nanda hampe
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tese Incompatibilidade de enxertia em Prunus, alterações fenotípicas, bioquímicas e gênicas Ivan dos Santos Pereira Pelotas, 2012. IVAN DOS SANTOS PEREIRA Engenheiro Agrônomo Incompatibilidade de enxertia em Prunus, alterações fenotípicas, bioquímicas e gênicas Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado. Orientador: José Carlos Fachinello Co-orientador (es): Ana Pina Luís Eduardo Corrêa Antunes Pelotas, 2012. Banca examinadora: José Carlos Fachinello – Professor, FAEM – UFPel (Presidente). Ângela Diniz Campos – Pesquisadora, Embrapa Clima Temperado. Flávio Gilberto Herter – Professor, FAEM - UFPel. Rodrigo Cezar Franzon – Pesquisador, Embrapa Clima Temperado. Moacir da Silva Rocha – Professor, CAVG - UFPel (Suplente). Paulo Celso de Mello Farias – Professor, FAEM – UFPel (Suplente). Agradecimentos Ao Profº José Carlos Fachinello, pela orientação, paciência e dedicação durante os anos de pesquisa. À Drª Ana Pina, pela brilhante orientação, paciência, dedicação, grande incentivo e amizade. Pessoa, que além de possibilitar a qualificação deste trabalho, me acolheu entre seus amigos e sua família.¡¡¡ Muchas Gracias !!! Ao Dr. Luis Eduardo Corrêa Antunes, pela orientação, dedicação, incentivo, parceria e grande amizade. Ao Dr. Carlos Augusto Posser Silveira, pelas discussões, sugestões, grande incentivo, parceria e enorme amizade, além das conversas descontraídas, regadas ao seu insuperável chimarrão, elaborado de forma meticulosa, quase que artística. Ao Dr. Rafael da Silva Messias, pelo grande auxílio e sugestões com relação à parte bioquímica, fisiológica e molecular, além do incentivo, da parceria e da grande amizade demonstrada. A Dra. Ângela Diniz Campos, pelo auxílio e sugestões com relação à parte bioquímica e fisiológica, além do incentivo, paciência e amizade. Aos Professores, Antônio Costa de Oliveira e Rogério Oliveira de Souza, pelo auxilio relacionado ao Curso de Pós-Graduação, em especial no caso do estágio de doutorado no exterior. Ao Dr. Flávio Gilberto Herter, por ser um pesquisador magnífico e uma pessoa exemplar, que acompanhou, incentivou, participou e contribuiu, para o meu crescimento e consequentemente para a realização deste trabalho. A Ana Wünsch, Ariana Cachi, Beatriz Bielsa, Enrique (Quique), Francisco Javier Rodrigo García, José Manuel Alonso Segura, José Miguel Ansón Hernández, Mari Carmen Villalba, María José Rubio Cabetas, María Pilar Bergua, María Teresa Espiau, Olga Frontera Sancho, Ons Gharbi, Pilar Errea Abad, Rafael Socias, Susana Ruber y demás funcionários del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentária de Aragón (CITA), por la ayuda, compresión, apoyo y amistad. A Teresa Bespín y María Pilar Tomey, funcionarias del CITA, por el cariño, dedicación y atención que tuvieron durante todo el tiempo que estuvimos juntos en el laboratorio, trabajando en extracciones, PCRs, callos, haciendo medio, o mismo fuera, en nostras cenas y copas. ¡¡¡ Muchas Gracias chicas !!! A Rosa Fustero, funcionaria del CITA y mi madre española, que mi recibió como a un hijo. Una amiga muy sensible, amable y con una alegría que contagia todos a su alrededor. ¡¡¡ Muchas Gracias Rosa !!! A Patricia Irisarri, colega de Doctorado en el CITA, por su cariño, sensibilidad, ayuda, atención y dedicación en todos los trabajos que hemos hecho juntos y por haber sido una gran amiga. ¡¡¡ Muchas Gracias Patri !!! A David, que en el Aparicio, hizo para nosotros, las mejores tapas de toda España, y donde he disfrutado de todo el sabor de la comida Española. Hasta hoy, mi paladar no encontró otro sabor semejante a sus patatas rellenas y su pulpo. ¡¡¡ Muchas Gracias amigo !!! A Miguel y Esther, por la amistad y por los buenos momentos que hemos pasado juntos. Me gustaría agradecer más una vez a Ana Pina, por su cariño y su inmenso corazón. ¡¡¡ Muchas Gracias Ana !!! Aos colegas de Pós-Graduação, Fernando José Hawerroth, Fernanda Quintanilha, Michel Aldrighi Gonçalves, Evandro Schneider, Gérson Vognolo, Mateus Pasa, Juliano Schmitz, Doralice Lobato de Oliveira Fischer, Gisely Moura e Simone Padilha Galarça, pelo auxílio e amizade. A todo o pessoal do laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado, Fabiane, Renê, Marcelo, Carol e Júnior, por toda ajuda, incentivo e amizade. A todos os professores da Pós-graduação, pelo convívio agradável e pelas experiências compartilhadas. A todo o pessoal do laboratório de Biologia Molecular, em especial, Vanessa e Natércia, por toda ajuda, incentivo e amizade. Aos estagiários e funcionários do departamento de Fruticultura da UFPel, em especial, Marcos, Luciane, Aloir, Nei, Barcelos e Pedro, pelo auxilio e pela amizade. A Madelon, responsável pela secretária do Colegiado da Pós-Graduação em Agronomia, pela enorme eficiência e boa vontade. Ao Carlos Eloi Ribeiro e aos meus tios, Ivone e Eduardo, pelo carinho e auxílio em um momento difícil. À UFPel, a FAEM e ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia Fruticultura de Clima Temperado, por permitir a realização do curso. Ao Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentária de Aragón (CITA), por permitir a utilização de sua estrutura e fazer parte do seu grupo de pesquisa internacionalmente reconhecido. À Embrapa Clima Temperado, por permitir a utilização de sua estrutura e de conviver com seus pesquisadores e demais funcionários. Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos no País e a CAPES, pela concessão da bolsa de estudos no exterior. Finalmente, agradeço a minha família, minha companheira de todas as horas Natália, meus pais Danilo e Maria Helena e meus irmãos Rafael, Charles e Elisa, pelo incentivo e apoio incondicional durante minha jornada. A todos vocês, MUITO OBRIGADO !!! Resumo PEREIRA, Ivan dos Santos. Incompatibilidade de enxertia em Prunus, alterações fenotípicas, bioquímicas e gênicas. 2012. 160f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. A enxertia permite combinar características específicas de diferentes espécies frutíferas, viabilizando a produção nas mais variadas condições edafoclimáticas. Entretanto, esse processo é muitas vezes limitado pela incompatibilidade de enxertia, fenômeno complexo, responsável por uma série de interações metabólicas entre porta-enxerto e cultivar. O objetivo deste trabalho foi estudar algumas diferenças fenotípicas, bioquímicas e gênicas entre combinações compatíveis e incompatíveis de Prunus. Desta forma, foram caracterizados: o crescimento vegetativo das combinações, sintomas de incompatibilidade; atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL); concentrações dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina e expressão das famílias de genes PAL, cinamato 4-hidroxilase (C4H) e 4-cumarato:CoA ligase (4CL), em enxertos compatíveis e incompatíveis. O experimento foi realizado no Centro Agropecuário da Palma, da Universidade Federal de Pelotas (Pelotas-RS, Brasil), onde as cultivares Chimarrita e Maciel foram enxertadas sobre os portaenxertos Capdeboscq, Tsukuba 1 e Umezeiro. As avaliações bioquímicas foram realizadas na Embrapa Clima Temperado (Pelotas-RS, Brasil) e a expressão gênica no Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentária de Aragón (C.I.T.A) (Zaragoza-Aragón, Espanha). Os resultados gerais indicam que: a) ‘Umezeiro’ apresenta elevado grau de incompatibilidade com as cultivares Chimarrita e Maciel; b) a incompatibilidade é causada pela diferença de concentração dos glicosídeos cianogênicos entre cultivar e porta-enxerto; c) a cianogênese induz o aumento de expressão de todas as famílias de genes estudadas e d) a prunasina é um marcador bioquímico consistente para a predição da incompatibilidade de enxertia entre espécies de Prunus. Palavras-chave: Prunus mume, P. persica, compatibilidade, fenilpropanóide, cianeto e compostos fenólicos. Abstract PEREIRA, Ivan dos Santos. Graft incompatibility on Prunus, phenotypc, biochemical and genetic changes. 2012. 160f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Grafting allows to combine specific characteristics of different fruit species, enabling the production in various soil and climatic conditions. However, this process is often limited by the graft incompatibility, complex phenomenon, responsible for a series of metabolic interactions between rootstock and variety. The purpose of this work was to study some phenotypic, biochemical and genetic differences between compatible and incompatible combinations of Prunus. Thus, were characterized: the vegetative growth of combinations, graft incompatibility symptoms; activity profile of phenylalanine ammonia-lyase (PAL); concentrations of cyanogenic glycosides amygdalin and prunasin and gene expression of PAL, cinnamate 4-hydroxylase (C4H) and 4-coumarate:CoA ligase (4CL) families in compatible and incompatible grafts. The experiment was conducted in the Agricultural Center of Palma, of Federal University of Pelotas (Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil), where Chimarrita and Maciel varieties were grafted on Capdeboscq, Tsukuba 1 and Umezeiro rootstocks. The biochemical evaluations were performed at the Center for Temperate Climate Agricultural Research (Embrapa CPACT) (Pelotas, Rio Grande do Sul, Brazil), and the gene expression analysis at the Centre of Agrofood Research and Technology of Aragón (C.I.T.A.) (Zaragoza, Aragón, Spain). The overall results indicate that: a) ‘Umezeiro’ has a high degree of incompatibility with Chimarrita and Maciel varieties; b) the incompatibility is caused by the difference in cyanogenic glycosides concentration between variety and rootstock, c) the cyanogenesis induces increased expression of all studied gene families and d) prunasin is a consistent biochemical marker of the graft incompatibility between Prunus species. Keywords: Prunus mume, propagation, compatibility, phenylpropanoid, cyanide and phenolic compounds. Lista de Figuras Figura 1. Produtividade de pêssegos e nectarinas nos principais Países produtores (FAOSTAT, 2011). Pelotas, RS, 2012. ........................... 14 Figura 2. Figura esquemática das três etapas de formação do enxerto. (A) proliferação de calo a partir da cultivar e do porta-enxerto; (B) formação de um novo cambio; e (C) Produção de novo floema e xilema. Adaptado de Hartmann et al. (2002). Pelotas, RS, 2012. .... 40 Figura 3. Região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ......................................................................................................... 68 Figura 4. Expressão gênica relativa diferencial de PAL1 e PAL2 na cultivar e no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ......................................................................................................... 70 Figura 5. Expressão gênica relativa global de PAL1 e PAL2. Pelotas, RS, 2012. ......................................................................................................... 70 Figura 6. Atividade enzimática da PAL na cultivar e no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ...................................... 71 Figura 7. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e a atividade enzimática da PAL no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ...................................... 72 Figura 8. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e atividade enzimática da PAL na cultivar das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ....................................... 72 Figura 9. Perfil cromatográfico padrão obtido por HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina. Pelotas, RS, 2012. .......................................................... 91 Figura 10. Corte macroscópico longitudional interno da região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B), ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C), ‘Maciel/Capdeboscq’ (D), ‘Maciel/Tsukuba 1’ (E), Maciel/Umezeiro (F), três anos e meio após a enxertia. Pelotas, RS, 2012. ............................................................. 93 Figura 11. Corte macroscópico da região de união do enxerto (combinação 'Maciel/Umezeiro') com destaque para a linha de descontinuidade vascular. Pelotas, RS, 2012. ............................................................ 94 Figura 12. Concentração dos glicosídeos cianogênicos (mg g-1) e atividade da fenilalanina amônia-liase - PAL (µmol min-1 g-1) nos porta-enxertos e nas cultivares estudadas. Pelotas, RS, 2012. .................................. 96 Figura 13. Correlação entre a concentração de prunasina e atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL) nas combinações compatíveis e incompatíveis. Pelotas, RS, 2012. .................................................... 98 Figura 14. Esquema resumido da rota fenilpropanóide. Adaptado de Taiz & Ziger (2004). Pelotas, RS, 2012. .................................................... 113 Figura 15. Índice SPAD observado pela análise das folhas das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. .................................... 122 Figura 16. Aparência externa e corte macroscópico longitudinal interno da região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B) e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (direita). Detalhes internos da região de união da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C). Pelotas, RS, 2012. .............................. 124 Figura 17. Concentração do glicosídeo cianogênico prunasina (mg g-1) no portaenxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos portaenxertos ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012........................................................................... 125 Figura 18. Concentração do glicosídeo cianogênico amigdalina (mg g-1) no porta-enxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos porta-enxertos ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012. ..................... 125 Figura 19. Expressão gênica relativa dos genes PA1L, PAL2, C4H1, C4H2 e 4C1L, 4CL2 e 4CL3 na cultivar e no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. .................................... 126 Figura 20. Relação filogenética entre genes PALs. As sequências de proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012. ....................................................................................................... 128 Figura 21. Relação filogenética entre os genes C4Hs. As sequências de proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012........................................................................... 129 Figura 22. Relação filogenética entre os genes 4CLs. As sequências de proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012........................................................................... 130 Figura 23. Esquema ilustrativo da via respiratória em combinações compatíveis e incompatíveis. Pelotas, RS, 2012. ............................................... 134 Figura 24. Correlação entre a concentração de prunasina no porta-enxerto ‘Umezeiro’ e a expressão dos genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3 na cultivar ‘Chimarrita’ (combinação incompatível). Pelotas, RS, 2012. .................................................. 137 Figura 25. Múltiplo alinhamento de sequências de proteínas dos genes C4H1 e C4H2 de P. persica, com identificação do motivo conservado PPGPIPVP. Pelotas, RS, 2012. ..................................................... 139 Figura 26. Expressão dos genes 4CL1, 4CL2 e 4CL3, em tecidos de calo (cultivados in vitro) e de casca. Pelotas, RS, 2012......................... 140 Lista de Tabelas Tabela 1. Cronograma de atividades a serem executadas durante o ano de 2008. Pelotas, RS, 2012................................................................... 30 Tabela 2. Cronograma de atividades a serem executadas durante o ano de 2009. Pelotas, RS, 2012................................................................... 30 Tabela 3. Cronograma de atividades a serem executadas de janeiro de 2010 a março de 2011. Pelotas, RS, 2012. .................................................. 30 Tabela 4. Custo total do projeto. Pelotas, RS, 2012.......................................... 30 Tabela 5. Características dos primers PAL1, PAL2 e Actina. Pelotas, RS, 2012. ......................................................................................................... 65 Tabela 6. Estabilidade dos genes de referencia Actina, AT5G12240 e TEF2. Pelotas, RS, 2012............................................................................. 65 Tabela 7. Análise de crescimento e compatibilidadde das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ....................................... 68 Tabela 8. Identificação dos tipos de incompatibilidade ‘translocada’, pelo índice SPAD e ‘localizada’ pela avaliação anatomia da união conforme Herrero & Mosse (1951). .................................................................. 92 Tabela 9. Concentração (mg g-1) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina nas diferentes épocas, cultivares e porções do enxerto. Pelotas-RS, 2012. ............................................................................ 95 Tabela 10. Diferença entre a concentração dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina encontradas nas cultivares e nos portaenxertos das combinações estudadas. Pelotas, RS, 2012............... 97 Tabela 11. Características dos primers de PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3. Pelotas, RS, 2012.................................................... 117 Tabela 12. Características dos primers de Actina, TEF2, RPII e AT5G12240. Pelotas, RS, 2012........................................................................... 118 Tabela 13. Estabilidade dos genes de referencia Actina, TEF2, RPII e AT5G12240. Pelotas, RS, 2012. .................................................... 118 Tabela 14. Número de vezes em que os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3, foram mais expressos na cultivar que no portaenxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. ....................................................................................................... 127 Sumário 1. Introdução................................................................................................. 14 2. Projeto de pesquisa ................................................................................. 17 2.1. Título .................................................................................................. 17 2.2. Equipe técnica ................................................................................... 17 2.3. Justificativa ....................................................................................... 17 2.4. Revisão de Literatura........................................................................ 19 2.5. Hipótese ............................................................................................. 27 2.6. Objetivo .............................................................................................. 27 2.6.1. Geral................................................................................................ 27 2.6.2. Específicos ...................................................................................... 28 2.7. Material e métodos............................................................................ 28 2.7.1. Material vegetal ............................................................................... 28 2.7.2. Extração de glicosídeos cianogênicos............................................. 28 2.7.3. Determinação cromatográfica de glicosídeos cianogênicos ............ 29 2.7.4. Delineamento e análise estatística .................................................. 29 2.8. 2.9. 2.10. 2.11. Resultados esperados ...................................................................... 29 Cronograma ....................................................................................... 30 Custos ................................................................................................ 30 Referências bibliográficas ............................................................... 31 3. Revisão de Literatura ............................................................................... 35 3.1. Origem e botânica ............................................................................. 35 3.2. Uso de porta-enxertos na fruticultura ............................................. 36 3.3. Tipos de porta-enxertos ................................................................... 36 3.3.1. Porta-enxertos de sementes ou francos .......................................... 37 3.3.2. Porta-enxertos clonais ..................................................................... 37 3.4. Influência do porta-enxerto sobre a cultivar .................................. 37 3.5. Enxertia .............................................................................................. 39 3.6. Incompatibilidade de enxertia .......................................................... 40 3.7. Tipos de incompatibilidade de enxertia .......................................... 41 3.7.1. Incompatibilidade ‘translocada’ ....................................................... 42 3.7.2. Incompatibilidade ‘localizada’ .......................................................... 43 3.7.3. Outros tipos de incompatibilidade.................................................... 45 3.8. Mecanismos potencialmente envolvidos na incompatibilidade de enxertia 45 3.8.1. Plasmodesmas: reconhecimento celular ......................................... 45 3.8.2. Hormônios ....................................................................................... 46 3.8.3. Compostos fenólicos ....................................................................... 47 3.8.4. Glicosídeos cianogênicos (GCs) ..................................................... 48 3.9. Métodos de diagnóstico da incompatibilidade de enxertia ........... 49 3.9.1. Isoenzimas e proteínas totais .......................................................... 50 3.9.2. Estudo histológico da união do enxerto ........................................... 50 3.9.3. Estudo macroscópico da união do enxerto...................................... 51 3.9.4. Estimativa da concentração de clorofila .......................................... 51 3.9.5. Enxertia in vitro ................................................................................ 52 3.9.6. Diferenças bioquímicas ................................................................... 52 4. Relatório do trabalho de campo ............................................................. 54 4.1. Avaliações fenotípicas ..................................................................... 54 4.2. Mecanismo de incompatibilidade por cianogênese....................... 56 4.3. Mecanismo de incompatibilidade por diferenças na composição fenólica 57 5. Artigo 1: Compatibilidade de enxertia em pessegueiro: análise de crescimento e expressão gênica da Fenilalanina amônia-liase .................. 59 5.1. Resumo .............................................................................................. 59 5.2. Abstract ............................................................................................. 60 5.3. Introdução ......................................................................................... 61 5.4. Material e métodos............................................................................ 63 5.4.1. Material vegetal ............................................................................... 63 5.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia ....................................... 63 5.4.3. Extração de RNA e síntese de cDNA .............................................. 63 5.4.4. Análise da expressão gênica ........................................................... 64 5.4.5. Seleção do gene de referência ........................................................ 64 5.4.6. Atividade enzimática da PAL ........................................................... 65 5.4.7. Análise estatística............................................................................ 66 5.5. Resultados ......................................................................................... 67 5.5.1. Avaliação da compatibilidade de enxertia ....................................... 67 5.5.2. Seleção do gene de referência ........................................................ 68 5.5.3. Expressão gênica de PAL1 e PAL2................................................. 69 5.6. Discussão .......................................................................................... 73 5.6.1. Compatibilidade de enxertia ............................................................ 73 5.6.2. Gene de referência para o estudo da compatibilidade de enxertia.. 73 5.6.3. Perfil da expressão gênica de PAL1 e PAL2 ................................... 74 5.6.4. Correlação entre transcrição e atividade da PAL ............................ 76 5.7. Conclusões ........................................................................................ 78 5.8. Referencias bibliográficas ............................................................... 79 6. Artigo 2: Cianogênese, a causa da incompatibilidade de enxertia em Prunus .............................................................................................................. 84 6.1. Resumo .............................................................................................. 84 6.2. Abstract ............................................................................................. 85 6.3. Introdução ......................................................................................... 86 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 6.8. Material e métodos............................................................................ 88 6.4.1. Material vegetal ............................................................................... 88 6.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia ....................................... 88 6.4.3. Determinação da atividade da PAL ................................................. 89 6.4.4. Determinação da concentração de GCs.......................................... 90 6.4.5. Análise estatística............................................................................ 91 Resultados ......................................................................................... 92 6.5.1. Compatibilidade de enxertia ............................................................ 92 6.5.2. Concentração dos GCs ................................................................... 95 6.5.3. Atividade da PAL ............................................................................. 97 6.5.4. Correlação entre prunasina e atividade da PAL .............................. 97 Discussão .......................................................................................... 99 6.6.1. Compatibilidade de enxertia ............................................................ 99 6.6.2. Diferenças bioquímicas entre combinações compatíveis e incompatíveis ........................................................................................... 100 6.6.3. Correlação entre prunasina e atividade da PAL ............................ 102 Conclusões ...................................................................................... 104 Referencias bibliográficas ............................................................. 105 7. Artigo 3: Expressão gênica de PAL, C4H e 4CL em resposta a incompatibilidade de enxertia por cianogênese......................................... 110 7.1. Resumo ............................................................................................ 110 7.2. Abstract ........................................................................................... 111 7.3. Introdução ....................................................................................... 112 7.4. Material e métodos.......................................................................... 114 7.4.1. Material vegetal ............................................................................. 114 7.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia ..................................... 114 7.4.3. Determinação da concentração de GCs........................................ 115 7.4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA ............................................ 115 7.4.5. Análise da expressão gênica e seleção do gene de referência ..... 116 7.4.6. Análise estatística.......................................................................... 121 7.5. Resultados ....................................................................................... 122 7.5.1. Compatibilidade de enxertia .......................................................... 122 7.5.2. Concentração dos GCs ................................................................. 123 7.5.3. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........... 125 7.5.4. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........ 127 7.6. Discussão ........................................................................................ 131 7.6.1. Incompatibilidade por cianogênese ............................................... 131 7.6.2. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........... 