Evaluation of the Topic Uses of Chondroitin Sulfate A

Trabalha de Pesquisa
Evaluation of the Topic Uses of Chondroitin
Sulfate A fCiprovetTMJ
as a Treatment to
Experimental Corneal Ulcer in Rabbits
José Joaquim Titton Ranzani'
Daniela Nogueira Cremonini2
Cláudia Valéría S. Brand8.oJ
Geórgia Nadalini Rodrígues4
Noeme Sousa Rachas
Rodrigo Mannarino6
Adalberto José Croccí7
-~-Ranzani JJT, Cremonini DN, Brandao CVS, Rodrigues GN. Rocha NS, Mannarino R. Croccí AJ. Avalia~iío do uso t6pico de 5ulfato de
condroitina A (Ciprove~
no tratamento de úlcera de c6mea experimental em coelhos. MEDVEP Rev Cienlif Med Vet Pequen05 Anim
Anim Estim 2004; 2(5):51.6.
\
Pretendeu-se avaliar a eficácia do sulfato de condroitina A como tratamento de úlceras de
córnea experimentais ern coelhos, analisando-se seu potencial antiinflamatório, alérn da redu~óo de tecido cicatricial por ele promovida. Utilizaram-se 15 coelhos, divididos ern tratados e
nóo tratados, subdivididos ern tres grupos de cinco animais cada, sacrificados no sétimo, 14° e
30° dias após a ceratedornia. Esta, do tipa lamelar, foi feíta ern ambos os olhos, sendo urn
deles tratado corn Ciprovet~ colírio (sulfato de condroitina A e ciprofloxacina associados) e o
contralateral, como controle, corn colírio de ciprofloxacina. Os olhos forarn avaliados quanto aos
sinais clínicos, bern como suas córneas, ern exame histopatológico. Quanto aos sinais, verificouse hiperernia de conjuntiva e blefarospasmo nos dois primeiros dias e teste de fluoresceína
pasitivo até, no máximo, o 5° dio. Nóo se observou diferen~a quanto aos sinais clínicos entre os
grupas tratados e nóo tratados. No corte histológico, puderarn ser vistos maior organiza~óo
lamelar, melhor distribui~óo de colágeno e fibrócitos e menor edema estromal, no grupo tratado corn Ciprove~ , indicando assirn urna cicatriza~óo mais eficiente.
PALAVRAS-CHAVE:
Úlcera da córnea/patologia;
Coelhos;
Sulfatos de condroitina.
.Apoio financeiro: FAPESP (Auxílio Pesquisa e Bolsa de Aprimoramento Técnjco -nívellll)
1 Docente do Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária -FMVZ -UNESP
-Botucatu,
Departamento de Cirurgia e -Veterinária
Botucatu, SP; e-mail: QUimOfmvz.unesp.br
2 Mestranda em Medicina Veterinária -Departamento
UNESP-
-FMVZ
-UNESP;
Dist. Rubiao Jr, s/n -CEP
de Cirurgia e Anestesjologia
Veterinária
SP;
18618.OQO.
-FMVZ
Botucatu, SP
-FMVZ
UNESP -Botucatu,
-Botucatu,
SP
-FMVZ-
SP
-UNESP
-FM-
MedveP
-UNESP
-Botucatu,
SP
UNESP -Botucatu.
SP
., -UNESP
-Botucatu.
SP
-
Pequenos Animais
e Animais de
2(5):51-6
-
INTRODU(;ÁO
A córnea é composta por quatro camadas:
epitélio, estroma, membrana de Descemet e
endotélio. Sua transparencia é atribuído a ausencia de vasos sangüíneos e pigmento,
ao
epitélio nao queratinizado e ao arranjo ordenado de suas fibrilas colágenas, as quais estao dispostas em laminas
paralelas
a superfície
corneana; seu grau de hidrata~ao também contribui para a sua transparencial,2. O estroma da
córnea é formado por fibrilas colágenas (Tipo I
e II), queratócitos e fibras nervosas amielínicas.
