Revisão das metaloproteases envolvidas em processos tumorais
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Revisão das metaloproteases envolvidas em processos tumorais
Revisão das metaloproteases envolvidas em processos tumorais Reiss, Maria Lucia Viana Reiss1 Centro Municipal de Saude Americo Veloso Resumo O câncer inicia-se a partir da transformação de um clone de celulas normais como resultado da ação de vários agentes mutagênicos que acarretam a perda do equilibrio homeostatico celular e, consequentemente, uma proliferação descontrolada. Contudo, um nodulo de celulas neoplasicas so se tornara realmente fora de controle organico quando adquirir a capacidade de degradar a matrizextracelular, sob o efeito da producao de enzimas proteoliticas, e de liberar fatoresangiogenicos. Os fatores angiogenicos promoverao a vascularizacao da massa tumoral suprindo-a de oxigenio e nutrientes, indispensaveis a seu posterior crescimento. Os vasos sanguineos e linfaticos, em contato com o tumor, também poderao favorecer o processo de metastase. As enzimas proteoliticas, ou proteases, degradarao, num primeiro momento, as proteinas extracelulares em contato íntimo com a celula que constituem um espaço denominado de matriz extracelular, para posteriormente avancarem em direcao ao tecido conjuntivo propriamente dito. Dentre as quatro famílias de proteases presentes num ambiente de degradação tumoral, as metaloproteases de matrizextracelular (MMPs) sao as que se apresentam mais abundantemente e de forma bem diversificada. Até o momento, são conhecidos aproximadamente 20 membros da familia das MMPs que se apresentam absolutamente fora de controle da acao dos inibidores enzimáticos teciduais num ambiente tumoral. Alem disso, vasta literatura tem demonstrado serem as MMPs sintetizadas em niveis distintos em tipos tumorais variados, no momento em que o tumor inicia sua fase de fenótipo mais agressivo. Dessa maneira, as MMPs e as proteinas envolvidas nas cascatas de sinalização, na via de transcrição de sinais que culminam com a sintese de MMPs, poderiam ser empregadas como marcadores tumorais visando prevenção de crescimento tumoral e metástase. O Problema Segundo Solomon e colaboradores (1991), o cancer resulta de uma serie progressiva de alteracoes geneticas que ocorrem em um unico clone de células como consequencia de alteracoes em um numero limitado de genes: os oncogenes, genes sob acao de fatores de crescimento, e os genes supressores tumorais. O desenvolvimento de um tumor solido primario defini-se quando uma unica celulanormal torna-se uma celula transformada como resultado de uma serie de 1 [email protected] fatores, dentre eles a acao de carcinogenos, ativacao de oncovirus ou radiacao que acarretam delecoes, translocacoes, inversoes genicas. A celula transformada difere da celula normal por varios aspectos sendo, um dos mais notaveis, sua capacidade de escapar dos mecanismos homeostaticos do corpo, o que favorece umaproliferacao descontrolada. Uma celula individual transformada tem o potencial, atraves de sucessivas divisoes celulares e posteriores mutacoes, de se desenvolver num cluster, ou nodulo, de celulas tumorais. Neste estagio, o tumor solido consiste de aproximadamente 106 celulas e apresenta um diametro em torno de 3 mm. A partir de entao, seu crescimento torna-se limitado pois e dependente, unicamente, de difusao para receber oxigenio e nutrientes e eliminar seus produtos de excrecao. Como consequencia, as celulas, no centro da massa tumoral tendem a morrer, devido a necrose ou a apoptose. Acredita-se que microtumores, neste estagio, possam sobreviver, num estado dormente, no qual o numero de celulas que proliferam se equivaleria ao das que morrem (Folkman, 1985; Gastl et al, 1997). Para um desenvolvimento posterior ocorrer, o tumor precisa induzir um processo angiogenico, iniciado pela secrecao de fatores pro-angiogenicos (Ausprunk & Folkman, 1997). Esses fatores sao capazes de induzir as celulas endoteliais (EC), nas vizinhancas dos vasos sanguineos, a degradar sua lamina basal e migrar em direcao ao tumor. Uma vez que o tumor passe a ter um suprimento sanguineo, se tornara muito mais invasivo e ira adquir um potencial para metastase, podendo levar a formacao de tumores secundarios. Metastase e o mais temido e o menos entendido aspecto do cancer. Na verdade, o tumor so passa a ser considerado um cancer quando adquire a capacidade