135 7.6.3. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL ........ 138 7.7. Conclusões ...................................................................................... 142 7.8. Referências bibliográficas ............................................................. 143 8. Conclusões ............................................................................................. 148 9. Referências bibliográficas..................................................................... 150 14 1. Introdução Com uma produção de 216.000 toneladas anuais em uma área de 20.000 hectares, o pessegueiro (Prunus persica L. Batsch) é uma das frutíferas de clima temperado mais importantes no Brasil. No cenário mundial, o País ocupa a décima terceira posição no ranking de produção e a vigésima quinta no ranking de produtividade (Figura 1), com 11,35 toneladas por hectare (FAOSTAT, 2011). A baixa produtividade faz com que a produção nacional seja insuficiente para abastecer o mercado interno, tornando necessária a importação de cerca de 14.000 toneladas anuais (AGRIANUAL 2010). Os dados estatísticos evidenciam a necessidade de incrementos na produtividade brasileira, a fim de alcançar a auto-suficiência e evitar a evasão de divisas. 50 40 30 t ha -1 ) 20 10 Áustria Israel França Malta Venezuela Estados Unidos Turquia Eslovênia Grécia Chile Itália Espanha Marrocos África do Sul Suíça República da Coréia China Turcomenistão Japão Colômbia Jordânia Guatemala Líbano Argentina Brasil 0 Figura 1. Produtividade de pêssegos e nectarinas nos principais Países produtores (FAOSTAT, 2011). Pelotas, RS, 2012. Do ponto de vista técnico, um dos principais problemas responsáveis pela baixa produtividade da cultura do pessegueiro no Brasil é a falta de porta-enxertos adaptados as condições de cultivo. O porta-enxerto exerce uma importante 15 influência sobre vários aspectos do sistema de produção, como o vigor, a precocidade, a qualidade dos frutos, a tolerância a estresses bióticos e abióticos e principalmente a produtividade (WERTHEIM & WEBSTER, 2005; PICOLOTTO et al., 2009; CANTÍN et al., 2010; OLMSTEAD et al., 2010; XIANG et al., 2010; GJAMOVSKI & KIPRIJANOVSKI, 2011; JIMÉNEZ et al., 2011a; JIMÉNEZ et al., 2011b; ORAZEM et al., 2011; ZRIG et al., 2011). Geralmente, procura-se adotar como porta-enxerto, aquele que reúna o maior número de características desejáveis e que seja compatível com as variedades que serão enxertadas (FINARDI, 1998). Entretanto, a utilização cada vez maior de porta-enxertos com origem genética distinta da cultivar que será enxertada, visando à obtenção de vantagens ao sistema de produção, aumenta a ocorrência de um fenômeno conhecido como incompatibilidade de enxertia. A incompatibilidade de enxertia pode ser descrita como a ausência do desenvolvimento normal dos tecidos no ponto de enxertia, especialmente do sistema vascular (xilema e floema), resultante da falta de afinidade entre porta-enxerto e cultivar (MOSSE, 1958; HARTMANN et al., 2002). Embora os eventos envolvidos na enxertia sejam conhecidos, os mecanismos pelos quais a incompatibilidade se expressa não estão claros e várias hipóteses têm sido estudadas na tentativa de explicar o fenômeno (PINA & ERREA, 2005). Na cultura do pessegueiro, o mecanismo de incompatibilidade melhor compreendido é o que ocorre entre pessegueiro (Prunus persica) e amendoeira (Prunus dulcis). Neste caso, a incompatibilidade é provocada pela maior concentração de prunasina no pessegueiro, composto que quando hidrolisado libera cianeto na interface do enxerto, causando danos celulares com prejuízo a continuidade vascular (MOORE, 1986; NOCITO et al., 2010). Entretanto, outros mecanismos de incompatibilidade têm sido propostos para justificar a incompatibilidade de enxertia entre diferentes espécies de Prunus (PINA & ERREA, 2005). Entre eles, o mais estudado envolve a diferença no perfil de compostos fenólicos entre cultivares e porta-enxertos incompatíveis. Estes compostos estão envolvidos em todos os estágios do processo de enxertia, e por isso, diferenças quantitativas ou qualitativas entre cultivar e porta-enxerto são relacionadas com a incompatibilidade de enxertia (ERREA, 1998; TELES et al., 2009; ZARROUK et al., 2010). 16 O entendimento do mecanismo de incompatibilidade que se manifesta entre diferentes combinações incompatíveis de Prunus pode acelerar o processo de obtenção de novos porta-enxertos para pessegueiro e contribuir para a melhoria dos índices de produtividade. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos, avaliar diferenças fenotípicas, bioquímicas e gênicas entre combinações compatíveis e incompatíveis de Prunus e identificar um marcador para sua detecção ou previsão. 17 2. Projeto de pesquisa 2.1. Título Cianogênese e a incompatibilidade de enxertia de Prunus sp. 2.2. Equipe técnica Aluno: Ivan dos Santos Pereira Orientador: José Carlos Fachinello Co-orientador: Luis Eduardo Corrêa Antunes 2.3. Justificativa O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, ficando a traz apenas de China e Índia. De acordo com o Instituto Brasileiro de Frutas (Ibraf), o incremento de produção tem se mantido na média de 4,5% ao ano. Mas para 2008, estima-se que haverá incremento de 10% em volume e de 14% em receita. Devendo, pela primeira vez ultrapassar a marca de US$ 1 bilhão nas vendas externas. Porém, o Brasil ainda apresenta exportações incipientes, sendo pouco participativo no mercado externo de frutas. Também está longe de ser um grande consumidor de frutas, a demanda per capita é de 57kg, enquanto que em países da Europa, como Espanha, Itália e Alemanha, essa demanda atinge respectivamente, 120, 114 e 112kg (ANUÁRIO, 2007). Devido a este cenário, há boas perspectivas futuras para o Brasil no que se refere ao mercado de frutas, com possibilidade de crescimento no mercado interno e externo. E além de tudo, a fruticultura brasileira está a cada ano firmando-se como um dos principais geradores de renda, empregos e desenvolvimento no meio rural. Dentro deste contexto, a cultura do pessegueiro pode ocupar lugar de destaque entre as frutíferas de clima temperado no crescimento deste setor. Inclusive com uma maior participação no mercado externo, tendência essa, fortalecida com o avanço da Produção Integrada de Pêssego (PIP), tendo em vista, que esse tipo de sistema de produção é de suma importância e preceito básico para o estabelecimento de uma relação de sucesso com o mercado externo. No âmbito nacional, contribui para a melhoria da qualidade de vida de um grande número de produtores, que em geral exploram a atividade em 18 pequenas áreas, em média dois hectares, caracterizando-se como uma cultura de base familiar e que gera de três a seis empregos por hectare, com grande impacto socioeconômico nas comunidades produtoras. Porém, os produtores de pêssego vêm sofrendo com uma baixa lucratividade, devido às baixas produtividades obtidas, mesmo com o avanço do melhoramento genético, que disponibiliza cultivares altamente produtivas, as médias de produção verificadas ficam em torno de cinqüenta por cento do potencial real dos genótipos. Dentre as principais causas pode-se citar a desuniformidade de vigor dos pomares, devido utilização de porta-enxertos originados de caroços e obtidos junto às indústrias processadoras sem nenhum controle e havendo misturas varietais; a suscetibilidade das plantas ao ataque de doenças e pragas de solo, como os nematóides; assim como ao replantio do pessegueiro e a morte precoce do pessegueiro, que tem causado grandes prejuízos aos pomares. Sendo a principal solução para esses problemas, a utilização de portaenxertos adequados. Mas atualmente, principalmente na região Sul, onde se concentra cerca de 64% da produção nacional, estão disponíveis aos produtores brasileiros poucas opções de porta-enxertos, em geral além da mistura varietal coletada nas indústrias, são utilizadas as cultivares Capdebosq e Aldrighi, que são susceptíveis a maioria dos fatores responsáveis pelas baixas produções, se fazendo necessário a introdução de novas cultivares de porta-enxertos, que confiram as características de interesse para a superação dos fatores problema e que sejam compatíveis com as cultivares utilizadas pelos persicultores brasileiros. Porém, muitas vezes se esbarra em um grande problema que é justamente a questão da compatibilidade, ou a falta da mesma, quando isso ocorre se diz que houve incompatibilidade, ou seja, a falta de afinidade de alguma natureza entre cultivar e porta-enxerto e que compromete a formação da muda, diminui a produtividade do pomar ao longo do tempo ou mesmo causa a morte de plantas já adultas. As pesquisas sobre a incompatibilidade de enxertos foram iniciadas porque constituem num importante problema para a fruticultura (HERNANDEZ, 2002). Segundo Mosse (1962), tais pesquisas tem três objetivos principais: conhecer o fenômeno da incompatibilidade; conhecer os possíveis sintomas 19 iniciais e conhecer as causas fundamentais. Além da capacidade de predizer a incompatibilidade, que seria um grande benefício para os produtores, tornando possível a seleção de combinações compatíveis, evitando posteriores problemas de incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993), principalmente quando a mesma se desenvolve lentamente e debilita a planta ao longo dos anos sem que o produtor perceba, lhe causando prejuízos acumulativos. Um método capaz de predizer e informar sobre a compatibilidade da combinação porta-enxerto e cultivar, permitiria reduzir de forma importante o processo de obtenção de novos porta-enxertos adaptados e seu estudo com diferentes cultivares (ERREA et al., 2003). 2.4. Revisão de Literatura O pessegueiro pertence à família Rosácea, gênero Prunus (L.). É uma espécie nativa da China, tendo sido encontradas referências na literatura chinesa 20 séculos a.C.. No Brasil, foi introduzido em 1532 por Martin Afonso de Souza, por meio de mudas trazidas da Ilha da Madeira (SACHS & CAMPOS, 1998). Atualmente, segundo dados do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), em 2006 foram colhidas no Brasil 199.719 toneladas de pêssego, em uma área de 22.453 hectares, com um rendimento médio de 8.894kg ha-1. Mas segundo Raseira & Nakasu (1998a; 1998b), pomares bem conduzidos e com tecnologia adequada, apresentam produção média superior a 20ton ha-1. O que configura um rendimento de menos de 50% do potencial existente. Conforme já evidenciado por Zecca (2002), muitos dos aspectos que possibilitam um maior rendimento da cultura do pessegueiro, estão relacionados com o emprego de porta-enxertos adequados. O emprego de porta-enxertos iniciou na Itália e em geral, na Europa, a partir dos anos 60, mas assumiu importância com o desenvolvimento da fruticultura industrial e responde as modernas exigências da fruticultura tecnicamente evoluída (LORETI, 2008). Para espécies como o pessegueiro, a demanda por novos portaenxertos é mais recente em conseqüência da difusão desta espécie em zonas marginais ou não indicadas do ponto de vista edafoclimático, como regiões 20 caracterizadas por terrenos encharcados, compactados, ácidos, alcalinos ou de baixa fertilidade (LORETI, 1988), ou devido a problemas como a presença de nematóides nas áreas de plantio ou ainda a necessidade de se realizar o replantio, devido à baixa disponibilidade de novas áreas, característica típica dos produtores de pêssego. Nas regiões produtoras de pêssego, no mundo, são usados diferentes porta-enxertos em função de condições específicas de cada uma (FINARDI, 1998). Geralmente, procura-se adotar como porta-enxerto, aquele que reúna o maior número possível de características desejáveis, tais como: ser de fácil obtenção; ser adaptado às condições de solo e clima locais; ser resistente a doenças e pragas do solo; ter boa compatibilidade com o enxerto; induzir vigor adequado à densidade e homogeneidade do pomar; ter boa ancoragem; induzir precocidade (para iniciar a produção) do enxerto; ser eficiente na produção de frutas de qualidade; propiciar longevidade às plantas; ser eficiente na absorção de água e nutriente e ser resistente a condições de estresse (asfixia, solos alcalinos ou ácidos, seca) (FINARDI, 1998). Segundo Fachinello et al. (1996), a enxertia é o principal método de obtenção de mudas para a formação de pomares comerciais. Sendo que 100% das plantas de pessegueiro são propagadas por enxertia. A enxertia é o processo de multiplicação pela qual parte de uma planta é inserida sobre outra com a qual tenha compatibilidade, passando a desenvolver-se sobre esta planta (LUZ, 1987). A enxertia, igualmente a outros métodos de propagação vegetativa, permite perpetuar as características genéticas da planta de origem (GEORGE & NISSEN, 1987), além das plantas atingirem a fase produtiva mais rapidamente em relação à propagação por sementes (HERNANDEZ, 2002; HARTMANN et al., 1990), possibilidade de exploração das características desejadas do porta-enxerto e da cultivar em uma única planta, possibilidade de rápida mudança de cultivares aproveitando um sistema radicular já existente, recuperação de plantas danificadas, auxilio no estudo de doenças virais pela indexagem (HARTMANN et al., 1990). É comumente utilizada para fins comerciais, como forma de propagação de espécies lenhosas, e com as partes enxertadas geralmente pertencentes à mesma espécie ou gênero. No entanto, as pesquisas com enxertia tem envolvido componentes com maior diversidade 21 genética, como por exemplo, a enxertia intersubfamilia (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Os enxertos heterespecíficos de plantas frutíferas em geral apresentam um sistema de simbiose problemático (ERREA, et al., 1992). Sendo o processo de enxertia a união de dois materiais vegetais geneticamente distintos, o ganho esperado no desempenho da copa está relacionado com a eficiência do porta-enxerto utilizado e com a compatibilidade dos tecidos de ambos. Portanto, a compatibilidade é fundamental para o sucesso de um pomar ao longo do tempo (CARLOS et al., 1997). Entende-se por compatibilidade de enxertia, a existência de uma união bem sucedida no ponto de enxertia e um desenvolvimento satisfatório da planta. Caso isso não aconteça, tem-se o que é chamado de incompatibilidade de enxertia (HARTMANN et al., 1997). A incompatibilidade de enxertia constitui num problema para a fruticultura (ERREA, et al., 1998). Conforme Oliveira Junior (1999), duas plantas são incompatíveis quando, por motivos intrínsecos a elas, não são capazes de formar uma união completa e equilibrada, impossibilitando o desenvolvimento normal da planta. Segundo o mesmo autor, a incompatibilidade surge devido as diferenças nas características de crescimento da copa e do porta-enxerto, diferenças fisiológicas e bioquímicas entre os dois ou ainda à produção de alguma substância tóxica de uma parte para a outra. Já Mosse (1958), define incompatibilidade como a ausência de desenvolvimento normal dos tecidos no ponto de enxertia, resultando em feixes vasculares incompletamente lignificados, que provocam uma interrupção da continuidade vascular e cambial com conseqüentes problemas físicos da união. Para Fachinello et al. (1995), duas plantas são incompatíveis quando por motivos intrínsecos a elas, não são capazes de formar uma união perfeita, impossibilitando o desenvolvimento normal da nova planta. Feucht (1988) define a incompatibilidade de enxerto como uma senescência prematura, a qual está relacionada com aspectos fisiológicas e bioquímicos. Alguns sintomas de incompatibilidade em espécies lenhosas incluem o excesso de suberização e espessamento da casca devido a um excesso de produção de células crivadas; baixa produção de tracheídeos e acúmulo excessivo de tanino indicado por manchas escuras na casca (COPES, 1980). 22 Sintomas externos, que também têm sido observadas, incluem atraso na brotação (NELSON, 1968), anomalia na morfologia das folhas e prematura queda das mesmas (COPES, 1980), redução do crescimento vegetativo, morte prematura (HARTMANN et al., 1990), perda de turgescência, menores taxas de transpiração durante o dia (SCHMID et al., 1988). Conforme Breen (1975), também podem ocorrer descoloração observada em folhas na copa das plantas devido à descontinuidade no enxerto vascular no ponto de união da enxertia. Outros sintomas morfofisiológicos da incompatibilidade são: a falta de união entre enxerto e porta-enxerto; diferenças de crescimento ou de vigor do enxerto e do porta-enxerto, que resulta em marcante diferença entre os diâmetros dos mesmos, com excessivo desenvolvimento abaixo, acima ou no ponto de união; o amarelecimento das folhas seguido de desfolhamento precoce; crescimento vegetativo reduzido; a diferença entre o enxerto e porta-enxerto com relação ao início e final do período vegetativo; e a morte prematura de plantas (FACHINELLO et al., 1995; SIMÃO, 1998). Em plantas lenhosas, a quebra no local da união do enxerto é considerado o mais confiável diagnóstico da incompatibilidade (GARNER, 1979). Implica que ocorre muito pouco ou nenhuma conexão vascular funcional, a presença de fibras formada entre porta-enxerto e cultivar, não conferindo resistência mecânica significativa para levar o enxerto ao pleno desenvolvimento. Diferentemente da quebra, os sintomas anatômicas e/ou fisiológicos devem ser observados cuidadosamente antes de definir combinações incompatíveis, uma vez que todos por si só lembram sintomas causados por condições ambientais desfavoráveis ou falhas de manejo (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Mosse (1962) dividiu a incompatibilidade em translocada e localizada. A incompatibilidade translocada ocorre quando algum fator ocasional, como uma toxina, é transportada de um componente do enxerto para o outro, e a inserção de um filtro mutuamente compatível não supera essa incompatibilidade. Outras características da incompatibilidade translocada incluem: • Continuidade vascular normal na união, embora possa às vezes haver um super crescimento da copa, tendo por resultado tecidos comprimidos da casca; 23 • Acumulação de amido na copa e sua quase total ausência abaixo do ponto de enxertia, ou seja, no porta-enxerto; • Degeneração do floema, que é o principal indicador; • Comportamento diferenciado de enxertos recíprocos; • Os efeitos são observados durante a fase inicial de crescimento; • Os enxertos raramente morrem por bloqueio no ponto de união; Alguns exemplos são a incompatibilidade de várias cultivares de amêndoeira (Prunus dulcis Mill.) (HEUSER, 1987) e pessegueiro (BREEN, 1974) sobre o porta-enxerto de ameixeira ‘Marianna 2624’ (P. cerasifera Ehrh. x P. munsoniona, que se caracteriza pela degeneração do floema e o fracasso do filtro, ocorrendo a incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). A incompatibilidade localizada ocorre na interface do enxerto e requer o contato entre os dois componentes do enxerto, uma vez que a inserção de um filtro mutuamente compatível supera a incompatibilidade (MOSSE, 1962). Neste modelo, o filtro aparentemente funciona como uma armadilha para a incompatibilidade, ou seja, inibe os fatores originários de um dos componente do enxerto que são prejudiciais ao outro, quando ambos estão em contacto direto (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Segundo Andrews & Marquez (1993), outras características da incompatibilidade localizada são: • Necrose do câmbio e descontinuidade dos tecidos vasculares, geralmente com a quebra na união do enxerto; • As combinações recíprocas demonstram respostas similares à incompatibilidade; • O sistema radicular fica gradualmente desnutrido, sendo a lenta evolução dos sintomas externos proporcional ao grau de severidade da descontinuidade vascular. Considerando o crescente número de estudos que levaram à observação destas alterações morfológicas e fisiológicas entre combinações compatíveis e incompatíveis em plantas lenhosas (Ermel et al., 1999; Espen et al., 2005), existe pouca informação sobre a base bioquímica da 24 incompatibilidade e os mecanismos moleculares envolvidos (PINA & ERREA, 2005; PINA & ERREA, 2007). Rodrigues et al. (2001), estudando a compatibilidade da enxertia em Prunus sp, concluíram que a atividade de peroxidase e a concentração de fenóis elevada estão relacionadas com a união incompatível entre enxerto e porta-enxerto. Schmid e Freitag (1998) observaram que o aumento de peroxidase coincidiu com o escurecimento dos tecidos na região enxertada. O aumento dos níveis de hexoses podem afetar os precursores de polifenóis, resultando em um aumento das concentrações de polifenóis endógenos, que são prejudiciais a compatibilidade (TREUTTER et al., 1985). Este também é um efeito da descontinuidade vascular sobre a incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). A incompatibilidade pode ser relacionada ainda à presença de algum tipo de vírus ou micoplasma existente em uma das duas partes que não é tolerada pela outra (SALAYA, 1999). Feucht e Schmid (1988) propôs que os fatores ambientais possam suscitar pequenas alterações metabólicas, tais como mudanças na síntese e de flavonóides e peroxidase, que eventualmente levam a incompatibilidade fisiológica do enxerto. Os efeitos do ferimento sobre os mecanismos de incompatibilidade também devem ser considerados, tendo em vista que as respostas a um ferimento estão necessariamente envolvidas ao processo de enxertia (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Outros fatores também podem contribuir para a falha do enxerto, incluindo a diferença taxonômica entre porta-enxerto e cultivar; condições ambientais adversas, tais como temperaturas extremas, privação de oxigênio e água (ANDREWS & MARQUEZ, 1993), nutrientes inorgânicos como N, P, K, Ca e Mg (SALESSES & AL KAI, 1985); alterações nos níveis nutricionais acompanhadas ou seguidas de alterações nos níveis de carboidratos devido a descontinuidade vascular (BREEN & MURAOKA, 1975). A incompatibilidade de enxertia, também pode estar relacionada com diferenças no nível protéico entre o porta-enxerto e a cultivar. Musacchi (1996), em estudo sobre incompatibilidade de enxertia de pereira sobre marmeleiro, encontrou diferentes proteínas entre as duas espécies e a presença de 25 diferentes modelos protéicos nos calos unidos por cinco dias na mesma placa de petri em comparação àqueles tecidos das duas espécies que não foram colocados em contato. Fachinello et al. (1999), mediante análise do padrão isoenzimático, observaram que além das alterações fisiológicas ocorre interação celular em nível molecular que permite a manifestação de novas formas isoenzimáticas como resultado da modificação bioquímica da união copa/porta-enxerto. Vários trabalhos descrevem a hipótese de que a incompatibilidade esteja relacionada às diferenças fisiológicas e bioquímicas existentes entre porta-enxerto e copa. A maior parte destes trabalhos descrevem as toxinas ou metabólitos produzidos durante o processo de enxertia como a principal causa da incompatibilidade. O movimento de substâncias que possam afetar negativamente uma das partes, ou que poderiam ser alterados durante o contato com a outra parte, há muito tem sido um aspecto controverso das relações entre porta-enxerto e cultivar (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Moore (1986) relata que a ocorrência da incompatibilidade está associada à produção de glicosídeos cianogênicos. Que são compostos causadores do fenômeno chamado cianogênese. Dois glicosídeos cianogênicos têm sido encontrados em tecidos de várias espécies de Prunus, o monoglicosídeo prunasina, que ocorre em praticamente todas as partes da planta, e o diglicosídeo amigdalina, encontrado principalmente nas sementes. A cianogênese é a produção de cianeto por organismos vivos, sendo um fenômeno relativamente comum em plantas superiores (VETTER, 2000). Segundo Poulton, (1990) a capacidade das plantas de libertar cianeto foi detectada em 3000 espécies de plantas de 110 famílias botânicas. A liberação do cianeto ocorre quando a planta sofre algum ferimento. Em plantas intactas, as enzimas que promovem a quebra dos glicosídeos cianogênicos, chamadas genericamente de β-glicosidases, encontram-se separadas destes por compartimentação (CONN, 1980). No caso da enxertia, o ferimento é causado pelo próprio processo, devido ao ferimento em ambas as pares do enxerto. 26 O envolvimento dos compostos cianogênicos no aparecimento da incompatibilidade de enxertia já havia sido descrito por Gur (1957), que verificou a ocorrência do glicosídeo cianogênico prunasina no marmeleiro e não na pereira. Ocorrendo incompatibilidade quando da enxertia destas espécies. No caso de algumas cultivares de pêra enxertadas sobre um portaenxerto marmeleiro, o glicosídeo cianogênico prunasina, produzido no marmeleiro ascende para a pereira e é hidrolisado pela β-glicosidase, produzindo cianeto na interface do enxerto (GUR et al. 1968). O cianeto interrompe a translocação, por causar a destruição do xilema e floema. Isto leva a uma redução da disponibilidade de carboidratos disponíveis para o sistema radicular do marmeleiro. As cultivares de pêra compatíveis com marmeleiro contém enzimas capazes de degradar a prunasina antes que seja hidrolisada, evitando assim a formação de cianeto. Em outros casos de combinações compatíveis, em que a prunasina está envolvida, podem ocorrer outros mecanismos de desintoxicação, pelo qual o cianeto ou o benzaldeido são metabolizadas (MOING & SALESSES, 1988). A incompatibilidade de enxertia entre pessegueiro e amendoeira também pode ser explicada pela incompatibilidade por toxinas. Em contraste com a pêra e o marmeleiro, no pessegueiro e amendoeira, ambos contêm glicosídeos cianogênicos. Porém as cultivares de pessegueiro incompatíveis com amendoeira contém níveis consideravelmente mais elevados de prunasina em relação aqueles que são compatíveis. Por isso, quando essas cultivares são enxertadas em amendoeiras, ocorre uma rede de circulação de prunasina para o porta-enxerto da amendoeira. E o aumento da atividade deste glicosídeo nos tecidos de amendoeira gera a produção de cianeto, que se acumula na interface do enxerto, resultando na incompatibilidade (GUR & BLUM, 1973), possivelmente pelo fato do acumulo de cianeto ultrapassar os níveis tolerados pela amendoeira. O caso de incompatibilidade entre a cultivar ‘Elberta’ cultivar de pessegueiro e ‘Marianna 2624’ de ameixeira é outro exemplo. Moing e Salesses (1988) consideram que porta-enxertos de ‘Marianna 2624’ podem ser progressivamente envenenados pela prunasina produzida na cultivar de pessegueiro. 27 Estudos realizados por Heuser (1983), com espécies de Prunus in vitro confirmam o mecanismo de incompatibilidade causado por toxinas. O calo de duas espécies, P. besseyi Bailey e P. tomentosa Thunb., foram mais sensíveis ao cianeto do que cultivares de pêssego. Tanto P. besseyi quanto P. tomentosa são utilizados como porta-enxertos para pessegueiro, e apresentam problemas de incompatibilidade com este, sendo a cianogênese novamente considerada a causa dessa incompatibilidade. Em estudos posteriores de Heuser (1987) a incompatibilidade entre a amendoeira ‘Nonpareil’ e a ameixeira 'Marianna 2624’ é causada pelos produtos da hidrolise do benzaldeído e da amigdalina, possíveis toxinas responsáveis pelo mecanismo de incompatibilidade. A amigdalina é um glicosídeo cianogênico, produzido pelo catabolismo da prunasina e pode ser prejudicial para as culturas de calo de ameixeira, porque quando hidrolisadas libera cianeto e benzaldeído. E a amendoeira, no entanto é incapaz de hidrolisar a amigdalina. O desenvolvimento de um método capaz de predizer a informação sobre a compatibilidade da combinação porta-enxerto e cultivar, permitiria reduzir de forma importante o processo de obtenção de novos porta-enxertos e seu estudo com diferentes cultivares (ERREA et al., 2003). 2.5. Hipótese A liberação de cianeto pela hidrólise dos glicosídeos cianogênicos prunasina e amigdalina, provoca sintomas de incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto de pessegueiro. 2.6. Objetivo 2.6.1. Geral Determinar e relacionar os níveis de cianeto e dos glicosídeos cianogênicos prunasina e amigdalina em combinações compatíveis e incompatíveis de porta-enxertos e cultivares de Prunus. 28 2.6.2. Específicos • Classificar as diferentes combinações de enxerto e porta-enxerto com base nos níveis de cianeto; • Verificar se os níveis de cianeto podem se constituir em marcador de incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto; • Relacionar os sintomas de incompatibilidade com os níveis encontrados nas combinações de enxerto e porta-enxerto. 2.7. Material e métodos 2.7.1. Material vegetal O tecido vegetal utilizado nas análises será coletado de plantas de pessegueiro de três anos de idade, provenientes do Centro Agropecuário da Palma - FAEM/UFPel. Serão utilizadas plantas com a combinação das cultivares ‘Maciel’ (Prunus persica) e ‘Chimarrita’ (P. persica) com os portaenxertos ‘Capdbodq’ (P. persica), ‘Aldrighi’ (P. persica), ‘Viamão’ (P. persica), ‘Flordaguard’ (P.persica), ‘Nemaguard’ (P. persica), ‘Okinawa’ (P. persica), ‘Tsukuba’ (P. persica), e ‘Umezeiro’ (P. mume). As amostras de tecido serão coletadas 5cm acima e abaixo do ponto de enxertia e no ponto de enxertia, assim como das folhas. Possibilitando verificar as concentrações de glicosídeos cianogênicos e cianeto total na cultivar, porta-enxerto e união entre ambos, além de verificar seus níveis nas folhas e a possível translocação para a região da enxertia. Tornando possível estabelecer uma relação entre essas concentrações com a ocorrência de incompatibilidade nas diferentes combinações. As amostras serão coletadas, postas em nitrogênio líquido, liofilizadas e armazenadas até o momento das análises. 