A matriz
extracelular
é composta
por
glicosaminoglicanos
(sulfato de condroitina/
dermatana, queratossulfoto,
ácido hialuronico)
e proteoglicanos, essenciais para a manuten~ao
da adequada hidrata~ao da córnea1,2. Similarmente a fun~ao dos condrócitos
no tecido
cartilaginoso, os queratócitos sao responsáveis
pela manuten~ao
e renova~ao
da matriz
extracelular,
secretando
o cológeno
e os
glicosaminoglicanos
(GAGS)2. Os GAGs sao
polissacárides de alto peso molecular, que podem
apresentar-se
como:
polímeros
monossulfatados,
entre eles o sulfato
de
condroitina;
polímeros
polissulfatados;
e
polímeros
nao sulfatados,
como o ácido
hialuronico2.
O proteoglicano e o cológeno tipo I constituem os principais componentes
do estroma
corneano. Os proteoglicanos ocupam a regiao
entre as fibrilas de colágeno e influenciam no
organiza~ao estromal. Assim, eles podem representar um importante papel no manuten~ao da
transparencia corneana3.
Os glicosaminoglicanos
sulfotados atuam
como antiinflamatórios, uma vez que inibem competitivamente
várias enzimas lisossomais
e
proteases, incluindo beta-glicosaminidase,
betaglucuronidase,
catepsina e elastase; também
possuem efeitos inibitórios
sobre o influxo
leucocitário, síntese de prostaglandina
E2, síntese de interleucina le forma~ao de complementos. Outro efeito desta substancia é estimular o
aumento do diametro das fibras colágenas, influenciando
assim sua matura~ao.
Portanto,
possui efeito condroprotetor, pois reduz a a~ao
enzimática destrutiva local, e estimula a regenera~ao da cartilagem.'5,6,7,8.
O sulfato de condroitina (SC) é um GAG
encontrado predominantemente
no cartilagem
articular e é um componente natural de diversos
outros tecidos corporais, como tendaes, ossos,
discos vertebrais, cora~ao e córnea9. Estimula a
52
MedveP
Revista
Científica
p Animais
de
de
síntese de GAG e proteogliconos por mecanismos intra e extracelulares 10.O SC também contribui para manter as características da cartilagem ao aumentar o pool de GAG usado pelo
condrócito para síntese de proteogliconos; em
adi~áo a este efeito restaurativo, a incorpora~áo-do SC a c9-"ilagem articular diminui o processo inflamotório, agindo diretamente sobre as
enzimos, inibindo o sistema complemento e a
atividade anti-prostaglondina11.12.
A ceratite ulcerativa, ou úlcera de córnea, é
caracterizada por processos erosivos superfici.
ais ou profundos no córnea, com perda de
epitélio e exposi~áo do estromo. Os agentes cau.
sois envolvidos com este tipo de ceratite sáo com
freqüencia os traumas, defeitos palpebrais, de.
sordens relacionadas com o sistema lacrimal,
além de infec~óes por fungos, bactérios e/ou ví.
rus. Os sinais mais evidentes sáo blefarospasmo,
fotofobia, epifora, edema, secre~áo ocular e
vasculariza~áo13.
Devida a diversidade de causas, os procedimentos terapeuticos seguem primordialmente
a identifica~áo e a elimina~áo da causa, tendo
como objetivo a restaura~áo e a preserva~áo da
córnea. Entre os procedimentos
clínicos
adotados, encontram-se a terapia antibiótico, os
analgésicos, os agentes lubrificontes, a atropina
e as drogas antiproteases (EDTA,acetilcisteína e
heparina). As úlceras que nao .respondem aos
tratamentos clínicos convencionais devem ser tratadas de forma cirúrgica, com ceratotomia, flap
de conjuntiva ou de terceira p6lpebra, tarsorrafia
ou aplica~ao de membranas biológicas13.14.
Outros trabalhos avaliaram o uso de SC15
e de glicosaminogliconos polissulfatados no tratamento de úlceras de córnea indolentes em
cáes16e cavalos17,mostrando serem uma alternativa terapeutica eficaz no trata mento de úlceras persistentes refratórias aos tratamentos convencionais.
Medicina
EstimacBo
OBJETIVOS
Avaliar a eficácia do sulfato de condroitina
A a 20% no tratamento de úlceras de córnea
experimentais
em coelhos, analisando-se
seu
potencial antiinflamatório,
além da forma~óo
reduzida de tecido cicatricial.