de invadir, invasao esta ligada, essencialmente, a producao e a liberacao de proteases. O processo de metastase (Figura I) envolve muitas etapas sequenciais, como enumerado a seguir: As celulas escapam do tumor primario, invadindo o tecido conjuntivo subjacente; As celulas entram na corrente circulatoria sanguinea e linfatica (intravasation); As células sobrevivem ao percurso no interior do sistema circulatorio; As células escapam da circulação sanguínea (extravasation); As células estabelecem uma nova colônia em órgãos distantes; A nova colônia de células precisa então crescer para formar um tumor secundário no novo órgão. Do ponto de vista evolutivo, podemos, também, considerar o câncer como uma forma aberrante de vida, de extraordinária complexidade, que não pode ser explicada, unicamente, por suas alterações genéticas associadas (Clark et al, 1995). Dessa maneira, o processo de transformação de uma célula normal em neoplásica, passa por uma evolução sequencial, que culmina em invasão tumoral emetástase, e está relacionado a uma série de acontecimentos celulares e moleculares nas células tumorais e estromais adjacentes ao tecido lesionado (Byerset al, 1994; Effert et al, 1995). Delimitação do Problema Dessa concepção mais global do processo neoplásico, tem surgido um bom numero de parâmetros biológicos que nos permitem conhecer melhor a historia natural docâncer. Um desses novos aspectos da biologia molecular dos tumores humanos são as enzimas proteolíticas, que produzidas pelas próprias células tumorais, pelas doestroma peritumoral ou pelo endotélio dos vasos próximos, tem adquirido, na presente década, um interesse especial. As proteases, devido a seu papel potencial na degradação dos elementos da matriz extracelular, facilitam a invasão tumoral emetástases, aspectos absolutamente chave na evolução do câncer (Liotta et al, 1991). Diante do exposto, entendendo a relevancia de se encontrar adequados instrumentos de controle e monitoracao do cancer, doenca que apresenta índices mundiais alarmantes de morbidade e mortalidade (Tabela I), convem que se desenvolva a consciencia por parte dos profissionais da area de saude, como um todo, da importancia precipua de se viabilizar metodos que enfoquem a dimensaopreventiva. Desse modo, cabe a analise de possivel adequacao pratica de pesquisas cientificas na area de proteases tumorais, visando sua aplicacao pratica em examesclinico-laboratoriais de rotina. Objetivo Mostrar que as metaloproteases de matriz e as proteínas envolvidas nas vias de transcrição de sinais que culminam com sua síntese, poderiam ser empregadas como importantes marcadores tumorais em analises clinico-laboratoriais de rotina de tumores humanos. Justificativa Tendo em vista estarem as enzimas proteolíticas, em especial as metaloproteases de matriz extracelular, relacionadas a mudança de fenótipo tumoral, com o início de comportamento mais agressivo por parte do tumor, espera-se que o presente trabalho possa vir a estimular estudos que visem o emprego acessível de métodos de diagnostico sensíveis na detecção precoce de níveis aumentados de proteases, de modo a poupar a vida e beneficiar uma grande parcela da população que e afetada por câncer todos os anos. Embasamento teórico As enzimas proteolíticas são responsáveis pela degradação dos componentes principais da matriz extracelular, incluindo a membrana basal, facilitando a invasão tumoral e metástase. A expressão da maioria das proteases tumorais tem sido associada a um comportamento mais agressivo dos carcinomas humanos e a um prognóstico desfavorável da doença. Contudo, a detecção da presença e de níveis enzimáticos se faz possível através do emprego de técnicas de pesquisa tais como a imunohistoquimica, hibridização in situ e Western/ Southern blotting. Desse modo, tais técnicas poderiam ser adaptadas para emprego, em larga escala, no exame de biopsias tumorais. Dentre as enzimas proteolíticas que degradam matriz extracelular, expressas por tumores, encontram-se representantes das quatro grandes famílias de proteases: metaloproteases, aspartil-proteases, cisteino-proteases e serinoprotease. O enfoque do presente trabalho se restringira a análise das metaloproteases de matriz extracelular por se apresentarem de forma variada e abundante em ambientes tumorais. Metaloproteases de Matriz Extracelular (MMPs) As MMPs constituem uma familia de endopeptidases, com atividade