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5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Breve histórico sobre potenciais elétricos em nervos e músculos, parte 2
Os principais elementos da teoria da membrana de Bernstein são os seguintes:
1. As células nervosas são compostas por um interior eletrolítico circundado
por uma fina membrana cuja permeabilidade iônica é seletiva.
2. No repouso, existe uma diferença de potencial elétrico através da membrana
da célula. Esse potencial de repouso não depende de processos metabólicos.
3. O potencial de repouso é gerado devido à seletividade da membrana no
repouso apenas aos íons de potássio. A concentração dos íons de potássio é
maior do lado de dentro da célula do que do lado de fora e essa diferença de
concentração causa difusão dos íons de potássio através da membrana.
A difusão provoca uma diferença de potencial através da membrana cujo
valor de equilíbrio (repouso) é dado pela equação de Nernst,
!" K + #$
RT
E=
ln + fora .
!" K #$
F
dentro
(1)
Este potencial de repouso torna-se acessível experimentalmente pela secção
transversal de um nervo, ou seja, ele é o potencial de injúria responsável
pela corrente de injúria.
4. Durante a excitação da célula, a permeabilidade da membrana aumenta de
forma generalizada para todos os íons (ou seja, a membrana torna-se
permeável aos íons que antes estavam impedidos de passar por ela no
repouso) e isso leva à diminuição ou ao desaparecimento da polarização
existente previamente (despolarização). Esta é a causa da “variação
negativa” de du Bois-Reymond.
1
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A figura abaixo fornece um esquema da teoria de Bernstein.
394
PICCOLINO
FIG. 8. Scheme of Bernstein’s theory of membrane polarization. (a) A muscle fiber in the resting state, with an excess of negative charges inside
the membrane and of positive charge outside; (b) a lesion has removed the local barrier to ion passage provided by the membrane, and, therefore,
A becomes negative with respect to B, allowing for a current flow from B to A. According to Bernstein [15], a similar phenomenon would occur
during excitation A representing then the active region of the membrane (From [15]).
Esquema da teoria da membrana de Bernstein. a. Célula nervosa ou fibra
state, excitable cells generated a diffusion potential across their
The English School: Lucas and Adrian
these ions in the intracellular compartment compared to the extracellular medium. According to Bernstein, the potential arose because the outward movement of the positive-charged potassium
ions could not be compensated by movements of other ions,
because of the exclusive permeability of the membrane for potassium. This tended to leave an excess of negative charges in the
interior of the cell and to create an excess of positive charges
outside (Fig. 8a and b).
To account for the excitatory events in nerve and muscle,
Bernstein assumed that the excitation consisted in a disappearance
of the polarization present in the resting state (i.e., in a “depolarization”) consequent to a sudden and generalized increase of the
ion permeabilities of the membrane. Bernstein’s theory will be
referred to as membrane theory of excitation, and one of its
implications, confirmed by later studies (see later) was that membrane electrical resistance decreased during excitation [15].
With Bernstein the focus on electrical phenomena of excitable
cells was, therefore, based clearly on the properties of the cell
membrane. This still undefined surface of separation between the
intracellular and extracellular media started to acquire a physico–
chemical connotation. Apparently one of the reasons that led
Bernstein to develop his membrane theory of nerve excitation was
the consideration of the similarity between the negativity of the
current measured from an injured nerve and the negativity of the
action current. Because injury was likely to produce an “exposure”
of the nerve interior to the recording electrode, it could be assumed
that a similar phenomenon occurred during the “negative oscillation” and therefore that nerve (and muscle) excitation consisted in
a reversible “rupture” of the membrane separating the intracellular
and extracellular media.
of electrical excitability was mainly due to the work of English
physiologists. A fundamental acquisition concerned the “all-ornothing” character of electrical excitation in nerve and muscle.
This character, whose origin can be traced to the work of Felice
Fontana [28,29,68], had already emerged from studies carried out
on heart muscle in 1871 by the American physiologist H. P.
Bowditch working in Carl Ludwig’s laboratory in Leipzig [17].
Bowditch noticed that if an electrical stimulus applied directly to
the isolated apex of frog heart was capable of inducing a contractile response (i.e., if its intensity was larger than a minimum
value), the strength of contraction remained constant when the
intensity was further increased. On the other hand, stimuli of
intensity smaller than the minimum effective value did not result in
any detectable contraction. For several years this “all-or-nothing”
property seemed, however, to belong exclusively to the heart
muscle, because the strength of contraction elicited in a striated
muscle, stimulated either directly or through its motor nerve,
increased apparently in a relatively smooth way by increasing the
stimulus intensity. In 1902, Francis Gotch put forward the hypothesis that this pattern was basically due to an increase of the number
of excited fibers, rather than an increase of the response amplitude
in any excited fiber, which he supposed to be a constant quantity
[37]. Following Gotch, Keith Lucas, working in Cambridge, succeeded in showing that other electrically excitable tissues indeed
follow the “all-or-nothing” law. In 1905 he reduced, by careful
dissection, the number of active muscle fibers in the dorso-cutaneous muscle of the frog to 20 or less, and excited the muscle
directly with an electrical stimulus. By increasing the intensity of
the stimulus he found that the strength of the resulting contraction
membrane
as a consequence
the selective permeability
of the excesso de cargas negativas do lado de
muscular no
estado
de ofrepouso.
Há um
After Bernstein the progress of knowledge on the mechanisms
membrane for potassium ions and of the higher concentration of
dentro da membrana e um excesso de cargas positivas do lado de fora. b. Uma
lesão na extremidade esquerda (região indicada por A) remove localmente a
membrana, que impedia a passagem de íons, e, portanto, a região A torna-se
negativa com relação à região B, de maneira que uma corrente pode fluir de B
para A. De acordo com Bernstein, um fenômeno similar ocorreria durante a
excitação da célula ou da fibra e, neste caso, A representaria a região ativa da
membrana.
O aspecto mais importante da teoria de Bernstein foi a valorização da
membrana neuronal como essencial para o entendimento dos fenômenos
elétricos nas células nervosas, mesmo que ainda pouco se soubesse na época
sobre as propriedades da membrana.
2
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O mais curioso, porém, sobre o modelo de Bernstein é que ele considerou apenas
o potássio como o íon mais importante e desprezou a reversão na polarização que
ele mesmo tinha observado experimentalmente em 1868. Por causa disso, a sua
teoria
permaneceu
incompleta,
considerando
apenas
um
dos
aspectos
fundamentais responsáveis pelo comportamento elétrico da membrana neuronal.
Sabemos atualmente que durante o repouso da célula a permeabilidade da
membrana ao potássio é dominante, mas durante a fase de excitação a
permeabilidade ao sódio torna-se transientemente dominante. Foi necessário
esperar aproximadamente mais meio século depois da teoria de Bernstein para se
chegar a uma teoria de membrana mais completa e satisfatória.
O próximo passo importante nessa história foi a constatação experimental de que
a excitação elétrica em nervos e músculos é um fenômeno do tipo tudo-ou-nada.
A emergência desse conceito pode ser datada dos estudos sobre o músculo
cardíaco feitos em 1871 pelo fisiologista norte-americano Henry P. Bowditch
(1840-1911) quando ele estagiou no laboratório do fisiologista alemão Carl
Ludwig (1816-1895) na Universidade de Leipzig.
