1 introdução

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UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
ANÁLISE DO POLIMORFISMO -1612 NO GENE DA
MMP-3 E -509 NO GENE DO TGF-β
β1 EM INDIVÍDUOS
COM DOENÇA PERIODONTAL CRÔNICA
André Luis Shinohara
Dissertação apresentada à Pró-Reitoria de Pesquisa e
Pós-Graduação, da Universidade do Sagrado
Coração, como parte dos requisitos para obtenção do
Título de Mestre, no Programa de Pós-Graduação
em Biologia Oral.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Paula de Souza Pardo
BAURU
2005
Shinohara, André Luis
S5569a
Análise do polimorfismo -1612 no gene da MMP-3
e –509 no gene do TGF-β1 em indivíduos com doença
periodontal crônica / André Luis Shinohara -- 2005.
42f.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula de Souza
Pardo.
Dissertação (Mestrado em Biologia Oral) Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP.
1. Doença periodontal crônica 2. Fator
transformador do crescimento-β1 (TGF- β1) 3.
Metaloproteinase da matriz-3 (MMP-3) 4. Polimorfismo
genético. I. Pardo, Ana Paula de Souza II. Título
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Dedico este trabalho
À minha esposa Raquel
Aos meus pais Yassuo e Taiko
À minha irmã Ana Luisa
Aos meus sogros Ivete e Vande
À minha cunhada Roberta
E a “DEUS
DEUS”
DEUS pelo dom da vida
4
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profª. Drª. Ana Paula de Souza Pardo, por sua
competência, conhecimento, paciência, dedicação e carinho, proporcionando crescimento não
só profissional, mas também espiritual. Minha eterna admiração e agradecimento.
Ao Coordenador do programa de Mestrado em Biologia Oral, Prof. Dr. Sergio
Augusto Catanzaro Guimarães, pelo seu incentivo, pela sua prontidão em ajudar e pela sua
capacidade de cativar a todos. Minha eterna gratidão.
Ao Prof. Dr. José Jobson de Andrade Arruda, Coordenador da Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade do Sagrado Coração, pelo seu conhecimento e
competência.
Aos demais professores do programa de Mestrado em Biologia Oral, Profª. Drª.
Ana Claudia Bensuaski de Paula Zurron, Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão, Prof. Dr.
Cássio Vicente Pereira, Profª. Drª. Ângela Mitie Otta Kinoshita e Prof. Dr. Jesus Carlos
Andreo, meus agradecimentos pelos ensinamentos prestados, pela amizade e dedicação.
Aos ex-professores do programa de Mestrado em Biologia Oral, Profª Drª.
Raquel Mantuanele Scarel-Caminaga e Prof. Dr. Antonio de Castro Rodrigues, o meu
muito obrigado.
À Irmã Marisabel Leite, Madre superiora provincial do IASCJ, pela confiança,
carinho e oportunidade de crescimento profissional e pessoal. Minha eterna gratidão e
admiração.
À Irmã Jacinta Turolo Garcia, Magnífica Reitora da Universidade do Sagrado
Coração, pelo carinho e oportunidade de me permitir estudar nesta Universidade.
À Irmã Ilda Basso, Vice-Reitora desta Universidade, pelo apoio e incentivo.
À Irmã Adelir Weber, Diretora do Centro de Ciências Biológicas e Profissões da
Saúde da Universidade do Sagrado Coração, pela dedicação e presteza.
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Meu eterno agradecimento às Irmãs do IASCJ, Madre Olívia Santorosa, Ir.
Evanira Maria de Souza, Ir. Susana de Jesus Fadel, Ir. Teresa Ana Sofiatti, Ir. Maria
Aparecida de Lima, Ir. Geni da Silva e Ir. Maria Luiza de Lucca, meu muito obrigado pela
disponibilidade e carinho.
À Profª. Drª. Claudia de Almeida Prado Piccino Sgaviol, Diretora do Curso de
Odontologia da Universidade do Sagrado Coração, pelo apoio.
À Profª. Drª. Gesilda Correa de Melo, coordenadora da disciplina de Periodontia
do curso de Odontologia da Universidade do Sagrado Coração, por permitir a coleta das
amostras, em sua atividade clínica, necessárias ao nosso estudo.
À Maria Geralda Leite Marcelino (Dona Alda), Coordenadora administrativa da
clínica de Odontologia da Universidade do Sagrado Coração.
À Profª. Drª. Adriana Terezinha de Mattias Franco, orientadora do meu estágio
docência, por todo o ensinamento.
Ao Prof. Dr. Dejair Caitano do Nasimento, um dos examinadores da minha
banca de qualificação.
Ao Prof. Dr. Sergio Roberto Peres Line, por sua participação na banca de
defesa, pelos comentários, críticas, e correções a minha dissertação, meu muito obrigado.
À Profª. Drª. Ana Cláudia Cardoso de Oliveira Demarch, Coordenadora
Técnica do Laboratório de Análises Clínicas - LAC, por permitir a utilização do laboratório
durante o desenvolvimento de nossa pesquisa.
Aos funcionários Ricardo Borgo e Ângela Moraes da Pró-Reitoria de Pesquisa e
Pós-Graduação da Universidade do Sagrado Coração.
À Marili Ferreira Caridade, secretária do Laboratório de Análise Clínica - LAC
da Universidade do Sagrado Coração, pela presteza.
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Às funcionárias do Laboratório de Análise Clínicas - LAC da Universidade do
Sagrado Coração, Leonice Ferreira (Nice), Luani Aparecida de Fátima Matias (Lu) e
Leonilda dos Santos (Nena), por estarem sempre prontas a nos ajudar.
À Terezinha Edina Morbi, coordenadora do Laboratório de Química da
Universidade do Sagrado Coração, por todo seu serviço prestado.
Aos amigos do programa de Mestrado em Biologia Oral, Fabio Barbosa
Freiria, Cláudia Maria Astolfi, Marcelo Morgeti, Daniela Buchaim e Carlos Renato Aur,
pela amizade, respeito e alegrias.
Ao Rodrigo Augusto da Silva, aluno do curso de Biologia e de iniciação
científica e Wilson Aparecido Orcini, técnico do laboratório de biologia molecular da
Universidade do Sagrado Coração, pela amizade e companheirismo em todos os momentos
em que estivemos desenvolvendo nossa pesquisa no laboratório. Também à Ariadne Letra,
aluna do programa de Doutorado em Biologia Oral da FOB-USP, por toda a sua ajuda.
Aos alunos, Aline, Adriana, Gisele, Fabio, Nilva, Rita e Isidra, da segunda
turma de Mestrado em Biologia Oral, pelo companheirismo.
À bibliotecária Mônica Pereira Losnak, pela colaboração e ajuda na confecção
deste trabalho.
À Profª. Drª. Cinthia Maria Ramazzini Remaeh, do curso de Letras-Português
da Universidade do Sagrado Coração e à sua monitora Caroline Barbosa Zanferrari, pela
importante ajuda na confecção deste trabalho.
Ao Carlos Alberto Macedo de Farias, secretário da Reitoria da Universidade do
Sagrado Coração, por sua simpatia e prontidão a ajudar.
