SUMMARY AND CONCLUSIONS

12
SUMMARY AND CONCLUSIONS
200
The goal of this thesis was to develop strategies to evaluate anti-restenotic pharma-
cological therapies. First, the objective was to develop and optimize a novel method
for local drug delivery in combination with the well-established cuff-induced neointima formation model in the mouse femoral artery – the “drug-eluting cuff” model.
After this, the newly established mouse model was used for studying the vascular
pathology of mice treated with the most well-known anti-restenotic compounds to
inhibit or prevent intimal hyperplasia and/or accelerated atherosclerosis used currently in combination with the drug-eluting stents (DES) technology. Furthermore,
the drug-eluting cuff model was used for the rapid characterization and screening of
a series of compounds with potential anti-restenotic capacity to be used in combination with the DES platform.
Post-angioplasty restenosis is the main drawback of percutaneous coronary interventions (PCI). DES have recently been shown to be effective to prevent this pathology. Chapter 2 is a review of the concept of the DES. This review describes the
results of several DES clinical trials and discusses some major topics as long-term
efficacy, side effects and implantation techniques from a clinical point-of-view. It is
shown that there is success and failure in the new field of DES. So far, the antirestenotic compounds sirolimus and paclitaxel are the most promising drugs.
Nevertheless, longer follow-up of current clinical studies is mandatory with regard
to long-term efficacy and potential side effects. For general wide-spread application
of DES many questions still need to be answered. At the moment, long-term followup (> 3 years) have demonstrated that both sirolimus- and paclitaxel-eluting stents
are superior over bare-metal stents to prevent in-stent restenosis. Recent head-tohead comparisons between both stents suggest that paclitaxel-eluting stent is either
of comparable or inferior efficacy (assessed by angiographic end points) with a similar safety profile (MACE) when compared with the sirolimus-eluting stent.
Nevertheless, DES technology still raises safety-related questions such as late stent
thrombosis, malapposition or incomplete opposed stent struts, and local polymer
hypersensitivity reactions. As implied in the term “drug-eluting stent”, the drug is
only one of the three parts involved in this novel technology. Studies addressing
both the stent design and the release kinetics/polymer coating are also of importance.
Chapter 3 focuses on the current efficacy and safety problems related to the use of
DES. Furthermore, the use of animal models in general and of a novel murine model
in particular in evaluating the existing and forthcoming compounds to be used in
201
12
combination with the DES platform technologies is discussed and illustrated. DES
to prevent in-stent restenosis after angioplasty are a new field in interventional cardiology and have yield promising short-term results. However, efficacy- and safetyrelated concerns have been rose recently which are difficult to address in human
clinical studies. Although efficacy and safety need ultimately to be determined clinically, preclinical testing of candidate drugs in well-defined animal models is necessary to gain insight into the basic biological responses to candidate compounds. The
present chapter illustrates the use of a new animal model to evaluate the existing
and forthcoming candidate compounds for DES. This novel mouse model enables
rapid screening of candidate drugs for DES and the establishment of dose-response
relationships with respect to both therapeutic and harmful effects on the vessel wall.
The results from drug testing using this model could help to quickly and cost-effectively establish the dose range of candidate drugs with reasonable potential for DES.
The development of the drug-eluting cuff mouse model is described in chapter 4.
The novel drug-eluting cuff was constructed from a blended polymeric formulation
of poly(ε-caprolactone) and poly(ethylene glycol) and simultaneously induces
reproducible intimal hyperplasia and allows local delivery of anti-restenotic compounds to the cuffed vessel segment. As a proof-of-principle, it is demonstrated that
paclitaxel- and rapamycin-eluting cuffs give a sustained release of the encapsulated
drug for at least three weeks, in vitro. Consequently, this sustained release resulted
in a substantially reduced neointima formation for both anti-restenotic agents tested, in vivo, with no systemic adverse effects or effect on control cuffed contralateral
femoral arteries. This new approach provides the possibility to evaluate the effectiveness and safety of new anti-restenotic agents to be used in combination with the
DES strategy in a rapid and easy animal model of restenosis. Especially the fact that
it is established for use in the mouse makes application in combination with various
transgenic (atherosclerotic) mouse strains possible with all the advantages for
detailed analysis of the underlying pathological effects.
In chapter 5 the effect of systemic and local dexamethasone treatment on neointima formation inhibition in the femoral artery cuff-induced mouse model of restenosis is assessed. More importantly, the microscopic histopathologic alterations after
local delivery of dexamethasone on arterial wall integrity and adverse vascular toxic
effects are evaluated. In this chapter it is described that both systemic and local dexamethasone therapy leads to an inhibition of neointimal growth in a murine model
of vascular hyperplasia. Nonetheless, systemic dexamethasone treatment is associ202
ated with systemic side effects. Local delivery of dexamethasone leads to an aboli-
tion of the systemic side effects but is associated with medial atrophy, reduced vascular smooth muscle cells (SMC) and collagen content, increased number of apoptotic cells and internal elastic lamina fracture. These outcomes point to a loss of vascular integrity, particularly at high concentrations. The results of this study indicate
that although local dexamethasone delivery has the potential to inhibit neointima
formation, the toxic-therapeutic window in which the delicate balance between
maximal anti-proliferative effects and minimal effects on vascular pathology is relatively narrow since vascular pathobiological side effects are already detected at relatively low, but effective, doses of dexamethasone in the drug-eluting cuffs.