Bowditch observou que se um estímulo elétrico fosse aplicado diretamente ao
ápice do coração de sapo isolado isso seria capaz de induzir uma contração.
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Para tal, a intensidade do estímulo elétrico tinha que ser maior que um dado valor
mínimo e a força da contração era sempre a mesma independente de aumentos na
intensidade do estímulo acima desse mínimo. Estímulos abaixo do valor mínimo
não provocavam nenhuma contração detectável.
Por vários anos essa característica tudo-ou-nada parecia ser uma propriedade
exclusiva do músculo estriado cardíaco. Estudos feitos com músculos estriados
esqueléticos, estimulados diretamente ou via seu nervo motor, mostravam que a
força da contração crescia de forma graduada (suave) em função da intensidade
do estímulo.
Em 1902, o neurofisiologista inglês Francis Gotch (1853-1913) apresentou a
hipótese de que o comportamento de excitação seria do tipo tudo-ou-nada
também para as fibras musculares esqueléticas.
Segundo Gotch, a não observação de um comportamento do tipo tudo-ou-nada
quando se estimula um pedaço de músculo esquelético seria porque ele é
composto de muitas fibras.
Embora cada fibra responda a um estímulo com uma excitação constante
independente da intensidade do estímulo, o que era medido nos experimentos da
época era a resposta coletiva de todas as fibras. Ou seja, o crescimento gradual
detectado seria apenas o crescimento do número de fibras individuais excitadas
por estímulos cada vez mais intensos.
4
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A maneira de testar essa hipótese seria conseguir isolar poucas fibras musculares
esqueléticas para testar sua resposta.
Esse teste foi feito pelo fisiologista inglês Keith Lucas (1879-1916) na
Universidade de Cambridge em 1905.
Lucas conseguiu reduzir, por dissecação cuidadosa, o número de fibras
musculares do músculo dorso-cutâneo do sapo a 20 ou menos e realizou
experimentos em que excitava o músculo diretamente com um estímulo elétrico.
Ao aumentar a intensidade do estímulo, Lucas observou que a força da contração
resultante aumentava em passos discretos cujo número era, em geral, menor que o
número de fibras musculares em sua preparação.
Em 1909 Lucas repetiu seu experimento, mas agora estimulando o músculo por
um estímulo aplicado ao nervo motor (composto por apenas 9 ou 10 fibras
nervosas). Novamente a resposta contráctil aumentava em passos discretos cujo
número era sempre menor do que o número de fibras nervosas (figura a seguir).
5
LUIGI GALVANI AND ANIMAL ELECTRICITY
5910187 –
395 15
Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula
FIG. 9. The 1909 experiment of Lucas and the all-or-nothing law. The abscissa represents the strength of the electrical stimulus applied
to the motor nerve and the ordinate the mechanical response of the muscle (height of the contraction of the cutaneous dorsi muscle of
the frog). Notice the step-like transitions in the muscle response as the intensity of the stimulus is increased within a critical range (From
[76]).
Figura retirada do artigo de 1909 de Lucas, intitulado “A contração “tudo ou
nada” da fibra muscular esquelética de anfíbio”. A abscissa representa a força do
increased in discrete steps, whose number was in general less than
the number of active muscle fibers [74].
In 1909 Lucas made a comparable experiment using a similar
preparation but elicited muscle contraction through a stimulus
applied to a motor nerve [76]. Again the contractile response
increased in discrete steps whose number was normally smaller, in
this case, than the number of the active nerve fibers (Fig. 9).
A direct demonstration of the all-or-nothing character of the
propagated electrical signal in nerve emerged from the first recording of the electrical activity of single nervous fibers, an epochmaking discovery obtained by Lucas’ student, Adrian in 1926.
Adrian, in his first study, using the capillary electrometer and a
vacuum tube amplifier, succeeded in revealing the presence of
individual electric oscillations in the discharge of various sensory
fibers of both frog and cat in response to physiological stimulation
[4] (Fig. 10A–C). In a second study, carried out in collaboration
with Zottermann [6], in order to better isolate the electrical activity
of a single fiber, Adrian made recourse to the nerve supplying the
sterno-cutaneous muscle of the frog on the assumption that this
muscle might contain just one muscle spindle. If the muscle was
cut carefully in order to minimize the number of active sensory
units, and a low mechanical load applied, the response recorded
from the nerve consisted in a rather regular train of impulse-like
deflections of constant amplitude and duration, which were shown
to represent the activity of a single sensory fiber. Increasing the
intensity of the stimulus led to an increase of the discharge frequency without any change of amplitude and duration of every
individual impulse. These features were later confirmed in a variety of nervous (and muscular) fibers leading to the understanding
that an impulse-code modulation is the ordinary means used by
many nerve fibers (and by other excitable cells) to code information.
Another property of the nervous signal, somewhat related to the
all-or-nothing feature, was revealed by the results of other experiments carried out by Lucas and Adrian. In these experiments
small segments of nerve were more or less completely inactivated
by exposure to alcoholic vapors or to other procedures interfering
with the conduction process [1,2,5,77,78]. In a frog nerve-muscular preparation, a long exposure time was necessary to produce the
conduction block if the treatment was applied to a short nerve
segment. A much shorter time was effective in blocking the nerve
if a long segment was exposed. However, if the treatment was
applied to two similar short segments, separated by a relatively
large untreated portion, the time of application needed to produce
the block corresponded closely to that necessary in the application
to a short single segment (Fig. 11a and b). Clearly, in the untreated
portion the signal was regenerated, regaining its original amplitude, if the block did not exceed a certain value. The words Lucas
wrote with reference to Adrian’s experiments penetrate a fundamental aspect of the “energetics” of nerve signal propagation, and
are worth quoting at length:
“A disturbance, such as the nervous impulse, which progresses
in space must derive the energy of its progression from some
source; and we can divide such changes as we know into two
classes according to the source from which the energy is derived.
One class will consist of those changes which are dependent on the
energy supplied to them at their start. An example of this kind is
a sound wave or any strain in an elastic medium which depends for
its progression on the energy of the blow by which it was initiated.
A sound wave will lose its initial energy if the medium in which
it progresses is imperfectly elastic, because the medium will be
heated in its deformation. Suppose a sound wave travelling
through air and then encountering a tract of treacle. In this passage
through the treacle it will lose its energy more rapidly than in the
passage through the air, but on emerging into the air again it will
have suffered permanent loss, and will not recover the energy
which it had before it entered the treacle. A second class of
progressive disturbance is one which depends for its progression
on the energy supplied locally by the disturbance itself. An example of this type is the firing of a train of gunpowder, where the
liberation of energy by the chemical change of firing at one point
raises the temperature sufficiently to cause the same change at the
next point. Suppose that the gunpowder is damp in part of the train;
in this part the heat liberated will be partly used in evaporating
estímulo elétrico aplicado ao nervo motor e a ordenada representa a resposta
mecânica do músculo (altura de uma alavanca levantada pela contração do
músculo). Observe o crescimento em degraus da resposta para estímulos acima de
um valor mínimo.