Aos professores e amigos da área de Endodontia da Universidade do Sagrado
Coração, Prof. Dr. Milton Carlos Kuga, Prof. Dr. Marco Antonio Húngaro Duarte, Prof. Dr.
José Carlos Yamashita, Profª. Drª. Eliane Cristina Gulin de Oliveira e Prof. Dr. Sylvio de
Campos Fraga, pela amizade e incentivo.
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Aos voluntários que contribuíram com a ciência, oferecendo as amostras para a
realização deste estudo.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelo
patrocínio oferecido para o desenvolvimento deste estudo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
pelo auxílio financeiro cedido a mim, para a freqüência e dedicação a este programa e ao
desenvolvimento da pesquisa.
À Universidade do Sagrado Coração, a PRPPG-USC e ao LAC-USC, pelo
apoio técnico, físico e científico oferecidos.
À Maria Lucia Tristão, ex-funcionária da PRPPG-USC, pela ajuda e dedicação
no início do programa de Mestrado em Biologia Oral. Meu muito obrigado.
Ao casal de amigos Paulo Mauricio Motta e Silva e Ester Grassi Pinto Ferreira
(Profª. Ms. de Dentística –USC) e sua filha Luisa, pela amizade, aconselhamento, apoio e por
todos os momentos de descontração pelos quais passamos quando estivemos juntos.
Ao amigo Marco Antonio Vilela, pela nossa eterna amizade e companheirismo.
Meu muito obrigado
À minha sogra Ivete Muccio, ao meu sogro Vande Malmonge Salorno e à
minha cunhada Roberta Muccio Malmonge, por toda ajuda, respeito e carinho.
Ao meu pai Yassuo Shinohara, à minha mãe Taiko Aikawa Shinohara e à
minha irmã Ana Luisa Shinohara, por todo o amor e carinho dedicados a mim.
Ao meu grande amor, minha esposa Raquel Muccio Malmonge Shinohara, por
todo seu amor, respeito e companheirismo em todos os momentos de nossa vida. Meu eterno
amor.
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RESUMO
Metaloproteinases da matriz (MMPs) degradam muitas das proteínas que compõe a matriz
extracelular, estando sua atividade implicada com a destruição do tecido conjuntivo durante a
invasão do câncer, destruição da cartilagem na artrite, ruptura da placa aterosclerótica e
destruição dos tecidos periodontais na periodontite. Recentemente, variações genéticas foram
detectadas na região do promotor do gene de várias MMPs. Esses polimorfismos genéticos
têm apresentado alelos-específicos que afetam a atividade de transcrição do promotor do
gene das MMPs, podendo estar associados com suscetibilidade e/ou severidade a doenças
comuns e complexas. Similarmente, polimorfismos genéticos foram encontrados no
promotor do gene do fator transformador do crescimento (TGF-β1), um importante fator
responsável pelo aumento na síntese de colágeno. Essas alterações poderiam contribuir com
o descontrole entre síntese e destruição dos componentes da matriz extracelular. Atualmente,
a doença periodontal representa o principal fator responsável pela perda de dentes em
adultos. O papel das bactérias na iniciação da doença está bem documentado, mas a ativação
das células de defesa requeridas para produção e liberação de mediadores que estimulam os
mecanismos de destruição do tecido conjuntivo não é clara. Sendo assim, o objetivo deste
estudo foi detectar polimorfismos genéticos no promotor do gene da MMP-3 e TGF-β1 e
associar à suscetibilidade da doença periodontal crônica em uma população brasileira. Os
pacientes foram divididos em dois grupos: Controle e Doença Periodontal. O DNA obtido a
partir de células epiteliais da mucosa jugal foi amplificado por PCR, digerido por RFLP e
analisados por eletroforese. Análise estatística foi realizada através do teste estatístico de χ2,
ao nível de significância de 5%. Os resultados mostraram diferença nas freqüências alélicas e
genotípicas do polimorfismo do gene do TGF-β1 entre os dois grupos estudados (p<0.05%).
Indivíduos com o genótipo T/T parecem ter um risco maior em desenvolver a doença
periodontal. Já o polimorfismo da MMP-3 apresentou freqüência genotípicas estatisticamente
diferentes (p<0.05%). Indivíduos com o genótipo 5A/5A parecem ter também um risco maior
em desenvolver a doença periodontal. Enquanto, em relação aos alelos, não apresentou
diferença estatisticamente significante (p>0.05%). Conclui-se que o polimorfismo no gene
TGF-β1 (-509 C/T) e do gene da MMP-3 (-1612 5A/6A) mostram estarem associados com a
doença periodontal crônica em brasileiros.
Palavras – Chave: Doença periodontal crônica. Fator transformador do crescimento-β1
(TGF-β1). Metaloproteinase da matriz-3 (MMP-3). Polimorfismo genético.
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ABSTRACT
Matrix metalloproteinases (MMPs) degrade a range of extracellular matrix proteins and have
been implicated in connective tissue destruction during cancer invasion, cartilage destruction
in arthritis, atherosclerotic plaque rupture, and periodontal tissues destruction. Recently,
genetic variances have been detected in the promoter of a number of MMPs genes. These
genetic polymorphisms have been shown to have allele-specific effects on the transcription
activities of MMP gene promoters, and to be associated with susceptibility and/or severity to
several diseases. Similarly, genetic polymorphisms have been found in the gene promoter of
the transforming growth factor-β1 (TGF-β1), an important growth factor reponsible to
increase the collagen production. These alterations could contribute to the imbalance between
the synthesis and degradation of the extracellular matrix components. Presently, periodontal
disease represents the main factor responsible for loss of teeth in adults. The role of bacterial
in the initiation of periodontitis is very well documented, but the activation of the host
defense cells required to release mediators that stimulate the pathway connective tissue
breakdown is unclear. Likewise, the aim of our study was to detect genetic polymorphisms in
the gene promoter of MMP-3 and TGF-β1 and to associate with susceptibility of the chronic
periodontal disease in a Brazilian population. Subjects were divided into two groups: Control
and Periodontal Disease. Genomic DNA from jugal mucosa was amplified by PCR, digested
by RFLP, and analyzed by electrophoresis. Statistical analysis (p<0.05%) was made through
χ2-test. Statistically significant difference was observed for allelic and genotype frequencies
of the TGF-β1 polymorphism between the two groups (p<0.05%). Individuals bearing T/T
genotype seem to have a bigger risk in developing the periodontal disease. Statistically
significant differences were observed for the genotypes frequencies in the MMP-3 gene
between the two groups (p<0.05%). Individuals bearing 5A/5A genotype seem to also have a
bigger risk in developing the periodontal disease. However, no statistically significant
differences were observed for allelic frequencies in the MMP-3 gene (p>0.05%). In the
conclusion, polymorphisms in the MMP-3 (-1612 5A/6A) and TGF-β1 (-509 C/T) genes
seem to be associated with disease periodontal chronic in Brazilian population.
Keywords: Chronic periodontal disease. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Matrix
Metalloproteinase-3 (MMP-3). Genetic polymorphism.
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Polimorfismo TGF-β1 C-509T.