Neointima formation after vascular injury is usually studied in healthy, normocholesterolemic animals, whereas patients undergoing PCI often have a prolonged history of hypercholesterolemia and diseased atherosclerotic coronary arteries. Hence,
DES may not only affect the formation of in-stent restenosis but might also affect the
formation or progression of atherosclerotic lesions and thus stabilization grade of
the pre-existing treated/stented plaques. Chapter 6 describes the vascular
histopathological responses of murine diseased atherosclerotic arteries to sirolimus
and paclitaxel. Here it is shown that local delivery of sirolimus and paclitaxel equally inhibit progression of cuff-induced neointima formation on pre-existing atherosclerotic lesions after secondary (drug-eluting) cuff placement. Nevertheless, deleterious effects on vascular pathology for higher concentrations of paclitaxel, but not
sirolimus were found. Furthermore, it is revealed that the expression of diverse
inflammation-, vessel wall composition and remodeling-, and especially apoptosisrelated genes are differently expressed in response to the two drugs. Altogether, this
indicates that although the anti-restenotic efficacy of both compounds is indisputable, the local vascular (adverse) effects are divergent between sirolimus and
paclitaxel. These differential responses between sirolimus and paclitaxel may
explain some of the remaining question of DES. Further studies investigating the
effect of these compounds on critical mechanisms of neointima formation and vascular healing are warranted. For future developments in DES era, lessons from preclinical studies in conjugation with results from clinical evaluations are indispensable for overcoming the problems of current DES platforms.
In the quest to develop pharmacological strategies for preventing and/or inhibiting
neointimal hyperplasia after vascular injury the GENetic DEterminants of
Restenosis (GENDER) project, including 3104 consecutive patients after successful
203
12
PCI was used to scan a broad spectrum of genes and their polymorphisms and,
thereby, get an overview of which processes are involved in the development of
restenosis. As described in chapter 7, the purpose of this association study was to
evaluate in a large unselected study population whether a variety of inflammatory
genetic determinants can predict the risk of clinical restenosis after PCI. This objective was addressed by using a two-step approach. First, the association was determined between 48 polymorphisms in 34 genes in pathways possible involved in the
inflammatory process and subsequently in the femoral artery cuff-induced mouse
model of restenosis to study the potential causal involvement of these inflammatory genes obtained in the first step. It was shown that genetic variants in inflammation-related factors play an important role in the development of restenosis.
Polymorphisms were found in four inflammation-related genes that predict restenosis: β2-adrenergic receptor, CD14, colony-stimulating factor 2, and eotaxin gene.
These genes were further validated for their involvement in the process of restenosis, at the mRNA level, in the mouse model of cuff-induced neointima formation.
These results can further contribute to the unraveling of the process of restenosis
and thereby provide novel therapeutic targets. This chapter underscores the power
of this translational approach based on a combined analysis of large patient populations and specific interventions in mouse models.
The pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNFα) is a key regulator of inflammatory responses and may exert critical influence on the development
and extension of restenosis. Chapter 8 describes the systematic genotyping of the
GENDER population for six polymorphisms in the TNFα gene. The role of TNFα in
restenosis development was also assessed in detail in ApoE*3-Leiden transgenic
mice, TNFα-null mice and by local delivery of a TNFα biosynthesis inhibitor,
thalidomide. The -238G-1031T haplotype of the TNFα gene increased clinical and
angiographic risk of restenosis. Preclinical data showed that TNFα mRNA was significantly, time-dependently, upregulated upon vascular injury. Mice lacking TNFα
or locally treated with thalidomide, by means of a thalidomide-eluting cuff, showed
a strong neointima formation inhibition. Taken together, TNFα plays an important
role in restenosis development and pharmacological modulation of TNFα may be an
anti-restenotic strategy.
17β-estradiol (E2) is also known to have anti-restenotic properties. Estrogen receptor alpha (ERα) has been demonstrated to mediate E2 anti-restenotic properties.
However the role of ERβ is not fully elucidated. In chapter 9, the respective role of
204
vascular ERα and ERβ in the anti-restenotic properties of E2 was investigated in the
drug-eluting cuff model by local delivery of an ERα- and of an ERβ-selective agonist.
Here it is demonstrated that in addition to ERα, ERβ-specific activation leads to
neointima formation inhibition in a murine model of restenosis. These data reveal a
yet unidentified protective role of ERβ in injury-induced neointima formation.
The phenotypic modulation of SMC from quiescent, differentiated cells into activated proliferating cells plays a key role in restenosis. The nuclear orphan receptor
Nur77 has been shown, in the past, to be involved in such phenotypic changes.
Furthermore, it has been shown recently that 6-mercaptopurine (6-MP) increases
Nur77 transactivation. In chapter 10 it is investigated whether 6-MP protects
against restenosis through activation of the nuclear receptor Nur77. These data
clearly demonstrate that activation of Nur77 by 6-MP inhibits SMC proliferation, a
hallmark of restenosis. In addition, by using a murine model of neointima formation, evidence is provided supporting the hypothesis that activation of Nur77 by 6MP drug-eluting cuffs inhibits neointima formation. Therefore, activation of the
nuclear receptor Nur77 by 6-MP or by other activators/agonists may be a rational
approach to treat (in-stent) restenosis.
Finally the last chapter, chapter 11, describes a new possible application for the
drug-eluting cuff mouse model. Here are described the means to conditionally modify genes at a predefined and localized region of a blood vessel using a drug-eluting
cuff which induce highly localized Cre-mediated recombination in the unique SMCreERT2(ki)/rosa26 mouse without affecting additional (non-targeted) SMC. Thus,
this technology enables physical limitation to the exposed area that can subsequently undergo Cre-mediated recombination.
Conclusions
Restenosis is the main drawback of percutaneous coronary interventions (PCI).
