1 universidade estadual de santa cruz ronaldo costa argôlo
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1 universidade estadual de santa cruz ronaldo costa argôlo
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ RONALDO COSTA ARGÔLO FILHO IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro de 2007 1 RONALDO COSTA ARGÔLO FILHO IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigêcias para a obtenção do título de mestre em Genética e Biologia Molecular. Área de Aplicada Concentração: Microbiologia Genética Molecular Orientadora: Prof.ª Rachel Passos Rezende ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro de 2007 2 RONALDO COSTA ARGÔLO FILHO IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigêcias para a obtenção do título de mestre em Genética e Biologia Molecular. Área de Aplicada Concentração: Microbiologia Genética Molecular Orientadora: Prof.ª Rachel Passos Rezende Ilhéus – BA, 27 de fevereiro de 2007 João Carlos Teixeira Dias – D.S. UESC/DCB João Luciano Andrioli – D.S. UESC/DCB Mara Lúcia Albuquerque Pereira – D.S. UESB/DEBI Rachel Passos Rezende – D.S. UESC/DCB (Orientadora) 3 DEDICATÓRIA À minha família que, com muito carinho e apoio, estiveram presentes nos bons e maus momentos não medindo esforços para que eu vencesse mais esta etapa na minha vida. 4 AGRADECIMENTOS A Deus por ter me iluminado em mais uma jornada e me dado forças para chegar até aqui. Aos meus pais, Ronaldo e Marinez, que por muitas vezes renunciaram seus desejos e sonhos para me proporcionarem mais esta vitória. Minha eterna gratidão. Aos meus irmãos, Rogério, Lizziane e Ramon, pela compreenção e amor dedicados. Muito obrigado. À minha noiva Katiane pelo carinho, compreensão, paciência e por estar ao meu lado durante todos os momentos dessa caminhada. Com amor, obrigado. Ao Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular. A todos os professores que participaram desta jornada, sempre solícitos, até mesmo fora do horário do curso, porque sem eles não haveria enriquecedoras idéias. Meus sinceros agradecimentos. À minha orientadora, que se portou como só o fazem os mestres. Acreditando no meu trabalho, deu-me a liberdade necessária dividindo comigo as expectativas, conduziu-me a maiores reflexões que ajudaram a transformar idéias em palavras. Minha especial admiração e gratidão. A Bianca e João que sempre estavam por perto quando eu precisava de um conselho ou uma palavra amiga de incentivo. Com respeito, admiração e carinho, muito obrigado. Aos meus colegas do Mestrado em Genética e Biologia Molecular, pelos momentos de convívio, estresses e alegrias. Obrigado. Aos amigos do laboratório de Monitoramento Ambiental, pelo companherismo, ajuda, carinho e dedicação. Com saudades, obrigado. À profª Selene e a Teti que contribuiram e incentivaram a realização deste trabalho. Obrigado. À Fiocruz na pessoa da Dr.ª Eliane Falavina dos Reis que contribuiu com a identificação das amostras. Meus sinceros agradecimentos. À Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular pela oportunidade e auxílio na execução deste trabalho. Obrigado. Finalmente, a todos que, de uma forma ou de outra, me ajudaram. Meu muito obrigada. 5 IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO RESUMO A Salmonella é um bacilo Gram-negativo, flagelado, anaeróbio facultativo, causadora da salmonelose. Esse gênero compreende duas espécies: S. enterica e S. bongori, sendo a primeira subdividida em seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica). De acordo com fatores antigênicos, essas subespécies foram divididas em mais de 2.500 sorotipos. A maioria das infecções por Salmonella é causada pela ingestão de alimentos contaminados, principalmente os de origem animal. Os répteis merecem destaque, pois a Salmonella é considerada pertencente a sua microbiota intestinal normal. O Teiú (Tupinambis sp.) é um dos maiores lagartos do Brasil, sendo importante devido ao alto valor de sua pele, sua utilização na alimentação e como animal de estimação. Com o aumento da popularidade dos animais exóticos, aumenta-se o risco de infecções devido ao contato inadequado com esses animais. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a prevalência de Salmonella nesses animais, identificar os níveis de resistência dos isolados a antibióticos e diferenciar os sorotipos por meio da PCR-DGGE. Para isso, foram coletadas amostras fecais de teiús (Tupinambis merianae) criados em cativeiro em dois períodos. No primeiro período, 86,67% dos animais foram positivos para Salmonella. Todos os isolados foram sensíveis a Gentamicina e Ampicilina. A S. Carrau, S. Rubislaw e S. Infantes foram os sorotipos que apresentaram maior resistência aos antibióticos testados. No segundo período, após a introdução de limpeza semanal das baias, verificou-se a presença de 81,48% de positividade para Salmonella. Devido a intermitência na liberação de Salmonella nas fezes pelos répteis, quatro animais negativos no primeiro período foram considerados positivos no segundo. Podemos assim considerar que 100% dos teiús eram portadores dessa bactéria. A PCR-DGGE tem sido amplamente utilizada por permitir o estudo filogenético de comunidades microbianas. Doze sorotipos isolados dos Teiús e mais sete isolados de serpentes foram submetidos à PCR-DGGE. Quando amplificados com o par de iniciadores ST11-ST15, somente as cepas rugosas de Salmonella apresentaram um padrão eletroforético diferente dos demais, demonstrando um alto grau de conservação desta região. A região V3 do 16S RNAr mostrou-se também bastante conservada não diferenciando a maioria dos sorotipos. Quanto a região V6V8 do 16S RNAr, esta também não diferenciou eficientemente os diferentes sorotipos, mas foi possível formar grupos de similaridade. Este é o primeiro estudo a aplicar esta técnica na análise da variedade genética de Salmonella e nosso estudo revelou o grande risco do contato com répteis. Torna-se imperativo o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico e tipagem mais rápidos e eficazes, que sejam capazes de identificar cepas novas ou que não são classificadas pelos métodos tradicionais e que também sirvam para análises evolutivas. Palavras-chave: Salmonelose; Réptil; Tupinambis sp.; PCR; DGGE. VI6 IDENTIFICATION, SEROTYPING AND DIFFERENTIATION BY PCR-DGGE OF SALMONELLA SEROTYPES ISOLATES FROM CAPTIVITY TEGUS ABSTRACT Salmonella is a Gram-negative bacillus, flagellate, facultative anaerobe and etiologic agent of salmonellosis. This genus encloses two species: S. enterica and S. bongori, being the first one subdivided in six subspecies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae and indica). In accordance with antigenic factors, these subspecies has been subdivided in more than 2.500 serotypes. The majority of the Salmonella infections are caused by the contaminated food ingestion, mainly of animal origin. The reptiles deserve prominence, because the Salmonella is considered pertaining to its normal enteric microbiota. The Tegu (Tupinambis sp.) is one of the biggest brazilian lizards, being important because to the high value of its skin, use in the feeding and as pet animal. With the increase of the exotic animals popularity, the risk of infections have grown due to the inadequate contact with these animals. Thus, the aim of this work was to study the Salmonella prevalence in these animals, to identify the antibiotic resistance levels exhibited by the isolates and to differentiate the serotypes by PCR-DGGE. For this, fecal samples of the captivity tegus (Tupinambis merianae), in two periods, were collected. In the first period, 86.67% of the animals were positive for Salmonella. All the strains were sensible the Gentamicin and Ampicilin. The S. Carrau, S. Rubislaw and S. Infants were the serotypes that had presented greater resistance to the tested antibiotics. In the second period, after the introduction of weekly cleanness in the cages, it verified presence of 81.48% Salmonella. Four negative animals in the first period had been considered positive in second, by the intermittent release of Salmonella in the reptile’s feces. Thus, we can consider that 100% of tegus were carrying of this bacterium. The PCR-DGGE has been widely used for filogenetic studies of microbial communities. Twelve Tegu’s isolates serotypes and seven serpent’s isolates serotypes were submitted to the PCR-DGGE. With the pair of primers ST11-ST15, only Salmonella rough strains had presented a different eletrophorretic profile from others, demonstrating a high degree of region conservation. The region V3 of 16S rRNA also revealed very conserved, it did not differentiate the majority of the sorotypes. Also the region V6-V8 of 16S rRNA did not differentiate efficiently the Salmonella serotypes. But, it was possible group the strains in clusters of similarity. This is the first study to apply this technique in the analysis of the genetic variety of Salmonella, and our study showed the great risk of the contact with reptiles. It’s imperative the development of faster methods of diagnosis and typing, that they are capable to identify new strains or unclassified strains by the traditional methods and that also serve for evolutionary analysis. Keywords: Salmonellosis; Reptile; Tupinambis sp.; PCR; DGGE. VII 7 LISTA DE TABELAS 1. Exemplos de Salmonella e seus hospedeiros....................................................6 2. Aparência da Salmonella nos meios seletivos mais comumente usados........18 3. Reações bioquímicas típicas de Salmonella spp.............................................19 4. Sorotipos de Salmonella isolados de serpentes...............................................49 5. Correlação entre os sorotipos de Salmonella enterica encontrados e a idade e baias dos animais analisados...........................................................................54 6. Padrões de resistência a antibióticos dos sorotipos de Salmonella enterica isoladas de 30 teiús..........................................................................................60 7. Grupos de similaridade gerados a partir da DGGE da região V6-V8 do 16S RNAr.................................................................................................................66 VIII 8 LISTA DE FIGURAS 1. Prevalência da S. Enteretidis, Typhimurium e outros sorotipos na Europa de 1998-2003..........................................................................................................7 2. Esquema da infecção por Salmonella por diferentes vias de administração (oral, intraperitoneal e intravenosa)...................................................................11 3. Invasão da mucosa intestinal pela Salmonella (setas pretas). Notar a destruição da mucosa após a invasão (setas vermelhas).................................12 4. Demonstração esquemática do desenvolvimento da diarréia...........................13 5. Princípio da Reação da Polimerase em Cadeia. Pequenas seqüências específicas de DNA (iniciadores) são utilizados para se ligarem às fitas de DNA desnaturado pelo aquecimento. Uma enzima termoestável (DNA polimerase) extende os iniciadores para formar a nova fita complementar...........................23 6. Sequência da região JEO402-1 isolado do cromossomo da S. Typhimurium LT2. A sequência sublinhada destaca a região utilizada para o desenho dos iniciadores..........................................................................................................25 7. Estrutura secundária do RNAr 16S. As regiões conservadas estão representadas pelas linhas em negrito e as variáveis (V1-V9) pelas linhas finas ...................................................................................................................27 8. Figura representativa do teiú (Tupinambis merianae)........................................42 9. Realização da coleta da amostra utilizando swab estéril...................................43 10. Aspecto das culturas de Salmonella em Agar XLT4 (esquerda) e SS (direita) e aspectos das colônias (detalhe).........................................................................44 11. Esquema representativo das principais provas bioquímicas para identificação de Salmonella.....................................................................................................46 12. Representação dos halos de inibição de crescimento pelo método de disco-difusão.......................................................................................................48 13. Esquema de preparação do gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante utilizando um “gradient maker”, sistema para produção do gradiente linear...................................................................................................52 14. Prevalência dos Sorotipos de Salmonella enterica encontrados nos 26 animais positivos da 1° análise................................................................................56 IX9 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR das amostras dos teiús e serpentes, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-ST15 (469 pb); (B) iniciadores F357GC-R518 (200 pb) e (C) iniciadores F984GC-R1378 (473 pb); 1, Marcador de peso molecular pGEM® (Promega); 2, Salmonella Carrau; 3, S. Rubislaw; 4, S. Agona; 5, S. Infantis; 6, S. Saintpaul; 7, S. Panama; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. I (O:6,7:-:1,5); 11, S. I (O:6,14,24:y:-); 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 13, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 14, S. Gaminara ; 15, S. Newport; 16, S. IV (O:61:c:1,5); 17, S. IIIb (O:47); 18, S. I (O:4,5:b:-); 19, S. I (O:4,5); 20, S. I (O:11:r:-).............................................................................................................62 16. DGGE dos produtos da PCR, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-ST15; (B) iniciadores F357GC-R518 e (C) iniciadores F984GC-R1378; 1, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 2, S. I (O:6,14,24:y:-); 3, S. Rubislaw; 4, S. Panama; S. I (O:6,7:-:1,5); 6, S. Infantis; 7, S. Agona; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. Carrau; 11, S. Saintpaul; 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 13, S. Newport; 14, S. I (O:11:r:-); 15, S. IV (O:61:c:1,5); 16, S. Gaminara ; 17, S. I (O:4,5:b:-); 18, S. IIIb (O:47); 19, S. I (O:4,5)..........................................................................................................65 X10 LISTA DE SIGLAS A Adenosina AMP Monofosfato de Adenosina C Citosina Clֿ Íon cloreto DCB Departamento de Ciências Biológicas DGGE Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante DNA Ácido Desoxirribonucleico GM-CSF Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos G Guanina HCO3ֿ Íon hidrogenocarbonato IL Interleucina IFN Iterferon + Potássio K MCP Proteína Quimiotactante de Monócitos Na+ Sódio pb Pares de Base PCR Reação da Polimerase em Cadeia pH Potencial Hidrogeniônico RNA Ácido Ribonucleico rpm Rotações por minuto UESC Universidade Estadual de Santa Cruz TAE Tris-Base, Ácido Acético e EDTA T Timina TNF Fator de Necrose Tumoral V Volts XI 11 SUMÁRIO RESUMO.....................................................................................................VI ABSTRACT.................................................................................................VII 1. 