FIGURA 2- Polimorfismo MMP-3 -1612 5A/6A.
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Resumo das informações sobre as reações de PCR e RFLP.
TABELA 2- Distribuição percentual da idade, sexo e raça.
TABELA 3- Freqüência dos diferentes alelos e genótipos do gene do TGF-β1.
TABELA 4- Freqüência dos diferentes alelos e genótipos do gene da MMP-3.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A: adenina
C: citosina
°C: grau celsius
DNA: ácido desoxirribonucléico
dNTP: deoxinucleotídeo
et al.: e colaboradores
G: guanina
IL: interleucina
Kb: quilo bases
KD: quilo dalton
LPS: lipopolissacarídeos
M: molar
mm: milímetro
MMP: metaloproteinase da matriz
mRNA: RNA mensageiro (ácido ribonucléico mensageiro)
ON: durante a noite (overnight)
pb: par de bases
PCR: reação em cadeia de polymerase (polymerase chain reaction)
Primer: oligonucleotídeo
RFLP: polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (restriction fragment length
polymorphism)
SNP: polimorfismo de base única (singles nucleotide polymorphism)
T: timina
TBE: tampão tris-borato-EDTA (ácido diamino tetracético), para corrida de eletroforese.
TGF-β: fator transformador do crescimento – beta (transforming growth factor-β)
TIMP: inibidor tecidual de metaloproteinase (tissue inhibitors of metalloproteinase)
TNF: fator de necrose tumoral (tumor growth factor)
U: unidade
µL: microlitros
%: por cento
χ2: qui-quadrado
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SUMÁRIO
1. Introdução................................................................................................... 14
2. Revisão da Literatura................................................................................. 15
2.1. Metaloproteinases da matriz extracelular.......................................... 15
2.2. Fator transformador do crescimento β1............................................. 18
2.3. MMPS E TGF-β1 na destruição tecidual da doença periodontal..... 19
2.4. Polimorfismos genéticos no gene do TGF-β1 e da MMP-3............. 20
3. Proposição.................................................................................................. 22
4. Material e método....................................................................................... 23
4.1. Seleção da amostra............................................................................................. 23
4.2. Obtenção das amostras de DNA.......................................................................... 23
4.3. Análise dos polimorfismos genéticos.................................................................. 24
4.4. Análise estatística dos resultados........................................................................ 25
5. Resultados................................................................................................... 26
6. Discussão.....................................................................................................30
7. Conclusão.................................................................................................... 33
8. Referências bibliográficas.......................................................................... 34
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1. Introdução
A doença periodontal crônica ou periodontite é caracterizada por uma
inflamação crônica de progressão lenta, que afeta os tecidos componentes do periodonto
(MATTIOLI et al., 2004; TUNES et al., 2004; ANZAI et al., 2004), um órgão com
características anatômicas e fisiológicas peculiares, exposto a um microambiente onde a
ameaça bacteriana pode ser muito variável. Essa patologia é relativamente comum em adultos
após a terceira década de vida e representa uma das maiores causas de morbidade dental.
Embora muitos pontos permaneçam obscuros sobre a patogênese da periodontite,
outros já estão bem esclarecidos. Sabe-se que a doença tem início com a infecção bacteriana
sobre a superfície dos dentes e dos tecidos que o circundam e que a destruição tecidual ocorre
pela ação de proteases produzidas pelo organismo do indivíduo durante o processo
inflamatório. Entre essas proteases encontramos a atividade de uma família de enzimas composta por aproximadamente vinte e cinco membros - denominados metaloproteinases da
matriz (MMPs). Acredita-se que a ação das MMPs nos tecidos periodontais deva ser a mais
importante via efetora da destruição do tecido periodontal.
Deste modo, o controle da atividade e da síntese das MMPs é fundamental para
que exista equilíbrio entre a taxa de produção e de destruição das moléculas que constituem os
tecidos periodontais. Influenciando a síntese das MMPs, encontramos algumas citocinas
inflamatórias (como as interleucinas) e fatores do crescimento (como o fator transformador do
crescimento-β1), que são moléculas sinalizadoras que atuam durante a inflamação, podendo
levar a um aumento ou diminuição da taxa de produção destas enzimas.
Além disto, polimorfismos genéticos, que são variações genéticas encontradas na
população e consideradas biologicamente normais, podem também influenciar a taxa de
síntese de enzimas, citocinas e fatores do crescimento, levando à progressão da periodontite
ou protegendo o indivíduo da doença. Polimorfismos genéticos foram encontrados em genes
de várias MMPs e do fator transformador do crescimento-β1 (TGF-β1), associados a outras
doenças (HOBBS at al., 1998; SYRRIS et al., 1998; ZHANG et al., 1999; PULLEYN et al.,
2001; GHILARDI et al., 2002; HINODA et al., 2002; KINANE; HART, 2003; DE SOUZA et
al., 2003a; DE SOUZA et al., 2003b; VASKU et al., 2004; DORR et al., 2004; DOS
SANTOS et al., 2004; DE SOUZA et al., 2005). Porém, pouco ainda se sabe sobre como e
quais polimorfismos poderiam estar atuando na periodontite. O objetivo do nosso estudo foi
avaliar se polimorfismos no gene da MMP-3 e do TGF-β1 estariam associados ou não com a
doença periodontal crônica.
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2. Revisão da Literatura
2.1. Metaloproteinases da matriz extracelular
As metaloproteinases da matriz (MMPs) compreendem uma família de enzimas
que apresentam especificidade pelas macromoléculas da matriz extracelular (YE, 2000;
KERRIGAN; MANSELL; SANDY, 2000; CASTRILLO et al., 2003; PICKARD;
DAMJANOVSKI, 2004; MIZON-GÉRARD et al., 2004; AMANO et al., 2005). A família
das metaloproteinases é formada por pelo menos vinte e cinco membros que exibem
similaridades estruturais e funcionais. As metaloproteinases são secretadas na forma de
zimógeno, estando às vezes associadas ao seu inibidor natural (STRICKLIN et al., 1983;
EMONARD; GRIMAUD, 1990; DE SOUZA; LINE, 2002; HOPPMANN et al., 2004). A
ativação das MMPs se dá em duas etapas. Inicialmente, o zimógeno sofre clivagem
proteolítica que resulta na remoção da porção amino-terminal. A clivagem pode ser feita por
várias enzimas como a tripsina, plasmina, catepsina B, elastase ou outra MMP. Em uma
segunda etapa, a enzima sofre autodigestão que resulta na sua forma ativada (VAN WART;
BIRKEDAL-HANSEN, 1990; DE SOUZA; LINE, 2002).
Acredita-se que a ativação é causada pela ruptura da ponte existente entre o
aminoácido cisteína e o íon zinco, que bloqueia o sítio ativo da molécula. Outra característica
comum entre as metaloproteinases é a dependência pelos íons zinco e cálcio. A interação do
zinco com dois resíduos de histidina presentes no domínio catalítico da molécula tem
importância crucial para o funcionamento adequado das metaloproteinases (DE SOUZA;
GERLACH; LINE, 2000). Os dois átomos de cálcio conferem estabilidade para a estrutura
terciária da proteína (DIOSZEGI; CANNON; VAN WART, 1995).
