samuel porfírio xavier

Transcrição

SAMUEL PORFÍRIO XAVIER
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA
BIOCOMPATIBILIDADE DO TITÂNIO SUBMETIDO A
DIFERENTES TRATAMENTOS DE SUPERFÍCIE
Introdução
SAMUEL PORFÍRIO XAVIER
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA
BIOCOMPATIBILIDADE DO TITÂNIO SUBMETIDO A
DIFERENTES TRATAMENTOS DE SUPERFÍCIE
Orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Perri de Carvalho
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Araçatuba da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte
dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Odontologia - Área
Ciurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial.
Araçatuba
2002
2
Introdução
3
DADOS CURRICULARES
Samuel Porfírio Xavier
Data de Nascimento: 18 de maio de 1969
Filiação: Sebastião Xavier e Maria Alice Porfírio Xavier
Endereço: Av. José Herbert Faleiros n. 85 casa 127, Condomínio Aroeira, Ribeirão
Preto –S.P.
Graduação: 1988/1992- Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP – USP)
Aprimoramento em Odontologia Hospitalar (1993/1994) e Cirurgia e Traumatologia
Buco-Maxilo-Facial (1994/1995)- Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo- S.P.
Título de Especialista: 1995- Colégio Brasileiro de Cirurgia e Traumatologia BucoMaxilo-Facial
Membro Aspirante do Colégio Brasileiro de Cirurgia e Traumatologia Buco-MaxiloFacial desde 1995
Especialização em Anatomia Cirúrgica da Face: 1994/1995- Instituto de Ciências
Biomédicas da USP-S.P.
Mestrado: 1995/1996- Área de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial
Faculdade de Odontologia de Araçatuba –UNESP
Função: Professor Assistente em RDIDP do Departamento de Cirurgia e
Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da FORP-USP desde novembro de 1996
Doutorado: 1999/2002- Área de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial
Faculdade de Odontologia de Araçatuba –UNESP
Introdução
4
Dedicatória
Introdução
5
Aos meus pais Sebastião e Maria Alice, presentes
em todos os momentos.
À toda minha família pelo incentivo incondicional.
Introdução
6
Agradecimentos
Introdução
7
Ao Prof. Dr. Paulo Sérgio Perri de Carvalho, meu
orientador, pelo apoio, paciência e compreensão. Meus sinceros
agradecimentos.
Ao Prof. Dr. Adalberto Luiz Rosa, por possibilitar a
realização de grande parte deste trabalho no Laboratório de
Cultura de Células da FORP-USP, e pela intensa e ativa
participação no decorrer de todas as fases de sua elaboração.
Meu respeito e gratidão.
Ao colega Cirurgião-Dentista Márcio Mateus Beloti,
pela fundamental cooperação no desenvolvimento desta pesquisa.
Aos colegas professores do Departamento de Cirurgia e
Traumatologia Buco-Maxilo-Facial e Periodontia da FORP-USP,
Drs. Valdemar Mallet da Rocha Barros, Luiz Antônio Salata
e Cássio Edvard Sverzut, que me apoiaram para realização
deste estudo.
À todos os professores do Curso de Pós-Graduação
em Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da FOA-UNESP,
com quem tive o prazer e satisfação de conviver e aprender.
Introdução
8
Aos funcionários da FOA-UNESP, pelo convívio,
disponibilidade e auxílio prestados durante todo o Curso de PósGraduação em Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial, em
especial às secretárias Isabel, Cláudia, Marina e Adélia.
Aos amigos André Lorenzetti, Cinthia de Oliveira Carlos,
Juliano Pratti Mercantil, Marcos Ribeiro Soares e Marconi
Gonzaga Tavares, pelo companheirismo de sempre.
À todos aqueles que não somente estiveram próximos
nas boas fases, mas que compreenderam e suportaram meus
momentos de ausência, “stress”, tristeza ou mau humor, e que
tiveram
para
comigo
muita
paciência
e
carinho,
quero
compartilhar a alegria da finalização de mais esta etapa.
O reconhecimento é a memória do coração...
Adágio Popular
Introdução
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ........................................................ 01
REVISÃO DA LITERATURA................................. 04
PROPOSIÇÃO .......................................................... 35
MATERIAL E MÉTODO......................................... 37
RESULTADO ........................................................... 48
DISCUSSÃO............................................................. 69
CONCLUSÃO .......................................................... 79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................... 81
RESUMO ................................................................ 102
ABSTRACT ............................................................ 104
9
Introdução 10
LISTA DE ABREVIATURAS
• ALP: fosfatase alcalina
• ANOVA: análise de variância
• BMP: proteína óssea morfogenética
• cpTi: titânio comercialmente puro
• EDTA: ácido etilenodiaminatetracetico di-sódico
• F: razão entre a fonte de variação entre tratamentos e
a fonte de variação dentro dos tratamentos
• FGF: fator de crescimento de fibroblastos
• GH: hormônio de crescimento
• gl: grau de liberdade
• h: hora
• IGF-I: fator de crescimento insulina-símile-I
• LiTi: liga de Ti-Al-V
• M: molar
• MBS: meio básico suplementado
• MEV: microscopia eletrônica de varredura
• ML: meio de lavagem
• MTS: meio total suplementado
• µg: micrograma
• µmol: micromol
• mg: miligrama
• ml: mililitro
• mm: milímetro
• mM: milimolar
Introdução 11
• n: número de amostras
• nm: nanometro
• p: nível de significância
• PBS: salina tamponada com fosfato
• Ra : rugosidade
• Ti: titânio
Introdução 12
INTRODUÇÃO
Introdução 13
INTRODUÇÃO
A implantodontia fornece uma solução confiável e segura para a substituição
de dentes ausentes. Embora a taxa de sucesso dos implantes seja alta, ocasionalmente
eles podem falhar. A maioria dessas falhas ocorrem nos períodos iniciais após a
implantação ou no primeiro ano de suporte de carga (Jemt et al., 1989; Zarb &
Schmitt, 1990; Quirynen et al., 1991, 1992; Naert et al., 1991, 1992; Gotfredsen et
al., 1993; Jemt & Lekholm, 1993; Wiesmeyer et al., 1995). Além do mais, sabe-se
que as respostas biológicas à superfície dos implantes nas fases primárias da
osseointegração são de fundamental importância para o sucesso clínico dos implantes
endósseos (Kieswetter et al., 1996).
Um dos principais objetivos da atual pesquisa em implantodontia é o
desenvolvimento de artifícios que induzam à uma reparação óssea rápida, guiada e
controlada. Mais especificamente, além de acelerar o fenômeno de reparação, os
implantes deveriam resultar em uma matriz interfacial com composição e estrutura
características de tecido ósseo com propriedades biomecânicas adequadas. Estes
resultados permitiriam não somente a recuperação mais rápida do paciente, mas
também a fixação estável entre o osso e o implante, que forneceria a possibilidade da
instalação de carga protética imediata ou precoce sobre o implante. Estes pontos são
de grande significância em termos de diminuição do tempo de tratamento e de
morbidade, melhor aspecto psicológico do paciente e diminuição dos custos (Puleo
& Nanci, 1999).
Introdução 14
Uma das formas de prevenir as falhas primárias dos implantes seria a de
otimizar o comportamento osseointegrador do Ti (Castellani et al., 1999). Isto
poderia ser alcançado pela compreensão das características de superfície dos
implantes, como a determinação dos efeitos da energia de superfície, composição,
rugosidade e topografia sobre as respostas biológicas iniciais, como a proliferação
celular, diferenciação, produção de matriz extracelular, maturação e calcificação
óssea (Kieswetter et al., 1996).
Na tentativa de melhorar a quantidade e qualidade da interface osso-implante,
numerosas modificações de superfície têm sido propostas, sendo muitas destas
baseadas na teoria de que uma melhor e mais rápida osseointegração pode ser
alcançada por alguma alteração da topografia ou rugosidade do implante
(Klokkevold et al., 1997). Para Carvalho et al. (2001), as características da superfície
do titânio são um aspecto importante a ser considerado, em virtude da sua capacidade
de receber diferentes tipos de tratamento com o objetivo de melhorar a qualidade da
interface e, como defendem alguns pesquisadores, diminuir o período não funcional
do implante.
Segundo Kilpadi et al. (1998), a ampla variedade de protocolos de
tratamentos de implantes de Ti implicam na contínua necessidade de se caracterizar
as superfícies, a fim de determinar as respostas biológicas correspondentes.
REVISÃO DA LITERATURA
Revisão da Literatura 16
REVISÃO DA LITERATURA
Observando a história humana, verficamos várias tentativas de tratamento
para a reposição de dentes ausentes. Descorbertas antropológicas no Oriente
próximo, América Central e Europa evidenciaram a tentativa do homem de repor
dentes perdidos utilizando materiais homólogos e aloplásticos, incluindo dentes
humanos e de animais, osso esculpido, pedaços de marfim, pedras e pérolas.
Aparentemente, o propósito de repor dentes era puramente estético. Em termos de
função mastigatória, estas reposições eram pouco ou nada eficientes (Bobbio, 1957;
Bobbio, 1973; Spiekermann et al., 2000).
Com o desenvolvimento da tecnologia em implantologia, que continuamente
evolui com novas descobertas e pesquisas, foi que começamos a compreender
melhor os princípios biológicos que comandam o desenvolvimento da interface
dinâmica entre o tecido vivo e uma estrutura artificial (Sykaras et al., 2000).
Atualmente, os implantes endósseos são bem aceitos como uma modalidade
de tratamento para reconstrução de estruturas da cavidade bucal e maxilofaciais,
servindo como elementos transmucosos de apoio para coroas de dentes unitários
(Sabri, 1998), dentaduras parciais fixas (Knabe & Hoffmeister, 1998), reconstruções
completas de arcadas dentárias (Balshi et al., 1999), de próteses totais removíveis
(Mericske-Stern, 1998), para reconstruir defeitos maxilofaciais (Nishimura et al.,
1998), como pilares de ancoragem para tratamentos ortodônticos e para o processo
de distração osteogênica (Brunski et al., 2000).
Vários metais e ligas metálicas usados para a fabricação de implantes dentais
têm produzido reações adversas nos tecidos, e seus baixos índices de sucesso
praticamente os afastaram da aplicação clínica. Muitos dos metais e ligas metálicas
como ouro, aço inoxidável, liga de cromo-cobalto, são hoje obsoletos para a indústria
da implantologia oral (Sykaras et al., 2000).
Titânio
O titâno comercialmente puro (cpTi) e as ligas de titânio com alumínio e
vanádio (Ti-Al6-V4), se tornaram os metais de escolha para confecção da parte
endóssea de implantes dentais. Tais metais têm sido utilizados, entre outros fatores,
devido a propriedades biomecânicas, possibilidades de tratamento e acabamento do
implante, assim como pela facilidade para procedimentos de esterilização (Ravnholt,
1988).
O primeiro relato da descoberta do elemento titânio é atribuído a Wilheim
Gregor, um mineralogista amador no ano de 1791. Passaram-se mais de 150 anos
para que o titânio se tornasse um metal disponível para utilização industrial,
principalmente devido à dificuldade do processo de extração do titânio dos minerais.
A partir das décadas de 1930 e 1940 é que foi possível se realizar o processamento
comercial do metal. Por apresentar apenas 60% do peso do aço e excelentes
propriedades mecânicas como resistência à corrosão e às variações de temperatura,
além de permitir sua manufatura nas mais diversas formas requeridas, o metal puro e
suas ligas vêm sendo utilizados tanto nas indústrias aero-espacial e química, assim
como para a confecção de implantes cirúrgicos (Williams, 1981b).
Quando exposto ao ar, o titânio reage formando uma camada de óxido de
titânio imediatamente (10-9 segundos) que alcança a expessura de 2 a 10 nm, o que
fornece resistência à corrosão (Ducheyne, 1988; Donley & Gillette, 1991). É esta
camada superficial de óxido é que fornece a base de sua excepcional
biocompatibilidade (Pilliar & Weatherly, 1986; Lautenschlager & Monaghan, 1993).
O cpTi tornou-se conhecido como o metal não nobre mais resistente à
corrosão, uma propriedade resultante da formação da camada de óxido de titânio que
se forma expontaneamente sobre sua superfície. Similar resistência à corrosão pode
ser observada também em ligas de Ti-Al6-V4 (Williams, 1981b).
Embora
resistência
à
corrosão
seja
um
pré-requisito
para
a
biocompatibilidade do material, ela não a garante necessariamente. Outras
propriedades são de crucial importância. A reputação do titânio como material
biocompatível foi baseada principalmente em dois fatores: em sua excelente
resistência à corrosão, que limita a quantidade de íons titânio liberados nos tecidos na
maioria das circunstâncias, e na sua inatividade biológica, algumas vezes
denominada “indiferença biológica”, onde sinais da presença do metal parecem não
influenciar os tecidos (Williams, 1994).
A condição de pureza química e de limpeza da superfície da camada de óxido
de titânio é considerada de suprema importância para o resultado biológico da
osseointegração (Albrektsson et al., 1981; Baier et al., 1984). Entretanto, os efeitos
negativos da contaminação da superfície dos implantes tem sido relatados na
literatura como resultado de deficiências nos processos de produção ou de
esterilização dos mesmos (Hartman et al., 1989; Ameen et al., 1993).
Segundo as normas da ASTM (1997), a composição estequiométrica do cpTi
permite sua classificação em 4 graus, dependendo principalmente do conteúdo de
oxigênio entre outros elementos com o ferro. Enquanto o grau I é mais puro e
maleável, o grau IV possui alguns contaminantes em graus aceitáveis e é mais rígido
(Carvalho et al., 2001).