Recently, drug-eluting stents were introduced successfully in clinical practice leading to a drop in the post-angioplasty restenosis rate. Nevertheless, safety and efficacy concerns related to the active compounds of such stents still exist. This thesis
aimed at the development of a local delivery system, in combination with the cuffinduced mouse model of neointima formation, in order to closely mimic the DES
mode-of-action and to further answer to such remaining questions related to this
205
12
novel technology. Altogether, these comprehensive studies on efficacy and safety of
anti-restenotic compounds using a novel developed mouse model of neointimal
hyperplasia have resulted in a thorough understanding of the mode-of-action of
these anti-restenotic drugs on neointimal hyperplasia inhibition as well as to further
assess the potential adverse effects on vessel wall biology and on the (treated) preexisting underlying atherosclerotic lesions. Especially the discovery of novel antirestenotic strategies to be used in combination with the DES technology is of specially importance for further preclinical studies in more advance animal models of
restenosis (e.g. porcine coronary artery model) as well as directly in the field of
interventional cardiology per se.
206
SAMENVATTING EN CONCLUSIES
208
Het doel van dit proefschrift was het ontwikkelen van strategieën ter evaluatie van
farmacologische therapieën ten behoeve van restenose preventie. In de eerste plaats
was het doel het ontwikkelen en optimaliseren van het “drug-eluting cuff” model.
Hierin is een nieuwe methode van lokale stoffen gecombineerd met het ‘cuff-geïnduceerde’ neointima formatie model in de Arteria (a.) femoralis van de muis. Hierna
werd dit geoptimaliseerde muismodel gebruikt voor het bestuderen van vaatwand
pathologie in de muis na behandeling met diverse restenose remmers die
momenteel in de kliniek gebruikt worden in ‘drug-eluting stents’ (DES) ter preventie van intima hyperplasie en/of versnelde atherosclerose. Voorts werd dit model
gebruikt voor snelle karakterisatie en screening van potentieel anti-restenotische
werking van stoffen, die eventueel kunnen worden toegepast in DES.
Restenose die optreedt na het toepassen van angioplastiek (“dotteren”), is het grootste nadeel van percutane coronaire interventies (PCI). Van DES is recent aangetoond dat dit een effectieve methode is om dergelijke pathologie te voorkomen. In
hoofdstuk 2 is het concept van DES nader toegelicht in de vorm van een
overzichtsverhaal. In deze review worden de resultaten van een aantal clinical trials
betreffende DES beschreven. Voorts worden belangrijke onderwerpen als effectiviteit op de lange termijn, bijwerkingen en implantatie technieken vanuit klinisch
oogpunt uitgebreid behandeld. Hierin wordt duidelijk dat het nieuwe gebied van
DES ‘ups and downs’ kent. Paclitaxel en sirolimus worden tot dusver gezien als de
meest veelbelovende stoffen. Een lange termijn follow-up van de huidige klinische
studies is echter noodzakelijk voor het in kaart brengen van de effecten en bijwerkingen op de lange termijn. Alvorens DES op algemenere schaal kunnen worden
toegepast dient een groot aantal vragen nog beantwoord te worden. Lange termijn
follow-up onderzoeken (> 3 jaar) laten op dit moment zien dat zowel sirolimus als
paclitaxel-eluting stents superieur zijn in het voorkomen van in-stent restenose in
vergelijking met de authentieke metalen stent. Een vergelijkend onderzoek tussen
sirolimus en paclitaxel-eluting stents wijst uit dat de paclitaxel eluting stent qua
effectiviteit gelijk is dan wel minder effectief (gebaseerd op angiografische eindpunten), met eenzelfde veiligheidsprofiel (MACE, Major Adverse Coronary Events), dan
de sirolimus eluting stent. Ondanks de huidige kennis, brengt de DES technologie
nog steeds een groot aantal veiligheidsgerelateerde problemen op zoals: trombose in
de stent, incorrecte positie en verschuiving van de stent, onvoldoende uitzetten van
de stent of lokale overgevoeligheidsreacties voor het gebruikte polymeer.
209
In hoofdstuk 3 worden de huidige effectiviteit en veiligheidsproblemen van DES
nader belicht. Daarnaast wordt het algemene gebruik van diermodellen besproken
en in het bijzonder een nieuw muismodel ter evaluatie van het gebruik van
bestaande en nieuwe stoffen in combinatie met de DES techniek toegelicht.
De toepassing van DES met als doel het voorkomen van in-stent restenose na angioplastiek is een nieuw domein binnen de interventie cardiologie met veelbelovende
resultaten op de korte termijn. Echter, recentelijk zijn er veel twijfels ontstaan over
de effectiviteit en de veiligheid van deze toepassing, waarover humane klinische
studies geen duidelijkheid kunnen geven. Ondanks het feit dat veiligheid en effectiviteit uiteindelijk klinisch getoetst dienen te worden, is het preklinisch toetsen van
potentieel werkzame stoffen in representatieve diermodellen nodig om inzicht te
verkrijgen in de basale biologische reactie hierop. In dit hoofdstuk wordt een nieuw
diermodel gepresenteerd waarin bestaande en nieuwe potentieel werkzame stoffen
worden getest voor hun toepassing in DES. Met behulp van dit muismodel is het
mogelijk een snelle screening uit te voeren van deze stoffen in DES. Daarnaast kunnen aan de hand van dit model dosis-respons relaties met betrekking tot therapeutische en schadelijke effecten op de vaatwand worden geanalyseerd.