Estas enzimas desempenham papel importante em vários processos fisiológicos e
patológicos, como na involução pós-parto (WEEKS; HALME; WOESSNER, 1976; SOUZA
et al., 1989; KERRIGAN; MANSELL; SANDY, 2000), na reabsorção óssea (SHAPIRO;
KOBAYASHI; LEY, 1993; OKADA et al., 1995; DORR et al., 2004), na inflamação através
da migração leucocitária (KNAUPER et al., 1993; CASTRILLO et al., 2003), na osteoartrite
(WOESSNER, 1994; BARAGI et al., 1995; YORIOKA et al., 2002), na doença periodontal
(BIRKEDAL-HANSEN, 1993b; DE SOUZA; LINE, 2002; DE SOUZA et al., 2005), no
crescimento e expansão de tumores benignos (AUTIO-HERMAINEN et al., 1993) e na
invasão e metástase tumoral (DE CLERCK et al., 1992; STERNLICHT et al., 1999; YE,
2000; YOSHIZAKI; SATO; FURUKAWA, 2002).
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A família das metaloproteinases da matriz está dividida em classes, sendo três
muito importantes para o processo de destruição tecidual. São elas: colagenases intersticiais,
gelatinases e estromelisinas. Essa classificação se baseia na especificidade pelo substrato.
As colagenases intersticiais são as mais específicas. Foram as primeiras a serem
descritas (GROSS; NAGAI, 1962) e, durante as últimas décadas, têm sido objeto de muitos
estudos que versam sobre sua expressão, distribuição, estrutura química e molecular em
processos normais e patológicos. Estas enzimas são as únicas com a capacidade de clivar a
tripla hélice dos colágenos tipo I, II, III em condições fisiológicas, tornando estas moléculas
suscetíveis à ação de outras enzimas (SOUZA et al., 1993).
Existem dois tipos de colagenases intersticiais que, apesar de exibirem grande
semelhança estrutural e de especificidade, são codificadas por genes distintos. A MMP-1, que
exibe uma distribuição ambígua, é sintetizada por fibroblastos, queratinócitos, células
endoteliais, macrófagos, osteoblastos, condrócitos e osteoclastos (BIKEDAL-HANSEN,
1993b). Quando analisada em eletroforese de gel de poliacrilamida, a colagenase de
fibroblastos aparece como várias bandas com peso molecular variando entre 57 e 52 kDa.
Essa variação provavelmente se deve à proteólise parcial da molécula.
A MMP-8 é produzida exclusivamente por leucócitos polimorfonucleares.
Apesar de possuir um núcleo protéico muito semelhante ao da colagenase de fibroblastos, a
alta taxa de glicosilação faz com que esta molécula tenha peso molecular de 75 kDa. Ao
contrário da colagenase de fibroblasto, que é rapidamente secretada após a sua síntese, a
colagenase de polimorfonucleares é armazenada em grânulos intracelulares que só são
liberados após a ativação das células (HIBBS; BAINTON, 1989).
Existem também as colagenases bacterianas que clivam as cadeias alfa do
colágeno em inúmeros sítios ricos no aminoácido glicina. Elas são muito utilizadas em
laboratório devido à sua grande especificidade pela tripla hélice da molécula do colágeno.
As gelatinases são capazes de degradar colágeno tipo V e VII, elastina e gelatina
(colágeno desnaturado). A gelatinase de 72 kDa (MMP-2) parece ser capaz de clivar também
o colágeno tipo X (WELGUS et al., 1990), porém, não é ativa sobre o colágeno tipo I, II e
III, laminina e proteoglicanos. A especificidade dessas enzimas sobre o colágeno tipo IV
parece indicar que elas participam da remodelação e degradação da membrana basal. É
também possível que a atividade gelatinolítica dessas enzimas esteja relacionada com a
remoção de fragmentos de colágeno desnaturado que sofreram ação de outras
metaloproteinases (REPONEN et al., 1992 e REPONEN et al., 1994).
17
A gelatinase de 72 kDa (MMP-2) é a metaloproteinase mais abundante, sendo
secretada por fibroblastos, queratinócitos, células endoteliais, macrófagos, osteoblastos e
condrócitos, estando também presente no plasma sangüíneo (BIRKEDAL-HANSEN, 1993a).
A gelatinase de 92 kDa (MMP-9) é produzida por neutrófilos polimorfonucleares,
queratinócitos e macrófagos e, ocasionalmente, por fibroblastos. Estudos de hibridização “in
situ” têm demonstrado que as gelatinases de 92 kDa são fortemente expressas nos tecidos
embrionários de ratos (REPONEN et al., 1994).
O terceiro grupo de metaloproteinases é formado pelas estromelisinas. As
estromelisinas-1 (MMP-3) e –2 (MMP-10) são capazes de digerir várias proteínas da matriz
extracelular como a laminina, fibronectina, proteoglicano (core protéico), colágeno tipo IV,
V, VII e X, colágeno desnaturado (gelatina) e caseína (CHIN; MURPHY; WERB, 1985;
STERNLICHT et al., 1999; HUMPHRIES et al., 2002; MEDLEY et al., 2003; HOPPMANN
et al., 2004). Além das estromelisinas-1 (MMP3) e -2 (MMP10), existe também a
estromelisina-3 (MMP-11) (YE, 2000; AMANO et al., 2005).
Quando analisada em gel de poliacrilamida, a MMP-3 apresenta um peso
molecular entre 60 e 53 kDa. Esta enzima parece não ser expressa por leucócitos ou
queratinócitos. A MMP-10 é expressa em menor quantidade e, aparentemente, pelas mesmas
células que expressam a MMP-3. Apresenta um peso molecular semelhante ao da MMP-3 e
parece não responder a fatores de crescimento (BIRKEDAL-HANSEN, 1993b).
As metaloproteinases da matriz são expressas por várias células do estroma
conjuntivo. Estas células podem responder de formas diferentes aos estímulos dos diversos
fatores do crescimento e citocinas inflamatórias. O TGF-β1 (fator transformador do
crescimento, membro da superfamília TGFs-β) é aparentemente um dos mais importantes
fatores do crescimento reguladores da síntese de MMPs em fibroblastos. Esse fator atua como
estimulante da atividade reparadora nos tecidos, inibindo a expressão, síntese e liberação de
MMPs pelos fibroblastos, além de estimular a produção de TIMP (inibidor tecidual de
metaloproteinase) que neutraliza a atividade da enzima na matriz extracelular.
A regulação da atividade proteolítica das metaloproteinases ocorre a nível
extracelular, através da ação de uma molécula inibidora específica de tecidos, a TIMP
(inibidor tecidual de metaloproteinase). Quatro membros da família TIMP - TIMP-1, -2, -3 e
-4 - já foram caracterizados (HERRON et al., 1986; MACNAUL et al., 1990; DE CLERCK et
al., 1994; CLARCK et al., 1997; SZKLARCZYK et al., 2002). Esses inibidores estão
distribuídos pelos tecidos e fluídos e são secretados por diversos tipos celulares, incluindo
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fibroblastos, neutrófilos polimorfonucleares, células endoteliais, condrócitos e células
neoplásicas.