Albrektsson (1985) relata que existem diferenças mecânicas entre os
diferentes graus de pureza do Ti, devido a contaminantes presentes em quantidades
mínimas. Traços de outros elementos como nitrogênio, carbono, hidrogênio, e ferro
têm sido detectados ou adicionados para o melhoramento de propriedades mecânicas
e físico-químicas dos implantes.
O ferro pode ser adicionado para fornecer resistência à corrosão e alumínio
para aumentar resistência mecânica e diminuir a densidade, enquanto o vanádio atua
como um retentor do alumínio e para prevenir corrosão (Williams, 1981a; Meffert et
al., 1992).
O Ti foi descrito como sendo um biomaterial seguro, que pode ser
efetivamente utilizado com um mínimo risco em muitas condições bem definidas.
Fora destas situações, principalmente quando grandes quantidades de titânio são
liberadas como resultado de deterioração ou desgaste, um nível de titânio pode ser
observado no sangue ou nos tecidos, embora a significância clínica e toxicológica
destes fatos ainda não sejam claras (Williams, 1994).
Williams (1994) ainda ressaltou que nenhum material é totalmente
biocompatível, e entre eles inclui-se o titânio. Porém, se utilizado apropriadamente,
este pode realizar uma performance de alto nível e desenvolver um ótimo
comportamento.
Entretanto, foi somente a partir da década de 1960 é que os fundamentos
científicos da implantologia em odontologia se desenvolveram. Àquela época,
estudos microscópicos em cicatrização de feridas ósseas iniciados pelo Professor
Branemark e colaboradores, utilizando câmaras de titânio, deram origem ao conceito
de osseointegração (Branemark et al., 1969).
Osseointegração
Os dados atuais da implantologia em odontologia demonstram que o sucesso
clínico dos implantes está diretamente associado ao fenômeno da osseointegração
(Glantz, 1998), inicialmente definido como “uma direta conexão estrutural entre um
tecido ósseo vivo e organizado e um implante funcional ao microscópio óptico”
(Branemark et al., 1969; Adell et al., 1981; Branemark, 1985).
Estudos iniciais indicavam que esta interface, quando entre Ti e osso, era rica
em glicosaminoglicanas (Linder, 1985). Trabalhos mais recentes de imunohistoquímica demonstraram que esta zona afibrilar é rica em proteínas não
colagenosas, como osteopontina (OPN), sialoproteína óssea (BSP) e proteínas do
plasma como a α2HS-glicoproteína (Ayukawa et al., 1998; Nanci et al., 1998).
Segundo Davies (1998), os mecanismos pelos quais os implantes intra-ósseos
de Ti se integram ao osso podem ser divididos em três diferentes fenômenos: a
osteocondução, a neo-formação óssea e a remodelação. Durante a fase
de
osteocondução ocorre a migração de células osteogênicas em diferenciação,
provenientes
de
tecido
ósseo
vizinho
e
tecido
conjuntivo
peri-vascular
indiferenciado, para a superfície do material. A migração das células ocorre através
da rede de fibrina que se forma pela resolução do coágulo sanguíneo presente entre o
osso e o implante. Assim, a superfície do implante se torna colonizada por uma
população de células osteogênicas antes do início da produção de matriz óssea. A
seguir, inicia-se a neo-formação óssea (“de novo bone formation”), a partir da
secreção de uma matriz orgânica sem colágeno pelas células osteogênicas. Tal
matriz,
constituída
principalmente
pelas
proteínas
osteopontina
(OPN)
e
sialoproteína óssea (BSP), fornece sítios para a nucleação de fosfato e cálcio, sendo
seguida pela formação de cristais, e só então haverá a formação de colágeno a sua
subsequente mineralização. A terceira fase de cicatrização, a remodelação óssea, é de
particular importância para a estabilidade a longo prazo de um implante.
Por esta cascata de eventos, o compartimento colágeno da matriz óssea se
torna separado da superfície do implante por uma camada de tecido calcificado não
colagenoso de cerca de 0,5 micrometros (Davies, 1998). Esta zona interfacial é
denominada linha cementária (laminae limitantes) pois se assemelha à estrutura
observada em interfaces ósseas naturais (Davies, 1996; Davies, 1998; Puleo &
Nanci, 1999).
As linhas cementárias foram relatadas inicialmente pelo histologista alemão
von Ebner em 1875, que descreveu a matriz interfacial mineralizada posicionada
entre o tecido ósseo e osso neoformado ( von Ebner apud Davies, 1996). A espessura
das linhas cementárias varia de 0,2 micrometros a 5 micrometros, e esta variabilidade
parece estar relacionada a espécie estudada, espessura do corte (Philipson, 1965),
variações individuais (Villanueva et al., 1986), e ao método utilizado para a
avaliação (Sokoloff, 1973).
Embora a espessura e a aparência da linha cementária variem, esta camada
parece se formar independente do tipo de biomaterial implantado, como cpTi, HA e
aço inoxidável (Nanci et al., 1998). Osteoblastos, tecido osteóide e matriz
mineralizada são observados adjacentes à camada laminae limitantes, sugerindo que
tecido ósseo é depositado diretamente sobre a superfície de um implante (Linder,
1985; Albrektsson & Hanson, 1986).
Desta forma, a formação de tecido ósseo em contato com o implante ocorre
em duas direções: não somente em direção ao biomaterial, mas também se
extendendo a partir do implante em direção ao tecido ósseo cicatricial (Puleo &
Nanci, 1999).
Fatores que interferem na osseointegração
O desenvolvimento da interface osso-implante de integração é complexo e
envolve numerosos fatores. Dentre eles incluem-se não somente aqueles relacionados
ao implante como material, forma, topografia e química de superfície, mas também a
carga mecânica, técnica cirúrgica, e as variáveis do paciente como quantidade e
qualidade óssea (Puleo& Nanci, 1999).
Muitas facetas da topografia de superfície de um implante são importantes
para a performance biológica dos diferentes materiais. É considerável a variação de
“designs” e topografias de superfície, como observado no estudo de 13 tipos de
implantes dentais comercialmente disponíveis no mercado (Wennerberg et al., 1993).
Nos últimos anos, os implantes cilíndricos, preferencialmente rosqueados,
têm dominado o mercado de implantes (Albrektsson, 1993). Esta situação se deve
aos resultados experimentais favoráveis observados a longo prazo, uma vez que a
introdução de roscas aos implantes cilíndricos aumenta a estabilidade do implante
significativamente (Frandsen et al., 1984). Os implantes em forma de parafuso
apresentam um contato mais íntimo com o osso do que implantes cilíndricos sem
roscas (Carlsson et al., 1986). Diferentes tipos de modelos de rosca têm sido
introduzidos com o mesmo objetivo: estabelecer uma fixação estável entre o osso e o
implante, e melhorar a transferência de carga (Ellingsen, 1998).
Em implantologia oral, um período de cicatrização de cerca de 3 a 6 meses,
livre de carga funcional, é aceito como sendo um tempo pré-requisito para se
alcançar a aposição óssea junto ao implante sem a interposição de tecido fibroso
cicatricial (Branemark et al., 1977).
Embora a colocação de carga imediata ou precoce sobre um implante, venha
sendo interpretada com um fator de indução de formação de tecido fibroso
interposicional, não é a carga imediata por si a responsável pelo encapsulamento
fibroso (Szmukler-Moncler et al., 1998; Szmukler-Moncler et al., 2000). Seria o
excesso de micro movimentação do implante durante a fase de reparação que
causaria interferência no processo da osseointegração, e este limite crítico estaria
entre 50 e 150µm (Szmukler-Moncler et al., 2000).
Após a implantação, os eventos iniciais que ocorrem na interface ossoimplante determinam a falha ou o sucesso dos implantes. Imediatamente após a
implantação ocorrem dissolução e/ou precipitação de íons, adsorção de lipídios,
açúcares e proteínas, adesão e proliferação celular e deposição de produtos de
secreção das células (Ducheyne et al., 1992). Tais interações levam à deposição de
uma camada de macromoléculas sobre o implante metálico, sendo esta composta por
elementos do plasma e da matriz extracelular, como fibrinogênio / fibrina,
fibronectina e outras glicoproteínas ou glicosaminoglicanas, que irão modular as
subseqüentes respostas celulares (François et al., 1997).
Neste contexto, a fibronectina, uma glicoproteína encontrada no sangue e no
tecido conjuntivo, apresenta um papel importante nas reações da interface osso-
implante. Sabe-se que a fibronectina é uma proteína multifuncional que reconhece
diversos tipos celulares, inclusive bactérias (François et al., 1997). Localizada na
parte central da molécula, a sequência peptídica de aminoácidos RGD (argininaglicina- aspartato) é reconhecida pelo receptor da integrina fibronectina de vários
tipos celulares eucariontes, com a função de adesão celular (Ruoslahti,1988).
Dentre as propriedades da fibronectina, destaca-se em particular a habilidade
de promover adesão de fibroblastos e osteoblastos à superfícies de biomateriais,
incluindo o titânio de implantes dentais (Schneider & Burridge, 1994; François et al.,
1997).
Propriedades de superfície dos implantes de Ti
Para ocorrer a formação de tecido ósseo é necessário que haja o recrutamento
e a proliferação de células precursoras de osteoblastos, que as mesmas se diferenciem
em osteoblastos e produzam matriz extracelular não mineralizada, que será
subseqüentemente calcificada (Schwartz & Boyan, 1994). Estes eventos são bastante
influenciados por algumas propriedades da superfície dos implantes de Ti, tais como,
a composição química, energia de superfície e a textura da superfície, uma
combinação entre topografia e rugosidade (Schwartz & Boyan, 1994).
Composição Química
Em odontologia, o cpTi tem se tornado um dos materiais para a confecção do
corpo do implante mais usados pelo seu melhor comportamento biológico, enquanto
a liga de Ti-Al6-V4 encontra mais utilidade na ortopedia devido às suas
características de maior resistência mecânica (van Noort, 1987; Grabowsky et al.,
1989).
A liga de Ti apresenta propriedades mecânicas superiores superiores àquelas
do cpTi (Keller & Lautenschlager, 1986 apud Keller et al., 1994) e a caracterização
da superfície por meio de vários métodos mostrou que não há diferença entre ambas
(Keller et al., 1994). Entretanto, as avaliações da biocompatibilidade in vivo e in vitro
de cpTi e liga de Ti com tecido ósseo ou cultura de osteoblastos apresentam
resultados discrepantes. Para implantes de cpTi e liga de Ti na forma de parafusos
implantados em fêmures de ratos e tíbias de coelhos, foi demonstrado que o tecido
formado na interface implante-osso apresenta maior aderência ao cpTi do que à liga
de Ti (Orr et al., 1992) e que para a remoção de parafusos de cpTi é necessário
exercer uma força de torque maior (Han et al., 1998). Além disso, foi observada
maior superfície de contato osso-implante nos parafusos de cpTi (Han et al., 1998).
Por outro lado, nas avaliações in vitro utilizando cultura de osteoblastos, não foram
detectadas diferenças entre cpTi e liga de Ti na adesão e morfologia celulares (Keller
et al., 1994), na atividade de fosfatase alcalina e síntese de osteocalcina (Kim et al.,
1997) e na produção de matriz mineralizada (Bouvier et al., 1994). No entanto,
nenhum desses estudos in vitro avaliou todas as fases de formação de matriz
mineralizada, que envolvem a adesão, a proliferação, a diferenciação celulares e a
mineralização da matriz extracelular (Cooper et al., 1998).
Apesar da camada de óxido de titânio se formar tanto sobre a superfície do
cpTi quanto do Ti-Al6-V4, é improvável que sejam idênticas. Certamente o
mosaicismo dos componentes da liga de Ti resultam numa química de superfície
mais complexa (Lincks et al., 1998). Segundo Keller et al. (1994) a camada de TiO2
é mais espessa na liga de Ti além de poder conter alumínio sobre esta, sendo que
estes fatores não implicariam em uma resposta biológica significante em termos de
adesão e morfologia celulares.
Recentemente, estudos usando cultura de fibroblastos demonstraram que a
liberação de íons de Vanádio, a partir de superfícies de liga de Ti, causariam um
impacto negativo na adesão celular (Eisenbarth et al., 1996). Thompson & Puleo
(1996) também mostraram que íons liberados pela liga de Ti podem inibir o fenótipo
osteogênico de células do estroma medular ósseo in vitro, sugerindo que a liberação
de íons a partir dos implantes poderia prejudicar a formação óssea.
Métodos imuno-histoquímicos de marcação tornaram possível a detecção de
linfócitos T ativados em associação com macrófagos acessórios em tecidos ao redor
de implantes ortopédicos de liga de titânio, demonstrando resposta imunológica
(Lalor & Revell, 1993). Outras observações in vitro foram feitas a respeito da
liberação por macrófagos, de mediadores de reabsorção como prostaglandina E2 e
interleucina 1, em associação a partículas de desgaste de liga de titânio-alumíniovanádio (Haynes et al., 1993).
Desde que Blumenthal & Posner (1984) relataram a inibição da formação de
cristais de apatita in vitro na presença de íons de Al, uma preocupação considerável a
respeito dos biomateriais seria o efeito potencial da liberação de alumínio pelas ligas
de Ti durante o desenvolvimento e manutenção da osseointegração.