2.7.2. Extração de glicosídeos cianogênicos A extração será realizada no laboratório de Cromatografia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos – FAEM/UFPel. Para a realização das análises serão utilizadas de 0,2-0,4 g de mostra, que serão agitadas em 10 ml de metanol durante 12 h, à temperatura ambiente, em um agitador recíproco, na presença de 0,2 g de poli(vinilpirrolidona), metodologia adaptada de BERENGUER-NAVARRO et al., (2002). As amostras serão 29 centrifugadas a 3000 rpm durante 10 min. Após, a suspensão será decantada e o sobrenadante filtrado, com filtro de nylon 0.45µm. A partir dessa solução, será realizada a injeção diretamente na coluna, conforme o método de Berenguer-Navarro et al., (2002). 2.7.3. Determinação cromatográfica de glicosídeos cianogênicos A análise Cromatográfica também será realizada no laboratório de Cromatografia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos – FAEM/UFPel. Onde serão realizadas em cromatógrafo HPLC (High Performance (pressure) Liquid Chromatography), utilizando os padrões SigmaAldrich. 2.7.4. Delineamento e análise estatística O delineamento estatístico do experimento onde as amostras serão coletadas é em Blocos casualizados com três repetições, onde cada unidade experimental constitui de cinco plantas. Os resultados serão submetidos a análise de variância e pelo teste F e as diferenças entre médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. 2.8. Resultados esperados Espera-se que sejam esclarecidas algumas das causas da incompatibilidade de enxertia do pessegueiro, seja possível acelerar a introdução e disponibilização aos produtores de novas cultivares de portaenxertos, melhor adaptados, resistentes e compatíveis com as cultivares atualmente recomendadas. Possibilitando uma evolução significativa nos índices de produtividade e qualidade, além de tornar o sistema de produção do pessegueiro mais sustentável e com menor custo, tendo em vista os inúmeros benefícios que podem ser introduzidos pelas diversas cultivares de portaenxertos. 30 2.9. Cronograma Tabela 1. Cronograma de atividades a serem executadas durante o ano de 2008. Pelotas, RS, 2012. ATIVIDADE Revisão bibliográfica Manutenção das plantas Elaboração Projeto Aquisição de regentes e materiais Adaptação e desenvolvimento de metodologias Execução de experimentos relacionados Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Tabela 2. Cronograma de atividades a serem executadas durante o ano de 2009. Pelotas, RS, 2012. Atividade Jan Fev Revisão bibliográfica x x Manutenção das plantas x x Adaptação e desenvolvimento de metodologias x x Execução de experimentos relacionados x x Elaboração de trabalhos científicos x x Mar x x x x x Abr x x x x x Mai x x x x x Jun x x x x x Jul x x x x x Ago x x x x x Set x x x x x Out x x x x x Nov Dez x x x x x x x x x x Tabela 3. Cronograma de atividades a serem executadas de janeiro de 2010 a março de 2011. Pelotas, RS, 2012. Atividade Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Revisão bibliográfica x x x x x x x x x x x x x x Manutenção das plantas x x x x x x x x x x x x x x x Aquisição de regentes e materiais Adaptação e desenvolvimento de x x x x x x x x x x x metodologias Execução de experimentos x x x x x x x x x x x relacionados Elaboração de trabalhos científicos x x x x x x x x x x x x x x x Apresentação e divulgação dos x x resultados 2.10. Custos Tabela 4. Custo total do projeto. Pelotas, RS, 2012. Descrição Material de consumo Custo total (R$) 10.744,35 Serviços 6.300,00 Material permanente 9.550,00 Subtotal Material existente na instituição Imprevistos (10%) Total 26.594,35 132.152,00 2.659,44 174.980,66 31 2.11. Referências bibliográficas ANDREWS, P. K.; C. S. MARQUEZ. Graft incompatibility. In: Horticultural Reviews. v. 15 (Ed. J. Janick), p.183-231, 1993. ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA 2008. Brazilian Fruit Yearbook. 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As plantas desse gênero são conhecidas como frutos de caroço, uma vez que suas sementes estão envoltas em um capa lignificada, o endocarpo (SRINIVASAN et al., 2005). No subgênero Prunus se encontram espécies frutíferas de importância, como as ameixeiras européia (P. domestica L. 2n6x48), a ameixeira japonesa (P. salicina Lindl), a ameixeira do tipo mirabolano (P. cerasifera Ehrn), o damasqueiro (P. Armeniaca L.), o damasqueiro japonês (P. mume Sieb & Zucc.) e a cerejeira negra (P. serotina Ehrh.); no subgenero Cerasus, a cerejeira (P. avium L.), a cerejeira nanking (P. tomentosa Thunb) e a cerejeira ácida (P. cerasus L.); no subgenero Amygdalus, o pessegueiro (P. persica L. Batsch), o pessegueiro chinês silvestre (P. davidiana Carrière Franch) e a amendoeira (P. dulcis L.); no subgeneros Padus a cereja pássaro (P. padus L.); e no Laurocerasus o louro cerejeiro (P. laurocerasus L.) (GILANI et al., 2010). O subgenero Prunus se subdivide nas seções Prunus, Prunocerasus e Armeniaca; o subgênero Amygdalus nas seções Euamygdalus e Chamaeamygdalus; o Cerasus, nas seções Microcerasus, Pseudocerasus, Lobopetalum, Eucerasus, Mahaleb, Phyllocerasus e Phyllomahaleb; enquanto Padus e Laurocerasus não possuem seções (RHEDER, 1940). Dentro da espécie Prunus persica existem ainda três variedades botânicas: vulgaris (pêssego comum), nucipersica (nectarina) e platycarpa (pêssego chato). Todas possuem o mesmo número cromossômico, 2n=16, fato que confere as mesmas características de compatibilidade de enxertia (BARBOSA et al. 1990). O nome botânico do pêssego refere-se ao seu país de origem, que segundo Lineu era a Pérsia, atual Irã. Porém, no século XIX descobriu-se que na verdade sua real origem era a China (BASSI & MONET, 2008). 36 3.2. Uso de porta-enxertos na fruticultura O emprego de porta-enxertos iniciou na Europa a partir dos anos 60, mas assumiu importância com o desenvolvimento da fruticultura industrial (LORETI, 2008) e a necessidade de adaptar as cultivares a condições de clima e solo desfavoráveis, além de conferir resistência e/ou tolerância a enfermidades e patógenos de solo (GARNER, 2003). Para espécies como o pessegueiro, a demanda por novos portaenxertos é recente em consequência da difusão desta espécie em zonas marginais ou não indicadas do ponto de vista edafoclimático, caracterizadas por terrenos encharcados, compactados, ácidos, alcalinos, de baixa fertilidade, infestados com nematoides ou ainda pela necessidade de se realizar o replantio (LORETI, 1988; MAYER et al., 2008; XIANG et al., 2010; ZRIG et al., 2011). Geralmente, procura-se adotar como porta-enxerto, aquele que reúna o maior número possível de características desejáveis, tais como: ser de fácil obtenção; ser adaptado às condições de solo e clima locais; ser resistente a doenças e pragas do solo; ter boa compatibilidade com a cultuvar copa; induzir vigor adequado à densidade e homogeneidade do pomar; ter boa ancoragem; induzir precocidade; ser eficiente na produção de frutas de qualidade; propiciar longevidade às plantas; ser eficiente na absorção de água e nutriente e ser resistente a condições de estresse (asfixia, solos alcalinos ou ácidos, seca) (FINARDI, 1998). 3.3. Tipos de porta-enxertos Tradicionalmente os porta-enxertos eram obtidos via propagação sexuada, o que gerava grande variabilidade genética e por consequência de comportamento das plantas no pomar (AGUSTÍ, 2004; WERTHEIM & WEBSTER, 2005). Atualmente, a nível mundial, a maioria dos porta-enxertos são obtidos por propagação vegetativa (clonal), garantindo que as plantas obtidas sejam idênticas à planta mãe e evitando as variações observadas em porta-enxertos obtidos por sementes (FELIPE 1989; WERTHEIM & WEBSTER, 2005). 37 3.3.1. Porta-enxertos de sementes ou francos São obtidos a partir de sementes germinadas de uma cultivar, geralmente de maturação tardia (PEREIRA & MAYER, 2005; WERTHEIM & WEBSTER, 2005). A variabilidade genética encontrada nesse tipo de porta-enxerto induz um comportamento heterogêneo que influi sobre características morfológicas e fisiológicas das plantas (FELIPE 1989; AUGUSTÍ, 2004), causando problemas como desuniformidade de germinação, vigor e compatibilidade, assim como uma resposta diferencial ao ataque de pragas, doenças e de adaptação ao solo, que resultam em variabilidade na produção (FELIPE, 1989; PEREIRA & MAYER, 2005). Em geral, sementes de pessegueiro apresentam taxa de germinação de 60 a 80%. Plantas originárias de sementes desenvolvem-se melhor em terrenos férteis e bem drenados, apresentando um sistema radicular extenso e profundo (LORETI, 2008). Este tipo de porta-enxertos vem sendo menos utilizado na implantação de novos pomares, cedendo espaço aos do tipo clonal (MASSAI et al., 1996). 3.3.2. Porta-enxertos clonais Um porta-enxerto clonal é obtido mediante um procedimento qualquer de propagação vegetativa, do qual são gerados um conjunto de plantas com mesma origem, geneticamente idênticos e de comportamento altamente homogêneo (ZARROUK, 2006). A variabilidade no comportamento de clones é reflexo das variações ambientais e do meio de cultivo (FELIPE, 1989). Dependendo da origem, cada clone possui determinadas características de comportamento, adaptação ao meio, resistência a pragas e doenças e características específicas que induz às cultivares enxertadas (AUGUSTÍ, 2004). 3.4. Influência do porta-enxerto sobre a cultivar Inúmeros trabalhos demonstram a influência dos porta-enxertos sobre o vigor da cultivar (USENIK et al., 2005; PICOLOTTO et al., 2009; JIMÉNEZ, et al., 2011b; GJAMOVSKI & KIPRIJANOVSKIB, 2011). Este efeito sobre o crescimento, embora não esteja completamente esclarecido, pode estar 38 relacionado com a restrição do fluxo de água, elementos minerais ou hormonais do porta-enxerto para a cultivar (ATKINSON et al., 2003). Restrições que, segundo Tombesi et al. (2011), podem estar relacionadas com características do xilema, como por exemplo, a dimensão do mesmo. O porta-enxerto também exerce significativa influência sobre a necessidade de horas de frio e a tolerância ao frio da cultivar, que pode resultar em mudança na data de floração (ROSSI et al., 2004; HERNÁNDEZ et al., 2010). Mitani et al., (2008), observaram antecipação da data de floração e sugerem que tal efeito pode estar associado ao controle do vigor exercido pelo porta-enxerto. Algumas pesquisas ainda apontam um aumento significativo do número de gemas florais pela utilização de determinados porta-enxertos (CHUN et al., 2002), oque pode estar relacionado com o aumento da produtividade observada por vários autores quando da utilização de diferentes porta-enxertos (TSIPOURIDIS & THOMIDIS, 2005; ZARROUK et al., 2006; BASSAL, 2009; PICOLOTTO et al., 2009; HERNÁNDEZ et al., 2010; GJAMOVSKI & KIPRIJANOVSKI, 2011; HUSSAIN et al., 2011). A qualidade dos frutos é outro aspecto influenciado fortemente pelos porta-enxertos. Diversos autores tem reportado seu efeito sobre o tamanho, a coloração, a firmeza, o teor de açúcar, a acidez, o conteúdo de ácido ascórbico, a composição química, resistência a danos pós-colheita, entre outras características qualitativas (TSIPOURIDIS & THOMIDIS, 2005; BASSAL, 2009; CANTÍN et al., 2010; HERNÁNDEZ et al., 2010; ORAZEM et al., 2011). Em geral, as cultivares são susceptíveis a maioria das formas de estresses, no entanto, os porta-enxertos podem conferir resistência ou tolerância a estresses abióticos, tais como: seca (RIEGER, 2001; RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010), asfixia de raiz (GÓMEZ-APARISI et al., 2003), salinidade (HUANG et al., 2009; CHELLI-CHAABOUNI et al., 2010; ZRIG et al., 2011); clorose férrica (JIMÉNES et al., 2011b) e deficiência de ferro (GONZALO et al., 2011). Também a estresses bióticos, como: infestação por nematóides (PINOCHET et al., 1995; FACHINELLO et al., 2000; MAYER et al., 2003; XIANG et al., 2010), vírus (RUBIO, et al., 2005), bactérias e fungos (SOCIAS I COMPANY et al., 1995; JIMÉNEZ et al., 2011). 39 3.5. Enxertia É uma forma de propagação assexuada de tecidos vegetais superiores, na qual se colocam em contato duas porções de tecido vegetal de tal maneira que se unam e posteriormente se desenvolvam, originando uma nova planta (FACHINELLO et el., 2005). São necessárias três etapas principais para a formação de um enxerto (HARTMANN et al., 2002): A – Proliferação de calo e estabelecimento de contato entre as regiões cambiais da cultivar e do porta-enxerto (Figura 2A). Nesta etapa, o cambio da cultivar e do porta-enxerto produzem células parenquimáticas que se entremeiam formando um tecido caloso que preenche os espaços vazios entre cultivar e porta-enxerto. Alguns autores consideram que esse evento pode ocorrer tanto em combinações compatíveis quanto incompatíveis. B – Diferenciação de células parenquimáticas de calo em novas células cambiais que conectam os câmbios da cultivar e do porta-enxerto (Figura 2B). As células começam a se diferenciar a partir do cambio original da cultivar e do porta-enxerto, evoluindo pela ponte de calo até se encontrarem. C – Produção do novo floema e xilema (Figura 2C). O novo cambio, já com atividade meristemática, se diferencia em novo xilema e floema, formando um sistema vascular contínuo e funcional entre cultivar e porta-enxerto. Esta etapa é apontada como fundamental para o sucesso da enxertia. 40 Cultivar Parênquima medular Xilema secundário Câmbio vascular Floema secundário Porta-enxerto Parênquima cortical Periderme (A) (B) (C) Figura 2. Figura esquemática das três etapas de formação do enxerto. (A) proliferação de calo a partir da cultivar e do porta-enxerto; (B) formação de um novo cambio; e (C) Produção de novo floema e xilema. Adaptado de Hartmann et al. (2002). Pelotas, RS, 2012. 3.6. Incompatibilidade de enxertia Geralmente os dois indivíduos que compõem um enxerto (cultivar e porta-enxerto) pertencem à mesma espécie botânica ou a espécies muito próximas dentro de um gênero (ERREA, 1991; ZARROUK, 2006). No entanto, atualmente é cada vez mais frequente o uso de porta-enxertos pertencentes a espécies distintas da cultivar, com o objetivo de obter-se uma série de vantagens, como: ser de fácil obtenção; ser adaptado às condições de solo e clima locais; ser resistente a doenças e pragas do solo; induzir vigor adequado à densidade e homogeneidade do pomar; ter boa ancoragem; induzir precocidade; ser eficiente na produção de frutas de qualidade; propiciar longevidade às plantas; ser eficiente na absorção de água e nutrientes; e ser compatível com as cultivares recomendadas (ERREA, 1991; FINARDI, 1998). Porém, a combinação de indivíduos geneticamente diferentes pode resultar em problemas de afinidade entre os componentes do enxerto (HARTMANN et al., 2002; PIROVANI et al., 2002). Entre as frutíferas do gênero Prunus, a utilização de diferentes espécies como porta-enxertos, associado ao grande dinamismo e a rápida renovação varietal destas espécies, obriga que a compatibilidade entre porta- 41 enxerto e cultivar seja determinada o mais precocemente possível (REIGHHARD, 2002; ZARROUK, 2006). Uma vez que, a falta de afinidade entre porta-enxertos e cultivares atrasa a disponibilização de novos portaenxertos, pois prolonga o processo de seleção e/ou introdução (HOSSEIN, et al., 2008; PINA & ERREA, 2009). Mosse (1958) define incompatibilidade de enxertia como a ausência de desenvolvimento normal dos tecidos no ponto de enxertia, resultando em feixes vasculares não completamente lignificados, que provocam uma interrupção da continuidade vascular e cambial com consequentes problemas físicos na união. Os sintomas de incompatibilidade em espécies lenhosas incluem espessamento da casca; queda prematura de folhas (COPES, 1980); atraso na brotação; quebra no ponto de união do enxerto; diferenças de vigor entre portaenxerto e cultivar; desenvolvimento excessivo abaixo, acima ou no ponto de união (FACHINELLO et al., 2005); redução do crescimento vegetativo e morte prematura das plantas (HARTMANN et al., 2002). Em alguns casos os sintomas não aparecem externamente, havendo prejuízos cumulativos ao longo dos anos (ERREA & BORRUEY, 2004). 3.7. Tipos de incompatibilidade de enxertia A incompatibilidade entre cultivar e porta-enxerto tem sido classificada em distintos tipos. A primeira classificação foi proposta por Argles (1937), que classificou os tipos de incompatibilidade de enxertia de acordo com a expressão dos sintomas. Porém, essa classificação é considerada inadequada, uma vez que não diferencia a falta de afinidade provocada por infecções virais ou enxertia realizada de maneira equivocada (ANDREWS & MÁRQUEZ, 1993). Posteriormente, as classificações tomaram por base as prováveis causas da incompatibilidade e não apenas os sintomas. Scaramuzzi (1955) dividiu a incompatibilidade em três grupos baseados na resposta a um terceiro componente, um filtro. No primeiro grupo, a incompatibilidade entre os dois componentes é superada pela utilização de um filtro compatível com ambos; no segundo grupo, o filtro não é capaz de prevenir a incompatibilidade; e no terceiro, o filtro induz a incompatibilidade entre componentes compatíveis. 42 Herrero (1956) sugeriu uma classificação da incompatibilidade em quatro classes: falha no pegamento do enxerto ou incompatibilidade total; falha do enxerto devido à infecção por vírus em um dos componentes da combinação; obstrução mecânica do enxerto e estrutura anormal da união geralmente associada ao acúmulo desproporcional de amido. Porém, entre as classificações já propostas, a de Mosse (1962) é a mais utilizada. Essa classificação divide a incompatibilidade de enxertia em plantas frutíferas em dois tipos: incompatibilidade ‘translocada’ e ‘localizada’. 3.7.1. Incompatibilidade ‘translocada’ Esse tipo de incompatibilidade se caracteriza por apresentar sintomas visíveis durante o desenvolvimento das plantas. A incompatibilidade ‘translocada’ pode estar associada aos seguintes sintomas (HERRERO, 1968; MOING et al, 1987; ERREA, 1991; MORENO et al., 1993): • Parada precoce do crescimento; • Coloração anormal das folhas: progredindo de amarelada para avermelhada ou alaranjada; • Redução do crescimento radicular; • Degeneração dos tubos crivados e células companheiras na região de união do enxerto; • Acúmulo de açúcares e amido na cultivar e decréscimo no porta-enxerto, que acontece devido a uma redução da translocação na união do enxerto; • Alteração da continuidade vascular na união produzido espessamento da casca nessa região; • Persistência dos sintomas quando da utilização de filtro. Em geral, os sintomas externos se manifestam em virtude da dificuldade na translocação de substâncias, que com frequência ficam acumuladas na cultivar durante o verão (USENIK & STAMPAR, 2000; SYLAYEVA et al., 2004). Os sintomas externos podem começar a se manifestar na primeira metade da estação seguinte à enxertia (SALESSES & ALKAI, 1984). Esse tipo de incompatibilidade não fica restrita à zona de união, 43 se transloca inclusive através do filtro, quando este está presente (BREEN, 1974). Atualmente a avaliação dos valores SPAD (Soil Plant Analysis Diagnostic) e a análise da concentração de clorofila em folhas permitem identificar casos de incompatibilidade severa entre cultivares de pessegueiro com distintos porta-enxertos de Prunus (ZARROUK, 2006). Um exemplo clássico deste tipo de incompatibilidade ocorre entre combinações de pessegueiro com Mirabolano ou Mariana (MORENO et al., 1993). Assim como, entre cultivares de pessegueiro ou necterineira enxertadas sobre porta-enxertos de ameixeira. No entanto, embora os sintomas e muitas mudanças bioquímicas sejam conhecidas, a causa desse tipo de incompatibilidade não está clara. 3.7.2. Incompatibilidade ‘localizada’ A incompatibilidade do tipo ‘localizada’ geralmente é associada a uma má formação estrutural do ponto de união entre cultivar e porta-enxerto, que pode resultar em ruptura do enxerto (ERREA & FELIPE, 1992; SIMARD & OLIVIER, 1999). A ocorrência dessa ruptura, em geral, esta associada à descontinuidade das conexões vasculares (floema e xilema), presença de tecidos parenquimatosos interrompendo essas conexões e descontinuidade da casca no ponto de união (ERREA & FELIPE, 1994; ERMEL et al., 1999; HARTMANN, et al., 2002). A incompatibilidade ‘localizada’ pode ocorrer ainda, pela necrose do tecido cambial que provoca descontinuidade vascular e/ou ausência de diferenciação do tecido vascular na linha de união (HERRERO, 1962; MUSACCHI et al., 2004). Esse tipo de incompatibilidade é um problema grave na propagação de plantas, principalmente porque a planta pode tardar vários anos para apresentar sintomas externos, causando perda de tempo, material vegetal e recursos financeiros (PINA, 2005). Diferentes estudos têm mostrado a implicação dos compostos fenólicos na diferenciação celular e na falta de lignificação em uniões incompatíveis (ERREA et al., 1994; ERREA, 1998; USENIK & STAMPAR, 2001). O acumulo de fenóis, seguido de sua oxidação, tem sido relacionado com a linha necrótica que aparece no xilema das combinações incompatíveis (FEUCHT et al., 1992; 44 ERREA, 1998). Neste mesmo contexto, a enzima peroxidase, relacionada ao processo de lignificação, tem sido observada em maiores quantidades nas combinações incompatíveis (SANTAMOUR, 1992; RODRIGUES et al., 2002). Outros compostos associados a problemas de compatibilidade desse tipo são os glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina. O acúmulo de cianeto liberado pela hidrólise dos glicosídeos na união do enxerto pode causar necrose das células cambiais e a descontinuidade vascular por alterações no xilema e floema (GUR et al., 1968; GUR & BLUM, 1973), oque foi confirmado quando o damasqueiro foi enxertado sobre pessegueiro (POESSEL & RUCART, 1988). Em estágios avançados pode-se observar o esgotamento do sistema radicular (ERREA, 1994). Isso ocorre devido à translocação deficiente no ponto de união, causada pela degeneração do floema (ZARROUK, 2006). A incompatibilidade ‘localizada’ pode estar associada aos seguintes sintomas (HERRERO, 1968; ERREA, 1991): • Continuidade cambial e vascular danificada, que pode estar associada à presença de tecido parenquimático não lignificado; • Quando da colocação de um filtro compatível com a cultivar e o porta-enxerto a incompatibilidade é inibida; • Apresenta sintomas proporcionais ao externos grau de e desenvolvimento descontinuidade na lento, união e esgotamento do sistema radicular. Mosse & Herreo (1951) propõe cinco graus de compatibilidade, baseados na análise da estrutura interna das uniões, sendo eles: A, B, C, D e E. As classes A, B e C são consideradas compatíveis, pois não apresentam capa de parênquima no tecido lenhoso que possa prejudicar a resistência mecânica. Já as classes D e E são incompatíveis, pois podem romper-se devido a danos mecânicos ou pela ação do vento (HERRERO, 1962). 45 3.7.3. Outros tipos de incompatibilidade 3.7.3.1. Incompatibilidade total A incompatibilidade total se caracteriza pelo completo desprendimento do enxerto ou pelo estado de roseta que acaba com a morte da planta (MOSSE, 1962, MORENO, 1990). 3.7.3.2. Incompatibilidade por vírus Esse tipo de incompatibilidade se manifesta pela infecção por vírus em um dos componentes do enxerto (MARÉNAUD, 1968). Um exemplo é o vírus chlorotic leaf spot (CLSV) (BERNHAD, 1990), que pode estar presente em um dos componentes do enxerto e que ao ser enxertado transmite a doença para o outro. 3.8. Mecanismos potencialmente envolvidos na incompatibilidade de enxertia Os eventos envolvidos na enxertia são conhecidos. No entanto, o mecanismo pelo qual a incompatibilidade se expressa não está claro e várias hipóteses tem sido estudadas na tentativa de explicar este fenômeno (PINA & ERREA, 2005). O grande número de combinações interespecíficas implicam em uma série de interações estruturais, bioquímicas e fisiológicas entre esses indivíduos, gerando um leque bastante amplo de causas prováveis para a ocorrência do fenômeno de incompatibilidade de enxertia. 3.8.1. Plasmodesmas: reconhecimento celular O estudo da incompatibilidade vista deste aspecto trata de causas que remetem à importância das plasmodesmas na comunicação celular. As plasmodesmas são extensões tubulares da membrana plasmática que atravessam a parede celular e conectam o citoplasma de células adjacentes formando o simplasto (TAIZ & ZAIGER, 2004). Desta forma, desempenham um importante papel no mecanismo de comunicação celular e no processo de enxertia (SCHULZ, 1999; PINA & ERREA, 2005). Jefree & Yeoman (1983) sugerem que o contato entre as células da cultivar e do porta-enxerto é estabelecido pelas plasmodesmas, resultando em 46 uma conexão simplástica e permitindo a interação metabólica mútua entre ambos (STRASBURGER, 1901; PINA & ERREA, 2005). A pesquisa de Kollmann et al. (1995), sobre o mecanismo de formação das plasmodesmas mostrou o desenvolvimento de plasmodesmas interespecíficas entre cultivar e porta-enxerto, sugerindo que o reconhecimento celular e a coordenação funcional podem estar envolvidos na formação do enxerto. Dessa forma, a ocorrência de plasmodesmas não funcionais tem sido associada à ocorrência de incompatibilidade de enxertia (PINA & ERREA, 2005). Tais problemas de funcionalidade das plasmodesmas podem estar associados a uma possível especificidade das mesmas. 3.8.2. Hormônios Tem sido relatado que a relação entre cultivar e porta-enxerto é afetada pelos hormônios de crescimento e que a incompatibilidade de enxertia também pode ter a mesma causa (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). A auxina tem sido associada a estágios importantes do processo de enxertia, como a proliferação e diferenciação do calo (SACHS, 1981), sugerindo que o acúmulo de auxina na base da cultivar esta altamente relacionada com o sucesso da enxertia. Aloni et al. (2008) propuseram que a principal causa da incompatibilidade pode ser a ocorrência de desequilíbrio hormonal no sistema radicular, principalmente com relação à auxina e etileno. Segundo essa teoria, após a enxertia, quando as conexões vasculares estão estabelecidas, a auxina produzida na cultivar, é translocada para o sistema radicular, onde ao atingir um limiar de grande concentração, desencadeia processos de degradação e deterioração das raízes. Relatos sugerem ainda, que a inibição do crescimento da raiz por concentrações elevadas de auxina pode ser causada pela produção excessiva de etileno (MULKEY et al, 1982; RAHMAN et al, 2001), que estimula a biossíntese de auxina em diferentes órgãos da planta e aumenta a capacidade de transporte de auxina (RUZICKA et al., 2007; ALONI et al., 2010). 47 3.8.3. Compostos fenólicos Os compostos fenólicos são um grupo de produtos secundários presente nas plantas com uma grande diversidade de funções (RHODES et al., 1986; TAIZ & ZEIGER, 2004). Estes compostos desempenham papel importante, pois participam da estrutura das plantas e estão envolvidos em um grande número de rotas metabólicas, bem como na resposta das plantas ao ambiente e na interação com patógenos (HASLAM, 1979; HARBORNE, 1980). Inúmeros autores têm relacionado à incompatibilidade de enxertia com diferenças quantitativas e qualitativas no conteúdo de fenóis, além de mudanças na atividade das enzimas que regulam a síntese destes compostos (TREUTTER & FEUCHT, 1991; ERREA, 1998; RODRIGUES et al., 2001; RODRIGUES et al., 2002; USENIK et al., 2006; HOSSEIN et al., 2008; PINA & ERREA, 2008). Segundo Errea (1998), os compostos fenólicos estão implicados em todos os eventos envolvidos no processo de enxertia. O autor demonstra que uma situação de estresse contínuo, causado pela falta de adaptação das duas partes que formam o enxerto, pode desencadear uma série de eventos, resultando em anormalidades no desenvolvimento do mesmo. Mudanças que afetam a difusão e a circulação de fenóis podem estar implicadas em dano celular e alteração do sistema cambial na união do enxerto. Além disso, uma forte acumulação de fenóis pode levar a sua oxidação com ação tóxica sobre uma série de reações metabólicas, inclusive a síntese de lignina (BUCHLOH, 1960). Têm sido demonstrado o envolvimento da fenilalanina amônia-liase (PAL) a da UDP-glicose pirofosforilase (UGPase) na incompatibilidade entre damasco e ameixeira em estágios precoces do desenvolvimento do enxerto (PINA & ERREA, 2008; PINA & ERREA, 2005). Estes resultados indicam que não ocorrem apenas alterações anatômicas durante a formação do enxerto, mas mudanças moleculares também podem estar envolvidas no comportamento diferencial de combinações compatíveis e incompatíveis. Compostos fenólicos como ligninas, flavonóides e antocianinas são produzidos na rota fenilpropanóide (DIXON & PAIVA, 1995), rota que têm sido relacionada com a resposta a muitos tipos de estresse, como no envolvimento em estágios precoces do desenvolvimento do enxerto, consistindo em 48 importante fonte de pesquisa sobre o fenômeno de incompatibilidade de enxertia. Por outro lado, há a possibilidade das alterações constatadas no perfil fenólico de combinações incompatíveis serem uma resposta ao fenômeno de incompatibilidade causado por outro fator, ainda desconhecido, e não a causa da incompatibilidade. Desta forma, torna-se importante que em estudos de incompatibilidade de enxertia sejam estudados vários possíveis mecanismos ao mesmo tempo. 