Infelizmente, Lucas morreu aos 37 anos em combate aéreo durante a Primeira
Guerra Mundial e não pode continuar seus estudos científicos.
A linha de pesquisa iniciada por ele foi continuada por seu estudante, e mais tarde
professor da Universidade de Cambridge, o eletrofisiologista inglês Edgar Adrian,
Lord Adrian, (1889-1977).
Em 1926, Adrian realizou um experimento para medir a atividade elétrica de tipo
tudo-ou-nada de uma única fibra nervosa.
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5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Em seu experimento, Adrian usou um eletrômetro capilar e um amplificador a
válvula. Antes de passar à descrição do experimento e seu resultado, vamos
descrever abaixo o que é um eletrodo capilar, um dos mais importantes
instrumentos usados para medir diferenças de potenciais elétricos entre o fim do
século XIX e as primeiras décadas do século XX.
O eletrômetro capilar foi inventado pelo físico francês Gabriel Lippmann (18451921) em 1872. O seu funcionamento se baseia nos fatos de que (1) existe uma
diferença de potencial na interface entre mercúrio e ácido sulfúrico diluído e que
(2) a tensão superficial nessa interface muda quando a diferença de potencial
entre os dois fluidos é alterada.
A figura da página seguinte (esquerda) mostra o esquema do eletrômetro capilar
de Lippmann.
O eletrodo capilar foi muito usado no fim do século XIX e início do século XX
para medir diferenças de potencial entre diferentes pontos da superfície do corpo
de humanos e animais.
Em particular, ele foi usado pelo fisiologista inglês Augustus D. Waller (18561922) para fazer o primeiro registro eletrocardiográfico em 1887 (figura da
esquerda a seguir, parte de baixo).
7
se of the variations in electric potential of the frog heart obtained by Bernsteinís
odification of the DuBois-Reymond instrument. The first to record electric potentials
– Biofísica
II –Waller
FFCLRPin
– USP
– Prof.
Antônio
g heart from the body surface was 5910187
Augustus
Desiree
1887
- 1888
[6].Roque – Aula 15
studies using the capillary electrometer invented by the French physicist Gabriel
ure 1 depicts the capillary electrometer.
meter as constructed by Lippmann in 1873. Its function is based on the principle of polarization
rcury-sulfuric
acid interface.
potentials(figura
are sensed
the two wires
with
the é
Eletrômetro
capilarElectric
de Lippmann
da by
esquerda,
topo).connected
Um tubo
capilar
ercury. If the potential difference changes, the mercury meniscus will be moving. The position
com mercúrio
e ácidoonto
sulfúrico
diluído.
potenciais
elétricos
observedpreenchido
by a microscope
or be projected
a screen.
If thatOs
screen
is covered
with no
he screen is moved perpendicular to the axis of the capillary, time varying potential differences
e no ácido
sulfúrico
diluído The
são lower
medidos
eletrodos
colocados
ensitive mercúrio
screen as function
of the
length (x-axis).
part por
of the
figure shows
three em
rking at contato
every 50com
ms, in
middle
the cardioscope
e is theentre
electrometer
osthe
dois
fluidos.
Quando a recording
diferençaand
detrace
potencial
os dois se
altera, as bordas do menisco de mercúrio se movem. A posição do menisco pode
ser observada com um microscópio ou projetada numa tela.
Se a tela for recoberta com algum material fotossensível e puder ser posta em
movimento perpendicularmente ao eixo do capilar, as variações temporais da
diferença de potencial podem ser registradas na tela fotossensível em função do
comprimento (eixo-x).
8
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
A parte de baixo da figura da esquerda mostra três traços: o indicado por t indica
o tempo, marcado a cada 50 ms; o do meio é o registro com o cardioscópio (um
instrumento que mede os deslocamentos mecânicos do coração); o de baixo é o
registro com o eletrômetro feito por Waller em 1887.
A figura da direita da página anterior ilustra o princípio de registro da diferença
de potencial entre os lados direito e esquerdo do corpo com o eletrômetro capilar.
Nas palavras do próprio Waller para a audiência de um congresso internacional de
fisiologia na Basiléia, Suíça (1889):
“O disco de luz sobre a tela transparente em frente a vocês é do campo de um
microscópio iluminado por trás. A sombra vertical é de um tubo capilar fino com
uma metade cheia com mercúrio e a outra metade cheia com ácido sulfúrico, isto
é, um eletrômetro capilar de Lippmann. Os baldes de água salgada nos quais eu
agora imerso minhas mãos estão conectados aos dois polos do eletrômetro, o
balde onde está a mão direita ao ácido sulfúrico e o onde está a mão esquerda ao
mercúrio. Vocês veem que o mercúrio pulsa com um ritmo que, obviamente, é o
do meu coração. E aqueles que estiveram mais perto da tela poderão distinguir
que a cada batida há um movimento duplo da coluna de mercúrio”.
9
Between 1893 and 1896 George J. Burch and Willem Einthoven developed methods of calibrating and
correcting records obtained from the capillary electrometer and predicted finally a signal shape which was close
to the ìtrueî ECG shape [9] (see 5910187
Figure 3).–Einthovenís
electrocardiographic
in 15
Biofísica IIdenomination
– FFCLRP –ofUSP
– Prof. Antôniowaveforms
Roque – is
Aula
use until today.
By means of the capillary electrometer Waller investigated systematically the potential distributions associated
with the beating heart on man and animals. Figure 2 depicts a display from Wallerís original publication in 1887
Fig. 3. Electrocardiographic
notation suggested by Einthoven, which resulted from his work with the capillary electrometer
[6, 8].
and which is very similar to that in use at present time (see Einthoven, W. [9]).
It deserves our unrestricted admiration that and how these scientists (without the tools of modern systems
theory) predicted the ECG signal just by ìthinkingî before its shape has been confirmed so brilliantly by the next
generation of electrical measurement instruments.
Fig. 2. Distribution of negative and positive potentials on human and animal body surfaces. Waller even predicted the
reversal of the electrical pattern in case of situs inversus [6, 7].
Between 1893 and 1896 George J. Burch and Willem Einthoven developed methods of calibrating and
A figura acima
(topo) mostra um registro do potencial cardíaco feito com um
correcting records obtained from the capillary electrometer and predicted finally a signal shape which was close
to the ìtrueî ECG shape [9] (see Figure 3). Einthovenís denomination of electrocardiographic waveforms is in
eletrômetro capilar
pelo médico e eletrofisiologista holandês Willem Einthoven
use until today.
(1860-1927). A parte de baixo da figura mostra um eletrocardiograma (ECG)
feito pelo mesmo Einthoven com a notação das formas de onda introduzida por
ele e usada até hoje. Note que o traço obtido pelo eletrômetro capilar não é muito
diferente do ECG.