Taborelli et al. (1997) apresentaram um estudo físico-químico das
propriedades do cpTi submetido à vários tratamentos designados para otimizar sua
topografia para aplicação em implantologia oral. A rugosidade, composição química
da superfície e umectabilidade foram analisados em espécimes de Ti preparados por
polimento mecânico, ataque ácido (HCl / H2SO4), jateamento de areia e ataque ácido
e spray de plasma de Ti. A espectroscopia eletrônica mostrou que todas as amostras
possuíam TiO2 e quantidades menores de C, S, Si e Ca como impurezas. Os
espécimes que sofreram ataque ácido apresentaram uma camada contendo hidrogênio
abaixo da camada superficial de óxido. Os tratamentos realizados neste estudo
influenciaram essencialmente a rugosidade de superfície, mas preservaram a
composição química e as propriedades de umectabilidade da camada superficial de
óxido de Ti.
Energia de Superfície
Para Doundoulakis (1987) e
den Braber et al. (1995), a aplicação de
tratamentos sobre a superfície do Ti pode modificar as propriedades de
umectabilidade (energia de superfície ou hidrofilia) e a performance biológica sobre
este, além de poder modificar a topografia de superfície (Kilpadi et al., 1998).
Segundo den Braber et al. (1995), vários estudos têm sido realizados para se
tentar explicar a influência da energia de superfície de um material de implante
sobre o comportamento celular. A teoria mais amplamente aceita é a de que estas
propriedades têm um efeito seletivo sobre a configuração e conformação das
proteínas que são adsorvidas sobre um substrato (Baier & Meyer, 1988; Uitto et al.,
1992). Estas proteínas desenvolvem uma importante função durante a adesão celular
(den Braber et al., 1995). Neste contexto, também observa-se que a umectabilidade
de uma superfície de um implante é primariamente determinada pela natureza da
camada mais externa de átomos do material, sendo independente da natureza química
ou do arranjo de átomos e moléculas interiores (Phillips, 1991).
A mensuração do grau de umectabilidade é um dos parâmetros de avaliação
de biocompatibilidade de um material (Lampin et al., 1997). Tal medida é expressa
pelo do ângulo de contato que um líquido (geralmente água) forma sobre a superfície
do material (Keller et al., 1994, Lampin et al., 1997).
As características das superfícies dos implantes, assim como propriedades
específicas de proteínas do meio intercelular, contribuem para a organização da
camada de proteínas adsorvidas, e a natureza desta determinar a resposta celular aos
implantes (Lampin et al., 1997). As moléculas envolvidas na adesão e proliferação
celulares incluem moléculas da matriz extracelular, receptores trans-membrana e
componentes do citoesqueleto intracelular. Dentre as proteínas do soro, a
fibronectina e a vitronectina têm sido relacionadas à promoção da adesão celular e
reorganização dos microfilamentos de actina (Puleo & Bizios, 1992; Degasne et al.,
1999). Por outro lado, a albumina humana apresenta uma alta afinidade pelo Ti
(Klinger et al., 1997) e é uma proteína não adesiva para os osteoblastos (Puleo &
Bizios, 1992).
A associação de fatores do soro com a superfície do material, previamente à
deposição local de células, é influenciada pela energia de superfície, que é sensível à
rugosidade e topografia da superfície do implante (Boyan et al., 1996). Dentre as
proteínas do soro, destacam-se a albumina, que age como um carreador para
proteínas menores, lipídios e mantenedor tampão do pH do sangue, e a fibronectina,
que está envolvida com a adesão celular. A concentração de albumina no soro
humano é cerca de 100 vezes maior do que a de fibronectina. A albumina seria a
primeira proteína a chegar sobre a superfície de uma amostra devido à sua alta
concentração e ao seu baixo peso molecular (Deligianni et al., 2001).
As superfícies hidrofílicas apresentam, de maneira geral, uma melhor
afinidade por células e menor afinidade por proteínas (principalmente albumina) do
que superfícies hidrofóbicas (Lampin et al., 1997), e este aumento no grau de
umectabilidade melhora a interação entre a superfície do implante e o meio biológico
(Baier et al., 1984).
Kilpadi & Lemons (1994) observaram que superfícies de cpTi que sofreram
passivação por ácido nítrico a 30% por 20 minutos à temperatura ambiente (ASTM,
1976) apresentavam uma maior energia de superfície.
Kilpadi et al. (1998) avaliaram os efeitos da mesma passivação e do processo
de esterilização à seco (205oC por 3 horas) sobre a topografia e a energia de
superfície de implantes de cpTi grau II. Os autores observaram que os valores de
rugosidade foram menores nas superfícies que foram esterilizadas sem prévia
passivação, e que a passivação e a esterilização aumentam a energia de superfície,
uma propriedade desejável para os implantes ósseos.
A passivação também tem sido recomendada para minimizar a corrosão dos
íons de Ti (Kilpadi et al., 1998). Sabe-se que a passivação sobre superfícies sulcadas
de implantes confeccionados à partir de um processo de usinagem, reduz a corrosão
de debris que podem não ter sido removidos por técnicas de limpeza convencionais
(Forrest, 1981).
Segundo os estudos de Callen et al. (1995), a passivação por ácido nítrico a
34% por 1 hora de implantes de cpTi e liga de Ti, usando os métodos baseados no
protocolo F86 da ASTM (1992), tem o intuito de reduzir a reatividade de superfície,
e o consequente potencial corrosão do material nos meios biológicos. Entretanto, os
autores relataram que tal tratamento de superfície reduziu a espessura da camada de
TiO2 na liga de Ti, enquanto não teve efeito significante sobre a camada de óxido do
cpTi. Foram detectados níveis in vitro mais elevados de íos Ti, Al e V na presença da
liga de Ti passivada. Em contraste, a passivação por ácido nítrico não influenciou a
liberação de íons a partir do cpTi.
Textura de superfície
A morfologia (textura) da superfície de um implante, incluindo a
microtopografia e rugosidade, tem sido relatada por influenciar o sucesso de
cicatrização dos implantes endósseos (Rich & Harris, 1981; Thomas & Cook, 1985).
Uma superfície mais rugosa aumenta a área de superfície e melhora o potencial de
embricamento mecânico do osso à superfície do implante (Klokkevold et al., 1997).
Conforme Wennerberg et al. (1993) demonstraram, os implantes dentais de
diversos sistemas comerciais apresentam diferentes rugosidades de superfície (em
micrometros). Os sistemas que possuem cilindros dos revestidos por HA (Osteobond,
Ra = 2,94; IMZ, Ra = 2,76; Micro-Vent, Ra = 1,89; Bio-Vent, Ra = 1,76; Impla-Med,
Ra = 1,69; Calcitek, Ra = 1,59) ou plasma spray (IMZ, Ra = 1,82), têm uma
rugosidade maior do que os usinados que utilizam a liga de titânio (Core-Vent, Ra =
1,21; Screw-Vent, Ra = 0,56; Mini-implante 3i, Ra = 0,41) ou o titânio
comercialmente puro (Impla-Med, Ra =0,54; 3i, Ra = 0,67; Nobelpharma, Ra =0,53)
Segundo Albrektsson (1998), diferentes pesquisadores podem apresentar
opiniões contrastantes a respeito do que seria uma superfície lisa ou rugosa; enquanto
um autor pode considerar uma superfície rugosa, outro pode determinar a mesma
como lisa, e vice-versa.
Alguns pesquisadores defendem que a rugosidade da superfície do Ti oferece
uma melhor adesão para a rede de fibrina, por onde migram os osteoblastos para as
proximidades da superfície do implante a fim de secretar matriz óssea, dando início à
formação da interface osseointegrada (Davies, 1998; Carvalho et al., 2001). Park &
Davies (2000) acreditam que estas interações precoces entre o coágulo, contendo
hemácias, plaquetas e fatores de crescimento, com a superfície do implante, devem
ter um papel importante no estágio da osseocondução sobre os implantes de
superfície rugosa.
O processo de manufatura utilizado para se alcançar a microtextura, por ação
química (Schroeder et al., 1981) ou física (Buser et al., 1991) também pode interferir
com o sucesso clínico. Atualmente, os implantes de Ti em uso clínico variam em
respeito à composição e rugosidade de superfície, sendo consenso apenas o fato de
que tecido ósseo se forma mais rapidamente sobre superfícies rugosas enquanto
tecido conjuntivo fibroso é mais freqüentemente observado sobre as superfícies lisas
(Cochran et al., 1994).
O aumento da rugosidade do titânio induz à formação de uma superfície mais
hidrofílica (McDonald et al., 1998), e o aumento desta hidrofilia resulta em uma
menor adsorção de albumina (Serro et al., 1999), sendo já observado por Serro et al.
(1997) a inibição do crescimento da camada de cálcio e fosfato sobre a superfície do
Ti na presença de albumina.
Dentre as superfícies dos implantes de Ti, uma das mais comumente
utilizadas é a usinada (Carvalho et al., 2001). Segundo Wennerberg (1998), o
processo de usinagem da superfície dos implantes é a única técnica de manufatura
que até o momento apresenta resultados clínicos apropriados à longo prazo. Tais
superfícies apresentam típicos traços ou sulcos que correm perpendiculares ao longo
eixo dos implantes, com grau de rugosidade entre 0,5 e 1,0µm (Albrektsson, 1998).
A
avaliação
da
superfície
dos
implantes
do
sistema
Branemark
(Nobelpharma), 3i e Osseodent por meio de MEV, mostrou uma típica e semelhante
superfície usinada, com sulcos correndo paralelos às roscas do parafuso. Em
contraste, a superfície do implante do sistema Core-Vent (Dentisply) apresentou um
alto grau de rugosidade com numerosas porosidades, cavidades e fossas, devido ao
tratamento plasma spray. Todos os implantes foram manufaturados a partir de cpTi,
entretanto, traços de silício foram demonstrados na porção rosqueada dos implantes
Core-Vent e 3i. Os implantes Core-Vent também mostraram impurezas como
alumínio e cromo. Porém, o estudo clínico destes implantes submetidos à carga
funcional pelo período de 1 a 2 anos, não mostrou diferença significante entre os
sistemas com relação à perda óssea marginal (Helsingen & Lyberg, 1994).
Buser et al. (1999) realizaram um estudo biomecânico em porcos miniatura,
da interferência da resistência da interface óssea aos implantes de cpTi com
superfície usinada (Ra= 0,15µm), jateada com areia de granulação 0,25-0,50mm +
ataque com ácidos clorídrico e sulfúrico (Ra= 2,0µm) e plasma spray (Ra= 3,1µm).
Foi concluído que a resistência na interface dos implantes de titânio é
significantemente influenciada pelas características de superfície, uma vez que os
implantes com superfície usinada apresentaram menores valores de remoção ao
torque quando comparados com os outros dois tratamentos de superfície.
O jateamento das superfícies é um método aplicável industrialmente para
aumentar a rugosidade. Análises experimentais não revelam qualquer efeito
desfavorável aos tecidos com a utilização do óxido de alumínio (Al2O3), um pó
muito freqüentemente empregado na texturização dos implantes. A característica da
superfície resultante do jateamento depende de vários fatores como a natureza e o
tamanho das partículas usadas, assim como a pressão e o tempo de aplicação
(Albrektsson, 1998).
Com relação à textura da superfície de implantes de Ti, um conjunto de
experimentos in vivo mostraram que com o aumento na rugosidade ocorre um
aumento na formação de tecido ósseo na superfície dos implantes. Nos implantes
com superfície lisa houve a formação de uma interface de tecido conjuntivo fibroso e
naqueles com superfície rugosa houve a formação de uma interface de tecido ósseo
(Thomas & Cook, 1985), sendo maior a porcentagem de contato entre implante e
osso com o aumento da rugosidade da superfície (Buser et al., 1991; Han et al.,
1998). A rugosidade da superfície é, ao menos parcialmente, responsável pela maior
aderência do tecido interfacial com o implante (Orr et al., 1992), sendo que,
implantes mais rugosos necessitam de maior força de torque para remoção e
apresentam maior volume de tecido ósseo entre duas roscas consecutivas dos
parafusos (Han et al., 1998). No entanto, nestes estudos, ou foram comparados
implantes de superfície lisa com implantes rugosos ou implantes que apresentavam
superfícies rugosas obtidas por diferentes métodos. Wennerberg et al. (1998),
estudando implantes com superfícies rugosas obtidas por um mesmo método (jato de
Al2O3), também mostraram que implantes rugosos apresentam maior contato com
tecido ósseo do que aqueles mais lisos. Entretanto, estes autores mostraram que havia
a mesma porcentagem de contato com osso entre as superfícies texturizadas com
partículas de Al2O3 de 25µm e de 250µm, enquanto a maior porcentagem de contato
foi observada com as superfícies texturizadas com partículas de 75µm. Estes
resultados sugerem que existe um nível de rugosidade que otimizaria a formação de
osso e que superfícies mais lisas ou mais rugosas não favoreceriam a formação de
osso na interface com o implante.
Em uma série de estudos, foram investigados sistematicamente os efeitos da
rugosidade de superfície e a resposta óssea em coelhos. Implantes de Ti com 4
diferentes estruturas de superfície foram criados por jateamento de Al2O3 ou TiO2
sobre superfícies usinadas. Partículas de 25µm de TiO2 e 25, 75 ou 250µm de Al2O3
foram utilizadas para o processo. Os autores concluíram que os implantes com
rugosidade de 1 a 1,5µm apresentaram melhor resposta em relação à retenção
(tração) óssea, assim como mais contato osso-implante na histomorfometria. Uma
superfície criada por jateamento de partículas de 250µm de Al2O3 , levou à formação
de uma superfície mais rugosa (2,11µm), o que não melhorou a retenção dos
implantes ao osso (Wennerberg et al., 1995; Wennerberg et al., 1996a; Wennerberg
et al., 1996b; Wennerberg et al., 1996c).