O mecanismo de ação da TIMP é complexo e envolve numerosos pontos de
interação com as metaloproteinases. O evento principal parece ser resultado da ligação ao
domínio catalítico N-terminal, do sítio ativo da metaloproteinase (MURPHY et al., 1994).
TIMP-1 parece ser mais efetivo na regulação das colagenases, enquanto que TIMP-2 é mais
efetivo com o grupo das gelatinases (HOWARD; BULLEN; BANDA, 1991; DE SOUZA;
LINE, 2000).
2.2. Fator transformador do crescimento - β1
O fator transformador do crescimento-β1 (TGF-β1) pertence a uma extensa
família de moléculas codificadas por genes distintos (GRAINGER et al., 1999; MURAOKA
et al., 2003; DOS SANTOS et al., 2004), responsáveis pela regulação da ativação, do
crescimento, da diferenciação e da função celular (GRAINGER et al., 1999; HUANG et al.,
2002; ANDREOTTI et al., 2002; MURAOKA et al., 2003; CARTURAM et al., 2004; COLL
et al., 2004: STOLL et al., 2004). O TGF-β1 é secretado na forma latente de pró-proteína,
contendo 25 kDa. Sua ativação ocorre por clivagem proteolítica que requer a ação de uma
variedade de enzimas, incluindo a participação das MMPs. (GRAINGER et al., 1999; DOS
SANTOS et al., 2004).
TGF-β1 possui ação pleiotrópica, isto é, atua ora com função pró-inflamatória e
ora com função antiinflamatória (STEINSVOLL; HALSTENSEN; SHENCK, 1999). Muitos
autores o consideram um agente antiinflamatório devido à forma potente com que induz a
expressão dos genes do colágeno, podendo provocar fibrose tecidual em certas circunstâncias
(ANDREOTTI et al., 2002; HUANG et al., 2002; DUNNING et al., 2003; CARTURAN et
al., 2004; DOS SANTOS et al., 2004), bem como pela capacidade de reduzir a síntese de
outras citocinas inflamatórias - tais como interleucina-1α/β, fator de necrose tumoral - e
diminuir a transcrição de algumas MMPs. Entretanto, outros autores classificam o TGF-β1
como um fator pró-inflamatório, uma vez que ele atua como um agente quimiotático para
neutrófilos, monócitos e linfócitos do sangue (TORRE-AMIONE et al., 1990; YE, 2000),
contribuindo com a migração destas células da corrente sangüínea para os focos de
inflamação.
TGF-β1 desempenha papel importante em vários processos fisiológicos e
patológicos, como nas fibroses (GRAINGER et al., 1999; HUANG et al., 2002; CARTURAN
19
et al., 2004), no câncer (GRAINGER et al., 1999; BLOBE; SCHIEMANN; LODISH, 2000;
DUNNING et al., 2003; MURAOKA et al., 2003), nas doenças coronárias (SYRRIS et al.,
1998; GRAINGER et al., 1999; YOKOTA et al., 2000; ANDREOTTI et al., 2002), nas
doenças inflamatórias (ANDREOTTI et al., 2002; JAAKKOLA et al., 2004), na doença
periodontal (WAHL et al., 1993; STEINSVOLL; HALSTENSEN; SCHENCK, 1999; DE
SOUZA et al., 2003b), na asma (HOBBS et al., 1998; PULLEYN et al., 2001) e também em
doenças renais (COLL et al., 2004).
2.3. MMPs e TGF-β1 na destruição tecidual da doença periodontal
A gengivite representa o início da lesão caracterizada pela inflamação do tecido
de sustentação que circunda os dentes, onde várias citocinas são produzidas por linfócitos,
monócitos, entre outras células (STEINSVOLL; HALSTENSEN; SCHENCK, 1999).
Uma vez instalada a gengivite, tem início à destruição dos tecidos após três a
quatro dias de acúmulo de placa bacteriana na superfície dental, estando associada com a
migração de neutrófilos polimorfonucleares do sangue para o local da inflamação pela ação da
quimiotaxia provocada pela interleucina-8 (IL-8) e do TGF-β1.
O TGF-β1 é um potente ativador de leucócitos polimorfosnucleares,
principalmente neutrófilos, facilitando a adesão na parede dos vasos sanguíneos e posterior
liberação para a matriz extracelular. Os lipopolisacarídeos bacterianos (LPS) também
induzem a secreção de TGF-β1 por monócitos, o qual contribui para sua liberação na região
da infecção (WAHL et al., 1993). O TGF-β1 é um dos mais importantes fatores do
crescimento reguladores da síntese de MMPs em fibroblastos.
A destruição do colágeno começa nas proximidades dos vasos sangüíneos.
Aproximadamente 70% do colágeno presente nos focos de inflamação é perdido como
conseqüência da liberação de MMPs armazenadas nos grânulos citoplasmáticos dos
neutrófilos (DE SOUZA; GERLACH; LINE., 1998). Os neutrófilos e os macrófagos são as
mais importantes células responsáveis pela destruição do periodonto. Alguns autores têm
demonstrado que a doença periodontal ocorre em ciclos recorrentes de destruição tecidual e
ciclos de estabilidade. Esta teoria relaciona as perdas com os períodos de ativação de MMPs
liberadas pelos neutrófilos na matriz extracelular do periodonto e os ciclos de estabilidade
com os períodos necessários para a síntese de novas enzimas após a exaustão das proteases
contidas nos grânulos citoplasmáticos (VAN DER ZEE; BURTSEN, 1997).
20
Alterações qualitativas e quantitativas ocorrem nos colágenos gengivais durante
a periodontite. Na gengiva, o colágeno se torna mais solúvel devido à presença de inúmeras
fibrilas de colágeno que não chegam a se polimerizar em fibras e são degradadas, indicando
síntese de novo colágeno ou de colágeno deficiente (BARTOLD et al., 1996).
Duas vias estão implicadas com a degradação fisiológica e patológica do
colágeno periodontal. A primeira ocorre pela fagocitose de fibrilas do colágeno pelos
fibroblastos, após MMPs sintetizadas por este tipo celular terem desnaturado o colágeno tipo
I. A segunda via está relacionada com a degradação do colágeno pela exacerbação na síntese
de MMPs, associada com o processo inflamatório. Ambas as vias são mediadas pela ação de
fatores do crescimento e citocinas da inflamação (BIRKEDAL-HANSEN, 1993a), estando a
via efetora da destruição sempre relacionada com a atividade de MMPs.
O valor dos parâmetros clínicos, tradicionalmente usados na determinação do
prognóstico da doença periodontal, parece estar - pelo menos em parte - relacionado com
genótipos específicos. São recentes as primeiras descrições de polimorfismos gênicos
associados à doença periodontal. Polimorfismos nos genes da IL-1α e β e TNF-α foram os
primeiros a serem associados com à periodontite, identificando indivíduos suscetíveis à
severidade da doença periodontal do adulto (KORNMAN et al., 1997; GORE et al., 1998).