10
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Voltando à nossa história, em 1926 Lord Adrian realizou pela primeira vez na
história o registro da atividade elétrica de uma única fibra nervosa. Ele trabalhou
com o nervo ciático do sapo dissecado de tal forma que apenas duas ou três fibras
83
IMPULSES IN PHRENIC NERVE FIBRES.
ficavam expostas ao registro (figura abaixo).
across by pressure with a fine hook (Fig. 1 C) and the central strand is
then split in the same way. The object of the dissection is to leave a few
Fig. 1. Method of dissecting nerve so as to divide all but two or three fibres.
fibres in the middle of the nerve intact but separated as far as possible
from one another. If this is accomplished, the remaining fibres are
divided until
,cautiously
smallest
is left joining
two
A estimulação
do músculo
era only
feitathepor
um strand
peso preso
a ele,theesticando-o.
Os
ends of the nerve (Fig. 1 D). We have rarely attempted to carry the
to the stage aatexistência
which only de
one oscilações
fibre is left undivided.
One
resultados de dissection
Adrian revelaram
elétricas individuais
nas
fibre chosen at random might turn out to be afferent and not motor, and
it isdo
much
harder
isolate a asingle
fibre than to(figuras
isolate a A,
three
group
fibras nervosas
sapo
em to
resposta
estimulação
B of
eC
a seguir).
or four. The electrical records usually provide sufficient evidence of the
number of motor fibres in action, and the actual number of undivided
fibres can be checked by microscopical examination after the experiment
As figuras A,is B
eC
seguirofsão
os primeiros
registros
publicados
over.
Theanumber
undivided
fibres has always
been greater
than theda atividade
-number of motor fibres which appear to be in action in our records.
elétrica unitária The
em process
fibrasofnervosas
por estímulos
dissection sensoriais
and still moreeliciadas
the subsequent
manipulationfisiológicos.
of the nerve might be expected to prove rapidly fatal to the few fibres
As respostas which
elétricas
obtidas
comtheum
eletrômetro
capilar
colocado em
the gap, but
bridge foram
fortunately
connective
tissue sheath
(which
has been split but not cut transversely) acts as a most effective splint and
contato com prevents
o nervo
sapo e aIn fact
ativação
foi feita por
undueciático
tension ordo
displacement.
the nervedo
can nervo
be handled
as though it were still undamaged, and the surviving fibres give a disestimulação mecânica
(um
peso)
do músculo
gastrocnêmio.
charge which
shows
no signs
of alteration
for periods as long as two
hours.
Each stage in the dissection is controlled by observing the impulse
in the nerveédistal
discharge
the division. The
distal portion
O traço acima
dos registros
umato calibração
temporal
feitais slung
com onum diapasão
two small paint brush electrodes (cf. Adrian and Zotterman(6)), the
proximal connected
earth and the distal to the input of the three valve
oscilando à frequência
de 200toHz.
amplifier described elsewhere(7). The amplified action currents can be
photographed with the capillary electrometer, but until the final stages
are reached it is usually more convenient to lead them to a telephone or
11
6-2
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396
FIG. 10. The first published recording of unitary electrical activity in
sensory nerve fibers elicited by physiological stimuli. The electrical responses were derived with a capillary electrometer from the sciatic nerve
of frog, and a mechanical stimulus applied to the gastrocnemius in order to
activate muscle sensory receptors therein. The trace above the recordings
is a time calibration provided by a tuning fork oscillating at the frequency
of 200 Hz. (A) Control, nerve killed near the muscle, no response; (B)
muscle relaxes, no weight, no response; (C) wt. of 100 g applied for 10 s:
clearly detectable, upward pointing deflections appear in the recording
trace (From [4], modified).
PICCO
essentially an electrical phenomenon. As a matter of fact, al
it was generally recognized that nerve excitation was con
associated with an electrical event, it was still unsettled w
electricity was the fundamental process of nerve signal
simply one of its many possible manifestations (such a
production, chemical modifications), a sort of epiphenome
an underlying, more essential, process.
It may seem surprising that the electrical nature of nerve
was still matter of debate more than one century after Galva
long after Matteucci and du Bois-Reymond. As a matter
theories of nerve conduction giving a predominant import
chemical mechanisms have, for a long time, challenged hyp
based on the preeminence of electrical phenomena. For inst
1946, Nachmansohn proposed that acetylcholine could ser
“messenger” for the conduction of the nerve impulse [89] a
hypothesis has persisted in the paths of science as late a
[90].
The unequivocal evidence that the nervous signal is fun
tally an electrical event, as Galvani had supposed at the end
18th century, had to await for the most modern epoch of e
physiology (i.e., the period of studies of nerve physiology
out by Hodgkin and his collaborators in Cambridge), which
the final elucidation of the mechanism underlying the gen
and propagation of the nerve signal. However, the seeds
modern development can be traced back to the work of Lu
Adrian.
Before considering some aspects of this work in det
should recognize that the difficulties in accepting the view
nerve signal is an electrical event were not without
grounds. The conduction of the nervous signal seemed to
slow for an event based on the propagation of a typical el
signal along a metallic wire. Moreover, starting from the
observations of von Helmholtz [44,47], it appeared that te
ture exerted a profound effect on the rate of propagation of n
impulses [101,102], and evidence had been accumulating p
to a strong temperature dependence of other kinetic parame
the propagated nervous disturbance [3,10,18,38,75]. Bec
high temperature coefficient was generally considered to
indication of the involvement of chemical reactions, these fi
led to envisioning the nervous impulse fundamentally as a
ical event [72], although the straight-forward applicability
reasoning to the case of the phenomena of cell excitati
conduction was questioned by some authors [3,72].
From the studies of Adrian, Lucas, and their predece
appeared increasingly evident that the electrical stimuli of in
insufficient to generate the “propagated disturbance” (o
threshold in modern terminology) were nevertheless cap
increasing the electrical excitability of a narrow segment o
around the point of application, and for a limited time d
[1,2,5,77,78]. A stimulus that was subthreshold if applied
could lead, through this mechanism, to the appearance of
developed nerve signal if applied in combination with
similar stimulus. Besides, this explained why a train of el
stimuli could be more effective in stimulating a nerve
compared to a single electrical pulse [5]. These findings sug
that “local responses” did not follow the all-or-nothing
propagated responses did. The different character of the tw
nomena was also evident in that the arrival of a prop
response was followed by a temporary reduction of loca
ability (a phenomenon already recognized in the heart mu
Felice Fontana [29,68], and denoted as the “refractory pha
Marey in 1876 [80]). This reduced excitability contrasted w
increase in electrical excitability which, as we have seen, ap
to be associated with weak stimuli. On the other hand, n
standing the obvious differences between local and prop
A. Controle. Nervo morto próximo ao músculo, sem resposta. B. Músculo
relaxado (sem peso), sem resposta. C. Peso de 100 g aplicado por 10 s. O traço
mostra claramente várias deflexões.
water, and the temperature rise will be less, so that the progress of
the chemical change may even be interrupted; but if the firing does
just succeed in passing the damp part, the progress of the change
in the dry part beyond will be just the same as though the whole
train had been dry [78].”
From the studies of Adrian and Lucas, it became increasingly
evident that the amplitude and time course of the propagated signal
in nerve and muscle depend in an essential manner on the local
conditions of the nerve region in which it is recorded (or otherwise
tested), and not on the intensity of the stimulus, nor on the
conditions of the nerve region from which it originates (provided
that the stimulus is of sufficient intensity and the propagation is not
completely blocked in between).