Para se avaliar os efeitos do jateamento de Al2O3 (corundum) seguido por
aplicação de ácido oxálico na superfície de implantes cilíndricos de cpTi sobre a
osseointegração, testes biomecânicos in vivo foram realizados por Li et al. (1999). Os
cilindros de titânio, inseridos em fêmures de cães, foram removidos 2, 4 e 12
semanas após a implantação. Os resultados mostraram que a força necessária para a
remoção dos implantes tratados foi 5 vezes maior do que para os implantes lisos. Os
autores destacam que a presença de vários pequenos picos na superfície resulta em
uma fixação óssea mais efetiva do que um pequeno número de altos picos, além da
grande importância dos micro-poros secundários para a integração osso-implante.
Li et al. (2001) avaliaram os efeitos do jateamento de Al2O3 e do ataque de
ácido oxálico sobre as propriedades químicas e topográficas da superfície do titânio.
Para tal, foram utilizados MEV, difratômetro de raios-X e o teste de liberação de íons
de Ti, tendo como critério a topografia da superfície do titânio, a inclusão de
partículas da areia de abrasão, a contaminação por elementos e a corrosão do titânio.
Os resultados mostraram que a superfície áspera criada pelo jateamento era um tanto
quanto irregular, com picos afilados e partículas aderidas de areia e taxa de corrosão
aumentada. Estas características foram modificadas pelo ataque de ácido oxálico. O
contorno da superfície áspera se tornou mais regular e arredondado, as partículas
introduzidas foram removidas completamente e a grau de corrosão diminuído. A
modificação causada pelo ataque ácido oxálico também criou numerosos microporos secundários (2µm de diâmetro) na base da macrotextura da superfície jateada.
Segundo os autores, este tipo de superfície com jateamento modificado é exeqüível e
confiável para ser aplicado em implantes odontológicos, sem nenhum dano à
biocompatibilidade do titânio.
Superfícies rugosas geralmente têm demonstrado altos valores em provas
mecânicas, indicando uma interface osso-implante mais forte. O estudo de Pebé et al.
(1997) procurou estabelecer os valores de contra-torque de implantes parafusados 3i®
preparados por polimento, jateamento por partículas de TiO2 ou ataque de ácido
clorídrico / sulfúrico, comparando os diferentes tipos de superfície pela porcentagem
histomorfométrica do contato osso-implante com e sem carga funcional. Os
resultados desta investigação em cães sugerem que a força da interface, determinada
pela prova de contra-torque, é influenciada pelas diferentes características de
superfície. A MEV mostrou a rugosidade progressiva das superfície dos implantes na
seqüência polido<jateado<ataque ácido. As superfícies com ataque ácido resistiram
às forças de contra-torque com mais propriedade em comparação às superfícies
jateadas ou usinadas. Entretanto, a avaliação histológica do osso, não demonstrou
uma vantagem para as superfícies mais rugosas quanto ao percentual de contato
ósseo ao nível microscópico.
Embora a microrugosidade mostre ser uma importante característica para a
resposta tecidual aos biomateriais, também há observações que indicam uma resposta
biológica à irregularidades ao nível ultraestrutural ou nanométrico (Ellingsen, 1998).
Entretanto, a interferência da rugosidade nanométrica ainda é de significância
desconhecida (Albrektsson, 1998; Ellingsen, 1998).
Klokkevold et al. (1997) compararam a resistência de remoção ao torque
reverso de implantes usinados rosqueáveis de Ti com outros de superfície tratada
com ataque ácido duplo (DAE) HCl / H2SO4 (Osseotite – 3i). O estudo realizado em
coelhos demonstrou que o DAE aumentou significativamente a força de
osseointegração. Enquanto a MEV mostrou uma textura sulcada típica e
relativamente lisa na superfície usinada, o implante tratado pelos ácidos apresentou
uma superfície irregular, com pequenos picos e vales (1-2µm).
Klokkevold et al. (2001) relatam que o mesmo tipo de tratamento ácido citado
acima (DAE), aumenta a integração óssea a um nível comparável com aquele
alacançado por superfícies mais complexas topograficamente, como as de plasma
spray. Tal estudo da força de remoção dos implantes em coelhos por contra-torque,
também mostrou melhor osseointegração dos implantes que sofreram ataque ácido
em relação aos somente usinados. Os autores concluem que a integração ossoimplante pode ser aumentada nos períodos iniciais com a utilização de implantes
com uma micro-estrutura de superfície apropriada, o que pode ser benéfico em
regiões com menor quantidade de tecido ósseo denso como a maxila ou em áreas de
enxertia óssea.
Muitos fatores incontroláveis do meio bucal assim como problemas técnicos,
impedem estudos experimentais in vivo sobre o comportamento tecidual básico
(Albrektsson & Hansson, 1986; Sennerby et al., 1993; Steflik et al., 1994; Bjursten et
al., 1990). Os experimentos com cultura de células in vitro parecem ser uma maneira
de preencher a existente falta de conhecimento à respeito desses aspectos (Castellani
et al., 1999).
A rugosidade de superfície tem se mostrado em diversos estudos in vitro
como um importante parâmetro que influencia a resposta biológica básica (Bowers et
al., 1992; Keller et al., 1990; Martin et al., 1995; Boyan et al., 1998; Ong et al., 1997;
Stanford et al., 1994; Castellani et al., 1999).
Porém, a influência final da configuração microgeométrica e textura de
superfície final sobre a resposta óssea ainda não é completamente compreendida
(Kieswetter et al., 1996; Cooper et al., 1998; Castellani et al., 1999; Park & Davies,
2000; Park et al., 2001).
Para estudar os efeitos de micro sulcos paralelos sobre a energia de superfície
e crescimento celular de fibroblastos in vitro, den Braber et al. (1995) produziram
discos de silicone texturizados com sulcos de 2, 5 ou 10µm, e profundidade de
0,5µm. A dimensão dos sulcos de superfície não interferiu com as características de
umectabilidade. Entretanto, a MEV mostrou que as superfícies com sulcos paralelos
de 2 e 5µm eram capazes de induzir a uma orientação e alinhamento celulares.
Nenhum efeito dos diferentes padrões das superfícies sobre o crescimento
fibroblástico pôde ser demonstrado.
Segundo Black (1992), as células tendem a responder mais fortemente aos
padrões de textura de superfície com dimensões aproximadas da ordem do tamanho
de uma célula, o que corresponde em geral em alguns micrometros. Albrektsson
(1998) ressalta que implantes com rugosidade acima de 1,5µm apresentariam uma
maior corrosão e liberação de íons para o meio tecidual, o que seria desfavorável
para a osseointegração, resultando em uma resposta óssea prejudicada.
Estudos in vitro têm demonstrado que células de linhagem osteoblástica
exibem características fenotípicas dependentes da rugosidade, sendo que estas
parecem se aderir mais rapidamente sobre superfícies de Ti com uma
microtopografia mais rugosa (Michaels et al., 1989; Bowers et al., 1992).
François et al. (1997) avaliaram a atividade biológica da fibronectina
adsorvida sobre superfícies de cpTi com 3 diferentes rugosidades: polidas (1,081 ±
0,047µm), processadas por polimento seguido por ataque ácido HCl / H2SO4 (1,44 ±
0,247µm) e preparadas por jateamento de areia e ataque ácido (2,455 ± 0,146µm).
Foi concluído que, ao contrário do que poderia se esperar, com o aumento da
rugosidade do Ti não houve um aumento, mas sim uma diminuição dos níveis de
adsorção de fibronectina in vitro.
Deligianni et al. (2001) avaliaram o efeito da rugosidade (Ra= 0,320; 0,490 e
0,874µm) da liga de Ti sobre a as células de medula óssea humanas e sobre a
adsorção de proteínas in vitro. A adesão e proliferação celulares foram maiores com
o aumento da Ra. Não houve diferença estatisticamente significante na expressão da
quantidade de ALP. Mais fibronectina foi adsorvida sobre as superfícies rugosas,
sendo a albumina humana adsorvida preferencialmente pelos substratos lisos. Os
resultados da adesão celular podem ser explicados pela adsorção diferencial das duas
proteínas sobre as superfícies.
Castellani et al. (1999) examinaram os efeitos de diferentes rugosidades de
superfície (Ra = 0,3 a 0,8 µm) em discos de cpTi utilizando células osteogênicas de
medula de ratos. Com base em seus achados, os autores concluíram que tal estudo in
vitro não pôde claramente confirmar os efeitos da rugosidade em relação à
proliferação, diferenciação e calcificação da matriz mineralizada.
Anselme et al. (2000) avaliaram quantitativamente a adesão de osteoblastos
humanos sobre substratos metálicos (TiAl6V4) com várias rugosidades de superfície
em diferentes períodos após a inoculação, e estudaram sua correlação com mudanças
qualitativas na expressão de proteínas de adesão. As células se orientavam de
maneira paralela nas superfícies polidas. Esta orientação não foi afetada pelos sulcos
residuais após o polimento. Nas superfícies jateadas as células nunca chegaram à
confluência e tinham um formato estrelado, e a camada celular não apresentava
organização. A orientação da matriz extracelular (fibronectina, colágeno tipo I,
osteopontina) e proteínas do citoesqueleto (actina e vinculina) refletiam a orientação
da camada de células. Os autores observaram uma menor adesão e proliferação
celulares nas superfícies mais rugosas e menos organizadas (jateadas). Tais
resultados seriam explicados pela formação de número e tamanho reduzidos das
placas de adesão sobre as superfícies mais caóticas.
Outros trabalhos relatam a influência da morfologia da superfície do implante
de Ti sobre as células osteoblásticas in vitro. As células parecem se orientar pelos
sulcos de superfícies micro-usinadas. Dependendo do grau de rugosidade, as células
podem se comportar nos sulcos como se as superfícies fossem lisas. Além do mais,
nas superfícies rugosas criadas sem padronização, como aquelas originadas a partir
de jateamentos ou ataques ácidos, as células formam diferentes focos de adesão, o
que resulta em um fenótipo distinto daquelas observadas em outras superfícies
sulcadas com o mesmo grau de rugosidade (Brunette, 1988; Chehroudi et al., 1990).
Alguns estudos demonstraram que a rugosidade de superfície de um implante
de cpTi pode modular a expressão fenotípica de células osteoblásticas isoladas
originalmente a partir de osteossarcoma humano (MG63). Em geral, células
cultivadas sobre superfícies mais rugosas tendem a exibir características mais
diferenciadas de osteoblastos, como reduzida proliferação celular e aumento da
atividade de fosfatase alcalina (Martin et al., 1995; Kieswetter et al., 1996; Boyan et
al., 1998; Lincks et al., 1998). Nestes trabalhos, o valor de Ra da superfície do Ti
variou de <0,1µm (liso), 3-4µm (rugoso) a >6µm (muito rugoso), sendo que as
superfícies que otimizaram a atividade osteoblástica apresentavm Ra de cerca de
4µm.
Utilizando-se de cultura de células MG63, Martin et al. (1995) estudaram os
efeitos da rugosidade de superfície do cpTi sobre a síntese de proteínas, proliferação
e diferenciação celulares. O número de células se mostrou aumentado no grupo de
cpTi polido e diminuído sobre a superfície mais rugosa (TPS). Foi observado que a
atividade de fosfatase alcalina (ALP) decrescia com o aumento da rugosidade do
cpTi submetido a 5 tratamentos de superfície, com exceção de um grupo específico
que sofreu jateamento áspero de areia seguido por ataque ácido (HCl e H2SO4). Tal
grupo experimental, embora apresentasse uma das superfícies mais rugosas, se
caracterizava por ter uma geometria de superfície muito regular. Estes resultados
demonstram que a regularidade da superfície de um implante é um importante fator
na diferenciação celular e calcificação.
Kieswetter et al. (1996) avaliaram a interferência da rugosidade do cpTi grau
II sobre a morfologia, proliferação celular e produção de fatores de crescimento
(TGF-β1) e citocinas (PGE2) utilizando cultura de células MG63. Os tratamentos
realizados geraram superfícies de Ti com graus crescentes de rugosidade [polimento,
banho de ácido nítrico, jateamento fino de areia seguido de ataque ácido (HCl e
H2SO4), jateamento áspero de areia seguida do mesmo ataque ácido e plasma spray
(TPS)]. Segundo os autores, não houve correlação entre o número de células e a
rugosidade da superfície do cpTi. Entretanto, as superfícies mais rugosas
apresentaram um conteúdo maior de PGE2 e TGF-β1, sugerindo que a rugosidade de
superfície pode modular a atividade de células que interagem com um implante,
afetando a reparação tecidual e o sucesso dos implantes.
Boyan et al. (1998) demonstraram que uma maior rugosidade de superfície de
implantes de cpTi aumenta a resposta fenotípica osteoblástica de células de linhagem
MG63 e que estas células respondem sinergisticamente a agentes reguladores
extrínsecos como o 1α-25-(OH)2D3, um derivado da vitamina D. Estes dados
sugerem que o sistema endócrino está ativamente envolvido na osseointegração ao
redor dos implantes.
