Gênero Clostridium spp
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Gênero Clostridium spp
Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp Prof. Marcos JP Gomes Clostridioses. Carbúnculo. Gangrena. Hepatite necrótica. Hemoglobinúria Bacilar ATUALIDADE Atualmente (2013), na “List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature” do pesquisador J.P. Euzèby há citação de 203 espécies e 5 subespécies no gênero Clostridium spp, conforme o site www.bacterio.cict.fr/c/clostridium.html INTRODUÇÃO São bastonetes; medem 0,3-2,0 µm de diâmetro e 1,5-20 m de comprimento; arranjos aos pares ou em cadeias curtas com as extremidades arredondadas ou pontiagudas; pleomórficos; geralmente Gram positivos no cultivo jovem; geralmente móveis por flagelos peritríquios; formam esporos ovais ou esféricos que deformam a parede celular. A maioria das espécies é quimiorganotrófica; alguns são quimioautotróficos e quimiolitotrófico. Podem ser sacarolíticos, proteolíticos, nenhum ou ambos. Geralmente produzem uma mistura de ácidos orgânicos e álcoois de carboidratos e peptonas. Não realizam uma redução dos sulfatos. Geralmente catalase negativos e anaeróbios obrigatórios; se houver crescimento em ar, ele é pequeno e a esporulação é inibida. Metabolicamente são muito diversos com temperatura ótima entre 10º C e 65º C. Estão distribuídos no ambiente. Muitas espécies produzem potentes exotoxinas, sendo que algumas espécies são patogênicas para os animais, tanto pela infecção de ferimentos quanto pela absorção de toxinas. Espécie Tipo: Clostridium butyricum A diferenciação deve ser realizada em laboratórios especializados, pois as necessidades de crescimento e os testes a serem aplicados são diversos. Recentemente, Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 novas espécies têm sido descritas. Microrganismos deste gênero são bastonetes Gram +, anaeróbios, esporulados que foram agrupados no gênero Clostridium por suas semelhanças morfológicas e tintoriais. São móveis, exceto do C. perfringens. São fermentadores e catalase negativos. São bastonetes retos com exceção do C. spiroforme. Estão distribuídos no solo e trato gastrintestinal dos animais e do homem, onde podem sobreviver e multiplicar-se. Podem formar esporos que asseguram sua sobrevivência em condições adversas, durante longos períodos de tempo. Podem tornar-se contaminantes de amostras clínicas por ter capacidade de esporular. PATOGENICIDADE: As principais doenças causadas pelos clostrídios nos animais são: 1-Clostridium perfringens (C. welchii) tipo A - Infecções de ferimentos, mastite gangrenosa, enterotoxemia do cordeiro e suíno, “yellow lamb”. Seu papel em outras enterotoxemias é controverso e seu isolamento não é prova de doença. 2-Clostridium perfringens (C. welchii) tipo B - Disenteria dos cordeiros, enterotoxemia dos bezerros, ovinos, caprinos e potros. 3-Clostridium perfringens (C. welchii) tipo C - Enterotoxemia dos ovinos, bezerros, cordeiros e leitões. 4-Clostridium perfringens (C. welchii) tipo D - Enterotoxemia em ovinos, cordeiros e caprinos. 5-Clostridium novyi (C. oedematiens) tipo A - Gangrena gasosa dos bovinos, ovinos, “Big head” dos carneiros e do Homem. 6-Clostridium novyi (C. oedematiens, C. gigas) tipo B – “Black disease” (hepatite necrótica infecciosa dos ovinos e bovinos) e morte súbita em bovinos e suínos. 7-Clostridium novyi (C. oedematiens/C. bubulorum) tipo C - Osteomielite em búfalos (Indonésia). 8-Clostridium novyi (C. oedematiens/C. haemolyticum) tipo D - Hemoglobinúria bacilar dos bovinos e doença do fígado necrótico dos ovinos. 9-Clostridium septicum - Edema maligno nos eqüinos, bovinos, ovinos e suínos. Gangrena gasosa, “braxy” nos ovinos, “navel-ill” dos cordeiros, carbúnculo sintomático nos suínos e dermatite gangrenosa nas aves. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 10-Clostridium chauvoei (C. feseri) - Carbúnculo sintomático dos ovinos, bovinos e, ocasionalmente nos suínos. 11-Clostridium tetani - Tétano em todas as espécies animais. 12-Clostridium botulinum tipo C e D - Botulismo em ovinos, bovinos, martas, cães, macacos, furões e diversas espécies de aves tais como ave doméstica e patos. 13-Clostridium colinum - Enterite ulcerativa “Quail disease” em codornas, perus e galinhas. 14-Clostridium spiroforme - Enterotoxemia espontânea ou induzida por antimicrobianos em coelhos. 15-Clostridium villosum - Abscessos espontâneos em gatos. 16-Clostridium difficile - Enterocolite induzida por antimicrobianos no hamster, coelhos e cobaias. Causa também enterocolite natural em suínos, potros e, no homem. CLASSIFICAÇÃO O gênero Clostridium spp pode ser didaticamente classificado em dois grupos, tendo como base, o mecanismo produtor de doença. O primeiro grupo consiste dos clostrídios que tem pouca ou nenhuma capacidade de invadir e multiplicar-se nos tecidos. Tais organismos concentram sua patogenicidade na produção de poderosas toxinas (neurotoxinas) longe do corpo do hospedeiro ou em áreas restritas. As lesões são causadas por toxina ou toxinas. Os dois representantes deste grupo são: Clostridium tetani e o Clostridium botulinum. O segundo grupo é numeroso, sendo representado por espécies que invadem e multiplicam nos intestinos e tecidos do hospedeiro. Esses organismos produzem toxinas bem menos potentes do que as do primeiro grupo. Clostrídios deste grupo elaboram toxinas no intestino, causando doenças denominadas enterotoxemias. A toxina age na mucosa intestinal ou em outro lugar, após a distribuição pela corrente circulatória. Feridas e pontos de inoculações podem tornar-se infectado com clostrídios invasivos, produtores de gangrena gasosa, edema e necrose. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Quadro 1. Etiologia e Diagnóstico das Principais Clostridioses Animais. Entrada Local Replic. Bacteriana Ingestão/ Músculo Síndrome ou Doença CS Espécies susceptíveis bovinos, ovinos Etiologia C. chauvoei Critério para Diagnóstico ou produção de toxina(s) Isolamento / IF Isol. agente feridas infectadas caprinos Feridas Edema maligno bovinos, ovinos C. septicum Gangrena gasosa caprinos C. chauvoei C. sordellii C. perfringens C. novyi Fígado IDelg. HB bovinos, ovinos C. haemolyticum Isol. agente em lesões caract. fígado HN ovino, bovinos C. novyi B Isol. agente em lesões caract. fígado EHemorrágica ovinos, caprinos C. perfringens Letalidade do conteúdo intestinal aguda bovinos tipos A,B,C em Cd e neutralização antissoro Enterotoxemia ovinos, caprinos C. perfringens Detecção toxinas tipo C e D bovinos tipo C, D Ossos, Botulismo bovinos, ovinos C. botulinum Letalidade cont intest ruminal, soro e Carcaças Botulismo caprinos, aves tipos C, D fígado para Cd imunizados antissoros Águas paradas e Botulismo Todas spp C. tetani Sinais clínicos da doença Alimentos cont Feridas Tétano de mamíferos Gl. Mamária Mastite gangr. bovinos C. perfringens Isolamento do agente do leite/ tecido mamário Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium tetani Prof. Marcos JP Gomes Tétano HISTÓRICO Etimologicamente, a palavra tétano é origem da palavra grega “teínein” que significa esticar, distender. Em latim, o termo “tetanus” significa rigidez de um membro em contração espasmódica muscular. A descrição revela, os sinais clínicos da contração muscular (sobretudo no pescoço e tronco) causada pelo C. tetani, responsável pela doença. Hipócrates registrou um caso de tétano, cujas descrições clínicas da doença eram conhecidas. Hipócrates viveu no século V AC, na Grécia, e conhecia a gravidade do tétano, descreveu-a como “todo espasmo que se segue a um ferimento, é mortal”. Uma pintura realizada por Sir Charles Bell, em 1809, retratou um exemplo conhecido desses sinais. O tétano permaneceu de difícil diagnóstico por séculos, pois não era possível detectar a causa, encoberta em mistério até o século XIX. A etiologia da doença foi descoberta pelos italianos Antonio Carle e Giorgio Rattone, em 1884, através da inoculação de pus de ferimento humano fatal (tétano) no nervo ciático de coelhos. Em 1885, Nicolaier reproduziu e confirmou as pesquisas de Rattone e Carle, observando a presença do bacilo na terra. Em 1889, Kitasato Shibasaburo isolou, pela primeira vez, o C. tetani de um paciente com tétano. Mais tarde, reproduziu a doença inoculando em animais e que a toxina poderia ser inativada por anticorpos específicos. Ainda em 1889, Tizzoni e Catani isolaram o C. tetani em cultivo puro. Neste mesmo ano, houve o descobrimento da toxina tetânica por Knud Faber feito considerado importante para o desenvolvimento do toxóide. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Em 1892, Behring e Kitasato propuseram um método de imunização eficaz com base na toxina envelhecida. A primeira imunização passiva do tétano ocorreu durante a Primeira Guerra Mundial (1914-1918). Em 1897, Edmond Nocard, mostrou que a antitoxina do tétano poderia induzir a imunidade passiva no homem e que poderia ser utilizada na profilaxia e tratamento. Em 1924, P. Descombey desenvolveu o toxóide tetânico que foi amplamente utilizado na prevenção do tétano induzido por ferimentos durante a II Grande Guerra. Em 1925, o método de Behring e Kitasato foi aperfeiçoado por Ramom e Descombey, através da ação do formol que pôde gerar a inativação da toxina ou anatoxina. O soro antitetânico (SAT) era produzido pela inoculação da toxina em eqüinos, obtendo daí anticorpos que seriam aplicados em pacientes com tétano. Esse processo, no entanto, causava reações adversas contra os anticorpos dos eqüinos, problema conhecido como doença do soro. Por isso, uma pessoa só podia receber os anticorpos somente uma vez durante a vida, pois uma segunda aplicação do soro poderia ser fatal. Com o uso do toxóide, o tétano tornou-se menos comum. A doença permanece freqüente em países africanos. No mundo, ocorrem cerca de um milhão de casos anualmente. No Brasil e nos países desenvolvidos, o tétano é uma doença infecciosa não contagiosa que se encontra em fase de declínio. Em 1979, Iizuka e colaboradores apontaram, no entanto, para a diferença desse quadro no Brasil e em outros países tropicais, nos quais o tétano era um problema de saúde pública com taxa média de mortalidade de 12 para 100 mil habitantes contra 5 para 100 mil em países desenvolvidos. Os indivíduos com mais anticorpos circulantes são os que foram vacinados nos primeiros anos de vida, embora com o passar dos anos, o paciente nem sempre consiga precisar seu histórico de vacinação anterior. Assim, parece que a imunização nos primeiros dias de vida foi importantíssima para a prevenção do tétano, desencadeando o controle da doença nos primeiros meses de vida das crianças. Antigamente, as populações mais afetadas pelo tétano eram as de baixa renda e o interesse em pesquisar métodos preventivos sobre a doença era pequeno. Pesquisas experimentais realizadas em cobaias estudaram a infecção por ferida umbilical, conhecida Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 popularmente como mal de sete dias. Os pesquisadores apontaram a imunização ativa das gestantes com o toxóide tetânico como prevenção do problema. Para os pediatras, a criança já deveria nascer protegida contra o tétano, independente do tratamento do cordão umbilical. CARACTERÍSTICAS BACTERIOLÓGICAS O C. tetani é uma bactéria Gram positivas (quando jovem), possuindo uma tendência em tornar-se Gram variável. É um bastonete reto com diâmetro entre 0,3 a 0,6 µm X 3 a 12 µm de comprimento. É móvel graças aos cílios peritríquios (mas certas linhagens são desprovidas de flagelos e, portanto imóveis), esporulados, anaeróbios estritos, não reduzem o nitrato; produzem uma DNAse, liquefazem a gelatina em 2 a 7 dias; produzem H2S; produz indol; resposta negativa para lecitinase e de lipase, não hidrolisa a esculina nem acidifica açúcares. MORFOLOGIA Apresentam-se sozinhos, tanto nos tecidos quanto em cultivo, mas também em longos filamentos. Os esporos são terminais deformando a parede celular. Os esporos são visualizados após 24 a 48 horas de incubação. Os esporos possuem a aparência de baquetas, raquete de “badminton” ou de tênis. HABITAT O C. tetani é uma bactéria telúrica de distribuição geográfica mundial, mas rara nas regiões nórdicas e nas grandes altitudes. O bacilo do tétano está presente no solo, especialmente nos: solos cultivados, depósitos fluviais e mares, transportado pelos ventos, pelas águas ou pela poeira das ruas ou das casas. A sobrevivência do bastonete tetânico é favorecida pelo pH neutro ou levemente alcalino, uma umidade de pelo menos 15% e uma temperatura de 20º C. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 CARACTERÍSTICAS CULTURAIS E BIOQUÍMICAS A temperatura ótima de crescimento é de 37° C; crescimento moderado a temperatura de 30° C e nula a temperatura de 25º C ou a 45° C. O cultivo é inibido por 20 % de bile e por 6,5 % de sal. Este microrganismo cresce em meios comuns se as condições de anaerobiose forem mantidas. A colônia é hemolítica e se assemelha a esfera de algodão no meio de gelatina, produzindo um aspecto semelhante a um guarda-chuva aberto. Este clostrídio não fermenta carboidratos, mas a adição de glicose favorece o seu crescimento. RESISTÊNCIA A esporulação é determinada por numerosos fatores. Ela é pequena ou nula a uma temperatura de 41° C ou por um pH inferior a 6; ela é retardada a uma temperatura de 20 ou 25° C. O esporo resiste, geralmente 10 minutos a 75-80° C. São destruídos pelo calor de 100º C por uma hora A sobrevivência do esporo no meio ambiente depende das condições físicoquímicas e a ação conjunta do ar e da luz que é considerada nefasta. Os esporos conservam sua vitalidade, durante muitos anos e por 18 anos no solo, mas abrigado da luz. Os esporos do C. tetani são resistentes para a maioria dos agentes esporocidas, desde que sejam protegidos da luz. Algumas amostras resistem à fervura por 90 minutos. Desinfecção por alguns compostos halogênicos (3% de iodo) os destrói. Fenol a 5% destrói os esporos em 10 a 12 horas. A adição de 0,5% de ácido clorídrico pode reduzir o tempo para 2 horas. A fervura destrói os esporos por 15 minutos. A autoclavação a 121º C por 20 minutos. PATOGENICIDADE Os esporos ou as formas vegetativas introduzidas no intestino são inofensivos. Foi demonstrado que os esporos inoculados estão viáveis, mas incapazes de germinar dentro do tubo digestivo e a toxina administrada por via oral ou retal foi inofensiva. Esse fato explica o porquê do tétano não ser adquirido via oral nem pelo tubo digestivo intacto. A doença ocorre após uma ferida contaminada por esporos do C. tetani. Nos animais, especialmente Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 nos eqüídeos pelos ferimentos nas extremidades, fraturas abertas, feridas umbilicais, feridas obstétricas, retenção da placenta, feridas de castração ou, de uma maneira geral, as feridas cirúrgicas contaminadas são a origem do tétano. ETIOPATOGENIA O período de incubação para o tétano é de 1-3 semanas, mas em média é de 10-14 dias. Raramente este período é mais longo. Nos ovinos, o começo dos sinais clínicos pode ser de 3-10 dias após a castração ou descola. A infecção do cordão umbilical pode tornar-se evidentes logo apos às 48 horas do nascimento. Os sinais clínicos são semelhantes entre as diferentes espécies. Inicialmente, os animais tornam-se relutantes ao mover-se, apresentam rigidez muscular; tremores, rigidez do pescoço e membros traseiros. Um a três dias depois, aparecem contrações musculares generalizadas. A cabeça e pescoço ficam estendidos, a cauda levantada, os membros assumem uma posição de cavalete e os músculos têm uma tensão semelhante à madeira. Bater palmas, exposição à luz ou mesmo o toque no animal pode causar reação com aumento das contrações tônicas. Inicialmente, os espasmos duram segundos ou minutos, mas depois se tornam permanentes. Os animais caem e são incapazes de levantar-se. A alimentação tornar-se difícil, podendo haver dificuldades na mastigação, na deglutição e salivação aumentada. Os animais desenvolvem trismo (“lockjaw”) com a progressão da doença. Há projeção da terceira pálpebra em cães e cavalos, as narinas aumentadas e arregalamento dos olhos. Espasmos faciais dando a expressão clássica do (“risus sardonicus”) no cavalo, no cão e homem. Os animais doentes transpiram e há dificuldades com a respiração, micção e defecação. Curtos espasmos podem ser localizados em um membro ou região do corpo próximo ao local da lesão em casos leves. A mortalidade é de até 80% dos animais não imunizados. O tétano humano é uma doença severa e sistêmica, afetando os músculos, os nervos autônomos, o sistema endócrino, o sistema cardiovascular, os pulmões, os rins e trato gastrintestinal. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 A tetanoespasmina bloqueia a sinapse inibitória, levando a espasmos em músculos supercontraídos. As sinapses excitatórias podem ser bloqueadas mais tarde, levando a paralisia flácida em animais sobreviventes aos efeitos agudos iniciais. O C. tetani está presente no tubo digestivo dos animais (macacos, cavalos, vacas, ovelhas, cabras, porcos, cães, gatos, ratos, cobaias, coelhos, aves etc.) ou no homem, particularmente indivíduos que possuem contato permanente com cavalos. Os herbívoros e mais especificamente, o cavalo possuem um papel importante na disseminação dos esporos. Há possibilidade de disseminação, através de solo, da poeira ou das fezes. O C. tetani pode contaminar os objetos inanimados (material médico ou cirúrgico insuficientemente esterilizado) ou a pele e mucosas dos vertebrados. A infecção dos animais e do homem pode ocorrer como resultado da contaminação de feridas, umbigo, aplicação de ferradura, cirurgia em baias, aplicação de borracha para castração de ovinos, aplicação de brincos, injeções infecções uterinas no pós-parto, infecções de umbigo, brigas de animais de pequeno porte, feridas causada por armadilhas, feridas profundas e penetrantes. Nestes locais, formam-se as condições de necrose ideais (baixa tensão de oxigênio e potencial de oxi-redução), permitindo a multiplicação do C. tetani e, posteriormente produção de toxinas. Após a germinação dos esporos, o bastonete se multiplica, produzindo uma potente neurotoxina que inibe a fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática, fazendo a liberação de neuro mediadores no espaço intersináptico. Os alvos da neurotoxina tetânica são os reguladores interneuronais situados na medula espinhal e cérebro, inibindo a glicina e o ácido gama-amino-butírico (GABA), resultando em hiperexcitabilidade dos neurônios motores e contraturas localizadas; depois generalizadas, permanentes, dolorosas e paroxísticas dos músculos esqueléticos. O C. tetani produz duas exoproteínas; uma neurotoxina ou tetanoespasmina e uma hemolisina ou tetanolisina. A tetanoespasmina é responsável pelos sinais clínicos da doença e os anticorpos para a toxina são protetores. A tetanoespasmina é uma exotoxina, uma neurotoxina codificada por um plasmídio. Ela age na pré-sinapse nos neurônios motores, bloqueando a Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 liberação de neurotransmissores pela hidrólise de proteínas “docking”. Ela é produzida, inicialmente, como uma cadeia de polipeptídio com peso molecular 150.000 Da. A cadeia pesada e a cadeia leve não são tóxicas quando separadas. A toxina é destruída pelo suco gástrico. É termostável e, dificilmente absorvida, através das mucosas. Ela é extremamente potente. 1DL50 com 50% de sobreviventes para o camundongo equivale a (= 2 X 10-8 mg). A tetanoespasmina liga-se especificamente aos gangliosídios das células nervosas. Gangliosídios são mucolipídios solúveis em água e clorofórmio, contendo ácido siálico, esteárico, esfingosina, galactose, acetilgalactosamina e glicose. Os gangliosídios estão ligados ao cerebrosídios insolúveis em água, no tecido nervoso. Duas moléculas de gangliosídio se ligam a uma molécula da toxina. A reação é extremamente difícil de reverter e o anticorpo neutralizante é ineficaz quando a ligação já ocorreu. A toxina circula ao longo do tronco nervoso e coluna vertebral pelo transporte axonal retrógrado, após a ligação ao gangliosídio. A ação específica da tetanoespasmina é evitar a liberação da glicina, substância necessária para inibição da cadeia nervosa da medula espinhal. Esta cadeia impede a contração de um músculo quando o seu oposto se contrai. A toxina causa contínua estimulação com espasmos tetânicos de um grupo de músculos. Outros efeitos incluem a ação paralítica nos nervos periféricos, assim como, o efeito inativante na cadeia inibitória, do SNC. Existe também um efeito na síntese protéica do cérebro. A atividade neuromuscular favorece a migração da toxina a qual migra, através dos axônios motores e nervos sensitivos. Há um consumo preferencial da toxina via raízes ventrais do SNC. A toxina acumula-se seletivamente na região da medula cervical, lombar e substância cinzenta do encéfalo. O tétano se desenvolve, primeiramente nos músculos daquele membro e em seguida, se difunde ascendentemente atingindo o membro oposto e subseqüentemente, na musculatura do tronco, quando a toxina atinge o nervo motor do membro anterior. Este fato é conhecido como tétano ascendente. A toxina pode circular no sangue e linfonodos, produzindo tétano nos músculos da cabeça e pescoço por meio dos centros nervosos motores. Esta forma é chamada de tétano descendente e observada em eqüinos e no homem. No tétano descendente, o primeiro sinal clínico é o relaxamento da membrana nictitante, trismo e ao riso sardônico. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 A hemolisina causa necrose tissular local e favorece a multiplicação do C. tetani. A ação da toxina não espasmogênica é pouco definida. Os sinais de tétano são semelhantes nos animais, sendo resultado de castrações, descolas infecções umbilicais, ferimentos profundos e lesões produzidas por pregos quando da colocação de ferraduras. Nos cães e gatos é geralmente uma complicação de ferimentos. DIAGNÓSTICO Os sinais clínicos do tétano são característicos que raramente são necessários exames laboratoriais. O microrganismo é facilmente identificável por seu esporo. Contaminantes podem ser removidos pelo tratamento com etanol a 50%, durante 1 hora. O reconhecimento dos sinais clínicos é simples, mas os sinais cerebrais não específicos vistos no começo do tétano podem sugerir raiva. A tetanoespasmina não é detectada pelos testes laboratoriais quando a toxina está se movimentando em seu alvo via neural. Em alguns casos, a tetanoespasmina pode ser detectada na circulação, mas o tétano não é uma verdadeira intoxicação (Johnson 2006). O exame post-mortem e a confirmação laboratorial não são necessários. Entretanto quando o diagnóstico não é claro, amostras devem ser colhidas e preservadas antes do tratamento com ATMs. A tetanoespasmina pode ser detectada, através do bioensaio em camundongos, com ou sem a neutralização com antissoro específico. Amostras de ferimentos podem ser submetidas ao isolamento bacteriológico (Akbulut et al. 2005). Sinais cerebrais ou do SNC podem ser vistas na intoxicação por estricnina, especialmente em cães. Curso prolongado acompanhado de histórico ligado ao uso desse veneno nas vizinhanças associado a temperatura normal ou baixa dos afetados pode indicar o uso de estricnina. Doença de Borna e outras encefalomielites podem confundir com tétano em cavalos. Encefalite espongiforme bovina (doença da vaca louca) deve ser considerada em bovinos. Paralisia flácida pode ser vista e parecer botulismo. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 TRATAMENTO O C. tetani é sensível às penicilinas, às tetraciclinas e ao cloranfenicol, mas resistentes aos aminoglicosídeos. Desinfecção de feridas. Abrir o ferimento e oxigenar. IMUNIDADE As aves são naturalmente resistentes e não possuem anticorpos nos seus tecidos. A antitoxina tetânica é preparada com o soro de eqüinos imunizados. A antitoxina pode ser utilizada na proteção passiva de animais contra o tétano. Geralmente, 1.500 unidades protegem um animal por duas a três semanas. A imunização (toxóide) contra o tétano é produzida pela incubação da toxina, altamente potente com uma solução de formalina a 0,4% até sua toxicidade ter sido completamente destruída. O toxóide é precipitado pelo sulfato de alumínio e potássio (alum); lavado e suspenso em salina. TSA Os clostrídios são resistentes aos aztreonam, aos aminosídeos, à trimetoprima, às sulfonamidas, às quinolonas, à colistina e à fosfomicina. São sensíveis às penicilinas (menos as cepas produtoras de beta-lactamases, mas não descritas para C. tetani), aos glicopeptídeos e ao metronidazole. A sensibilidade à clindamicina e ao cloranfenicol é variável e dependente da linhagem. Em veterinária, as penicilinas e tetraciclinas são as mais utilizadas na profilaxia e tratamento do tétano. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 PREVENÇÃO As feridas devem ser propriamente limpas e desinfetadas. Cirurgias, especialmente aquelas realizadas em larga escala devem ser realizadas com precauções de higiene. Eqüinos devem ser imunizados antes de procedimentos cirúrgicos ou aplicados antitoxina logo após cirurgias ou medicado com penicilina de depósito (penicilina benzatínica). VACINAÇÃO E CONTROLE Uma única dose de toxóide produz apreciável grau de imunidade. A imunização ativa emprega toxóide; ela deve ser aplicada duas vezes com intervalo de 1-2 meses de intervalo e após isso repetir anualmente. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium botulinum Prof. Marcos JP Gomes Botulismo nos diferentes Hospedeiros INTRODUÇÃO O reagrupamento das espécies C. argentinense, C. baratii, C. botulinum e C. butyricum foi justificado, pois elas produzem ou podem produzir toxinas protéicas. Essas toxinas, em número de sete, designadas por letras de A - G diferem de suas propriedades antigênicas, mas suas atividades são idênticas. Essas toxinas são responsáveis no homem e nos animais de uma enfermidade conhecida como botulismo e, caracterizada por paralisia flácida. Em condições naturais, o botulismo resulta na ingestão de toxina pré-formada nos alimentos contaminados (intoxicação) ou na multiplicação intestinal (bebes) ou em feridas infectadas (potros) por linhagens produtoras de toxinas (toxinfecção). As neurotoxinas botulínicas são as toxinas mais potentes conhecidas e, após a ingestão, a dose letal para o homem é estimada em 0,1-1 µg para a toxina botulínica A. Um exemplo teórico mostra que somente um grama da toxina disseminada ou inalada poderia matar mais de um milhão de pessoas. As toxinas podem se tornar armas biológicas (dispersão das toxinas por aerossóis ou contaminação de um reservatório de água potável). A utilização potencial das toxinas botulínicas em atos de terrorismo desencadeou de maneira paradoxal, o interesse e a pesquisa em direção ao tratamento de doenças caracterizadas por hiperatividade muscular (Botox, Dysport, Neurobloc) (ou para suprimir as rugas Vistabel). O C. argentinense é uma espécie proteolítica, não sacarolítica, desprovida de lipase (contrariamente do C. botulinum); crescimento ótimo é a 37° C; possui esporo moderadamente termorresistente (D104 de 0,8 - 1,12 min.); pode produzir toxina do Tipo G. São bastonetes com 0,5 a 2,0 μm de diâmetro e 1,6 - 9,4 µm de comprimento; móveis com cílios peritríquios; podem ou não esporular; hidrolisam a gelatina; digerem lentamente o Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 leite e a carne; produzem amoníaco e gás sulfídrico (H2S). Crescimento é inibido por 6,5 % de NaCl ou 20% de bile. Após 48 h de incubação a 37° C, as colônias são lisas brilhantes com um diâmetro de 1-4 mm, beta-hemolítica. É hemolítico no AS com hemácias de carneiro. As colônias velhas tornam-se rugosas, podendo ter um aspecto de ovo sobre o prato (achatadas). No caldo PYG, o crescimento forma um sedimento liso e esbranquiçado com pH de 6,2-6,3 após cinco dias de incubação. Há produção de ácido acético, ácido isobutírico, ácido butírico, ácido iso-valérico e ácido fenil-acético. O C. baratii não é proteolítico (carne ou leite), não hidrolisa a gelatina; não produz lipase; a temperatura ótima de crescimento está entre 30 e 45° C e, algumas linhagens, dessa espécie produzem toxina do tipo F. No cultivo em caldo PYG, o C. baratii são bacilos retos, de 0,5 a 1,9 µm de diâmetro e 1,6 a 10,2 μm de comprimento; imóveis. Os esporos são redondos ou ovais subterminais ou terminais, deformando a parede celular. O crescimento é inibido por 6,5 % de NaCl ou 20% de bile. No AS, as colônias são circulares ou apresentam contornos irregulares; são chatas ou ligeiramente convexas, translúcidas ou opacas lisas, brilhantes e seu diâmetro é de 0,5 a 2 mm. Certas linhagens são betahemolíticas, outras com hemólise alfa e outras sem hemólise. No caldo PYG, o crescimento forma um sedimento abundante depois de cinco dias, em um pH de 4,5 a 4,8. Após o cultivo no caldo PYG, os principais produtos terminais do metabolismo são ácido butírico, ácido acético e ácido lático. Todas as linhagens produzem quantidades pequenas de ácido fórmico propiônico e ácido succínico. O C. butyricum não é proteolítico (carne ou leite), não hidrolisa a gelatina não produz lipase; degrada a pectina; sua temperatura ótima de crescimento está entre 30 e 37° C e certas linhagens produzem toxina Tipo E. As bactérias se apresentam como bastonetes retos com extremidades arredondadas no crescimento no caldo PYG; com 0,5 a 1,7 µm de diâmetro e 2,4 a 7,6 μm de comprimento; agrupados em cadeias curtas; móveis por cílios peritríquios. Os esporos são ovais; geralmente não deformam a parede celular, ocupando a posição central ou subterminal. O crescimento é estimulado pela adição de açúcar, mas inibido por 6,5 % de NaCl. No AS, as colônias possuem um diâmetro de 1 a 6 mm; são circulares ou com contornos irregulares, geralmente convexas; translúcidas; lisas; Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 brilhantes; de coloração esbranquiçada ou cinzenta. No caldo há formação de sedimento, apos 5 dias de incubação; o pH fica entre 4,6 – 5,0. Os principais produtos do metabolismo produzidos em caldo PYG são ácido butírico, ácido acético e ácido fórmico. Pode haver formação de ácido lático, ácido succínico, etanol e butanol. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 BOTULISMO Prof. Marcos Gomes INTRODUÇÃO Botulismo é uma afecção nervosa, apirética causado por neurotoxinas; possui distribuição mundial e descrita no homem e nos animais (Tabela 1). Em todas as espécies se observa paralisia flácida, mas sem problemas de consciência e sem sinais sensitivos. Tabela 1. Neurotoxinas e os hospedeiros preferenciais ___________________________________________________________________________ Neurotoxinas Hospedeiros Preferenciais afetados ___________________________________________________________________________ BoNT/A Galinhas, homem BoNT/B Equinos, bovinos, homem BoNT/C Aves, bovinos, caninos, martas, ferrets, raposas, equinos, suínos BoNT/D Bovinos BoNT/E Peixes, aves, homem BoNT/F Homem BoNT/G Homens? ______________________________________________________________________________________ BoNT — botulinum neurotoxin. No homem, as toxinas associadas com a intoxicação são principalmente as toxinas A, B, E e excepcionalmente as toxinas C e F. Nos animais, o botulismo é essencialmente causado pelas toxinas C e D e mais raramente, as toxinas A, B e E. É uma doença grave caracterizada por paralisia flácida e alterações respiratórias importantes causadas pela ação das diferentes neurotoxinas produzidas, principalmente pelo C. botulinum. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 HABITAT O C. botulinum e o seu esporo estão distribuídos em todos os lugares. É freqüente nos solos e sedimento marinho de todo o mundo. O esporo é freqüentemente detectado na superfície de frutas, vegetais e frutos do mar. MORFOLOGIA E COLORAÇÃO O C. botulinum possui sete diferentes neurotoxinas que não podem ser diferenciadas, tendo com base a morfologia. São bastonetes grandes que aparecem em cadeias curtas ou em unidades individuais. Possuem 0,5-0,8 μm de diâmetro e 3-6 m de comprimento; móveis quando jovens com flagelos peritríquios. Os esporos são ovais, cêntricos ou excêntricos; Gram positivos, mas em cultivos velhos mostram-se Gram negativos. CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E BIOQUÍMICA As colônias crescem na profundidade do Agar e estão cobertas por uma penugem. As colônias superficiais são grandes, semitransparentes com bordos irregulares. Meios preparados com fígado promovem melhor crescimento do que músculo. O C. botulinum liquefaz a gelatina, produz ácido e gás da glicose, levulose e maltose. O ácido acético é o principal produto metabólico produzido por todas as amostras. Conforme a amostra produz outros ácidos graxos, como: ácido propiônico, butírico, isovalérico, valérico e iso-capróico. São anaeróbios estritos, mas não são difíceis nas exigências culturais. Cresce melhor em torno dos 30ºC. RESISTÊNCIA Os esporos são muito resistentes, podendo resistir à fervura por 30 minutos por várias horas. Resistem a autoclavação a 120º C por 20 minutos. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 INATIVAÇÃO DAS TOXINAS As toxinas podem ser inativadas pelo calor (30 min a 80° C, por qualquer tempo a 100° C) e pelo hipoclorito de sódio (NaOCl a 0,1 %, durante 30 min). Os raios solares inativam as toxinas em 1 a 3 horas. As toxinas são inativadas em 12 horas quando em aerobiose e na escuridão. A cloração clássica utilizada para o tratamento das águas potáveis destrói 84% das toxinas em 20 minutos. SOROLOGIA E TIPOS TOXIGÊNICOS As toxinas botulínicas produzidas pelo C. botulinum são classificadas de acordo com o tipo. Há 8 tipos de exotoxinas produzidas das quais 7 são neurotoxinas. As toxinas A, B e E são, freqüentemente relacionadas à doença no homem. A neurotoxina C1 e D são mais freqüentes nos animais domésticos e aves. A neurotoxina do tipo B tem sido observada em bovinos e eqüinos. O tipo C1 é mais freqüente em cães. O tipo C2 não é considerado uma neurotoxina, mas causa alteração da permeabilidade vascular nos tecidos e diarréia em casos de botulismo das aves. As neurotoxinas são produtos antigenicamente distintos, entretanto os efeitos neurológicos são similares. As toxinas interferem com a liberação de acetilcolina dos neurônios colinérgicos da junção neuro-muscular e sinapses autônomas, provocando uma paralisia flácida e alterações no sistema nervoso autônomo. TOXICIDADE E PATOGÊNESE A toxigenicidade da amostra do tipo D necessita da presença do bacteriófago. Os tipos A, B, E e F são provavelmente saprófitos do solo e ambientes aquáticos. As do tipo C e D são parasitos obrigatórios do trato digestivo dos mamíferos e aves. A toxina existe como um complexo de moléculas de toxina e uma hemaglutinina de 500.000 (peso molecular). As toxinas das cepas não proteolíticas, incluindo os tipos C, D, E e G e poucas cepas do tipo B requerem exposição à enzimas proteolíticas (tripsina) para a expressão da atividade tóxica. A toxina ativada pode ter mais que 2,6 X 108 LD50 por miligrama de nitrogênio. As toxinas botulínicas podem ser produzidas em temperaturas abaixo de 30º C. Somente um Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 tipo de toxina é normalmente produzido por uma cepa, muito embora os tipos C e D possam produzir múltiplas toxinas. As toxinas botulínicas são sintetizadas como uma única cadeia polipeptídica inativa com 150 kDa que é liberada pela lise bacteriana. As proteases bacterianas e tissulares clivam a toxina para uma molécula ativa composta de uma cadeia pesada e outra leve conectada por uma única ponte dissulfeto. A toxina é absorvida pelo trato gastrintestinal desloca-se ate a corrente circulatória até as sinapses no SN periférico. MECANISMO DE AÇÃO A toxina liga-se; é internalizada na junção nervosa e altera a liberação de neurotransmissores. Há tecnicamente três regiões funcionais para a toxina: 1) A porção carboxi-terminal da cadeia pesada orienta a ligação neuroespecífica. 2) A porção amino-terminal da cadeia pesada orienta a penetração celular e a translocação de membranas. 3) A cadeia leve é responsável pelo bloqueio da liberação do neuro-transmissor. A toxina liga-se à grande molécula carregada negativamente nas terminações nervosas que consiste de poli-sialo-gangliosídios e outros lipossomas ácidos. Então, ela move-se, lateralmente para ligar-se ao receptor protéico específico que internalizada a toxina. A toxina é internalizada na terminação nervosa que não é mais acessível à neutralização pela antitoxina. A toxina botulínica permanece no local da junção neuromuscular onde passa a interferir com a liberação de acetilcolina. O botulismo normalmente é decorrente da ingestão de alimento contaminado com a toxina pré-formada. A toxina pode ser elaborada na carcaça ingerida ou que contaminou indiretamente outro alimento. As larvas de insetos que se desenvolvem em carcaças onde a toxina foi elaborada podem carrear suficiente toxina para atingir as aves quando estas se alimentam desses insetos. Outra possibilidade é a decomposição da vegetação que ocorre próximo a margens de lagos e rios os quais propiciam um ambiente favorável para síntese da toxina. Aves aquáticas que se alimentam nestas áreas podem desenvolver botulismo. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Restos de alimentos e farinha de carne são origens bem conhecidas da toxina botulínica para raposas e martas. Afosforose em bovinos e ovinos produzem uma alteração do apetite chamada de "pica" a qual provoca a ingestão de ossos, ou de carcaças em decomposição. Esta depravação do apetite pode levar à ocorrência de botulismo. A doença é chamada, na África do Sul, de “lamsiekte” (“lame sickness”), pois nesta enfermidade há claudicação devido à hipofosforose ou osteomalácia. A doença existe onde há deficiência de fósforo no solo, bem como, a ingestão de ossos (pica). Na Holanda, o botulismo em bovinos foi relacionado com os resíduos de grãos de cervejaria contaminados com o C. botulinum tipo C. O botulismo toxinfeccioso é uma forma da doença observada, inicialmente nos Estados Unidos, (Kentucky) onde o C. botulinum produziu toxina em áreas necróticas do corpo. Potros de 2 a 8 semanas foram afetados após a absorção da toxina. Evidenciaram lesões típicas da síndrome dos potros: disfagia aguda, tremores, fraqueza, prostração e morte. Áreas de necrose localizadas no estômago, umbigo, abscessos pulmonares e feridas estavam colonizadas pelo C. botulinum. Os esporos responsáveis pelo botulismo estão difundidos no ambiente. Este fato necessita de pré-requisitos incluindo: a) Contaminação de um substrato importante pelo organismo. b) Multiplicação dos organismos e produção da toxina. c) Sobrevivência da toxina aos processos líticos que a degrade. d) Ingestão da toxina pelo hospedeiro suscetível. Após a ingestão da toxina, ela atravessa a parede intestinal em direção à corrente sangüínea e linfática. A hemaglutinina a protege contra a digestão fisiológica. As bactérias no rúmen dos bovinos e ovinos inativam uma quantidade substancial da toxina ingerida, fazendo com que a dose letal (oral) para estes dois animais sejam bem maiores que para as outras vias. Esta observação é importante em relação ao manuseio de amostras (conteúdo ruminal) para pesquisa da toxina. As amostras devem ser congeladas até a realização dos testes laboratoriais. Na corrente sangüínea, a toxina é carreada ao sistema nervoso periférico onde se liga aos gangliosídios na junção neuromuscular. A Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 toxina penetra na célula nervosa, ligando-se a superfície interna da membrana nervosa, impedindo a liberação de acetilcolina. A toxina botulínica age somente nos nervos colinérgicos do sistema nervoso periférico. A barreira hemato-encefálica protege os nervos colinérgicos do cérebro da ação da toxina. O sinal clínico no animal intoxicado é a paralisia flácida que progride, envolvendo a musculatura respiratória resultando em morte. Há alterações na visão, na locomoção e na deglutição. A língua geralmente permanece paralisada e a deglutição torna-se difícil pela paralisia faringeana, levando a uma paralisia respiratória e morte. Nas aves, há paralisia nas asas, pernas, pescoço. As aves não conseguem retrair a membrana nictitante. Os suínos e os animais carnívoros são normalmente resistentes a toxina botulínica. A doença do tipo C1 tem sido registrada em cães. DIAGNÓSTICO (Clínico e Laboratorial) O diagnóstico do botulismo, assim como no tétano, está baseado na história e sinais clínicos. Numerosos animais podem estar envolvidos, sugerindo uma fonte comum de toxina. O exame rotineiro de sangue é normal, exceto quando há infecção bacteriana secundária. Amostra de líquido cefalorraquidiano é normal O diagnóstico definitivo está baseado na detecção da toxina em aproximadamente 10 ml de soro (colhido no início do quadro clínico) ou em 50 gramas de fezes, vomito amostras de alimento ingerido. A prova diagnóstica laboratorial do botulismo nos animais é a demonstração da toxina no soro, no vomito, no conteúdo ruminal, no conteúdo intestinal e no alimento. O soro, o filtrado intestinal e o filtrado alimentar devem ser inoculados em camundongos. A proteção passiva é uma prova indireta da presença da toxina. O nível de toxina nos animais afetados é de cerca de 20 LD50 em camundongo. As amostras de alimentos suspeitos e conteúdo intestinal devem ser tripsinizadas antes da inoculação, para ativar a toxina precursora. A prova de ELISA está indicada na detecção de toxinas dos tipos A, B, E e G, entretanto não são aplicáveis na rotina laboratorial. A presença de esporos do C. botulinum está disseminada em amostras ou materiais suspeitos o seu valor fica limitado. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 TRATAMENTO A terapia do botulismo é centrada no tratamento de suporte. Monitorar a hidratação. Assistência quanto à água e alimentos. Megaesôfago e diminuição no reflexo de deglutição podem levar a pneumonia por aspiração (falsa via). Antimicrobianos são indicados no caso de complicações secundárias. Aminoglicosídeos devem ser evitados, pois eles interferem com a transmissão neuromuscular e piora o quadro paralítico. Monitoramento da excreta (urina e fezes) pela retenção. Abrigo e rotação do animal para o seu conforto. O uso de antitoxina pode não ser disponível, mas é controverso. A antitoxina só é eficiente quando a toxina ainda não foi absorvida pelo sistema nervoso. Antitoxinas potentes contendo o tipo C1 estão indicadas nos cães severamente acometidos quando administrado o mais rápido possível, isto é, nos primeiros 5 dias. Animais com sinais clínicos leves recuperam-se espontaneamente. A administração de antimicrobianos é controversa, pois poderiam piorar os sinais clínicos pela liberação de mais toxina pela lise bacteriana ou poderiam promover a colonização intestinal do organismo do botulismo. IMUNIZAÇÃO E CONTROLE Antitoxinas homólogas protegem os animais contra o botulismo. A vacinação nas aves não está aplicada à rotina visto que a ocorrência da doença é esporádica. A vacinação é indicada nas regiões de alto risco como África do Sul e Austrália, assim como, em certas populações (animais de zoológico). Em algumas áreas são utilizadas toxóides polivalentes. Na Austrália, os ovinos e bovinos são imunizados duas vezes e, posteriormente revacinação anual. No Brasil e África do Sul, toxóides C e D são efetivos no programa de vacinação. As duas primeiras com adjuvante oleoso e a vacinação de manutenção em solução aquosa. A toxina livre pode ser inativada pela administração de antitoxina polivalente. A resposta é Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 dependente da quantidade de toxina ligada e ao tipo de toxina. A antitoxina é ineficaz se a toxina estiver ligada à membrana da célula nervosa. Esforços devem ser feitos para esvaziar o trato gastrintestinal com a aplicação de purgativos. Correção do solo e pastagens com cálcio e fósforo diminui acentuadamente os casos da doença. Tabela 1. Distribuição, Hospedeiros e Enfermidades associadas aos Tipos do C. botulinum Amostra Distribuição Hospedeiro(s) A Homem América do Norte Bov., eqüinos B C1 Doença(s) Botulismo I ntoxicação pela forragem Aves “Limberneck” Martas Botulismo América do Norte Homem Botulismo Europa Bov. eqüinos (potros) Intoxicação pela forragem Aves “Limberneck” Martas Botulismo Potros “Shaker foal syndrome” América do Norte Patos “Limberneck” Austrália Aves silvestres. “Western Duck disease” Canadá Homem Botulismo Europa Martas Botulismo Aves Diarréia C2 Não é neurotoxina D África do Sul Bovinos “Lamzieekte” E União Soviética Homem Botulismo América do Norte (Grandes Lagos) F América do Norte Homem Botulismo Homem ? Botulismo ? Dinamarca G Argentina Suíça Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostrídios Invasivos Clostridium perfringens Prof. Marcos Gomes Enterotoxemias Enterites agudas Doença do rim pulposo INTRODUÇÃO O Clostridium perfringens foi isolado, pela primeira vez, por Welch e Nuttall, em 1892, de um cadáver (homem) em adiantado estado de decomposição. Em 1900, Migula propôs a denominação de Bacillus welchii em homenagem ao pesquisador americano. HABITAT O agente está amplamente distribuído nos solos e trato alimentar de quase todos os animais de sangue quente. É geralmente encontrado como invasor do trato alimentar após a morte. É necessário cuidado no isolamento deste clostrídio após a morte. Este agente é encontrado, na gangrena gasosa do homem, dos animais, ou associado aos outros anaeróbios, neste processo. ENFERMIDADES Está associado às lesões semelhantes ao edema maligno, especialmente nos ovinos. Existe variação toxigênica desses microrganismos responsáveis por toxemias fatais em ovinos, bezerros, leitões e no homem. Essas variações podem ser divididas em cinco tipos: A, B, C, D e E, tendo como base a produção de quatro principais toxinas letais. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO O C. perfringens é um bastonete reto e grosso; possui apresentação individual, aos pares ou raramente, em cadeias; possui 1,0 μm de Ø e 4 - 8 µm de comprimento; esporos ovais e pequenos, geralmente não deformando a parede celular do bastonete; não são formados em meio muito ácido; amostras com capacidade variável de esporular. Algumas vezes, é difícil encontrar esporos, independentemente do meio de cultura; esporulação nos tecidos é incomum; nos cultivos velhos torna-se pleomórfico, aparecendo como clavas, como células gordas ou filamentos; cápsula formada nos tecidos e meios de cultura; não possui flagelos; Gram positivos, mas tornam-se Gram variáveis com os subcultivos. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS E BIOQUÍMICAS As colônias do C. perfringens no AS são circundadas por dois tipos de hemólise; uma estreita com hemólise completa e outra externa com hemólise incompleta. No meio de gema de ovo forma-se um precipitado esbranquiçado no meio como resultado da atividade da lecitinase (da fosfolipase C). As colônias são pequenas e biconvexas no agar profundo. O cultivo desse agente em meio contendo glicose ou outro substrato fermentável produz uma grande quantidade de gás que causa rompimento do selo de parafina com facilidade. O C. perfringens liquefaz a gelatina rapidamente, mas não o meio de ovo coagulado ou o meio soro de Loeffler. Cresce bem em meio de carne cozida ou Tarozzi, produzindo uma quantidade enorme de gás. Fragmentos de carne ou fígado tornam-se róseos, não digeríveis e com um odor desagradável que é chamado de “stormy fermentation” ocorre no “litmus milk”. C. perfringens produz ácido e gás da glicose, levulose, galactose, manose, maltose, lactose, sacarose, xilose, trealose, rafinose, amido, glicogênio e inositol. Os produtos de fermentação incluem: ácido acético e ácido butírico. ANTÍGENOS E TOXINAS A base de classificação dos C. perfringens está na produção de quatro toxinas principais (alfa, beta, épsilon e iota). Estas toxinas são proteínas com atividade enzimática; Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 lábeis ao calor e antigênicas, podendo ser utilizadas como toxóides pela ação de químicos que a inativam sua toxigenicidade sem perder sua antigenicidade. A alfa toxina é uma fosfolipase C que foi a primeira toxina bacteriana com o mecanismo de ação bioquímico elucidado. As principais toxinas produzidas pelo C. perfringens e suas doenças associadas estão mostradas nos quadros 2 e 3 abaixo. Outras toxinas menos importantes incluem: a hialuronidase, desoxirribonuclease, colagenase e proteinases. ETIOPATOGENIA O C. perfringens é distribuído na natureza, fazendo parte da flora intestinal dos animais hígidos. Dieta rica em proteína faz aumentar a população desses microrganismos nos intestinos. Tipo A Amostras do tipo A estão bem adaptadas em sobreviver no solo enquanto que as do tipo B, C, D e E estão mais adaptadas ao intestino. O C. perfringens é a causa mais comum de miosite necrotizante em eqüinos como seqüela de ferimentos ou injeções. O C. perfringens tipo A causa uma doença chamada “yellow lamb disease” que ocorre na Califórnia e no Oregon, durante a primavera. Os animais apresentam: depressão, anemia, icterícia e hemoglobinúria, morrendo em 6 a 12 horas, após os primeiros sinais clínicos. A toxina alfa é produzida no intestino delgado; absorvida pela circulação, causando hemólise intravascular maciça e lesão vascular. Nos leitões ela se apresenta como uma diarréia aquosa e amarelada em animais abaixo de cinco dias, geralmente aos três dias e com alta morbidade e baixa mortalidade. Tipo B O C. perfringens tipo B está relacionado com a disenteria dos cordeiros. A doença ocorre na Inglaterra, Escócia, País de Gales, África do Sul e Oriente Médio. O cordeiro Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 infecta-se com a mãe ou ambiente, durante os primeiros dias de vida. A população de organismos aumenta naqueles animais que ingerem grandes quantidades de leite. A toxina beta causa lesões hemorrágicas e necrose da mucosa intestinal (intestino delgado). Os animais acometidos morrem em poucas horas, após os primeiros sinais de dor abdominal, desinteresse pelo mamar e sangramento contínuo. O agente causa enterite hemorrágica em cordeiros, cabritinhos, terneiros e potros. Tipo C O C. perfringens tipo C está associado à enterotoxemia em muitas espécies animais. Enterite necrótica e hemorrágica em terneiros e cordeiros. Nos cordeiros, a doença assemelha-se à disenteria dos cordeiros. A doença nos bezerros é geralmente observada em animais vigorosos, saudáveis e com menos de uma semana de vida. A enterite hemorrágica é causada pela beta toxina, podendo ser demonstrada no conteúdo intestinal fresco. Ela é muito lábil e, facilmente desnaturada pela ação enzimática no intestino, sendo de pouco valor a sua ausência como prova diagnóstica. Leitões com uma semana de idade podem exibir enterite hemorrágica com grande mortalidade. Na necropsia são observadas lesões de enterite grave, mostrando áreas de necrose na mucosa do jejuno. A doença é freqüente no Reino Unido, Estados Unidos e Dinamarca e, uma vez estabelecida na propriedade, tornase enzoótica. A beta toxina é aparentemente responsável por lesões intestinais de aves que apresentam fraqueza e disenteria. A doença dos ovinos adultos é chamada de “Struck” ou doença do Romney Marsh é causada pelo C. perfringens tipo C. O organismo está no solo em áreas de criação de da raça Romney March na Inglaterra. A doença é vista no início da primavera. Por razões desconhecidas, o microrganismo multiplica-se no abomaso e intestino delgado, produzindo a toxina beta. A toxina beta causa necrose da mucosa intestinal. Disenteria ou diarréia raramente são observadas. Em alguns casos, há evidência de toxemia pelo acúmulo de fluido na cavidade peritoneal e torácica, sem lesões visíveis no trato intestinal. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Tipo D Em áreas endêmicas, muitos animais albergam o C. perfringens tipo D em várias partes do trato digestivo. Essas amostras podem prover a origem para a infecção fatal se as condições são favoráveis para o rápido e profuso crescimento do microrganismo no intestino. Essa condição está associada à súbita mudança de uma dieta pobre para uma dieta rica ou excessiva ingestão de alimentos palatáveis; daí o termo doença da superalimentação. A flora ruminal normal é composta de organismos digestores da celulose, mas na mudança brusca da dieta há um desequilíbrio dessa flora e parte desse alimento passa indigerível para o intestino delgado. A presença do amido não digerido, no intestino favorece o profuso crescimento do organismo e conseqüentemente produção da toxina. Não se sabe como o tipo D supera o crescimento do tipo A, pois o tipo D está inicialmente, em desvantagem pelo tipo A. A prototoxina épsilon possui baixa toxicidade; é liberada pela multiplicação de bactérias na luz do intestino delgado e ativada por enzimas digestivas como a tripsina. A ativação máxima em toxina épsilon é alcançada pela combinação da tripsina e quimiotripsina, aumentando a toxicidade em pelo menos 1.000 vezes. A toxina épsilon purificada possui um peso molecular de aproximadamente 32 Da e toxicidade por volta de 3,2 X 106 DML / mg quando testada intravenosa em camundongos. A estrutura funcional molecular da toxina não é conhecida, mas alguns resíduos importantes de aminoácidos para a sua função foram identificados. A conversão da prototoxina em toxina épsilon totalmente ativa ocorre pela remoção de um peptídeo Nterminal. A produção da toxina épsilon pela bactéria é codificada pelo gene contido em um grande plasmídio presente somente no C. perfringens tipo D ou B. A toxina épsilon não atua ou age diretamente sobre a mucosa intestinal e pequenas quantidades da toxina épsilon na luz intestinal são inócuas, mas quando altas concentrações persistem no intestino por muitas horas, há um aumento da permeabilidade intestinal levando a absorção de mais toxina na circulação sistêmica. A toxina tem um efeito de permease sobre a mucosa intestinal, aumentando sua própria absorção. A toxina ativada Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 seletivamente afeta o cérebro e, em certo grau, os rins e outros tecidos. O efeito no cérebro é manifesto por alterações dos capilares cerebrais tornando-os permeáveis às proteínas plasmáticas e água, resultando num rápido extravasamento de fluidos no cérebro e aumento da pressão intracerebral. O aumento de pressão favorece o aparecimento dos sinais do SNC, tais como incoordenação e convulsões. Edemas e efusões também ocorrem em diversos graus no pulmão, pericárdio e outras cavidades serosas. O C. perfringens tipo D é responsável pela enterotoxemia dos ovinos (doença do rim pulposo ou doença da superalimentação), ocorrendo em áreas de criação de ovinos no mundo inteiro. O agente é encontrado no solo e trato digestivo dos ovinos saudáveis. O sistema intensivo de criação, confinamentos ou a preparação para exposições são fatores estressantes e predisponentes da doença. A toxina épsilon se liga aos receptores na superfície do endotélio vascular particularmente do cérebro e as células renais da alça de Henle, túbulos contorcidos distais e sinusóides hepáticos. O local de grande afinidade para a toxina épsilon pode ser uma sialoproteína localizada nas membranas sinápticossomais. A degeneração das células do endotélio vascular permite alterações na dinâmica dos fluidos e perda das proteínas plasmáticas. Estudos ultraestruturais do cérebro evidenciaram que as junções próximas ao endotélio vascular são rompidas, causando processos de astrócitos perivasculares indo desde inchação até ruptura que causam edema intercelular e perivascular seguido de degeneração e necrose, tanto focal quanto difusa. Macroscopicamente, são observados focos de encefalomalácia simétrica bilateral no corpo estriado, área talâmica, mesencéfalo, hipocampo, e pedúnculos cerebrais. A extensão das lesões varia com o quanto a doença é aguda. Na doença da superalimentação há sinais patognomônicos de hiperglicemia e glicosúria. Trabalhos experimentais em ovinos e em animais de laboratório demonstraram que a hiperglicemia é o resultado da glicogenólise das reservas de glicogênio hepático. A toxina ligada ao hepatócito estimula a produção de AMP cíclico que por sua vez causa transforma glicogênio em glicose. A explicação mais plausível parece ser que o edema cerebral seria a lesão primária agindo na divisão simpática do sistema nervoso Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 autônomo estimularia a liberação de catecolaminas (epinefrina, norepinefrina, dopamina) via medular da suprarenal a qual ativa a adenilatociclase impulsionando a produção de AMP cíclico que por sua vez glicogenólise e hiperglicemia. Hiperglicemia junto com lesão renal leva a glicosúria. Esta seqüência de eventos provavelmente ocorre em menos de 1 hora após a toxina épsilon entrar na circulação sistêmica. A doença do rim pulposo é um tipo de autólise post mortem que ocorre rapidamente nos tecidos lesionados. A toxina épsilon é antigênica, estimulando a produção de anticorpos específicos mesmo quando a infecção do tipo D é subclínica. Trabalho experimental com anticorpo monoclonal mostrou que a resposta imune a um único epítopo da toxina épsilon é suficiente para proteger contra a toxina e a doença. Nos caprinos, a doença clínica pode ter a forma superaguda até crônica, evidenciadas pela diarréia sanguinolenta, associadas à enterocolite hemorrágica ou necrótica. A imunidade nos caprinos é frágil ou pequena. A suscetibilidade do trato intestinal dos caprinos ao C. perfringens tipo D é considerada responsável por esta diferença na patogênese entre ovinos e caprinos. Tipo E O C. perfringens tipo E está associado à enterite hemorrágica e necrótica em terneiros na Austrália. Sua patogenicidade em ovinos e bovinos não está bem esclarecida. O agente e a toxina estão presentes ao mesmo tempo no intestino de ovinos e bovinos durante o exame “post-mortem”, mesmo sem sinais de enterotoxemia por clostrídios. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Quadro 1. Características das principais Toxinas do C. perfringens Toxina Propriedades Mecanismo de ação Efeito no organismo ________________________________________________________________________________________ alfa Fosfolipase C (lecitinase) Hidrolisa lecitina na mitocôndria membrana celular fosfolipídios sanguíneos e endotélio capilar. Hemolít, leucocida;↑ permeab capilar. pela lesão endotelial; degeneração membrana plasmática muscular beta Necrotizante tripsina lábil Desconhecida Necrose da mucosa intestinal. épsilon Necrotizante e neurotóxica Lesão célula endotelial do cérebro Necrose liquefativa do tec. cerebral; Necrose córtex renal; ↑ Edema perivascular Produzido no cérebro e meninges. ↑ permeabilidade da mucosa intestinal iota Desconhecida Necrose da mucosa intestinal. Necrotizante, letal; ativ. enzim. prototoxina Quadro 2. Principais Doenças e Toxinas do C. perfringens A, B, C , D e E __________________________________________________________________________ Tipo Doença (s) Distribuição ____________________________________________ A “Yellow lamb disease” B Disenteria cordeiros Enterite hemor.(ov.,cap.) C Enterite necrótica cordeiros leitões, terneiros e aves Struck (ovinos) D E Enterotoxemia Doença superalimentação Doença do rim pulposo. Enterotoxemia Cordeiros e bezerros California Europa, África Sul Oriente médio, Irã Mundial T o x i n a s alfa beta épsilon iota α_______β______ε______ι____ +* - - - + +* + - + +* - - +* - Inglaterra Mundial + - América do Norte Inglaterra. Austrália + - - +* __________________________________________________________________________ *= A toxina mais importante na doença. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 DIAGNÓSTICO Na enterotoxemia, o conteúdo do intestino delgado, corado pelo método de Gram, com freqüência, contém elevado número de bacilos Gram positivos, semelhantes os C. perfringens. Esta prova possui valor limitado pela rápida multiplicação bacteriana que tem lugar, após a morte em todas as porções intestinais. É importante a identificação da toxina no conteúdo intestinal (delgado). Inocula-se pequena quantidade de (< 0,5 ml) do líquido clarificado na veia caudal de ratos. A morte acontece em minutos, constituindo em prova presuntiva da enterotoxemia. Noutro procedimento, se inocula uma mistura de três partes do líquido problema a uma parte de diferentes antitoxinas do C. perfringens. A interpretação dos resultados se realiza segundo o quadro abaixo. Quadro 4. Prova biológica entre as diferentes toxinas do C. perfringens em ratos. A prova intradérmica evidencia atividade necrosante em cobaia, utilizando o procedimento parecido sendo mais específica. Utiliza o cultivo em caldo. Os ensaios utilizam tanto sobrenadante tripsinizados como sobrenadante não tripsinizados, já que algumas toxinas são destruídas (B, C) e, outras sejam ativadas pela tripsina. As amostras Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 devem ser colhidas recentemente ou mantidas congeladas até o momento da realização da prova. A invasão dos tecidos antes da morte ocorre quando se trata de “Struck”, nos demais tipos de enterotoxemia, o isolamento e tipificação da toxina podem proporcionar uma prova confirmatória, visto que raramente são decisivas. Os cordeiros afetados com enterotoxemia causado pelo C. perfringens tipo D podem evidenciar presença de glicose na urina. TRATAMENTO A maioria dos casos, a doença é aguda e exige procedimento terapêutico rápido. O C. perfringens é sensível à: penicilina G, às tetraciclinas, ao cloranfenicol, à furazolidona, à bacitracina, à eritromicina, à lincomicina. É resistente aos aminoglicosídios. CONTROLE E PREVENÇÃO O Toxóide tipo-específico tratado pelo formol e precipitados pelo hidróxido de alumínio (alum) são imunobiológicos eficientes contra as enterotoxemias causadas pelo C. perfringens. Vacinas para o tipo B e C ou antissoro tem proteção cruzada para a beta toxina que é uma toxina importante para os dois tipos. Os antissoros B e C podem ser usados na proteção da disenteria dos cordeiros. Leitões podem ser protegidos contra a enterite necrótica do tipo C, pela imunização de porcas com o toxóide do tipo B ou C. Ovelhas devem ser vacinadas, tanto com o tipo B ou C, no verão e, poucas semanas antes do nascimento. Assim os cordeiros seriam protegidos passivamente pelo colostro da mãe. A vacinação contra o C. perfringens tipo D deve ser efetuada na mãe e, 10 dias após o nascimento e, novamente 2 a 6 semanas. Durante o surto da doença pode ser administrado soro hiperimune e toxóide ao mesmo tempo, seguido da aplicação de toxóide quatro semanas mais tarde. A administração de antimicrobianos na ração reduz a mortalidade de galinhas devida à enterite necrosante produzida pelo C. perfringens Tipo A. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium novyi Prof. Marcos JP Gomes Hepatite Necrótica (HN); Bighead; Gangrena Gasosa (GG). INTRODUÇÃO São microrganismos habitantes do solo. Tem distribuição mundial. É causa da hepatite necrótica dos ovinos e bovinos. Conhecidos como hepatite necrótica ou "Black disease", É causa de gangrena gasosa proveniente de ferimentos. Na Austrália, esses ferimentos (cabeça e face) de ovinos são devido às lutas entre si, sendo conhecida como "Bighead." O C. novyi tipo A causa gangrena gasosa, no homem e nos animais pela infecção de feridas. A lesão típica é edema como acontece no quadro de “bighead” de carneiros jovens; o edema da cabeça, pescoço e a parte cranial do tórax espalham-se rapidamente seguida da invasão do tecido subcutâneo lesionado pela luta. A hepatite necrótica infecciosa ou “black disease” dos ovinos e bovinos resulta das infecção do C. novyi tipo B. Os esporos em latência germinam no fígado lesionado pela migração de fasciolas e os efeitos sistêmicos resulta em morte (aguda ou superaguda) seguida da disseminação da toxina alfa. Seus efeitos hepatotóxicos histotóxicos e cardiotóxicos produzem edema difuso nas serosas e necrose hepática focal (Elder and Miles 1957). O nome “black disease” deriva da característica escurecida por baixo da pele devido a congestão venosa. A morte súbita de porcas tornou-se um problema emergente que está associado à multiplicação de C. novyi tipo B no fígado ou no parto (Elder e Miles, 1957; Friendship e Bilkei 2006). Clostridium novyi tipo D normalmente chamado de C. haemolyticum causa hemoglobinúria bacilar do gado e outros ruminantes. A patogenia é semelhante à hepatite necrótica ou black disease, especialmente na migração das formas jovens da F. hepática e causando lesão hepática predispondo a ocorrência da doença. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Alem da gangrena gasosa causada pelo C. novyi tipo A, recentemente tem sido reconhecida como causa de septicemia em dependentes de drogas, o Clostridium botulinum, que fazem o uso de drogas por via intramuscular (Ryan et al. 2001; McGuigan et al. 2002). A média de idade dentre os 60 casos foi de 30 anos e a maioria injetou heroína ácida via extravenosa. Os casos fatais foram próximos a 90% (McGuigan et al. 2002). A produção diferencial entre as toxinas α e β é o principal fator fenotípico. O C. novyi produtor de toxina α pertence à família das grandes citotoxinas que modificam as pequenas proteínas de ligação GTP as quais afetam o citoesqueleto (Just e Gerhard 2004; Schirmer e Aktories 2004; Ziegler et al. 2008). A atividade enzimática da toxina intacta tem aproximadamente 550 fragmentos de aminoácidos e a mutação no resíduo do ácido aspártico dentro deste fragmento reduz dramaticamente a atividade da enzima (Busch et al. 2000). A alfa toxina especificamente modifica a subfamília de proteínas Rho (Rho, Rac, Cdc42, e RhoG) pela N-acetil-glucosaminilação da Thr -37 (Selzer et al. 1996). A toxina β do C. novyi tipo D é uma fosfolipase C (FLC) (Hauer et al. 2004 ). É uma proteína de 42,869Da e mostra alto grau de homologia com as fosfolipases C. Sua extremidade N terminal possui resíduo de ligação ao Zn 2+ que são comuns para essas enzimas. A extremidade C terminal é altamente homóloga a região equivalente da fosfolipase C do C. novyi tipo A, a toxina α do C. perfringens e a fosfolipase C do Clostridium bifermentans (Hauer et al. 2004). Esporos mutantes não toxigênicos obtidos por engenharia genética do C. novyi administrados endovenosamente germinam e produzem lesão tecidual somente em determinadas condições de redução de oxigênio aquelas encontradas em tumores sólidos. Esta abordagem é agora aplicada em testes clínicos (Wei et al. 2008). Não há tratamento eficaz contra as infecções por C. novyi, mas a profilaxia com toxóides é eficaz. Uma segunda geração de imunógenos veterinários pode estar baseada no toxóide α, tanto natural como recombinante (Amimoto et al. 1998). Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 MORFOLOGIA & COLORAÇÃO O Clostridium novyi é um bastonete grande, medindo 5 a 10 m de comprimento e 1 a 1,5 m de diâmetro; esporo oval central ou subterminal; deforma o corpo bacteriano; acapsulado; possui flagelo peritríquios; móveis sob condições de anaerobiose; G positivo quando jovens, mas tornam-se Gram variáveis. O C. novyi é anaeróbio estrito, sendo difícil cultivá-lo no isolamento primário. O crescimento pode ser melhorado com a adição de glicose, sangue ou cérebro. As colônias são chatas com bordos irregulares que se espalham na superfície do Agar como um “filme” de crescimento transparente. Há hemólise, após 48 a 72 de incubação. No meio de carne cozida, o crescimento é lento e a carne torna-se rósea. A gelatina é liquefeita e o soro coagulado, mas não digerido. As colônias quando crescidas em meio contendo gema de ovo produzem uma zona de precipitação opalescente (Reação de Nagler), devido à produção de lecitinase (gama toxina) pelo C. novyi tipo A e devido à beta toxina do tipo B e D. A fermentação de carboidratos é variável. A grande maioria produz ácido e gás da glicose, mas não fermentam a lactose. RESISTÊNCIA Os esporos podem resistir a 95º C por 15 minutos, mas são destruídos a 120ºC durante 5 min. Morrem rapidamente quando expostos aos hipocloritos. Resistem 1 hora quando expostos a 10% de fenol, 10% de formalina ou 0,1% de mertiolato. Os esporos podem permanecer viáveis por muitos anos nos solos e em carcaças de animais mortos. ANTÍGENOS E TOXINAS O C. novyi está dividido em 4 tipos (A, B, C e D). Os mais importantes destes componentes tóxicos em relação à etiologia são: (α) alfa, (β) beta, (γ) gama, delta (δ) e epsilon (ε) toxinas e os quatro tipos de organismos, segundo evidencia o Quadro 1 abaixo. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Quadro 1. Enfermidades Causadas pelas Toxinas do C. novyi (A,B,C e D). Tipo Espécie animal Doença T o x i n a alfa beta gama delta épsilon α______ β______ γ____ δ______ε___ A Ovinos, bovinos GG *++ - + + + B Ovinos, bovinos HN *++ + - - - C Búfalos - - - - - D Bovinos, ovinos - *+++ - - - α: letal Osteomielite? HB β: lecitinase γ: fosfolipase D δ: hemolisina s ε: lipolítica ETIOPATOGENIA O C. novyi está presente no solo e intestino dos herbívoros, podendo causar GG em: eqüinos, bovinos, ovinos, caprinos, suínos e animais de laboratório. O organismo pode contaminar a superfície de feridas cutâneas e, menos freqüentemente, causar infecções intestinais. Na ferida infectada, desenvolve-se lesão de GG que se assemelha àquela causada pelo C. septicum e diferenciada em laboratório. Tipo A “Big head” é uma enfermidade comum na Austrália, caracterizada por lesões na face e cabeça de reprodutores ovinos belicosos. Na superfície ferida há desenvolvimento do C. novyi tipo A e produção de toxinas, causando edema gelatinoso grave com posterior toxemia. A alfa toxina é responsável pelo edema gelatinoso e morte do animal. Tipo B “Black disease” ou Hepatite necrótica (HN) é uma hepatite crônica, principalmente de ovinos e bovinos, ocorrendo em regiões infectadas pela F. hepatica. O clostrídio está presente no solo, no intestino de herbívoros e sob a forma de esporo no fígado, em áreas endêmicas de fasciolose. A patogenia da doença está relacionada com a migração de formas Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 imaturas no fígado, proporcionando as condições necessárias ao desenvolvimento do C. novyi no fígado. Os esporos passam para a forma vegetativa; há multiplicação dos microrganismos; produção de grandes quantidades de alfa toxina e a morte por toxemia. DIAGNÓSTICO As lesões hepáticas contêm bacilos de grande tamanho, desde Gram positivos até Gram variáveis com esporo grande de forma ovalada que podemos identificar mediante o conjugado fluorescente anti-C. novyi (Wellcome Diagnostics, Dartford, UK). A anamnese e as lesões indicam o diagnóstico clínico, mas o diagnóstico final deve ser confirmado, no laboratório, utilizando amostras de fígado e uso da imunofluorescência (IF). ENVIO DE AMOSTRAS É importante que o material suspeito seja enviado o mais rápido possível, e que o exame bacteriológico seja realizado pouco tempo após a morte. Após a inoculação em meio de carne cozida ou Tarozzi, a amostra deve ser submetida a 65º C por 15 minutos para destruir as bactérias contaminantes, seguido da incubação anaeróbia a 37ºC, durante 24 a 48 horas. É importante lembrar que este clostrídio é anaeróbio estrito e de crescimento difícil. Cobaias podem ser utilizadas como animais para a inoculação experimental, causando edema subcutâneo grave seguido de morte. CONTROLE E PREVENÇÃO Os animais são imunizados contra a doença com toxóide concentrados pelo alum. Duas doses de vacina imunizam bem os animais, conferindo um ano de proteção. No caso de surtos da doença pode ser utilizado soro hiperimune. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium haemolyticum Prof. Marcos JP Gomes Hemoglobinúria Bacilar (HB) INTRODUÇÃO O Clostridium haemolyticum está intimamente relacionado com o Clostridium novyi Tipo D sendo causa da Hemoglobinúria Bacilar (HB) dos bovinos (“Red Water Disease”, Doença Hemorrágica ou Icterohemoglobinúria infecciosa) e ocasionalmente, em ovinos. MORFOLOGIA E COLORAÇÃO O C. haemolyticum é maior que os outros clostrídios invasores; mede 1 a 1,3 m de diâmetro e 3 a 5,6 m de comprimento; apresentam-se sozinhos ou em cadeias curtas nos tecidos e no cultivo; esporo oval e subterminal; causa aumento de volume na célula em que se aloja; ativamente móveis quando jovens; Gram positivos quando jovens, mas perdem rapidamente a capacidade de manter-se corado. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS E BIOQUÍMICAS As colônias crescidas no AS são lenticulares e, mais tarde, tornam-se lanosas. A formação de gás é pequena ou nenhuma, exceto se açúcar for adicionado ao meio de crescimento. São hemolíticas. Liquefaz a gelatina em dois a quatro dias, mas não amolece nem liquefaz o soro coagulado e o meio ovo. Os meios com carne cozida e o meio cérebro suportam bem o crescimento, entretanto não há digestão dos sólidos ou enegrece o meio. Não ataca o leite. Glicose e levulose são os açúcares que são fermentados por este clostrídio. Forma grande quantidade de H2S no meio de fígado ou meio com peptonaproteose. Forma grande quantidade de indol. É negativo para a prova do VM / VP. O C. haemolyticum é muito exigente em suas necessidades de crescimento e multiplicação. Boas condições de anaerobiose e meios, contendo triptofano para crescimento ótimo e formação da toxina. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 ANTÍGENOS E TOXINAS O C. haemolyticum / C. novyi tipo D possuem o mesmo padrão protéico no PAGE, sendo desta maneira, indistinguíveis. Este clostrídio produz toxina beta enquanto que o C. novyi tipo B produz toxina alfa e beta. A toxina beta tem peso molecular de 32.000 D e é lábil à tripsina. ETIOPATOGENIA Acreditou-se que o agente existisse somente na região das Montanhas Rochosas, nos Estados Unidos. Mais tarde, verificou-se que ela ocorria no Golfo do México, Flórida, México Central, País de Gales, Nova Zelândia, Romênia, Turquia e América do Sul. A doença está relacionada ao pastejo em áreas pantanosas em que o pH é próximo a 8 ou mais alto. O microrganismo mostra uma predileção por águas alcalinas. Animais portadores podem introduzir o agente em áreas não infectadas. A doença ocorre principalmente durante o verão e outono. O local da produção da toxina é o fígado. A destruição hepática é causada pela migração de larvas de F. hepatica que favorece a germinação dos esporos do C. haemolyticum. A lesão hepática é importante na multiplicação bacteriana e síntese da toxina com posterior ocorrência de surtos de hemoglobinúria bacilar em animais após 2º a 3º dias da realização de biópsias hepáticas. Estudos experimentais em coelhos sugerem a seguinte seqüência de eventos: a) migração das formas imaturas de F. hepatica, através do fígado, causando lesões em arteríolas e necrose do parênquima hepático; b) hipoxia e outras alterações no fígado com necrose, induzindo a germinação de esporos do C. haemolyticum presentes nas células de Kupffer; c) as células vegetativas do C. haemolyticum produzem fosfolipase C que destrói as células de Kupffer, deixando as bactérias livres e d) multiplicação de maior número de bactérias e, produção de mais fosfolipase C. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 A toxina beta liberada (fosfolipase C) no fígado causa hemólise maciça intravascular e lesão capilar. A hemoglobina passa para a urina. Há hemorragias na luz do intestino como resultado da lesão capilar. Os animais infectados separam-se dos demais. Mostram-se arqueados com contração da musculatura abdominal e dificuldade ao moverse. Respira com dificuldade e geme. Febre (40 a 41º C), hipotermia e morte. As fezes mostram-se biliosas ou sanguinolentas. A urina torna-se avermelhada semelhante ao vinho do Porto e espumosas (↑ albumina). Não há hemácias íntegras na urina. Infartos no fígado são as principais lesões anatomopatológicas. Esses infartos (tecido necrótico) variam de 5 a 20 centímetros de diâmetro, redondos (“petit pois”) e de coloração mais clara. O infarto pode ser localizado em qualquer parte do fígado como resultado da trombose de um dos ramos da veia porta. Nos sinusóides hepáticos são encontrados grandes números de bactérias, contendo esporos terminais ou subterminais. As membranas serosas e o tecido subcutâneo apresentam grandes hemorragias, assim como os órgãos parenquimatosos. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL As lesões hepáticas são as melhores fontes de esfregaços positivos para o Gram e prova de imunofluorescência. No cultivo, é preciso Agar sangue recentemente preparado e condições de anaerobiose estritas. O C. haemolyticum deve ser cultivado em meios contendo fígado. A fosfolipase C (beta toxina) inoculada em cobaia por via intramuscular. Coelhos, cobaias e camundongos são animais indicados na inoculação experimental, pois são sensíveis à toxina. A inoculação subcutânea provoca hemorragia, edema e pouco ou nenhum gás, no ponto de inoculação. A morte dos animais inoculados ocorre em um a dois dias. TRATAMENTO A doença é caracterizada por morte súbita e, dificilmente tratada com antimicrobianos. O tratamento precoce com antimicrobianos dá bons resultados. O C. haemolyticum é sensível à penicilina G, à ampicilina, ao cloranfenicol e às tetraciclinas. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Antissoro pode ser utilizado como profilaxia e terapia (500 - 1.000 mL). Antissoro, antitoxina e transfusão de sangue possuem pouco valor prático pelas características populacionais da doença. PREVENÇÃO E CONTROLE Cultivos formolados e precipitados (toxóides) pelo alum são utilizados para imunização de bovinos. Em áreas endêmicas os animais devem ser imunizados a cada seis meses. A vacinação deve ser repetida a cada 6 a 12 meses em áreas endêmicas. O controle estratégico contra F. hepatica deve ser instituído como auxiliar no controle da HB. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium septicum Prof. Marcos JP Gomes Edema Maligno (EM) Gangrena Gasosa (GG) INTRODUÇÃO O C. septicum foi a primeira espécie identificada do gênero Clostridium spp, sendo denominada na época de Vibrion septique, por Pasteur e Jubert, em 1877. Foi chamado Bacillus oedematis maligni por causa de sua associação com o tipo de lesão original (Edema maligno), mas que agora é chamado de Gangrena Gasosa (GG). As propriedades do C. septicum são semelhantes ao C. chauvoei. Desse modo, o C. septicum tem sido chamado de C. chauvoei tipo A e o C. chauvoei tem sido chamado C. chauvoei tipo B. O Clostridium septicum está no solo e nas fezes dos animais domésticos. É um invasor após a morte, particularmente nos ruminantes, podendo invadir o fígado quando sofre migração de larvas de F. hepatica (Gariev 1986). As infecções iatrogênicas (Harwood, 1984) são mais comuns em equinos do que em outras espécies, ocorrendo também em infecções umbilicais em ovelhas. “Braxy” em ovinos e bovinos é causada pela invasão do C. septicum sobre mucosa abomasal lesionada pelo frio ou pela pouca qualidade do alimento (Schamber et al. 1986). Necrose hemorrágica, edema e toxemia são achados no abomaso e intestino delgado proximal (Ellis et al. 1983). O agente está associado como causa do edema maligno dos animais domésticos e homem decorrente de feridas traumáticas, carcinoma oculto intestinal, diabetes melitos, cirrose hepática e doença vascular periférica (Chen et al. 2001). Mionecrose clostridiana não traumático é incomum, mas fatal; com começo súbito, taquicardia acumulo de gás nos tecidos moles e formação de bolhas (Burke e Opeskin 1999). Hemorragia, edema e necrose se desenvolvem rapidamente quando a infecção se espalha ao longo dos planos faciais. Dor, edema de picada, crepitação do local, diminuição da temperatura, sugerindo perda da circulação (Hickey et al. 2008) e curso clínico menor que 24 h. A fonte de infecção no Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 homem é geralmente intestinal com mortalidade de que varia entre 33% a 58% (Rechner et al. 2001). Os produtos tóxicos ou potencialmente tóxicos do C. septicum incluem toxina β (DNase, leukocidina), toxina γ (hialuronidase) (Princewill and Oakley, 1976); toxina δ (hemolisina O2 lábil) e neuraminidase (Gadalla e Collee, 1968; Zenz et al. 1993), mas a principal fator de virulência é a α toxina (Tweten, 2001). A toxina α é secretada como uma prototoxina com 46,450 Da que possui 72% da sequencia de aminoácidos semelhante à estrutura primária da aerolisina da Aeromonas hydrophila (Ballard et al. 1995). A atividade específica da toxina é aproximadamente 1,5 × 106 unidades hemolíticas /mg e a LD 50 é de aproximadamente 10 μg/kg (Ballard et al. 1993). A toxina α aparentemente liga-se aos receptores de proteínas âncoras ao glicofosfatidil inositol (Gordon et al. 1999). Ela é ativada pela clivagem proteolítica do fragmento ácido do aminoácido C-terminal; um propeptídeo que pode uma chaperona intramolecular que estabiliza monômeros da toxina α e as acompanha para a membrana onde a ativação das proteases e oligomerização são seguidas pela formação de poros na membrana plasmática (Ballard et al. 1993; Sellman and Tweten, 1997). Deleções dos domínios transmembranosos da toxina α elimina a formação de poros e toda e qualquer contribuição da toxina na patogenia da doença (Kennedy et al. 2009). A furina e outras proteases eucarióticas ativam “in vivo” a toxina na superfície celular (Gordon et al. 1997). O curso clínico é curto e se foca na prevenção e no tratamento. A morte seguida ao desafio com o C. septicum é retardada pela imunização. A resposta conferida pelos anticorpos aos toxóides produz uma imunidade longa nos animais domésticos (Green et al. 1987; Hjerpe, 1990), embora possam existir diferenças na imunogenicidade dentre as espécies de hospedeiros (Green et al. 1987). Segundo Knott e colaboradores, em 1985, trabalhando com bovinos confinados, as perdas com mortes foi de aproximadamente 50% dos vacinados com uma economia estimada em mais de (R$ 20,0) ($10) / animal devido à dupla vacinação e, com um custo médio de menos de (R$ 0,50) ($0.25) / dose. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 DISTRIBUIÇÃO O C. septicum é habitante normal do solo e nas fezes de herbívoros e outras espécies animais. Está associado ao "Braxy" e ao carbúnculo sintomático (poucas vezes) em bovinos e ovinos; assim como na Gangrena Gasosa de feridas em bovinos, ovinos e do homem. MORFOLOGIA E COLORAÇÃO O C. septicum é um bastonete grande; mede 2 a 10 m de comprimento e 0,4 a 1 m de diâmetro; desenvolve filamentos curtos ou longos, podendo ser diferenciado do C. chauvoei que não produz formas alongadas; é pleomórfico, incluindo formas de cigarro, formas gordas, formas de limão ou com extremidades puntiformes; esporo oval (subterminal ou central) que deforma a célula bacteriana; flagelos peritríquios; móveis; Gram positivo quando jovem, mas com o tempo torna-se Gram variável; formas pleomórficas coram-se irregularmente (nos pólos e centro). CARACTERÍSTICAS CULTURAIS O C. septicum é anaeróbio estrito. Cresce bem nos meios comuns, sendo favorecido pela adição de glicose. As colônias no meio sólido são redondas e semitransparentes, mas logo se torna maior, de coloração acinzentada, com bordos filamentosos e irregulares. Possui crescimento em "ondas". Produz hemólise no meio de AS com hemácias de eqüinos. Esse clostrídio no meio de carne cozida produz coloração rósea da carne porque não há digestão. A cultura produz odor rançoso. A gelatina é liquefeita, mas o soro não é digerido após cinco a sete dias de incubação. O meio de “litmus milk” sofre a fermentação do tipo “stormy”. O leite é coagulado após quatro a cinco dias de fermentação. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 ANTÍGENOS E TOXINAS O C. septicum produz quatro toxinas: a) α - alfa (lecitinase) necrotizante, hemolítica e letal. b) β - beta (dessoxiribonuclease), leucocida. c) γ - gama (hialuronidase). d) δ - delta (hemolisina). A toxina mais importante é a alfa. Ela é fatal, necrotizante e também contém uma hemolisina oxigênio estável. ETIOPATOGENIA A patogenia está relacionada com a produção das toxinas. A infecção de ferida (denominada de edema maligno) irradia-se a partir do ponto de infecção em um período de horas ou dias. O músculo adquire cor escura nos planos aponeuróticos, desenvolvendo hemorragia, edema e necrose. O músculo torna-se enfisematoso com aspecto semelhante ao carbúnculo sintomático ou como a gangrena gasosa. As tumefações crepitantes mudam de dolorosas e quentes para indolores e frias. Os sinais clínicos são: febre, taquicardia, anorexia e abatimento. O curso da enfermidade é rápido e mortal (um dia). O “Braxy” dos escoceses e o “Bradsot” dos dinamarqueses fazem parte de uma doença mortal em ovinos produzidas pelo C. septicum em clima frio. Produz uma lesão na parede do rúmen semelhante ao tecido subcutâneo. Os sinais clínicos são: toxemia e dor abdominal. No Homem, a infecção de feridas devido ao C. septicum pode progredir até celulite ou até gangrena gasosa. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O material deve ser processado o mais breve possível, pois após a morte há a invasão dos tecidos pelo C. septicum. É necessário o diagnóstico diferencial entre o C. septicum e o C. chauvoei, podendo ser utilizada a imunofluorescência. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 CONTROLE E PREVENÇÃO O tratamento pode ser realizado com ATMs, incluindo penicilina e tetraciclina por via sistêmica e/ou local. O debridamento, drenagem e limpeza das lesões com antissépticos. Os bezerros devem ser imunizados aos 3-4 meses de idade e os cabritos e cordeiros na época do desmame. É aconselhável a vacinação anual. O controle pode ser obtido com a vacinação com toxóide (alfa). Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium chauvoei Prof. Marcos JP Gomes Carbúnculo Sintomático (CS) INTRODUÇÃO O Carbúnculo Sintomático (CS) e edema maligno compreendem o grupo das mionecroses, clostridioses altamente fatais causadas por bactérias anaeróbicas do gênero Clostridium, que afetam o tecido muscular e subcutâneo de ruminantes e outras espécies animais. Nos bovinos, o carbúnculo sintomático é uma infecção “endógena” não contagiosa produzida pelo C. chauvoei. Em contraste, o edema maligno nas diferentes espécies animais susceptíveis, é uma doença “exógena”, relacionada com a presença de feridas na pele, podendo ser causada pelo C. chauvoei, C. septicum, C. sordellii, C. novyi tipo A e C. perfringens tipo A (Gyles, 1993). O C. chauvoei foi chamado de C. feseri, Bacillus anthracis symptomatici ou Bacillus carbonis É uma importante causa de carbúnculo sintomático (CS) nos ruminantes. Tem distribuição mundial e causa sérios prejuízos econômicos. Clostridium chauvoei causa carbúnculo sintomático uma miosite necrotizante enfisematosa que parece edema maligno (Burke and Opeskin, 1999). Os animais infectados desenvolvem febre alta anorexia depressão e claudicação com lesões crepitantes e morte súbita. Nas áreas centrais da lesão são geralmente secas e enfisematosas, mas nas áreas periféricas à lesão são edematosas, hemorrágicas, necróticas e a infiltração leucocitária é pequena. O papel da toxina α e da toxina β (ADNase) não são definidos (Ramachandran 1969). A expressão do flagelo está associada à virulência e sujeita a variação de fase (Tamura et al. 1995 ); a imunidade antiflagelo (Kojima et al. 2000 ); anticorpos antiflagelos idiotípicos imunizam o camundongo contra o desafio (Kijima-Tanaka et al. 1994). Proteínas recombinantes da flagelina não induziram proteção de camundongos contra o Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 desafio (Kojima et al. 2000). O soro hiperimune obtido em equinos e penicilina pode ser utilizado na terapia e na profilaxia da enfermidade. MORFOLOGIA E COLORAÇÃO O C. chauvoei é um bastonete reto com bordos arredondados visto no tecido e no cultivo; mede 3-8 m de comprimento e 0,6 m de diâmetro; pleomórficos com apresentação solitária ou em cadeias de três a cinco organismos no exsudato peritonial das cobaias inoculadas; esporo oval e excêntrico semelhante ao limão; móveis (jovens) com flagelos peritríquios; pleomórfico cora-se diferentemente quando jovens e quando subcultivados. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS São pouco exigentes. São estritamente anaeróbios. A adição de sangue ou tecido favorece o crescimento. Cresce bem em meios contendo infuso de fígado, pois requerem cisteína. As colônias crescidas no AS são delicadas, esféricas, irregulares e compactas. São pouco hemolíticas, evidenciando uma estreita faixa de hemólise ao redor das colônias. No caldo fígado, o seu crescimento mostra-se moderadamente turvo. Liquefaz a gelatina, contendo um pouco de soro. Cresce no meio de soro-sangue coagulado e coagula a albumina do ovo. O meio de carne cozida torna-se avermelhado e o fluido turvo. Não há digestão da carne e apresenta pouco gás. As culturas têm odor rançoso característico. ANTÍGENOS & TOXINAS As principais toxinas produzidas pelo C. chauvoei são: a) α - alfa toxina (lecitinase), hemolítica, necrotizante e letal). b) β - beta toxina (ADNase) c) γ - gama toxina (hialuronidase) e d) δ - delta toxina (hemolisina) Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 ETIOPATOGENIA O C. chauvoei está distribuído no solo e trato intestinal dos herbívoros. A sobrevivência do agente no solo sob a forma de esporos é o fator mais significante para a transmissão aos bovinos, pois a ingestão de pastos contaminados com esporos constitui-se na principal fonte de infecção. Bovinos jovens, entre quatro meses e três anos de idade, no mais alto nível nutricional são os mais susceptíveis. Há duas manifestações do carbúnculo sintomático nos bovinos. A forma clássica, mais freqüente e que atinge normalmente o tecido muscular esquelético e a forma visceral, raramente encontrada, afetando principalmente o coração (Uzal et al., 2003). A patogenia do CS em bovinos, ainda é incerta. Na forma clássica, a hipótese corrente é que os esporos presentes no intestino são veiculados por macrófagos até musculatura onde permanecem em latência. Traumas nas grandes massas musculares proporcionam um ambiente de baixo potencial de óxido-redução, possibilitando a germinação dos esporos e a conseqüente produção de toxinas. Acredita-se que as toxinas, em especial, a toxina alfa necrosante, mas também o fator edema, a hialuronidase (gama), a ADNase (beta) a hemolisina oxigênio lábil (delta) e a neuraminidase são responsáveis pelas lesões iniciais. É possível que o processo tóxico seja incrementado pelo metabolismo bacteriano, produzindo gás por processo fermentativo. Nos bovinos, a enfermidade vem precedida da permanência de esporos nos músculos esqueléticos e procedentes do intestino. Os fatores que favorecem a germinação dos esporos, multiplicação das bactérias