1.1. 2. INTRODUÇÃO.............................................................................................1 Objetivos ................................................................................................3 A SALMONELLA........................................................................................4 2.1. Morfologia e Taxonomia........................................................................4 2.2. Importância Epidemiológica.................................................................6 2.3. Patogênese da Infecção por Salmonella.............................................9 2.4. Imunidade dos Animais à Salmonella.................................................14 2.5. Detecção de Salmonella.......................................................................15 2.5.1. Detecção Microbiológica.........................................................................16 2.5.1.1. Identificação Bioquímica....................................................................19 2.5.1.2. Detecção sorológica...........................................................................20 2.5.2. Detecção Molecular.................................................................................21 2.5.2.1. Reação da Polimerase em Cadeia.....................................................21 2.5.2.2. Caracterização Molecular...................................................................26 2.6. Prevenção da Salmonelose...................................................................31 2.7. Tratamento da Salmonelose.................................................................32 2.7.1. Sensibilidade a Antibióticos.....................................................................33 2.8. Salmonella em Répteis..........................................................................35 2.8.1. O Teiú......................................................................................................40 3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................42 3.1. Amostragem...........................................................................................42 3.2. Cultivo e Identificação da Salmonella..................................................43 3.3. Teste de Sensibilidade a Antibióticos..................................................47 3.4. Análise Estatística.................................................................................48 3.5. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR).............................................48 3.5.1. Extração do DNA.....................................................................................48 3.5.2. Iniciadores................................................................................................49 3.5.3. Amplificação ............................................................................................50 3.5.4. Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE)....................51 XII 12 4. RESULTADOS E DISCUSSÂO..................................................................53 4.1. Análise Bacteriológica..........................................................................53 4.2. Sorotipagem......................................................................................55 4.3. Antibiograma..........................................................................................58 4.4. Caracterização Molecular......................................................................61 5. CONCLUSÕES............................................................................................68 REFERÊNCIAS...........................................................................................69 ANEXO........................................................................................................83 XIII 13 1. INTRODUÇÃO O Teiú é um dos maiores lagartos encontrados em território brasileiro, sendo economicamente importante devido ao alto valor de sua pele. Além disso, a população do interior do país, assim como os povos indígenas, utilizam a carne deste animal como fonte de proteína em sua dieta, e sua gordura para fins medicinais. A salmonelose é um dos mais importantes problemas de saúde pública, afetando mais pessoas e animais que qualquer outra simples doença. O habitat natural dos membros do gênero Salmonella é o intestino de vertebrados de sangue quente e sangue frio, de onde os microrganismos são disseminados em ambientes podendo prontamente sobreviver e se multiplicar. É normalmente difícil avaliar a situação da salmonelose em países em desenvolvimento devido à escassez de estudos e da falta sistemática da vigilância epidemiológica. Répteis de vida livre bem como domesticados têm sido demonstrados como reservatórios de Salmonella. Estes animais podem portar o agente sem demonstrar qualquer sinal clínico. Estima-se que 60 a 90% de todos os répteis portam e disseminam Salmonella continuamente, porque ela faz parte de sua microbiota intestinal normal. 1 No Brasil, poucos estudos epidemiológicos têm sido realizados demonstrando a prevalência de Salmonella spp. em répteis. Essas informações são de grande importância, visto que no Brasil grande parte da população vive no meio rural e em tribos indígenas, consumindo a carne de animais silvestres, assim como os répteis, sem saber sobre o grande risco de contrair infecções por Salmonella, caso a carne não seja devidamente preparada e cozida. A carência de pesquisas sobre a prevalência de Salmonella em répteis no município de Ilhéus/BA, como também em todo país, motivou-nos a estudá-la, a fim de verificar quais são os sorotipos mais freqüentes isolados de teiús nessa região. O uso crescente de antibióticos por criadores e vendedores no tratamento profilático de animais pode contribuir para o desenvolvimento de cepas de Salmonella resistentes a antibióticos, que podem causar infecções que não respondam a antibioticoterapia. O monitoramento da susceptibilidade a antimicrobianos da Salmonella é importante para substanciar a escolha de antimicrobianos para o tratamento da salmonelose clínica e para avaliar o risco de transferência de Salmonella para o homem. Em microbiologia clínica, a identificação rápida e correta dos agentes infecciosos é um requisito essencial para o diagnóstico e a posterior aplicação de um tratamento adequado. Assim, técnicas moleculares têm sido desenvolvidas com o intuito de aumentar a especificidade e sensibilidade dos diagnósticos, reduzindo tempo, custos e a subjetividade de protocolos microbiológicos. As atividades de elucidação de agentes de enfermidades transmitidas por répteis devem ser sistematizadas pela notificação destes eventos. As informações de expostos/afetados, período de incubação e sinais e sintomas prevalentes são de importância para que programas de controle sejam mais específicos e eficazes. 2 Assim, a ameaça imposta por zoonoses de répteis merece mais consideração e estudos, pois o contato com estes animais consiste em uma grande ameaça a saúde pública. 1.1. Objetivos 1.1.1. Objetivo Geral • Estimar a prevalência de infecções por Salmonella em Teiús (Tupinambis merianae) criados em cativeiros e diferenciar os sorotipos utilizando a técnica da PCR-DGGE. 1.1.2. Objetivos Específicos • Identificar os sorotipos; • Verificar a sensibilidade dos isolados à uma seleção de antibióticos; • Analisar os riscos do consumo e manipulação desses animais; • Verificar a capacidade dos iniciadores ST11-ST15, F357-R518 e F984-R1378 em diferenciar sorotipos de Salmonella pela PCR-DGGE. 3 2. A SALMONELLA 2.1. Morfologia e Taxonomia O gênero Salmonella, pertencente à família Enterobacteriaceae, é composta por bactérias anaeróbias facultativas, gram-negativas em forma de bacilos, que possuem tipicamente 0,7 à 1,5µm de lagura e 2 à 5µm de comprimento, embora longos filamentos possam ser formados (Pelczar, 1997). A classificação atual do gênero Salmonella é baseada em características bioquímicas e homologia de DNA (Aabo, 1993) que divide o gênero Salmonella em duas espécies: Salmonella enterica, que está dividida em seis subespécies, e Salmonella bongori. A sorotipagem é usada para identificar esse microrganismo além do nível de subespécie, a partir de um esquema desenvolvido por Kauffman e White (Brenner et al., 2000), que divide o gênero em tipos sorológicos (sorotipos ou sorovares), tendo por base a composição antigênica das Salmonellas com relação aos seus antígenos “O” (somático), “Vi” (capsular – presente em alguns sorotipos) e “H” (flagelar), estando o antígeno “O” relacionado com a virulência da Salmonella (Brenner et al., 2000; Tindall et al., 2005). Quando uma cepa não expressa o antígeno O, esta é designada como variante “Rugosa” no lugar do antígeno O na 4 sua fórmula antigênica. Uma outra variante que impede a sorotipagem da Salmonella é a “Mucoide” que expressa uma cápsula, impedindo a detecção também do antígeno O, sendo também designada no local do antígeno O em sua fórmula antigênica (CDC, 2005). A caracterização antigênica da Salmonella é uma poderosa ferramenta epidemiológica. Entretanto, não é amplamente utilizada por laboratórios de diagnóstico de processos infecciosos, o que restringe um melhor conhecimento da dinâmica de circulação deste patógeno. Atualmente, o gênero é composto por cerca de 2.541 (CDC, 2005) sorotipos diferentes, sendo aproximadamente 60% pertencentes a Salmonella enterica subespécie enterica (I), que coloniza o trato entérico de animais de sangue quente, sendo responsáveis por 99% das infecções humanas, enquanto que os outros 40% pertencem às outras subespécies salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), indica (VI) e à espécie S. bongori, estas comumente encontradas em animais de sangue frio e no ambiente (Brenner et al., 2000; Solari et al., 2003). Os sorotipos de Salmonella podem estar estritamente adaptados a um hospedeiro ou podem ser encontrados em um grande número de espécies animais (Tabela 1) (Baumler, 1998; Campos, 1999). Para pesquisa veterinária e humana as cepas mais importantes pertencem a S. enterica subsp. enterica como habitantes de animais sangue-quente. A nomenclatura da Salmonella é complexa, com cientistas que usam muitos sistemas diferentes. Anteriormente a cepa descrita, por exemplo, como Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium é atualmente chamada de Salmonella Typhimurium, utilizando uma nova designação do CDC que encurta os nomes (Brenner et al., 2000). 5 Tabela 1. Exemplos de Salmonella e seus hospedeiros Hospedeiro Sorotipos Humano S. Typhi, S. Paratyphi, S. Sendai, S. Schottmuelleri, S. Hirschfeldii Bovino S. Dublin Suino S. Choleraesuis, S. Typhisuis Frango S. Pullorum, S. Gallinarum Ovino S. Abortusovis Equino S. Abortusequi Fonte: (Baumler, 1998) Entretanto existem sorotipos que, embora não sejam adaptados a alguma espécie hospedeira, pode causar a doença tanto em humanos como em outros animais. As mais importantes são S. Typhimurium e S. Enteretidis, que têm sido envolvidas em muitos surtos de salmonelose (CDC, 2005). 2.2. Importância Epidemiológica A Salmonella tem sido recuperada a partir do intestino de um grande número de animais incluindo peixes, répteis, aves, e mamíferos (Wray; Sojka, 1977; Cox et al., 1999). A sua excreção com as fezes pode comtaminar água, solo, outros animais e alimentos. Os animais são infectados pelo contato direto, pelo contato com as fezes de animais infectados ou com água e alimentos contaminados. Um estudo americano indicou que a grande maioria (95%) dos casos de salmonelose em humanos foram transmitidos por alimentos, e que crianças, idosos, gestantes e 6 pessoas imunodeprimidas fazem parte do grupo de risco à infecção (Olsen et al., 2001). A figura 1 mostra o número de casos de salmonelose humana reportados em 24 países da Europa de 1998 a 2003, onde mais de 80% dos casos foram causados Nº. de Casos Notificados pela S. Enteretidis e S. Typhimurium (Fisher, 2004). 220000 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 1998 Enteretidis Typhimurium Outras 1999 2000 2001 2002 2003 Anos Figura 1. Prevalência da S. Enteretidis, Typhimurium e outros sorotipos na Europa de 1998-2003. Fonte: (Adaptado de Fisher, 2004) Perdas financeiras resultantes de infecções por Salmonella são consideráveis. Em 1996 o Serviço de Recursos Econômicos dos Estados Unidos (ERS) estimou que infecções por Salmonella, veiculadas por alimentos, em humanos causaram um custo total de $0.6 a $3,5 bilhões de dólares anualmente em despesas médicas e perdas na produtividade (Dargatz et al., 1998). Atualmente, cerca de 1,4 milhão de casos de salmonelose ocorre a cada ano nos EUA, resultando em cerca de 600 mortes. Apenas 2,5% desses casos são isolados e sorotipados (Brenner et al., 2000). No Brasil, entre os anos de 1999 e 2003 foram notificados 724 surtos de salmonelose, onde 654 foram por Salmonella spp., 55 S. Enteretidis, 10 S. Typhi e 5 por S. Paratyphi (Salmonella spp., 2007). Uma grande variedade de alimentos tem sido implicada como veículo de 7 transmissão da salmonelose, incluindo carne, ovos, leite, frutas, sucos e vegetais. A contaminação pode ocorrer ao longo da cadeia produtiva do alimento incluindo produção, beneficiamento, distribuição, venda em mercados, manuseio e preparo (Olsen et al., 2001; Zhao et al., 2003). A resistência das Salmonellas às adversidades ambientais é um ponto de destaque na epidemiologia das toxinfecções alimentares, pois esta se mantém virulenta por 89 dias em água de tanques, 120 dias em solo seco, 280 dias em gramados, 28 meses em fezes de aves, 30 meses em fezes de vaca e de répteis (Grespan, 2001; Vasconcellos, 2001; Laidlaw, 2003). Registra-se em todo mundo aumento da incidência de salmonelose humana causada por S. Enteritidis, principalmente por ser veiculada por aves e ovos. Este sorotipo também é importante por também causar infecções extra-intestinais muitas vezes fatais (Lírio et al., 1998; Hamada et al., 2003). Em São Paulo ocorreu um aumento no número de casos de salmonelose de 1992 a 1996 de aproximadamente 5% para mais de 50%. Alimentos de origem animal continuam sendo os principais responsáveis pelas infecções por Salmonella, demonstrando o risco que este alimento representa à saúde pública, se consumidos mal cozidos, indevidamente manipulados ou deteriorados (Lírio et al., 1998). A produção industrial de alimentos de origem animal e o intercâmbio comercial intensivo de animais e produtos destinados ao consumo humano têm favorecido a introdução e disseminação de novos sorotipos de Salmonella na cadeia alimentar. Alguns estão associados a diferentes fontes específicas de contaminação, e são isolados em uma área específica, outros podem ser freqüentemente isolados em diferentes países, a exemplo da S. Typhimurium e S. Enteritidis (Almeida et al., 2000). 