Lincks et al. (1998) relataram que a resposta de células MG63 ao cpTi e liga
de titânio é dependente da rugosidade de superfície e composição química. A
aumentada diferenciação de células cultivadas sobre superfícies rugosas de cpTi e
liga de Ti foi indicada pela diminuição da proliferação celular, aumento da ALP e
produção de osteocalcina. A produção de fatores locais (PGE2 e fator de crescimento
TGF-β) também foi aumentada sobre as superfícies rugosas, apoiando a conclusão de
que estas células são mais diferenciadas. A composição da superfície também
interferiu na diferenciação celular, uma vez que as células incubadas sobre o cpTi
rugoso apresentaram maior ALP do que aquelas sobre liga de Ti rugoso.
Células MG63 cultivadas sobre superfícies rugosas produziram níveis
aumentados de osteocalcina, uma proteína não colagenosa cálcio-adesiva expressa na
mineralização da matriz extracelular que é utilizada como um marcador de
maturação osteoblástica (Owen et al., 1990; Aronow et al., 1990).
A aumentada expressão do fenótipo osteoblástico diferenciado também foi
demonstrada por Groessner-Schreiber & Tuan (1992), que observaram que a
superfície de titânio rugoso aumentou a ALP e a calcificação em cultura de células
osteobláticas de embriões de galinha.
Ong et al. (1996) observaram que ocorre adsorção de constituintes
anorgânicos (cálcio e fósforo) sobre a superfície de discos de cpTi imersos em meio
de cultura α-MEM sem proteína. A quantidade do depósito inorgânico se mostrou
independente da rugosidade de superfície (Ra variando de 0,11 a 0,28µm). A cultura
de células osteobláticas de ratos mostrou que a orientação celular é dependente da
topografia, sendo que as células aderidas sobre o Ti mais liso eram mais
arredondadas, enquanto as localizadas sobre a superfície mais rugosa tinham um
formato mais alongado e seguiam a orientação dos sulcos da superfície. As
diferenças na orientação celular observadas neste trabalho são similares àquelas
observadas em outros estudos in vitro que utilizaram cultura de células de ratos
(Inuoe et al., 1987; Gitto et al., 1994).
Células do estroma medular ósseo de fêmures de ratos adultos jovens
produzem tecido mineralizado semelhante ao osso quando em cultura. Ozawa &
Kasugai (1996) avaliaram 3 materiais de implante [ HA, cerâmicas de vidro (GC), e
cpTi passivados por ácido nítrico 28% por 1 hora], assim como a capacidade desses
materiais fornecerem um meio ideal para as células da medula se diferenciarem em
osteoblastos em função da produção de tecido mineralizado. O estudo foi feito pela
mensuração do conteúdo de DNA, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e cálcio (Ca)
presentes na cultura, assim como pela expressão de osteopontina e sialoproteína
óssea por meio de análise da expressão genética. As medidas de DNA não mostraram
diferença entre cada material, mas a ALP e conteúdo de Ca na cultura em HA e GC
foram maiores que nos grupos cpTi e controle. A análise da expressão de genes
revelou maior expressão de osteopontina e sialoproteína óssea na cultura de HA. A
formação de nódulos mineralizados (número e área) foi mais predominante na HA,
seguida pelas GC. Estes resultados mostram que HA e GC fornecem uma situação
favorável para as células medulares se diferenciarem em osteoblastos, resultando
numa maior quantidade de formação de tecido mineralizado sobre estas superfícies.
Tal estudo in vitro poderia explicar a rápida adesão óssea da HA e GC in vivo.
Puleo & Nanci (1999) revisaram diversos estudos que vêm sendo realizados
para a modificação bioquímica da superfície do Ti visando imobilizar proteínas,
enzimas ou peptídeos sobre os biomateriais, com o propósito de controlar a interface
osso-implante, induzindo à uma resposta celular e tecidual específicas. Neste
contexto, uma das maneiras de se alcançar este domínio, seria a utilização de
moléculas contendo o peptídeo RGD sobre os materiais para se mediar uma adesão
celular idealizada. Uma outra forma seria a modificação da superfície do implante
pelo uso de biomoléculas que demonstram efeito osteotrópico, como fatores de
crescimento que induzem à mitogenicidade (IGF-I, FGF-2 e PDGF-BB), ao aumento
de atividadde das células ósseas (TGF-β1) ou à osteoindução (BMPs) (Puleo &
Nanci; 1999).
Rosa & Beloti (2002a) estudaram os efeitos da composição química do Ti e
da rugosidade de superfície sobre o comportamento de celulares medulares
osteogênicas de ratos avaliando: adesão e proliferação celulares, conteúdo de
proteína total, atividade de fosfatase alcalina (ALP), e formação de nódulos
mineralizados. As células foram cultivadas sobre discos de cpTi e liga de Ti-Al-V
com quatro diferentes médias de rugosidade de superfície (Ra). Para a avaliação da
adesão celular, as células foram cultivadas por 2h; para a mensuração da proliferação
celular, conteúdo de proteína total e atividade de ALP, por 14 dias; e 21 dias de
cultura para observação dos nódulos de mineralização. A adesão celular e a
quantidade de proteína total não foram influenciadas pela composição química ou
rugosidade de superfície. A proliferação, atividade de ALP e a formação de nódulos
de mineralização foram afetados somente pela composição química. Os resultados
sugerem que o cpTi otimizaria a diferenciação osteoblástica de células de medula
óssea de ratos in vitro, pela redução na proliferação ceular, aumento da atividade de
ALP e formação de nódulos de mineralização nas superfícies com diferentes
rugosidades, sendo que os diferentes valores de Ra não alteraram significativamente a
resposta celular.
Através de um estudo in vitro utilizando células de medula óssea humana,
Rosa & Beloti (2002b) avaliaram os efeitos da rugosidade do cpTi sobre a adesão,
proliferação e diferenciação celulares. A adesão celular não foi afetada pela
rugosidade de superfície. A proliferação, quantidade de proteína total e atividade de
ALP foram influenciados, enquanto não houve aumento estatisticamente significante
na formação de nódulos de mineralização em superfícies com Ra próximo a 0,80µm .
Os resultados obtidos sugerem que um Ra entre 0,80 e 1,90µm otimizaria os eventos
celulares intermediários e finais, mas não afetaria os eventos iniciais, e que
superfícies mais lisas não favoreceriam as respostas celulares.
PROPOSIÇÃO
Proposição 47
PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo é investigar algumas características da
superfície do cpTi submetido a diferentes tratamentos de superfície e avaliar a
biocompatibilidade utilizando cultura de osteoblastos.
MATERIAL E MÉTODO
Material e Método 49
MATERIAL E MÉTODO
1- Discos de titânio
Os discos de titânio (Ti) comercialmente puro grau II, fornecidos pela Emfils
Indústria e Comércio, foram obtidos a partir de barras comerciais com 12 mm de
diâmetro e cortados para terem 4 mm de espessura. Todos os discos foram usinados
em um torno CNC (Traub TNL 12, Alemanha), e as superfícies preparadas como se
descreve a seguir:
•
T1 – discos usinados
•
T2 – discos usinados tratados com banho em ácido nítrico 65%
durante 05 minutos a 100 Co
•
T3 – discos usinados tratados com jateamento da superfície com óxido
de alumínio (granulação 100 µm) com pressão de 95 libras por polegada quadrada
•
T4– discos usinados tratados com jateamento da superfície como o
realizado em T3 seguido por banho em ácido nítrico como em T2
O tratamento T4 é o mesmo realizado sobre os implantes de cpTi do Sistema
Colosso confeccionados e comercializados pela Emfils Indústria e Comércio. Todos
os discos foram esterilizados por 2,5 Rd de raios gama.
2- Rugosidade de Superfície
A rugosidade de superfície dos discos (Ra) foi avaliada utilizando um
rugosímetro (Prazis Rug-03, Arotec, São Paulo), do Laboratório de Materiais
Dentários da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo.
Foram utilizados 05 discos de cada grupo, sendo que em cada disco foram
tomados 05 valores de Ra, medidos em 05 sítios diferentes. A média dessas 05
medidas foi considerada o valor de Ra de cada disco.
3- Análise da topografia de superfície
A topografia da superfície dos discos foi avaliada utilizando microscopia
eletrônica de varredura (MEV). Para tanto, os discos foram montados em suportes de
alumínio, receberam cobertura de ouro com aproximadamente 20nm de espessura e
foram observados em um microscópio eletrônico de varredura (JSM-5410, Jeol,
Estados Unidos). As peças foram processadas no Laboratório de Microscopia
Eletrônica da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias- UNESP, Jaboticabal.
4- Análise da composição química da superfície
Três discos de cada grupo foram submetidos a avaliação de elementos
químicos presentes na superfície. Para tanto, as superfícies foram analisadas por um
Espectrofotômetro Sequencial de Fluorescência de Raios-X (VRA 30, Carl Zeiss,
Alemanha). As análises foram realizadas no Laboratório Integrado de Pesquisa de
Biocompatibilidade de Materiais do Departamento de Materiais Dentários e Prótese
da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto.
5- Meios de cultura
Para os procedimentos de cultura de células foram utilizados diferentes meios
de cultura, para o armazenamento temporário dos fêmures dos ratos, retirada das
medulas ósseas, isolamento e cultura das células das medulas ósseas.
5.1- Meio de lavagem (ML)
Foi utilizado para o armazenamento temporário e transporte dos fêmures. Este
meio foi feito com uma proporção de 93,8ml de Meio Mínimo Essencial modificação
α (α-MEM, Gibco), 5ml de Gentamicina 10mg/ml (Gibco) e 1,2 ml de Fungizone
250 µg/ml (Gibco). Este meio foi preparado 24 horas antes de ser utilizado e
estocado em frascos universais a 4oC.
5.2- Meio básico suplementado (MBS)
Este meio foi composto na proporção de 170ml de α-MEM, 30ml de soro de
feto bovino (Gibco, Life Technologies), 1ml de Gentamicina 10mg/ml e 240µl de
Fungizone. A solução foi estocada em frasco universal a 4oC.
5.3- Solução de estoque de ácido ascórbico/β-glicerofosfato (aa/β-gp)
Esta solução foi composta de 5mg de ácido ascórbico (Sigma) e 2,16g de βglicerofosfato (Sigma), dissolvidos em 10ml de água destilada por agitação manual
vigorosa. A solução foi esterilizada por filtração através de filtro de Millipore 0,2µm
(Whitman, Reino Unido) em um frasco universal de 20 ml e estocado a 4oC por até
uma semana.
5.4- Meio total suplementado (MTS)
Foi utilizado como meio nutriente para manter as células vivas e mimetizar as
condições do ambiente in vivo que permitem a proliferação celular e diferenciação
das células em osteoblastos. Sua composição foi 20ml de MBS, 200µl de
dexametasona 10-5M (Sigma) e 200µl de aa/β-gp. Esta solução foi aquecida a 37oC
antes de ter contato com as células.
6- Cultura de células
Para as culturas primárias de células de medula óssea de ratos foi utilizado o
método descrito por Maniatopoulos et al. (1988). Um rato Wistar (Rattus norvegicus
albinus) jovem com 05 semanas de idade e pesando 150 g, foi sacrificados por
deslocamento cervical, mantido em posição supina e submetidos à antissepsia da pele
utilizando álcool 70% e solução de clorexidina 2,5%. Os fêmures foram expostos por
meio de incisão, músculos e ligamentos foram removidos e os ossos foram
cuidadosamente desarticulados a fim de preservá-los intactos, e colocados no ML.
Em uma capela de fluxo laminar, as peças cirúrgicas foram lavadas em álcool
70% e em clorexidina 2,5% sendo, então, submetidos a três passagens em ML e uma
lavagem em MBS para remoção do excesso de antibióticos.
Em seguida, os ossos foram colocados em uma placa de petri contendo 10ml
de MTS, o remanescente de tecido mole aderido foi removido e as epífises foram
cortadas. Utilizando uma seringa de 20ml com uma agulha 20/8 para injetar o meio
de cultura, as respectivas medulas ósseas foram lavadas com 20ml de MTS, sendo
que esse meio rico em células em suspensão foi transferido para um frasco de cultura
de 75cm2 (Corning), contendo 10ml de MTS, de forma que o volume final de
solução contendo as células foi de 30ml para cada fêmur (fig.1).
B
C
A
C
Figura 1. Obtenção das células para a cultura a partir do fêmur do rato. A- epífise
sendo cortada; B- medula óssea lavada com MTS; e C- transferência para frasco de
cultura.
Os frascos foram colocados em uma incubadora umidificada sob uma
atmosfera de 95% de O2 com 5% de CO2 a 37oC. As células se multiplicaram e
aderiram ao fundo do frasco pelo período de 02 semanas, durante o qual o MTS foi
trocado a cada 48 horas. O desenvolvimento das células foi avaliado com
microscopia óptica durante esse período, para monitorar sua aparência e crescimento.
Ao final das duas semanas, as células tinham colonizado toda a superfície dos frascos
e estavam confluentes (fig.2), podendo ser incubadas com os discos de Ti.
O MTS dos frascos foi retirado e os mesmos foram lavados três vezes com
20ml de solução salina tamponada com fosfato- PBS - (Gibco) estéril e aquecida a
37oC. Ao final desse processo, a PBS foi substituída por 20ml de uma solução
contendo Tripsina 0,25% (Gibco) e EDTA 1mM (Gibco) para remover as células
aderidas aos frascos. Para facilitar a remoção das células foi utilizado um raspador de
células. Posteriormente, a solução de tripsina contendo as células em suspensão foi
centrifugada a 1500 rpm por 05 minutos, e o sobrenadante foi descartado.