Foi demonstrado estatisticamente em um estudo longitudinal de 14 anos, que a presença de
genótipos variantes (chamados positivos para IL-1) resultantes de polimorfismos genéticos
aumentariam as chances de morbidade dental em 2,7 vezes e, quando associado ao efeito do
fumo, poderiam resultar em risco de até 7,7 vezes maior de perda dental (MCGUIRE; NUNN,
1999).
A associação entre uma dada doença e um polimorfismo genético conhecido,
além de permitir a identificação de indivíduos de maior risco ao desenvolvimento da doença
em questão, contribui para decifrar a heterogeneidade etiológica da mesma auxiliando na
elucidação de sua patogênese (SOFAER, 1990).
2.4. Polimorfismos genéticos no gene do TGF-β1 e da MMP-3
Os genes estão estruturados em três regiões básicas distintas: promotor, exons e
introns. Exons representam regiões que são transcritas em mRNA e posteriormente traduzidas
em aminoácidos que formam a proteína. Um ou vários exons podem compor um gene. O
mesmo ocorre com os introns, mas estes são regiões silenciosas, normalmente não transcritas
21
em mRNA. O promotor representa uma região do gene que está posicionada aquém do início
do primeiro exon. O promotor não é transcrito em mRNA, mas controla as taxas de expressão
do gene (DE ROBERTIS; HIB, 2001). O símbolo negativo que antecede a posição do
polimorfismo está relacionado com o promotor e significa que este está a um certo número de
pares de bases nitrogenadas, aquém do início do primeiro exon.
Polimorfismos são alterações que ocorrem com freqüência maior ou igual que
1% na população e estão dentro de um padrão de normalidade. No entanto, os polimorfismos
genéticos podem interferir com o metabolismo celular e estar relacionados com a proteção ou
predisposição a certas doenças (THOMPSON; McINNES; WILLARD, 1993).
Polimorfismos genéticos em genes de proteínas, que podem estar envolvidas
com a patogênese da doença periodontal, vêm sendo investigados com bastante interesse.
Kornman et al. (1997) foram os primeiros a reportar uma correlação positiva entre a presença
de um genótipo composto no gene da interleucina-1 com a suscetibilidade à doença
periodontal crônica na população norte-americana.
Atualmente, outros polimorfismos em genes de citocinas, fatores do crescimento
e metaloproteinases da matriz têm sido pesquisados, havendo resultados positivos para a
presença de alelos específicos com a suscetibilidade e/ou severidade da periodontite
(SCAREL-CAMINAGA et al., 2002; DE SOUZA et al., 2003a; DE SOUZA et al., 2003b;
TREVILATTO et al., 2003; SCAREL-CAMINAGA et al., 2003; DE SOUZA et al., 2005).
Polimorfismos genéticos foram verificados em várias posições do promotor do
TGF-β1. O polimorfismo que corresponde à troca de base C/T na posição –509 do promotor
do gene TGF-β1 foi correlacionado com a severidade à asma e risco à alergia (HOBBS et al.,
1998), à doença periodontal (DE SOUZA et al., 2003b), entre outras patologias. O genótipo
T/T apresentou forte associação com a severidade à asma (PULLEYN et al., 2001).
Polimorfismo genético também foi identificado no gene da estromelisa-1 (MMP3) na posição –1612, onde a inserção/deleção de uma base adenina cria os alelos 5A e 6A.
Este polimorfismo vem sendo investigado para várias doenças com resultados positivos e
apresenta forte associação com problemas relacionados à desordem vascular como
ateroesclerose, infarte do miocárdio e aneurisma (YE et al., 1995; HUMPHRIES et al., 1998;
DE MAAT et al., 1999; TERASHIMA et al., 1999; YOON et al., 1999).
Polimorfismos genéticos podem estar associados ou não com certas patologias,
dependendo da população estudada. Deste modo, é sempre importante testar a hipótese de
associação em populações diferentes. O estudo em brasileiros tem valor devido à alta taxa de
miscigenação da população brasileira.
22
3. Proposição
O objetivo do nosso estudo foi investigar a existência de associação entre o
polimorfismo na posição -1612 do promotor do gene da MMP-3 e o polimorfismo na posição
-509 do promotor do gene do TGF-β1 com a doença periodontal crônica.
23
4. Material e método
4.1 Seleção da Amostra
A amostra foi composta por indivíduos do sudeste brasileiros, adultos (acima de
25 anos), de ambos os sexos e não-fumantes. Foram excluídos os pacientes fumantes, pois o
fumo por si só aumenta o risco à doença em cerca de 03 vezes, e o objetivo foi avaliar risco
conferido por polimorfismos genéticos. Pacientes com histórico de diabetes, pacientes
grávidas ou em lactação, pacientes com histórico de hepatite e infecção por HIV ou pacientes
com pré-medicação antibiótica recente, como também uso crônico de antiinflamatórios, foram
excluídos. Pacientes que possuíam menos de 20 dentes também foram excluídos. Não foram
excluídos pacientes pertencentes a qualquer grupo étnico-racial, pois a tentativa de se isolar
determinadas características raciais é de pouco valor em um país altamente miscigenado como
o Brasil.
Os pacientes em tratamento na clínica de periodontia da Faculdade de
Odontologia da Universidade do Sagrado Coração foram triados e divididos em dois grupos.
Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento para a participação voluntária na
pesquisa conforme as normas do Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição. Os grupos
foram classificados de acordo com a profundidade de sondagem encontrada e perda de
inserção conjuntiva em:
1) Pacientes do Grupo Controle: Ausência de dentes com sinais clínicos de perda de
inserção conjuntiva ≥3 mm
2) Pacientes do Grupo Doença Periodontal: Pacientes apresentando perda de inserção
conjuntiva ≥5 mm em pelo menos três dentes e em pelo menos dois quadrantes diferentes
4.2. Obtenção das amostras de DNA
O DNA foi obtido a partir de células epiteliais da mucosa bucal, e as células
obtidas após bochecho com solução contendo glicose a 3% durante 2 minutos, seguido de leve
raspagem da mucosa jugal com espátula de madeira autoclavada. Parte das amostras de DNA
foram extraídas com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (24:1:1) (MANIATIS et al., 1989).
A outra parte das amostras de DNA foram extraídas com acetato de amônia 10M/álcool
isopropílico/álcool etílico.
24
4.3. Análise dos Polimorfismos Genéticos
Análise do polimorfismo no gene do TGF-β1
Reação de PCR foi utilizada para amplificação do fragmento da região
promotora do gene do TGF-β1 (740pb). Em seguida, os fragmentos resultantes foram
submetidos à digestão pela enzima de restrição Bsu36 I (RFLP - Restriction Fragment Length
Polymorphism) para verificação da presença dos alelos. Os primers, as condições de
amplificação e a análise do material amplificado estão descritos abaixo:
Primers: 5`- TTT TGC CAT GTG CCC AGT AG-3`
Antisense: 5`- CAC CAG AGA AAG AGG ACC AG-3`
PCR: Desnaturação do DNA a 95°C durante 3 min seguida por 35 ciclos a 95°C durante 1
minuto, 57°C durante 1 minuto e 72°C durante 1minuto, extensão final a 72°C durante 7 min.