8 2.3. Patogênese da Infecção por Salmonella A salmonelose caracteriza-se por uma enfermidade aguda, apresentando variações geográficas na freqüência dos sorotipos, atingindo a sua maior incidência em populações com baixa qualidade de higiene que não contam com medidas de saúde públicas satisfatórias (Gutiérrez-Cogco et al., 2000). A patologia de infecções por Salmonella é extremamente variável. Sua severidade é influenciada pelo sorotipo, virulência, resistência natural ou adquirida do hospedeiro, rota e quantidade da dose infectante (Reed et al., 1986). Embora a Salmonella possa entrar no corpo através da faringe, trato respiratório ou conjuntivas, a bactéria usualmente infecta o hospedeiro por via oral e se deposita no intestino, onde invadem os enterócitos (Wray; Sojka, 1977). A maior parte das infecções por Salmonella está confinada a região gastrintestinal, e são geralmente erradicadas por mecanismos de defesa natural dos hospedeiros. Estas defesas são importantes na resistência à colonização e invasão intestinal. Em indivíduos saudáveis, o número de Salmonella ingerido é reduzido no estômago, que tem uma acidez normal de pH menor que 3,5, sendo letal para ela. A motilidade intestinal também protege o intestino por arrastar a Salmonella ingerida. A microflora normal, provavelmente protege o intestino por meio de microrganismos anaeróbios que liberam cadeias de peptídeos (lactoferrina e lisozima) que são nocivos à Salmonella, e a secreção de anticorpos de mucosa (IgA) também protege o intestino contra esse patógeno (Giannella, 2000; Laidlaw, 2003). Como em outros bacilos Gram-negativos, o envelope celular da Salmonella contém um complexo de lipopolissacarídeos (LPS) estrutura que é liberada na lise 9 dos microrganismos. O LPS funciona como uma endotoxina, e é importante na determinação da virulência dos organismos, além de ser responsável pela especificidade do antígeno O. Eles provocam febre, ativam o sistema complemento, sistemas de coagulação, depressão na função do miocárdio, e altera a função linfocítica (Giannella, 2000). Para ser completamente patogênica, a Salmonella deve possuir uma variedade de atributos chamados fatores de virulência. Estes incluem a habilidade de invadir células, uma camada completa de lipopolissacarídeos, habilidade de se replicar intracelularmente, e possibilidade de produzirem toxinas (Giannella, 2000). Pesquisas indicam que o locus inv, encontrado em várias espécies de Salmonella e está relacionado com a aderência e invasão de células, sendo homólogo a fatores de virulência em outros patógenos (Finlay, 1994). A estratégia de virulência comum a Salmonella é invadir a mucosa intestinal, onde os tecidos linfóides associados ao intestino (Placas de Peyer’s) tentam limitar a multiplicação da bactéria. Se este mecanismo de defesa não obter sucesso, a Salmonella é drenada dos tecidos intestinais infectados para linfonodos regionais, onde entram em contato com os macrófagos que revestem os ductos linfáticos. Se esses mecanismos de defesa limitarem com sucesso a expansão bacteriana, a infecção permanece localizada no intestino e as bactérias são incapazes de se propagar. Caso contrário, a Salmonella pode causar bacteremia. A figura 2 mostra um esquema de três diferentes caminhos da infecção por Salmonella; infecções por via oral, intravenosa e intraperitoneal. Depois de uma infecção localizada, os patógenos se disseminam pelo corpo a partir do tecido linfóide associado ao intestino via ductos linfáticos eferentes e torácico até a veia cava (Baumler et al., 2000). 10 Infecção oral Colonização do intestino delgado Infecção intraperitoneal Drenagem para linfonodos mediastinais Invasão dos enterócitos e entrada nas Placas de Peyer Infecção localizada Drenagem para linfonodos mesentéricos Disseminação via ducto torácico até grandes vasos Infecção intra venosa Infecção sistêmica Sangue Sobrevivência e multiplicação em macrófagos de fígado e baço Figura 2. Esquema da infecção por Salmonella por diferentes vias de administração (oral, intraperitoneal e intravenosa). Fonte: (Baumler, 2000). A figura 3 mostra que após a invasão do intestino, a maioria das Salmonellas induz uma resposta inflamatória aguda, que pode causar destruição do epitélio e ulcerações. A invasão na mucosa intestinal leva as células epiteliais a sintetizar e liberar várias citocinas pré-inflamatórias incluindo: IL-1; IL-6; IL-8; TNF-2; IFN-U; MCP-1 e GM-CSF. Esta resposta inflamatória aguda causa sintomas como febre, apatia, dor abdominal, e diarréia (Giannella, 2000; Laidlaw, 2003). 11 Figura 3. Invasão da mucosa intestinal pela Salmonella (setas pretas). Notar a destruição da mucosa após a invasão (setas vermelhas). Fonte: (Gianella, 2000) A invasão da mucosa intestinal é seguida pela ativação da adenilciclase (AC), resultando no aumento dos níveis de AMP-cíclico e induzindo secreção de fluidos devido ao desequilíbrio hidroeletrolítico (H2O, Na+, Clֿ, K+, HCO3ֿ) (Figura 4). O mecanismo pelo qual adenilciclase é estimulada não é bem conhecido, podendo envolver o local de síntese de prostaglandinas ou outros componentes da reação inflamatória. Em adição, cepas de Salmonella elaboram uma ou mais enterotoxinas como substâncias que podem estimular secreção intestinal, agravando ainda mais a diarréia (Giannella, 2003). Durante a infecção de ratos com S. Enteretidis, aproximadamnete 80% das bactérias que sobreviveram a passagem através do estômago são liberadas com as fezes dentro de 6 a 10 horas após a infecção. Aproximadamente 15% permanecem localizadas no lúmen do ceco e intestino grosso, e somente 5% conseguem penetrar na parede do intestino delgado (Carter; Collins, 1974). 12 Cl - HCO3 H2O K LUZ INTESTINAL + Na+ MEMBRANA CELULAR HCO3 K+ - CL Na+ H2O Enterotoxinas AMPc Citocinas AMPc AC AC INFLAMAÇÃO ATP ENTERÒCITO AC AC INATIVA ATIVA ATP Figura 4. Demonstração esquemática do desenvolvimento da diarréia em uma infeção por Salmonella. Fonte: Elaborado a partir de Gianella (2000). Em mamíferos, folículos linfáticos do intestino delgado estão agrupados nas Placas de Peyer. Estes funcionam como principal porta de entrada para a Salmonella, e sua colonização contribui com o desenvolvimento da doença durante as infecções localizadas e sistêmicas. O fígado e o baço geralmente se encontram aumentados durante a infecção sistêmica (Baumler et al., 2000). Se a resposta imune local nos tecidos associados ao intestino é eficiente, uma distribuição equilibrada pode aparecer conduzindo a colonização ou até mesmo comensalismo das bactérias. Isto significa que os microrganismos sobrevivem no animal sem causar uma resposta imune específica ou uma infecção (Casadevall; Pirofski, 2000). De acordo com a patogênese, a salmonelose pode apresentar-se de várias formas, como febre entérica, gastroenterite, septicemia (infecção generalizada), infecções focais, e até mesmo um estado assintomático (Giannella, 2000; Casadevall; Pirofski, 2000; Baumler et al., 2000). É uma doença aguda de variável 13 severidade comumente manifestada por náuseas, vômitos, dores abdominais e diarréia (com ou sem sangue), geralmente é autolimitante, mialgia, cefaléia, febre (38º a 39ºC) e calafrios são comuns, no entanto, o sintoma patognomônico é a diarréia. Outros sintomas são sonolência e prostração (Meehan, 1996; Woodward et al., 1997; Giannella, 2000; Mermin, 2004). A Salmonella pode ser transportada pelos ductos linfáticos dos linfonodos regionais e migrar para os vasos sanguíneos eferentes, caindo na circulação sanguínea, causando septicemia, meningite, encefalite e osteomielite, podendo levar à morte (Woodward et al., 1997; Mermin, 2004). O período de incubação da Salmonella é de 12 a 72 horas, mas pode se extender por até uma semana. Em alguns surtos, onde um grande número de microrganismos são ingeridos, períodos de incubação tão curtos quanto 02 horas e 30 minutos têm sido reportados (DDTHA/CVE, 2005). 2.4. Imunidade dos Animais à Salmonella O sistema imune consiste em duas grandes categorias, imunidade natural e específica. Imunidade natural ou não-específica inclui as barreiras físicas e químicas, componentes do soro, assim como sistema complemento, células de defesa não-específicas, como neutrófilos polimorfonucleares, macrófagos e células natural killer (Portnoy, 1992). A imunidade específica ou adquirida está dividida em dois tipos, imunidade humoral e celular. Os anticorpos, produzidos pelos linfócitos B, provêm a função efetora ativa para a imunidade humoral. Esses anticorpos protegem o hospedeiro contra infecções pela ligação à superfície do organismo 14 infectante impedindo a invasão das células hospedeiras (Michetti et al., 1992), e aumentando sua fagocitose (Johnson et al., 1985). A imunidade celular é mediada por Linfócitos T e estas células podem também possuir função efetora (Linfócitos T citolíticos) ou função reguladora (células T auxiliares e supressores) pela modificação e ativação das células B ou outras células T. Este componente da resposta imunológica é importante na proteção contra patógenos intracelulares, como os vírus, parasitas e algumas espécies bacterianas, e atua pela eliminação direta da célula hospedeira infectada ou pela ativação de células fagocíticas de defesa (Schat, 1993). Ambas imunidades humoral e celular parecem atuar na proteção contra a infecção por Salmonella, embora ainda seja controversa a importância de cada uma delas em proteger o hospedeiro (Mastroein, 1993). 2.5. Detecção de Salmonella A confirmação do diagnóstico faz-se pelo isolamento do agente etiológico das matérias fecais do paciente ou do alimento suspeito através de provas bioquímicas e sorológicas, ou ainda através de alguns métodos de detecção rápida, como enzymeliked immunoassay (ELISA), imunodifusão, hibridização de DNA, hemoaglutinação e imunoflorescência, mas muitos destes métodos falham na especificidade (Rahn et al., 1992; Aabo et al., 1993; Burkhalter et al., 1995). Todos estes sistemas de rápida detecção requerem pré-enriquecimento seguido por enriquecimento seletivo e um pós-enriquecimento (Rahn et al., 1992). 15 O método de cultivo tradicional para Salmonella envolve um mínimo de três dias para amostras negativas e cinco dias para confirmação de amostras positivas desde o pré-enriquecimento até a confirmação bioquímica (Bailey et al., 1994; Lantz et al., 1994; Trkov; Avgustin, 2003). Para uma análise bacteriológica, as condições em que as amostras são transportadas e a escolha dos meios de cultivo podem drasticamente afetar os níveis de recuperação de Salmonella. Os protocolos rotineiros podem, certamente, subestimar a real prevalência de alguns biotipos tais como, lactose positivos e S. enterica subsp. IIIa e IIIb, que requerem meios especiais para não serem confundidos com coliformes (Tang et al., 1998; Corrente et al., 2004). Assim para controlar uma infecção com eficiência, a utilização de um rápido e preciso teste de diagnóstico é necessário . A Salmonella pode ser isolada a partir de fezes, pele, cavidade oral, vísceras e qualquer superfície que o hospedeiro tenha tido contato (Martino, 1999; Fegan et al., 2005). 2.5.1 Detecção Microbiológica O isolamento por meio da cultura de Salmonella é muito comum na produção animal e indústrias de alimentos. A maioria dos métodos microbiológicos foi desenvolvida para o diagnóstico clínico de salmonelose em humanos e animais (Flowers et al., 1992). Salmonella pode crescer a uma temperatura que varia de 2 a 54°C. Embora cresça abaixo de 7°C, essa propriedade tem sido amplamente observada somente 16 quando cultivada em meios bacteriológicos, não em alimentos. Enquanto que, o crescimento acima de 48°C é confinada a cepas mutantes. A ótima temperatura para seu crescimento é 37°C. A ecologia natural de muitas cepas de Salmonella que preocupam a saúde pública é o trato grastrointestinal de animais de sangue-quente (Cox et al., 1999; Brenner et al., 2000). O pH ótimo para o crescimento da Salmonella está entre 6,5-7,5, mas podem crescer em pH que varie de 4,05-9,5 (limites máximos) em meio líquido (Cox et al., 1999). Um grande número de meios para pré-enriquecimento tem sido proposto. O Caldo Lactosado (LB) foi, talvez, o primeiro a ser amplamente utilizado. Mas este foi alvo de críticas, pois a fermentação da lactose acaba por acidificar o meio a níveis inibitórios ou letais a Salmonella (Hiker, 1975). A Água Peptonada Tamponada (APT) tem sido usada por não possuir um açúcar fermentável. Fricker (1987) propôs que a APT é mais apropriada que o LB para o isolamento da Salmonella. Meios de enriquecimento seletivo são formulados para inibir seletivamente outras bactérias enquanto permite que a Salmonella se multiplique a níveis detectáveis. Atualmente existem três principais tipos de caldos para enriquecimento seletivo: Tetrationato, Selenito-Cistina e Rappaport-Vassiliadis (RV) (Nascimento et al., 2000). Alguns pesquisadores preferem utilizar o Selenito (Cox et al., 1972), enquanto outros preferem o Tetrationato (Cherrington et al.,1993) ou o RV (Bager; Petersen, 1991). A superioridade de um caldo sobre outro é variável. Segundo alguns autores, melhor que os resultados apresentados por um caldo sobre outro, seria a utilização combinada dos mesmos (Nascimento et al., 2000). Meios para plaqueamento não podem ser julgados somente por sua capacidade seletiva, mas também por sua habilidade em diferenciar colônias de Salmonella de outras bactérias. Diferentes tipos de meios foram desenvolvidos para 17 o isolamento de Salmonella, de onde as colônias suspeitas podem ser utilizadas para futuras investigações (Nascimento et al., 2000). A Tabela 2 resume a aparência das colônias de Salmonella em uma variedade dos mais frequentemente meios de cultivo utilizados. O ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) tem sido apontado como um dos mais específicos na identificação da Salmonella, e com uma sensibilidade equivalente ao Agar Entérico Hektoen (HE) (Dusch; M Altwegg, 1995). Nascimento et al. (2000) relatou que o ágar Salmonella-Shigella (SS), o ágar Xilose Lisina Desoxilato (XLD) e o HE quando associados entre si aumentam a sensibilidade na detecção de Salmonella. Tabela 2. Aparência da Salmonella nos meios seletivos mais comumente usados Aparência das colônias de Salmonella Meio de Cultura Agar Sulfito de Bismuto Preta metálica brilhante Agar Verde Brilhante Vermelha Agar Entérico Hektoen (HE) Azul-esverdeado com centro negro Agar MacConkey Clara Agar Rambach Vermelho com bordas pálidas Agar Salmonella-Shigella (SS) Clara com centro negro Agar Xilose Lisina Desoxilato (XLD) Vermelha Agar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) Vermelha com centro negro Fonte: Elaborado a partir de Littell (1977). 18 2.5.1.1. Identificação Bioquímica Colônias típicas de Salmonella encontradas em ágar seletivo devem ser confirmadas por testes bioquímicos. Os principais testes para a identificação de Salmonella estão listados na Tabela 3. Testar todas estas reações requer consideráveis recursos. Consequentemente, é frequente o uso de meios compostos como o ágar de três açúcares e ferro (TSI), que contém glicose, lactose e sacarose, um sistema para detecção de H2S (sulfeto) e um indicador de pH (Koneman et al., 2001). Tabela 3. Reações bioquímicas típicas de Salmonella spp. Teste Redução do Nitrato Oxidase Oxidação/Fermetação Hidrólise da Uréia Indol Produção de H2S Utilização do Citrato Malonato de Sódio Crescimeto em KCN MR VP Liquefação de Gelatina Reação + F + + + - Teste Reação Fermentação de: Glicose + Manitol + Maltose + Lactose Sacarose Salicina Adonitol Duleitol + Lisina Descarboxilase + Arginina Dihidrolase + Ornitina Decarboxilase + Deaminação da Fenilalanina KCN- Cianeto de Potássio; MR- Vermelho de Metila; VP- Voges-Proskauer; F-Fermenta Fonte: (Koneman et al., 2001). 