3.8.4. Glicosídeos cianogênicos (GCs) Os glicosídeos cianogênicos (GCs) foram confirmados como causadores da incompatibilidade entre algumas cultivares de pereira e marmeleiro (GUR et al., 1968; MOORE, 1986) e pessegueiro e amendoeira (GUR & BLUM, 1973). No primeiro caso, o glicosídeo cianogênico prunasina, que ocorre no marmeleiro e não na pereira, ascende do porta-enxerto para a cultivar, onde é hidrolisado pela β-glicosidase, ocorrendo a liberação de cianeto na interface do enxerto (GUR et al. 1968). Pelo fato dos GCs e da β-glicosidase encontrarem-se compartimentados, o processo de cianogênese inicia apenas quando ocorre o rompimento destes compartimentos, possivelmente nesse caso seja desencadeado pela enxertia. Uma vez em contato com a amigdalina, a enzima o hidrolisa, gerando uma molécula de glicose e outra de prunasina. Posteriormente, a prunasina é hidrolisada pela mesma enzima produzindo outra molécula de glicose e uma α-hidroxilitrila, que finalmente sofre ação de uma hidroxilitrila-liase, resultando na liberação do cianeto (CONN, 1980; ZAGROBELNY et al., 2004). Na combinação entre pessegueiro e amendoeira, a prunasina está presente tanto na cultivar quanto no porta-enxerto. Mas, em muito menor quantidade na amendoeira. Nesse caso ocorre a translocação de prunasina da cultivar (pessegueiro) para o porta-enxerto (amendoeira), onde é hidrolisado e libera cianeto. Moraes et al. (2001), sugerem que em seringueira, a incompatibilidade observada entre as cultivares enxertadas sobre o portaenxerto PA1 é provocada pela translocação de GCs da copa para o portaenxerto, que não possui em seu metabolismo a capacidade de remoção do cianeto. 49 Em geral, as espécies cianogênicas apresentam também a capacidade de metabolizar o cianeto, evitando danos celulares. O processo de desintoxicação do cianeto é composto por duas rotas principais (MOLLER & POULTON,1993). A primeira rota envolve a formação de β-cianoalanina a partir do cianeto e da cisteína, reação catalisada pela β-cianoalanina sintase. A βcianoalanina é posteriormente convertida em asparagina (MILLER & CONN, 1980). A segunda rota converte o cianeto em tiocianato e é catalisada pela rodanase (BORDO & BORK, 2002). A rota mais comum em plantas é a da βcianoalanina (ZAGROBELNY et al., 2004). Desta forma, tanto a manifestação quanto o grau da incompatibilidade podem depender também da capacidade de desintoxicação por parte das plantas. O cianeto liberado na união do enxerto causa prejuízo a atividade cambial e necrose das células na interface do enxerto, afetando o sistema vascular e dificultando a translocação (GUR et al. 1968; MOORE, 1986; ANDREWS & SERRANO, 1993). Segundo alguns autores, os níveis de GCs nos porta-enxertos e nas cultivares podem servir como indicadores de compatibilidade (GUR & BLUM, 1973; MORAES et al., 2001). 3.9. Métodos de diagnóstico da incompatibilidade de enxertia A detecção precoce da incompatibilidade de enxertia pode reduzir o período necessário para a obtenção ou adaptação de novos porta-enxertos. Atualmente, os métodos mais confiáveis para a detecção da incompatibilidade são os tradicionais. Na incompatibilidade ‘translocada’, observa-se os sintomas folhares, enquanto na ‘localizada’ são analisadas as anomalias anatômicas da união do enxerto (ZARROUK, 2006). Porém, esses métodos apresentam algumas desvantagens porque são necessários vários anos de avaliações e muitas vezes os sintomas podem não se correlacionar com a incompatibilidade (ANDREWS & MARQUEZ, 1993). Por essas razões, a tendência é que se busquem métodos de detecção rápidos e precoces, relacionados a aspectos fisiológicos, bioquímicos e moleculares. 50 3.9.1. Isoenzimas e proteínas totais Para alguns autores, a análise de isoenzimas entre porta-enxerto e cultivar pode ser empregada para predizer a incompatibilidade de enxertia (SANTAMOUR et al., 1986; ZARROUK et al., 2010). Gulen et al. (2002) sugerem que as isoperoxidases A e B podem ser usadas como marcadores de compatibilidade entre pêra e marmelo. Hossein et al. (2008), em estudo de compatibilidade entre cultivares de pêra e um porta-enxerto de marmelo, concluíram que a presença da banda A na união do enxerto foi um indicador de compatibilidade enquanto a ausência foi relacionada com incompatibilidade entre algumas combinações. A ausência da banda B também foi relacionada com a incompatibilidade entre combinações. Gökbayrak et al. (2007) avaliaram a possibilidade de utilizar isoenzimas (peroxidases, fosfatase ácida e esterase) e proteínas totais no diagnóstico precoce da incompatibilidade entre uvas americanas. Seus resultados indicaram que a fosfatase ácida e as proteínas totais podem ser usadas para determinar a incompatibilidade em uvas. A utilização de proteínas totais separadas por eletroforese também foi um método viável segundo Gullen et al. (2005), onde em combinações incompatíveis ocorre a formação de uma banda extra em relação as compatíveis. 3.9.2. Estudo histológico da união do enxerto A tentativa de diagnosticar a incompatibilidade através da observação da união do enxerto começou com Mosse (1962), no entanto, até hoje é um método bastante empregado por vários autores na busca de uma detecção precoce (SALVATIERRA et al., 1998; DOLGUM et al., 2008; PINA & ERREA, 2009). Na incompatibilidade ‘localizada’, a interface do enxerto apresenta descontinuidade vascular associada à presença de células necróticas no lenho e na casca, além de células não-lignificadas no lenho e invaginações ou quebra do câmbio, como verificado entre combinações de pêssego e damasco (Lapins 1959) e de damasco e ameixa (ERREA et al. 1994). Herrero (1951) concluiu que os sintomas típicos da incompatibilidade do enxerto ‘localizada’ não são observados antes do final do primeiro ano de crescimento. Mas, Pina & Errea (2009), observaram por meio de análise histológica, diferenças entre combinações compatíveis e incompatíveis, de duas a quatro semanas após a enxertia. Flaishman et al. (2008), em estudo histológico da compatibilidade 51 entre homoenxertos e heteroenxertos de Arabidopsis revelaram quatro estágios de desenvolvimento na formação do enxerto: (1) desenvolvimento de uma camada necrótica, (2) proliferação de calo na cultivar enxertada, (3) diferenciação de novos tecidos vasculares no enxerto, e (4) formação de uma união vascular plena entre cultivar e porta-enxerto. Ermel et al. (1999), relatam que a análise multivariada de dados histológicos pode ser usada para estudar a expressão estrutural da incompatibilidade de enxertia ‘localizada’. Essa técnica leva em conta a alta variabilidade na estrutura da interface do enxerto, que pode permitir a detecção dos primeiros eventos estruturais, decorrentes da resposta de incompatibilidade. A análise multivariada dos dados histológicos pode servir como uma ferramenta para o diagnóstico precoce da incompatibilidade em programas de melhoramento de porta-enxertos. Além de facilitar o estudo dos estágios iniciais de desenvolvimento do enxerto (ERMEL et al. 1997), e, assim, contribuir para a compreensão dos processos de determinação celular, diferenciação e comunicação celular. 3.9.3. Estudo macroscópico da união do enxerto A observação de uma possível descontinuidade da união do enxerto é em geral empregada para determinar a existência de incompatibilidade ‘localizada’. Normalmente é realizada a partir do primeiro ano após a enxertia (ZARROUK, 2006). Segundo Mosse & Herrero (1951), a incompatibilidade ‘localizada’ pode ser classificada de acordo com o grau em A, B, C, D e E, conforme reportado anteriormente. Esse método é amplamente utilizado por outros pesquisadores como principal forma de comprovação da incompatibilidade de enxertia (MORENO et al., 1993; ZARROUK et al., 2006) 3.9.4. Estimativa da concentração de clorofila Para a determinação do nível de incompatibilidade ‘translocada’ a campo, tem sido proposto um método baseado na estimativa do teor de clorofila nas folhas de cada combinação. Isso porque entre os sintomas deste tipo de incompatibilidade estão folhas amareladas e avermelhadas, desfolha, vigor reduzido e morte (MORENO et al., 1993). Desta forma, a concentração de clorofila pode ser estimada com a utilização de um aparelho SPAD que gera um valor correspondente ao grau de incompatibilidade ‘translocada’ 52 (ZARROUK, 2006). Diversos autores têm associado baixos valores SPAD com combinações incompatíveis de Prunus (MORENO et al., 1993; ZARROUK, 2006). 3.9.5. Enxertia in vitro O cultivo in vitro, com uniões de calo e microenxertos vem sendo uma técnica cada vez mais difundida. Vários autores vêm utilizando essa técnica para acelerar o diagnóstico da incompatibilidade de enxertia. Errea et al. (2001) detectaram anomalias celulares associadas a combinações de calos incompatíveis de Prunus a partir da terceira semana, sugerindo a utilização de uniões de calo in vitro como um método precoce de detecção da incompatibilidade. Segundo Nito et al. (2005), quanto maior a diferença taxonômica entre os dois componentes do enxerto, maior será a eficiência do método in vitro. Pina & Errea (2005) observaram diferenças na estrutura celular e na presença de pectinas nos espaços intercelulares. Já Nocito et al. (2010) e Pina & Errea (2009), constataram através de uniões in vitro, diferenças fisiológicas e histológicas correlacionadas com o grau de compatibilidade das uniões. Os métodos de diagnóstico da incompatibilidade baseados em uniões in vitro apresentam uma série de vantagens, principalmente o ganho de tempo, porém para a sua indicação é importante o estudo da sua correlação com uniões in vivo. Vários estudos in vivo não confirmam as conclusões obtidas in vitro (ERMEL et al., 1997). 3.9.6. Diferenças bioquímicas Diferenças na distribuição de carboidratos são sugeridas como indicativo de incompatibilidade. Alguns estudos relacionam a incompatibilidade ‘translocada’ com a distribuição de carboidratos acima e abaixo da união (MOING et al., 1987; KUBOTA et al., 1990; SALVATIERRA et al., 1999; YANO et al., 2002; OLMSTEAD et al., 2010). Em combinações incompatíveis de Prunus, é observado um acúmulo de amido e açúcares (glicose, sacarose, sorbitol e frutose) na cultivar e baixas concentrações no porta-enxerto (MOING et al., 1987; YANO et al., 2002; OLMSTEAD et al., 2010). Esta diferença é atribuída à dificuldade de translocação através da região de união do enxerto, 53 causada pelos danos ao floema, que em combinações incompatíveis é funcional em algumas áreas e em outras não (BREEN, 1975; SALVATIERRA et al., 1999; OLMSTEAD et al., 2010). Diferenças na atividade enzimática de enzimas relacionadas à produção de compostos fenólicos também são apontadas como forma de avaliar a compatibilidade de enxertia. As peroxidases são as mais estudadas (RODRIGUES et al., 2002; TELES et al., 2009; ZARROUK et al., 2010). A quantificação da atividade da enzima peroxidase e do conteúdo de fenóis totais nos tecidos vegetais pode ser um indicativo precoce da compatibilidade da enxertia no gênero Prunus (TELES et al., 2009; ZARROUK et al., 2010). Segundo Santamour (1992), para se obter plantas sem problemas de compatibilidade e com um sistema vascular funcional na união do enxerto, é necessário que as atividades da enzima peroxidase sejam similares, tanto no enxerto como no porta-enxerto, para que ocorra a mesma reestruturação das células e produção de ligninas correlatas. Pina & Errea (2008), verificaram maior expressão gênica da PAL, enzima que coordena a rota fenilpropanóide, em combinações incompatíveis de Prunus. Expressão que se correlacionou com a maior concentração de fenóis na união destas combinações. A rota fenilpropanóide é responsável pela biossíntese da maior parte dos compostos fenólicos nas plantas. Os compostos fenólicos regulam a síntese de AIA oxidase, mais precisamente o ácido pcumárico, precursor da lignina (TAIZ & ZEIGER, 2004). Outros compostos utilizados na detecção da incompatibilidade de enxertia são os glicosídeos cianogênicos. A diferença de concentração entre os glicosídeos cianogênicos é conhecida como causa da incompatibilidade entre pêreira e marmeleiro, pessegueiro e amendoeira (GUR & BLUM 1968; GUR, 1973; NOCITO et al., 2010). Moraes et al. (2001) sugerem que em seringueira os glicosídeos cianogênicos também estão associados a incompatibilidade de enxertia. Os glicosídeos responsáveis pela liberação de cianeto são amigdalina, prunasina, linamarina (seringueira) e lotaustralina (seringueira) (GUR 1957; MORAES et al., 2001). A determinação de tais compostos em cultivares e porta-enxertos pode servir de parâmetro para a enxertia, que pode ser realizada apenas entre cultivar e porta-enxerto com concentrações similares. 54 4. Relatório do trabalho de campo O projeto elaborado teve como base o experimento implantado no ano de 2008, no Centro Agropecuário da Palma, da Universidade Federal de Pelotas. Onde foram transplantadas combinações das cultivares ‘Maciel’ e ‘Chimarrita’ com os porta-enxertos ‘Capdeboscq’ (Prunus persica), ‘Tsukuba 1’ (Prunus persica), e ‘Umezeiro’ (Prunus mume). O pomar experimental foi implantado em delineamento estatístico, sendo composto por quatro blocos nos quais foram alocadas as parcelas de cada combinação constituídas de cinco plantas. A partir do experimento de campo, foram desenvolvidas atividades voltadas ao estudo da compatibilidade entre as combinações. Inicialmente o trabalho tinha o objetivo de estudar a incompatibilidade de enxertia apenas através do mecanismo de cianogênese, avaliando os glicosídeos cianogênicos (GCs). Porém, com a possibilidade de parceria com o grupo de pesquisa em fruticultura de clima temperado do Centro de Investigación y Tecnologia Agroalimentaria de Aragón, em Zaragoza, na Espanha, se agregou outro possível mecanismo incompatibilidade, relacionado com as diferenças no perfil fenólico entre cultivares e porta-enxertos incompatíveis. Para diagnosticar a incompatibilidade de enxertia e relacionar os resultados bioquímicos ao fenômeno, foram realizadas avaliações de crescimento dos enxertos durante os quatro anos do projeto. 4.1. Avaliações fenotípicas Paralelo as análises bioquímicas foram conduzidas avaliações fenotípicas do crescimento das plantas, que foram realizadas durante os ciclos de crescimento. As variáveis avaliadas foram: - Massa fresca de poda: obtida pela pesagem do total de material retirado na poda de cada parcela nas safras 2008/09, 2009/10 e 2010/11. - Área foliar: estimada pelo produto do número total de folhas de cada planta pela área foliar média de 50 folhas, utilizando-se um medidor de área foliar modelo Área Meter 3100 (safra 2009/10). 55 - Diâmetro do tronco: medido na cultivar (5cm acima da união), no ponto de união e no porta-enxerto (5cm abaixo da união), durante as safras 2008/09, 2009/10 e 2010/11. - Constante de compatibilidade a campo (CC): foi calculado segundo Perraudine (1962), pela seguinte equação: CC= [(C/A)+(C+A)/2B]+10; onde: A= diâmetro do tronco 5cm acima do ponto de enxertia (cultivar); B= diâmetro do tronco no ponto de enxertia; C= diâmetro do tronco 5cm abaixo do ponto de enxertia (porta-enxerto), sendo que quanto mais próximo de 12 for o resultado, maior será a afinidade entre porta-enxerto e cultivar. - Índice de sobrevivência: corresponde ao total de plantas que sobreviveram após 36 meses da implantação do pomar experimental. - Avaliação da incompatibilidade ‘translocada’: realizada através da concentração da clorofila, estimada pelo índice SPAD. Já a incompatibilidade ‘localizada’, foi avaliada pela análise anatômica interna e externa da região de união dos enxertos, conforme sugerido por Mosse & Herreo (1951). A incompatibilidade ‘translocada’ foi analisada pela concentração de clorofila por área de folha, estimativa a campo, usando um SPAD-502 meter (Minolta). Foram realizadas duas medidas (lado superior e inferior) em 10 folhas de cada planta, sendo avaliadas três plantas de cada parcela, totalizando 30 folhas por parcela. As medidas foram realizadas no verão de 2011, aproximadamente 150 dias após a plena floração. Quanto maior o grau de incompatibilidade ‘translocada’ menor será o índice SPAD (MORENO et al., 1993). O grau de compatibilidade ‘localizada’ das combinações estudadas foi avaliado na região da união do enxerto, três anos e meio após a enxertia, através das classes (A, B, C, D e E) propostas por Mosse & Herreo (1951). As classes correspondem aos seguintes níveis de compatibilidade: • A: união perfeita, a linha da união na casca e no lenho não é visível; • B: boa união, a linha de união na casca e no lenho são continuas, embora no lenho seja muitas vezes visível devido a excessiva formação de raias; • C: união com descontinuidade na casca, os tecidos da casca do porta-enxerto e da cultivar são separados por uma camada marrom escura com aparência de cortiça; 56 • D: uniões com descontinuidade do lenho, os tecidos do lenho do porta-enxerto e da cultivar foram separados em muitos pontos, por outro lado os tecidos da casca seguem como na classe C; • E: quando ocorre a quebra da união no pomar ou viveiro. As classes A, B e C, são consideradas compatíveis, pois não apresentam prejuízo a resistência mecânica. Entretanto, as classes D e E são incompatíveis, pois podem romper-se por dano mecânico ou ação do vento (HERRERO, 1962). 4.2. Mecanismo de incompatibilidade por cianogênese O estudo da cianogênese como mecanismo de incompatibilidade foi realizado pela determinação das concentrações dos GCs amigdalina e prunasina na cultivar e no porta-enxerto de cada combinação em duas épocas, inverno e verão. As análises foram realizadas no laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado em Pelotas, Brasil, no ano de 2011. No momento da coleta as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e logo após armazenadas a temperatura de -70ºC. Posteriormente passaram pelo processo de liofilização e foram armazenadas em tubos plásticos vedados até a realização das análises. Foram utilizados padrões prunasina e amigdalina (Sigma-Aldrich), carvão ativado (Sigma-Aldrich) e metanol (Vetec) específicos para HPLC (High Performance Liquid Chromatography). A água utilizada foi obtida empregandose o sistema Milli-Q de purificação (Millipore) e filtrado em filtro de nylon 0,1 µm. A extração foi realizada em 500 mg de amostra, com 8 mL de metanol e 2000 mg de carvão ativado. Esse mix permaneceu sob agitação durante 16 horas a temperatura ambiente. A seguir, foi realizada uma centrifugação a 3000 rpm durante 20 min e o sobrenadante foi filtrado à vácuo em filtro de nylon 0,1 µm. Do total filtrado, 20 µL foram submetidos à análise cromatográfica. Para as determinações cromatográficas empregaram-se uma coluna analítica Inertsil ODS-3 (150 x 4,6 mm, 4 µm) e pré-coluna equivalente, mantidas a 25°C durante a análise. A fase móvel foi água-metanol (60:40; v/v) 57 com fluxo de 1,3 mL min-1 e detecção UV no comprimento de onda de 254 nm. Os resultados foram expressos em mg g-1 de GC em base seca. A separação cromatográfica dos compostos amigdalina e prunasina foi realizada com sucesso. Foram obtidos quatro picos: Pico 1: água (1,16 min), Pico 2: metanol (1,38 min), Pico 3: amigdalina (2,44 min) e Pico 4: prunasina (3,44 min). Sendo os dois primeiros picos referentes à fase móvel. 4.3. Mecanismo de incompatibilidade por diferenças na composição fenólica As diferenças entre a composição fenólica de cultivares e do portaenxertos incompatíveis foi avaliada pela atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL) e expressão gênica da fenilalanina amônia-liase 1 (PAL1), fenilalanina amônia-liase 2 (PAL2), cinamato 4-hidroxilase 1 (C4H1), cinamato 4-hidroxilase 2 (C4H2), 4-cumarato:CoA ligase 1 (4CL1), 4-cumarato:CoA ligase 2 (4CL2) e 4-cumarato:CoA ligase 3 (4CL3). As análises referentes a atividade da PAL foram realizadas no laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado em Pelotas, RS no ano de 2010. Foi determinada de acordo com as metodologias descritas por Hyodo & Yang, (1971) e Hyodo et al., (1978), padronizada para análise de casca com modificações de acordo com Campos et al. (2003). Para a extração foram utilizados 500 mg de tecido fresco de casca, macerados em microtriturador em uma mistura de 4 ml de tampão borato de sódio 50 mM pH 8,5 contendo 25 gL-1 de PVP 10 e 4 mL L-1 de mercaptoetanol (±4 °C). Em seguida foi realizada a filtração do extrato bruto em papel Whatman nº 1. O extrato bruto foi centrifugado por 15 min na velocidade de 6.000 rpm e o sobrenadante (extrato enzímico) foi filtrado em papel Whatman nº 1 e utilizado para análise da atividade da PAL. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro UV PC Shimadzu em 290nm. A atividade enzimática foi expressa em unidades que foram definidas como a quantidade de enzima que produz 1 mM de ácido trans-cinâmico por minuto por grama de tecido fresco (µmol min-1 g-1). Com base na sequência de aminoácidos do pessegueiro no GDR (Genome Database of Rosaceae - http://www.rosaceae.org) e homologia com 58 sequências de genes de mesma função em Arabdopsis foram desenhados primers específicos. A análise de Real Time qRT-pcr foram realizadas em um equipamento Applied Biosystems 7500/7500 Fast (Applied Biosystems) com um volume total de 25 µL contendo: 12,5 µL do SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µL de cDNA diluído (1,6 ng µl-1), 0,75 µL de cada primer (300 mM) e 6,0 µL de água Milli-Q. O protocolo foi idêntico para todos os conjuntos de primer: 95 ºC por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ºC por 30 seg, 60 ºC por 1 min, 72 ºC durante 1min e uma extensão final de 72 ºC por 10 min. Posteriormente, um protocolo de dissociação com gradiente de 95 ºC por 15 seg. Os níveis de expressão foram calculados pelo método Ct (cycle threshold). O ∆Ct ou Ct normalizado foi obtido subtraindo valores Ct de cada gene alvo do Ct do gene de referência (housekeeping), enquanto o ∆∆Ct foi calculado usando o Ct de amostras não enxertadas. Os resultados foram submetidos à análise da variância e as variáveis com diferenças significativas (p<0,05) foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro. As análises foram realizadas através do programa estatístico WinStat versão 2.11 (MACHADO & CONCEIÇÃO, 2003). 59 5. Artigo 1: Compatibilidade de enxertia em pessegueiro: análise de crescimento e expressão gênica da Fenilalanina amônia-liase 5.1. Resumo A fenilalanina amônia-liase (PAL) é a enzima chave da rota fenilpropanóide. Essa rota é responsável pela biossíntese de um grande número de compostos secundários, como as antocianinas, os flavonóides e as ligninas. Níveis elevados da PAL são associados ao acúmulo de compostos fenólicos na união de enxertos incompatíveis. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a expressão e a atividade da PAL em diferentes combinações de Prunus, confirmando ou não a possibilidade de utilizar a PAL como indicador bioquímico de incompatibilidade de enxertia. O estudo foi realizado em plantas da cultivar Chimarrita (Prunus persica L. Batsch) enxertada sobre os portaenxertos ‘Capdeboscq’ (P. persica L. Batsch), ‘Tsukuba 1’ (P. persica L. Batsch) e ‘Umezeiro’ (P. mume Sieb. et Zucc.). As avaliações de crescimento vegetativo mostraram que ‘Chimarrita’ enxertada sobre ‘Umezeiro’ apresentou crescimento reduzido, resultando na morte de algumas plantas, enquanto os demais porta-enxertos induziram crescimento vigoroso a ‘Chimarrita’. O cálculo da constante de compatibilidade a campo (CC) indica que a combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresenta certo grau de incompatibilidade. Além disso, a expressão e a atividade da PAL foram maiores em ‘Umezeiro’. De acordo com os dados, houve um elevado nível de incompatibilidade entre a cultivar ‘Chimarrita’ e o porta-enxerto ‘Umezeiro’. O incremento da expressão gênica e da atividade enzimática da PAL podem ser usadas como marcador bioquímico com a finalidade de predizer a incompatibilidade de enxertia em Prunus. Palavras-chave: análise de crescimento, rota fenilpropanóide; atividade enzimática, genes de referência. 60 Graft compatibility in peach: analysis of growth and gene expression of phenylalanine ammonia-lyase 5.2. Abstract The phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is the key enzyme of phenylpropanoid pantway. This pantway is responsible for the biosynthesis of a large number of secondary compounds such as anthocyanins, flavonoids and lignins. The high levels of PAL are associated with the phenolic compounds accumulum in the union of incompatible grafts. The objective of this work was to study the expression and activity of PAL in different Prunus combinations, confirming or not the possibility to use the PAL as a biochemical marker of graft incompatibility. The study was conducted in the Chimarrita variety (Prunus persica L. Batsch) grafted on Capdeboscq (Prunus persica L. Batsch), Tsukuba 1 (P. persica L. Batsch) and Umezeiro (P. mume Sieb. et Zucc.) rootstocks. The growth evaluation indicated that ‘Chimarrita’ grafted in ‘Umezeiro’ showed reduced growth, resulting in the death of some plants, while the other rootstocks induced a vigorous growth on ‘Chimarrita’. The estimative of field determination of compatibility constant (CC) indicates that ‘Chimarrita’/’Umezeiro’ combination present a certain degree of incompatibility. The gene expression and activity of PAL were higher in ‘Umezeiro’. According with the results had a high level of incompatibility between ‘Chimarrita’ and ‘Umezeiro’. It was also noted that the increase in gene expression and enzymatic activity of PAL can be used as a biochemical marker to predict graft incompatibility in Prunus. Keywords: growth analysis, phenylpropanoid pathway, enzymatic activity, housekeeping. 61 5.3. Introdução A enxertia é uma técnica amplamente utilizada na fruticultura moderna, pela qual cultivar e porta-enxerto são unidos e formam uma nova planta. Geralmente, tanto a cultivar quanto o porta-enxerto são pertencentes à mesma espécie botânica, no entanto, quando são enxertadas espécies diferentes, principalmente de gêneros distintos, são frequentes os problemas de incompatibilidade de enxertia (Hartmann et al., 2002). A incompatibilidade é um obstáculo importante no desenvolvimento de novos porta-enxertos, especialmente em espécies frutíferas, onde enxertos incompatíveis podem crescer vários anos sem nenhum sintoma externo (Errea & Felipe, 1993; Hartmann et al., 2002). A sequência normal de eventos para a formação do enxerto segue três etapas básicas, que iniciam pela proliferação de células parenquimáticas de ambos os componentes do enxerto, formando um tecido de calo que preenche os espaços entre cultivar e porta-enxerto; posteriormente, ocorre a diferenciação destas células parenquimáticas em novas células cambiais, que ligam os câmbios da cultivar e do porta-enxerto; e por último, o novo câmbio se diferencia em novos tecidos do xilema e floema, formando as novas conexões vasculares (Hartmann et al., 2002). Entretanto, quando alguma destas etapas não é cumprida, ocorre a incompatibilidade de enxertia. Embora, para a maioria das combinações incompatíveis, a causa da incompatibilidade não seja conhecida, vários autores associam níveis elevados de compostos fenólicos a danos nas três etapas de formação do enxerto, havendo um consenso de que diferenças no perfil fenólico de combinações compatíveis e incompatíveis são um aspecto importante no processo de incompatibilidade de enxertia (Wang & Kollmann, 1996; Hartmann et al., 2002; Pina & Errea, 2008; Teles et al., 2009; Nocito et al., 2010; Zarrouk et al., 2010). A principal origem dos compostos fenólicos nas plantas é a rota fenilpropanóide, nesta rota, a enzima chave é a fenilalanina amônia-liase (PAL; EC 4.3.1.24), que catalisa a desaminação da fenilalanina para a produção de ácido trans-cinâmico, que posteriormente é convertido em ácido p-cumárico por uma reação oxidativa catalisada pela cinamato 4-hidroxilase (C4H; EC 1.14.13.11) e que subsequentemente sofre uma tioesterificação ativada pela 4cumarato:CoA ligase (4CL; EC 6.2.1.12), produzindo o p-cumaroil CoA, que é 62 canalizado para a produção de flavonóides, antocianinas e ligninas (Dixon & Paiva, 1995; Singh et al., 2009; Weitzel & Petersen, 2010; Neutelings, 2011). Em combinações incompatíveis de calos da cultivar Moniqui (Prunus armeniaca) com o porta-enxerto Marianna 2624 (Prunus munsoniana x Prunus cerasifera), foi observado um elevado nível de transcrição da PAL associado ao acúmulo de compostos fenólicos solúveis, como os flavonóides, porém, sem a formação de lignina, indicando um aumento da concentração de compostos fenólicos até um limiar prejudicial a compatibilidade de enxertia (Pina & Errea, 2008). O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão e a atividade da PAL em diferentes combinações de Prunus, confirmando ou não a possibilidade de utilizar a PAL como indicador bioquímico de incompatibilidade de enxertia. Foi estudado também o comportamento vegetativo das combinações a fim de comprovar os diferentes graus de compatibilidade. 63 5.4. Material e métodos 5.4.1. Material vegetal A cultivar de pêssego Chimarrita (P. persica L. Batsch) foi enxertada sobre os porta-enxertos ‘Capdeboscq’ (P. persica L. Batsch), ‘Tsukuba 1’ (P. persica L. Batsch) e ‘Umezeiro’ (P. mume Sieb. e Zucc.). O método de enxertia foi o de gema ativa, realizado no verão de 2007. As plantas foram cultivadas a campo no Centro Agropecuário da Palma na Universidade Federal de Pelotas, Brasil. Amostras de casca foram coletadas dois anos após a enxertia, 5cm acima e abaixo da união do enxerto. Todas as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC. 5.