De ontwikkeling van het ‘drug-eluting-cuff’ muismodel wordt beschreven in hoofdstuk 4. De nieuwe ‘drug-eluting-cuff’ bestaat uit een polymeer mengsel van poly
ε-caprolactone en polyethylene glycol. Gebruik van dit mengsel heeft een tweeledig
doel; enerzijds zorgen het voor repreduceerbare inductie van intima hyperplasie
anderzijds zorgen het voor lokale afgifte van anti-restenotische stoffen aan het vaatsegment waar de cuff zich omheen geplaatst is. Als ‘proof-of-principle’ is middels
een in vitro experiment aangetoond dat paclitaxel- en rapamycine-‘eluting-cuffs’ in
staat zijn om gedurende tenminste 3 weken een constante hoeveelheid van de in de
cuff opgenomen stof af te geven. Als gevolg van deze constante afgifte werd, in vivo,
een substantiële afname van neointima formatie voor beide geteste anti-restenotische stoffen gezien waarbij geen systemische bijwerkingen optraden. Met behulp
van deze nieuwe benadering is effectiviteit en veiligheid van nieuwe anti-restenotische stoffen, voor toepassing in DES snel en eenvoudig te testen in een diermodel
voor restenose. Dit is in het bijzonder van belang aangezien het model is opgezet
voor toepassing bij muizen, waardoor de toepassing bij diverse transgene (eventueel
met een atherosclerose achtergrond) muizenstammen mogelijk is, met alle voordelen van gedetailleerde analyse van onderliggende pathologische effecten.
210
In hoofdstuk 5 worden de effecten van systemische en lokale behandeling met
dexamethason op remming van neointima formatie in a. femoralis onderzocht, met
behulp van het ‘cuff-induced’ restenose muismodel. Evaluatie van de microscopische histopathologische veranderingen in de samenstelling van de arteriële vaatwand
na lokale afgifte van dexamethason is een belangrijk onderdeel in dit hoofdstuk. In
het huidige hoofdstuk wordt beschreven dat zowel, systemisch als lokale dexamethason therapie leidt tot een remming van neointima vorming in een muismodel
van vasculaire hyperplasie. Echter, het systemisch gebruik van dexamethason kent
een aantal algemene negatieve bijwerkingen. Lokale afgifte van dexamethason leidde niet tot systemische bijwerkingen, maar leidde tot atrofie van de media, een verminderd aantal gladde spiercellen, een verminderde hoeveelheid collageen, een toename van het aantal apoptotische cellen en breuken in de interne lamina elastica.
Deze uitkomsten duiden op verlies van de vaatwand integriteit, voornamelijk bij
hoge concentraties. De resultaten van deze studie geven aan dat, ondanks het feit dat
lokale afgifte van dexamethason een remming geeft van neointima formatie, het toxisch-therapeutisch raam, de fijne balans tussen maximale antiproliferatieve effecten
en minimale vasculaire pathologie, relatief nauw is: al bij een relatief een lage, maar
effectieve, dosis dexamethason is sprake van vasculaire pathobiologische bijwerkingen.
Vaatschade en daarop volgende neointima formatie, wordt meestal bestudeerd in
gezonde, normocholesterolemische dieren, terwijl het meerendeel van de patiënten
die PCI ondergaan een uitgebreide geschiedenis hebben van hypercholesterolemie
en aangetaste atherosclerotische coronair arteriën. Deze nieuwe benadering maakt
het mogelijk de effectiviteit en veiligheid van nieuwe anti-restenotische stoffen, die
in combinatie met DES gebruikt zouden kunnen worden, te evalueren in een snel en
eenvoudig restenose diermodel. Vandaar, dat DES niet alleen van invloed zijn op de
formatie van ‘in-stent’ stenose, maar ook een effect hebben op de formatie en progressie van onderliggende atherosclerotische laesies en daarmee de mate van stabilisatie van reeds bestaande, maar behandelde/gestente plaques. In hoofdstuk 6
wordt de vasculaire histopathologische respons op het gebruik van sirolimus en
paclitaxel van aangetaste atherosclerotische arteriën in de muis beschreven. Hieruit
blijkt dat lokale afgifte van sirolimus en paclitaxel een gelijkmatige remming geeft
van de progressie van ‘cuff-geïnduceerde’ neointima formatie na pre-existerende
atherosclerotische laesies na secundaire plaatsing van de ‘drug-eluting cuff’.
Gebruik van paclitaxel in hogere concentraties leidde tot schadelijke effecten met
betrekking tot vaatwand pathologie. Bij sirolimus was van een dergelijk effect geen
211
sprake. Daarnaast werd, als reactie op beide stoffen, een verschil gevonden in
expressie van diverse genen die gerelateerd zijn aan ontsteking, vaatwand samenstelling, remodeling, en in het bijzonder apoptosis. Dit samengenomen geeft een
zonder twijfel vergelijkbaar anti-restenotisch effect van beide stoffen aan, echter
betreffende de lokale vasculaire bijwerkingen zijn paclitaxel en sirolimus verschillend. Dit verschil in reactie geeft wellicht antwoorden op enkele open vragen met
betrekking tot DES. Verder onderzoek naar de effecten van deze stoffen op kritieke
mechanismen van neointima formatie en vasculaire genezing is zeker nodig. Voor
toekomstige ontwikkelingen op gebied van DES zijn de conclusies van preklinische
studies in combinatie met resultaten van klinische evaluaties onmisbaar om de
huidige vraagstukken van het DES platform het hoofd te bieden.
Het GENetic DEterminants of Restenosis (GENDER) project, waarin 3104 patiënten die PCI hadden ondergaan, waren geïncludeerd, werd gebruikt om nieuwe farmacologische strategieën te ontwikkelen ter preventie en remming van neointima
hyperplasie na vaatschade. In dit project werd een breed spectrum van genen en
bijbehorende polymorfismen gescreend om zodoende een overzicht te krijgen van
de processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van restenose. Zoals beschreven
in hoofdstuk 7, was het doel van deze studie om in een grote populatie te evalueren
of een verscheidenheid van genetische inflammatoire determinanten het risico op
restenose na PCI kunnen voorspellen. Deze evaluatie vond in twee stappen plaats.