19 2.5.1.2. Detecção Sorológica Estruturas antigênicas presentes na superfície de bactérias podem ser identificadas pela utilização de soro poli ou monovalente. Os antígenos Somático (O), Flagelar (H) e Capsular (Vi) da Salmonella causam aglutinação das colônias no soro e os sorotipos podem então ser identificados (Brenner et al., 2000). A sorotipagem é mundialmente utilizada na classificação das salmonelas, mas este método tem um limitado poder discriminatório e não revela relações filogenéticas das cepas de mesmo sorotipo ou entre sorotipos diferentes (Sukhnanand et al., 2005), além de estar sendo implicado como caro, laborioso e requerente de mais de 150 soros específicos, o que a torna indisponível para a maioria dos laboratórios, justificando a pouca notificação dos casos e surtos (Baudart et al., 2000; SonneHansen; Jenabian, 2005). A habilidade da Salmonella em transferir, adquirir e recombinar os genes da flagelina fase 1 (fliC) e para o antígeno O (rfb) pode explicar a existência de tão grande número de sorotipos, mas este é apenas mais uma das limitações da sorotipagem. De fato, estudos revelam que cepas de mesmo sorotipo podem estar distantemente relacionadas (Lagatolla et al., 1996). As mudanças epidemiológicas das infecções por Salmonella e a emergência de novas cepas (ex. S. Typhymurium DT104 e S. Newport resistentes a múltiplas drogas) torna imperativo o desenvolvimento de novos métodos de subtipagem, que não apenas discriminem os subtipos mas que também possa ser usado em análises evolutivas (Sukhnanand et al, 2005). 20 2.5.2 Detecção Molecular As provas moleculares apresentam as vantagens de serem altamente específicas e usadas em condições adversas para detectar um gene ou seqüências de ácidos nucléicos de um organismo particular ou de um grupo de organismos; serem usadas para detectar e identificar organismos sem a necessidade de cultivo e isolamento em cultura pura, descartando a subjetividade dos testes microbiológicos; serem designadas e usadas para detectar organismos específicos ou grupos taxonômicos amplificados como é o caso de provas de regiões alvo da molécula de RNA ribossômico (RNAr) com diferentes níveis de variabilidade (Coutinho et al., 1999). Durante muito tempo as técnicas moleculares eram caras e laboriosas para serem executadas de forma rotineira, mas este quadro tem mudado consideravelmente nos últimos anos (Sonne-Hansen; Jenabian, 2005). 2.5.2.1. Reação da Polimerase em Cadeia A extraordinária habilidade da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) de replicar exponencialmente uma determinada sequência de DNA, a tornou uma poderosa ferramenta para a epidemiologia, medicina e biologia molecular. A PCR é baseada na capacidade que iniciadores específicos, para determinada região do DNA de um organismo, tem em anelar somente com a sequência desejada através da complementariedade de bases. A Taq DNA polimerase, uma enzima responsável pela extensão do DNA alvo, reconhece o complexo formado pelo iniciador e a fita do 21 DNA molde, que resulta na cópia simultânea de ambos os sentidos do segmento do DNA entre os dois iniciadores anelados. Os passos de desnaturação, anelamento e extenção ocorrem de forma cíclica, graças a termoestabilidade da Taq DNA polimerase, até que a sequência alvo se encontre em quantidades detectáveis (Oste, 1988; Aabo et al., 1993; Van der Zee; Huis, 1997). O princípio da PCR é explicado na Figura 5. Antes de iniciar o primeiro ciclo no termociclador, o DNA, os iniciadores, a polimerase, os desoxirribonucleotideos trifosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), cloreto de magnésio (MgCl2) e um tampão são misturados em um tubo. Então a sequência alvo do genoma da Salmonella é amplificada pela repetição de três passos (Kreuzer; Massey, 2002): I. Desnaturação do DNA fita-dupla em fita-simples por aquecimento; II. Anelamento específico por complementariedade dos iniciadores ao DNA fita-simples pelo resfriamento; III. Extensão enzimática dos iniciadores para produzir uma cópia exata da sequência alvo fita-dupla. Este processo do I ao III é usualmente repetido em 30 a 40 ciclos. Depois a amplificação é confirmada realizando-se uma eletroforese em gel de agarose. Stone 1994 aperfeiçoou os métodos de detecção de DNA bacteriano através do PCR em combinação com o enriquecimento das culturas. Antes da PCR é necessário extrair e purificar o DNA do material testado, pois a amplificação é inibida por um extenso número de substâncias químicas como componentes alimentares e ambientais, ácido húmico, urina, sais biliares, meios seletivos usados no isolamento dos patógenos. A remoção de substâncias inibitórias é um passo importante na preparação das amostras para a PCR (Rahn et al., 1992; Aabo et al., 1993; Lantz et al., 1994; Jeníková et al., 2000; Sibley et al., 2003). A PCR tem sido frequentemente 22 usada para identificar Salmonella em amostras clínicas e alimentos (Cohen et al., 1993; Rahn et al., 1992). Primeiro Ciclo 1 2 1 DNA DNA polimerase Desoxirribonucleotídeos MgCl2 Tampão Desnaturação + Anelamento dos Iniciadores 2 1 2 Anelamento + Extensão Segundo Ciclo 1 1 Reação 2 2 Figura 5. Princípio da Reação da Polimerase em Cadeia. Pequenas sequências específicas de DNA (iniciadores) são utilizados para se ligarem às fitas de DNA desnaturado pelo aquecimento. Uma enzima termoestável (DNA polimerase) estende os iniciadores para formar a nova fita complementar Fonte: (Kreuzer; Massey, 2002). As principais vantagens da PCR como método de diagnóstico são: a velocidade e facilidade de utilização; a sua sensibilidade, pois é capaz de amplificar seqüências a partir de discretas quantidades do DNA-alvo e até mesmo do DNA de 23 uma única célula (Li et al., 1988); e por sua robustez, ou seja, por permitir a amplificação de seqüências específicas a partir de material no qual está gravemente degradado em um meio onde o isolamento de DNA é problemático. Como desvantagens desta técnica, nota-se a necessidade de informação sobre as seqüências-alvo de DNA e a infidelidade na replicação do DNA (Strachan; Read, 2002). Muitos iniciadores têm sido usados na identificação da Salmonella. Alguns destes foram selecionados a partir de genes associados com a virulência do microrganismo, como o invA e fimA. O gene invA está relacionado com a capacidade da Salmonella invadir as células hospedeiras (Rahn et al., 1992; Aabo et al., 1993; Burkhalter et al., 1995; Cohen et al., 1996) e tem sido considerado como um dos iniciadores mais específicos para este gênero (Malorny et al., 2003), e o gene fimA que é encontrado na unidade fimbrial da bactéria (Cohen et al., 1996). Os iniciadores ST11 e ST15 (Aabo et al., 1993) foram selecionados de uma região, específica do cromossomo da S. Typhimurium LT2, denominada JEO402-1 de 2,3 kilobases (Figura 6) obtida pela utilização da endonuclease de restrição Sau 3A (Olsen et al., 1999). Esta região demonstrou ser altamente sensível e específica para todo o gênero Salmonella, identificando 185 cepas de 93 sorotipos diferentes através de testes de hibridização cruzada (Olsen et al., 1999). Aabo et al. (1993) demonstraram que o par de iniciadores ST11-ST15 também é altamente sensível e específico, não apresentando nenhum resultado falso-positivo quando utilizado com outras enterobactérias e somente dois sorotipos da Salmonella arizonae (subespécie IIIa) não foram identificadas, o que não invalida a eficiência dos iniciadores já que esta subespécie é raramente encontrada em associação a casos humanos. 24 ST15 - ST11 - Figura 6. Sequência da região JEO402-1 isolado do cromossomo da S. Typhimurium LT2. A sequência sublinhada destaca a região utilizada para o desenho dos iniciadores. Fonte: (Olsen et al., 1999) 25 2.5.2.2. Caracterização Molecular O Sequenciamento de genes e de fragmentos cromossomais ou ribossomais (16S, 23S e 16S-23S), RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism), MLST (Multilocus Sequence Typing), PCR Ribotyping, IS200 Fingerprinting, têm sido utilizados para tentar diferenciar a Salmonella ao nível molecular (Pelkonen et al., 1994; Sonne-Hansen; Jenaiban, 2005; Sukhnanand et al., 2005). Entretanto, muito destes métodos tem sido descritos como caros e laboriosos ou pouco sensíveis e específicos, não diferenciando cepas estreitamente relacionadas. O par de iniciadores ST11-ST15 tem sido utilizado na identificação de Salmonella, demonstrando ser altamente conservado dentro deste gênero (Aabo et al., 1993; Gouws et al., 1998; Maciorowski et al., 2005). Devido a esta característica estes iniciadores podem ser utilizados, por exemplo, em análises genéticas de filogenia ou caracterização molecular. Mas, pouco se sabe sobre o real poder destes iniciadores em diferenciar a Salmonella aos níveis de espécie, subespécie ou sorotipo. Os RNArs são bastante conservados tanto funcionalmente como em sua sequência e está associado com regiões de moderada variação (Ward, 2002, Woese, 1987). Assim, a comparação de sequências de RNAr se tornou uma poderosa ferramenta para deduzir relações filogenéticas e evolutivas de organismos (Weisburg et al., 1991), assim como, sua própria identificação (Rodício; Mendoza, 2004). A molécula amplamente utilizada para análises filogenéticas em procariontes é a 16S, subunidade menor do RNAr. É um polirribonucleotídeo de aproximadamente 1500 nucleotídeos, codificado pelo gene rrs (DNAr). Como 26 qualquer sequência de cadeia simples, o RNAr 16S se dobra em uma estrutura secundária que intercala cadeias simples e cadeias duplas (Figura 7) (Rodício; Mendoza, 2004). O número de cópias do operon ribossômico no genoma bacteriano varia de 1 a 15, sendo relativamente constante a nível de gênero e espécie (Luz et al., 1998; Rodício; Mendoza, 2004). Contudo, na maioria dos casos, todas as cópias do DNAr 16S de um organismo são idênticas ou quase idênticas. O DNAr 16S é a molécula preferida pelo seu tamanho e por ser melhor manejável experimentalmente (Rodício; Mendoza, 2004). Figura 7. Estrutura secundária do RNAr 16S. As regiões conservadas estão representadas pelas linhas em negrito e as variáveis (V1-V9) pelas linhas finas. Fonte: (Rodício; Mendoza, 2004) 27 Por meio da análise do RNAr 16S, Woese (1987) percebeu que o Reino Procaryota era inválido pelo fato das Eubactérias e Archeobactérias serem tão distantes entre si como são dos Eucariotos. Assim, introduziu-se o termo Domínio para substituir o Reino e dividiram-se os organismos celulares em três domínios: Bacteria, Archea e Eucarya. Desde então, a análise do RNAr 16S tem sido utilizada para estabelecer relações filogenéticas, causando um grande impacto na classificação e identificação bacterianas (Rodício; Mendoza, 2004). Os principais problemas com a identificação e nomenclatura de bactérias são (Clarridge III, 2004): 1. Bactérias com mesmo genótipo mas fenótipos diferentes (Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e M. bovis ATCC 19210); 2. Bactérias com genótipos similares mas fenótipos diferentes (E. coli ATCC 11775 e Shigella dysenteriae ATCC 13313); 3. Bactérias com fenótipos similares mas genótipos diferentes (Nocardia asteroides ATCC 19247 e N. farcinica ATCC3318); 4. Bactérias muito distantes para pertencerem à mesma espécie (Enterobacter (Pantoea) agglomerans (bg1) e E. (Pantoea) agglomerans (bg2)); 5. Bactérias muito distantes para pertencerem ao mesmo gênero (Clostridium tetani ATCC 19406 e C. Innocuum ATCC14501); 6. Bactérias muito próximas para serem de diferentes gêneros (Enterobacter cloacae ATCC 13047 e Citrobacter werkmanii). Diversas técnicas têm sido criadas para a análise do RNAr 16S (LeblondBourget et al., 1996; Espejo et al.,1998; Rodício; Mendoza, 2004; McAuliffe et al., 2005), mas poucas têm sido usadas na caracterização e diferenciação da 28 Salmonella em nível molecular. As mais comumente utilizadas para este fim é o sequenciamento (Woo et al., 2001) e RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Pelkonen et al.,1994). Contudo, várias pesquisas indicam que a região RNAr 16S não é adequada para grupos bacterianos proximamente relacionados (Leblond-Bourget et al., 1996; Cilia et al., 1996). Entretanto, Van Beek e Priest (2002) otimizaram a separação de Lactobacillus por intermédio da DGGE, utilizando a região variada V6-V8 do RNAr 16S. O RNAr 23S tem ganhado destaque por possuir maior número de regiões variáveis, o que permite análises filogenéticas ao nível de espécie e subespécie. O estudo desta região pode, portanto, ser usado de forma complementar ao RNAr 16S (Christensen et al., 1998). O espaço entre os genes 16S e 23S do DNAr é chamado de ITS (Internal Transcribed Spacer). Este espaço contém um maior grau de variabilidade do que as regiões 16S e 23S. Estas variações têm sido utilizadas na diferenciação de espécies bacterianas e análises filogenéticas (Leblond-Bourget et al., 1996). O estudo desta região tem sido amplamente realizado para a análise da diversidade de cepas de Salmonella, encontrando resultados bastante promissores (Baudart et al., 2000; Christensen et al., 2000). A Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) tem sido amplamente utilizada por permitir o estudo filogenético de comunidades microbianas (Muyzer et al., 1993). A DGGE é baseada na eletroforese dos fragmentos de DNA, previamente amplificados pela PCR, em gel com gradiente desnaturante. Esses fragmentos ficam sujeitos a um ambiente com crescentes níveis de desnaturação, que acabam por promover mudanças conformacionais na molécula, reduzindo sua migração (Sigler et al., 2004; Ercolini, 2004). Assim, fragmentos com mesmo 29 tamanho mas com composição de bases diferentes irão apresentar diferentes padrões eletroforéticos, diferenciando cada microrganismo (Coutinho et al., 1999; Ercolini, 2004). Fischer e Lerman (1983) relataram que esta técnica é capaz de detectar uma simples mudança de base no DNA. A adição de um grampo contendo 30 a 40 pb GC a um dos iniciadores da PCR garante que o fragmento de DNA irá permanecer parcialmente como fita-dupla, impedindo sua completa desnaturação, o que acarretaria a perda da definição dos padrões eletroforéticos (Sheffield et al., 1989; Ercolini, 2004). Segundo Sheffield (1989), a adição deste grampo aumentou a capacidade da DGGE em detectar mudanças em uma única base no DNA. Em microbiologia ambiental a DGGE tem sido amplamente empregada como ferramenta para obtenção do perfil de populações microbianas complexas sem a necessidade de cultivá-las, sendo superior a clonagem com subsequente sequenciamento (Muyzer; Smalla, 1998). Mas, ainda é muito pouca sua utilização na identificação e diferenciação de bactérias patogênicas. A região RNAr 16S tem sido a mais utilizada na DGGE, tanto na microbiologia ambiental quanto na clínica. No entanto, alguns pesquisadores tem proposto o uso de outros iniciadores mais específicos quando a análise envolver microrganismos estreitamente relacionados, pois tem sido demonstrado que outras regiões do genoma bacteriano podem oferecer melhores resultados na diferenciação de organismos de mesma espécie do que o 16S RNAr (Ercolini, 2004; Yergeau et al., 2005; Tacão et al.,2005;). Tacão et al. (2005) conseguiram melhores resultados com a DGGE quando utilizaram uma região específica para desenhar os iniciadores e, assim, conseguiram diferenciar a maioria das espécies de Aeromonas. Visto que, a utilização de iniciadores universais requerem o passo de cultivo das amostras para que somente a espécie alvo seja 30 amplificada, com o desenvolvimento de iniciadores específicos, a DGGE pode ser aplicada diretamente do material clínico, diminuindo custos e o tempo de processamento. Uma grande vantagem da DGGE é a possibilidade de comparar múltiplas amostras em um único gel (Davies et al., 2004). A maior limitação desta técnica é que seqüências muito grandes podem não ser eficientemente separadas. O produto do PCR não deve ultrapassar 500 pb, o que acaba limitando as informações para inferências filogenéticas (Muyzer; Smalla, 1998). Entretanto, Clarridge III (2004) relatou que sequências de no mínimo 500 pb já são suficientes para análise filogenéticas. 