MATERIAL
E MÉTODO
Foram utilizados 15 coelhos hígidos, da
ra~a Norfolk, machos e femeas, com peso variando entre 2200 e 3000g, com idade variando
Veterinária
2004:
2(5):51-6
-Pequenos
Animais
9".'V ...V.. ...~---I ...,., , ~ o""'.. .,...'V
,tral do compus de Botucatu -UNESP. Foi realizado exame oftalmológico individual para exclusáo dos animais que apresentassem quaisquer
altera~óes. Finalmente, os animais foram identificados e mantidos em gaiolas individuais, onde
receberam ra~áo (Ra~áo para coelhos -Purina~)
e ógua a vontade.
Os coelhos foram inicialmente tranqüilizados com acepromazina* (1mg/Kg, IM) e, após
15 minutos, receberam tiopental**,
vio
intravenasa, até atingirem plano anestésico adequado para o procedimento. Procedeu-se, entáo, a ceratectomia lamelar em ambos os olhos,
demarcando-se a córnea com punch de 5mm de
diámetro e removendo-se o botáo com auxílio
de pin~a colibri e lámina de bisturi no15, para
excisáo de 1/3 da espessura corneana total, sob
mensura~áo de paquimetria.
O olho direito de cada animal foi tratado
com Ciprovet~**. colírio (sulfato de condroitina A
a 20% e ciprofloxacina a 0,3%) e o contralateral,
como controle, com colírio de ciprofloxacina.*.*,
no mesma concentra~áo. Instituiu-se tratamento
duas vezes ao dia no 1° dia e uma vez ao dia,
nos subseqüentes. Os animais foram subdivididos em tres grupos, de acordo com os períodos
de coleto das córneas, para avalia~áo
histopatológica oos 7, 14 e 30 dias. Os animais
foram avaliados, diariamente, com uso de ilumina~áo artificial direta, quanto aos seguintes sinais clínicos: fotofobia, blefarospasmo, quemose,
hiperemia conjuntival, secre~áo, opacidade e
neovasculariza~áo,além do teste da fluoresceína.
Estos a Itera~óes foram quantificodas de forma
subjetiva em: 0- ausente; 1 -leve; 2 -moderado; 3 -intenso; 4 -grovel8. Ao final de cada
período,
os onimais foram novamente
anestesiados, sob o mesmo protocolo, e em seguido sacrificados com 1Oml de cloreto de potássio em ba/us, via intravenoso, pora enuclea~áo e
posterior coleta das córneas. O exome
histopatológico foi realizado em microscopia de
luz com colora~áo de hemotoxilina-eosina e
tricrómico de Masson. Nesse exame avoliaramse parometros referentes o edema epitelial e
estromal, presen~a de abrosáo e células jovens
epiteliais, neoforma~áo vascular, infiltra~áo de
leucócitos mono e polimorfonucleares, prolifero~áo de fibrócitos e reorronjo das fibrilas de
col6geno, observados segundo observa~óesdescritas por Spencerl9 (1985) e Margot,
Grossniklous2° (1991 }. Estes parámetros
morfológicos foram ovaliados no mesmo padráo
utilizado poro os sinais clínicos.
RESULTADOS
Nóo se observaram, durante todo o tratamento, sinais defotofobia, neovasculariza~óo,
quemose ou presen~a de pigmentos. Quanto aos
sinois de blefarospasmo, hiperemia de conjuntiva
e sec~óo seromucosa, os animais apresentaramnos em grau leve a moderado, apenas no primeiro dio após a ceratedomia. O teste de fluoresceína
positivo foi obtido .em todos os animais até, no
máximo, o 5° dio, náo se observando diferen~a
entre os grupos tratados e nóo tratados.
A opacidade local, limitada apenas a área
ceratectomizada, permaneceu por todo o tratamento, sendo mais discreta após 15 dios do
mesmo. Todos os animais apresentaram este sino1 clínico, nóo se observando diferen~a entre
os grupos tratado e nóo tratado.
Nos cortes histopatológicos dos animais
sacrificados no sétimo dia, observou-se, no camada epitelial, grande quantidade de células
jovens, edema, células descamadas e áreas de
abrasóo, tanto no grupo tratado como no controle, sendo este quadro mais intenso neste último. Verificou-se, ainda, desorganiza~óo lamelar
e edema estromal, além de intensa prolifera~óo
de fibrócitos e fibrilas de colágeno, sendo que
no grupo controle houve maior edema e desorganiza~óo lamelar e menor prolifera~óo de
fibrócitos e fibrilas de colágeno.