Allereerst, werd naar het verband gezocht tussen 48 polymorfismen, in 34 genen, en
mechanismen die mogelijk betrokken zijn bij het inflammatoire proces. Vervolgens
werden deze inflammatoire genen bestudeerd in het a. femoralis “cuff-induced”
restenose muismodel, om een potentieel causaal verband aan te tonen. Hiermee
werd aangetoond dat een aantal van de genen waarin genetische variatie van inflammatie gerelateerde factoren werd gevonden een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van restenose. Polymorfismen werden gevonden in vier inflammatie gerelateerde genen die restenose kunnen voorspellen: β-2 adrenerge receptor, CD14,
colony-stimulating factor 2, en het eotaxin gen. Deze genen zijn vervolgens op
mRNA niveau verder gevalideerd voor hun betrokkenheid bij het restenose proces
in het muismodel. De resultaten hiervan kunnen een verdere bijdrage leveren bij het
in kaart brengen van het restenose proces en nieuwe therapeutische doelen aandragen. In dit hoofdstuk wordt de essentie onderstreept van de gevolgde translationele
benadering, gebaseerd op een gecombineerde analyse van een grote patiënt populatie en specifieke interventies in een muismodel.
212
Pro-inflammatoire cytokine tumor necrose factor alpha (TNFα) speelt een sleutelrol
bij inflammatoire reacties en heeft vermoedelijk een belangrijke invloed op het
ontstaan en van de verdere ontwikkkeling van restenose. In hoofdstuk 8 wordt de
systematische genotypering van de GENDER populatie voor zes polymorfismen in
het TNFα gen beschreven. De rol van het TNFα gen in ontwikkeling van restenose
werd ook gedetailleerd onderzocht in APOE*3-Leiden, TNFα knockout muizen en
door lokale afgifte van een TNFα biosynthese remmer, thalidomide. Het 238G1031T haplotype van het TNFα gen vergroot de klinische en angiografische kans op
restenose. Preklinische data liet zien dat het mRNA niveau van TNFα significant,
tijdsafhankelijk, opgereguleerd was op het moment van vaatschade. TNFα knockout
muizen en muizen die lokaal met thalidomide zijn behandeld, door middel van een
thalidomide afgevende cuff, lieten een sterke remming zien van neointima formatie.
Dit samengenomen, geeft aan dat TNFα een belangrijke rol speelt bij het ontwikkelen van restenose en farmacologische modulatie van TNFα zou een mogelijke antirestenose strategie kunnen zijn.
17β-oestradiol (E2) heeft ook anti-restenotische eigenschappen. Van oestrogeen
receptor alpha (ERα) is aangetoond dat het de anti-restenotische eigenschappen van
E2 medieert. De rol van ERβ is echter nog niet volkomen duidelijk. In hoofdstuk
9, wordt de rol van zowel ERα als die van ERβ met betrekking tot de anti-restenotische eigenschappen van E2 onderzocht aan de hand van het ‘drug-eluting cuff’
model door lokale afgifte van een ERα- of ERβ-selectieve agonist. Hier wordt
getoond, dat in aanvulling op ERα, ERβ-specifieke activatie leidt tot remming van
neointima formatie in een muismodel voor restenose. Aan de hand van deze data
komt een tot nog toe onbekende beschermende rol van ERβ tegen schade geοnduceerde neointima formatie aan het licht.
De fenotypische modulatie van gladde spiercellen van latente, gedifferentieerde
cellen naar geactiveerde prolifererende cellen speelt een belangrijke rol in restenose.
Van de nuclear orphan receptor Nur77 is in het verleden aangetoond dat deze
betrokken is bij een dergelijke verandering van fenotype. Daarnaast is recentelijk
aangetoond dat 6-mercaptopurine (6MP) de transactivatie van Nur77 doet toenemen. In hoofdstuk 10 wordt bestudeerd of 6-MP een beschermende rol heeft tegen
het optreden van restenose door het activeren van de nucleaire receptor Nur77. Deze
data laat duidelijk zien dat activatie van Nur77 door 6-MP proliferatie van gladde
spiercellen, een belangrijk kenmerk van restenose, remt. In aanvulling hierop werd
extra ondersteuning geleverd aan de hypothese, dat activatie van Nur77 door 6-MP
213
‘drug-eluting cuffs’ de vorming van neointima remt, met data verkregen met behulp
van een muismodel voor neointima formatie. Zodoende lijkt activatie van de nucleaire receptor Nur77 door 6-MP, of andere activatoren / agonisten van deze “orphan
receptor”, een rationele benadering voor het behandelen van ‘in-stent’ restenose.
In het laatste hoofdstuk, hoofdstuk 11, wordt een mogelijk nieuwe toepassing voor
het ‘drug-eluting cuff’ muismodel beschreven. Zo wordt de manier beschreven om
genen te reguleren in een vooraf gedefinieerd en lokaal gebied van een bloedvat.
Hierbij wordt, met behulp van een ‘drug-eluting cuff’, een Cre-gemedieerde recombinatie in de unieke SM-CreERT2(ki)/rosa26 muis bewerkstelligd, zonder daarbij
andere dan tot de doelgroep behorende cellen te raken. Deze technologie maakt een
fysieke begrenzing van het blootgestelde gebied mogelijk, waarin vervolgens Cregemedieerde recombinatie plaats kan vinden.