2.6. Prevenção da Salmonelose As medidas de controle são de fundamental importância devido ao interesse do consumidor, cada vez mais exigente, sobre as doenças transmitidas por alimentos. O controle da Salmonella se apresenta como um desafio a toda indústria de alimentos. É importante ressaltar que este controle está baseado no conhecimento detalhado da epidemiologia da infecção e em um programa de controle específico para cada empresa. Existe no mercado uma vacina bastante efetiva contra febre tifóide. Mas, ela não é eficaz para o restante das espécies não-tifoidais. Todo alimento deve ser tratado contra a SalmoneIla antes da distribuição, realizar práticas para reduzir contaminação cruzada de carcaças de animais (Cordano; Virgilio, 1996), 31 providenciar treinamento em práticas de higiene para todos os manipuladores de alimentos, restaurantes, e matadouros e expandir programas de vigilância sanitária. O correto cozimento e refrigeração dos alimentos também são efetivos no controle da salmonelose (Giannella, 2000). A exemplo disso, foi observada uma baixa prevalência de Salmonella em abatedouros que empregam programas rigorosos de higiene (Rheault; Quessy, 1999). Manipuladores de répteis devem lavar suas mãos imediatamente após contato direto ou indireto. Os aquários e as jaulas dos répteis devem ser devidamente limpos em locais onde não ocorra preparação de alimentos para consumo humano. Os répteis devem ficar confinados em seus aquários ou jaulas e não terem livre acesso para áreas ocupadas por pessoas, principalmente crianças (Woodward et al. 1997). 2.7. Tratamento da Salmonelose O tratamento geral para salmonelose é a reposição de fluidos via oral ou intravenosa, controle da dor, náuseas e vômitos. A terapia específica consiste na administração de antibióticos (Giannella, 2000). Os antibióticos geralmente não são recomendados para a terapia de gastroenterites não invasivas causadas por Salmonella não tifoidal, porque a terapia não restringe a doença, a menos que meningite ou infecções complicadas ocorram. Além disso, a antibioticoterapia pode prolongar a liberação de bactérias pelas fezes (Campos, 1999; James, 2000; Wooley et al., 2001; Giannella, 2000), sendo somente indicada, principalmente, em casos de crianças menores de 3 anos de idade, idosos, pessoas imunocomprometidas ou 32 com hemoglobinopatias, devendo sempre ser baseada no antibiograma (Campos, 1999; Giannella, 2000). 2.7.1 Sensibilidade a Antibióticos A distribuição mundial da resistência antimicrobiana é uma realidade. A crescente taxa de emergência de novos fenótipos resistentes, as oportunidades para cepas semelhantes se disseminarem de pessoa a pessoa, e entre pessoas e animais são altamente reconhecidos. A disseminação de microrganismos resistentes ocorre mais freqüentemente em países em desenvolvimento do que em países desenvolvidos, pois este último apresenta programas mais adequados de higiene. A resistência antimicrobiana é um problema mundial que requer respostas locais, regionais, nacionais e mundiais. A vigilância é a chave para entender a dimensão e a tendência da resistência antimicrobiana, sendo importante também para avaliar os impactos das intervenções de controle (Williams, 2001). Um fator que contribuiu para o desenvolvimento de resistência foi o uso indevido de antibióticos na medicina humana e veterinária, pecuária, agricultura e aqüicultura. (Woodward et al., 1997; Laidlaw, 2003). Na pecuária, antibióticos são usados no tratamento e prevenção de doenças bem como na promoção de crescimento. Esta rotina de práticas tem levado a emergência de bactérias resistentes a diversos tipos de antibióticos, causando um sério problema de saúde pública, primariamente pelo crescente risco de falhas em tratamentos, impondo limitações na escolha de drogas para terapia (Velonakis et al. 2001; Zhao et al., 33 2003; Woodward et al., 1997). Como exemplo disto a S. Typhimurium DT 104, apareceu em 1988 como um grande problema mundial, porque se apresentou resistente a múltiplos antibióticos, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamidas, tetraciclina, e em alguns casos a trimetropima (Threlfall et al., 1996; James, 2000). Estudos moleculares mostraram que na DT 104 multiresistente, todos os genes de resistência estão localizados no DNA cromossomal, que é um fenômeno raro para S. Typhimurium (Threlfall et al., 1996; Williams, 2001). Avanços recentes na caracterização molecular dos mecanismos de resistência a antibióticos destacam a existência de estruturas genéticas, chamadas integrons, envolvidas na aquisição de genes de resistência. Os integrons promovem a captura de um ou mais conjuntos de genes com o mesmo sítio de ligação, formando assim “clusters” (grupos) compostos de genes de resistência a antibióticos. Vários estudos têm demonstrado que os integrons estão amplamente distribuídos em cepas de S. enterica (Threlfall et al., 1994). Estes genes de resistência a drogas são transferidos entre as espécies de Salmonella junto com os integrons classe 1 presente em transposons e plasmídios conjugativos. (Taddei et al., 1997; Chopra et al., 2003; Hamada et al., 2003). Em condições intestinais, o material genético que confere resistência a antibióticos é prontamente transmitido entre as enterobactérias (Blake et al., 2003). A resistência a antibióticos também foi relatada em animais exóticos. Em 1998 foi encontrada, em cepas de Salmonella isoladas de cobras, resistência a três antibióticos, a estreptomicina, tetraciclina e o ácido nalidixico. No mesmo ano foi encontrada, em cepas isoladas de lagartos, resistência a oito antibióticos diferentes, ampicilina, kanamicina, sulfamethoxazole, tetraciclina, trimethoprim/sulfamethoxazole, estreptomicina e ácido nalidixico (Headrick et al., 34 2001). A prevalência de resistência adquirida por cepas isoladas de répteis é baixa, mas o contato cada vez maior destes animais com o homem tem contribuído para aumentar esta taxa (Pasmans et al., 2005). O monitoramento da susceptibilidade a antimicrobianos da Salmonella é importante, pois além de auxiliar na escolha do antibiótico correto é uma ferramenta importante na documentação epidemiológica de cepas de Salmonella resistentes (Wall et al., 1995; Van der Wolf, 1999). 2.8. Salmonella em Répteis É um fato que os répteis assumem cada vez mais uma maios importância mundial. Os animais exóticos têm sido introduzidos em áreas geográficas específicas com finalidades distintas: produção de alimentos, modelo biológico para investigações científicas, educação e preservação (zoológicos e similares), participação em feiras ou exposições, atividades de lazer (circos), esportivas (competições) e inclusive como animais de companhia ou adorno (Vasconcellos, 2001). Além disso, é comum a população do interior do país, assim como povos indígenas, utilizarem a carne destes animais como fonte de proteína em sua dieta, mas de todas estas possibilidades o animal de companhia ou adorno é o que estabelece o grau máximo de proximidade com os seres humanos e, com isto, cria o maior risco para a introdução de zoonoses no próprio domicílio (Vasconcellos, 2001). Cada espécie de réptil possui seus próprios requerimentos biológicos e 35 comportamentais que devem ser satisfeitos para que se alcance a homeostase, um equilíbrio do estado fisiológico com seu ambiente. A biologia natural de várias espécies de répteis ainda não é completamente entendida e muitos répteis em cativeiro vivem em condições que se assemelham apenas superficialmente ao seu habitat natural. Portanto, sua biologia e comportamentos específicos precisam rotineiramente permanecer inalterados. Esta situação cria numerosos estressores que prejudicam a homeostase. Como os outros animais, os répteis respondem ao estresse tipicamente envolvendo uma crescente atividade endócrina, particularmente da glândula adrenal. Longo tempo de cativeiro e estresse, associado a crescente produção de adrenalina e outros hormônios podem resultar em um desequilíbrio das funções normais do organismo (Laidlaw, 2003). A incapacidade de resistir satisfatoriamente ao estresse crônico pode resultar em deteriorações gerais da saúde, bem como emergência de doenças diretamente relacionadas com a dificuldade de adaptação ao cativeiro (Grespan, 2001; Laidlaw, 2003). Esta é usualmente referida como a "Síndrome da má adaptação" e pode também envolver um decréscimo na capacidade de resistir aos parasitas, mesmo àqueles que fazem parte da microbiota normal, por ter sido quebrada a relação de simbiose entre o parasita e o hospedeiro (Laidlaw, 2003). Uma grande variedade de patógenos pode ser transmitida por répteis para humanos por contato direto ou contato indireto, como superfícies contaminadas com fezes ou por partículas de material fecal na pele ou garras e água contaminada (CDC, 1995, 1999; Laidlaw, 2003). Algumas das zoonoses mais comumente relatadas são por Campilobacter, E. coli, Mycobacterium e Streptococcus, mas a mais freqüente é por Salmonella (Laidlaw, 2003). A gravidade dessas doenças em algumas pessoas é elevada, por isso elas 36 devem evitar entrar em contato com répteis. As crianças menores de 5 anos de idade, pessoas imunodeprimidas, recém operadas, usando drogas imunodepressoras, que estejam recebendo radioterapia, mulheres grávidas, pessoas com deficiência nutricional, com infecções crônicas e que recentemente receberam antibioticoterapia (Laidlaw, 2003). Os répteis tomam-se infectados por via Salmonella transmissão transovariana, contato direto com outro réptil ou contato com as fezes de outro réptil direta ou indiretamente. Os animais jovens de algumas espécies de répteis ingerem as fezes dos adultos adquirindo a bactéria (Mitchell; Shane, 2000). A infecção por Salmonella spp. em répteis foi primeiramente descrita em cobras no ano 1944 e em tartarugas e lagartos em 1946. Até 1960, casos de salmonelose associado a répteis eram raros. Répteis em cativeiro são rotineiramente identificados como portadores de Salmonella. Durante a década de 70 cerca de 4% das famílias americanas possuíam tartarugas como animais de estimação e estes animais foram responsáveis por 14% (300.000) de todos os casos de salmonelose em crianças menores de dez anos de idade nos Estados Unidos. Em 1975, a Administração de Alimentos e Drogas (FDA) proibiu a distribuição e venda de tartarugas menores que 10 cm, e muitos estados proibiram a venda de qualquer tartaruga. Esta ação resultou na prevenção de estimados 100.000 casos de salmonelose por ano. Contudo, desde 1986, a popularidade de outros répteis, como as iguanas, aumentou e com ela a incidência de infecções causadas por sorotipos associados a répteis (CDC, 1995). Mais recentemente, relatos de répteis, que não as tartarugas, como reservatórios têm ganhado atenção. O número de infecções por sorotipos raros de Salmonella aumentou de 3,3% em 1987 para 7,3% em 1991 e teve uma pequena 37 queda de 1,1 % em 1997 (Olsen et al., 2001), evidenciando a importância desses animais para a saúde pública. O número de proprietários de répteis é crescente assim como o número de lojas e criadores, pois este além de ser exótico é de fácil criação. Durante os anos de 1991-2001 o número de casas com répteis dobrou de 850.000 para 1,7milhão (CDC, 2003). Estimam-se que nos Estados Unidos e Canadá 3 a 5% de todos os casos de salmonelose estejam associados com contato com animais exóticos (Headrick et al., 2001; Geue; Löschner, 2003). O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) relatou que aproximadamente 93.000 casos de salmonelose ocorridos nos Estados Unidos em um ano resultaram do contato com répteis e anfíbios. Isto representa aproximadamente 7% de todos os casos de salmonelose ocorridos (Headrick et al., 2001). Estudos demonstraram que no Brasil a maior prevalência de Salmonella é encontrada em lagartos (62,5%), ficando em segundo lugar as cobras (53,3%) e depois os quelônios (25,8%) (Sá; Solari, 2001). Répteis são conhecidos como portadores de sorotipos raros de Salmonella não comumente associados com infecções humanas, incluindo alguns da subespécie arizonae que são particularmente associados a cobras. Com o crescimento da popularidade dos répteis como animais de estimação, infecções por estes sorotipos têm aumentado principalmente em crianças (Chishoin et al., 1999). Devido a Salmonella fazer parte da microbiota normal de 60 a 90% dos répteis e ser excretada intermitentemente, o risco de infecção é grande e imprevisível (James, 2000; Headrick et al., 2001). Apesar de a Salmonella fazer parte da microbiota normal dos répteis, um estudo estimou que um terço dos répteis morrem por complicações dessa doença (Weil et al., 2001). Tentativas de erradicar estas 38 bactérias dos répteis com uso de antibióticos têm falhado, contribuindo apenas para o desenvolvimento de cepas resistentes (Laidlaw, 2003). Determinar se um animal é ou não infectado depende de uma série de exames durante dias ou semanas, porque o microrganismo pode não ser detectado em todas as vezes que as fezes são evacuadas. Um réptil pode ser negativo em um exame, mas positivo em outro subseqüente (Weil et al., 2001;). Uma grande variedade de sorotipos de Salmonella de todas as subespécies tem sido isolada de répteis, algumas vezes mais de um sorotipo simultaneamente no mesmo animal (Corrente et al., 2004; Pasmans et al., 2005), muitos destes representam raros ou também chamados 'exóticos' sorotipos (Mitchell; Shane, 2000; Geue; Löschner, 2003). Os sorotipos mais comumente encontrados em répteis e relatados como causa de salmonelose humana são S. Java, S. Stanley, S. Marina, S. Poona, e S. Pomona, enquanto que as cepas mais comumente encontradas em animais domésticos e produtos alimentícios, causadoras de salmonelose em humanos, são a S. Typhimurium e S. Enteretidis (Headrick et al., 2001; Laidlaw, 2003). Os sorotipos S. Flint, S. Kintambo, S. Ealing, S. Carrau e S. Abaetetuba também estão relacionados com infecções transmitidas por répteis (Olsen et al., 2001). Médicos Veterinários desempenham um papel importante para a saúde pública informando o grande risco que há do contato de humanos com animais suspeitos de salmonelose. Eles devem acentuar a importância de um rigoroso programa de saúde pública (Wall et al., 1995). É fundamental que as autoridades empreguem controle sanitário e promovam campanhas informativas à população (Sá; Solari, 2001). O recente declínio das infecções por S. Marina que começou em 1997 deve-se a crescente educação por veterinários, pediatras, e donos de lojas de 39 animais sobre o risco da salmonelose associadas a répteis (Olsen et al., 2001). Carne de répteis usadas para consumo humano também representam um risco à saúde pública (Weil et al., 1995; Gonzáles et al., 1999). Existem relatos de contaminação de carne de crocodilo, usada para o consumo humano, por Salmonella na Austrália (Weil et al., 1995). A contaminação da carne pode ocorrer nos matadouros pela excreção de animais assintomáticos, equipamentos do matadouro e paredes contaminados. Contaminação cruzada de carcaças e produtos cárnicos pode ocorrer durante subseqüente manipulação, processamento, preparação e distribuição (Rhealt; Quessy, 1999; McEvoy et al., 2003; Molla et al., 2003). 