hidrolitica de amplo espectro para as proteinas extracelulares. As MMPs pertencem a uma familiade pelo menos 20 membros, produto de genes, homologos ou pseudohomologos, relacionados entre si (Woessner, 1991). Estas enzimas podem ser classificadas deacordo com criterios estruturais e funcionais, em quatro grandes familias de diferente especificidade ao substrato (Shingleton et al, 1996): colagenases (MMP1, MMP8 e MMP13), gelatinases (MMP2 e MMP9), estromalisinas (MMP3, MMP7, MMP10, MMP11 e MMP26) e metaloproteinas de membrana (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP24 e MMP25, tambem conhecidas como MT1-MMP a MT6-MMP, respectivamente.) (Tabela II). Ha tambem alguns membros da familia das MMPs que possuem caracteristicas especiais que impedem sua insercao nos grupos supracitados, tais como a metaloelastase de macrofago (Belaaouaj et al, 1994), a estromalisina-3 (Basset et al, 1990), MMP-19 (Pendas et al,1997) e a enamelisina (Liano et al, 1997). Embora as MMPs sejam classificadas com base na sua afinidade por substrato, nota-se que ha sobreposicao entre as subclasses, em termos de suas afinidades. Fica assim estabelecida uma promiscuidade funcional, significando que as MMPs nao tem necessariamente um substrato definido. Esta promiscuidade e ainda exacerbada em processos patogenicos como a proteolise relacionada a invasao tumoral. Alem disso, as atividades das MMPs interferem umas com as outras na medida em que muitas delas podem ativar outras proenzimas, o que sugere que a ativacao controlada das mesmas pode envolver uma cascata, englobando diferentes membros da familia das MMPs (Cawston, 1998). Todas as MMPs têm algumas caracteristicas em comum, incluindo, dentre estas: 1) um dominio catalitico, que acomoda um atomo de Zn+2 no sitio ativo; 2) um dominio propeptidico, essencial para a manutencao de sua latencia enzimatica, e que e removido quando a enzima e ativada (Shima et al, 1992) e 3) um domínio translacional, peptideo sinal que direciona o produto para secreção. A maioria das MMPs tambem possuem um dominio C-terminal com uma sequencia de homologia a hemopexina, que constitui um sitio de ligacao para os inibidores teciduais. As gelatinases –A e –B (MMPs 2 e 9) diferem das demais por apresentarem um dominio semelhante a FN, separando o dominio catalitico do semelhante ahemopexina. A gelatinase B possui ainda um dominio semelhante ao colageno. As MT-MMPs sao caracterizadas por um dominio transmembrana que e responsável pela ancoragem da enzima a membrana plasmatica (Nguyen et al, 2001; Liekens et al, 2001). Todas as MMPs requerem um pH neutro e Ca+2 para poderem atuar e sao inibidas por uma familia especifica de proteinas, que se denominam inibidores tissulares de MMP (TIMP) (Matrisian ,1990; Nguyen et al, 2001). Atualmente são conhecidos quatro membros da familia das TIMPs que sao capazes de se ligar e inibir a atividade de todos os membros da familia das MMPS. Eles demonstram, entretanto, diferencas na sua distribuicao nos tecidos e na habilidade de formar complexos com a forma inativa da MMP (McCawley & Matrisian, 2000). As MMPs estao amplamente distribuidas no organismo humano onde desempenham uma serie de funcoes fisiologicas como, por exemplo, na cicatrizacao (Wolf et al, 1992), na reabsorcao ossea (Delaisse et al, 1992), na involucao mamaria (Talhouk et al,1992) e em outras funcoes fisiologicas associadas a gravidez e parto (Jeffrey,1991). Recentemente, tem-se demonstrado que as MMPs tambem estão implicadas em processos patologicos variados como na artrite reumatoide (Harris, 1990), na enfermidade periodontal (Page, 1991), na esclerose múltipla (Chandler et al, 1997), em algumas doencas cardiovasculares (Tamarina et al, 1997) e certas alteracoes hematologicas (Guedez et al, 1996). A fisiopatologia dos processos benignos e malignos na qual as MMPs e as TIMPs estao implicadas, e que envolve alteracoes no mecanismo de turnover da matriz extracelular, tem certamente sido alvo de investigacao. Contudo, o papel das MMPs na fisiopatologia tumoral, como determinante do potencial metastatico nas celulasneoplasicas (Tabela III), tem gerado maior interesse em investigacao clinica, já que o processo de invasao tumoral inicia-se a partir da degradacao de elementos da matriz extracelular e do estroma intersticial, tais como colageno, laminina, fibronectina, tenascina, gelatinas e proteoglicanos (Liotta et al,1991). A atividade