Conclusies
Restenose is het grootste nadeel van percutane coronaire interventies (PCI). De
recentelijke succesvolle introductie van ‘drug-eluting stents’, als klinische toepassing, heeft het aantal gevallen van restenose na angioplastiek doen dalen. Echter,
over de veiligheid en effectiviteit van de gebruikte actieve stoffen in deze stents
bestaan nog veel twijfels die tot vragen leiden. Dit proefschrift had de ontwikkeling
van een systeem voor lokale afgifte in combinatie met een muismodel voor ‘cuffinduced’ neointima formatie als doel. Aan de hand hiervan kon de DES methode zo
dicht mogelijk in de muis benaderd worden om een antwoord te kunnen geven op
de vragen betreffende deze nieuwe technologie. Samenvattend, bij de in dit proefschrift beschreven studies is gekeken naar effectiviteit en veiligheid van antirestenotische stoffen met behulp van een nieuw opgezet muismodel voor neointima
hyperplasie. Dit heeft geleid tot een degelijk inzicht in de wijze waarop anti-restenotische stoffen invloed hebben op remming van neointima hyperplasie. Voorts heeft
het geleid tot het verder onderzoeken van de mogelijke bijwerkingen van deze stoffen op de vaatwand biologie en op de (behandelde) pre-existerende onderliggende
atherosclerotische laesies. In het bijzonder de ontdekking van nieuwe anti-restenotische strategieën om te gebruiken in combinatie met DES technologie is van bijzonder belang voor verdere preklinische studies in meer geavanceerde restenose diermodellen (bijv. coronair arterie model in het varken) en voor toepassing in het veld
van de interventie cardiologie.
214
SUMÁRIO E CONCLUSÕES
216
O principal objectivo da presente tese foi o desenvolvimento de novas estratégias
para a avaliação de terapias farmacológicas anti-reestenose. O objectivo proposto foi
o de desenvolver e optimizar uma nova metodologia para a libertação localizada de
fármacos em conjugação com o reconhecido modelo de formação de neoíntima
induzida pela colocação de um colar exterior na artéria femoral do ratinho – o “colar
com libertação controlada de fármacos”. Este novo modelo animal foi utilizado para
estudar a patologia vascular em ratinhos com os compostos anti-reestenose usados
actualmente em combinação com a tecnologia dos stents com libertação controlada
de fármacos (SLCF) para inibir ou prevenir a formação de neoíntima e/ou arteriosclerose acelerada. Posteriormente, o modelo do colar com libertação controlada
de fármacos foi utilizado para a caracterização e identificação de diversos fármacos
com possíveis propriedades anti-reestenose para serem utilizados em combinação
com a plataforma dos SLCF.
A principal limitação da intervenção coronária percutânea (ICP) é a reestenose após
angioplastia. O capítulo 2 é uma revisão do conceito dos SLCF. Este capítulo
descreve o resultado de vários estudos clínicos com SLCF e discute tópicos importantes, de um ponto de vista clínico, tais como eficácia a longo prazo, efeitos nocivos
e técnicas de implementação. Na nova área de investigação dos SLCF foi demonstrado que existe, igualmente, sucesso e fracasso. Até à data, os fármacos antireestenose mais promissores são o sirolimus e o paclitaxel. No entanto, o seguimento dos doentes por um período mais longo de tempo após a ICP é obrigatório para
uma avaliação cuidada da sua eficácia a longo prazo e hipotéticos efeitos nocivos.
Para uma aplicação generalizada dos SLCF ainda há muitas questões que necessitam
de resposta. Até ao momento, o seguimento dos doentes a longo prazo (> 3 anos)
demonstrou que ambos os stents com libertação controlada de sirolimus e paclitaxel são superiores aos stents livres de fármacos na prevenção da reestenose intrastent. Recentes comparações entre os dois stents sugerem que o stent com libertação
controlada de paclitaxel possui uma eficácia comparável ou inferior (confirmado por
angiografia) com uma segurança semelhante relativamente ao stent com libertação
controlada de sirolimus. A tecnologia dos SLCF ainda está envolta em questões relacionadas com segurança, tais como trombose tardia do stent, má colocação do stent
e reacções locais de hipersensibilidade ao polímero que reveste o stent. Como está
implícito na terminologia “stents com libertação controlada de fármacos”, o fármaco constitui apenas uma das três partes desta nova tecnologia. Estudos que
descrevam o design do stent, a cinética de libertação de fármacos e o revestimento
polimérico do stent são também de vital importância para o sucesso dos SLCF.
217
O capítulo 3 foca os problemas de eficácia e de segurança relacionados com o uso
dos SLCF. Aqui é, também, discutido e ilustrado o uso de modelos animais em geral,
e de um modelo de ratinho em particular, na avaliação dos fármacos existentes e
vindouros para serem utilizados em combinação com a plataforma tecnológica dos
SLCF. Os SLCF para prevenir reestenose intra-stent após angioplastia são uma nova
área de investigação em cardiologia de intervenção que geraram resultados promissores a curto prazo. No entanto, a sua eficácia e segurança têm sido recorrentemente
questionadas mas tais questões são difíceis de endereçar em estudos clínicos. Apesar
da eficácia e segurança dos SLCF terem de ser obrigatoriamente comprovadas clinicamente, a avaliação pré-clinica de fármacos com possíveis propriedades antireestenose é necessária para um melhor conhecimento destes fármacos nas
respostas biológicas básicas. Aqui é demonstrado o uso de um novo modelo animal
para a avaliação de fármacos existentes e vindouros para possível uso em combinação com os SLCF. Este novo modelo em ratinhos permite a rápida identificação
de fármacos para uso nos SLCF bem como o estudo de seus efeitos terapêuticos e
nocivos na vasculatura.
O desenvolvimento do modelo do colar com libertação controlada de fármacos em
ratinhos é descrito no capítulo 4. Este novo modelo foi construido a partir de uma
mistura polimérica de ε-policaprolactona e polietilenoglicol. Esta mistura induz
hiperplasia reproduzível da íntima e simultaneamente permite a libertação controlada de fármacos localmente para o vaso sanguíneo. Como prova do seu funcionamento foi demonstrado que colares com libertação controlada de sirolimus e paclitaxel permitem uma libertação controlada, in vitro, durante três semanas.