2.8.1 O Teiú O teiú (Tupinambis sp.) é um lagarto de ampla distribuição geográfica em toda América do Sul (Abe, 1983). Possui o corpo robusto e mandíbulas fortes, sendo um apto caçador. Onívoro, inclui na sua dieta animais mortos, frutas, lesmas, insetos, e pequenos vertebrados (Fitzgerald et al., 1991). As duas espécies deste lagarto (T. merianae e T. teguixin) são altamente exploradas devido ao alto valor de sua pele. Cada ano, mais de 1 milhão de peles são exportadas da Argentina para os Estados Unidos, Canadá, México, China, Japão e vários países europeus. Centenas de pessoas caçam os teiús, pois a venda de cada pele é equivalente ao salário de um dia de um trabalhador rural na Argentina. Muitas famílias comem a sua carne e sua gordura é de grande valor para propósitos medicinais (Fitzgerald et al., 1991; 40 Gonzáles et al., 1999; Nogueira Filho; Nogueira, 1999; Flores, 2000). Os teiús alcançam a maturidade sexual com 3 anos de idade, são animais ovíparos com o tamanho da postura proporcional ao tamanho da fêmea, oscilando entre 20-50 ovos (Noriega et al., 1996). Sua criação em cativeiro tem sido proposta para o seu aproveitamento racional (Noriega et al., 1996; Nogueira Filho; Nogueira, 1999), e tem demonstrado índices econômicos satisfatórios (Gonzáles et al., 1999). A particular razão para o foco na Salmonella em répteis advém de estudos indicando que ela é mais virulenta para humanos que cepas carreadas por outros hospedeiros (Scott; Foster, 1997). A ameaça imposta por zoonoses de répteis merece maior consideração e estudos, pois o contato com estes animais consiste em uma grande ameaça a saúde pública. 41 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Amostragem Teiús (Tupinambis merianae), criados em cativeiro na fazenda Almada pertencente à Universidade Estadual de Santa Cruz, localizada no município de llhéus / BA, foram analisados neste estudo (Figura 8) Todos os teiús foram utilizados, a fim de determinar a real prevalência de Salmonella nestes animais. Eles estavam agrupados por tamanho e idade em dez baias, sendo dois aquários (baias I e 2) e oito baias de concreto com pequenas áreas de vegetação e com tocas, também de concreto, cobertas com telhas de amianto. A água era servida em bebedouros coletivos por baia e a dieta era basicamente pedaços de frango cru. Figura 8. Figura representativa do teiú (Tupinambis merianae). 42 Swabs cloacais dos trinta animais existentes foram acondicionados e processados, em no máximo seis horas após a coleta das fezes, no Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual de Santa Cruz para identificação de Salmonella spp. (Figura 9). Figura 9. Realização da coleta da amostra utilizando swab estéril. 3.2. Cultivo e Identificação da Salmonella O isolamento de bactérias das amostras fecais foi realizado de acordo com APHA (Flowers et al. 1992), com algumas modificações. As amostras fecais foram coletadas, inoculadas em 3 ml de Água Peptonada Tamponada (MERCK), para recuperação das bactérias que são encontradas em pequenas quantidades nas fezes, e incubadas em estufa bacteriológica a 43°C. Depois de 18-24h, aproximadamente, 1ml de cada amostra foi transferido para tubos contendo 9 ml de Caldo Tetrationato (MERCK) e outros com 9ml de Caldo Selenito-Cistina (Micromed) e incubados a 43°C por 24 horas. Estes meios garantem condições ótimas para o 43 crescimento da Salmonella enquanto inibe o crescimento de outras enterobactérias. Utilizando a alça bacteriológica, uma alíquota de cada caldo de enriquecimento seletivo foi plaqueada em ágar Xilose-Tergitol 4 (XLT4) (MERCK) e ágar Salmonella-Shigella (SS) (MERCK) pelo método de esgotamento em quadrante para o melhor isolamento das colônias. As placas foram incubadas a 43°C por 24 horas. Colônias de coloração vermelha, com ou sem precipitado negro no centro, crescidas no ágar XLT4 e as colônias transparentes, com ou sem precipitado negro no centro, crescidas no ágar SS foram consideradas como prováveis colônias de Salmonella spp. (Figura 10). Figura 10. Aspécto das culturas de Salmonella em ágar XLT4 (esquerda) e SS (direita) e aspéctos das colônias (detalhe). Três colônias suspeitas para Salmonella foram repicadas de cada placa de ágar XLT4 e SS para a realização dos testes bioquímicos complementares, compreendendo o ágar Tríplice Açúcar e Ferro (TSI), prova do Vermelho de Metila (VM), produção de urease, de H2S, de Indol, mobilidade e descarboxilação da lisina. Primeiramente, as colônias suspeitas foram repicadas em tubos contendo ágar TSI (MERCK) inclinado com o auxílio de uma agulha bacteriológica, a colônia foi introduzida até a profundidade do ágar e estriada na superfície inclinada. O que caracteriza a Salmonella neste meio é a fermentação da glicose e ausência de 44 fermentação da lactose, acidificando somente a profundidade do meio tornando-o amarelo. A superfície inclinada torna-se vermelha à medida que se formam aminas alcalinas a partir da descarboxilação oxidativa de peptídeos na superfície (Figura 11) (Koneman et al., 2001). As amostras suspeitas no TSI foram repicadas para realização das demais provas. A produção de urease foi medida inoculando as bactérias em meio líquido contendo uréia e indicador de pH vermelho de fenol, que em pH ácido ou neutro torna o meio amarelo e em pH neutro vermelho. Bactérias produtoras de urease produzem amônia alcalinizando o meio que fica vermelho. A Samonella não produz urease, por tanto a cor do meio permanece inalterada. As provas de mobilidade, produção de Indol e de H2S foram mensuradas a partir do Agar Sulfeto-IndolMobilidade (SIM) (MERCK). Como as bactérias do gênero Salmonella são flageladas, portanto móveis, o teste de mobilidade é importante na identificação deste patógeno. A mobilidade é caracterizada, ao exame macroscópico, pela turvação do ágar a partir da linha de inoculação. O Indol é um dos produtos de degradação do metabolismo do Triptofano. A Salmonella não possui a enzima triptofanase, por isso não são produtoras de Indol. O Indol foi detectado a partir do aparecimento da cor vermelha após a adição do reativo de Kovac (Mikrobiologie), uma solução de p-dimetilaminabenzaldeído. A prova do Vermelho de Metila foi realizada a partir da inoculação das bactérias suspeitas em Caldo VM-VP (MERCK), sendo caracterizadas pela produção de ácidos fortes a partir da glicose, mantendo o pH do meio abaixo de 4,4, desenvolvendo cor vermelha após a adição do VM indicando prova positiva. A Salmonella é VM positiva. A descarboxilação da lisina pela Salmonella foi detectada através da inoculação das bactérias em ágar FerroLisina (LIA) (DlFCO) com o mesmo procedimento realizado no ágar TSI. Ao 45 descarboxilar a lisina, a Salmonella produz aminas que alcalinizam o meio tornandoo vermelho, sendo assim detectado macroscopicamente (Figura 11) (Koneman et al., 2001). As amostras positivas foram repicadas para tubos contendo Tripticase Soy Agar (TSA) (MERCK), incubadas a 43°C por 24 horas e enviadas ao Laboratório de Enterobactérias da Fundação Oswaldo Cruz-RJ (Fiocruz) para sorotipagem, usando antígenos específicos para cada sorogrupo. Estes procedimentos foram repetidos com os mesmos animais após 4 meses, depois de terem sido implantados procedimentos de limpeza das baias, utilizando água sanitária (2-3% de hipoclorito de sódio), com a finalidade de diminuir a carga bacteriana local e a contaminação cruzada entre os animais. TSI SIM VM Urease LIA Figura 11. Esquema representativo das principais provas bioquímicas para identificação de Salmonella. Fonte: Elaborado a partir de Koneman et al. (2001). 46 3.3. Teste de Sensibilidade a Antibióticos Os isolados de Salmonella foram testados quanto à sensibilidade a antibióticos pelo método de disco-difusão em ágar. As bactérias foram inoculadas em Tripticase Soy Broth (TSB) (MERCK) e incubadas a 43°C por 24 horas para o desenvolvimento do inóculo. Uma alíquota de cada suspensão bacteriana foi semeada em placa de ágar Mueller-Hinton (MERCK), estriando, com o auxílio de um swab, a amostra três vezes sobre toda a superfície do ágar, girando a placa em 60° antes da segunda e terceira vezes para assegurar uma distribuição uniforme do inóculo. Os discos com antibióticos foram colocados com o auxílio de uma pinça logo após o estriamento, sendo pressionados cuidadosamente contra o ágar para melhor adesão do disco, e incubados a 37°C por 18 horas (Koneman et al., 2001). Foram utilizados discos de Ampicilina (AMP 10mcg-CECON), Cloranfenicol (CLO 30mcg-CECON), Estreptomicina (EST 10mcg-CECON), Sulfonamida (SF 300mcgCECON), Tetraciclina (TET 30mcg-CECON) e Gentamicina (GEN 10mcg-CECON). O diâmetro dos halos de inibição do crescimento foi mensurado, com o auxílio de uma régua, e classificados em sensível, intermediário e resistente de acordo com a tabela fornecida pelo fabricante dos discos de antibióticos (Figura 12). 47 Figura 12. Representação dos halos de inibição de crescimento pelo método de disco-difusão. 3.4. Análise Estatística O modelo estatístico usado para a análise da prevalência foi o teste não paramétrico de Wilcoxon. Significância estatística das diferenças entre os tratamentos foi baseado no teste - t (p<0,01). 3.5. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) 3.5.1. Extração do DNA Todos os sorotipos de Salmonella isolados a partir dos teiús e mais 7 diferentes sorotipos isolados de serpentes por Argôlo (2004) (Tabela 4) foram 48 cultivados em Tripticase Soy Agar (TSA) para posterior extração do DNA. Foram coletadas aproximadamente 10 colônias de cada placa e transferidas para tubos tipo eppendorf de 200µL contendo 100µL de água Mili-Q estéril. A amostra foi homogeneizada com o auxílio de um agitador para tubos tipo Vortex e colocada a 95°C por 10min para a lise das células. Após este passo, a amostra foi centrifugada por 1min a 5.000rpm e coletado o sobrenadante (DNA) (Adaptado de Christensen et al. 1998). Tabela 4. Sorotipos de Salmonella isolados de serpentes Sorotipos S. I (O 11:r:-) S. IV (O:61:c:1,5) S. IIIb (O:47) S. I (O:4,5) S. I (O:4,5:b:-) S. Newport S. Gaminara Fonte: (Argôlo, 2004) 3.5.2. Iniciadores Foram utilizados os iniciadores específicos para Salmonella, ST11-F com grampo de GC (5’-CGCCCGCCGCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGG GGAGCCAACCATTCTAAATTGGCGCA-3’) e ST15-R (5'-GGTAGAAATTCCCAGCG GTACTG-3') (Invitrogen) (Aabo et al., 1993), e os iniciadores universais para as regiões variáveis V3, F357 com grampo de GC (5’-CGCCCGCCGCGCCGCG CGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3’) e R518 (5’49 ATTACCGCGGCTGC TGG-3’) (Promega) (Mcewan et al., 2005), e V6-V8 do 16S DNAr, F984 com grampo de GC (5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGG GCGGGGGCAGGGGGGGAACGCGAAGAACCT-3’) e R1378 (5’-CGGTGTGTACA AGGCCCGGGAACG-3’) (Invitrogen) (Heuer et al., 1997). A utilização do grampo de GC acoplado a um dos iniciadores impede a completa separação das fitas do DNA, aumentando a sensibilidade da Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE) (Sheffield et al., 1989). A escolha dos iniciadores foi baseada na necessidade de acelerar o método de diagnóstico e identificação de sorotipos, assegurando um eficiente combate e controle da doença. 3.5.3. Amplificação Foram transferidos 2 µL do sobrenadante (DNA) para tubos tipo eppendorf de 200µL contendo 48 µL de uma mistura de 33,50 µL de Água Milli-Q autoclavada, 10mM do Tampão da Taq polimerase (Promega), 2,5mM de MgCl2 (Promega), 10 pmol de cada iniciador (Invitrogen), 200µM de cada dos dNTP (Promega), 1,25 U da Taq DNA Polimerase (Promega) (Aabo et al., 1993). A PCR para ambos pares de iniciadores, ST11GC-ST15 e F984GC-R1378, foi realizada utilizando as seguintes condições: uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 60ºC por 2 minutos e extensão a 72ºC por 1 minuto e uma extensão final de 10 minutos, adaptado de Aabo et al. (1993) e Heuer et al. (1997). Para o par de iniciadores F357GC-R518 foi realizada uma PCR de 30 ciclos com as seguintes 50 condições: uma desnaturação inicial a 94ºC por 4 minutos seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 55ºC por 1 minutos e extensão a 72ºC por 1 minuto e uma extensão final de 5 minutos (Mcewan et al., 2005). O produto da reação foi visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta (UV) após eletroforese em gel agarose a 1% (100V por 30min.) pré-corado com brometo de etídio. 3.5.4. Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) A DGGE se baseia no padrão eletroforético dos fragmentos de DNA, previamente amplificados pela PCR, que estaciona de acordo com a sua sequência nucleotídica. A análise por DGGE foi realizada conforme Muyzer et al. (1993) e Sigler et al. (2004). A DGGE foi realizada utilizando-se Sistema para análise de mutações CDC 20x20cm (BioAgency Biotecnologia LTDA.). Dez microlitros dos produtos de PCR foram colocados em um gel vertical de poliacrilamida a 6% (acrilamida-bisacrilamida 37,5:1, Promega) com gradiente crescente e linear de desnaturante de 40% a 50%, onde a solução 100% desnaturante contém 40% (v/v) de formamida (VETEC) e 7M de Urea (Promega) e a solução 0% sem nenhum dos agentes desnaturantes. O gel foi sujeito a eletroforese, primeiramente por 15min a 60V e em seguida por 5 horas a 200V (Sigler et al., 2004) em tampão TAE 1x, a uma temperatura constante de 60ºC. Posteriormente, o gel foi corado durante 30min com 1x SYBR SafeTM DNA Gel Stain (Invitrogen) diluído a partir do estoque em tampão TAE. As bandas foram observadas e fotografadas em um transiluminador ultravioleta 51 (KODAK Electrophoresis Documentation and Analysis System 290). A Figura 13 mostra um esquema de como foi preparado o gel de DGGE para a eletroforese. Maior Gradiente Menor Gradiente _ Sob Agitação + Cuba de Eletroforese Figura 13. Esquema de preparação do gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante utilizando um “gradient maker”, sistema para produção do gradiente linear. 