In the work of Lucas, and in the initial studies of Adrian, the
nervous signal is generally referred to as “propagated disturbance”
to distinguish it from the local effects induced by electrical stimulation near the site of stimulus application, effects that could be
revealed especially by using subthreshold stimuli. “Propagated
disturbance” was also a noncommittal term employed to avoid
possible objections against the notion that the nerve signal was
Um segundo estudo de Adrian, feito em colaboração com o fisiologista sueco
Yngve Zotterman (1898-1982), que visitou seu laboratório em Cambridge em
1926, consistiu de registros da atividade elétrica em um dos pequenos músculos
do pescoço do sapo. As fibras musculares eram cortadas de tal forma que apenas
uma pequena parte da sua terminação permanecia presa ao nervo. Adrian assumiu
que nessa pequena parte havia apenas um fuso muscular (receptor sensorial), de
maneira que a estimulação ativaria apenas uma fibra.
12
158
E. D. ADRIAN AND Y. ZOTTERMAN.
passage-of.sensory impulssto the central nervous system. The sensation
diminishes after. a time, but it; does so very slowly. The difierence
5910187of–aBiofísica
FFCLRPto– aUSP
– Prof.
Antônio Roque – Aula 15
constant
stimulus
nerve andIIan–end-organ
between the response
can. therefore be represented diagrammatically as in Fig. 3 B. Now if
we assume that the end-organ reacts in exactly the same way as the nerve
A estimulação por
uma
cargaof amecânica
(peso)
revelouit isuma resposta no
much slower rate
of adaptation,
with pequena
this one exception
fibre,
obvious that. a steady stimulus will produce a regular discharge of imnervo que consistia
umthetrem
regular
de deflexões
e duração
an impulse willcom
be set amplitude
up and
is firt applied
stimulus
pulses.deWhen
the end-organ will become refractory. It will recover and, as soon as its
constantes (comoexcitability
impulsos
pela value,
fibra).
another impulse will
hadpropagando-se
returned to the requisite
be set up. If the stimulus has the strength a, (Fig. 3 A) the impulses
* ma a a
0 la Va
a a .s.. 2IsJom
Mig. 4 A, B and C. Exp. 1. Single end-organ in action. Rhythm with various loads.
A. I1 grmn., 10 sec. ,Frequency 33 per mec.
B. f, grin,, 10 sec. Frequency 27 per sec.
(C. J gri., 10 se. Frequency 21 per se. Les regular.
D. -,-xp. 15. Cinemnatograph film. Gradual loading and progressve increase in fr-equency.
O aumento da intensidade do estímulo provocava o aumento da frequência de
descargas elétricas, sem variação na amplitude e na duração dos impulsos. Esses
resultados foram confirmados por medidas com outras fibras nervosas (e
musculares), levando Adrian a propor que a maneira como a informação sobre os
estímulos é codificada pelos nervos é através de um código de frequência de
impulsos (figura acima).
13
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Os estudos de Adrian e Lucas reforçaram a hipótese de que o sinal nervoso é de
natureza elétrica. Além disso, eles mostraram que o sinal nervoso que se propaga
pelos nervos e músculos consiste de pulsos estereotipados cuja amplitude e
variação temporal não dependem da intensidade do estímulo (mas a frequência
dos pulsos sim), desde que essa intensidade tenha um valor suficientemente
grande.
O nome dado por Lucas, e mantido por Adrian em seus estudos iniciais, para o
pulso que se propaga pelos nervos e músculos era “distúrbio propagado”
(atualmente ele é chamado de “potencial de ação”). Esse nome era
suficientemente neutro para evitar conflitos com os que eram contrários à
hipótese de que o sinal nervoso é de natureza elétrica (mesmo em plena década de
1930 ainda havia cientistas que debatiam essa hipótese).
O termo usado por Lucas e Adrian também foi escolhido para diferenciar a
perturbação nervosa que se propagava pelo nervo das perturbações locais que
eram induzidas no local da aplicação do estímulo. Essas perturbações locais
podiam ser estudadas usando estímulos subliminares, ou seja, estímulos
insuficientes para produzir um “distúrbio propagado”.
Adrian observou que um único estímulo subliminar aplicado a um nervo não
produz um sinal nervoso (distúrbio propagado), mas a aplicação de dois ou mais
estímulos subliminares pode levar ao aparecimento de um sinal nervoso bem
definido.
14
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Isso explicava porque um trem de estímulos elétricos poderia ser mais efetivo em
estimular um nervo do que um único estímulo isolado.
As respostas elétricas locais induzidas em um nervo por um estímulo subliminar
foram chamadas por Adrian de “respostas locais” (atualmente, diríamos que essas
respostas são flutuações localizadas do potencial de membrana com amplitude
inferior ao limiar de voltagem para a geração de um potencial de ação).
As descobertas de Adrian sugeriam que as “respostas locais” não seguem a lei do
tudo-ou-nada válida para os “distúrbios propagados”. Além dessa diferença entre
os dois fenômenos, Adrian também observou outra:
A passagem de um “distúrbio propagado” por um ponto em um nervo era seguida
por uma redução temporária da excitabilidade local naquele ponto (isto é, por um
dado tempo ficava mais difícil provocar a ocorrência de um “distúrbio
propagado” naquele ponto). Esse fenômeno já era conhecido antes de Adrian.
Felice Fontana o observou no músculo cardíaco e o fisiologista francês ÉtienneJules Marey (1830-1904) o denominou de “fase refratária” (atualmente usa-se o
termo “período refratário”).
De maneira oposta, a passagem de uma “resposta local” em um ponto em um
nervo era seguida por um aumento temporário na excitabilidade local naquele
ponto (isto é, por um dado tempo ficava mais fácil provocar a ocorrência de um
“distúrbio propagado” naquele ponto).
15
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Em síntese:
- Estímulo fraco (abaixo do limiar) → aumento temporário da excitabilidade
local → facilitação da ocorrência de um distúrbio propagado caso mais
estímulos fracos sejam aplicados no local
- Estímulo forte (acima do limiar)
→ distúrbio propagado → redução
temporária da excitabilidade no local
Adrian também realizou um experimento em que uma região do nervo de um
sapo era resfriada pela aplicação de vapor de álcool. Esse resfriamento impedia a
passagem de um “distúrbio propagado” pela região resfriada, mas Adrian
observou que quando o “distúrbio propagado” chegava ao início da região que
bloqueava sua passagem, na outra extremidade dessa região ocorria um aumento
na excitabilidade local. Esse resultado era compatível com a teoria do circuito
local de Hermann (ver aula passada) e sugeria que um “distúrbio propagado” é
precedido por uma onda de aumento de excitabilidade.
Enquanto Adrian realizava seus experimentos na Inglaterra, do outro lado do
Atlântico, nos Estados Unidos, o biofísico americano Kenneth Stewart Cole
(1900-1984), trabalhando na Universidade de Colúmbia em Nova York e no
Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole na península de Cape Cod no
estado de Massachusetts, começava um estudo sistemático sobre as propriedades
elétricas das membranas celulares.