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia A avaliação da compatibilidade consistiu de análise de crescimento, índice de compatibilidade a campo (CC) e índice de sobrevivência. As variáveis de crescimento foram: peso fresco do material de poda acumulado, área foliar e diâmetro do tronco. O peso fresco do material de poda acumulado foi tomado no primeiro e segundo ano após a enxertia. A área foliar foi avaliada no segundo ano após a enxertia e o diâmetro do tronco foi medido durante o primeiro, segundo e terceiro ano após a enxertia. A CC foi calculada de acordo com a fórmula desenvolvida por Perraudine (1962): CC = [(C / A) + (C + A) / 2B] / 10, onde A: indica o diâmetro 5cm acima da união (cultivar); B: diâmetro na união do enxerto e, C: diâmetro 5cm abaixo da união (porta-enxerto). Os diâmetros do tronco empregados para os cálculos foram medidos no terceiro ano após a enxertia. 5.4.3. Extração de RNA e síntese de cDNA O RNA total foi isolado usando o protocolo CTAB adaptado por Messias et al. (2010), no Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Clima Temperado, Brasil. A concentração e a qualidade do RNA extraído foi medida em um Nanodrop Spectrometer (Nanodrop 1000, Thermo Scientific) com resultados indicando concentrações suficientes em todas as amostras e qualidade variando de 1,90 e 2,10 (relação de absorção 260/280nm). A integridade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1,0% com brometo 64 de etídio (EtBr). 1mg de RNA total foi empregado para a síntese de cDNA utilizando o kit SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 5.4.4. Análise da expressão gênica A análise da expressão gênica foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Fruticultura do Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (C.I.T.A.), Espanha. Com base na sequência de aminoácidos do pessegueiro no GDR (Genome Database of Rosaceae - http://www.rosaceae.org) e sua homologia com sequências de genes de mesma função em Arabdopsis, foram desenhados primers específicos para PAL1 e PAL2 de Prunus. A análise de expressão gênica foi realizada por Real Time qRT-pcr, com os primers apresentados na Tabela 5. As reações foram realizadas em um equipamento Applied Biosystems 7500/7500 Fast (Applied Biosystems) com um volume total de 25µL contendo: 12,5µL de SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5µL de cDNA diluído (1,6ng µl-1), 0,75µl de cada primer (300 mM) e 6,0µl de água Milli-Q. O protocolo foi idêntico para todos os conjuntos de primer: 95ºC por 10min, seguido de 40 ciclos de 95ºC por 30s, 60ºC por 1min, 72ºC durante 1min e uma extensão final de 72ºC por 10min. Posteriormente, um protocolo de dissociação com gradiente de 95ºC por 15s, 60ºC por 1min e 95ºC por 15s. Os níveis de expressão foram calculados pelo método Ct (cycle threshold). O ∆Ct ou Ct normalizado foi obtido subtraindo valores Ct de cada gene alvo do Ct do gene de referência, enquanto o ∆∆Ct foi calculado usando o Ct de amostras não enxertadas. 5.4.5. Seleção do gene de referência O gene de referência é o método mais comumente utilizado para a normalização dos parâmetros internos sobre análise de expressão gênica em Real Time. Como não existem estudos que indicam um gene de referência específico para estudar a compatibilidade de enxertia em Prunus, foram testados três genes utilizados para controle interno em estudos de expressão, Actina, Translation Elongation Factor 2 (TEF2) e AT5G12240. Os genes foram 65 avaliados quanto a sua especificidade, presença de dímeros na curva de dissociação, estabilidade e eficiência. Os pares de primers foram testados por RT-PCR convencional e eletroforese em gel de agarose 2,5% com EtBr para a verificação da especificidade e do amplicon. A eficiência da Real Time qRT-pcr dos três genes foi calculada usando dados brutos de fluorescência tomadas do 7500 System SDS Software (Applied Biosystems) e analisados no software LinRegPCR, de acordo Ruijter et al. (2009). A análise da estabilidade foi realizada pelo algoritmo NormFinder adaptado para Microsoft Excel, conforme descrito por Andersen et al. (2004) e Tong et al. (2009). Os dados sobre os pares de primers são apresentados nas Tabelas 5 e 6. Tabela 5. Características dos primers PAL1, PAL2 e Actina. Pelotas, RS, 2012. Símbolo Sequências (5’-3’) (1) Temperatura (°C) Tamanh o (pb) Eficiência R 2(1) ATGAGGTGAAGCG 62 CATGGTG 85 1,941 0,999 CTATGGCAGCCAC PAL1RqRT-Pp 62 TTGGGAA AGGTCAAACGGAT PAL2FqRT-Pp 58 GGTCAAC 85 1,974 0,999 ATTGCAGCCACCT PAL2RqRT-Pp 60 GAGCTAT TGAGGCTCCTCTC Actina (forward) 62 AACCCTA 90 1,978 0,999 ATACATGGCAGGC Actina (reverse) 58 ACATTGA (1) 2 Real Time qRTpcr eficiência e o coeficiente de relação (R ) foram estimados através do programa LinRegPCR de acordo com Ruijter et al. (2009). PAL1FqRT-Pp Tabela 6. Estabilidade dos genes de referencia Actina, AT5G12240 e TEF2. Pelotas, RS, 2012. Ordem de estabilidade 1º (melhor gene) 2º 3º Sem grupos Actina AT5G12240 TEF2 Sete grupos Actina AT5G12240 TEF2 5.4.6. Atividade enzimática da PAL A atividade da PAL foi determinada de acordo com os métodos descritos por Hyodo & Yang (1971) e Hyodo et al. (1978), padronizados e modificados para análise de casca de acordo com Campos et al. (2003). Para a extração foram utilizados 500mg de tecido fresco de casca, macerados (±4°C), 66 em microtriturador em uma mistura de 4 mL de tampão borato de sódio 50mM (pH 8,5) contendo 25g L-1 de PVP 10 e 4mL L-1 de mercaptoetanol. Em seguida foi realizada a filtragem do extrato bruto em papel Whatman nº 1. O extrato foi centrifugado por 15min na velocidade de 6.000rpm e o sobrenadante (extrato enzimático) foi filtrado em papel Whatman nº 1 e utilizado para análise da atividade da PAL. As leituras foram realizadas a 290nm em espectrofotômetro UV PC Shimadzu. A atividade enzimática foi expressa em unidades definidas como a quantidade de enzima que produz 1mM de ácido trans-cinâmico por minuto por grama de tecido fresco (µmol min-1 g-1). 5.4.7. Análise estatística O delineamento experimental foi em blocos casualizados com quatro repetições. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as variáveis com diferença significativa (p<0,05) tiveram as médias comparadas pelo teste de Tukey (α 0,05). Sendo a análise dos dados realizada através do programa estatístico WinStat 2.11 (Machado & Conceição, 2003). 67 5.5. Resultados 5.5.1. Avaliação da compatibilidade de enxertia Em relação às variáveis de crescimento, peso fresco do material de poda e área foliar, a combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou resultados inferiores em relação as outras duas combinações (‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ que, entretanto, não diferiram entre si (Tabela 7). Quanto ao diâmetro do tronco da cultivar, no primeiro ano não houve diferença significativa entre as combinações. Porém, a partir do segundo ano, a cultivar ‘Chimarrita’ apresentou diâmetro superior quando enxertada sobre ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. No porta-enxerto, o diâmetro de ‘Umezeiro’ também foi menor em comparação ao dos demais porta-enxertos a partir do segundo ano. No entanto, no ponto de união do enxerto, ‘Capdeboscq’ teve diâmetro inferior nos dois primeiros anos, mas no terceiro já não houve diferença entre as combinações. A combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou ainda um maior diâmetro do tronco do ponto de união em relação à cultivar e ao porta-enxerto, fato que não ocorre nas demais combinações (Figura 3). O cálculo da CC indica a formação de dois grupos de compatibilidade. Um grupo formado pelas combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, com grau elevado de compatibilidade e outro composto pela combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, com menor nível de compatibilidade. A combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou ainda, um índice de sobrevivência de 90%, sendo inferior ao obtido pelas combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, que ao longo de três anos, tiveram um índice de sobrevivência de 100%. 68 Tabela 7. Análise de crescimento e compatibilidadde das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. Combinações* Variáveis de crescimento e compatibilidade ‘Chimarrita/ ‘Chimarrita/ ‘Chimarrita/ Capdeboscq’ Tsukuba 1’ Umezeiro’ Massa fresca de poda (g) 2 Área foliar (cm ) Constante de compatibilidade a campo (CC) Índice de sobrevivência (%) Diâmetro do tronco (cm) 4.095,5 a 14.411,8 a 4.519,5 a 14.578,6 a 1.659,0 b 7.538,3 b 10,9 a 100,0 a 10,9 a 100,0 a 10,5 b 90,0 b a 9,4 a 22,9 a 37,9 a Cultivar 1º ano 2º ano 3º ano 11,7 a 23,9 a 39,3 10,2 b 19,8 b 31,7 a b 15,9 b 28, 3 a 44,1 a União 1º ano 2º ano 3º ano 18,3 a 32,3 a 48,8 19,0 a 32,6 a 49,9 a 12,1 a 24,8 a 41,9 a Porta-enxerto 1º ano 2º ano 3º ano 14,7 a 27,9 a 42,5 12,9 b 22,1 b 32,9 a a *valores seguidos de letras minúsculas iguais na linha, não diferem pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade de erro. (A) (B) (C) Figura 3. Região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. 5.5.2. Seleção do gene de referência Todos os genes apresentaram boa especificidade pela presença de uma única banda com o tamanho esperado e não foi observado a presença de dímeros. A eficiência foi calculada usando dados brutos de fluorescência analisados no software LinRegPCR e os resultados indicaram não haver diferenças significativas entre Actina e os genes alvo, PAL1 e PAL2 (Tabela 5). A análise de estabilidade foi realizada considerando duas situações. Na primeira, os valores Ct foram agrupados em sete grupos relacionados com as condições experimentais: não enxertados, ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (cultivar), 69 ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (porta-enxerto), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (cultivar), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (porta-enxerto), ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (cultivar) e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (porta-enxerto). Na segunda situação, não foram considerados grupos. Em ambos os casos Actina foi o gene de referência com a melhor estabilidade (Tabela 6). Desta forma, Actina foi o gene de referência selecionado para a normalização dos dados deste estudo. 5.5.3. Expressão gênica de PAL1 e PAL2 As análises de expressão gênica indicaram que PAL1 e PAL2 foram altamente influenciadas pelas diferentes combinações (Figura 4). A combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresentou expressão de PAL1 e PAL2 superior a ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ tanto na cultivar quanto no porta-enxerto. Na cultivar da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (combinação incompatível), PAL1 foi oito e cinco vezes mais expressa que em ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, respectivamente. No porta-enxerto da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, PAL1 foi seis e três vezes mais expressa que ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, respectivamente. A expressão gênica de PAL2 segue a mesma tendência. Na cultivar da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ foi quinze vezes mais expressa que em ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e três vezes mais que ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’. Entre os porta-enxertos, PAL2 foi três vezes mais expressa em ‘Umezeiro’ que ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. Tanto PAL1 quanto PAL2 foram mais expressas na cultivar, e entre as isoformas, PAL1 foi cerca de quatro vezes mais expressa que PAL2 (Figura 5). Resultados que indicam haver na cultivar e no porta-enxerto da combinação incompatível, um significativo incremento da expressão da PAL1 e PAL2, mas especialmente da PAL1. 70 14 Expressão gênica relativa 12 10 PAL1 Cultivar PAL2 Cultivar PAL1 Porta-enxerto PAL2 Porta-enxerto 8 6 4 2 0 'Capdeboscq''Tsukuba 1' 'Umezeiro' Figura 4. Expressão gênica relativa diferencial de PAL1 e PAL2 na cultivar e no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. Expressão gênica relativa 5 4 3 2 1 0 PAL1 PAL2 Figura 5. Expressão gênica relativa global de PAL1 e PAL2. Pelotas, RS, 2012. A atividade enzimática da PAL também foi significativamente influenciada pelas diferenças de compatibilidade (Figura 6). Assim como no estudo de expressão, a atividade da PAL foi superior no porta-enxerto ‘Umezeiro’ da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Neste porta-enxerto, a atividade de PAL foi 26 e 32% maior que nos porta-enxertos ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’, respectivamente. 71 Por outro lado, a atividade da PAL não diferiu entre ‘Chimarrita’ enxertada sobre os três porta-enxertos. Comparando a atividade entre cultivar e porta-enxerto, apenas na combinação ‘Chimarrita/Umezeiro’ houve diferença significativa, sendo que a atividade no porta-enxerto foi 32% maior que na cultivar. Pela análise de expressão se poderia supor que a atividade da PAL na cultivar da combinação incompatível deveria ser superior a das demais, porém, a elevada expressão gênica de PAL1 e PAL2 na copa dessa combinação não foi revertida em atividade enzimática. Este efeito pode ser observado com mais clareza na análise de correlação entre transcrição e atividade da PAL, no portaenxerto, com índices de 0,94 e 0,88 para PAL1 e PAL2, respectivamente (Figura 7). Por outro lado, na cultivar, os índices de correlação foram baixos, 0,36 para PAL1 e 0,37 em PAL2 (Figura 8). Atividade enzimática da PAL 1,4 1,2 Cultivar Porta-enxerto 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 'Capdeboscq''Tsukuba 1' 'Umezeiro' Figura 6. Atividade enzimática da PAL na cultivar e no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. 72 1,4 y = 0,822 + 0,0878x y = 0,788 + 1,007x R = 0.88 R = 0.94 Atividade enzimática da PAL 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0 1 2 3 4 6 0,0 5 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Expreção gênica da PAL2 Expressão gênica da PAL1 Figura 7. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e a atividade enzimática da PAL no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. 1,1 y = 0,780 + 0,00823x R = 0.36 y = 0,783 + 0,0225x R = 0.37 Atividade enzimática da PAL 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0 2 4 6 8 10 12 Expressão gênica da PAL1 14 16 0 1 2 3 4 5 6 7 Expressão gênica da PAL2 Figura 8. Correlação entre expressão gênica de PAL1 e PAL2 e atividade enzimática da PAL na cultivar das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita/Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. 73 5.6. Discussão 5.6.1. Compatibilidade de enxertia Pela análise conjunta dos parâmetros de crescimento, sobrevivência e CC, foi constatado que a combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ apresenta um elevado grau de incompatibilidade de enxertia. Segundo diversos autores, o crescimento reduzido da cultivar e do porta-enxerto’, o desenvolvimento pronunciado do tronco na região de união do enxerto e a menor CC da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, são sintomas que comprovam a incompatibilidade de enxertia entre os dois genótipos (Abolins, 2004; Rodrigues et al., 2004; Fachinello et al., 2005; Gökbayrak et al., 2007; Aloni et al., 2010; Martínez-Ballesta et al., 2010). Resultado que está de acordo com Teles et al. (2009), que observaram o mesmo comportamento entre os referidos genótipos. 5.6.2. Gene de referência para o estudo da compatibilidade de enxertia Real Time é um método avançado de estudo de expressão gênica (Radonic et al., 2004; Feng et al., 2012). Mas para sua correta utilização é necessário um método de padronização preciso (Czechowski et al., 2005; Ruijter et al., 2009; Wan et al., 2011). O gene de referência é o método mais utilizado para normalizar dados obtidos por Real Time e controlar possíveis erros experimentais na mensuração da expressão gênica (Tong et al., 2009; Feng et al., 2012). No presente estudo, as condições experimentais que podem influenciar a expressão de genes são: os diferentes genótipos e os níveis de compatibilidade. Para o estudo de diferentes genótipos, tublin beta, RNA polymerase II (RPII) e translation elongation factor 2 (TEF2) são os genes de referência mais recomendados para a normalização de estudos em pessegueiro (Tong et al., 2009). No entanto, ainda não foram realizados estudos sobre genes de referência para a condição de diferentes níveis de compatibilidade de enxertia. Por esta razão, foram testados Actina, TEF2 e AT5G12240, todos já empregados em outros estudos envolvendo diversas condições experimentais em pessegueiro (Radonic et al., 2004; Tong et al., 2009; Jiménez et al., 2010). 74 Embora todos apresentem uma boa especificidade, eficiência e sem presença de dímeros, Actina foi o gene que mostrou a melhor estabilidade para a condição experimental apresentada, com diferentes níveis de compatibilidade de enxertia. Com base nesses resultados, Actina foi o melhor gene de referência para normalização de dados relacionados com o estudo de compatibilidade em Prunus. Este resultado não corrobora com Tong et al. (2009) e Jimenez et al. (2010), que sugerem TEF2 e AT5G12240 como gene de referência no pêssego. No entanto, estes autores testaram outras condições experimentais que não a compatibilidade de enxertia. 5.6.3. Perfil da expressão gênica de PAL1 e PAL2 A via fenilpropanóide, coordenada pela PAL, é responsável pela síntese de diversos metabólitos secundários com funções importantes para as plantas, especialmente pela resposta a diferentes formas de estresse. Pina & Errea (2008), estudando uniões de calo de Prunus observaram uma abundante expressão da PAL associada a altos teores de compostos fenólicos em uniões incompatíveis. Neste estudo, o perfil transcricional mostra um forte aumento da expressão dos genes PAL1 e PAL2, tanto na cultivar quanto no porta-enxerto da combinação incompatível (‘Chimarrita’/‘Umezeiro’). Por outro lado, os enxertos compatíveis apresentaram níveis baixos de transcrição de ambas isoformas. Resultados que indicam que a análise gênica da PAL pode ser um indicador promissor para a avaliação da incompatibilidade de enxertia em espécie de Prunus. O aspecto que torna os genes PAL1 e PAL2 marcadores promissores para o estudo de compatibilidade se devem ao papel fundamental que esta enzima desempenha na biossíntese de muitos compostos fenólicos. Substâncias apontadas por Errea (1998) como potencialmente causadoras da incompatibilidade de enxertia. Conforme descrito por esse autor, em todas as fases de estabelecimento de enxerto de combinações incompatíveis podem ser encontradas diferenças quantitativas e/ou qualitativas no perfil de compostos fenólicos. Neste estudo, houve um desequilíbrio quantitativo do perfil de compostos fenólicos, mostrado pela elevada transcrição de PAL1 e PAL2 na cultivar e no porta-enxerto da combinação incompatível (‘P. persica x P. 75 mume’). Resultados semelhantes foram relatados por outros autores em outras combinações, como por exemplo, em ‘P. cerasifera’ x ‘P. salicina’ (Rodrigues et al., 2001); ‘P. armeniaca’ x ‘P. persica’ (Usenik, et al., 2006); ‘P. avium’ x ‘P. cerasus’ (Gebhardt & Feucht, 1982;. Treutter et al., 1986); ‘P. persica’ x ‘P. tomentosa’ (Salvatierra et al., 1999); ‘P. armeniaca’ x ‘P. munsoniana’ x ‘P. ceracifera’ (Pina & Errea, 2008) e ‘P. armeniaca’ combinado com outras espécies de Prunus (Errea et al., 1994). O grande número de combinações de Prunus com alterações quantitativas no perfil de compostos fenólicos indica um modelo consistente para incompatibilidade do enxerto. Ambos, PAL1 e PAL2 apresentaram aumento de transcrição relacionado à incompatibilidade, mas, cada gene tem um padrão distinto de magnitude de mudanças. Comparando a expressão de PAL1 e PAL2 na combinação incompatível e na expressão gênica global de PAL é evidente que PAL1 foi mais expressa que PAL2. Portanto, além de diferenças quantitativas, também podem estar ocorrendo diferenças qualitativas entre os tipos de compostos fenólicos formados. Estudos relatam que PAL1 e PAL2 têm padrões similares de expressão e de desenvolvimento em tecidos específicos (Fukasawa-Akada et al., 1996), mas, normalmente PAL1 e PAL2 estão filogeneticamente separados e talvez sejam reguladas por diferentes mecanismos de controle do desenvolvimento (Kumar & Ellis, 2001), o que pode induzir funções distintas. No entanto, embora possam desempenhar funções diferentes, vários autores sugerem que ambos são importantes para o processo de lignificação (Oh et al., 2003; Raes et al., 2003; Rohde et al., 2004) e, consequentemente, desempenham um papel importante no sucesso da enxertia. A lignificação pode ser o principal evento para a formação de uma união sólida (Errea, 1998; Buchloh, 1962), de modo que nos enxertos incompatíveis a lignificação ocorre dentro de áreas isoladas da medula e nenhuma conexão vascular é observada (Gebhardt & Goldbach, 1988). Até o momento, a hipótese mais aceita para a incompatibilidade de enxertia em pessegueiro é a do tipo ‘translocada’, (Herrero, 1951). Mas os resultados apresentados neste trabalho indicam a ocorrência da incompatibilidade ‘localizada’ ou mesmo uma associação das duas formas. A descrição dos sintomas de incompatibilidade ‘localizada’ segundo alguns 76 autores, concorda com esta proposição (Errea & Felipe, 1993; Errea, 1994; Zarrouk et al., 2006). As evidências mostradas neste trabalho sugerem, ainda, que os genes PAL1 e PAL2, fortemente expressos na combinação incompatível, podem estar associados a um desequilíbrio quantitativo ou qualitativo da biossíntese dos compostos fenólicos na interface do enxerto, causando problemas na biossíntese de alguns compostos, como a lignina e, induzindo a incompatibilidade de enxertia. 5.6.4. Correlação entre transcrição e atividade da PAL Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a atividade da PAL foi sensível as diferenças de compatibilidade. A análise no tecido da casca da cultivar e do porta-enxerto indica um forte aumento da atividade desta enzima no porta-enxerto da combinação incompatível (‘Chimarrita’/‘Umezeiro’). No entanto, não foram verificadas diferenças significativas de atividade na cultivar (Figura 8). Por outro lado, no porta-enxerto essa correlação foi alta, corroborando com Olsen et al. (2008), que também observaram uma elevada correlação entre transcrição e atividade enzimática. Estes resultados indicam que, na cultivar da combinação incompatível, apesar de haver alta transcrição da PAL, por alguma razão, não se refletiu em atividade enzimática. De acordo com Achnine et al. (2004), isso pode ocorrer devido a canalização metabólica associada a complexos de membrana que abrigam isoformas específicas da PAL e, alterações no metabolismo resultante da superexpressão de uma isoforma da enzima pode nem sempre se refletir simplesmente em aumento quantitativo na atividade enzimática ou numa alteração qualitativa do padrão associado às isoformas com consequências cinéticas. Mas, os mesmos autores sugerem que mais trabalhos são necessários para determinar se as relações entre PAL1 e PAL2 diferem durante o desenvolvimento ou em resposta a estímulos ambientais, e se isso pode trazer consequências metabólicas independentes do nível geral de atividade da PAL. De uma forma geral, não está claro se a maior expressão e atividade da PAL é causa da incompatibilidade de enxertia ou uma resposta ao estresse causado pela incompatibilidade gerada por outro mecanismo. Desta forma, são 77 expostas duas hipóteses para estudos posteriores: A) A maior expressão de PAL1 e PAL2 no porta-enxerto da combinação incompatível é responsável pelo desequilíbrio quantitativo ou qualitativo na produção de compostos fenólicos, causando a incompatibilidade de enxertia. B) A expressão diferencial de PAL1 e PAL2 na combinação incompatível é um reflexo do estresse gerado pelo verdadeiro agente causador, ainda desconhecido. 78 5.7. Conclusões Houve um aumento de transcrição e atividade da PAL em combinações incompatíveis. A PAL pode ser empregada como um marcador viável deste fenômeno em Prunus. Com base no comportamento vegetativo apresentado pelas combinações neste estudo, a enxertia da cultivar ‘Chimarrita’ sobre o portaenxerto ‘Umezeiro’ caracterizou-se como incompatível, ao contrário das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, que foram compatíveis. 79 5.8. Referencias bibliográficas Abolins, M., 2004. Evaluation of Compatibility for Grafted Apple-Trees by the Method of Coincidence Growth Rhythms. Acta Hortic. 658, 549-554. Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Sci Hortic-Amsterdam. 127, 119-126. Andersen, C.L, Jensen, J.L., Orntoft, T.F., 2004. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Adv. Cancer Res. 64, 5245-5250. Buchloh, G., 1962. 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Batsch), Tsukuba 1 (P. persica L. Batsch) e Umezeiro (P. mume Sieb. et Zucc.). Foram realizadas estimativas do teor de clorofila (índice SPAD) e análises macroscópicas da anatomia interna na interface dos enxertos, além da determinação do conteúdo de glicosídeos cianogênicos e atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (PAL). A partir dos resultados, conclue-se que, as combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e ‘Maciel’/‘Umezeiro’ foram incompatíveis e que o teor de prunasina pode ser utilizado como marcador bioquímico da incompatibilidade de enxertia. Palavras-chave: compatibilidade fenilalanina amônia-liase. de enxertia, prunasina, amigdalina, 85 Cyanogenesis, the cause of graft incompatibility in Prunus 6.2. Abstract Cyanogenesis is the only incompatibility mechanism known on fruits species. In this mechanism the cyanide released by the hydrolysis of cyanogenic glycosides amygdalin and prunasin causes lesions in the graft interface that block totaly or partially the vascular system. The objective of this study was to investigate the cyanogenic potential of varieties and rootstocks in the compatible and incompatible of Prunus combinations, as well as, to confirm or to refute the use of cyanogenic glycosides as markers of graft incompatibility. The work was conducted in Chimarrita (Prunus persica L. Batsch) and Maciel varieties (Prunus persica L. Batsch) grafted in the Capdebosc (Prunus persica L. Batsch), Tsukuba 1 (P. persica L. Batsch) and Umezeiro (P. mume Sieb. et Zucc.) rootstocks. Were made estimates of chlorophyll content (SPAD index), macroscopic analysis of anatomy internal in the interface of the grafts, determination of cyanogenic glycosides content and activity enzymatic of phenylalanine ammonia-lyase (PAL). The results indicate that ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ and ‘Maciel/Umezeiro’ combinations are incompatibles and the level of prunasina can be used as a biochemical marker of graft incompatibility. Keywords: graft compatibility, prunasin, amygdalin, phenylalanine ammonialyase. 86 6.3. Introdução Cianogênese é um processo pelo qual as plantas e outros organismos liberam cianeto, processo que ocorre através da hidrólise dos glicosídeos cianogênicos (GCs) (Conn, 1980). Os GCs são compostos presentes em cerca de 2500 espécies de plantas, pertencentes a mais de 130 famílias, com destaque para as rosaceas (Buhrmester et al., 2000; Vetter, 2000; Neilson et al., 2011). Em geral, as plantas cianogênicas utilizam essa capacidade como mecanismo natural de defesa contra herbívoros e patógenos (Gleadow & Woodrow, 2002; Zagrobelny & Moller, 2011), entretanto, a produção de cianeto também é responsável pela incompatibilidade de enxertia entre algumas espécies frutíferas (Gur et al., 1973; Moore, 1986; Nocito et al., 2010). A incompatibilidade de enxertia pode ser descrita como a falta de afinidade entre cultivar e porta-enxerto, havendo um desenvolvimento anormal do sistema vascular no ponto de enxertia (Mosse, 1958). Em plantas superiores, os poucos casos de incompatibilidade conhecidos tem como causa os GCs amigdalina e prunasina, que nestes casos, estão presentes em concentrações distintas na cultivar e no porta-enxerto (Gur et al., 1968; Gur & Blum, 1973, Moore, 1986). O processo de incompatibilidade por cianogênese inicia com a hidrólise da amigdalina pela β-glicosidase, produzindo uma molécula de glicose e outra de prunasina, na sequência a prunasina também sofre hidrólise da β-glicosidase formando outra molécula de glicose e αhidroxinitrila, que se dissocia formando cianeto e benzaldeído (Conn, 1980). Desta forma, quando é realizada a enxertia entre genótipos com diferenças elevadas na concentração destes GCs, o cianeto produzido pelo genótipo de maior potencial cianogênico provoca danos oxidativos que podem levar a morte de células no genótipo de menor potencial (Nocito et al., 2010). Nos casos onde este mecanismo de incompatibilidade está presente, as diferenças hormonais (Aloni et al., 2010), na composição de carboidratos (MartínezBallesta, 2010; Olmstead et al., 2010) e de fenóis (Errea, 1998; Rodrigues et al., 2002; Pina & Errea, 2008; Zarrouk et al., 2010), verificadas por diversos autores entre combinações compatíveis e incompatíves são na verdade um efeito. A hipótese proposta por este trabalho é de que os GCs amigdalina e prunasina são responsáveis pela liberação de cianeto na união do enxerto, 87 causando descontinuidade vascular e o enfraquecimento da união de combinações interespecíficas, resultando em incompatibilidade de enxertia. Desta forma, o presente estudo tem como objetivos principais, avaliar o potencial cianogênico de cultivares e porta-enxertos em combinações compatíveis e incompatíveis de Prunus, assim como, confirmar ou refutar a utilização dos GCs como marcadores da incompatibilidade de enxertia. Além de verificar uma possível relação da cianogênese com a atividade da PAL em combinações compatíveis e incompatíveis. 