52 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Análise Bacteriológica O teiú (Tupinambis merianae), como qualquer outro réptil, é um potencial reservatório de Salmonella spp. principalmente por ser, na maioria das vezes, portador assintomático desta bactéria. Estima-se que 60 a 90% dos répteis são portadores de Salmonella constituindo um grave problema para a saúde pública (Almeida, 2000; Departament for..., 2000; James, 2000). Répteis de vida livre bem como domesticados têm sido demonstrados como reservatórios de Salmonella. Estes animais podem portar o agente sem demonstrar qualquer sinal clínico (Geue; Löschner, 2003). Na primeira análise para a detecção de Salmonella em teiús, 86,67% das amostras analisadas foram consideradas positivas para Salmonella enterica subsp. enterica, discordando de Brenner et al. (2000) que descreveu que a subespécie enterica é comumente encontrada em animais de sangue-quente e que as demais subespécies em animais de sangue-frio, como os répteis. Todas as baias apresentaram pelo menos um animal positivo e todos os animais negativos estavam em baias diferentes (Tabela 4). 53 Tabela 5. Correlação entre os sorotipos de Salmonella enterica encontrados e a idade e baias dos animais analisados Baia Idade(anos) 1 2 2 2 3 2 4 3 5 3-5 6 3-5 7 5 8 5 9 6 10 6 Total positivo/ Total de animais 1ª análise 2a análise 26/30 22/27 Sorotipos Positivas/Total Positivas/Total encontrados de animais de animais S. Rubislaw e S. 1/1 0/1 Infantis S. Rubislaw, S. I a (O:6,7:-:1,5) e S. 2/2 2/2 Infantis S. I (O:6,14,24:y:-) e 3/4 4/5b S. Carrau S. Rubislaw 1/1 1/1 S. Rubislaw e S. 6/6 6/6 Agona S. Carrau, S. Saintpaul, S. 4/5 3/3 Brandenburg e Salmonella sp. (Rugosa) S. Rubislaw, Salmonella sp. 2/3b 3/3 (Rugosa) e S. Saintpaul S. Rubislaw, S. I (O:6,14,24), S. Agona 4/5 4/5 e S. Carrau S. Panama (02 cepas c 1/1 0/1 díferentes) S. Rubislaw (03 cepas 1/1d 0/1 diferentes) Total de Sorotipos: 09 a Um animal portador de dois sorotipos diferentes (S. I (O:6,7:-:1,5) e S.Rubislaw) e duas cepas diferentes do sorotipo Rubislaw; b Um animal portador de dois sorotipos diterentes, Baia 3- S. Carrau e S. I (O:6,14,24:y:-) e Baia 7- S. Saintpaul e Salmonella sp. 'Rugosa'; c Animal portador de duas cepas diferentes do mesmo sorotipo; d Animal portador de três cepas diferentes do mesmo sorotipo. Na segunda coleta, foram repetidas as análises de amostras de 27 animais. Mesmo com a introdução da limpeza semanal das baias, 81,48% foram consideradas positivos para Salmonella enterica e os quatro animais negativos da 54 primeira análise foram considerados positivos, enquanto que outros cinco mostraram-se negativos, concordando com o estudo de Weil et aI. (1995), que observaram o fato de que a Salmonella não é liberada em todas as coletas de fezes, apesar de colonizar normalmente o trato intestinal destes animais, levando a um alto número de diagnósticos falso-negativos e mascarando a real prevalência da SalmoneIla nestes animais. Pode-se inferir portanto, que 100% dos teiús analisados são portadores dessa bactéria, já que, foram isoladas de todos os animais em um curto período de tempo. Apesar da limpeza semanal das baias não ter surtido o efeito esperado, esta prática não deve ser descartada pois pode diminuir o risco de infecção por parte dos tratadores. Não houve diferença significativa entre a prevalência de Salmonella da primeira para segunda análise (p>0,01). 4.2. Sorotipagem É crescente o número de infecções humanas causadas por sorotipos raros de Salmonella. A sorotipagem representa um importante instrumento epidemiológico que permite avaliar a prevalência de determinados sorotipos, e auxiliar num possível programa de controle de salmoneloses. As amostras positivas da primeira análise foram enviadas a Fiocruz-RJ para a realização da sorotipagem. Um total de nove diferentes sorotipos de Salmonella enterica foram encontrados, dos quais 23,33% representam a Salmonella Rubislaw; 20% S. Carrau e S. Agona; 6,67% S. Infantis, S. Saintpaul e a cepa rugosa e 3,33% S. Panama, S. Brandenburg, S. I (O:6,14,24), 55 S. I (O:6,14,24:y:-) e S. I (O:6,7:-:1,5) (Figura 14). Estes resultados se opõem aos resultados descritos por Sá e Solari (2001) que, em estudos realizados com répteis no Brasil, não isolaram nenhum dos sorotipos encontrados no presente estudo. Aqui, sugerimos fortemente a ocorrência de variação geográfica na distribuição dos sorotipos de Salmonella spp (Gutiérrez-Cogco et al., 2000). 3% 3% 24% 3% 3% 3% 7% 7% 20% 7% 20% S. enterica (O:6,14,24) S. enterica (O:6,7:-:1,5) S. Brandenburg S. enterica (O:6,14,24:y:-) S. Panama Salmonella. sp. - Rugosa S. Saintpaul S. Agona S. Rubislaw S. Infantis S. Carrau Figura 14 - Prevalência dos Sorotipos de Salmonella enterica encontrados nos 26 animais positivos da 1° análise. Das 26 amostras positivas na primeira coleta, 30 cepas diferentes de Salmonella foram encontradas, onde três animais apresentaram dois sorotipos 56 diferentes (Tabela 4). Algumas vezes, mais de um sorotipo podem ser encontrados simultaneamente no mesmo animal (Corrente et al., 2004; Pasmans et al.; 2005), muitos destes são chamados raros ou exóticos. A maioria dos sorotipos de Salmonella, isolados de répteis, associados com a salmonelose humana são da subspécie enterica (Headrick et al., 2001; Olsen et al., 2001; Laidlaw, 2003). Estes dados corroboram nossos resultados onde todos os sorotipos encontrados nos teiús são da subespécie I (enterica), que é a que possui maior capacidade invasiva de acordo com Pasmans et al. (2005), e todos eles têm sido isolados de fontes humanas, alimentares e ambientais (Rheault; Quessy, 1999; Jakabi et al., 1999; Gutiérrez-Cogco et al., 2000; Mitchel; Shane, 2000; Cox et al., 2002; Geue; Löschner, 2002). Dos 30 teiús analisados oito eram jovens, apresentando idade entre 0 e 2 anos (baias 1-3), onde sete (87,5%) foram considerados positivos para Salmonella. Dos 19 animais maiores de 3 anos (baias 5-10), 16 (84,2%) foram considerados positivos (Tabela 4). O sorotipo mais frequente entre os animais jovens foi S. Carrau com 57,14% e entre os animais adultos foi a S. Agona com 27,27% do total encontrado. O sorotipo Rubislaw foi amplamente distribuído entre as idades (Tabela 4). Os sorotipos Rubislaw e Carrau foram isolados de cães da região de Ilhéus (Maciel et al., 2004), sugerindo que estes sorotipos devem ser endêmicos dessa região. A S. Rubislaw também foi associada a infecções humanas associadas com répteis no Canadá e nos Estados Unidos, ocorrendo casos de meningites fatais em crianças (Van der Wolf, 1999; Epidemiology section, 1999; Fatal neonatal..., 2000). A S. Infantis e S. Saintpaul estão entre os cinco sorotipos mais prevalentes no Japão e Finlândia (Pelkonen et al., 1994; Hamada et al., 2003; Hata et al., 2003) e a S. 57 Agona entre os cinco mais prevalentes sorotipos em São Paulo, Brasil (Tavechio et al., 2002). A S. Saintpaul, S. Carrau e S. Panama também têm sido descritas como causas de infecções humanas associadas com répteis (Weil et al., 1995; Olsen et al., 2001; Geue; Löschner, 2002). Enquanto que, a S. Brandenburg tem sido associada à ocorrência de abortos em pequenos ruminantes, causando prejuízos econômicos aos criadores (Surveillance report, 2002). Alimentos de origem animal constituem um dos principais responsáveis por casos de salmonelose humana, entre eles ovos, carne e derivados (Lírio et al., 1998). A carne de várias espécies de répteis são utilizadas para consumo humano, a qual se não adequadamente manipulada e processada, traz grande risco a saúde pública (Weil et al., 1995; Gonzales et al., 1999). A S. Saintpaul, S. Brandenburg e a S. Infantis têm sido isoladas de matadouros e amostras de carne (Rheault; Quessy, 1999; James, 2000), demonstrando a necessidade de programas rigorosos de higiene nos locais que lidam com esse tipo de alimento. 4.3. Antibiograma Cepas de Salmonella resistentes a múltiplas drogas têm emergido (Cordano; Virgílio, 1996; Davis et al., 2002; Zhao et al., 2003). O teste de sensibilidade a antibióticos realizado com as cepas de Salmonella isoladas dos teiús revelou a Gentamicina e Ampicilina como sendo as drogas mais potentes in vitro, e a sulfonamida foi o antibiótico com maior nível de resistência (83%) (Tabela 5), concordando com os dados de Corrente et al. (2004). Entretanto, a Gentamicina não 58 é comumente usado para tratamento de infecções intestinais. Dos sorotipos encontrados a S. Carrau, S. Rubislaw e S. Infantes foram as que apresentaram maior resistência aos antibióticos, onde a S. Carrau foi a única que apresentou resistência a tetraciclina, e a S. Rubislaw e S. Infantes foram as únicas que apresentaram resistência ao cloranfenicol (Tabela 5). Pasmans et al. (2005) identificaram dois sorotipos isolados de répteis resistentes a Nitrofurantoin e dois isolados de humanos, um resistente a Ampicilina e Espectiomicina, e outro a Sulfonamida. Também relataram que existe uma tendência em isolados de humanos possuírem maior resistência a antibióticos do que isolados de répteis. Assim, uma possível causa da grande taxa de resistência encontrada em isolados de teiús é a pressão antropogênica que estes animais sofrem no cativeiro Foi observado que um animal da baia dois era portador de duas cepas diferentes de S. Rubislaw, uma sensível e outra resistente ao cloranfenicol. O animal da baia nove era portador de duas cepas diferentes de S. Panama, uma com resistência à estreptomicina e com resistência intermediária à tetraciclina e outra com resistência intermediária à estreptomicina e sensível à tetraciclina. O animal da baia dez era portador de três cepas diferentes da S. Rubislaw, uma resistente à estreptomicina e das outras duas, uma possuía resistência intermediária e a outra era sensível à tetraciclina (Tabela 5). Esses resultados sugerem que genes de resistência a antibióticos estejam sendo transferidos lateralmente entre as cepas, o que representa um dado importante quanto à variabilidade genética entre microrganismos de mesma sorotipagem e quanto à importância da realização do antibiograma para um direcionamento específico de tratamentos. Ainda, concordam com Blake et al. (2003) que notificaram a transferência de genes de resistência entre enterobactérias em condições intestinais e com Hamada et al. (2002) que 59 comprovaram esta transferência entre a S. Typhimurium e S. Infantis. A única forma de limitar a transmissão de características de resistência é diminuir a prevalência de bactérias resistentes e, mais diretamente, controlar a prescrição e utilização de antibióticos. Como o tratamento de répteis com antibióticos não é viável para eliminar a bactéria de seu intestino, boas práticas de higiene são recomendadas para os donos de répteis e o pessoal envolvido em criações para diminuir o risco de infecção. Tabela 6. Padrões de resistência a antibióticos dos sorotipos de Salmonella enterica isoladas de 30 teiús Antibiótico Gentamicina Estreptomicina Tetraciclina Ampicilina Sulfonamida Cloranfenicol Sorotipos S. Infantis S I/R S/I S R S/R S. I (O:6,14,24:y:-) S S S S R S S. I (O:6,14,24) S S I S R S S. I (O:6,7:-:1,5) S R I S S S S. Agona S R S/I S R S S. Carrau S S/R S/R S R S S. Rubislaw S I/R S/I S S/R S/R S. Saintpaul S R S S R S S. Brandenburg S R S S R S S. Panama Salmonella sp. (Rugosa) S I/R S/I S R S S R S/I S R S 100 20 53 100 17 85 I (Intermedíário) - 20 41 - - - R (Resistente) - 60 6 - 83 15 Percentual (%) S (Sensível) 60 4.4. Caracterização Molecular Diversas características morfológicas, bioquímicas, sorológicas e genéticas têm sido utilizadas na identificação e diferenciação da Salmonella. Intervenções clínicas e de saúde pública dependem da rápida e apurada identificação de bactérias patogênicas. A PCR, utilizando os iniciadores específicos ST11-ST15, tem demonstrado ser mais sensível e específica do que os métodos tradicionais na identificação de Salmonella (Argôlo, 2004). Antes da PCR é necessária a extração do DNA, principalmente quando se trabalha com comunidades complexas. A PCR realizada a partir de culturas puras com posterior utilização na DGGE atesta o grau de pureza das linhagens além de possibilitar a distinção de linhagens com diferentes sequências no DNA. Todos os iniciadores, ST11GC-ST15, F357GC-R518 e F984GC-R1378, anelaram eficientemente no cromossomo da Salmonella pela PCR, gerando produtos compatíveis com a DGGE de 469 pb, 200pb e 473 pb, respectivamente (Figura 15). Segundo Clarridge III (2004), fragmentos de DNA com 500 a 1500 pb são comuns para sequenciamento e comparações em bancos de dados. 61 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 4 5 6 7 8 9 A 469pb 1 2 3 B 200pb 1 2 3 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C 473pb Figura 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR das amostras dos teiús e serpentes, (A) utilizando os iniciadores ST11GCST15 (469 pb) ; (B) iniciadores F357GC-R518 (200 pb) e (C) iniciadores F984GC-R1378 (473 pb); 1, Marcador de peso molecular pGEM® (Promega); Isolados dos Teiús: 2, Salmonella Carrau; 3, S. Rubislaw; 4, S. Agona; 5, S. Infantis; 6, S. Saintpaul; 7, S. Panama; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. I (O:6,7:-:1,5); 11, S. I (O:6,14,24:y:-); 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 13, Salmonella sp. ‘Rugosa’; Isolados de serpentes: 14, S. Gaminara ; 15, S. Newport; 16, S. IV (O:61:c:1,5); 17, S. IIIb (O:47); 18, S. I (O:4,5:b:-); 19, S. I (O:4,5); 20, S. I (O:11:r:-). 62 A DGGE talvez seja a técnica molecular mais comumente utilizada para análise de comunidades microbianas sem a necessidade de cultivo, pois consegue aliar a grande quantidade de informação contida no genoma microbiano com a facilidade e baixo custo de uma eletroforese para obter o perfil de comunidades complexas. Com a sua utilização foi possível identificar microrganismos nãocultiváveis ou ainda as variações presentes entre organismos de mesma espécie (Muyzer et al. 1993). A PCR-DGGE pode ser usada para detectar as diferenças dentro dos genes de importância tecnológica, para monitoramento de espécies de interesse alimentar e clínico e também para diferenciar cepas que pertencem à mesma espécie. Neste caso, as principais áreas de atuação da PCR-DGGE são a taxonomia e a aplicação tecnológica e clínica. As bandas na DGGE podem ser reveladas por brometo de etídio ou SYBR green. Entretanto, o procedimento mais sensível é com nitrato de prata, mas, corados desta forma, os géis não podem ser usados para experimentos de hibridização e DNA fita-simples também é corado dificultando a análise do perfil das bandas (Ercollini, 2004). O SYBR safe, utilizado neste estudo, tem surgido como uma nova alternativa para a visualização de géis de DGGE, obtendo melhores resoluções que o brometo de etídio, além de não trazer riscos à saúde (MIT, 2006). A DGGE demonstrou uma boa resolução com a utilização do protocolo segundo Sigler et al. (2004), que identificaram o tempo de 5h a 200V como sendo o melhor para a obtenção de uma melhor separação das bandas no gel. Estes mesmos autores perceberam que longos períodos de eletroforese acabam por instabilizar o gradiente desnaturante, causando a perda da capacidade em separar as bandas no gel de acordo com sua sequência nucleotídica. Assim, um menor tempo é indicado para a DGGE, aumentando seu poder de separação das bandas. 