16
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Cole usava uma ponte de Wheatstone de corrente alternada para medir a
impedância da membrana de células de invertebrados e vertebrados imersas em
uma solução salina (banho). Ele trabalhou com ovos de ouriços-do-mar, algas
gigantes, axônios gigantes de lula e músculos de sapos. Os experimentos de Cole
davam essencialmente sempre os mesmos resultados, resumidos a seguir:
Cada célula tem um citoplasma de alta condutância (condutividade elétrica com
valor entre 30 a 60% do valor da condutividade elétrica da solução salina usada
como banho). O citoplasma está isolado do banho por uma membrana de baixa
condutância e capacitância elétrica de aproximadamente 1 µF/cm2.
Os experimentos de Cole confirmaram a teoria da membrana de Bernstein e
deram suporte à teoria do circuito local de Hermann. Na visão que começava a
emergir sobre o comportamento elétrico de uma célula nervosa, esta passava a ser
vista como tendo um interior (citoplasma) no qual os íons podem se movimentar
quase tão livremente como se estivessem no espaço extracelular separado do
exterior por uma membrana de dimensões moleculares e baixa permeabilidade ao
fluxo iônico.
O axônio de um neurônio podia então ser imaginado como um tubo condutor
cilíndrico (como um cabo submarino) isolado do meio extracelular por uma
membrana de capacitância e resistência elétricas bem definidas. Uma perturbação
elétrica em um ponto desse cabo se propagaria passivamente como um fluxo de
corrente ao longo da direção axial do cilindro para regiões vizinhas do ponto.
17
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Parte dessa corrente escaparia pela membrana e fluiria pelo meio extracelular de
volta ao ponto onde a perturbação se originou (veja a figura do modelo do
circuito local de Hermann na página 31 da aula passada).
Voltando à Inglaterra, na segunda metade da década de 1930 o então jovem
fisiologista Alan Lloyd Hodgkin (1914-1998) da Universidade de Cambridge
realizou experimentos que comprovaram de forma definitiva o modelo de
condução elétrica do impulso nervoso.
Hodgkin repetiu os experimentos de Adrian da década de 1920 em que a
propagação do impulso nervoso pelo nervo ciático de um sapo é bloqueada pelo
resfriamento de um pedaço do nervo. Ele aplicava estímulos elétricos em um dos
lados intactos do nervo e observava o efeito do outro lado (medindo a contração
do músculo) no momento em que o impulso nervoso atingia a fronteira entre a
região intacta e a região bloqueada (veja a figura a seguir).
18
excitability beyond the block and enabled S2 to excite. Subsequent
experiments showed that the increase in excitability lasted for a few
5910187
– Biofísica
II – FFCLRP
– USP – Prof.
Aula 15
milliseconds, and that
it might
involve
a decrease
of Antônio
90 p.c.Roque
in –the
electrical threshold.
si
A
Blocked
Block
S2
y';
|
+
"
C
Fig. 1.
*excitabikty
,
Fig. 2.
This kind of summation can be observed in Various ways; thus B lair
that it occurred in anodally polarized nerves,
and (Hodgkin,
I. have observed
it at pressure
as well transmission
retirada
A. L., Evidence
for electrical
in nerve.
as at cold blocks.
ThePart
im-1. J.
portant point about the observation is that it provides a method of
Physiol. (London) 90:183-210, 1937):
testing theories of nervous transmission. According to an electrical theory
the explanation of summation would be that eddy currents spread
through the block and increase excitability
in the
nerve
beyond.
Fig. 2 foi
Um nervo foi bloqueado pela ação de
resfriamento
local.
Quando
o bloqueio
shows how the conventional local circuit diagram can be extended to
completo,
máximo
S1 aplicado
A não and
produzia
resposta shock.
em C. Um
explainum
thechoque
interaction
between
blockedemimpulse
subthreshold
If the flow of S era então
beyond
the block
was just
below
threshold,
an ele
choque subliminar current
aplicado
a B; como
ele era
abaixo
do limiar,
2
impulse would not traverse the block, but it would produce a large
também
resposta.
Entretanto,
dois transmission
choques fossem
increasenãoin produzia
excitability.
The electrical
viewseof osnervous
would
it could be shown that the
combinadosbedeconsiderably
maneira questrengthened
S2 seguisse Sif
1 por 1 ou 2 milisegundos, impulsos
increase in excitability was produced in this way. If the local circuits set
Segundo
as próprias
palavras
& Erlanger
[1936]
found de Hodgkin no artigo de onde a figura acima foi
eram ativados e podiam ser detectados em C. Claramente o trem de impulsos
bloqueados aumentava a excitabilidade do nervo além da região bloqueada e
permitia que S2 gerasse excitação.
19
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Tendo demonstrado que um potencial de ação1 gerado antes da região bloqueada
produz uma redução no limiar de excitação (potencial local) depois da região
bloqueada, Hodgkin mediu como esses potenciais locais se propagavam ao longo
do nervo à frente da região bloqueada.
Ele
observou
que
a
amplitude
de
um
potencial
subliminar
decai
exponencialmente com a distância percorrida à PICCOLINO
medida que ele se propaga ao
longo do nervo (veja a figura a seguir, extraída do mesmo artigo citado acima).
) Increase of excitability; (b) appearance of subthreshold depolarizations in the region distal to the site of
ase of excitability is observed only if the test shock (S2) is applied after the control shock (S1) with a delay
he two sites of stimulation. (b) The upper record, A, represents the action potential recorded proximally to
1
A recorded
partir deste
ponto, vamoslonger
começar
a nos referir
pulso
elétrico
se the
propaga
por um nervo ou neurônio pelo seu nome
the potentials
at progressively
distances
beyondaothe
blocked
site.que
Note
progressive
block, andmoderno:
the calibration
difference
potencial
de ação.between A and B–F. (From [51]).
l propagation and elec-
20
concerned. Large stimuli evoked responses characterized by a
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
No traço de cima (A) está mostrado o potencial de ação registrado num ponto
antes da região bloqueada. Os traços posteriores (B−F) mostram os potenciais
subliminares registrados além da região bloqueada, em pontos cada vez mais
distantes dela. Note o progressivo decaimento do potencial com a distância
(perceba que houve uma mudança de escala para mostrar os pulsos em B−F em
relação a A).
Posteriormente, Hodgkin notou que não era necessário fazer um experimento com
uma região bloqueada do nervo para observar o decaimento do potencial com a
distância. Um potencial subliminar gerado em um ponto de um nervo intacto se
propagava pelo nervo com sua amplitude diminuindo exponencialmente com a
distância. Ele interpretou esse fenômeno em termos do modelo de circuito local
de Hermann como sendo a propagação passiva de um pulso elétrico gerado em
uma região excitada da membrana para regiões não excitadas da membrana.
O que faltava era mostrar que essa excitação elétrica que se propagava a partir da
geração de um pulso subliminar em um ponto do nervo era da mesma natureza
que a excitação propagante que seguia à frente de um potencial de ação quando
este se propagava pelo nervo.
Isso tornou-se possível a partir de um trabalho realizado por Cole e seu
colaborador Howard J. Curtis (1906-1989) em 1939 no Laboratório de Biologia
Marinha em Woods Hole.
21
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Desde 1936, Cole e Curtis vinham usando uma ponte de Wheatstone de corrente
alternada de alta sensibilidade desenvolvida por eles para realizar medidas da
capacitância e da resistência de membrana de diferentes tipos de célula.
