio - Anaeróbios aerotolerantes Toleram a presença do oxigênio, mas não podem utilizá-lo para seu crescimento. Fermentam carboidratos produzindo ácido lático. O acúmulo deste ácido inibe o crescimento da microbiota competitiva aeróbia estabelecendo um nicho ecológico. Exemplo: Lactobacillus Podem tolerar o oxigênio devido a produção de SOD. 66 33 Aeróbios e facultativos Indispensável para aeróbios Enzimas que destroem espécies tóxicas de oxigênio. Catalases (a) e peroxidases (b) são proteínas que contém porfirina. As SOD (c) contêm metal como cobre e zinco, manganês ou ferro. A SOR (e) catalisa a redução de um elétron de O2- a H2O2 utilizando o citocromo c reduzido como doador de elétron. Adaptado de Madigan et al., 2004. 67 Oxigênio Relações dos microrganismos com o oxigênio Grupo Relação com o O2 Tipo de metabolismo Exemplo Habitat típico Aeróbios Obrigatórios Exigido Resp.aeróbia Micrococcus luteus Pele, poeira Facultativos Não exigido, mas com melhor crescimento em O2 Resp. aeróbia, anaeróbia, fermentação Escherichia coli Intestino grosso de humanos Microaerofilos Exigido, mas em níveis inferiores ao atmosférico Resp. aeróbia Spirillum volutans Água de lagos Aerotolerantes Não exigido, sem melhor crescimento na presença de O2 Fermentação Streptococcus pyogenes Trato respiratório superior Obrigatórios Nocivo ou letal Fermentação ou resp. anaeróbia Methanobacterium formicicum Lodo de digestores de esgoto, sedimentos de lagos anóxicos Anaeróbios 68 Adaptado de Madigan et al., 2004. 34 Oxigênio Representação dos tipos de crescimento bacteriano quanto à presença de oxigênio em meio caldo tioglicolato + ágar (+ denso). (a) aeróbios obrigatórios. (b) anaeróbios obrigatórios. (c) aeróbios facultativos. (d) microaerófilos. (e) anaeróbios aerotolerantes. Madigan et al., 2004. 69 Cultivo de anaeróbios - necessidade de fervura da água para eliminar o oxigênio dissolvido. • meio deve conter um agente redutor –tioglicolato de sódio – que se combina com o oxigênio dissolvido residual, eliminando essa forma do meio. 2H2 + O2 2H2O N2 , H2 , CO2 Jarra para cultivo de bactérias anaeróbias em placa de Petri (à esquerda): após a adição de água à embalagem contendo o bicarbonato de sódio e boroidreto de sódio, ocorre a liberação de dióxido de carbono e hidrogênio. Com o catalisador de paládio ocorrerá a reação entre o oxigênio e o hidrogênio, formando a água. Câmara de anaerobiose (à direita). Tortora et al., 2005. 70 35 Cultivo de anaeróbios Jarra de anaerobiose. O envelope acondicionado na jarra produz uma reação química que gera H2 + CO2. O H2 reage com o O2 da jarra, na superfície de um catalisador de paládio, originando H2O. A atmosfera final gerada na jarra é composta por N2, H2 e CO2. 71 Cultivo de anaeróbios Câmara de anaerobiose Não somente incubar, mas também manipular em atmosfera anóxica Evacuada e preenchida com gás livre de O2 72 36 Momento III “Aprendendo Microbiologia com Poema e Poesia” By Ilana Camargo http://www.icej.org.br/?p=372 Encontro com uma Drag queen verde! Será que vai me notar? Se isso não ocorrer, não vou chorar, nem tampouco esporular! Sou mesófilo e sempre estou com você. No seu calor me sinto bem. Vou crescer, você vai ver!! Pode até me cortar o oxigênio, como sou anaeróbio facultativo, vou continuar a crescer, Oh! Gênio! Porém, se no meu meio jogar sal, me inibirá e te deixarei... Não sou halófilo, afinal! Se você quiser me ver, me semeie em EMB e vou aparecer. Fermento lactose e ácido forte pode ser observado. Assim, como uma Drag queen verde, por todos posso ser notado. Sou bacilo Gram Negativo. Meu nome é Escherichia coli, e nosso encontro pode ser divertido! 74 37
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