e produção de toxinas provocam a formação de lesões que se caracterizam por edema, hemorragia e necrose das miofibrilas. A parte central da lesão é seca, que se escurece, tornando-se enfisematosa como conseqüência da fermentação bacteriana mesmo com lesão edematosa e hemorrágica, na periferia. Animais (6 meses - 3 anos) gordos bem alimentados entrada incerta ??? oral (pastejo) multiplica intestino linfáticos circulação alfa toxina (necrotizante leucocida) efeito difusor da toxina - hialuronidase - mionecrose (esponja)- toxina Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 circulante toxemia fatal degeneração do coração e órgãos parenquimatosos bacteremia morte (1 a 2 dias). SINAIS CLÍNICOS E LESÕES Nos bovinos, o CS ocorre em animais em bom estado nutricional e com idade entre 6 meses e 3 anos. Estes fatores ocorrem em campos com histórico da doença. Alguns animais apresentam morte súbita, outros evidenciam sinais de edema crepitante nas grandes massas musculares. Clinicamente, os animais apresentam temperatura elevada, anorexia, depressão e manqueira quando o membro é atingido. O local torna-se edematoso e, à palpação, é observada crepitação decorrente das bolhas de gás produzidas pela multiplicação da bactéria. A evolução para morte ocorre geralmente em até 72 horas. A lesão é acompanhada por edema, hemorragia e necrose miofibrilar, exalando acentuado odor rançoso (Hateway, 1990). Em relação ao edema maligno nos bovinos, o mesmo apresenta sintomatologia clínica, curso e lesões macro e microscópicas bem semelhantes às do carbúnculo sintomático clássico. Os animais tornam-se claudicantes e febris. A morte acontece geralmente, após 24 horas do início dos sinais clínicos. Na porção central da lesão há uma área bem definida de músculo com coloração mais escura, necrótica e com pequenas bolhas de gás. Em volta desta área, o tecido conetivo torna-se róseo com fluido amarelado ou hemorrágico. Há septicemia causada pelo agente, pouco antes da morte. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Isolamento de C. chauvoei é difícil, uma vez que deve ser cultivado em estritas condições anaeróbias e as amostras estão freqüentemente contaminadas com outras bactérias anaeróbicas que mascaram o C. chauvoei. O método padrão para detecção de C. chauvoei é baseada no cultivo. As quantidades de C. chauvoei são altas na maioria das amostras do músculo de bovinos mortos pelo CS. No entanto, isso nem sempre é o caso, pois a flora contaminante pode impedir o cultivo. Antes de identificação bioquímica, é importante ter uma cepa controle. A detecção rápida e um sistema confiável na detecção do Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 C. chauvoei são desejáveis em amostras que contêm uma flora mista. Exemplos de casos de carbúnculo são enviados para o laboratório como o tecido muscular, pois este é o material mais fácil a partir da qual extrair uma cultura pura. As amostras podem ser enviadas para o laboratório como compressas de tecido muscular infectado que podem não exigir isolamento de cultivo puro. As fezes podem conter esporos e formas vegetativas que passam pelo sistema digestivo dos animais em pastos contaminados. O diagnóstico laboratorial pode identificar o C. chauvoei no músculo lesionado ou no sangue cardíaco, através de esfregaço. Se a morte ocorreu recentemente, devemos enviar osso longo de bovino ou ovino (metacarpo ou metatarso) em refrigeração ao laboratório. As amostras inoculadas com crescimento em carne cozida ou Tarozzi deverão ser inoculadas em cobaias, para confirmação das lesões e reisolamento do agente. No laboratório, a diferenciação entre o C. septicum e o C. chauvoei se dão pelas características morfológicas e pela imunofluorescência. Em esfregaços de tecidos infectados se podem identificar bastonetes esporulados, através da IF. TRATAMENTO O tratamento para o CS é contraditório e, muitas vezes, impossível de ser aplicado. A medida de controle adotada no surto é a imunização de todos os animais com ou sem a aplicação de penicilina de ação retardada. O C. chauvoei é sensível a penicilina que pode ser utilizada concomitantemente ao soro hiperimune no local da lesão. Tetraciclinas e cloranfenicol podem ser empregadas nos estágios iniciais da doença. CONTROLE E PROFILAXIA A imunização preventiva dos animais evita o aparecimento de carbúnculo sintomático e sua repercussão econômica. O toxóide é o cultivo inativado pelo formol e precipitado pelo alum. A imunização de bovinos inicia aos 3-6 meses e depois anual. Embora a imunidade seja forte e adequada, é aconselhável a revacinação duas a três Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 semanas após a primeira. A vacinação deve ser feita no verão e outono, conforme o manejo aplicado. O soro hiperimune preparado em eqüinos, geralmente não é utilizado por razões práticas e econômicas. No Brasil, existe uma vacina viva comercializada e indicada para bovinos, ovinos e caprinos. É a única vacina viva do mundo e produzida pelo laboratório Manguinhos. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Clostridium sordellii Prof. Marcos Gomes INTRODUÇÃO O Clostridium sordellii é um importante patógeno tanto do homem quanto dos animais domésticos. A morte de pacientes pós-cirurgias geralmente devido à substituição de articulação do joelho. Este microrganismo pode causar também endometrites (pós-parto ou espontânea) com começo repentino, sinais de gripe, hipotensão refratária progressiva e edema de progressão rápida. Os achados laboratoriais são de leucocitose acentuada e hematócrito alto. O curso clínico é curto, levando a morte na maioria dos casos (Rorbye et al. 2000). Recentemente, o C. sordellii foi associado à endometrite e ao choque séptico pós uso intravaginal de drogas como o misoprostol ou mifepristona (Aronoff et al. 2008). O C. sordellii é causa comum de fascite necrozante após injeção de heroína (Dunbar and Harruff 2007). O C. sordellii foi um agente importante no intestino de bovinos acometidos da síndrome de morte súbita (Manteca et al. 2001) e esta enterite foi experimentalmente reproduzida (Al-Mashat e Taylor, 1983). A infecção causada pelo C. sordellii deve ser diferenciada da peritonite aguda associada à infecção umbilical dos ruminantes (Ortega et al. 2007). As toxinas letais e hemorrágicas são antigênica e funcionalmente semelhantes às toxinas B e A do C. difficile, respectivamente (Geny et al. 2007). O pulmão e coração são o alvos preferenciais em camundongos inoculados com a toxina letal por via intraperitoneal e lesão das células endoteliais causaram aumento da permeabilidade vascular. O papel da fosfolipase do C. sordellii na patogenia não é bem conhecida (Karasawa et al. 2003). Ela possui maior homologia à fosfolipase do C. bifermentans do que com a toxina α do C. perfringens e sua atividade hemolítica foi menor que 1% que a do C. perfringens tipo A. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 A imunização de cobaias com toxóides (toxina letal e hemorrágica) protegeu contra o desafio e ambas devem fazer parte do imunógeno (Amimoto et al. 2001). Uma revisão de 10 anos de registros do “King County Medical Examiner's” detectou 87 mortes devido à fascite necrotizante e infecções necrotizantes relacionadas aos tecidos moles. Em 64 desses casos, havia dados suficientes para fornecer uma análise das manifestações, microbiologia e fonte de infecção. Metade (32) dos casos foram devido à injeção de heroína “black tar”, uma forma quase exclusiva de heroína no noroeste dos Estados Unidos. Destes, devido à injeção de alcatrão negro, 24 foram infecções clostridianas com várias espécies representadas, oito dos quais foram C. sordellii. Dos 32 casos não associados com a injeção de drogas, predominaram espécies de estreptococos, com S. pyogenes isoladas em 14 casos. Só não três de 32 casos associados ao uso de drogas injetáveis foram infecções clostridianas. Essas diferenças foram estatisticamente significativas. O S. aureus foi isolado de 14 casos, dois eram cepas resistentes à meticilina. No geral, 28 dos 64 casos eram infecções multimicrobianas, 15, devido à injeção de alcatrão negro e 13 não associadas à injeção de drogas. Este estudo permite concluir que a fascíte necrotizante, devido à injeção de heroína “black tar” é uma clostridiose e desta forma significativamente diferente da de fasceíte necrotizante, devido a outras causas. O C. sordellii foi uma descoberta potencialmente importante nos intestinos de bovinos com a "síndrome da morte súbita". Culturas puras de um isolado do C. sordellii obtidos a partir de um caso de enterite hemorrágica em uma vaca de dois anos de idade foram utilizadas para infectar os bezerros em três experimentos. O C. sordellii deu início a um ligeiro aumento na temperatura retal e fezes moles com sangue e muco no prazo de um a seis dias da inoculação em seis bezerros, em dois experimentos controlados. O C. sordellii foi isolado nas fezes dos animais afetados, mas somente de seu intestino grosso ao abate. Pequenas alterações inflamatórias foram observadas no trato gastrointestinal. A patogênese da infecção do C. sordellii foi estudada experimentalmente em bezerros e o filtrado da cultura reproduziu alterações clínicas e patológicas semelhantes aos produzidos pela cultura geral. Nesses estudos, o organismo foi isolado da porção anterior do trato gastrointestinal após quatro dias da inoculação. As mudanças histológicas produzidas Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 consistiram em congestão discreta e alterações inflamatórias na mucosa do jejuno e íleo e dilatação das criptas e dilatação capilar na mucosa do intestino grosso. A relação entre C. sordellii e as mudanças observadas em infecções naturais e experimentais foi comparada com às do C. difficile no homem. A infecção pelo C. sordellii deve ser parte do diagnóstico diferencial da peritonite aguda eqüina associada com infecção remanescente do cordão umbilical. A análise histopatológica e bioquímica identificou os pulmões e o coração como órgãos alvo preferenciais pela toxina letal (LT). Extravasamento maciço de sangue fluido na cavidade torácica resultando num aumento da permeabilidade vascular do pulmão, gerando profunda modificação como desidratação aumento do hematócrito, hipóxia e finalmente falência cardiorrespiratória. O aumento da permeabilidade vascular induzida pela LT resultado de modificações das células endoteliais pulmonares quando evidenciadas pela ME. A análise imunoistoquímica demonstrou que a VE-caderina, uma proteína participante nas junções intercelulares foi redistribuída da membrana para o citosol nas células endoteliais do pulmão. Nenhum sinal importante da inflamação induzida pela LT foi observado que pudesse participar da síndrome do choque tóxico. O principal efeito da LT é a inativação de pequenas GTPases dependentes da glicosilação, em particular Rac, que está envolvida na polimerização da actina que ocorre "in vivo" nos pulmões levando desestabilização da junção da E-caderina. Concluindo que as células mais suscetíveis à LT são as células endoteliais vasculares do pulmão. A toxina letal (LT) e a toxina hemorrágica são antigenicamente e funcionalmente similares às do C. difficile toxinas A e B, respectivamente. As lesões preferenciais em camundongos inoculados com a toxina letal por via intraperitoneal são pulmões e coração, alem de lesão das células endoteliais provocadas pela permeabilidade vascular. Toxina glicosilada letal, Ras, Rac e Ral, diferem de outras grandes toxinas clostridianas na modificação da Ras. O gene que codifica a enzima fosfolipase C do C. sordellii (CSP), foi clonada e expressa como uma proteína histidina-alvo (His-tag). A proteína foi purificada para comparar suas atividades enzimáticas e biológicas com as fosfolipases do C. perfringens e do C. bifermentans. A fosfolipase do C. sordellii possui 371 resíduos de aminoácidos na Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 forma madura e possuir maior homologia com a fosfolipase do C. bifermentans do que com a fosfolipase do C perfringens A. A atividade da hidrólise dos fosfolipídios (gema de ovo) foi cerca 30% menor do que aquela observada no C. perfringens tipo A e somente 1% da atividade hemolítica. A fosfolipase do C. sordellii é tóxica para camundongos e a imunização com C. bifermentans ou C. sordellii não protege contra a fosfolipase do C. perfringens tipo A. Ela tem maior homologia com a fosfolipase do C. bifermentans do que com a toxina α do C. perfringens, e sua atividade hemolítica menor 1% que a do C. perfringens tipo A. A imunização de cobaias com toxóides da toxina letal (LT) e da toxina hemorrágica (HT) protegeu contra o esporo desafio e ambos devem estar contidos no imunógeno. Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Gênero Clostridium spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes 2013 Referências Bibliográficas recomendadas para o Gênero Clostridium spp. Al-Mashat, R.; Taylor, D. 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