Eles trabalharam inicialmente com a alga de água doce do gênero Nitella2 e
mostraram que a capacitância da sua membrana superficial vale 1 µF/cm2 e não
muda de valor durante a passagem de um potencial de ação. Porém, a
resistência da membrana superficial é fortemente reduzida quando um
potencial de ação passa pelo ponto de medição.
Em 1936, Cole encontrou-se com o zoólogo inglês John Zachary Young (19071997) em um congresso nos Estados Unidos e este contou-lhe sobre uma nova
preparação experimental com a qual estava trabalhando. Tratava-se do axônio
gigante de lula.
Young tinha descoberto na região do manto da lula fibras nervosas bastante
grossas que se “pareciam com veias”. Posteriormente, ele mostrou que essas
fibras são de fato axônios motores que controlam a contração do manto causando
a expulsão de um poderoso jato de água que impulsiona o animal para a frente ou
para trás para que ele possa atacar uma presa ou escapar de um predador. Young
chamou esses axônios motores de axônios gigantes (veja a figura a seguir).
2
Essa alga tem células cilíndricas longas capazes de transmitir impulsos elétricos de duração bem mais lenta (1 segundo) que a dos
impulsos em nervos de animais. Pode parecer estranho, mas algumas plantas têm a capacidade de disparar impulsos elétricos para
sinalizar eventos.
22
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Cole percebeu que o axônio gigante de lula seria um modelo ideal para o estudo
da propagação nervosa por uma única fibra nervosa, ao contrário do que vinha
sendo feito até então com músculos e nervos de animais como o sapo (compostos
por vários axônios).
Cole e Curtis usaram eletrodos externos ao axônio gigante para estimulá-lo e
medir o potencial de ação gerado e, ao mesmo tempo, com sua ponte de
Wheatstone, medir a variação na resistência da membrana do axônio no ponto
pelo qual o potencial de ação passava. O resultado obtido por eles é que a
resistência da membrana é fortemente reduzida pela passagem do potencial de
ação. Correspondentemente, a condutância da membrana é fortemente aumentada
pela passagem do potencial de ação.
A figura abaixo, retirada do artigo original de Cole e Curtis (Cole, K. S. and
Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. J. Gen.
Physiol. 22:649-670, 1939) mostra o resultado deles.
23
5910187 –AND
Biofísica
II – ELECTRICITY
FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
LUIGI GALVANI
ANIMAL
ence of potential should exist across
permeable to all ion species), but
observation, made by Bernstein him
by Shaefer [98]) that the amplitude
sometimes exceed that of the injury
these results was postponed by the
the events of war.
In 1949, Hodgkin and Katz su
action potential of the squid nerve
decreasing the extracellular concen
suggested that this was the consequ
selective increase of membrane perm
discharge of the action potential [6
largely in excess in the extracellular
interior, the resulting electrochemica
(axon interior vs. extracellular comp
brane potential would change polari
sequence of the sodium permeability
membrane potential, which in the r
permeability for potassium ions, wo
FIG. 13. The classical demonstration of the increase of conductance in the
ing the excitation by the permeabil
squid axon during the discharge of the action potential. Upper line: action
passage
frompositivo
the one to the other of
A figura mostra duas
medidas
O traço
único
com um
pico
potential;
white-darksuperpostas.
band: measure of the membrane
impedance
obtained
the consequence of a specific chang
with the Wheatstone bridge method by applying a high frequency (20 KHz)
induced by the electrical stimulus. T
sinusoidal signal to two electrodes placed on the opposite site of a giant
seguido por um decaimento
abaixo
valorchanges
de repouso
é o potencial
de ação
axon. From a measure
of thedo
impedance
obtained at various
became selectively
permeable to sod
frequencies (and proportional to the width of the band) the change of
potential was an important revisio
conductance was
to be approximately
40 times atclaro-escuro
the peak of the
which
an unselective
pas
medido extracelularmente.
Oestimated
envelope
(ou banda)
é a assumed
medida
da
action potential relative to rest. Time marks: 1 ms apart. (From [24]).
excitation, a theory which, as alre
almost complete disappearance of
impedância feita com a ponte de Wheatstone pela aplicação de um
sinal senoidal
potential whatsoever during nerve e
In order to verify whether the new
respect to the exterior [60] (Fig. 14). Unexpectedly, however, it
de alta frequência (20
KHz)
a
dois
eletrodos
situados
em
lados
opostos
dopermeability
axônio states of
between
two
appeared that during excitation the potential overshot the zero
for
the
basic
properties
of nerve exc
level by several tens of millivolts, a finding that was clearly in
necessary
to
study
in
an
accurate and
contrast
with Bernstein’s
theory (no
differ- (ou o aumento na
gigante. A largura do
envelope
medemembrane
a redução
nasubstantial
impedância
of membrane currents and permeabil
ance of the action potential. Howev
condutância) da membrana associada ao potencial de ação.
difficult with conventional technique
and “explosive” properties of the act
permit a study of the relationship be
membrane voltage during the excita
rate information on the electrical eve
As alças abaixo da figura são para marcar o tempo. Elas medem intervalos
iguais to circumv
potential it was necessary
this event, by forcing the membran
maintain,para
certainmedir
levels in spite of i
de 1 ms, mas o espaçamento não mostra isso porque a escala usada
neously when the threshold value w
tempo pelo osciloscópio de Cole e Curtis era logarítmica.
The Voltage Clamp, the Squid Axon
Model
The sought for technique that
membrane
events
underlying
A medida das variações na impedância para várias frequências permitiu
a Cole
e the ge
was the voltage-clamp devised in
Marmont [81]. It was applied in a m
Curtis estimar o aumento na condutância da membrana de aproximadamente
40%in collabora
by Hodgkin and Huxley
studies published in 1952, which r
stone in the investigations on anim
no ponto em que ocorre o pico do potencial de ação.
epoch of Lucas and Adrian, the exp
gated response had been somewhat
based on partial block of small seg
24 informat
procedures could give little
FIG. 14. The first published intracellular recording of the action potential
once
the
threshold
was
exceeded.
in the squid axon. Time course of the difference between the internal and
In
voltage
clamp,
the
“block” of
external potential, in the resting state and during the discharge of an action
ing the explosive character of the ac
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
A importância do aumento na condutância (ou diminuição na resistência) da
membrana é que ela indica que a membrana do axônio torna-se muito mais
permeável aos íons no ponto por onde passa um potencial de ação.
Essa descoberta do aumento na condutância iônica estava de acordo com a teoria
da membrana de Bernstein.
Para relembrar, segundo Bernstein o valor negativo do potencial de membrana no
repouso é devido à alta permeabilidade da membrana ao potássio, que possui alta
concentração no meio extracelular. Ainda segundo Bernstein, quando ocorre um
potencial de ação a membrana torna-se permeável a todos os íons e é isso que faz
com que o potencial de membrana convirja para zero (e não ultrapasse o zero).
Será que o potencial converge mesmo para zero? Como já vimos, o próprio
Bernstein fez alguns experimentos em que o pulso de potencial ultrapassava o
zero e tornava-se transitoriamente positivo, mas ele preferiu descartar esses
resultados.