Consequentemente, esta libertação controlada de sirolimus e paclitaxel resultou na
inibição da formação de neoíntima, in vivo, sem quaisquer efeitos sistémicos
nocivos. Esta nova metodologia permite a avaliação de novos fármacos antireestenose em relação à sua eficácia e segurança num modelo animal de reestenose
rápido e simples. Esta caracterização pré-clínica poderá levar à sua futura utilização
em combinação com os SLCF. O facto deste modelo ter sido desenvolvido, especialmente, para ser utilizado em ratinhos permite a sua aplicação em conjugação com
diversas estirpes de ratinhos transgénicos (arterioscleróticos), o que permite uma
análise detalhada dos efeitos patológicos subjacentes.
No capítulo 5 foi analisado o efeito do tratamento sistémico e local com dexametasona na inibição da formação de neoíntima no modelo de reestenose induzida pelo
colar exterior na artéria femoral do ratinho. As alterações histopatológicas foram
218
avaliadas após o tratamento local com dexametasona no que diz respeito à integri-
dade vascular e efeitos nocivos. Neste capítulo é descrito como ambos os tratamentos com dexametasona, sistémico e local, levam a uma inibição da formação de
neoíntima num modelo de hiperplasia vascular em ratinho. No entanto, o tratamento sistémico com dexametasona está associado a efeitos sistémicos nocivos. A libertação local de dexametasona conduz ao desaparecimento destes efeitos sistémicos
nocivos mas está associada a atrofia da túnica média, perda de células do músculo
liso e da quantidade de colagénio, aumento do número de células apoptóticas e do
número de fracturas na lâmina elástica interna. Estes resultados indicam uma perda
generalizada da integridade vascular, especialmente a concentrações elevadas de
dexametasona. Os resultados deste estudo indicam que apesar da libertação local de
dexametasona ter a capacidade de inibir a formação de neoíntima, a capacidade
tóxico-terapêutica na qual ocorre um equilíbrio entre o máximo efeito antiproliferativo e o mínimo efeito na vasculatura é relativamente pequena, uma vez que
efeitos patobiológicos nocivos ocorrem em doses relativamente baixas, mas eficazes,
de dexametasona no colar.
A formação de neoíntima após a lesão do vaso sanguíneo é normalmente estudada
em animais normo-colesterolémicos. No entanto, doentes submetidos a ICP têm,
frequentemente, uma história clínica prolongada de hipercolesterolemia e lesões
arterioscleróticas nas artérias coronárias. Desta forma, os SLCF poderão não só
afectar a formação da reestenose intra-stent mas também a formação e/ou progressão das lesões arterioscleróticas pré-existentes nas artérias coronárias, bem
como o seu grau de estabilização. O capítulo 6 descreve as respostas
histopatológicas de artérias arterioscleróticas de ratinhos aos fármacos sirolimus e
paclitaxel. Aqui é demonstrado que a libertação local de sirolimus e paclitaxel inibe,
igualmente, a progressão da formação de neoíntima induzida pelo colar exterior na
artéria femoral do ratinho em lesões arterioscleróticas pré-existentes após a colocação de um segundo colar com libertação controlada de fármacos. Efeitos nocivos
na vasculatura foram encontrados a concentrações elevadas de paclitaxel mas não
de sirolimus. Este estudo revela, também, que a expressão de diversos genes inflamatórios, composição vascular e, especialmente, apoptose apresentam uma
diferente expressão em resposta aos dois fármacos. Em conclusão, estes estudos
indicam que apesar da eficácia anti-reestenose dos dois fármacos ser semelhante, os
efeitos nocivos na vasculatura são divergentes entre sirolimus e paclitaxel. Esta
resposta divergente entre sirolimus e paclitaxel poderá explicar algumas das
questões persistentes associadas ao uso dos SLCF. No entanto, um maior número de
219
estudos sobre o efeito destes fármacos em mecanismos críticos na formação de
neoíntima são necessários. Para futuros desenvolvimentos na era dos SLCF são
indispensáveis mais estudos pré-clínicos, em combinação com estudos clínicos, para
ultrapassar os restantes problemas associados a esta nova tecnologia.
Na busca de novas estratégias farmacológicas para prevenir e/ou inibir a hiperplasia da neoíntima após lesão vascular foi usado o projecto GENes DEterminantes da
Reestenose (GENDER). Este projecto incluiu 3104 doentes consecutivos após ICP e
foi concebido para investigar um largo espectro de genes e seus polimorfismos, de
forma a obter uma visão global dos processos possivelmente envolvidos no
mecanismo da reestenose. Como descrito no capítulo 7, o objectivo deste estudo
associativo foi o de avaliar uma grande população de doentes nos quais uma
variedade de determinantes genéticos inflamatórios pudessem fazer prever o risco
de reestenose clínica após ICP. Este objectivo foi endereçado através de duas etapas
distintas. Inicialmente foi estudada a associação entre 48 polimorfismos em 34
genes possivelmente envolvidos no processo inflamatório. Subsequentemente
alguns destes genes inflamatórios, obtidos na primeira etapa, foram estudados no
modelo de formação de neoíntima induzida pelo colar na artéria femoral do ratinho.
Este estudo demonstra que variantes genéticas, em factores inflamatórios, possuem
um papel importante no mecanismo da reestenose. Os resultados deste estudo
demonstam que polimorfismos em quatro genes inflamatórios estão associados com
a pré-disposição para a reestenose após ICP: receptor beta 2 adrenérgico, CD14,
GM-CSF e eotaxina. Estes genes foram posteriormente validados, ao nível do
mRNA, para comprovar o seu envolvimento no processo da reestenose no modelo
de formação de neoíntima em ratinho. Estes resultados poderão contribuir para um
maior conhecimento sobre o processo da reestenose e, deste modo, permitir o
desenvolvimento de novos alvos terapêuticos. O presente capítulo reforça o poder da
investigação translacional baseada em análises combinadas entre estudos populacionais e intervencões específicas em modelos animais.