Figura 2. Células em confluência colonizando a superfície do frasco de cultura em
duas semanas de cultura (microscopia óptica - aumento 20x).
O preciptado foi resuspenso em 10ml de MTS e amostras dessa suspensão de
células foram utilizadas para contagem do número de células, utilizando um
hemacitômetro e microscópio de fase invertido (Axiovert 25, Carl Zeiss, Alemanha),
para determinar o número de células / ml.
Os discos de Ti dos grupos T1, T2, T3 e T4 foram individualmente colocados
nos poços de cultura, em placas de 24 poços (Falcon, Franklin Lakes, Estados
Unidos). Os poços foram preenchidos com 2ml de MTS com células em suspensão
numa concentração de 2x104 células/poço. Em cada placa, cinco poços sem discos de
Ti foram utilizados para controle das condições de cultura das células. As placas
foram mantidas em incubadora sob atmosfera de 95% de O2 com 5% de CO2 a 37oC,
e a cada dois dias o MTS foi trocado.
Para cada um dos parâmetros avaliados foram utilizados 05 discos de Ti para
cada grupo, exceto para a avaliação da morfologia celular em que foram utilizados
03 discos.
Todos os experimentos relacionados à cultura de células foram realizados no
Laboratório de Cultura de Células do Departamento de Cirurgia e Traumatologia
Buco-Maxilo-Facial e Periodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão PretoUSP.
7- Morfologia celular
Ao final de 03 dias em cultura, o meio de cultura dos poços contendo discos
de titânio incubados com células foi removido, os poços lavados três vezes com PBS
a 37°C e preenchidos com solução fixadora de glutaraldeído 3% em tampão
cacodilato de sódio 0,1 M por até duas horas. Os poços foram lavados com tampão
cacodilato de sódio 0,1 M, impregnados com tetróxido de ósmio 1%, desidratados
em série crescente de álcoois conforme o seguinte protocolo: álcool 30% (10
minutos)- álcool 50% (10 minutos)- álcool 70% (overnight)- álcool 80% (10
minutos)- álcool 95% (10 minutos)- álcool 100% (10 minutos) e levados para
secagem de ponto crítico a 40o C e pressão de 1300psi durante 4 minutos. Em
seguida, os discos de titânio foram revestidos com 20nm de ouro e observados em
um microscópio eletrônico de varredura.
8- Adesão celular
As células foram incubadas pelos períodos de 04 e 24 horas, ao final dos
quais o meio foi removido, os poços lavados três vezes com PBS a 37°C para
remover as células não aderidas. Em seguida, as células aderidas foram
enzimaticamente liberadas (Tripsina 0,25% + EDTA 1mM) para permitir a contagem
do número de células. Para tanto, os poços foram preenchidos com 1,5ml de uma
solução de tripsina 0,25% e EDTA 1mM para remover as células aderidas, etapa que
foi monitorada pela observação dos poços vazios em microscópio de fase invertido.
A suspensão de células em solução enzimática foi centrifugada, o sobrenadante
descartado e os precipitados resuspensos em meio de cultura para realizar a
contagem do número de células (como descrito acima). A adesão celular foi expressa
como a porcentagem do número inicial de células.
9- Proliferação celular
Ao final de 07, 14 e 21 dias em cultura, as células cultivadas na presença dos
discos de Ti foram contadas seguindo o mesmo método descrito acima para a
avaliação da adesão celular, diferenciando-se desse apenas pelo fato de que a ação
enzimática foi repetida três vezes, para garantir que todas as células fossem
liberadas.
10- Medida de proteína total
A dosagem de proteína total foi realizada seguindo o método de Lowry. Ao
final de 14 e 21 dias em cultura, o meio de cultura dos poços contendo os discos de
Ti incubados com células foram removidos, os poços lavados três vezes com PBS a
37°C e preenchidos com 2 ml de solução de laurilsulfato de sódio 0,1% (Gibco). Ao
final de pelo menos 30 minutos, 1 ml dessa solução de cada poço foi transferido para
tubos de ensaio, misturado com 1 ml de solução de Lowry (Sigma) e deixados em
repouso a temperatura ambiente por 20 minutos. Após esse período, foi adicionado a
cada tubo 0,5 ml da solução de reagente de fenol de Folin e Ciocalteau (Sigma) e
novamente deixados em repouso, a temperatura ambiente, por 30 minutos para
permitir o desenvolvimento de coloração. Em seguida, a absorbância de cada tubo foi
medida em um espectrofotômetro (CE3021, Cecil, Cambridge, Reino Unido)
utilizando o comprimento de onda de 680nm. A concentração de proteína total
(µg/ml) em cada poço foi calculada a partir de uma curva padrão contruída usando
concentrações de albumina bovina conhecidas. A quantidade de proteína total foi
normalizada pelo número de células.
11- Medida da atividade de fosfatase alcalina
A atividade de fosfatase alcalina foi medida utilizando-se de um kit
comercial. Em cada tubo de ensaio foram colocados 0,5 ml de solução de tampão
alcalino de 2-amino-2-metil-1-propanol 1,5 mol/l (Sigma) e 0,5 ml de solução de ρnitrofenil fosfato 0,004% (Sigma), com os tubos mantidos em banho a 37°C. Um
volume de 0,1 ml de laurilsulfato de sódio dos mesmos poços utilizados para medida
de proteína total foi acrescentado a cada tubo, misturados gentilmente e mantidos a
37°C por 15 minutos. Ao final desse período, em cada tubo foram acrescentados 10
ml de solução de hidróxido de sódio 0,05N e a absorbância foi medida em um
espectrofotômetro utilizando o comprimento de onda de 410 nm. A atividade de
fosfatase alcalina, expressa em µmol de ρ-nitrofenol/hora, foi calculada a partir de
uma curva padrão obtida com concentrações conhecidas de ρ-nitrofenol e hidróxido
de sódio 0,02N. A atividade de fosfatase alcalina foi normalizada pela quantidade de
proteína total e pelo número de células.
12- Matriz mineralizada
Ao final de 21 dias cultura, o meio de cultura dos poços contendo os discos
de Ti incubados com células foi removido, os poços lavados três vezes com PBS a
37°C e preenchidos com solução fixadora de glutaraldeído 3% em tampão fosfato
(pH=7,3). Em seguida, os discos de Ti foram desidratados em série crescente de
álcoois conforme o seguinte protocolo: álcool 30% (1 hora)- álcool 30% (1 hora)álcool 50% (1 hora)- álcool 50% (1 hora)- álcool 70% (overnight)- álcool 95% (1-2
horas)- álcool 95% (1-2 horas)- álcool 100% (1 hora)- álcool 100% (1 hora). Após a
desidratação, os discos de Ti foram corados com Alizarin red S, que colore em
vermelho os nódulos de mineralização ricos em cálcio. Os discos foram fotografados
e as imagens obtidas, processadas em um programa analisador de imagens (Image
Tool for Windows, versão 2.02, San Antonio, Estados Unidos). Foi calculada a
porcentagem da área total dos discos que apresentavam formação de matriz
mineralizada.
13- Análise Estatística
Os dados referentes à Ra, adesão e proliferação celulares, síntese de proteína
total, atividade de fosfatase alcalina e à formação de nódulos de matriz mineralizada
foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Duncan,
quando apropriado, utilizando o software SPSS versão 6.0 para Windows.
RESULTADO
Resultado 60
RESULTADO
Rugosidade média da superfície (Ra)
A análise dos dados por meio de ANOVA, comparando as superfícies dos
discos T1, T2, T3 e T4, mostrou que a Ra não foi afetada pelos tratamentos
realizados (F=0,22; gl=3; p=0,88). Os dados são mostrados na Tabela 1.
TABELA1. Rugosidade média (Ra) em µm das superfícies dos discos de titânio.
Disco
T1
T2
T3
T4
1
2,65
1,75
1,64
1,53
2
1,64
2,21
2,48
1,71
3
1,65
1,81
1,80
1,80
4
1,94
1,61
1,87
1,82
5
1,73
1,83
1,82
2,10
Média
1,92
1,84
1,92
1,79
DP
0,42
0,22
0,32
0,21
Topografia de superfície
Foi observado por meio de MEV que as superfícies dos discos apresentaram
uma topografia diferenciada para cada tipo de tratamento realizado, sendo que T3 e
T4 mostraram uma morfologia de superfície menos organizada, caracterizada por
fossas, sulcos e depressões irregulares (figs. 3 e 4).
Resultado 61
Figura 3. Topografia de superfície nos grupos T1 (A), T2 (B), T3 (C) e T4 (D). MEV
(aumento 1000x).
Resultado 62
Figura 4. Topografia de superfície nos grupos T1 (A), T2 (B), T3 (C) e T4 (D). MEV
(aumento 5000x).
Resultado 63
Composição química
A análise da composição química da superfície dos implantes pela
espectrofotometria sequencial de fluorescência de Raios-X mostrou que o Ti é o
elemento químico presente em todos os grupos experimentais. Entretanto, nos grupos
T3 e T4 foram detectados traços de alumínio (Al) conforme observado na Tabela 2.
TABELA 2. Elementos químicos encontrados na superfície dos discos de Ti.
Grupo
Elementos químicos
T1
Ti
T2
Ti
T3
Ti e Al
T4
Ti e Al
Morfologia celular
A avaliação das células cultivadas por 3 dias sobre os discos de Ti não
evidenciou diferenças que pudessem sugerir a influência da textura da superfície
sobre a morfologia celular. No entanto, foi possível observar um filme composto de
células e matriz extracelular recobrindo parte da superfície dos discos, contornando
as irregularidades da superfície. Também foi possível observar células poligonais e
alongadas emitindo prolongamentos (figs. 5 a 8).
Resultado 64
Figura 5. Células fusiformes (c) emitindo prolongamentos. Superfície T1. MEV-3
dias de cultura (aumento 750x em A, 1500x em B).
Resultado 65
Figura 6. Células poligonais (c) emitindo prolongamentos sobre a superfície T2.
MEV-3 dias de cultura (aumento 750x em A, 1500x em B).
Resultado 66
Figura 7. Células (c) sobre a superfície T3. MEV-3 dias de cultura (aumento 750x
em A, 1500x em B).
Resultado 67
Figura 8. Célula (c) sobre a superfície T4. MEV-3 dias de cultura (aumento 1000x
em A, 2000x em B).
Resultado 68
Adesão Celular
Os dados obtidos para a adesão celular, expresso como % do número inicial
de células, nos períodos de 4 e 24 horas de incubação relacionados aos diferentes
tratamentos de superfície são mostrados na Tabela 3 e Figura 9.
A porcentagem de células aderidas no periodo de 24 horas foi
significantemente maior do que a observada no período de 04 horas de incubação
(F=4,96; p=0,037).
A análise estatística da adesão celular após 4 horas por meio de ANOVA
mostrou que não houve diferença estatisticamente significante entre os tratamentos
(F=2; gl=3; p=0,153). O mesmo resultado foi observado em 24 horas (F=2,36; gl=3;
p= 0,11).
TABELA 3. Porcentagem de adesão celular em 04 e 24horas de incubação.
T1
T2
T3
T4
4h
24h
4h
24h
4h
24h
4h
24h
33,50 33,50
16,50 29,00
44,50 72,00
16,50 83,50
28,00 50,00
22,00 88,50
61,00 72,00
28,00 72,00
28,00 61,00
33,00 55,50
22,00 33,50
16,50 83,50
44,50 50,00
55,50 66,50
28,00 44,50
28,00 61,00
33,50 78,00
22,00 44,00
39,00 44,50
16,50 89,00
Média 33,50 54,50
29,80 58,70
38,90 53,50
21,10 77,80
6,74 16,40
15,57 19,77
15,20 17,65
6,30 11,25
DP
Resultado 69
% nº inicial células
100
80
60
4h
40
24h
20
0
T1
T2
T3
T4
Superfície
Figura 9. Adesão celular expressa como % do número inicial de células nos períodos
de 4 e 24 horas de incubação
Resultado 70
Proliferação celular
A análise estatística para 2 fatores de variação (tratamento de superfície e
tempo) mostrou que não houve diferença estatisticamente significante entre o
número de células quando comparadas as superfícies avaliadas (F=2,01; gl=3;
p=0,125), nem entre a interação tempo vs. superfície (F=2,05; gl=6; p=0,077), mas
houve diferença estatisticamente significante entre os períodos de tempo (F=11,94;
gl=2; p=0,0001).
A avaliação entre os períodos de tempo mostrou que o número de células
aumentou de 7 para 14 dias e permaneceu estável de 14 para 21 dias de cultura
(F=10,26; gl=2; p=0,0002), conforme pode ser observado na Figura 10.
O número de células encontrado ao final 7 dias em cultura foi maior que o
número inicialmente plaqueado (2x104 células), não existindo diferença entre as
superfícies testadas (F=3,01; gl=3; p=0,061). De maneira similar, não houve
diferença estatisticamente significante entre os grupos experimentais tanto aos 14
dias (F=2,87; gl=3; p=0,069) quanto em 21 dias de cultura (F=1,53; gl=3, p=0,246).
Os dados obtidos são mostrados na Tabela 4.
Resultado 71
TABELA 4. Proliferação celular. Número de células x 104 aos 7, 14 e 21 dias de
cultura.