88 6.4. Material e métodos O experimento foi conduzido a campo, no Centro Agropecuário da Palma, pertencente à Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel (FAEM) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), município de Capão do Leão, RS, Brasil. A enxertia foi realizada em dezembro de 2007 e o pomar implantado em outubro de 2008, em uma densidade de 1333 plantas por hectare com espaçamento 5 x 1,5m. Sendo o pomar conduzido em “Y” e conduzido conforme as normas da Produção Integrada de Pêssegos (Fachinello et al., 2003). 6.4.1. Material vegetal As cultivares ‘Chimarrita’ (P. persica L. Bastsch) e ‘Maciel’ (P. persica L. Bastsch) foram enxertadas sobre os porta-enxertos ‘Capdeboscq’ (P. persica L. Bastsch), ‘Tsukuba 1’ (P. persica L. Bastsch) e ‘Umezeiro’ (P. mume Sieb. et Zucc.). Sendo os porta-enxertos obtidos por sementes originadas do banco de germoplasmas da FAEM/UFPel. A amostragem para as análises bioquímicas foram realizadas em duas épocas, inverno de 2008 e verão de 2009. Para as avaliações da atividade da PAL foram coletadas amostras apenas na segunda época. Foi amostrado o tecido da casca da cultivar (5cm acima da união) e do porta-enxerto (5cm abaixo da união). As amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC até o momento das análises. 6.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia A fim de se especificar o tipo e o grau de compatibilidade entre as combinações propostas, foi realizado um estudo para avaliar a manifestação das incompatibilidades ‘translocada’ e ‘localizada’. A diagnose da incompatibilidade ‘translocada’ foi realizada através da concentração da clorofila por área de folha, estimada pelo índice SPAD (Moreno et al., 1993; Zarrouk, 2006). A estimativa foi feita a campo, usando um SPADA 502 meter (Minolta), sendo realizadas duas medidas (lado superior e inferior) em 10 folhas de cada planta, sendo avaliadas três plantas de cada parcela, totalizando 30 folhas por parcela. As medidas foram realizadas no 89 verão de 2011, aproximadamente 150 dias após a plena floração. Quanto maior o grau de incompatibilidade ‘translocada’ menor será o índice SPAD (Moreno et al., 1993). Já a incompatibilidade ‘localizada’ foi avaliada pela análise anatômica interna e externa da região de união dos enxertos, conforme sugerido por Mosse & Herreo (1951). O grau de compatibilidade ‘localizada’ das combinações estudadas foi avaliado na região da união do enxerto, três anos e meio após a enxertia, através das classes (A, B, C, D e E) propostas por Mosse & Herreo (1951). As classes correspondem aos seguintes níveis de compatibilidade: A: união perfeita, a linha da união não é visível; B: boa união, a linha de união na casca e no lenho são continuas, embora no lenho seja muitas vezes visível devido a excessiva formação de raias; C: união com descontinuidade na casca, os tecidos da casca do porta-enxerto e da cultivar são separados por uma camada marrom escura com aparência de cortiça; D: uniões com descontinuidade vascular, os tecidos do lenho do porta-enxerto e da cultivar estão separados, por outro lado os tecidos da casca seguem como na classe C; e E: quando ocorre a quebra da união no pomar ou viveiro. As classes A, B e C, são consideradas compatíveis, pois não prejudicam a resistência mecânica, entretanto as classes D e E são incompatíveis, pois podem romper-se por dano mecânico ou ação do vento (Herrero, 1962). 6.4.3. Determinação da atividade da PAL As análises foram realizadas no laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado em Pelotas, RS, Brasil, no ano de 2010. A atividade de PAL foi determinada de acordo com as metodologias descritas por Hyodo & Yang, (1971) e Hyodo et al., (1978), padronizada para análise de casca com modificações de acordo com Campos et al. (2003). Para a extração foram utilizados 500mg de tecido fresco de casca, que foram macerados em banho de gelo (±4°C), com o auxí lio de um microtriturador em uma mistura de 4mL de tampão borato de sódio 50mM (pH 8,5) contendo 25g L-1 de PVP 10 e 4mL L-1 de mercaptoetanol. Em seguida foi realizada a filtração do extrato bruto em papel Whatman nº 1. O extrato bruto foi centrifugado por 15min na velocidade de 6.000rpm e o sobrenadante 90 (extrato enzimático) foi filtrado em papel Whatman nº 1 e utilizado para análise da atividade da PAL. As leituras foram realizadas a 290nm em espectrofotômetro UV PC Shimadzu. A atividade enzimática foi expressa em unidades que foram definidas como a quantidade de enzima que produz 1mM de ácido transcinâmico por minuto por grama de tecido fresco (µmol min-1 g-1). 6.4.4. Determinação da concentração de GCs As análises foram realizadas no laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado em Pelotas, RS, Brasil, no ano de 2011. No momento da coleta as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e logo após armazenadas a temperatura de -80ºC. Posteriormente, passaram pelo processo de liofilização e foram armazenadas em tubos plásticos até a realização das análises. Foram utilizados padrões prunasina e amigdalina (Sigma-Aldrich), carvão ativado (Sigma-Aldrich) e metanol (Vetec), específicos para HPLC (High Performance Liquid Chromatography). A água utilizada foi obtida empregandose o sistema Milli-Q de purificação (Millipore) e filtrado em filtro de nylon 0,1µm. A extração foi realizada em 500mg de amostra, com 8mL de metanol e 2000mg de carvão ativado. Esse mix permaneceu sob agitação durante 16 horas a temperatura ambiente. A seguir, foi realizada uma centrifugação a 3000rpm durante 20min e o sobrenadante foi filtrado a vácuo em filtro de nylon 0,1µm. Do total filtrado, 20µL foram submetidos à análise cromatográfica. Para as determinações cromatográficas empregaram-se uma coluna analítica Inertsil ODS-3 (150 x 4,6mm, 4µm) e pré-coluna equivalente, mantidas a 25°C durante a análise. A fase móvel foi água-met anol (60:40; v/v) com fluxo de 1,3mL min-1 e detecção UV no comprimento de onda de 254nm. Os resultados foram expressos em mg g-1 de GC em base seca. A separação cromatográfica dos GCs amigdalina e prunasina foi realizada com sucesso, sendo obtidos quatro picos: Pico 1: água (1,16min), Pico 2: metanol (1,38min), Pico 3: amigdalina (2,44min) e Pico 4: prunasina (3,44min). Os dois primeiros são referentes à fase móvel e os dois últimos aos GCs (Figura 9). 91 [mV] 3,44 Prunasina 4 2,44 Amigdalina 3 10 1,38 Metanol 2 20 1,16 Água 1 Voltage 30 0 0 1 2 3 Time 4 [min.] Figura 9. Perfil cromatográfico padrão obtido por HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina. Condições cromatográficas: coluna de fase reversa Inertsil ODS-3 (150 x 4,6mm, 4µm) acoplada a uma coluna de guarda equivalente. Fase móvel: 60% água (Milli-Q) e 40% metanol (grau HPLC) (v/v). Temperatura de 25°C, fluxo de 1,3mL min-1, volume de injeção de 20µL e detecção em 254nm. Pico 1: água; Pico 2: metanol; Pico 3: amigdalina e Pico 4: prunasina. Pelotas, RS, 2012. 6.4.5. Análise estatística O delineamento experimental para a análise dos GCs foi em blocos casualizados, com quatro repetições, duas cultivares, três porta-enxertos, duas porções do enxerto e duas épocas, em um esquema fatorial (2x3x2x2). A atividade da PAL também segue um esquema fatorial (2x3x2), com quatro repetições, porém, não foi contemplado o fator época. Os resultados foram submetidos à análise da variância e as variáveis com diferenças significativas (p<0,05) foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro. As análises foram realizadas através do programa estatístico WinStat versão 2.11 (Machado & Conceição, 2003). 92 6.5. Resultados 6.5.1. Compatibilidade de enxertia Não foram constatadas diferenças significativas entre o índice SPAD das seis combinações estudadas, o que indica a ausência de incompatibilidade do tipo ‘translocada’ (Tabela 8). Por outro lado, a avaliação macroscópica anatômica do ponto de união dos enxertos aponta a existência de incompatibilidade ‘localizada’ nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e ‘Maciel’/‘Umezeiro’, nas quais, pode-se observar uma clara descontinuidade vascular na região de união do enxerto (Figuras 10C, 10F e 11), fato que as classifica como incompatíveis da classe D (Herrero & Mosse, 1951). Outro sintoma evidente é a desproporcionalidade do diâmetro da região de união do enxerto em relação a cultivar e o porta-enxerto, sintoma clássico de incompatibilidade de enxertia (Rodrigues et al., 2004; Fachinello et al., 2005). Outros aspectos negativos observados a campo em relação a essas combinações foram à baixa resistência mecânica e a morte de plantas quando submetidas a situações de estresse, como déficit hídrico e encharcamento (dados não apresentados). Situação oposta pode ser observada entre ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Maciel/Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Maciel/Tsukuba 1’. Estas combinações apresentam uma união vascular continua entre cultivar e portaenxerto, não havendo sintomas de descontinuidade vascular em nenhum nível (Figura 10). Conforme os critérios de Mosse & Herreo (1951) essas quatro combinações pertencem à classe A, ou seja, apresentam uma união perfeita. Tabela 8. Identificação dos tipos de incompatibilidade ‘translocada’, pelo índice SPAD e ‘localizada’ pela avaliação anatomia da união conforme Herrero & Mosse (1951). Combinações Incompatibilidade ‘translocada’ ns Incompatibilidade ‘localizada’ ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ 37,05 ns 37,05 ns 37,59 A A D ‘Maciel/Capdeboscq’ 36,28 ns A ‘Maciel/Tsukuba 1’ 36,67 ns A 37,64 ns D ‘Maciel/Umezeiro’ ns Diferenças não significativas na coluna de cada cultivar, pelo teste de Tukey ao nível de significância de 5 %. A: união perfeita; B: união boa; C: união com descontinuidade na casca; D: união com descontinuidade na casca e lenho; E: quebra da união. 93 (A) (D) (B) (E) (C) (F) Figura 10. Corte macroscópico longitudional interno da região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B), ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C), ‘Maciel/Capdeboscq’ (D), ‘Maciel/Tsukuba 1’ (E), Maciel/Umezeiro (F), três anos e meio após a enxertia. Pelotas, RS, 2012. 94 Figura 11. Corte macroscópico da região de união do enxerto (combinação 'Maciel/Umezeiro') com destaque para a linha de descontinuidade vascular. Pelotas, RS, 2012. 95 6.5.2. Concentração dos GCs No inverno as concentrações de amigdalina foram superiores as do verão, enquanto, entre as cultivares, Chimarrita teve maior concentração que Maciel. Entretanto, as diferentes combinações avaliadas não induziram diferenças significativas na concentração de amigdalina (Figura 12A). Mas, comparando a concentração de amigdalina entre os portaenxertos não enxertados (Figura 12B), se observa uma maior concentração de amigdalina em ‘Umezeiro’, caracterizado como incompatível. Esta concentração foi 44% superior a encontrada em ‘Capdeboscq’ e 56% superior a ‘Tsukuba 1’. Comparando a concentração de amigdalina da cultivar e do porta-enxerto de cada combinação, não houve diferença significativa (Tabela 10). Tabela 9. Concentração (mg g-1) dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina nas diferentes épocas, cultivares e porções do enxerto. Pelotas-RS, 2012. Glicosídeo cianogênico -1 Amigdalina (mg g ) -1 Prunasina (mg g ) Época Inverno Verão a b 26,07 17,30 a b 43,26 38,70 Cultivares Chimarrita Maciel a b 24,16 19,21 a a 40,26 41,70 Porção do enxerto Cultivar Porta-enxerto a a 19,38 23,99 b a 35,66 46,30 * Valores seguidos de letras minúsculas iguais na linha, dentro de cada fator, não diferem pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade de erro. O estudo das concentrações de prunasina aponta um efeito diferencial significativo entre as épocas, porções do enxerto e porta-enxertos, além de interação entre porções do enxerto e porta-enxertos (Tabela 9). Entre as épocas, as maiores concentrações de prunasina foram obtidas no inverno, 11% superiores às do verão. Comparando as porções do enxerto, os teores foram em geral 26% superiores no porta-enxerto em relação à cultivar. Entre todas as combinações estudadas, não houve diferença significativa entre os teores de prunasina na cultivar. No entanto, nos portaenxertos, foi constatada uma concentração altamente superior de prunasina em ‘Umezeiro’, diferença de 118% em relação à concentração observada em ‘Capdeboscq’ e 121% em relação à ‘Tsukuba 1’ (Figura 12C). 96 Nos porta-enxertos não enxertados, a concentração de prunasina também foi superior em ‘Umezeiro’. No entanto, com diferenças menores em relação ao observado quando este foi enxertado (Figura 12B). A Tabela 10 apresenta a diferença de concentração de amigdalina e prunasina na cultivar em relação ao porta-enxerto de cada combinação. Esses dados indicam que nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, a cultivar Chimarrita apresentou uma concentração de prunasina 31,55mg g-1 ou 94,37% menor que o porta-enxerto Umezeiro. Em relação à combinação ‘Maciel’/‘Umezeiro’, essa diferença é ainda maior, ou seja, ‘Maciel’ teve uma concentração de prunasina, 114,62% menor que ‘Umezeiro’. 80 80 Cultivar Porta-enxerto (C) 60 60 40 40 20 20 -1 01,4 Cultivar Porta-enxerto (D) 1,2 -1 (B) -1 -1 Amigdalina Prunasina Atividade da PAL (µmol min g ) 800 Glicosideos cianogênicos (mg g ) Prunasina (mg g ) (A) -1 Amigdalina (mg g ) Cultivar Porta-enxerto 60 1,0 0,8 40 0,6 0,4 20 0,2 0 0,0 'Capbeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' 'Capbeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' Figura 12. Concentração dos glicosídeos cianogênicos (mg g-1) e atividade da fenilalanina amônia-liase - PAL (µmol min-1 g-1) nos porta-enxertos e nas cultivares estudadas. A: Concentração do glicosídeo cianogênico amigdalina no tecido da casca da cultivar e do porta-enxerto das combinações estudadas; B: Concentração dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina no tecido da casca dos porta-enxertos, não enxertados; C: Concentração do glicosídeo cianogênico prunasina no tecido da casca da cultivar e do porta-enxerto das combinações estudadas; D: Atividade da fenilalanina amônia-liase - PAL (µmol min-1 g-1). Pelotas, RS, 2012. 97 Tabela 10. Diferença entre a concentração dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina encontradas nas cultivares e nos porta-enxertos das combinações estudadas. Pelotas, RS, 2012. Cultivar Glicosídeo cianogênico Amigdalina Prunasina Porta-enxerto ‘Chimarrita’ -1 ‘Capdeboscq’ ‘Tsukuba 1’ ‘Umezeiro’ ‘Capdeboscq’ ‘Tsukuba 1’ ‘Umezeiro’ mg g a 3,77 a -6,16 a -8,11 a 4,26 a 0,11 b -31,55 % a 5,37 a -46,00 a -41,12 a -11,37 a 9,25 b -94,37 ‘Maciel’ -1 mg g a -4,20 a -1,62 a 11,32 a 0,82 a 1,07 b -38,76 % a -12,12 a -44,12 a -73,87 a 1,25 a -3,87 b -114,62 * Valores seguidos de letras minúsculas iguais na coluna, dentro de cada glicosídeo cianogênico, não diferem pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade de erro. 6.5.3. Atividade da PAL Principal enzima da rota fenilpropanóide, sendo responsável pela biossíntese de um grande número de compostos fenólicos, a atividade da PAL não diferiu entre cultivares. Porém, entre os porta-enxertos, ‘Umezeiro’ teve atividade 26% e 32% superior a ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba1’, respectivamente (Figura 12D). 6.5.4. Correlação entre prunasina e atividade da PAL Tendo em vista que tanto a prunasina quanto a PAL apresentaram uma relação significativa com a incompatibilidade manifestada neste experimento, foi realizado um estudo de correlação entre ambos. Nas combinações compatíveis, o coeficiente de correlação foi extremamente baixo (R = 0,01), indicando não haver relação entre as variáveis (Figura 13A). Mas, nas combinações incompatíveis, foi constatada uma correlação significativa (R = 0,87) entre a concentração de prunasina e a atividade da PAL (Figura 13B). 98 1,3 y = 0,876 - 0,000269x R = 0,01 (B) (p < 0,001) -1 -1 Atividade da PAL (µmol min g ) y = 0,628 + 0,00815x R = 0,87 (A) (p < 0,95) 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 20 25 30 35 40 -1 Prunasina (mg g ) 45 20 40 60 80 100 -1 Prunasina (mg g ) Figura 13. Correlação entre a concentração de prunasina e a atividade da fenilalanina amônia-liase (PAL) nas combinações compatíveis (A) e incompatíveis (B). Pelotas, RS, 2012. 99 6.6. Discussão 6.6.1. Compatibilidade de enxertia Os resultados apresentados neste trabalho indicam que o porta-enxerto Umezeiro (P. mume) é incompatível com as cultivares Chimarrita (P. persica) e Maciel (P. persica), corroborando com Teles et al. (2009), que estudando a enxertia entre as mesmas espécies, constaram elevada incompatibilidade, não indicando sua utilização. Por outro lado, em estudos anteriores, Campo Dall’Orto et al. (1992), concluíram que o grau de incompatibilidade apresentado entre ‘Umezeiro’ e cultivares de pessegueiro não é total, sendo possível seu aproveitamento como indutor de nanismo visando o adensamento de pomares, ponto de vista apoiado por Mayer et al. (2006). No entanto, é importante salientar que, embora a incompatibilidade entre ‘Umezeiro’ (P. mume) e pessegueiro (P. persica) não seja total, há um risco significativo na sua recomendação, uma vez que o grau de incompatibilidade observado nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e ‘Maciel’/‘Umezeiro’ foi elevado, podendo gerar prejuízos aos produtores ao longo dos anos (Hartmann et al., 2002) e em situações em que as plantas estão sujeitas a alguma forma de estresse, como o déficit hídrico, pode ocorrer morte de plantas. Entretanto, nas combinações compatíveis, ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, ‘Maciel/Capdeboscq’ e ‘Maciel/Tsukuba 1’ não foi constatado linha parenquimática no lenho, fato que garante uma união mecanicamente forte (Moreno et al., 1995). Sendo que, combinações que mantêm essa característica até dois anos após a enxertia podem ser recomendadas com segurança para o cultivo comercial (Herrero, 1951; Mosse, 1962). O estudo de compatibilidade que apontou a ocorrência da incompatibilidade ‘localizada’ nas combinações ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ e ‘Maciel/Umezeiro’ não corrobora com trabalhos anteriores, que indicavam de forma geral a ocorrência de incompatibilidade ‘translocada’ (Herrero, 1951; Salesses & Alkai, 1984). No entanto, à medida que se passou a utilizar novas espécies como porta-enxertos para pessegueiro, além da ameixeira, também se passou a observar a incompatibilidade ‘localizada’ em alguns casos (Errea et al., 1994; Ermel et al., 1999). Alguns autores observaram ainda, que 100 dependendo das espécies combinadas, pode haver a coexistência de ambos os tipos, como foi constatado por exemplo, entre cultivares de nectarina enxertadas sobre ameixeira (Moreno et al., 1995; Zarrouk et al. 2006). 6.6.2. Diferenças bioquímicas entre combinações compatíveis e incompatíveis Nas combinações avaliadas, não foi observado relação entre a concentração de amigdalina e a incompatibilidade de enxertia. Segundo Moore (1986), a enxertia entre um genótipo com alta concentração deste GC com outro de baixa concentração pode resultar em uma combinação incompatível. Mas, como tal diferença não foi constatada, se poderia considerar que a amigdalina não participa do processo de incompatibilidade. Entretanto, a determinação dos níveis de amigdalina nos porta-enxertos não enxertados revela uma concentração maior deste GC justamente em ‘Umezeiro’, portaenxerto caracterizado como incompatível. Esse fato, associado à concentração elevada de prunasina em ‘Umezeiro’ enxertado, sugere que o processo de enxertia pode estar desencadeando a hidrólise da amigdalina, convertendo-a a prunasina e por isso não foram constatadas diferenças de concentrações da amigdalina entre as combinações (Conn, 1994; Vetter, 2000; Zagrobelny et al., 2004). Além disso, indica que o metabolismo dos GCs está ativo no sentido da cianogênese, ou seja, da produção de cianeto. Embora a amigdalina possa estar envolvida no processo de incompatibilidade de enxertia, neste estudo o GC que parece estar associado de forma direta com esse fenômeno, em todos os aspectos, é a prunasina. Sua relação com a incompatibilidade de enxertia começa a ser evidente nas diferenças de concentração entre os porta-enxertos não enxertados. Neste caso, ‘Umezeiro’ já apresenta uma concentração de prunasina cerca de 50% superior à ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. Essa elevada capacidade cianogênica de ‘Umezeiro’ já havia sido destacada por Nanda et al. (2005), que identificou neste genótipo uma nova enzima da família das hidroxilitrila-liases, responsável pela última etapa de liberação do cianeto. Entretanto, essa relação fica ainda mais evidente nas combinações, onde a diferença nos níveis de prunasina é ainda maior em ‘Umezeiro’, com relação à ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’, chegando a valores superiores a 100%. 101 Porém, o papel da prunasina neste fenômeno fica claro quando se compara o teor da cultivar com o do porta-enxerto em cada combinação (Tabela 10). As cultivares enxertadas em ‘Umezeiro’ apresentam um teor de prunasina muito inferior ao encontrado neste porta-enxerto. Fato que não ocorre em relação à ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’, que integram as combinações compatíveis e apresentam teores de prunasina semelhantes às cultivares enxertadas sobre eles. O elevado potencial cianogênico de ‘Umezeiro’ em relação às cultivares de pessegueiro é a possível causa dessa incompatibilidade de enxertia. Teles et al. (2009), já destacavam essa possibilidade quando constataram combinações altamente incompatíveis entre as mesmas espécies. A situação de incompatibilidade observada neste experimento é semelhante à encontrada por Gur & Blum (1973), entre P. persica e P. dulcis. Em ambos os casos, tanto a cultivar quanto o porta-enxerto são espécies cianogênicas. A diferença é que o mecanismo de incompatibilidade por cianogênese até agora conhecido, indica a translocação da prunasina do componente do enxerto com maior potencial cianogênico para o de potencial menor (Gur et al., 1968, Gur & Blum, 1973; Moore 1986). No entanto, neste trabalho não há essa translocação de ‘Umezeiro’ para as cultivares Chimarrita e Maciel, possivelmente, devido à liberação de cianeto na interface do enxerto, que compromete a funcionalidade do sistema vascular. Essa estreita relação entre os altos teores de prunasina e a ocorrência de incompatibilidade pode habilitar a utilização da prunasina como marcador bioquímico da incompatibilidade de enxertia. O estudo da PAL revelou em ‘Umezeiro’ uma atividade muito superior em relação à apresentada por ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’. Tais resultados corroboram com Pina & Errea (2008), que observaram uma maior expressão da PAL nas combinações incompatíveis de Prunus. Os mesmos autores observaram, ainda, que a atividade elevada da PAL está correlacionada com o aumento de compostos fenólicos na união do enxerto, podendo ser esse acúmulo de fenóis uma causa provável da incompatibilidade. Por estarem implicados nos processos de divisão, desenvolvimento e diferenciação dos novos tecidos vasculares, diferenças quantitativas do perfil fenólico entre os componentes do enxerto podem resultar em disfunção metabólica entre as 102 células da cultivar e do porta-enxerto, resultando em incompatibilidade de enxertia (Errea, 1998; Musacchi et al., 2000). Usenik et al. (2006), observaram que em combinações incompatíveis, há diferença significativa entre a quantidade de fenóis da cultivar e do portaenxerto, resultado que corrobora com este experimento, onde na combinação incompatível foi observada a maior atividade da PAL no porta-enxerto. Alguns autores sugerem que essa diferença pode ser utilizada como marcador bioquímico da incompatibilidade de enxertia (Errea et al., 1992; Musacchi et al., 2000). 6.6.3. Correlação entre prunasina e atividade da PAL A análise conjunta da concentração de prunasina e da atividade da PAL indica uma correlação altamente significativa entre esses dois compostos nas combinações incompatíveis. Embora essa relação não esteja clara, é possível analisá-la sobre duas óticas distintas. Pode-se levar em consideração a origem de ambos os compostos. Tanto a PAL como a prunasina estão relacionadas com a fenilalanina (Kumar & Ellis, 2001; Olafsdottir et al., 2002; Xu et al., 2010). A PAL é a primeira enzima da rota fenilpropanóide e catalisa a conversão da fenilalanina em ácido transcinâmico (Liu et al., 2006). Posteriormente, o ácido transcinâmico é hidroxilado a ácido p-cumárico pela cinamato 4-hidroxilase (C4H), enzima do grupo da superfamília do citocromo P450 e, subsequentemente, o ácido pcumárico é transformado em compostos envolvidos em diversas funções, como flavonóides, antocianinas e ligninas (Huang et al., 2010). Por outro lado, a biossíntese de CGs derivados da fenilalanina é pouco conhecida, porém se sabe que em Carica papaya, a biossíntese de prunasina inicia com o citocromo P450 catalizando a conversão da fenilalanina em benzilaldoxima (Ganjewala et al., 2010). A seguir, a benzilaldoxima é transformada em uma α-hidroxinitrila pela ação de um segundo citocromo P450 e, por último, a UDPGglicosiltransferase cataliza a síntese de prunasina a partir da α-hidroxinitrila (Zagrobelny et al., 2004). Desta forma, uma maior concentração do aminoácido fenilalanina em enxertos incompatíveis pode estar relacionada com a maior quantidade de prunasina e atividade da PAL nos mesmos. 103 Outro foco passível de análise refere-se a uma relação de causa e consequência entre prunasina e PAL. A prunasina, presente em maiores concentrações nos enxertos incompatíveis, quando hidrolisada pela βglicosidase, libera cianeto, provocando sérios danos celulares à união do enxerto (Nocito et al., 2010). Em consequência, há uma maior atividade de PAL, indicando um aumento da produção de compostos fenólicos pela rota fenilpropanóide (Chang et al., 2010; Nocito et al., 2010; Giberti et al., 2012), conforme ocorre em outras formas de estresse (Dixon et al., 1995; Su et al., 2011; Giberti et al., 2012). Por tanto, pode estar havendo uma maior indução da rota fenilpropanóide pela PAL, em resposta ao dano provocado pela cianogênese na região de união do enxerto incompatível, explicando assim, a sua correlação positiva com a prunasina. De forma geral, é evidente que a cianogênese possui papel fundamental, sendo o principal fator responsável pela incompatibilidade. Porém, não está claro se a maior atividade da PAL é uma resposta da planta ao estresse sofrido, ou se também atua como causa do fenômeno. Havendo a necessidade de que em estudos futuros, a relação entre prunasina e PAL seja pesquisada em um número maior de combinações incompatíveis de Prunus. 104 6.7. Conclusões O porta-enxerto Umezeiro é incompatível com as cultivares Chimarrita e Maciel. Diferenças elevadas entre os teores de prunasina na cultivar e no porta-enxerto causam incompatibilidade de enxertia entre P. persica e P. mume. A prunasina é um marcador bioquímico viável da incompatibilidade de enxertia em Prunus; Em combinações incompatíveis, a atividade da fenilalanina amônialiase (PAL) é altamente correlacionada com a concentração de prunasina. 105 6.8. Referencias bibliográficas Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M., 2010. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Sci Hortic-Amsterdam 127, 119126. Buhrmester, R.A., Ebinger, J.E., Seigler, D.S., 2000. Sambunigrin and cyanogenic variability in populations of Sambucus canadensis L. (Caprifoliaceae). Biochem Syst Ecol. 28, 689-695. Campo Dall’Orto, F.A.; Ojima, M.; Barbosa, W.; Martins, F.P., 1992. O nanismo do pessegueiro induzido pela enxertia no damasqueiro-japonês. Pesqui Agropecu Bras. 27, 517-521. Campos, A.D., Ferreira, A.G., Hampe, M.M.V., Antunes, I.F., Brancão, N., Silveira, E.P., Silva, J.B., Osório, V.A., 2003. 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Sendo coordenada pela fenilalanina amonia-liase (PAL), seguida da cinamato 4-hidroxilase (C4H) e da 4-cumarato:CoA ligase (4CL), esta rota pode estar envolvida na resposta da planta a incompatibilidade de enxertia por cianogênese. O objetivo do presente trabalho foi analisar a expressão gênica das principais enzimas da rota fenilpropanóide e uma possível relação do perfil de expressão com a incompatibilidade causada pelos glicosideos cianogênicos. Foi observada uma maior concentração de prunasina no porta-enxerto da combinação incompatível. Onde, também foi constatado, uma maior expressão de todos os genes estudados. Houve uma significativa correlação entre os teores de prunasina e expressão destes genes. Com base nestes resultados, é possível concluir que a incompatibilidade de enxertia é causada pelo maior potencial cianogênico do porta-enxerto Umezeiro em relação a cultivar Chimarrita, e que a maior expressão dos genes da rota fenilpropanóide ocorre em resposta ao estresse gerado pela elevada produção de cianeto na interface do enxerto. Palavras-chave: Prunus, compatibilidade, cianeto, compostos fenólicos, antioxidante, genes de referência. 