A citocina pró-inflamatória factor de necrose tumoral alfa (TNFα) é um importante
regulador das respostas inflamatórias e, desta forma, poderá exercer uma influência
crítica no desenvolvimento e extensão da reestenose. O capítulo 8 descreve a
genotipagem sistemática da população do projecto GENDER em seis polimorfismos
do gene TNFα. O papel da citocina TNFα na reestenose foi avaliado em detalhe em
ratinhos transgénicos ApoE*3-Leiden, ratinhos deficientes em TNFα e por libertação local de um fármaco inibidor da biosíntese de TNFα (talidomida). O haplótipo
220
-238G-1031T do gene TNFα aumenta o risco da reestenose clínica e angiográfica. Os
resultados pré-clínicos demonstraram que os níveis de expressão de mRNA do gene
TNFα estavam significativamente aumentados, ao longo do tempo, após a indução
da lesão vascular. Ratinhos deficientes em TNFα ou tratados localmente com talidomida (por via de um colar com libertação controlada de talidomida) demonstraram
uma forte inibição na formação de neoíntima. Estes resultados, clínicos e pré-clínicos, enfatizam um papel importante para a citocina pró-inflamatória TNFα no
desenvolvimento da reestenose e que a modulação farmacológica dos níveis de
TNFα poderá ser uma possível estratégia anti-reestenose.
A hormona 17-β-estradiol (E2) é também reconhecida por possuir propriedades
anti-reestenose. O receptor alfa de estrogénio (ERα) tem sido reconhecido pela sua
capacidade de mediar os efeitos anti-reestenose do E2. No entanto, a função do
receptor beta de estrogénio (ERβ) ainda não está inteiramente elucidada. No capítulo 9, as respectivas funções dos receptores vasculares ERα e ERβ nas propriedades anti-reestenose do E2 foram investigadas no modelo do colar com libertação controlada de agonistas específicos do ERα e do ERβ. Aqui foi demonstrado
que em adição ao ERα, a activação específica do ERβ resulta numa inibição da formação de neoíntima em ratinhos. Estes resultados revelam um papel protector, até
agora desconhecido, para o ERβ na reestenose.
A modulação fenotípica das células do músculo liso do estadio quiescente (diferenciado) para o estadio proliferativo desempenha um papel relevante na reestenose. O
receptor nuclear órfão Nur77 foi descrito, no passado, como parte integrante destas
alterações fenotípicas. Recentemente foi também demonstrado que o fármaco 6mercaptopurina (6-MP) tem a capacidade de aumentar a transactivação do receptor
Nur77. No capítulo 10 foi investigada a actividade do fármaco 6-MP na inibição da
formação de neoíntima através da activação do receptor nuclear órfão Nur77. Este
estudo demonstrou claramente que a activação do receptor Nur77 pelo fármaco 6MP inibe a proliferação das células do músculo liso, in vitro. Aqui foi também
demonstrado que a activação do receptor Nur77 através do modelo do colar com
libertação controlada de 6-MP inibe a formação de neoíntima, in vivo. Desta forma
conclui-se que a activação do receptor nuclear Nur77 por acção do fármaco 6-MP,
ou através de outros activadores/agonistas, poderá ser uma possível estratégia para
tratar reestenose intra-stent.
221
Por último, o capítulo 11 descreve uma possível nova aplicação para o modelo do
colar com libertação controlada de fármacos. Aqui é descrita uma nova metodologia
para a modificação condicional de genes numa região pré-definida e localizada do
vaso sanguíneo. O modelo do colar com libertação controlada de fármacos foi utilizado como forma de induzir a recombinação localizada, mediada pela enzima Cre
sob o controle de um promotor específico para células do músculo liso (promotor
SM22), na estipe SM-CreERT2(ki)/rosa26 em ratinhos sem afectar células adicionais
(não-alvo) do músculo liso. Desta forma esta tecnologia permite a limitação física da
área de recombinação desejada que, posteriormente, poderá sofrer recombinação
mediada pela enzima Cre.
Conclusões
Reestenose é a principal limitação da intervenção coronária percutânea (ICP).
Recentemente, a introdução dos stents com libertação controlada de fármacos
(SLCF) em cardiologia de intervenção levou à diminuição da taxa da reestenose após
angioplastia. No entanto, ainda existem questões de eficácia e segurança relacionadas com o uso dos fármacos que revestem estes stents.
A presente tese teve por objectivo o desenvolvimento de um sistema de libertação
local de fármacos em combinação com o modelo de formação de neoíntima induzida pela colocação de um colar exterior na artéria femoral do ratinho. Esta metodologia pretende mimetizar o modo de acção dos SLCF e, desta forma, tentar responder
às questões recorrentes associadas a esta nova tecnologia. No seu conjunto, os estudos descritos nesta tese estão relacionados com a eficácia e segurança de fármacos
anti-reestenose. Estes estudos permitiram uma compreensão detalhada do modo de
acção destes fármacos anti-reestenose na inibição da hiperplasia da neoíntima, bem
como o estudo de efeitos potencialmente nocivos na biologia vascular e também em
lesões arterioscleroticas pré-existentes. É de especial relevo a descoberta de novas
estratégias farmacológicas anti-reestenose para serem utilizadas em combinação
com a tecnologia dos SLCF. A descoberta destes novos fármacos anti-reestenose
poderá ter uma aplicação em estudos pré-clínicos em modelos animais da
reestenose mais evoluídos (por exemplo, em artérias coronárias de suínos) bem
como uma importância imediata na área de cardiologia de intervenção.
222