das MMPs e regulada por expressao genica, por ativacao da proenzima e por inativacao da enzima ativa, por inibidores tissulares especificos. As MMPs ampliam o processo de invasao tumoral, nao so atraves da degradacao das proteinas da MEC, como tambem da ativacao de cascatas de transducao de sinal que promovem motilidade e da solubilizacao de fatores de crescimento ligados a MEC (Mc Cawley & Matrisian, 2001). A expressao de MMPs e induzida por fatores de crescimento, celula-celula e celula-matriz. Muitos genes de MMPs (mmp1, mmp3, mmp7, mmp9, mmp10, mmp12 e mmp13) sao induziveis por estímulos xtracelulares que ativam um fator de transcricao dimerico, o complexo AP1, composto pelas proteinas JUN e FOS, que vai se ligar ao promotor de MMPs, no nucleo celular, e ativar sua transcricao. A inducao da expressao e atividade de AP1 sao mediadas por tres classes de proteinas quinases ativadas por mitogenos (MAPK), ERKs, quinase do N-terminal de JUN ativada por estresse (JNK) e a de p38 (Westermarck & Kahari, 1999). A proteina quinase C (PKC) ativa a via de sinalizacao de ERK1/ERK2. Recentemente, tem-se mostrado que a super expressao de isoformas de PKC, tais como promotor de MMP1. PKC tambem desempenha funca o importante na expressao de MMP9 em celulas de gliomas malignos (Yabkowitz et al, 1999). De acordo com estudos recentes, Chintala e colaboradores (1998) observaram que PKC, quando ativado, medeia mudancas no citoesqueleto de celulas de gliomas, induzindo a producao de MMP9. Um aspecto relevante da dinamica das MMPs na fisiopatologia tumoral e que sua expressao pode ocorrer tanto em celulas neoplasicas quanto em celulas estromais e endoteliais peritumorais (Hahnel et al, 1993). Estas ultimas, provavelmente, recebem sinais bioquimicos originados do tumor, como fatores de crescimento ecitocinas (Uria et al,1997). Analise imunohistoquimica da expressao de MMP-2 tem mostrado um aumento da enzima em epitelio de mama e colon. No entanto, estudos de hibridizacao in situ evidenciaram que o RNAm de MMP-2 em tecidos com cancer de mama esta predominantemente localizado no estroma. Esta discrepancia de resultados pode ser explicada pela recente descoberta de que MMP2 latente liga-se a superficie de celulas malignas por interacao com MT1-MMP (revisto por Westermarck & Kahari, 1999). As celulas endoteliais tambem sintetizam varias MMPS: MMP-1, MMP-2, MMP9 e MT1-MMP. Dentre estas a MMP-2 (gelatinase-A, 72kDa), MMP-9 (gelatinase B, 92 kDa) e a MT1-MMP foram descritas como exercendo importante papel na angiogenese (Stetler-Stevenson, 1999). Nguyen e colaboraddores (2001) postularam um modelo para o papel das gelatinases, MMP-2 e MMP-9, na angiogenese. A MMP-2, constitutivamente secretada pelas celulas endoteliais, seria ativada atraves de uma cascata de ativacoes enzimaticas a partir da trombina. A trombina, que se encontra elevada em situacoes angiogenicas, ativaria a proteina quinase C (PKC) na superfície endotelial. A PKC, ativada rapidamente, iria fosforilar a MMP-2, fazendo com que as celulas endoteliais iniciassem a degradacao da lamina basal. Depois desta etapa, as MMP-9, seriam liberadas de vesiculas intracelulares, presentes nas celulas endoteliais, e exerceriam o papel de mantenedoras da degradacao da lamina basal. Com a digestao da lamina basal, as celulas endoteliais passariam a fazer contato com o colageno tipo I, do conjuntivo subjacente, que por sua vez ira promover a upregulation da MT1-MMP que ativa, por feedback positivo, a MMP-2. Esta ativação pelo colageno I pode ser sustentada por longos periodos ate que os novos capilares formados secretem sua lamina basal que servira como barreira para que nao haja o contato das celulas com o colageno. Tabela II A familia das metaloproteases de matriz e seus substratos Tabela III Expressao de Metaloproteases em Neoplasias Humanos Lafleur e colaboradores (2001) demonstram que a MT1-MMP era a principal enzima equerida para ativação da para o-MMP-2 em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), uma vez que anticorpos anti-MT1-MMP bloqueiam este processo. Este mesmo grupo, em 2002, demonstrou que a atividade das MT-MMPse especificamente requerida durante o processo de tubulogenese endotelial em géis de fibrina e que provavelmente as principais enzimas envolvidas seriam MT1-MMP, MT2MMP ou MT3-MMP. Apesar dos niveis de MMP-2 ativa se apresentarem elevados durante a diferenciacao das celulas