111 Gene expression of PAL, C4H and 4CL in response to graf incompatibility by cyanogenesis 7.2. Abstract Phenylpropanoid pathway plays an important role in growth, development and stress responses of various plants spécies. Being coordinated by phenylalanine ammonia-lyase (PAL), followed by cinnamate 4-hydroxylase (C4H) and 4cumarate:CoA ligase (4CL), this pathway may be involved in plant response to graft incompatibility by cyanogenesis.The main objective of this study was to analyze the gene expression of key enzymes of the phenylpropanoid panthway and a possible relation of this expression profiles with the graft incompatibility caused by cyanogenic glycosides. The results showed higher concentration of prunasina in the rootstock of the incompatible combination. Where, also found greater expression of all genes studied. Including a significant correlation between the levels of expression of these genes with the prunasin concentration. Based on these results, it is possible to say that the graft incompatibility was caused by higher cyanogenic potential of Umezeiro rootstock in relation to Chimarrita variety. And the increased expression of genes of the phenylpropanoid pathway, occurs in response to stress generated by high production of cyanide in the graft interface. Keywords: Prunus, compatibility, cyanide, phenolic compounds, antioxidant housekeeping. 112 7.3. Introdução A rota fenilpropanóide é responsável pela biossíntese de inúmeros compostos secundários importantes para o metabolismo das plantas, como as ligninas, os flavonóides e as antocianinas (Figura 14). Esta via é constituída por três enzimas chave, a fenilalanina amônia-liase (PAL; EC 4.3.1.24), a cinamato 4-hidroxilase (C4H, EC 1.14.13.11) e a 4-cumarato:CoA ligase (4CL; EC 6.2.1.12). A PAL é a primeira enzima na rota fenilpropanóide e catalisa a conversão de L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico (Kumar & Ellis, 2001; Liu et al., 2006; Olsen et al., 2008). É uma das enzimas mais estudadas nas plantas devido à sua importância na biossíntese de vários metabólitos secundários. Na sequência, a C4H, segunda enzima-chave nesta rota, catalisa a hidroxilação do ácido cinâmico, convertendo-o a ácido 4-cumárico, que também está envolvido na biossíntese de diversos metabolitos, além de controlar o fluxo de carbono para as fitoalexinas que são sintetizadas quando as plantas são atacadas por agentes patogênicos, de forma semelhante a PAL (Bell-Lelong et al., 1997; Bubna et al. 2011; Yang et al., 2012). Por fim, a 4CL catalisa a reação de ativação do ácido 4-cumárico formando tioésteres de CoA, como o p-cumaroil CoA (Hu et al., 1998; Kumar & Ellis, 2001; Gaid et al., 2011). Vários estudos têm mostrado que a expressão dos genes PAL, C4H e 4CL são sensíveis a uma série de estímulos bióticos e abióticos, incluindo a infecção por patógeno, ferimento, deficiência nutricional, radiação UV, temperaturas extremas, entre outras condições de estresse (Dixon e Paiva, 1995; Betz et al., 2001; Olsen et al., 2008; Kiselev et al., 2009; El-kereamy et al., 2011; Su et al., 2012). Neste sentido, Pina & Errea (2008), também relatam a maior expressão da PAL em combinações incompatíveis de Prunus, que se deu, concomitantemente ao acúmulo de compostos fenólicos. Os compostos fenólicos são há muitos anos estudados como peças importantes no processo de incompatibilidade de enxertia. Embora ainda não seja conhecido o verdadeiro papel destes compostos nesse fenômeno, sabe-se que ocorrem diferenças quantitativas e/ou qualitativas destes compostos entre combinações compatíveis e incompatíveis (Errea, 1998; Rodrigues et al., 2001; Pina & Errea, 2008; Teles et al., 2009; Zarrouk et al., 2010). 113 Recentemente, Nocito et al. (2010), estudando a incompatibilidade por cianogênese entre calos de pereira (Pyrus communis) e marmeleiro (Cydonia oblonga), encontraram evidências de que este mecanismo de incompatibilidade atua produzindo um importante estresse oxidativo, resultando em danos que, dependendo do nível, podem causar a morte das células. Os mesmos autores observaram, ainda, o aumento da atividade de enzimas antioxidantes que atuam na redução deste estresse oxidativo. Considerando o papel das enzimas PAL, C4H e 4CL na rota fenilpropanóide e o aumento da produção de enzimas e compostos antioxidantes em combinações incompatíveis devido a cianogênese, o objetivo do presente trabalho foi analisar a expressão gênica das principais enzimas da rota fenilpropanóide e sua relação com a incompatibilidade causada pelos glicosideos cianogênicos (GCs) amigdalina e prunasina. L- Fenilalanina Fenilalanina amônia-liase (PAL) ácido cinâmico Cinamato-4-hidroxilase (C4H) ácido 4-cumárico 4-cumarato-CoA ligase (4CL) p-cumaroil CoA FLAVONÓIDES ANTOCIANINAS LIGNINAS Figura 14. Esquema resumido da rota fenilpropanóide. Adaptado de Taiz & Zeiger (2004). Pelotas, RS, 2012. 114 7.4. Material e métodos 7.4.1. Material vegetal A cultivar Chimarrita (P. persica L. Batsch) foi enxertada sobre os porta-enxertos Capdeboscq (P. persica L. Batsch), Tsukuba 1 (P. persica L. Batsch) e Umezeiro (P . mume Sieb. e Zucc.). O método de enxertia empregado foi o de gema ativa. As plantas foram cultivadas a campo no Centro Agropecuário da Palma na Universidade Federal de Pelotas, Brasil. Amostras de casca foram coletadas dois anos após a enxertia, 5cm acima e abaixo da união do enxerto. Todas as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC. 7.4.2. Avaliação da compatibilidade de enxertia A compatibilidade foi avaliada através de dois métodos, o índice SPAD e o método de análise visual proposta por Mosse & Herrero (1951). O índice SPAD, que identifica diferenças de concentração de clorofila por área de folha, foi empregado para avaliar a incompatibilidade ‘translocada’. Com a utilização de um SPAD 502 meter (Minolta), foram realizadas duas medidas (lado superior e inferior) em 10 folhas de cada planta, sendo avaliadas três plantas de cada parcela, totalizando 30 folhas por parcela. As medidas foram realizadas no verão de 2011, aproximadamente 150 dias após a plena floração. Quanto maior é o grau de incompatibilidade ‘translocada’ menor será o índice SPAD (Moreno et al., 1993). A análise visual proposta por Mosse & Herrero (1951), que avalia o grau de compatibilidade ‘localizada’ das combinações, foi realizada três anos e meio após a enxertia, através das classes A, B, C, D e E, propostas pelos referidos autores. As classes correspondem aos seguintes níveis de compatibilidade: A: união perfeita, a linha da união na casca e no lenho não é visível; B: boa união, a linha de união na casca e no lenho são continuas, embora no lenho seja muitas vezes visível devido a excessiva formação de raias; C: união com descontinuidade na casca, os tecidos da casca do portaenxerto e da cultivar são separados por uma camada marrom escura com aparência de cortiça; D: uniões com descontinuidade vascular, onde os tecidos do lenho do porta-enxerto e da cultivar estão separados em muitos pontos, no 115 entanto, os tecidos da casca seguem como na classe C, e E: quando ocorre a quebra da união no pomar ou viveiro. Sendo as classes A, B e C, são consideradas compatíveis, enquanto as classes D e E incompatíveis. 7.4.3. Determinação da concentração de GCs As análises foram realizadas no laboratório de Fisiologia Vegetal da Embrapa Clima Temperado, Brasil. No momento da coleta as amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênios líquido e, logo após, armazenadas a -80ºC. Posteriormente foram liofilizadas e armazenadas em tubos plásticos até a realização das análises cromatográficas. Para as análises cromatográficas, foram utilizados, padrões prunasina e amigdalina (Sigma-Aldrich), carvão ativado (Sigma-Aldrich) e metanol (Vetec), específicos para HPLC (High Performance Liquid Chromatography). A água utilizada foi obtida empregando-se o sistema Milli-Q de purificação (Millipore) e filtrado em filtro de nylon 0,1µm. A extração foi realizada em 500mg de amostra, com 8mL de metanol e 2000mg de carvão ativado. Esse mix permaneceu sob agitação durante 16 horas a temperatura ambiente. A seguir, foi realizada uma centrifugação a 3000rpm durante 20min e o sobrenadante foi filtrado à vácuo em filtro de nylon 0,1µm. Do total filtrado, 20µL foram submetidos à análise cromatográfica. Para as determinações cromatográficas empregaram-se uma coluna analítica Inertsil ODS-3 (150 x 4,6mm, 4µm) e pré-coluna equivalente, mantidas a 25°C durante a análise. A fase móvel foi água-met anol (60:40; v/v) com fluxo de 1,3mL min-1 e detecção UV no comprimento de onda de 254nm. Os resultados foram expressos em mg g-1 de GC em base seca. 7.4.4. Extração de RNA e síntese de cDNA O RNA total foi isolado usando o protocolo CTAB adaptado por Messias et al. (2010) no Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Clima Temperado, Brasil. A concentração e a qualidade do RNA extraído foi medida em um Nanodrop Spectrometer (Nanodrop 1000, Thermo Scientific) com resultados indicando concentrações suficientes para todas as amostras e qualidade variando de 1,90 e 2,10 (relação de absorção 260/280nm). A integridade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1,0% com brometo 116 de etídio (EtBr). Sendo empregado 1mg de RNA total para a síntese de cDNA utilizando o kit SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 7.4.5. Análise da expressão gênica e seleção do gene de referência O estudo de expressão gênica das enzimas da rota fenilpropanóide, foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Fruticultura do Centro de Investigación y Tecnologia Agroalimentaria de Aragón, Espanha. Com base nas sequências de aminoácidos de P. persica obtidas no GDR (Genome Database of Rosaceae - http://www.rosaceae.org) e sua homologia com sequências de genes de mesma função em Arabdopsis, foram desenhados primers específicos para PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3. A análise por Real Time, foi realizada com os primers apresentados nas Tabelas 11 e 12. As reações foram realizadas em um equipamento Applied Biosystems 7500/7500 Fast (Applied Biosystems), com um volume total de 25µL contendo: 12,5µL do SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5µL de cDNA diluído (1,6ng µl-1), 0,75µL de cada priemer (300mM) e 6,0µL de água Milli-Q. O protocolo foi idêntico para todos os conjuntos de primer: 95ºC por 10min, seguido de 40 ciclos de 95ºC por 30s, 60ºC por 1min, 72ºC durante 1min e uma extensão final de 72ºC por 10min. Posteriormente, um protocolo de dissociação com gradiente de 95ºC por 15s, 60ºC por 1min e 95ºC por 15s. Os níveis de expressão foram calculados pelo método Ct (cycle threshold). O ∆Ct ou Ct normalizado foi obtido subtraindo valores Ct de cada gene alvo do Ct do gene de referência, enquanto o ∆∆Ct foi calculado usando o Ct de amostras não enxertadas. Os genes de referência testados foram Actina, Translation Elongation Factor (TEF2), RPII e AT5G12240. Os pares de primers foram testados por RTPCR convencional e eletroforese em gel de agarose 2,5% com EtBr para a verificação da especificidade e do amplicon. A eficiência da Real Time qRT-pcr dos três genes foi calculada usando dados brutos de fluorescência tomadas do 7500 System SDS Software (Applied Biosystems) e analisados no software LinRegPCR, de acordo Ruijter et al. (2009). A análise da estabilidade dos genes de referência foi realizada pelos programas GeNorm, NormFinder e 117 BestKeeper, adaptados para o programa Microsoft Excel, conforme descrito por Andersen et al. (2004) e Tong et al. (2009). Os dados sobre as caracteristicas dos pares de primers são apresentados nas Tabelas 11, 12 e 13. A análise de eficiência indica que os quatro genes de referência testados podem ser utilizados, pois foram eficiêntes para as condições experimentais (Tabela 11). No entanto, a análise de estabilidade, realizada por três modelos e quatro métodos diferentes, sugere nos três casos, Actina como melhor gene para a normalização dos dados (Tabela 13). Tabela 11. Características dos primers de PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3. Pelotas, RS, 2012. Símbolo Sequência (5’-3’) PAL1FqRTpp (forward) PAL1RqRTpp (reverse) PAL2FqRTpp (forward) PAL2RqRTpp (reverse) C4H1FqRTpp (forward) C4H1RqRTpp (reverse) C4H2FqRTpp (forward) C4H2FqRTpp (forward) 4CL1FqRTpp (forward) 4CL1RqRTpp (reverse) 4CL2FqRTpp (forward) 4CL2RqRTpp (reverse) 4CL3FqRTpp (forward) 4CL3RqRTpp (reverse) ATGAGGTGAAGCGC ATGGTG CTATGGCAGCCACTT GGGAA AGGTCAAACGGATG GTCAAC ATTGCAGCCACCTGA GCTAT CTGGCATCCATGTCA CAAAC GTCCGATACCACAG CCAAGT CCACCCTGAGATCCA AAAGA GGGTGTCTGGCTCT GTGATT TAAGAGCTGGAGCT GCCATT CACGATGGGGGCAA TACTAA AGAGTTGGGGCGGC GATTTT GCACAAAAGGCGCA ATGGTC GTTCGTCGACAAGCT TCGAG CGCCAAGTTTCGGG TAGTTA (1) (1) Temperatura (ºC) Tamanho (pb) Eficiência R 2(1) 62 85 1,93 0,999 85 1,97 1,000 78 2,01 0,999 83 1,99 0,999 98 1,99 0,999 97 1,98 0,999 74 1,99 0,999 62 58 60 60 60 60 61 60 61 62 62 61 60 Eficiência e coeficiente de relação (R2) da Real Time qRT-pcr, estimados através do programa LinRegPCR, de acordo com Ruijter et al. (2009). 118 Tabela 12. Características dos primers de Actina, TEF2, RPII e AT5G12240. Pelotas, RS, 2012. Símbolo Actina (forward) Actina (reverse) TEF2 (forward) TEF2 (reverse) RPII (forward) RPII (reverse) AT5G12240 (reverse) AT5G12240 (reverse) Sequência (5’-3’) Temperatura (°C) TGAGGCTCCTCTCAACC 62 CTA ATACATGGCAGGCACAT 58 TGA GGTGTGACGATGAAGA 60 GTGA AAGGAGAGGGAAGGTG 60 AAAG TGAAGCATACACCTATG 60 ATGATGAAG CTTTGACAGCACCAGTA 60 GATTCC AGTCAGCCCAGTACGAA 60 GAGG TGCTTCTGCTTCACCCA 60 CCT (1) Tamanho (pb) Eficiência R 2(1) 90 1,97 0,999 129 1,94 0,999 128 1,93 1,00 600 1,91 1,00 (1) Eficiência e coeficiente de relação (R2) da Real Time qRT-pcr, estimados através do programa LinRegPCR, de acordo com Ruijter et al. (2009). Tabela 13. Estabilidade dos genes de referencia Actina, TEF2, RPII e AT5G12240. Pelotas, RS, 2012. Ordem NormFinder Sem grupos Grupos* Actina Actina TEF2 TEF2 RPII RPII AT5G12240 AT5G12240 GeNorm BestKeeper 1 RPII e AT5G12240 Actina 2 Actina TEF2 3 TEF2 RPII 4 AT5G12240 *sete grupos: 3 porta-enxertos x 2 dois pontos amostrados em cada combinação (cultivar e porta-enxerto) + amostra não enxertada. As sequências de proteínas analisadas foram: Arabidopsis thaliana PAL1 (PAL1_ARATH), A. thaliana PAL2 (PAL2_ARATH), A. thaliana PAL3 (PAL3_ARATH), A. thaliana PAL4 (PAL4_ARATH), Brassica napus PAL (AAX22053.1), Capsicum annuum PAL (ACF17667.1), Catharanthus roseus PAL (BAA95629.1), Cicer arietinum PAL2 (PAL2_CICAR), Citrus limon PAL (Q42667.1), Cynara cardunculus var. Scolymus PAL1 cardunculus var. Scolymus PAL3 (BAG31930.1), D. carota PAL1 (CAL91037.1), C. (CAL91169.1), Daucus carota PAL (PAL1_DAUCA), Glycine max PAL1 (P27991.1), G. max PAL2 (ACS88364.1), G. max PAL (ACT32033.1), Ipomoea batatas PAL1 (PAL1_IPOBA), I. batatas PAL2 (PAL2_IPOBA), I. (AAG49585.1), sativa Lactuca sativa PAL (AAL55242.1), L. nil PAL PAL2 (AAO13347.1), Malus domestica PAL1 (MDP0000787168), M. domestica PAL2 (MDP0000668828), Manihot esculenta PAL1 (AAK60274.1), M. esculenta PAL2 (AAK60275.1), Morus alba PAL (ADI40166.1), Nicotiana tabacum PAL 119 (P35513.2), N. tabacum PAL1 (PAL1_TOBAC), N. tabacum PAL2 (PAL2_TOBAC), N. tabacum PAL3 (PAL3_TOBAC), N. tabacum PAL4 (ACJ66297.1), Oryza sativa PAL1 (PAL1_ORYSJ), O. sativa PAL2 (PAL2_ORYSJ), Petroselinum crispum PAL1 (P24481.1), P. crispum PAL2 (PAL2_PETCR), P. crispum PAL3 (P45729.1), Phaseolus vulgaris PAL1 (PAL1_PHAVU), P. vulgaris (PAL3_PHAVU), Pisum (Q04593.1), kitakamiensis PAL2 (PAL2_PHAVU), sativum PAL1 Populus kitakamiensis PAL1 (PAL1_POPKI), (Q01861.1), PAL2 P. vulgaris PAL3 P. sativum PAL2 (PAL2_POPKI), Populus Populus kitakamiensis PAL4 (PAL4_POPKI), Prunus avium PAL1 (O64963.1), P. persica PAL1 (PAL1 Peach), P. persica PAL2 (PAL2 Peach), Pyrus communis PAL (ABB70117.2), Pyrus x bretschneideri PAL1 (ADF59061.1), Pyrus x bretschneideri PAL2 (ADF59062.1), idaeus Rubus PAL1 (Q9M568.1), R. idaeus PAL2 (AAF40224.1), Scutellaria baicalensis PAL1 (ADN32767.1), S. baicalensis PAL2 (ADN32768.1), Solanum lycopersicum PAL1 (PAL1_SOLLC), S. lycopersicum PAL5 (PAL5_SOLLC), S. tuberosum PAL1 (PAL1_SOLTU), S. tuberosum PAL2 (PAL2_SOLTU), Zea mays PAL (B6SRL9_MAIZE), Citrus clementina PAL1 (CAB42793.1), C. clementina PAL2 (CAB42794.1), P. cerasifera x P. munsoniana PAL (ABK32084.1), Pinus taeda PAL (P52777.1), Coffea canephora PAL1 (AAN32866.1), C. canephora PAL2 (AAN32867.1), Acacia auriculiformis x A. mangium C4H (ABX75854.1), Allium cepa C4H (AAS48416.1), A. sativum C4H (ADO24190.1), A. thaliana C4H (NP_180607.1), Brassica napus C4H2 (ABF17875.1), B. rapa C4H (BAI77480.1), Canarium album C4H (ACR10242.1), Capsicum annuum C4H (ACF19421.1), C. sinensis C4H (AAF66066.2), Citrus x paradisi C4H (AAK57011.1), Cucumis sativus C4H (CAK95273.1), G. max C4H (Q42797.1), Gossypium hirsutum C4H (ACH56520.1), G. hirsutum C4H2 (ACZ06240.1), Gynura bicolor C4H (BAJ17666.1), Hibiscus cannabinus C4H2 (ABF58026.1), Humulus lupulus C4H (ACM69364.1), Ipomoea batatas C4H (ADB65927.1), Isatis tinctoria C4H (ADG43134.1), Leucaena leucocephala C4H (ACZ54906.1), Lithospermum erythrorhizon C4H (BAB71717.1), Malus domestica C4H (peach C4H1) (MDP0000225698), M. domestica C4H (MDP0000229348), N. tabacum CYP73A47v1 (ABC69411.1), Oryza sativa Japonica C4H (NP_001046819.1), Parthenocissus henryana C4H (ABA59555.1), P. crispum (Q43033.1), Petunia 120 x hybrida C4H2 (ADX33333.1), P. vulgaris C4H (CAA70596.1), Pinus taeda trans-cinnamate 4-hydroxylase (AAD23378.1), P. tremuloides transcinnamate 4-hydroxylase (ABF69099.1), P. trichocarpa trans-cinnamate 4hydroxylase (ACC63873.1), P. trichocarpa x P. deltoides C4H (AAG50231.1), P. avium C4H (ADZ54778.1), P. persica C4H1 (C4H1 Peach), P. persica C4H2, Ricinus communis C4H (XP_002534996.1), R. coreanus C4H (ABX74779.1), R. occidentalis C4H (ACM17896.1), Rubus sp. C4H (ABX74781.1), Ruta graveolens C4H (Q9AR74.1), Salvia miltiorrhiza C4H (ABC75596.1), S. tuberosum C4H (ABC69046.1), Sorghum (XP_002452044.1), Trifolium pratense C4H bicolor hypothetical protein (ACB78015.1), Z. mays C4H (NP_001151365.1), P. persica 4CL1 ; P. persica 4CL2; P. persica 4CL3; Z. mays 4CL (Q6Q297); N. tabacum 4CL (Q42943); N. tabacum 4CL1 (O24145); A. lyrata 4CL (XM_002894282.1); A. thaliana 4CL1 (NM_001084228.1); A. thaliana 4CL2 (NM_113019.3); A. thaliana 4CL3 (NM_105180.3); A. thaliana 4CL5 (NM_113018.3); A. thaliana 4CL4 (AY376731.1); A. thaliana (AC025294.14); Capsicum annuum 4CL (AF212317.1); C. annuum putative 4CL2 (EU616540.1); G. max 4CL (FJ770469.1); G. max 4CL14 (X69954); G. max 4CL4 (X69955.2); Gossypium hirsutum 4CL (HM462000.1); G. hirsutum 4CL1 (FJ479707.1); G. hirsutum 4CL2 (FJ848870.1); M. domestica 4CL2 (MDP0000260512); M. domestica 4CL3 (MDP0000293578); O. sativa 4CL1 (L43362); Petroselinum hortense pc4CL-1 (X13324.1); P. hortense Pc4CL-2 (X13325.1); Pinus taeda PT4CL1 (U12012.1); P. taeda PT4CL2 (U12013.1); P. tremuloides Pt4CL1 (AF041049.1); P. tremuloides Pt4CL2 (AF041050.1); S. tuberosum St4C1-1 (M62755.1); P. avium 4CL1 (GU990523.1); O. sativa 4CL2 (X52623); R. idaeus 4CL1 (AF239687.1); R. idaeus 4CL2 (AF239686.1); R. idaeus 4CL3 (AF239685.1); R. graveolens 4CL1 (EU196763.1); R. graveolens 4CL2 (EU196764.1); Salvia miltiorrhiza 4CL2 (AY237164.1); S. tuberosum 4CL2a (AF150686.1); Sorbus aucuparia p-CL1 (GU938595.1); S. aucuparia p-CL2 (GU949552.1); S. aucuparia p-CL3 (GU949553.1); Z. mays 4CL2 (NM_001156842.1). O alinhamento das sequências de proteínas foi realizado usando o Clustal W implementado no programa MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007), que também foi usado para a construção da árvore filogenética baseada no método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de 121 ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). O multialinhamento das sequências de proteínas para a identificação de sequências conservadas entre genes da mesma família foi realizado pelo software online Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW (http://www.genome.jp/tools/clustalw). 7.4.6. Análise estatística O delineamento experimental foi de blocos casualizados, com quatro repetições, em esquema fatorial (3x2), três porta-enxertos e duas porções do enxerto (cultivar e porta-enxerto). Os resultados foram submetidos à análise da variância e as variáveis com diferenças significativas (p<0,05) foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro, utilizando o programa estatístico WinStat versão 2.11 (Machado & Conceição, 2003). As análises de correlação foram realizadas no programa gráfico estatístico SigmaPlot versão 11.0 (SigmaPlot, 2004). 122 7.5. Resultados 7.5.1. Compatibilidade de enxertia Não houve diferenças significativas entre os índices SPAD das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (Figura 15), o que indica, a não existência de incompatibilidade ‘translocada’ em qualquer das combinações. No entanto, pela análise macroscópica da anatomia da união do enxerto, é possível observar na combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, uma descontinuidade vascular entre cultivar e porta-enxerto, havendo a formação de uma linha de separação entre ambos, evento que não ocorre nas demais combinações (Figura 16). Conforme a metodologia de avaliação proposta por Herrero & Mosse (1951), combinações com tais características pertencem à classe D, ou seja, são incompatíveis, pois podem romper-se com relativa facilidade. Outra característica que contribui para a caracterização desta combinação como incompatível é o engrossamento do tronco na região de união, especialmente na cultivar, associado ao pequeno diâmetro da cultivar e principalmente do porta-enxerto (Figura 16G). Este comportamento é típico de uma combinação incompatível (Fachinello et al., 2005). 50 Índice SPAD 40 30 20 10 0 'Capdeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' Figura 15. Índice SPAD observado pela análise das folhas das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. 123 7.5.2. Concentração dos GCs Foram observadas diferenças significativas entre os teores de prunasina nos porta-enxertos das combinações, tendo ‘Umezeiro’, anteriormente caracterizado como incompatível, apresentado o dobro da concentração verificada em ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’ (Figura 17). Por outro lado, não foram constatadas diferenças entre os teores de prunasina na cultivar Chimarrita enxertada sobre os diferentes porta-enxertos. Nas combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ e ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’, não houve diferenças significativas entre os teores de prunasina na cultivar e no porta-enxerto. Porém, na combinação incompatível, ‘Chimarrita’ apresentou uma concentração de prunasina 65% menor que ‘Umezeiro’. Na comparação dos teores de prunasina entre porta-enxertos não enxertados, ‘Umezeiro’ apresentou uma concentração de prunasina superior a ‘Capdeboscq’ e ‘Tsukuba 1’ (Figura 17). 124 (A) (B) (C) (D) (E) (F) Diâmetro: 3,9cm ‘Chimarrita’ Diâmetro: 6,0cm Linha que demonstra a descontinuidade vascular entre os componentes do enxerto. ‘Umezeiro’ Diâmetro: 3,0cm (G) Figura 16. Aparência externa e corte macroscópico longitudinal interno da região de união das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ (A e D), ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ (B e E) e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (C e F). Detalhes internos da região de união da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ (G). Pelotas, RS, 2012. Os níveis de amigdalina não foram significativamente diferentes na cultivar ‘Chimarrita’ enxertada sobre os três porta-enxertos, ou mesmo entre os porta-enxertos, quando estes estavam combinados com ‘Chimarrita’ (Figura 18). Porém, entre os porta-enxertos não enxertados, ‘Umezeiro’ teve concentração superior aos demais (Figura 18). 125 100 Cultivar Porta-enxerto Porta-enxerto não enxertado -1 Prunasina (mg g ) 80 60 40 20 0 'Capdeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' Figura 17. Concentração do glicosídeo cianogênico prunasina (mg g-1) no porta-enxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos porta-enxertos ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012. 100 -1 Amigdalina (mg g ) 80 Cultivar Porta-enxerto Porta-enxertos não enxertados 60 40 20 0 'Capdeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' Figura 18. Concentração do glicosídeo cianogênico amigdalina (mg g-1) no porta-enxerto e na cultivar, das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, e nos porta-enxertos ‘Capdeboscq’, ‘Tsukuba 1’ e ‘Umezeiro’, não enxertados. Pelotas, RS, 2012. 7.5.3. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL A expressão gênica das três famílias de enzimas da rota fenilpropanóide avaliadas neste trabalho foi fortemente influenciada pela compatibilidade de enxertia. Tanto as PALs, quanto as C4Hs e as 4CLs foram significativamente mais expressas na cultivar e no porta-enxerto da combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, classificada como incompatível (Figura 19). 126 Comparando a expressão dos sete genes avaliados, é possível constatar que em todos os casos há uma maior expressão na cultivar em relação ao porta-enxerto. Ainda em relação a diferença de expressão entre cultivar e porta-enxerto, na combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ todos os genes foram várias vezes mais expressos na cultivar (Tabela 14). 14 Expressão gênica relativa 12 10 PAL1 Cultivar PAL2 Cultivar PAL1 Porta-enxerto PAL2 Porta-enxerto 8 6 4 2 Expressão gênica relativa 100 0 80 C4H1 Cultivar 'Capdeboscq' C4H2 Cultivar C4H1 Porta-enxerto C4H2 Porta-enxerto 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' 4CL1 Cultivar 'Capdeboscq' 4CL2 Cultivar 4CL3 Cultivar 4CL1 Porta-enxerto 4CL2 Porta-enxerto 4CL3 Porta-enxerto 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' 'Capdeboscq' 'Tsukuba 1' 'Umezeiro' 60 40 20 Expressão gênica relativa 30 0 25 20 15 10 5 0 Figura 19. Expressão gênica relativa dos genes PA1L, PAL2, C4H1, C4H2 e 4C1L, 4CL2 e 4CL3 na cultivar e no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. 127 Tabela 14. Número de vezes em que os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3, foram mais expressos na cultivar que no porta-enxerto das combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’, ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ e ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’. Pelotas, RS, 2012. Combinações ‘Chimarrita’/‘Capdeboscq’ ‘Chimarrita’/‘Tsukuba 1’ ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’ PAL1 1 1 2 PAL2 2 2 9 C4H1 2 3 19 C4H2 1 1 11 4CL1 2 2 10 4CL2 1 1 15 4CL3 2 2 6 7.5.4. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL As sequências de proteína de várias espécies foram utilizadas para estimar as relações filogenéticas com as sequências de P. persica. Em geral, todas as enzimas apresentaram maior homologia com espécies da mesma família botânica. No caso da PAL1, foi homóloga com P. avium (PAL1) e P. communis (PAL) e Pyrus x bretsscheideri (PAL1). Já PAL2, teve maior homologia com M. domestica (PAL1 e PAL2), P. comunis (PAL) e Pyrus x bretschneideri (PAL2) (Figura 20). Se pode observar também, uma divisão entre monocotiledôneas e dicotiledôneas, onde ambas as isoformas da PAL apresentaram maior similaridade com espécies dicotiledôneas, estando mais distantes de monocotiledôneas, como O. sativa (PAL1 e PAL2), Z. mays (PAL) e P. taeda (PAL). A C4H2 apresentou maior proximidade genética com P. avium (C4H) e M. domestica (C4H). Enquanto, C4H1 agrupou com P. vulgaris (C4H), R. communis (C4H), Z. mays (C4H) e O. sativa (C4H) (Figura 21). Ao contrário do que ocorreu com as PALs, que foram similares as monocotiledôneas, entre as C4H, a C4H2 foi mais similar as dicotiledôneas e a C4H1 às monocotiledôneas. Entre as isoformas de 4CL, as 4CL1 e 4CL2 apresentaram maior proximidade genética entre si do que em relação a 4CL3. A isoforma 4CL1 foi homóloga a R. ideaus (4CL1), S. aucuparia (p-CL1) e G. max (4CL14) (Figura 22). Enquanto 4CL2 foi agrupou com R. ideaus (4CL2), M. domestica (4CL2) e S. aucuparia (p-CL2) e 4CL3 à P. avium (4CL1), M. domestica (4CL3) e S. aucuparia (p-4CL3). dicotiledôneas. Em geral, as PALs foram agrupadas com as 128 86 99 81 97 93 99 75 55 99 99 99 91 97 66 68 98 99 88 97 99 94 86 99 99 79 99 97 90 86 99 73 99 99 64 91 94 55 97 99 99 67 96 Capsicum annuum PAL Solanum lycopersicum PAL5 Nicotiana tabacum PAL1 Nicotiana tabacum PAL4 Solanum lycopersicum PAL1 Solanum tuberosum PAL1 Solanum tuberosum PAL2 Ipomoea batatas PAL1 Ipomoea nil PAL Ipomoea batatas PAL2 Nicotiana tabacum PAL3 Nicotiana tabacum PAL Nicotiana tabacum PAL2 Catharanthus roseus PAL Scutellaria baicalensis PAL1 Scutellaria baicalensis PAL2 Cynara cardunculus var. Scolymus PAL1 Lactuca sativa PAL2 Gynura bicolor PAL Lactuca sativa PAL Cynara cardunculus var. Scolymus PAL3 Daucus carota PAL1 Daucus carota PAL Petroselinum crispum PAL3 Petroselinum crispum PAL1 Petroselinum crispum PAL2 Citrus limon PAL Manihot esculenta PAL1 Populus kitakamiensis PAL4 Populus kitakamiensis PAL2 Populus kitakamiensis PAL1 Arabidopsis thaliana PAL3 Arabidopsis thaliana PAL4 Cicer arietinum PAL2 Rubus idaeus PAL1 Prunus persica PAL2 Malus domestica PAL1 Malus domestica PAL2 Pyrus x bretschneideri PAL2 Prunus avium PAL1 Prunus persica PAL1 Pyrus communis PAL Pyrus x bretschneideri PAL1 Rubus idaeus PAL2 Citrus clementina PAL1 Citrus clementina PAL2 Arabidopsis thaliana PAL2 Brassica napus PAL Arabidopsis thaliana PAL1 Manihot esculenta PAL2 Morus alba PAL Phaseolus vulgaris PAL3 Pisum sativum PAL1 Pisum sativum PAL2 Glycine max PAL1 Phaseolus vulgaris PAL1 Glycine max PAL2 Phaseolus vulgaris PAL2 Coffea canephora PAL1 Coffea canephora PAL2 Pinus taeda PAL Oryza sativa PAL1 Oryza sativa PAL2 Zea mays PAL Dicotiledôneas Monocotiledôneas Figura 20. Relação filogenética entre genes PALs. As sequências de proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012. 