RFLP: 15 µL do produto de PCR foram submetidos à digestão com 3U da enzima de restrição
Bsu36 I (New England Biolabs), durante 16 horas a 37°C. A enzima reconhece e corta o alelo
contendo a base citosina (alelo C), gerando fragmentos contendo 551pb e 189pb.
Análise de polimorfismo no gene da MMP-3
Para analisar a presença do polimorfismo neste gene foram utilizados primers
sense diferentes e específicos para cada alelo, desenhados de forma que englobavam a região
polimórfica. Duas reações de PCR foram realizadas para todas as amostras. O primer sense,
com desenho para o polimorfismo 5A, amplificava 95pb, enquanto o primer sense para o
polimorfismo 6A amplificava 92pb. Os primers, as condições de amplificação e a análise do
material amplificado estão descritos abaixo:
Análise da presença do polimorfismo 5A no promotor da MMP-3
Sense: 5`- GAC AAG ACA TGG TTT TTC -3`
Antisense: 5`- AGA CAT GGG TCA CGG -3`
PCR: Desnaturação do DNA a 95°C durante 3 min seguida por 35 ciclos a 95°C durante 1
minuto, 44°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, extensão final a 72°C durante 7 min.
25
Análise da presença do polimorfismo 6A no promotor da MMP-3
Sense: 5`- AAG ACA TGG TTT TTT -3`
Antisense: 5`- AGA CAT GGG TCA CGG -3`
PCR: Desnaturação do DNA a 95°C durante 3 min seguida por 35 ciclos a 95°C durante 1
minuto, 41°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, extensão final a 72°C durante 7 min.
As seqüências gênicas foram amplificadas em um termociclador convencional
(GeneAmpPCR System 9700) e analisadas por eletroforese de géis de poliacrilamida a 10%.
Os géis foram corados pela prata, técnica descrita por Sanguinetti, Dias Neto e Simpson
(1994).
4.4. Análise estatística dos resultados
A associação entre polimorfismos genéticos e o grau de severidade da doença
periodontal em pacientes adultos e portadores de periodontite de início precoce foi avaliada
através do teste χ2 ao nível de significância de 5%.
Tabela 1: Resumo das informações sobre as reações de PCR e RFLP
Anelamento
Enzima
Fragmento
(PCR)
Restrição
(pb)
57°C
Bsu 36I
740
(1 min)
(37°C)
551 + 189
F: GAC AAG ACA TGG TTT TTC
41°C
X
95
5A
R: AGA CAT GGG TCA CGG
1 min
MMP-3
F: AAG ACA TGG TTT TTT
44°C
X
92
6A
R: AGA CAT GGG TCA CGG
1 min
SNP
TGF-β
β1
(- 509)
MMP-3
Primer (5` - 3`)
*F: TTT TGC CAT GTG CCC AGT AG
**R: CAC CAG AGA AAG AGG ACC AG
*Primer Sense **Primer Antisense
26
5. Resultados
As características da população estudada estão na tabela 2 que mostra a
distribuição percentual da idade, sexo e raça nos dois grupos estudados:
Tabela 2. Distribuição percentual da idade, sexo e raça.
Parâmetros
Grupo controle
Grupo doença
38,12
42,58
Desvio padrão (+-13,8)
Desvio padrão (+-9,9)
Feminino
71,3%
76,8%
Masculino
28,7%
23,2%
Caucasiano
86,4%
72%
Nego/Mulato
10,6%
28%
Japoneses
3%
0%
Média de idade
TGF-β
β1
O polimorfismo no gene do TGF-β1 foi analisado em 101 pacientes no grupo
controle e 103 pacientes no grupo doença periodontal. O padrão da análise por enzima de
restrição é mostrado na Figura 1. Esse polimorfismo corresponde a uma troca de base entre
citosina e timina na posição –509 do promotor do gene do TGF-β1, que cria dois alelos
diferentes: alelo C e alelo T. Analisando os resultados, encontramos diferença estatisticamente
significante na freqüência dos genótipos (p=0,0284) e alelos (p=0,0438) entre os grupos
controle e doença. No grupo controle, o genótipo T/T foi encontrado com freqüência de
10,8%, enquanto que no grupo doença periodontal foi observado em 25,3% dos pacientes
(p=0,0214). A freqüência dos alelos e dos genótipos do gene TGF-β1 é mostrada na tabela 3.
27
740pb
551pb
189pb
Figura 1: Polimorfismo TGF-β1 C-509T
Tabela 3. Freqüência dos diferentes alelos e genótipos do gene do TGF-β1.
Grupo doença
Valor de p
Valor de p
periodontal
Teste χ2
Teste χ2
104 (50,5%)
0,2322
*0,0438
79 (39,1%)
102 (49,5%)
0,1020
Genótipos
n = 101
n = 103
T/T
11 (10,8%)
26 (25,3%)
*0,0214
C/C
33 (32,7%)
27 (26,2%)
0,5186
C/T
57 (56,5%)
50 (48,5%)
0,5619
TGF-β
β1
Grupo controle
Alelos
n = 202
n = 206
C
123 (60,9%)
T
* P ≤ 0,05 (Significante)
*0,0284
28
MMP-3
O polimorfismo 5A/6A na região promotora do gene da MMP-3 foi analisado
em 103 pacientes no grupo controle e 90 pacientes no grupo doença periodontal. O padrão da
análise por enzima de restrição é mostrado na Figura 2. Observando os resultados dos
genótipos, notamos uma diferença estatisticamente significante entre o grupo controle e o
grupo doença periodontal (p=0,0286). Os resultados mostram freqüência do genótipo 5A/5A
de 7,8% no grupo controle e de 21,1% no grupo doença periodontal (p=0,0543). Observando
a freqüência dos alelos encontrados nos dois grupos, não encontramos diferença
estatisticamente significante (p=0,1281). Entretanto, quando comparamos isoladamente a
freqüência do alelo 6A, encontramos diferença estatística significante (p=0,0454). A
freqüência dos genótipos e dos alelos do gene MMP-3 se encontra na tabela 4.
Figura 2: Polimorfismo MMP-3 -1612 5A/6A
29
Tabela 4. Freqüência dos diferentes alelos e genótipos do gene da MMP-3.
Grupo doença
Valor de p
Valor de p
periodontal
Teste χ2
Teste χ2
MMP-3
Grupo controle
Alelos
n = 206
n = 180
5A
86 (41,7%)
90 (50,0%)
0,8211
6A
120 (58,3%)
90 (50,0%)
*0,0454
0,1281
Genótipos
n = 103
n = 90
5A/5A
08 (7,8%)
19 (21,1%)
*0,0543
*0,0286
6A/6A
25 (24,3%)
19 (21,1%)
0,4510
5A/6A
70 (67.9%)
52 (57,8%)
0,1238
* P ≤ 0,05 (Significante)
30
6. Discussão
A doença periodontal é multifatorial e seu grau de severidade é influenciado por
fatores ambientais e genéticos (HART; KORNMAN 1997). Nos últimos anos, o estudo dos
polimorfismos genéticos se tornou assunto de interesse na área da periodontologia, uma vez
que polimorfismos genéticos em genes de citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e
proteases, moléculas que participam do complexo mecanismo que envolve a destruição dos
tecidos periodontais, podem estar envolvidos com a doença periodontal. Este assunto também
tem nos interessado, por isso neste trabalho investigamos o possível envolvimento do
polimorfismo na posição -509 do gene do TGF-β1 e o polimorfismo na posição -1612 do gene
da MMP-3 com a severidade da doença periodontal.