T1
T2
T3
T4
7d
14d 21d
7d
14d 21d
7d
14d 21d
7d
14d 21d
3,13 3,75 2,17
3,10 3,16 2,56
2,06 2,97 1,39
2,09 4,52 2,39
2,50 4,89 2,94
2,75 3,17 2,59
1,75 3,19 3,02
2,16 4,08 3,64
2,44 2,50 3,31
2,14 2,59 2,72
2,53 2,94 4,72
2,65 4,39 5,50
2,77 2,86 3,67
3,00 3,27 2,56
2,47 3,86 3,39
1,48 3,63 3,89
2,80 3,25 2,94
2,20 2,64 3,70
2,47 2,66 4,00
2,24 3,33 4,53
Média 2,73 3,45 3,01
2,64 2,97 2,83
2,26 3,12 3,30
2,12 3,99 3,99
0,28 0,93 0,56
0,45 0,32 0,49
0,34 0,45 1,25
0,42 0,50 1,15
DP
6
Nº células x 104
5
4
T1
T2
T3
T4
3
2
1
0
0
7 dias
14 dias
21 dias
Período
Figura 10. Proliferação celular aos 7, 14 e 21 dias de cultura.
Resultado 72
Proteína total
A medida de proteína total foi afetada pelos tratamentos de superfície dos
discos de Ti. Os resultados obtidos ao final de 14 e 21 dias de cultura foram
normalizados pela número de células e são apresentados na Tabela 5.
TABELA 5. Proteína total (µg/104 células) aos 14 e 21 dias de cultura.
T1
T2
T3
14d
21d
14d
21d
14d
21d
T4
14d
21d
32,55 42,18
29,26 36,65
22,76 33,41
17,07 21,23
31,07 35,61
25,97 41,98
19,44 56,09
20,15 29,55
24,47 44,19
30,22 32,89
26,73 32,10
19,51 25,90
19,46 34,39
31,85 36,19
26,22 32,80
18,35 22,42
21,40 32,28
32,40 38,50
22,89 39,59
11,56 20,80
Média 25,79 37,73
29,94 37,24
23,61 38,80
17,33 23,98
2,55
2,97 10,12
3,43
DP
5,80
5,17
3,33
3,70
Quando os valores de proteína total foram submetidos à ANOVA para dois
fatores de variação para comparação entre superfície e tempo, observamos que a
quantidade de proteína total foi estatisticamente maior aos 21 dias quando comparada
aos 14 dias de cultura (F=39,32; gl=1; p=0,0001), e que os valores de proteína total
do grupo T4 foram sigificativamente menores nos dois períodos (F=19,41; gl=3;
p=0,0001). Não houve diferença estatística entre a interação superfície vs. tempo
(F=1,52; DF=3; p=0,229).
Resultado 73
Os dados mostraram existir diferença entre as superfícies avaliadas, sendo
que aos 14 dias a quantidade de proteína total foi semelhante entre T1, T2 e T3, e os
valores desses superiores aos da superfície T4 (F=9,12; gl=3; p=0,0009). O mesmo
resultado foi obtido aos 21 dias de cultura (F=6,37; gl=3; p=0,0048).
Desta forma foi caracterizado que tanto aos 14 quanto aos 21 dias de cultura,
a medida de protéina total se comportou da seguinte forma: T1=T2=T3>T4.
Proteína Total (µg/104 cel)
Os resultados podem ser observados na Figura 11.
60
40
14 dias
21 dias
20
0
T1
T2
T3
T4
Superfície
Figura 11. Quantidade de proteína total para as diferentes superfícies aos 14 e 21 dias
de cultura
Resultado 74
Medida da atividade de fosfatase alcalina
A análise ANOVA para dois fatores de variação nos mostrou que não houve
diferença estatisticamente significante entre a quantidade de atividade de fosfatase
alcalina nos períodos de 14 e 21 dias (F=1; gl= 3,97; p=0,055). Da mesma forma,
não houve diferença da quantidade de atividade de fosfatase alcalina quando
comparadas as superfícies (T) e os períodos de tempo (F=0,41; gl=3; p=0,75) e entre
a interação superfície vs. tempo (F=1,80; gl=3; p=0,17) conforme mostrado na
Tabela 6 e Figura 12.
A análise estatística da atividade de fosfatase alcalina mostrou que não houve
diferença entre as superfícies avaliadas tanto aos 14 dias (F=1,08; gl=1; p=0,39)
quanto em 21 dias de cultura (F=1,13; gl=3; p=0,37).
TABELA 6. Atividade de fosfatase alcalina (U/L) aos 14 e 21 dias de cultura.
T1
T2
T3
T4
14d
21d
14d
21d
14d
21d
14d
21d
0,13
0,15
0,10
0,20
0,28
0,16
0,01
0,08
0,17
0,12
0,19
0,18
0,17
0,08
0,18
0,16
0,29
0,01
0,10
0,24
0,17
0,13
0,15
0,22
0,23
0,01
0,19
0,09
0,17
0,22
0,19
0,15
0,24
0,16
0,23
0,09
0,12
0,17
0,18
0,05
Média
0,21
0,09
0,16
0,16
0,18
0,15
0,14
0,13
DP
0,06
0,08
0,06
0,07
0,06
0,05
0,08
0,07
Resultado 75
Atividade de FA (U/L) normalizado
0.30
0.20
14 dias
21 dias
0.10
0.00
T1
T2
T3
T4
Período
Figura 12. Atividade de fosfatase alcalina aos 14 e 21 dias de cultura.
Resultado 76
Matriz mineralizada
Após 21 dias de cultura observou-se a formação de nódulos de matriz
mineralizada revestindo uma pequena área da superfície dos discos de titânio, cujos
resultados são apresentados na Tabela 7 e Figura 13. Os poços controles (sem discos
de titânio) apresentaram uma quantidade de mineralização de 42,50% ± 5,40 (Figura
14).
Tabela 7. Porcentagem de mineralização aos 21 dias de cultura
Disco
T1
T2
T3
T4
1
6,14
9,00
3,30
0,86
2
10,32
6,20
6,64
0,92
3
12,51
6,62
5,59
0,86
4
15,54
5,54
1,27
1,14
5
10,71
6,19
1,00
0,79
Média
11,04
6,71
3,56
0,91
DP
3,43
1,34
2,52
0,13
Os escores de mineralização foram comparados pelo teste de Duncan’s
(ANOVA). A comparação entre os valores mostrou existir diferença estatisticamente
significante (F=19,05; gl=3; p=0,00001), sendo que ocorreu menor formação de
nódulos de matriz mineralizada sobre as superfícies de T3 e T4 (T1>T2>T3=T4),
conforme pode ser observado na Figura 15.
Resultado 77
Figura 13. Mineralização sobre os discos de Ti após 21 dias de cultura.
Resultado 78
Figura 14. Amostra de poço controle. Mineralização aos 21 dias de cultura.
Resultado 79
Mineralização
% área total do disco
16
12
8
4
0
T1
T2
T3
T4
Material
Figura 15. Porcentagem de mineralização aos 21 dias de cultura.
DISCUSSÃO
Discussão 81
DISCUSSÃO
Observamos na literatura que muitas publicações não descrevem em detalhes
os métodos utilizados para a caracterização das superfícies dos implantes. Isto talvez
se deva ao fato de que os fabricantes não divulguem os protocolos de tratamentos de
superfície realizados sobre seus implantes por serem segredo comercial. Wennerberg
et al. (1998) concluíram que mesmo quando utilizados os mesmos métodos e
parâmetros na texturização de superfícies, pode-se obter resultados que não
necessariamente serão iguais. Daí a importância de se avaliar a superfície a cada
novo experimento, o que permitirá obter a rugosidade e a topografia daquela
superfície, independente dos métodos utilizados para se obtê-los.
Nossas avaliações da superfície demonstraram que os tratamentos realizados
modificaram a textura do cpTi, resultando em superfícies de rugosidade semelhante,
porém com topografias diferenciadas, conforme observado pela MEV. Os grupos que
sofreram o jateamento de Al2O3 (T3 e T4) apresentaram superfícies menos
organizadas, caracterizadas por fossas, sulcos e depressões irregulares. Uma vez que
os valores de Ra encontrados em nosso trabalho foram semelhantes entre os grupos,
podemos dizer que os resultados biológicos não foram influenciados pela rugosidade,
mas talvez por outros fatores como: irregularidades da topografia de superfície
(Albrektsson, 1998; Ellingsen, 1998),
contaminação da superfície por Al
(Blumenthal & Posner, 1984; Bellows et al., 1999) ou possíveis alterações na energia
de superfície do metal pelos tratamentos realizados (Baier et al., 1984; Boyan et al.,
1996; Lampin et al., 1997). Tais parâmetros serão discutidos adiante, separadamente.
Discussão 82
Em nosso experimento, observamos que nos grupos tratados com jateamento
(T3 e T4), foi detectado o elemento químico alumínio (Al) sobre as superfícies dos
discos. Vale salientar que o método utilizado neste trabalho permitiu apenas a
detecção de elementos químicos, e não uma análise quantitativa. A presença de
alumínio sobre superfícies T3 e T4 talvez seja explicada por alguma deficiência do
processo de limpeza realizado posteriormente ao jateamento. Sabe-se que o Al é um
elemento químico tóxico aos tecidos e que inibe a formação de cristais de apatita, o
que é desfavorável para o desenvolvimento e a manutenção da osseointegração
(Blumenthal & Posner, 1984). Bellows et al. (1999) descreveram os efeitos
citotóxicos do alumínio quando este é adicionado ao meio de cultura. Entretanto,
segundo Albrektsson (1998), análises experimentais de implantes com superfície
texturizada por jateamento de Al2O3, não demonstram qualquer efeito desfavorável
aos tecidos que pudesse ser atribuído ao material utilizado para o jateamento, uma
vez que se trata de uma cerâmica bioinerte (Sykaras et al., 2000). Wennerberg (1996)
não observou diferença na formação de tecido ósseo sobre superfícies jateadas com
Al2O3 ou TiO2, sugerindo que o material utilizado não interfere com a resposta
biológica. Entretanto, nesse trabalho não foi realizada análise de contaminação de
superfície. Porém, mesmo não se sabendo ao certo qual a concentração de alumínio
que causaria efeitos negativos à integração osso-implante, podemos supor que possa
ter havido algum efeito negativo sobre as superfícies T3 e T4.
No presente estudo, foi avaliado o comportamento de células de medula óssea
de ratos cultivadas sobre discos de cpTi, submetidos à diferentes tratamentos de
superfície. Os resultados mostraram que todos os discos, independente da textura de
superfície que eles apresentaram, permitiram a adesão e proliferação celulares, e a
Discussão 83
diferenciação osteoblástica, comprovada por apresentarem atividade de fosfatase
alcalina e formação de nódulos de matriz mineralizada.
Com relação à morfologia celular, não foram evidenciadas diferenças que
pudessem sugerir a influência da textura de superfície sobre as células cultivadas por
3 dias sobre os discos de titânio. Foi possível observar células aderidas e espraiadas
com características morfológicas de osteoblastos, isto é, com formato poligonal,
emitindo longos prolongamentos, e um filme composto de matriz extracelular e
células recobrindo parte da superfície dos discos, de forma semelhante ao relato de
outros autores (Anselme et al., 2000).
Os dados para a adesão celular mostraram que não houve diferença
estatisticamente significante entre os tratamentos após 4 horas de incubação. O
mesmo resultado foi observado em 24 horas de cultura. Entretanto, a porcentagem de
células aderidas no período de 24 horas foi significativamente maior do que a
observada no período de 04 horas, estando os mesmos em concordância com o
estudo de Deligianni et al. (2001) onde foi observada uma relação de aumento da
adesão celular tempo-dependente. O presente estudo não demonstrou qualquer efeito
da textura de superfície sobre a adesão celular.
Os efeitos da rugosidade da superfície sobre a adesão celular podem ser ações
da rugosidade apenas, ou da reação que ocorre entre o substrato e o soro presente no
meio de cultura. Essa interação inicial produz um filme de macromoléculas que
modifica as respostas celulares (Martin et al., 1995). A fibronectina, uma proteína
envolvida na adesão celular, presente no soro, interage com as glicosaminoglicanas e
o citoesqueleto permitindo a adesão e o espraiamento celulares. É possível que uma
superfície rugosa possa adsorver mais fibronectina que uma superfície lisa e
Discussão 84
conseqüentemente, promover a adesão de um maior número de células (Martin et al.,
1995). Entretanto, os dados da literatura são conflitantes: apesar de Deligianni et al.
(2001) observarem uma maior quantidade de adsorção de fibronectina e adesão
celular em superfícies de Ti mais rugosas, os estudos de François et al. (1997)
demonstraram uma redução dos níveis de adsorção de fibronectina in vitro. Anselme
et al. (2000) também observaram menor adesão celular em superfícies rugosas com
topografia irregular (jateadas), o que poderia ser explicado pela formação reduzida
de placas de adesão sobre estas superfícies mais caóticas. Porém, nos estudos in vitro
de Rosa & Beloti (2002 a,b) nos quais foi utilizado o mesmo modelo de cultura de
células que nesta pesquisa, a adesão celular não foi afetada pela rugosidade de
superfície do Ti.