Nas córneas coletadas no 14° dia, mantiveram-se as altera~óes observadas na fase anterior (sétimo dio), porém, com menos intensidade, principalmente em rela~óo as 6reas de
descama~óo ea desorganiza~óo lamelar, sendo
mais intensas no grupo controle.
Na última fase (30° dia), as 6reas de
descama~óo estavam muito reduzidas e as células jovens e o edema estavam presentes, mas
em menor intensidade. A rela~óo entre as altera~óes estromais dos grupos controle e tratado
manteve-se, sendo, também, menos intensa que
nos outras fases.
ANÁLISE
ESTATísTlCA
Paro cada variável avaliada no experimento e representada por escores, foram utilizados
'.'Labyes.Argentirla
'-*Biamotil(AlIergan.Frurntost)
'Acepran(Unívet)
'"HypnoI (Clis1áliaj
MedveP
-Revista
Científica de Medicina Veterinária .Pequenos
e Animais de Estima~ao 2004; 2(5):51-6
Animais
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~
testes noo-paramétricos21 visando a compara~oo do efeito de momentos em cada olho, pelo
teste de Friedman, e do efeito nos olhos em cada
momento, pelo teste de Wilcoxon. O nível de
significancia adotado foi de 5% de probabilidode. Mostrou-se significancia (p<0,05) apenas
entre os resultados histopatológicos oos 14 e
30 dios, mos nao entre os grupos.
,~-'"
FIGURA
1: ÚIcelademnea~~n0018scelna.
24hapós~lamelar
FIGURA 2; Fotomicrogralia
comeMIB do oiho esquelOO aos 7 díaS; observar os def9itos
na reepíteIiza¡;ao (HE. 2OOX).
---~
FIGURA 3: FotomicrografiacomeanaOOcitH1mr&1oaos
--~.--"
14dí8s(HE,
200X).
FIGURA.:
Fotomicrogr&fía
comeana doolhoesquerrJo
Figura 3} ; tx¡IBf O edema eslromal e desorganíz8fio
PBrBdos 80$ do oiho contra/ateral
FIGURA5: FotomiCIOgIiIfiacomeana ¡jJ dho diI8#oaos 14 mas (tlÍCfOmiC()
de Masson..
2OOX).Notaro 8mHJjo~
0IyaIWzaIXJ
que /18Figura6, 19fB18111e
~ d/K) cootraiateraI¡jJ
mesmoanimal.
80$14 días (mesmoanim81
da
lameIar mais intensos qU8l1do CCHII-
(HE. 200X).
FIGURA 6: Fotomicrograti8comeana 00 oiho esquerdo 808 14dias (mesmo animal da
Figura 5); notar o deS8I78/Ijolamelar,princip8/menleptúximo a membranab8s8/epitelial
(~
de Masson. 200X).
DISCUssAo
Quanto aos efeitos antiinflamatórios do
sulfato de condroitina A, pouco póde-se observar, comparativamente, entre os grupos, visto que
a cerotedomio 10melar induziu pouca ou nenhuma reo~óo inflamotória local, por se trator de
54
..~
MedveP
-Revista
um procedimento estéril, pouco abrasivo au
agressivo. Por este mesmo motivo, os sinais clínicos observados foram muito superficiais, sendo a rea~áo inflamatória mínima, com ausencia
de edema 00 redor da lesáo, neovasculariza~áo,
0Científica
de Medicina
e Anlmais
de Estima~ao
Veterinária
-Pequenos
2004;
2(5):51-6
Anlmais
fotofobia, quemose, blefarospasmo intenso, pigmenta~áo ou hiperemia conjuntival persistente.
Quanto aos sinais de blefaraspasmo, hiperemia
de conjuntiva e secre~áo seramucosa, as ani.
mais apresentaram-nas em grau leve a moderado, apenas no primeiro dia após a ceratedomia.
A reepiteliza~áo ocorreu até o 5° dia, corroborando as observa~óes de Rawe et a/.22
(1992), náo se observando diferen~a entre os
grupos tratados e náo tratados. Segundo
Spencer19(1985), a regenera~áo epitelial ocorre
de modo extremamente rápido, sendo que a
córnea desnuda é recoberta dentro de 4 a 7 dias.