O fato é que realizando apenas medidas do potencial de injúria com nervos de
sapos, como se fazia até a década de 1930, seria impossível determinar com
certeza se o potencial converge para zero ou ultrapassa esse valor.
25
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
O potencial de injúria é a diferença de potencial entre um pedaço intacto de um
nervo e a extremidade seccionada (injuriada) dele. Portanto, ele é apenas uma
medida grosseira do verdadeiro potencial de membrana, que é a diferença de
potencial entre o interior e o exterior de um neurônio. E sem conhecer o valor
exato do potencial de repouso de um neurônio não é possível saber se a amplitude
de um potencial de ação ultrapassa o zero ou não.
A descoberta do axônio gigante de lula tornou possível, pela primeira vez, a
realização de uma medida intracelular do potencial de membrana e, portanto, de
um potencial de ação a partir do valor de repouso.
Em 1938, Hodgkin fez uma visita a Cole e Curtis em Woods Hole e aprendeu
sobre o axônio gigante de lula e as medidas deles sobre aumento da condutância
associada à passagem de um potencial de ação.
De volta a Cambridge, Hodgkin começou a trabalhar juntamente com o biofísico
inglês Andrew Fielding Huxley (1917-2012) usando o axônio gigante de lula
como modelo experimental.
Um dos estudos feitos por eles tinha por objetivo medir a viscosidade do
citoplasma, ou axoplasma, do axônio gigante. O método usado era inserir uma
pequena gota de mercúrio pela extremidade cortada de um axônio pendurado na
vertical e medir sua velocidade de queda pelo interior do axônio.
26
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Para surpresa dos dois, a gota de mercúrio não caía, mas permanecia na
extremidade cortada. Eles descobriram que isso ocorria porque o interior do
axônio não é fluídico como eles supunham, mas pastoso como um feixe de pasta
de dentes espremido para fora de um tubo de pasta de dente.
Este resultado lhes deu a ideia de que poderiam inserir pelo interior do axônio um
tubo muito fino de vidro (um capilar de vidro) preenchido com uma solução
salina condutora. Esse capilar de vidro poderia ser utilizado como eletrodo
(chamado de eletrodo capilar) para medir a verdadeira diferença de potencial
entre o interior e o exterior do axônio.
A possibilidade de se registrar o potencial de membrana com um eletrodo interno
ao axônio gigante de lula já havia sido considerada durante a visita de Hodgkin a
Cole em 1938, mas esta era a primeira vez que isto se tornava possível.
Hodgkin e Huxley então cortaram um axônio gigante em um dado ponto com
uma tesoura bem fina e conseguiram inserir por essa extremidade cortada uma
cânula de vidro bem fina. Posteriormente, eles amarraram o axônio à cânula com
um fio de seda, selando o lado exposto do axônio.
Pela cânula eles inseriram um eletrodo capilar de 100 µm de diâmetro até que a
ponta do eletrodo ficasse em contato com o interior do axônio. Essa inserção
tinha que ser feita com muito cuidado para que a ponta do eletrodo não arranhasse
a superfície interna da membrana.
27
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Eles resolveram esse problema com o uso de dois espelhos em ângulo reto e um
microscópio. A figura abaixo, tirada do artigo publicado por eles em 1939
(Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F., Action potentials recorded from inside a
nerve fiber. Nature 144:710-711, 1939), mostra o eletrodo capilar no interior do
axônio.
A inserção do eletrodo capilar no interior do axônio permitiu a primeira medida
realizada na história do potencial de membrana de um neurônio (o potencial no
interior da célula medido em relação ao potencial no exterior).
Confirmando o que já se sabia, Hodgkin e Huxley obtiveram que o potencial de
membrana no repouso é negativo. O valor medido por eles era de
aproximadamente −50 mV.
28
membrane potenti
permeability for p
FIG. 13. The classical demonstration of the increase of conductance in the
ing the excitation
squid axon during the discharge of the action potential. Upper line: action
from the o
5910187
BiofísicaofIIthe
– FFCLRP
– USP
– Prof. obtained
Antônio Roquepassage
– Aula 15
potential; white-dark
band:–measure
membrane
impedance
the consequence o
with the Wheatstone bridge method by applying a high frequency (20 KHz)
by the ele
sinusoidal
to two no
electrodes
placed eles
on the determinaram
opposite site of a giant
Após a medida
do signal
potencial
repouso,
o que induced
acontece
axon. From a measure of the impedance changes obtained at various
became selectively
frequenciespassa
(and proportional
to the
of the a
band)
change ofEstapotential
quando um impulso
pelo axônio
emwidth
resposta
um the
estímulo.
foi umawas an
conductance was estimated to be approximately 40 times at the peak of the
which assumed a
relative na
to rest.
Time marks:
1 ms apart.e (From
[24]).que o potencial
das medidas action
mais potential
importantes
história
da biofísica
mostrou
excitation, a theo
almost complete d
no interior do axônio cresce em direção a zero e ultrapassa o zero, tornando-se
potential whatsoev
In order
respect to the
exterior
[60] (Fig.
14). Unexpectedly,
however,
it
positivo e crescendo
quase
tanto
do lado
positivo quanto
a magnitude
do to veri
between two perm
appeared that during excitation the potential overshot the zero
for the
basic prope
potencial de repouso
(o picotens
do of
potencial
chegava
a 40
level by several
millivolts,dea ação
finding
that wasaproximadamente
clearly in
necessary
to study
contrast with Bernstein’s membrane theory (no substantial differof membrane curre
mV).
ance of the action
difficult with conv
and “explosive” pr
permit a study of
membrane voltage
rate information on
potential it was ne
this event, by forc
maintain, certain l
neously when the
The Voltage Clam
Model
The sought fo
membrane events
was the voltage-c
Marmont [81]. It w
by Hodgkin and H
studies published
stone in the inves
epoch of Lucas an
gated response had
based on partial b
procedures could g
FIG. 14. The first published intracellular recording of the action potential
once the threshold
in the squid axon. Time course of the difference between the internal and
In voltage
potential,
the resting state
and por
duringterra.
the discharge
of an action
A teoria da external
membrana
deinBernstein
caía
A figura
acima, tirada
do clam
ing the explosive c
potential. Time mark, 500 Hz. Notice the large positive overshoot of the
the application
of
during the action
potential,
which contrasted
withdo
the potencial
mesmo artigomembrane
citado potential
anteriormente,
mostra
a histórica
medida
de
relies on the use
expectation of the Bernstein’s theory (From [60]).
ação feita por Hodgkin e Huxley.
29
5910187 – Biofísica II – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque – Aula 15
Após a descoberta de Hodgkin e Huxley, que foi confirmada por Cole e Curtis em
1940, o problema central na neurofisiologia passou a ser determinar o
mecanismo iônico responsável pela geração de um potencial de ação.
Infelizmente, devido à Segunda Guerra Mundial que eclodiu logo após as
medidas de Hodgkin e Huxley em 1939, toda a pesquisa na área foi interrompida
por vários anos e só foi retomada pelos mesmos Hodgkin e Huxley e outros oito
anos depois.
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