129 65 81 94 53 96 96 74 100 68 93 77 73 100 58 100 100 77 100 100 99 51 Petunia x hybrida C4H2 Solanum tuberosum C4H Capsicum annuum C4H Nicotiana tabacum CYP73A47v1 Lithospermum erythrorhizon C4H Leucaena leucocephala C4H Acacia auriculiformis x Acacia mangium C Cucumis sativus C4H Humulus lupulus C4H Rubus coreanus C4H Rubus sp. C4H Rubus occidentalis C4H Malus domestica C4H (peach C4H1) Malus domestica C4H (peach C4H2) Prunus avium C4H Prunus persica C4H2 Hibiscus cannabinus C4H2 Salvia miltiorrhiza C4H Gynura bicolor C4H Petroselinum crispum Isatis tinctoria C4H Brassica napus C4H2 Arabidopsis thaliana C4H Brassica rapa C4H Ipomoea batatas C4H Parthenocissus henryana C4H Populus trichocarpa trans-cinnamate 4-hy Populus trichocarpa x Populus deltoides Populus tremuloides trans-cinnamate 4-hy Canarium album C4H Gossypium hirsutum C4H Gossypium hirsutum C4H2 Ruta graveolens C4H Citrus sinensis C4H Citrus x paradisi C4H Glycine max C4H Trifolium pratense C4H Allium cepa C4H Allium sativum C4H Pinus taeda trans-cinnamate 4-hydroxylas Sorghum bicolor hypothetical protein Zea mays C4H Oryza sativa Japonica C4H Ricinus communis C4H Phaseolus vulgaris C4H Prunus persica C4H1 Classe I Classe II Figura 21. Relação filogenética entre os genes C4Hs. As sequências de proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012. 130 100 99 98 100 99 60 61 100 100 55 53 58 84 100 84 88 98 100 55 100 100 100 56 100 81 88 97 100 56 Capsicum annuum 4CL Capsicum annuum putative 4CL2 Nicotiana tabacum 4CL1 Solanum tuberosum 4CL1 Solanum tuberosum 4CL2 Nicotiana tabacum 4CL Salvia miltiorrhiza 4CL2 Petroselinum crispum 4CL1 Petroselinum crispum 4CL2 Rubus idaeus 4CL2 Malus domestica 4CL2 Prunus persica 4CL2 Populus tremuloides 4CL1 Prunus persica 4CL1 Rubus idaeus 4CL1 Ruta graveolens 4CL2 Arabidopsis thaliana 4CL5 Arabidopsis thaliana 4CL1 Arabidopsis thaliana 4CL2 Pinus taeda 4CL1 Pinus taeda 4CL2 Arabidopsis thaliana 4CL3 Ruta graveolens 4CL1 Gossypium hirsutum 4CL Gossypium hirsutum 4CL1 Gossypium hirsutum 4CL2 Populus tremuloides 4CL2 Glycine max 4CL Glycine max 4CL4 Rubus idaeus 4CL3 Malus domestica 4CL3 Prunus avium 4CL1 Prunus persica 4CL3 Oryza sativa 4CL Zea mays 4CL Zea mays 4CL2 Arabidopsis thaliana 4CL4 Classe I Classe II Classe III Figura 22. Relação filogenética entre os genes 4CLs. As sequências de proteínas foram alinhadas e a árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA versão 4.1. Método de distância Neighbor Joining (NJ) com medidas de suporte e confiabilidade de ramos calculadas com porcentagem de 1000 repetições (bootstrap). Pelotas, RS, 2012. 131 7.6. Discussão 7.6.1. Incompatibilidade por cianogênese A incompatibilidade de enxertia observada neste estudo, entre ‘Chimarrita’ (P. persica) e ‘Umezeiro’ (P. mume), é atribuída à maior concentração de prunasina em ‘Umezeiro’. Resultado que corrobora com Teles et al. (2009), que já haviam constatado a incompatibilidade entre os mesmos genótipos e, além disso, indicavam um possível envolvimento da prunasina neste processo. O mecanismo de incompatibilidade por cianogênese já foi descrito entre combinações de pereira/marmeleiro e pessegueiro/amendoeira (Gur et al., 1968; Gur & Blum, 1973; Moore, 1984; Moore, 1986). No primeiro caso, a pereira, que contêm concentrações elevadas de prunasina, é enxertada sobre o marmeleiro, que por sua vez, não apresenta este composto. No segundo caso, ambas as espécies contêm prunasina, porém, o pessegueiro apresenta concentrações superiores, e essa diferença é suficiente para que se manifeste a incompatibilidade. Situação semelhante ocorre na combinação ‘Chimarrita’/‘Umezeiro’, onde ambos são cianogênicos, porém, a diferença de concentração entre cultivar e porta-enxerto é elevada, tornando a combinação incompatível. A incompatibilidade por cianogênese ainda é pouco conhecida, havendo um número restrito de trabalhos que abordam esse mecanismo. Entretanto, sabe-se que o processo de incompatibilidade inicia na interface do enxerto, onde a prunasina é hidrolisada pela β-glicosidase havendo a liberação de cianeto (Gur & Blum, 1973; Moore, 1986). Desta forma, quando se combina uma espécie com teor elevado de prunasina, como ’Umezeiro’, com outra de baixo teor, como ‘Chimarrita’, há uma produção elevada de cianeto na interface do enxerto, prejudicial especialmente à espécie com menor teor de prunasina. Isso ocorre porque uma espécie que contêm baixo potencial cianogênico, geralmente apresenta uma menor capacidade de desintoxicação (Zagrobelny et al., 2004). A desintoxicação do cianeto acumulado em plantas é realizada através de uma reação química entre o cianeto e a cisteína, catalisada pela βcianoalanina sintase, que converte esse composto tóxico em β-cianoalanina, que posteriormente é convertida em asparagina (Miller & Conn, 1980). Em 132 plantas com baixo potencial de desintoxicação, o aumento da concentração de cianeto na interface do enxerto resulta em estresse severo, que pode resultar em uma série de distúrbios fisiológicos e bioquímicos em toda a planta e, dependendo do grau, pode levar a morte de células na região de união do enxerto. Essa morte celular forma uma linha necrótica separando a cultivar do porta-enxerto e diminuindo a resistência mecânica entre ambos, fato que ficou evidente no estudo de Gur et al. (1968), na combinação entre pereira e marmeleiro. No presente trabalho, também foi constatada essa mesma linha divisória que caracteriza uma separação entre ‘Chimarrita’ e ‘Umezeiro’, porém, em menor grau. Essa menor intensidade do fenômeno entre ‘Chimarrita’ e ‘Umezeiro’ possivelmente se deve ao fato de ambos serem espécies cianogênicas com relativo potencial de desintoxicação, ao contrário da combinação pereira/marmeleiro. Recentemente, estudos de Nocito et al. (2010), avaliaram o efeito da incompatibilidade por cianogênese sobre o metabolismo da planta e seus resultados explicam grande parte do processo em que o cianeto causa a incompatibilidade de enxertia. Os referidos autores estudaram a incompatibilidade por cianogênese entre pereira (Pyrus communis) e marmeleiro (Cydonia oblonga), encontrando fortes evidências de que este mecanismo de incompatibilidade se dá por uma disfunção da via respiratória da planta. As evidências que comprovam esse fato são uma menor produção de energia (ATP) pela respiração mitocondrial, associada a um aumento do consumo de oxigênio (O2) na combinação incompatível. Esse comportamento indica a utilização de uma via respiratória alternativa, não sensível ao cianeto. Em condições naturais, a respiração das plantas é composta por três processos básicos, a glicólise, o ciclo do ácido cítrico e a cadeia de transporte de elétrons. Este último é organizado em quatro complexos, Complexo I (NADH desidrogenase), Complexo II (sucinato desidrogenase), Complexo III (complexo de citocromos bc1) e Complexo IV (citocromo c oxidase) (Taiz & Zeiger, 2004). Porém, em situações onde o cianeto está presente, a citocromo c oxidase é inibida e os Complexos III e IV são inativados. Nestes casos, a partir do Complexo II, a respiração segue uma via alternativa, que é composta pela oxidase alternativa (AOX), único componente desta via e que catalisa a redução de quatro elétrons de oxigênio para água. Nesta rota, a energia livre 133 que seria armazenada na forma de ATP é perdida na forma de calor (Taiz & Zeiger, 2004) (Figura 23). A utilização desta via alternativa sugere que o aumento no consumo de O2 na combinação incompatível se deve a um incremento do fluxo de elétrons ao longo da via de respiração mitocondrial alternativa (Nocito et al., 2010). Este comportamento tem sido amplamente relacionado a diferentes formas de estresses em tecidos vegetais e resulta em dano oxidativo secundário, devido ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), que incluem peróxido de hidrogênio (H2O2), o ânion oxigênio (O2-), os radicais hidroxila (OH) e o oxigênio “singlet” (1O2) (Arora et al. 2002; Pellin et al., 2002; Kim et al., 2011; Carneiro et al., 2012; Wang et al., 2012). ROS são geradas naturalmente como subprodutos da via respiratória, onde as mitocôndrias são as principais organelas produtoras (Apel & Hirt, 2004). Quando o aumento das ROS é relativamente pequeno, a capacidade antioxidante das células é suficiente para manter o equilíbrio entre produção e eliminação (Van Breusegem & Dat 2006). Porém, em condições de estresse, como a incompatibilidade de enxertia por cianogênese, este delicado equilíbrio é perturbado, levando a um acúmulo de ROS (Figura 23). As ROS têm potencial de interagir com muitos componentes celulares e a sua alta concentração gera estresse oxidativo, que causa danos a proteínas, lipídios e DNA, e consequentemente a membranas e outras estruturas, podendo levar a morte celular, que quando ocorre se caracteriza por necrose dos tecidos (Van Breusegem & Dat 2006; Gao et al., 2008). Além de indicar a ativação da via respiratória alternativa, a AOX desempenha um papel importante no controle da produção de ROS (Vanlerberghe et al., 2002). Mas no caso da incompatibilidade por cianogênese, Nocito et al. (2010), observaram na combinação incompatível uma baixa expressão desta enzima. Fato que sugere a manutenção da situação de estresse oxidativo. Desta forma, pode-se dizer que a incompatibilidade de enxertia desencadeada pela cianogênese é causada por danos celulares devido ao estresse oxidativo resultante do acúmulo de ROS nas células próximas á interface do enxerto. Danos que podem ser mais ou menos severos, dependendo do grau de estresse gerado. 134 RESPIRAÇÃO Combinação compatível Combinação incompatível Cianeto Glicólise Glicólise Ciclo do ácido cítrico Ciclo do ácido cítrico Cadeia de transporte de elétrons Cadeia de transporte de elétrons Complexo I (NADH desidrogenase) Complexo I (NADH desidrogenase) Complexo II (sucinato desidrogenase) Complexo II (sucinato desidrogenase) Complexo III (complexo de citocromos bc1) Oxidase alternativa (AOX) Complexo IV (citocromo oxidase) - Energia (ATP); - Consumo de O2 normal; - Baixos níveis de ROS. FUNCIONAMENTO CELULAR PERFEITO - Calor; - Consumo de O2 elevado; - Altos níveis de ROS. ESTRESSE OXIDATIVO = DANO CELULAR Figura 23. Esquema ilustrativo da via respiratória em combinações compatíveis e incompatíveis. Em combinações compatíveis, a via respiratória (sensível ao cianeto) é composta por três processos básicos: glicólise, o ciclo do ácido cítrico e a cadeia de transporte de elétrons. Estando a cadeia de transporte de elétrons organizada em quatro complexos (I, II, III e IV), que ao final resulta na formação de energia na forma de ATP com consumo normal de oxigênio (O2) e baixa produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Nas combinações incompatíveis, o cianeto está presente, a citocromo c oxidase é inibida e os Complexos III e IV são inativados. A partir do Complexo II, a respiração segue uma via alternativa (não sensível ao cianeto), que é composta pela oxidase alternativa (AOX). Nesta rota, a energia é perdida na forma de calor, há um grande consumo de O2 e uma produção elevada de ROS, que causa danos à célula (estresse oxidativo). Pelotas, RS, 2012. 135 7.6.2. Expressão gênica das famílias de genes PAL, C4H e 4CL Plantas submetidas a estresses bióticos e abióticos, como a incompatibilidade de enxertia por cianogênese, induzem a produção de grandes quantidades de ROS, gerando um estresse oxidativo que ocasiona uma série de distúrbios, inclusive a morte de células e consequentemente de tecidos. Porém, visando a sua própria proteção contra “super” produções de ROS, as plantas desenvolveram estratégias adaptativas antioxidantes para redução do dano oxidativo (Mitter, 2002; Saleh & Plieth, 2009; Gholizadeh & Kohnehrouz, 2010; Giró et al., 2011; Wang et al., 2012). A redução do estresse oxidativo gerado por altas concentrações de ROS pode ser realizada tanto pela ação de enzimas antioxidantes, como a peroxidase (POD), a ascorbato peroxidase (APX), a dehidroascorbato redutase (DHR), a glutationa redutase (GR), a superóxido dismutase (SOD) e a catalase (CAT) (Nocito et al., 2010), quanto por compostos antioxidantes, como os flavonóides e as antocianinas (Gao et al., 2008). Nocito et al. (2010), observaram que em combinações com incompatibilidade de enxertia causada pela cianogênese, houve um significativo incremento da atividade da APX, DHR, GR, SOD e CAT. Da mesma forma, a fim de verificar um possível incremento da atividade antioxidante na combinação incompatível, foram avaliadas neste trabalho as mudanças na expressão gênica de PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3, enzimas que coordenam a rota fenilpropanóide e que, consequentemente, regulam a produção de compostos fenólicos antioxidantes. O estudo de expressão constatou uma maior expressão de todos os genes avaliados, tanto na cultivar quanto no porta-enxerto da combinação incompatível (‘Chimarrita’/‘Umezeiro’). Por outro lado, os enxertos compatíveis apresentaram baixos níveis de expressão destes genes. Este resultado indica haver um importante incremento da atividade fenilpropanóide, voltada à produção de compostos fenólicos com ação antioxidante, como flavonóides e antocianinas, visando combater o estresse oxidativo gerado pelo acúmulo de ROS. Comportamento já verificado frente a uma série de formas de estresses por inúmeros autores (Mittler, 2002; Gholizadeh & Baghban, 2010; Nocito et al., 2010; Giró, et al., 2011; RubioWilhelmi et al., 2011). Inclusive, Pina & Errea (2008), verificaram uma maior 136 expressão da PAL associada ao aumento da concentração de compostos fenólicos em uniões incompatíveis de Prunus. Porém, mesmo com o aumento da capacidade antioxidante, caracterizada pela maior atividade de algumas enzimas, observadas por Nocito et al. (2010) e da expressão das enzimas PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3, produtoras de antioxidantes, apresentadas no presente estudo, a taxa de produção de ROS possivelmente continua sendo superior a capacidade antioxidante na combinação incompatível e, portanto, se mantém a condição de estresse oxidativo e, por consequência, de incompatibilidade. O papel da prunasina como agente causal, que desencadeia todo o processo de incompatibilidade de enxertia, ficou evidente na correlação entre os teores de prunasina no porta-enxerto e a expressão de todos os genes chave da rota fenilpropanóide na cultivar, da combinação incompatível (Figura 24). Essa análise, com índices de correlação elevados, fortalece a linha de raciocínio abordada na presente discussão, onde o enxerto parece estar sendo submetido a uma situação de estresse oxidativo, causado pela elevada liberação de cianeto e “super” produção de ROS na região de união. Esta situação explica o grande aumento da expressão dos genes que coordenam a rota fenilpropanóide e que são responsáveis pela biossíntese de compostos fenólicos antioxidantes (flavonóides e antocianinas), que atuam no controle do estresse oxidativo, e de compostos fenólicos estruturais (ligninas), que contribuem para a manutenção da união entre cultivar e porta-enxerto. Em geral, as famílias de genes PAL, C4H e 4CL apresentaram um perfil de expressão gênica muito semelhantes em relação aos diferentes níveis de compatibilidade de enxertia. A mesma tendência também foi observada por outros autores (Singh et al., 2009; Tuan et al., 2010). Este fato indica a existência de uma coordenação entre esses genes para a regulação da rota fenilpropanóides. 137 25 Expressão gênica relativa de PAL1 e PAL2 20 Prunasina vs PAL1 y = - 3,719 + 0,193x (R = 0,87) Prunasina vs PAL2 y = - 1,798 + 0,0756x (R = 0,91) 30 40vs C4H1 50 Prunasina y = -60 41,604 +70 1,608x (R80 = 0,90) 90 15 10 5 0 140 20 Expressão gênica relativa de C4H1 e C4H2 120 X Data Prunasina vs C4H2 y = - 23,951 + 0,909x (R = 0,93) 100 80 60 40 20 Expressão gênica relativa de 4CL1, 4CL2 e 4CL3 0 50 20 30 40vs 4CL1 50 y = - 7,353 60 + 0,293x 70 (R =80 0,86) Prunasina 40 X Data Prunasina vs 4CL2 y = - 14,157 + 0,532x (R = 0,91) 90 Prunasina vs 4CL3 y = - 5,091 + 0,208x (R = 0,904) 30 20 10 0 -10 20 30 40 50 60 70 80 90 Prunasina Figura 24. Correlação entre a concentração de prunasina no porta-enxerto ‘Umezeiro’ e a expressão dos genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3 na cultivar ‘Chimarrita’ (combinação incompatível). Pelotas, RS, 2012. 138 7.6.3. Análise filogenética das famílias de genes PAL, C4H e 4CL A família de genes PAL é relativamente pequena na maioria das espécies, com dois, três ou quatro genes como em Arabdopsis, mas há exceções, como o caso do tomate, onde foram verificados cerca de vinte e seis genes (Chang et al., 2008; Huang et al., 2010). No presente trabalho, o estudo da família de multigenes da PAL realizado em pessegueiro possibilitou identificar duas isoformas, PAL1 e PAL2. A análise filogenética das sequências de proteínas dos genes PAL de Prunus com as sequências de outras espécies, agrupou PAL1 e PAL2 próximas (Figura 20). Este resultado está de acordo com o que dizem alguns autores, que apontam PAL1 e PAL2 como pertencentes a uma mesma classe dentro da família das PAL, e que por isso possuem estrutura similar e consequentemente desempenham funções semelhantes (Raes et al., 2003; Rohde et al., 2004). A principal função atribuída a PAL1 e PAL2 na maioria das espécies é de coordenar a biossíntese de lignina (Raes et al., 2003; Souza & Abreu, 2007; Olsen et al., 2008; Huang et al., 2010). Em geral, a análise filogenética das sequências de proteínas dos genes PAL apresenta a formação de dois grupos, um composto pelas dicotiledôneas e outro pelas monocotiledôneas (Kumar & Ellis, 2001; Tuan et al., 2010), comportamento que também foi confirmado neste trabalho. Em geral, a família de genes C4H também é composta de poucos membros (Costa et al., 2003; Lucheta et al., 2007), e no genoma do pessegueiro não foi diferente, sendo identificados apenas C4H1 e C4H2. A identidade das duas isoformas foi confirmada pela verificação da sequência de proteínas PPGPIPVP, que segundo Betz et al. (2001), está presente nas C4H2 e não na C4H1 (Figura 25). Em virtude da similaridade filogenética, as sequências de proteínas dos genes C4Hs são distribuídos em duas classes (I e II) (Raes et al. , 2003; Lu et al., 2006; Liu et al., 2009), e na maioria das espécies, ambas isoformas pertencem à classe I (Raes et al. , 2003; Lu et al., 2006; Liu et al., 2009). Porém, no presente caso, enquanto C4H2 agrupou-se com outros membros da classe I, C4H1 apresentou maior similaridade com membros da classe II (Figura 21). Este resultado, embora não fora esperado, está de acordo com Nedelkina et al. (1999), que observaram essa mesma tendência para as espécies Zea mays e Phaseolus vulgaris. Inclusive se pode verificar que essas mesmas espécies estão agrupadas com C4H1 de P. 139 persica na classe II da árvore filogenética. A localização das C4Hs em grupos diferentes pode ser atribuída à estrutura diferencial dos dois genes, fato que provavelmente confere a ambos funções distintas. Há uma série de funções atribuídas à família C4H, como resposta a luz UV, ao ataque de patógenos, a estresses nutricionais e a ferimentos sofridos pela planta. Porém, a mais destacada é a sua realção com a biossíntese da lignina (Yang et al., 2005; Bjurhager et al., 2010; Cook et al., 2012). Neste sentido, Lu et al. (2006), estudando C4H1 e C4H2 em Populus tremuloides e P. trichocarpa, sugerem que há uma maior expressão de C4H1 em tecidos com predominância de lignina G (guaiacila), comum em órgãos tenros como caules jovens. Por outro lado, a C4H2 é mais expressa em órgão com predomínio de lignina S (siringuila), como tecidos fibrosos. C4H1 C4H2 C4H1 C4H2 C4H1 C4H2 C4H1 C4H2 -----------------------------------XPLSIPIFGNWLQVGNDLNHRLLAS 25 MDLLLLEKTLLGLFIAVIVAITISKLRGKRFKLPPGPIPVPVFGNWLQVGDDLNHRNLTD 60 *:.:*:********:***** *:. MSQTYGSIFLLKLGSKNLAVVSDPALATQVLHNQGIEFGSRPRNVVFDIFTGNGQDMVFT 85 LAKKFGDIFLLRMGQRNLVVVSSPDLAKEVLHTQGVEFGSRTRNVVFDIFTGEGQDMVFT 120 :::.:*.****::*.:**.***.* **.:***.**:*****.**********:******* IYGDHWRKMRRIMTLPFFTNKVVQHYSNMWEEEMDQVVHDLNKDEGAKTEGIVIRKRLQL 145 VYGEHWRKMRRIMTVPFFTNKVVQQYRHGWESEAAAVVEDVKKYPGSATNGMVLRRRLQL 180 :**:**********:*********:* : **.* **.*::* *: *:*:*:*:**** MLYNIMYRMMFNAKFESQEDPLFIEATRFNSERSRLAQSFEYNYGDFIPLLRPFLRGYLN 205 MMYNNMYRIMFDRRFESEEDPLFMKLKGLNGERSRLAQSFDYNYGDFIPILRPFLRGYLK 240 *:** ***:**: :***:*****:: . :*.*********:********:*********: C4H1 C4H2 KCRDLQSRRLAFFNHYFVEQRRKIMAANGEKHK-ISCAIDHIIDAQIKGEISEENVLYIV 264 ICKEVKEKRIRLFKDYFVDERKKLSSTKTTTNEGLKCAIDHILDAQQKGEINEDNVLYIV 300 *::::.:*: :*:.***::*:*: ::: .:: :.******:*** ****.*:****** C4H1 C4H2 ENINVAAIETTLWSMEWAIAELVNHPTIQRKIRDEIS-IVHKGAPVTESNLHELPYLQAT 323 ENINVAAIETTLWSIEWGIAELVNHPEIQKKLRDELDSVLGPGVQITEPDTQKLPYLQAV 360 **************:**.******** **:*:***:. :: *. :**.: ::******. VKETLRLHTPIPLLVPHMNLEEAKLGGYIIPKESKVVVNAWWLANNPAWWKDPEEFRPER 383 IKETLRLRMAIPLLVPHMNLNDAKLGSYDIPAESKILVNAWWLANNPALWKKPEEFRPER 420 :******: .**********::****.* ** ***::*********** **.******** C4H1 C4H2 C4H1 C4H2 C4H1 C4H2 FLDEECGTEAVAGGKVDFRYLPFGMGRRSCPGIILALPILGLVIAKLVSNFEMKAPQGVE 443 FLEEEAKVEANGN---DFRYLPFGVGRRSCPGIILALPILGITLGRLVQNFELLPPPGQS 477 **:**. .** .. ********:****************:.:.:**.***: .* * . KIDVSEKGGQFSLHIANHSTVVFNPIKA 471 KLDTTEKGGQFSLHILKHSTIVLKPRS- 504 Figura 25. Múltiplo alinhamento de sequências de proteínas dos genes C4H1 e C4H2 de P. persica, com identificação do motivo conservado PPGPIPVP. Pelotas, RS, 2012. As isoformas 4CL1 e 4CL2 foram agrupadas próximas, diferente da 4CL3, que está filogeneticamente distante (Figura 22). Segundo vários autores, a família 4CL pode ser dividida em três classes (I, II e II). As 4CL1 e 4CL2 pertencem à classe I e a 4CL3 à classe II, enquanto a classe III é formada por 140 monocotiledôneas (Ehlting et al, 1999; Endler, et a., 2008; Silber et al., 2008; Gaid et al., 2011). Neste estudo, foi observada a mesma divisão entre classes, sendo as 4CL1 e 4CL2 agrupadas na classe I e a 4CL3 na classe II. Classes diferentes estão associadas a funções distintas, desta forma, as 4CLs pertencentes a classe I, normalmente são mais expressas em órgãos lignificados, como o tecido do xilema, folhas, entrenós e raízes (Kumar e Ellis, 2003; Hu et al, 1998), indicando uma íntima participação dessas isoformas com o processo lignificação. Por outro lado, a classe II tem sido relacionada com a biossíntese de flavonóides e antocianinas (Hu et al, 1998; Cukovic et al 2001; Kumar e Ellis, 2003; Gaid et al., 2011), e por isso as 4CL3 tem apresentado maior expressão em órgãos como flores e frutas (Kumar e Ellis, 2003). Esta relação, entre expressão e função das 4CLs foi confirmada neste estudo, onde a expressão das 4CL1 e 4CL2 foi maior em tecidos da casca, altamente lignificados, enquanto em tecido de calo, com baixa concentração de lignina, a 4CL3 foi mais expressa (Figura 26). 4CL3 4CL2 Tecido da casca 4CL1 4CL3 4CL2 4CL1 Tecido de calo 100pb Figura 26. Expressão dos genes 4CL1, 4CL2 e 4CL3, em tecidos de calo (cultivados in vitro) e de casca. Pelotas, RS, 2012. Em geral, os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1 e 4CL2, apresentaram na análise filogenética, um comportamento similar ao relatado pela literatura, sugerindo uma participação ativa destas isoformas na biossíntese de lignina. Estes resultados associados a “super” expressão destes genes na combinação incompatível, sugere que, o engrossamento do caule na região de união, principalmente na cultivar, é devido a uma elevada produção de lignina pela planta, que busca estabilizar a união enfraquecida pela ação do cianeto. 141 Por outro lado, a maior expressão da 4CL3 na combinação incompatível pode estar associada á produção de flavonóides e antocianinas que podem estar atuando na diminuição do estresse oxidativo gerado pelo acúmulo de ROS. 142 7.7. Conclusões A incompatibilidade de enxertia entre P. persica e P. mume é causada pela prunasina, que quando hidrolisada, libera cianeto na interface do enxerto. O cianeto, que é especialmente prejudicial à espécie de menor capacidade cianogênica (P. persica), instala na planta uma situação de estresse oxidativo pelo acúmulo de ROS. Uma vez estressada, a planta busca sobreviver, ativando mecanismos de defesa que são regulados pela rota fenilpropanóide. Desta forma, há um aumento de expressão das três famílias de genes (PAL, C4H e 4CL) que coordenam esta via, aumentando a produção de compostos antioxidantes e estruturais, que buscam combater o estresse oxidativo e manter a união estável. 143 7.8. Referências bibliográficas Andersen, C.L., Jensen, J.L., Orntoft, T.F., 2004. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Adv. Cancer Res. 64, 5245-5250. Apel, K., Hirt, H., 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu Rev Plant Biol. 55, 373-399. Arora, A., Sairam, R.K., Srivastava, G.C., 2002. Oxidative stress and antioxidative system in plants. Curr. Sci. 82, 1227-1238. Bell-Lelong, D.A., Cusumano, J.C., Meyer, K., Chapple, C., 1997. 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Entretanto, não ficou claro se essa diferença é a causa ou apenas uma consequência da incompatibilidade. Por tanto, foram propostas duas hipóteses para estudos subsequentes: a) A maior expressão de PAL1 e PAL2 na combinação incompatível gera desequilíbrio na produção de compostos fenólicos de forma a causar incompatibilidade de enxertia; e b) A maior expressão de PAL1 e PAL2 na combinação incompatível é um reflexo do estresse gerado pelo verdadeiro agente causador da incompatibilidade, que ainda é desconhecido. O Artigo 2, cujo título é “Cianogênese, a causa da incompatibilidade de enxertia em Prunus”, avalia o mecanismo de incompatibilidade por cianogênese através da determinação da concentração dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina na cultivar e no porta-enxerto das combinações. Sendo constatado que a incompatibilidade presente entre P. persica e P. mume é devido à maior concentração de prunasina em P. mume (porta-enxerto ‘Umezeiro’). Ao mesmo tempo, observou-se, que há uma correlação altamente significativa entre o mecanismo de incompatibilidade por cianogênese e a alteração do perfil de compostos fenólicos. Fato que ajuda a responder a questão pendente do Artigo 1, indicando que a hipótese mais provável é de que as alterações no perfil fenólico sejam uma consequência da incompaibilidade por cianogênese. Já o Artigo 3, intitulado “Expressão gênica de PAL, C4H e 4CL em resposta a incompatibilidade de enxertia por cianogênese”, estuda a incompatibilidade por cianogênese e as alterações na composição fenólica como um mecanismo único de incompatibilidade de enxertia. Este último trabalho mostra que a incompatibilidade por cianogênese causa alterações na via respiratória que desencadeiam uma série de processos metabólicos que culminam em uma situação de estresse oxidativo, 149 especialmente para o genótipo de menor potencial cianogênico (P. persica). Como forma de defesa contra esse estresse, a planta ativa a rota fenilpropanóide, responsável pela produção de compostos fenólicos, produzindo compostos antioxidantes para a diminuição do estresse oxidativo, e de ligninas para a manutenção da estrutura da união do enxerto. Com base nos resultados gerais apresentados e discutidos nos três artigos deste trabalho, pode-se concluir que: • As combinações ‘Chimarrita’/’Umezeiro’ e ‘Maciel/Umezeiro’ são incompatíveis. Entretanto, o grau de incompatibilidade não é total e a morte de plantas foi verificada apenas em situações de estresse hídrico severo. Sendo assim, acredita-se que em situações onde essas mesmas combinações sejam cultivadas em condições ótimas de fertilidade do solo, irrigação e sanidade, o grau de incompatibilidade manifestado pode não ser limitante; • A incompatibilidade observada entre P. persica e P. mume é resultado de uma diferença quantitativa dos glicosídeos cianogênicos amigdalina e prunasina, onde a espécie P. mume possui maior concentração; • O glicosídeo cianogênico prunasina é um marcador bioquímico viável e estável para a diagnose da incompatibilidade de enxertia entre espécies de Prunus. Constatando-se que combinações com diferenças elevadas entre as concentrações de prunasina na cultivar e no porta-enxerto não são recomendadas. • Em resposta ao estresse gerado pela cianogênese há uma “super” expressão das famílias de genes fenilalanina amônia-liase (PAL), cinamato 4-hidroxilase (C4H) e 4-cumarato:CoA ligase (4CL); e • Os genes PAL1, PAL2, C4H1, C4H2, 4CL1, 4CL2 e 4CL3 apresentaram uma importante relação com a incompatibilidade de enxertia em Prunus, podendo ser empregados como indicadores de incompatibilidade de enxertia. Trabalhos futuros, sobre o mecanismo de incompatibilidade de enxertia por cianogênese, devem ser realizados em uma gama maior de combinações, envolvento distintas espécies de Prunus. 150 9. Referências bibliográficas AGRIANUAL 2010. Hortifrutículas. Agrianual 2010: Anuário da agricultura brasileira, São Paulo, p.440-446, 2010. AGUSTÍ, M. Fruticultura., Madrid: Mundi-prensa, 2004. 493p. ALONI, B.; COHEN, R.; KARNI, L.; AKTAS, H.; EDELSTEIN, M. 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