em gel de fibrina, esta enzima parece nao ser a responsavel pela tubulogenese, pois nem anticorpos anti-MMP-2 e nem o dominio hemopexina C-terminal (PEX) desta MMP foram capazes de inibir o processo de formacao de tubo (Lafleur et al, 2002). Por outro lado, a MT1-MMP possui uma potente atividade fibrinolitica e a transfeccao de celulas MDCK, não invasivas, com MT1-MMP aumentou a invasao e uma resposta tubulogenica quando estas celulas foram cultivadas em gel de fibrina (Hiraoka et al, 1998). As MMPs, sao expressas de forma abundante em tumores malignos, independentemente de sua origem celular (Heppner et al, 1996; Basset et al, 1997; Johnsen et al, 1998). Em consequencia disso, podem ser empregadas como marcadores tumorais. Uma correlacao significativa entre a expressao aumentada de uma MMP e um pior prognostico, em termo de sobrevida, pode ser demonstrada em diversos casos, como enumerado a seguir: estromalisina-3, em cancer de mama (Linder et al, 1997; Ahmad et al, 1998) e de colo (Porte, 1995); a colagenase intesticial, em cancer colorretal (Murray et al, 1996), esofagico (Murray et al, 1998), e condrossarcoma (Kawashima et al,1997); gelatinase B, em cancer colorrectal (Zeng et al, 1996); gelatinase A, em cancer gastrico (Allgayer et al,1998), de ovario (Garzetti et al, 1995), de mama (Talvensaari-Mattila et al, 1998) ede bexiga (Kanayama et al, 1997), e colagenase-3, em cancer de mama (Lamelas, 1998). Estudos demonstram que as MMPs-7, MMP-9 (Patterson & Sang, 1997) e MMP-12 (Cornelius et al, 1998) podem atuar como bloqueadores da angiogenese, uma vez que sao capazes de induzir a formacao de angiostatina a partir de plasminogenio, um dos mais potentes inibidores angiogenicos atualmente conhecidos. Entao, e possivel supor que a producao endogena de angiostatina por MMPs e parte de um dos mecanismos de feedback negativo do controle da degradacao de matriz induzida por MMP e consequentemente da promocao da motilidade de celulas endoteliais e angiogenese (revisto por Hagedom & Bikfalvi, 2000). Conclusão Num organismo saudavel, a liberacao de enzimas proteoliticas e bem circunscrita e controlada por inibidores enzimaticos que favorecem o inicio do processo de resolucao de “danos” teciduais fisiologicos. Contudo, num ambiente tumoral, onde o equilibrio homeostatico organico foi vencido pelo tumor, os inibidores enzimaticos teciduais serao pouco eficazes em decorrencia da balanca tender para a logica tumoral, de expandir e invadir, em detrimento da do hospedeiro, de restringir e sobreviver. Alem disso, substancias anti-angiogenicas, tal como a angiostatina, produzida pela clivagem do plasminogenio por MMPs, que tambem apresentam resistencia nesse jogo de forcas entre invasor e hospedeiro, uma especie de trunfo organico, parecem desempenhar igualmente papel ineficaz. Por outro lado, as MMPs aumentam bastante seus niveis em processos patologicos, especialmente nos tumorais, encontrando-se fora de controle organico, e apresentam um comportamento promiscuo, exercendo o papel de outras em termos de sua afinidade por um determinado substrato. Dessa maneira, normatizar quais MMPs estariam presentes numa determinada neoplasia de um orgao especifico torna-se tarefa um tanto quanto dificil. Estudos recentes afirmam que a presenca de MMPs em neoplasias e sinal indicativo de alto grau de agressividade e malignidade tumoral. Logo, biopsias de neoplasias deveriam ser submetidas sempre a metodos que visassem a deteccao precoce de niveis aumentados de proteinas que compoem a cascata de sinalizacao da via de transcricao de sinais, como por exemplo, da proteina quinase C (PKC) e suas isoformas, que ultimam com a producao de MMPs. Para tanto, convem que se adequem metodos laboratoriais da biologia molecular, como o da imunohistoquimica e/ou o da hibridizacao in situ, ao campo da clinica medica. Embora tal sondagem nao promova um retrocesso no processo de degeneração organica de pacientes, podera definir diagnostico precoce e tratamento pronto, visando o impedimento de instalacao de mal maior. Referência Bibliográfica 1. Afzal S, Lalani EN, Poulsom R, Stubbs A, Rowlinson G, Sato H et al. MT1-MMP, and MMP-2 mRNA expression in human ovarian tumors: possible implications for the role of desmoplastic fibroblasts. Hum Pathol 1998; 29: 155-165. 2. Ahmad A, Hanby A, Dublin E, Poulsom R, Smith P, Barnes D et al. 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