O genótipo T/T do TGF-β1 foi encontrado com freqüência maior no grupo
doença periodontal quando comparado com o grupo controle. Este resultado concorda com
outro encontrado anteriormente por De Souza et al. (2003b), onde o mesmo genótipo foi
encontrado com maior freqüência no grupo de pacientes que apresentavam periodontite
severa, mas discorda do resultado encontrado por Holla et al. (2002), que não verificou
associação entre este polimorfismo e a doença periodontal.
Os mecanismos de controle da concentração do TGF-β1 no plasma são pouco
compreendidos. Evidências mostram que a concentração da molécula ativa do TGF-β1 pode
estar predominantemente sob controle genético. Grainger et al. (1999), observaram que o
polimorfismo genético na posição -509 está significantemente associado com os níveis
plasmáticos do TGF-β1. A associação entre esse polimorfismo e a densidade óssea foi
analisada em um estudo envolvendo 625 mulheres japonesas na menopausa. Os resultados
mostraram que o genótipo T/T foi encontrado com maior freqüência em mulheres que
apresentavam osteoporose (YAMADA et al., 2001). O genótipo T/T também foi associado
com a severidade à asma (PULLEYN et al., 2001).
Os resultados mostram que este polimorfismo no gene do TGF-β1 exerce
influência moderada sobre o curso da doença periodontal. Isto pode ter explicação no fato do
TGF-β1 apresentar ação pleiotrópica (STEINSVOLL; HALSTENSEN; SCHENCK, 1999).
TGF-β1 estimula de forma potente a síntese do colágeno tipo I (OVERALL; WRANA;
SODEK, 1991b), diminui a produção das metaloproteinases da matriz e estimula a síntese dos
inibidores de metaloproteinases (OVERALL; WRANA; SODEK, 1991a; BIRKEDALHANSEN, 1993b), resultando na formação de matriz extracelular. Devido a isto, o TGF-β1 é
31
considerado um fator capaz de promover fibrose tecidual (PAGE, 1991; HOBBS et al., 1998).
Por outro lado, TGF-β1 promove a migração de neutrófilos, monócitos e linfócitos da
corrente sangüínea para o local da doença (WAHL et al., 1993), contribuindo assim com o
processo inflamatório. A bifuncionalidade do TGF-β1, além de explicar o fato de
encontrarmos uma moderada associação entre o polimorfismo genético e a doença
periodontal, lança a hipótese que polimorfismo no gene do TGF-β1 dificilmente será
descoberto como sendo o principal no controle da periodontite.
Em nosso estudo encontramos também o genótipo 5A/5A do gene da MMP-3
com maior freqüência no grupo doença quando comparado ao grupo controle. Entretanto, este
polimorfismo foi investigado na doença periodontal em japoneses, e os resultados
demonstraram que este polimorfismo não influencia a doença em japoneses (ITAGAKI et al.,
2004). A MMP-3 ou estromelisina-1 degrada uma grande variedade de moléculas da matriz
extracelular, possuindo importante papel durante a remodelação da matriz (NAGASE, 1997).
O alelo 5A promove maior atividade do promotor em relação ao alelo 6A em fibroblastos (YE
et al., 1996). Fatores de transcrição que promovem repressão na taxa de expressão do gene
demonstraram ter maior afinidade pelo alelo 6A, reprimindo a síntese da MMP-3 (Ye et al.,
1996). Estudos têm demonstrado que o alelo 5A possui forte associação com o enfarte agudo
do miocárdio (YE et al., 1995; HUMPHRIES et al., 1998; TERASHIMA et al., 1999).
Indivíduos que carregam o alelo 5A podem sofrer mais comumente ruptura da placa
ateroesclerótica devido à maior atividade transcripcional do promotor do gene da MMP-3. A
placa ateroesclerótica e o periodonto possuem proteínas que servem de substrato para a MMP3. O aumento na síntese desta enzima leva a uma destruição de diversas proteínas encontradas
no ateroma e no periodonto.
Outro mecanismo que requer a participação da MMP-3 pode estar implicado
com o processo da periodontite. As metaloproteinases são sintetizadas na forma de zimógeno
e sua ativação ocorre na matriz extracelular. A ativação das MMPs requer a participação de
proteases que clivam a ligação do íon zinco com resíduos de cisteína existentes no sítio ativo
da enzima (MURPHY; KNAUPER, 1997). Sabe-se que a MMP-3 é capaz de ativar outras
MMPs (BIRKEDAL-HANSEN, 1993b). Desta forma, polimorfismo no promotor da MMP-3
que aumenta a síntese desta enzima contribui com o aumento na taxa de ativação de outras
MMPs, acarretando em uma maior taxa de destruição tecidual.
Relacionar polimorfismos genéticos à doença não é uma tarefa simples, visto que
alterações em nosso genoma ocorrem a cada 10 Kb, sendo a maioria delas silenciosas
(HENNIG et al., 1999). Polimorfismos em gene diversos vêm sendo investigados para a
32
doença periodontal (KORNMAN et al., 1997; GORE et al., 1998; DIEHL et al., 1999;
SCAREL-CAMINAGA et al., 2002; DE SOUZA et al., 2003a; DE SOUZA et al., 2003b). Os
principais genes candidatos são os envolvidos com a degradação do colágeno tipo I e com a
quimiotaxia de células sangüíneas para o local da inflamação. Consideramos que, além dos
polimorfismos estudados nos gene do TGF-β1 e da MMP-3, muitos outros polimorfismos e
genes ainda não investigados podem ser candidatos de estudo para a doença periodontal.
Em resumo, observamos que os polimorfismos no gene do TGF-β1 e da MMP-3
apresentaram associação com a doença periodontal. A importância destes dados não deve ser
desprezada. Entretanto, devemos ter cautela ao dizer que são marcadores genéticos para a
doença periodontal, uma vez que esta é multifatorial e não sabemos ao certo qual o papel e a
importância destes polimorfismos durante o desenvolvimento da doença.
33
7. Conclusões
•
O polimorfismo C/T na posição -509 do gene TGF-β1 está associado à doença periodontal
crônica. Os resultados apresentados mostram que o genótipo T/T apresenta maior
freqüência em indivíduos com a doença periodontal.
•
O polimorfismo 5A/6A na posição -1612 do gene da MMP-3 está também associado com
a doença periodontal crônica. Os resultados obtidos mostram que o genótipo 5A/5A
apresenta freqüência maior nos pacientes com a doença periodontal crônica em
brasileiros.
34
8. Referências Bibliográficas
AMANO, T. et al. The matrix metalloproteinase stromelysin-3 cleaves laminin receptor at
two distinct sites between the transmembrane domain and laminin binding sequence within
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