Com relação à proliferação celular, verificamos que a literatura apresenta
resultados controversos. Alguns estudos mostraram que superfícies lisas favorecem a
proliferação celular (Stanford et al., 1994; Martin et al., 1995; Kieswetter et al.,
1996). Entretanto, enquanto De Santis et al. (1996) e Hatano et al. (1999)
observaram maior proliferação celular em células cultivadas sobre superfícies
rugosas, Rosa & Beloti (2002a), não verificaram diferença na proliferação celular
sob diferentes condições de rugosidade. Em nosso experimento, não houve
interferência da rugosidade de superfície sobre a proliferação celular pois o Ra foi
semelhante entre os grupos. O número de células ao final de 7 dias de cultura foi
maior que o número de células inicialmente plaqueado, aumentou de 7 para 14 dias,
e permaneceu estável de 14 para 21 dias de cultura. Esta estabilização nos períodos
finais de avaliação talvez seja explicada pelo fato de as células já estarem em uma
fase de mineralização e não mais em proliferação. Não houve interferência dos
Discussão 85
tratamentos de superfície sobre a proliferação celular tanto aos 7, 14 e 21 dias de
cultura, uma vez que não houve diferença estatisticamente significante entre os
grupos experimentais.
Em geral, a síntese celular é sensível a diferentes tipos de material e
topografias de superfície (Lincks et al., 1998). Enquanto Castelanni et al. (1999) e
Rosa & Beloti (2002b) não encontraram diferenças significantes na produção de
proteínas entre superfícies diferentes, Martin et al. (1995) observaram inibição de
produção protéica sobre substratos lisos. Tal discrepância de resultados poderia ser
explicada pela diferença das superfícies com valores de Ra desiguais obtidas por
diferentes métodos, ou pelo emprego de células de origens diferentes. Em nosso
trabalho, a medida de proteína total foi influenciada pelos tratamentos de superfície
realizados, sendo menor nos poços que continham os discos T4. Talvez tal diferença
do conteúdo de proteína total possa ser explicada por possíveis alterações causadas
pelo ataque ácido realizado sobre as superfícies de textura irregular. De forma geral,
os tratamentos ácidos minimizam a corrosão dos íons de Ti (Kilpadi et al., 1998),
removem debris (Forrest, 1981), aumentam a energia de superfície (Kilpadi &
Lemons, 1994; Kilpadi et al., 1998), e criam rugosidade de superfície (Lazzara &
Davies, 2001), o que pode ser desejável para os implantes endósseos. Encontramos
na literatura uma variedade de estudos com diferentes protocolos de ataque ácido
(Callen et al., 1995; Kieswetter et al., 1996; Klokkevold et al., 1997, Kilpadi et al.,
1998; Klokkevold et al., 2001; Li et al., 2001). Acreditamos que somente com
resultados de futuras pesquisas com protocolos definidos e reproduzíveis utilizando
diferentes ácidos, concentrações, temperaturas e tempos de exposição sobre o Ti com
Discussão 86
diferentes texturas de superfície, é que poderemos compreender melhor este
mecanismo.
A atividade de fosfatase alcalina e a formação de nódulos de matriz são
indicadores de diferenciação osteoblástica. Ozawa & Kasugai (1996) encontraram
um baixo nível de atividade de ALP após 7 dias em cultura e, um grande aumento na
atividade dosada aos 14 dias, além de observarem o mesmo nível de atividade entre
as células cultivadas sobre o titânio e aquelas cultivadas diretamente sobre o plástico,
como controle, levando-os a concluírem que o titânio não afeta a diferenciação
osteoblástica. Em geral, células cultivadas sobre superfícies mais rugosas tendem a
exibir maior diferenciação osteoblástica, como por exemplo, uma maior atividade de
fosfatase alcalina (De Santis et al., 1996; Boyan et al., 1998; Hatano et al., 1999). Tal
atividade de ALP parece ser uma característica de células osteoblásticas pois tem
sido relatado em estudos com culturas de células de osteossarcoma MG63 (Boyan et
al., 1998), osteoblastos de embriões de galinha (Groessner-Schreiber & Tuan, 1992)
e humanas (Rosa & Beloti, 2002b). Por outro lado, enquanto Rosa & Beloti (2002a)
não observaram qualquer efeito sobre a ALP , outros autores relatam aumento na
ALP sobre superfícies lisas (Stanford et al., 1994; Martin et al., 1995; Kieswetter et
al., 1996). Acreditamos que as diferenças de origem celular tornam difíceis as
comparações entre os resultados da literatura acima citados, uma vez que, a
princípio, apresentam comportamento diferenciado. Em nosso estudo, os tratamentos
de superfície realizados não influenciaram a atividade de ALP tanto aos 14 quanto
aos 21 dias de cultura. Isto se justifica pois os valores de Ra entre os grupos foram
semelhantes, e o aumento na atividade de ALP ocorreria com o aumento da
rugosidade de superfície (Boyan et al., 1998; Lincks et al., 1998).
Discussão 87
Este estudo mostrou uma diferença significante na formação de nódulos de
matriz mineralizada sobre as superfícies testadas após 21 dias de cultura,
diferentemente de Castellani et al. (1999) e Rosa & Beloti (2002a) que não
encontraram diferenças na formação de nódulos de matriz mineralizada em
condições de rugosidades variadas. Além da evidente diminuição da formação de
nódulos dos grupos testados em relação as poços controle, houve diferenças entre os
grupos experimentais, havendo menor formação de matriz mineralizada sobre as
superfícies T3 e T4. Desta forma, ficou caracterizado que ocorreu menor formação
de nódulos sobre as superfícies que sofreram jateamento de Al2O3. Poderíamos
sugerir que a topografia de superfície irregular e menos organizada pode ter sido
desfavorável, ou que a presença de Al detectado sobre tais superfícies tenha
influenciado negativamente a formação de matriz mineralizada, conforme o relato de
Blumenthal & Posner (1984). Dentre as superfícies jateadas, a porcentagem de
mineralização sobre a superfície final T4 foi ainda menor. Sendo a composição da
química de superfície, rugosidade e a topografia semelhantes entre as superfícies T3
e T4, poderíamos especular que tais diferenças podem ter ocorrido devido à uma
possível influência do ataque ácido sobre T4, o que poderia alterar a configuração de
superfície ao nível ultraestrutural nanométrico, energia de superfície ou até mesmo a
camada de óxido (Albrektsson, 1998; Ellingsen, 1998). Entretanto seriam necessários
outros métodos de estudo para pesquisar a influência do ataque ácido sobre os
parâmetros citados.
Os diferentes resultados de mineralização observados na literatura poderiam
ser explicados pela diferença nos graus de diferenciação osteoblástica. Por exemplo,
Martin et al. (1995) e Kieswetter et al. (1996) usaram células osteoblásticas de
Discussão 88
osteossarcoma MG63 que não são capazes de produzir nódulos de matriz
mineralizada. Por outro lado, Stanford et al. (1994) e Hatano et al. (1999) utilizaram
células de calvária de ratos que possuem uma maior capacidade de formação de
matriz (Castellani et al., 1999) do que as células de medula óssea de ratos utilizadas
no trabalho de Rosa & Beloti (2002a). Devido as diferentes origens celulares e
diferenças nos métodos experimentais de caracterização de superfície do Ti, a
comparação de resultados se torna difícil ou até mesmo questionável.
Segundo alguns autores, haveria um grau de rugosidade que otimizaria a tanto
a diferenciação osteoblástica in vitro (Martin et al., 1995; Kieswetter et al., 1996;
Boyan et al., 1998; Lincks et al., 1998; Deligianni et al., 2001; Rosa & Beloti,
2002b) quanto a formação óssea in vivo (Thomas & Cook, 1985; Buser et al., 1991;
Orr et al., 1992; Han et al., 1998; Wennerberg , 1998; Li et al., 1999). Tal valor seria
de cerca de 1,0 a 1,5µm (Wennerberg et al., 1995; Wennerberg et al., 1996a;
Wennerberg et al., 1996b; Wennerberg et al., 1996c). Para Albrektsson (1998),
implantes com rugosidade acima de 1,5µm apresentariam uma maior taxa de
corrosão e de liberação de íons para os meios teciduais, o que seria desfavorável para
a osseointegração. Entretanto, o grau de rugosidade alcançado pelos tratamentos
realizados no cpTi avaliado em nosso trabalho, ultrapassa este nível de Ra
denominado ideal. Da mesma forma, os discos avaliados em nosso estudo também
apresentaram um valor maior de Ra do que os observados em implantes comerciais
de cpTi reconhecidos pela alta taxa de sucesso clínico como os da Impla-Med
(Ra=0,54), 3i (Ra=0,67), e Nobelpharma (Ra= 0,53) (Wennerberg et al., 1993).
Porém, pesquisas mais recentes vêm mostrando resultados biológicos favoráveis com
implantes de cpTi texturizados por duplo ataque ácido a uma rugosidade que varia de
Discussão 89
1 a 2 µm (Klokklevold et al., 1997; Klokklevold et al., 2001, Lazzara & Davies,
2001).
Devemos ainda ressaltar que a influência da configuração da morfologia de
superfície dos implantes ao nível nanométrico sobre a resposta biológica aos
implantes não é bem compreendida (Kieswetter et al., 1996; Cooper et al., 1998;
Castellani et al., 1999; Park & Davies, 2000; Park et al., 2001). Acreditamos que a
avaliação isolada da rugosidade de um implante em µm, não seja um parâmetro ideal
para a sua caracterização, pois superfícies com os mesmos valores de Ra podem
apresentar morfologias diferenciadas, conforme observado em nossos resultados.
Somente com a utilização e desenvolvimento de outros métodos de caracterização é
que poderemos futuramente compreender melhor a interferência de alterações
ultraestruturais sobre a resposta óssea.
Nosso estudo in vitro fornece uma contribuição para a compreensão das
respostas celulares às diferentes texturas de cpTi estudadas. Entretanto, mesmo se
tratando de um método controlado, apresenta limitações. Ao nosso ver, uma
complementação com estudos in vivo, utilizando implantes em tecido ósseo de
origem embriológica semelhante aos ossos maxilares humanos, permitiria uma
melhor compreensão da influência destas diferentes topografias de superfície sobre a
osseointegração.
CONCLUSÃO
Conclusão 91
CONCLUSÃO
1. Os tratamentos realizados não influenciaram a rugosidade de superfície do
cpTi.
2. O jateamento de superfície por Al2O3 originou uma topografia de
superfície mais irregular nos grupos T3 e T4.
3. O jateamento descrito impregnou as superfícies T3 e T4 com Al.
4. As superfícies estudadas foram biocompatíveis pois proporcionaram
adesão e proliferação celulares, síntese de proteínas, atividade de fosfatase
alcalina e produção de matriz mineralizada.
5. Pela observação da quantidade de proteína total diminuída no grupo T4
tanto aos 14 quanto aos 21 dias de cultura, e menor formação de nódulos
de matriz mineralizada sobre as superfícies T3 e T4 aos 21 dias de
cultura.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas 93
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RESUMO
Resumo 114
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar a biocompatibilidade do Ti com
diferentes tratamentos de superfície utilizando cultura de osteoblastos. As superfícies
dos discos de Ti comercialmente puro foram preparadas por meio de usinagem (T1),
usinagem + HNO3 (T2), usinagem + jateamento com Al2O3 (T3) e usinagem +
jateamento com Al2O3 + HNO3 (T4). As superfícies foram avaliadas quanto a
rugosidade e a topografia. Osteoblastos obtidos pela diferenciação de células de
medula óssea de ratos foram cultivados sobre discos de Ti e os seguintes parâmetros
foram avaliados: adesão e proliferação celular, medida de proteína total, atividade de
fosfatase alcalina e formação de nódulos de matriz mineralizada. Os dados foram
comparados por meio de ANOVA. Não houve diferença nas superfícies quanto a
rugosidade e observou-se, por meio de microscopia eletrônica de varredura, que T3 e
T4 mostraram topografia mais irregular. Tanto a adesão após 4 e 24 hs como a
proliferação celular após 7, 14 e 21 dias não foram afetadas pelos tratamentos de
superfície. A quantidade de proteína total avaliada na superfície T4 foi menor do que
nas outras superfícies após 14 e 21 dias de cultura. Não houve diferença entre as
superfícies na atividade de fosfatase alcalina nos períodos de 14 e 21 dias. A
formação de matriz mineralizada após 21 dias de cultura foi menor sobre as
superfícies T3 e T4. Estes resultados sugerem que estes tratamentos de superfície
com jateamento ou a combinação do jateamento e ataque ácido interferem
negativamente com a biocompatibilidade do Ti.
Palavras-chave: implante, biocompatibilidade, titânio
ABSTRACT
Abstract 116
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the biocompatibility of Ti with different
surface treatments using culture of osteoblast-like cells. The surfaces of
commercially pure titanium discs were machined (T1), machined + acid etched
HNO3 (T2), machined + sandblasted Al2O3 (T3) and machined + sandblasted Al2O3 +
acid etched HNO3 (T4). The surface evaluation included average roughness and
topography. Osteoblast-like cells obtained from rat bone marrow cells were cultured
on Ti discs and the evaluated parameters were: cell adhesion and proliferation, total
protein content, alkaline phosphatase activity and bone-like nodules formation. Data
were compared by ANOVA. There was no difference among the surfaces in average
roughness while SEM showed that T3 and T4 presented a more irregular topography.
Cell adhesion after 4 and 24 hours were not affected by the surface treatments,
neither were cell proliferation after 7, 14 and 21 days of culture. Total protein
content on T4 was the lowest after 14 and 21 days of culture. There was no
difference between the surfaces regarding to alkaline phosphatase activity in 14 and
21 days periods. Bone-like nodules formation after 21 days of culture was lower on
T3 and T4 surfaces. These results suggest that these surface treatments by either
sandblasting or the combination of sandblasting and acid etching negatively affect
the biocompatibility of Ti.
Key-words: implant, titanium, biocompatibility

samuel porfírio xavier

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