A opacidade local, limitada apenas a área
ceratedomizada, permaneceu por todo o tratamento, sendo observada também por Roweet a/.22
(1992). Esta opacidade é causada pelo edema
corneano associado a irregularidade das fibrilas
de colágeno19. Todos os animais apresentaram
este sinal clínico, náo se observando diferen~a
entre os grupos tratado e náo tratado.
A avalia~áo histológica foi baseada nos altera~óes citadas por Spencer19(1985) e Margot,
Grossniklaus2°( 1991).Nos cortes histopatológicos
da camada epitelial, a grande quantidade de células jovens, edema, células descarnadas e áreas
de abrasáo, foi mais significativa no grupo controle. Neste mesmo grupo, edema mais intenso
também foi observado, tanto no meio intra como
no extracelular, ocorrendo principalmente próximo a membrana basal e caraderizado pela colora~áo pálida do citoplasma celular e das áreas
náo preenchidas por epitélio, retratando igual observa~áo de Spencer19(1985).
Assim, tambérn, a intensa desorganiza~áo
lamelar e o edema estromal, associados a redu-
zida prolifera~óo de fibrócítos e fibrilas de
colágeno, foram observados no grupo controle,
comporativamente ao grupo tratado. A ausencia
de neovasculariza~óo ou de polimorfonucleares,
a nóo forma~óo de tecido cícatricial, caracterizado pela presen~a de tecido conectivo com arranjo irregular, c~Jroboram as informa~óes de
Spencer!9 (1985).
.Rawe et 0'}2 (1992) e Lance et 0/.23(1988)
relataram uma alta densidade de fibrócitos próximo a área lesada, principalmente após 7 a 14
dias da ceratectomia, como foi observado nos
cortes histológicos referentes a estes períodos.
Lance et 0'.23 {1988) observaram a presen~a de neutr6filos no estrama anterior, próximo a
área lesada, ao contrário do que foi observado
aos 7, 14 e 30 días após ceratectomia.
Apesar da análise estatística nóo apresentar diferen~as significativas entre os grupos tratado e nóo tratado, considerou-se a avalia~óo
histopatol6gica relevante, visto que o número de
animais utilizados é reduzido, de modo que nóo
fornece varia~óes numéricas suficientes para indicar estas diferen~as.
CONCLUsAo
Quanto aos efeitos antiinflamatórios do
sulfato de condroitina A a 20%, no trata mento
de úlceras de córnea em coelho, pouco se p6de
observar, comparativamente ao grupo controle.
Este estudo, porém, mostrou efic6cia no uso tópico de sulfato de condroitina A, quanto a organiza~áo cicatricial do tecido estromal, caracterizando sua a~áo sobre o tecido composto por
col6geno.
~~
~--~
-c_-Ranzani JJT. Cremonjni DN. Brandio CVS. Rodrigues GN. Rocha NS. Mannarino R. Crocci AJ- Evaluation of Ihe topic uses of chondroitin
sulfate A (Ciprovet"'. as a treatment to experimental comeal ulcer in rabbits, MEDVEP Rev Cientif Med Vet Pequenos Aním Anim Estim 2004;
2(5):51-6.
The obiective of this test was to measure the efficacy of chondroitin sulfate A as a treatment to experi.
mental corneal ulcer in rabbits. We observed, through exams, its anti-inflammatory
potential, as well as
a reduction of cicatricial tissue. We utilized 15 rabbits that were divided into two categories: treated and
non-treated. The rabbits were also subdivided into three groups with five animals, on the seventh, 151h
and 30'h days after lamellar ceratectomy. This one was done in both eyes. Only one eye was treated
with Ciprovet'M eyewash (chondroitin sulfate A and ciprofloxacin associated) and the other, as a control,
was treated only with ciprofloxacin. The eyes were evaluated as for clinical signs and its corneas underwent
a histopathology
exam. The signs observed were: hyperemic coniunctiva and blefarospasm in the two
first days, and a positive fluorescein test within the following five days. There were no real significant
differences in the clinical signs obtained from the treated and non-treated groups. In the histological
exam, though, there was more lamellar organization,
and a better collagen and fjbrocytes distribution.
There was less stromal edema in the group treated with CiprovetTM, with indicatjon of a more efficjent
cicatrisation.
KEYWORDS:
Corneal
MedveP
ulcer/pathology;
-Revista
Rabbits;
Científica
e Animais
Chondroitin
de
de
Medicina
Estima<;ao
sulfates.
Veterinária
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Animais
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