63 A DGGE demonstrou pouca eficiência na separação das bandas dos produtos de PCR gerados pelos três pares de iniciadores. Com os iniciadores ST11GC-ST15, que amplificaram eficientemente parte da região JEO402-1 específica para Salmonella, somente as cepas rugosas puderam ser diferenciadas das demais, mas não entre si. Com os iniciadores F357GC-R518 somente uma cepa ‘Rugosa’ e o sorogrupo (O:11:r:-) puderam ser diferenciados. Com os produtos de amplificação dos iniciadores F984GC-R1378 também não foi possível diferenciar as salmonelas em nível de sorotipo, mas podemos formar 4 grupos de similaridade (Figura 16; Tabela 6). Também não foi possível a separação das subspécies encontradas, ficando as subspécies diarizonae e houtenae em grupos onde a subespécie enterica também faz parte (Tabela 6). Essa pouca diferenciação pode ser explicada pelo, suposto, alto nível de similaridade das regiões amplificadas entre as diferentes subespécies e sorotipos de Salmonella. Outro fator que pode ter causado isto é a co-migração de fragmentos do DNA, mesmo possuindo diferentes sequências alguns fragmentos se comportam de maneira similar no gel, o que é um problema para a obtenção de bandas individuais (Muyzer; Smalla, 1998). Melhores discriminações podem ser obtidas com a utilização de iniciadores para regiões mais variáveis, como a região ITS ou 23S, que têm conseguido satisfatoriamente distinguir espécies de Mycobcterium e Streptococcus (Clarridge III, 2004). Apesar da pouca eficiência na separação das cepas de Salmonella, diversos pesquisadores têm demonstrado a capacidade da DGGE em diferenciar bactérias nos mais variados ecossistemas. Ercolini (2004) e McAuliffe et al. (2005) descreveram a capacidade da PCR-DGGE em identificar bactérias ácido-láticas e Mycoplasmas, respectivamente, por meio da amplificação da região V3 do DNAr 16S. Pepe et al. (2003) conseguiram identificar membros do gênero Bacillus ao nível 64 de espécie e Cocolin et al. (2002) diferenciaram ao nível de sorotipo algumas espécies de Listeria. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A B C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 3 4 4 3 2 4 2 3 Figura 16. DGGE dos produtos da PCR, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-; (B) iniciadores F357GC-R518 e (C) iniciadores F984GC-R1378; Isolados dos Teiús: 1, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 2, S. I (O:6,14,24:y:-); 3, S. Rubislaw; 4, S. Panama; 5, S. I (O:6,7:-:1,5); 6, S. Infantis; 7, S. Agona; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. Carrau; 11, S. Saintpaul; 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; Isolados de serpentes: 13, S. Newport; 14, S. I (O:11:r:-); 15, S. IV (O:61:c:1,5); 16, S. Gaminara ; 17, S. I (O:4,5:b:-); 18, S. IIIb (O:47); 19, S. I (O:4,5). 65 Tabela 7. Grupos de similaridade gerados a partir da DGGE da região V6-V8 do 16S RNAr Grupo Sorotipos S. Brandenburg 1 S. Gaminara 2 S. IIIb (O:47) S. I (O:6,14,24) S. Newport S. IV (O:61:c:1,5) 3 S. I (O:4,5) S. I (O:11:r:-) Salmonella sp. ‘Rugosa’ Salmonella sp. ‘Rugosa’ S. I (O:6,14,24:y:-) S. Carrau S. Infantis S. Saintpaul 4 S. Agona S. Rubislaw S. Panama S. IV (O:61:c:1,5) S. I (O:4,5:b:-) A região ITS do DNAr tem sido utilizada associada à DGGE como uma opção para se conseguir diferenciar microrganismos ao nível de subspécie e sorotipo, por esta região possuir sequências tanto conservadas como hipervariáveis (LeblondBourget et al., 1996). Buchana et al. (2001) identificaram a grande diversidade intraespecífica da E. coli utilizando esta região e Park e Kilbane II (2005) conseguiram diferenciar variedades de Streptomyces mais eficientemente com a região ITS do que com a 16S DNAr. Contrariando a alta sensibilidade deste método, algumas espécies distintas mostraram posição de bandas similar na DGGE, como relatado em outros estudos 66 de PCR-DGGE (Tacão et al., 2005; Yergeau et al., 2005). Apesar de possuir resolução máxima de 1 pb entre fragmentos de DNA (Fischer; Lerman, 1983), este poder de separação depende do tamanho e da sequência dos produtos amplificados pela PCR. Assim, fragmentos obtidos de espécies diferentes com diferentes sequências entre si podem migrar de forma similar, tomando a mesma posição no gel (Muyzer et al., 1993; McAuliffe et al., 2005). Esta limitação somente poderá ser solucionada com a ecisão da banda para o sequenciamento. Como relatado anteriormente, foram encontrados mais de um sorotipo em alguns animais. Mas, este dado pode ter sido mascarado devido a subjetividade do diagnóstico microbiológico. Além disso, algumas cepas de Salmonella não podem ser identificadas pelos métodos tradicionais (Rugosa e Mucóide). A capacidade da DGGE em diferenciar espécies poderia evitar estes tipos de problemas. 67 5. CONCLUSÕES • Os teiús representam um importante reservatório de sorotipos raros de Salmonella e que ocorrem diferentes padrões de sensibilidade a antibióticos entre eles. • É fundamental que as autoridades sanitárias promovam campanhas educativas e incentivem a notificação dos casos ocorridos para uma melhor atuação da vigilância sanitária no controle dessa doença. • Rápidos e sensíveis métodos diagnósticos se fazem necessários para assegurar um eficiente combate à doença. A medida que os recursos técnicos aumentam, os custos laboratoriais diminuem, tornando os preços destes tipos de diagnósticos mais competitivos. • A tipagem da Salmonella baseada na PCR-DGGE utilizando os iniciadores ST11ST15, F357-R518 e F984-R1378 não alcançou níveis de subspécie ou sorotipo. Apesar disto, novas pesquisas devem ser realizadas com regiões mais variáveis do cromossomo da Salmonella, pois esta técnica tem um grande poder discriminatório, sendo uma poderosa e promissora ferramenta na identificação de organismos, sem a necessidade de meios específicos e metodologias laboriosas para a identificação. 68 REFERÊNCIAS 1. AABO, S.; RASMUSSEN, O.F.; ROSSEN, L.; SORENSEN, P.D.; OLSEN, J.E. Salmonella identification by the polymerase chain reaction. Mol. Cel. Probe. v. 07, 1993. p. 171-178. 2. ABE, AS. Observations on dormancy in tegu lizards. Naturalia, v. 8, 1983. p. 235-239. 3. ALMEIDA, I.A.Z.C.; PERESI, J.T.M.; CARVALHO, I.S.; RODRIGUES, E.C.A.; MARQUES, D.F.; TAVECHIO, A.T.; FERNANDES, S. A. Salmonella: sorotipos identificados na região de São José do Rio Preto/SP, no período de 1990 - 1999. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 59, n. 1/2, 2000. p. 33-37. 4. ARGÔLO, L.S. Prevalência de Salmonella spp. em serpentes mantidas em cativeiro e comparação da técnica microbiológica padrão de diagnóstico com a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 2004. 43f. Monografia. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus/BA. 2004. 5. BAILEY, J.S.; STERN, N.J.; COX, N.A.; LINE, J.E. Detecting Salmonella and Campylobacter: a review of cultural and rapid methods for the detection of Salmonella and Campylobacter on poultry. Broiler Industry, dez. 1994. 6. BAGER, F.; PETERSEN, J. Sensitivity and specificity of different methods for the isolation of Salmonella from pigs. Acta Vet. Scand. v. 32, 1991. p. 473-81. 7. BAUDART, J.; LEMARCHAND, K.; BRISABOIS, A.; LEBARON, P. Diversity of Salmonella strains isolated from the aquatic environment as determined by serotyping and amplification of the ribosomal DNA spacer regions. Appl. Environ. Microbiol. v. 66, n. 4, 2000. p. 1544-52. 8. BAUMLER, A. J.; TSOLIS, R. M.; FICHT, T. A.; ADAMS, L. G. Evolution of host adaptation in Salmonella enterica. Infetc. Immun. v.66, n. 10, 1998. p. 4579-87. 9. BAUMLER, A.J.; TSOLIS, R.M.; HEFFRON, F. Virulence Mechanisms of Salmonella and their Genetic Basis. In: Wray, C.; Wray A. Salmonella in Domestic Animals. Wallingford, UK: CABI Publishing, 2000. p. 57-72. 10. BLAKE, D.P.; HILLMAN, K.; FENLON, D.R.; LOW, J.C. Transfer of antibiotic resistance between commensal and pathogenic members of the Enterobacteriaceae under ileal conditions. J. Appl. Microbiol. v. 95, 2003. p. 428. 69 11. BRENNER, F.W.; VILLAR, R.G.; ANGULO,F.J.; TAUXE, R.; SWAMINATHAN, B. Salmonella nomenclature. J. Clin. Microbiol. v. 38, n. 7, p. 2465-2467, jul. 2000. 12. BUCHANA, A.; ALBERB, M.; HODSONA, R.E. Strain-specific differentiation of enviromental Escherichia coli isolates via denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of the 16S-23S intergenic spacer region. FEMS Mocrobiol. Ecol. v. 35, n. 3, 2001. p. 313-321. 13. BURKHALTER, P.W.; MILLER, C.; LITHY, J. Detection of Salmonella spp. in eggs: DNA analyses, culture techniques, and serology. J. AOAC Int., v. 78, n. 6, 1995. p. 1531-1537. 14. CASADEVALL, A.; PIROFSKI, L.N. Host-Pathogen Interactions: Basic Concepts of Microbial Commensalism, Colonization, Infection, and Disease. Infect. Immun. v. 68, 2000. p. 6511-6518. 15. CAMPOS, L.C. Salmonella. In: TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O.F.; CANDEIAS, J.A.N. Microbiologia. São Paulo: Atheneu, 1999. cap. 29. 16. CARTER, P.B.; COLLINS, F.M. The route of enteric infection in normal mice. J. Exp. Med. v. 139, 1974. p. 1189-1203. 17. CDC-Centers for Disease ControI and Prevention. Reptile-associated salmonellosis: selected states, 1994-1995. Morbid. Mortal. Weekly. Rep. v. 44, 1995. p.347-350. 18. CDC-Centers for Disease Control and Prevention. Reptile-associated salmonellosis: selected states, 1996-1998. Morbid. Mortal. Weekly. Rep. v. 48, 1999. p. 1247-1249. 19. CDC-Centers for Disease Control and Prevention. Reptile-associated salmonellosis: selected states, 1998-2001. Morbid. Mortal. Weekly. Rep. v. 52, 2003. p. 126-1209. 20. CDC-Centers for Disease Control and Prevention. Salmonella Surveillance: Anual Summary 2004. Atlanta, Georgia: US Departament of Health and Human services, CDC, 2005. 21. CHERRINGTON, C.A.; HUIS, I.; VELD, J.H. Comparison of classical isolation protocols with a 24h screen to detect viable salmonellas in faeces. J. Appl. Bacteriol. v. 75, 1993. p. 65-68. 22. CHISHOIM, S.A.; OLD, D.C.; CRICHTON, P.B. Confinnation of infection from pet skinks by genotypic analysis of Salmonella Glostrup. Sciehwekly Report. v. 33, n. 99/05, 2 fev, 1999. 70 23. CHRISTENSEN, H.; NORDENTOFT, S.; OLSEN, J.E. Phylogenetic relationships of Salmonella based on rRNA sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 1998. p.605 -610. 24. CHRISTENSEN, H.; MØLLER, P.L.; VOGENSEN, F.K.; OLSEN, J.E. 16S to 23S rRNA spacer fragment length polymorphism of Salmonella enterica at subspecies and serotype levels. J. Appl. Microbiol. v. 89, n. 1, 2000. p. 130136. 25. CILIA, V.; LAFAY, B.; CHRISTEN, R. Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the species level. Mol. Biol. Evol. v. 13, n. 3, 1996. p. 451-461. 26. CLARIDGE III, J.E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for indentification of bacteria on clinicla microbiology and infectious diseases. Clin. Microbiol. Rev. v. 17, n. 4, 2004. p. 840-862. 27. COCOLIN, L.; RANTSIOU, K.; IACUMIN, L.; CANTONI, C.; COMI, G. Direct Identification in Food Samples of Listeria spp. and Listeria monocytogenes by Molecular Methods. Appl. Environ. Microbiol. v. 68, 2002. p. 6273-82. 28. COHEN, H.J.; MECHANDA, S.M.; LIN, W. PCR aplication of the fimA gene sequence of Salmonella Typhimurium, a specific method for detection of Salmonella spp. Appl. Environ. Microbiol. v. 62, n. 12, 1996. p. 4303-08. 29. CORDANO, A.M.; VIRGILIO, R. Evolution of drug resistance in Salmonella Panama isolates in Chile. Antimicr. Agents and Chemother., v. 40, n. 2, 1996. p. 336-341. 30. CORRENTE, M.; MADIO, A.; FRIEDRICHK, G.; GRECO, G.; DESARIO, C.; TAGLIABUE, S.; D’INCAU, M.; CAMPOLO, M.; BUONAVOGLIA, C. Isolation of Salmonella strains from reptile and comparison of different culture media. J. Appl. Microbiol. v. 96, 2004. p. 709-715. 31. COUTINHO, H.L.C.; OLIVEIRA, V.M.; MANFIO, G.P.; ROSADO, A.S. Evaluating the Microbial diversity of soil samples: methodological innovations. An. Acad. Bras, Rio de Janeiro, v.3, n.71, 1999. p. 491-503. 32. COX, N.A.; DAVIS, B.H.; KENDALL, J.H.; WATTS, A.B.; COLMER A.R. Salmonella in the laying hen. 3. A comparison of various enrichment broths and plating media for the isolation of Salmonella from poultry feces and poultry food products. Poult. Sci. v. 51, n. 4, 1972. p. 1312-16. 33. COX, J.M.; WOOLCOEK, J.R; SARTOR, A.L. The significance of Salmonella, partieularly S. Infantis, to the Australian egg indurtry. Rural Industries Research and Development Corporation, n. W02/028, 2002. Disponível em: <http://www.rirdc.gov.au>. Acesso em: 08 set. 2003. 71 34. DARGATZ, D.A.; WELLS, S.J.; FEDORKA-CRAY, P.J.; AKKINA, J. The Veterinarian's role in diagnosis, treatment and prevention of multidrug resitant Salmonella Typhimurium DT104. APHIS: USDA. 1998. Disponível em <http://www.aphis.usda.gov> Acesso em: 08 set 2001. 35. DAVIES, C.E.; HILL, K.E.; WILSON, M.J.; STEPHENS, P.; HILL, C.M.; HARDING, K.G.; THOMAS, D.W. Use of 16S ribosomal DNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis for analysis of the microfloras of healing and nonhealing chronic venous leg ulcers. J. Clin. Microbiol. v. 42, n. 8, 2004. p.3549-3557. 36. DAVIS, M.A.; HANCOEK, D.D.; BESSER, T.E. Multiresistant clones of Salmonella enterica: the importance of dissimination. J. Lab. Clin. Med. v. 140, n. 3, 2002. p. 1325-41. 37. DDTHA/CVE (Divisão de Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar/Centro de Vigilância Epidemiológica). Rev. Saúde Pública. v. 39, n. 3, 2005. p. 515518. 38. Departament for Public Health Division of Epdemiology and Health Planning. Snakes, iguanas & reptiles tales. Epidemiologic Notes & Reports. v. 35, n. 2. 2000. p. 1-2. 39. DUSCH, H.; ALTWEGG, M. Evaluation of five new plating media for isolation of Salmonella species J. Clin. Microbiol. v. 33, n. 4, 1995. p.802-804. 40. EPIDEMIOLOGY SECTION – Epidemiology And Prevention Branch. Usefulness of PFGE in evaluating a cluster of Salmonella Rubislaw infections in south Georgia. Geórgia Epidemiology Report. v. 15, n. 1, 1999. 41. ERCOLINI, D. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food. J. Microbiol. Meth. v. 56, 2004. p. 297-314. 42. ESPEJO, R.T.; FEIJOO, C.G.; ROMERO, J.; VÁSQUEZ, M. PAGE analysis of the heteroduplexes between PCR-amplified 16S rDNA: estimation of the sequence similarity and rDNA complexity. Microbiology. v. 144, 1998. p. 1611-17. 43. Fatal neonatal Salmonella Rubislaw infection in household with pet reptile in england. Eurosurveillance Weekly. v. 6, 10 fev, 2000. 44. FEGAN, N.; VANDERLINDE, P.; HIGGS, G; DESMARCHELIER, P. A study of the prevalence and enumeration of Salmonella enterica in cattle and on carcasses during processing. J. Food Prot. v. 68, n. 6, 2005. p. 1147-53. 45. FINLAY, B.B. Cell biology of Salmonella patogenesis. In: MILLER, V.L.; KAPER, J.B.; PORTNOY, D.A.; ISBERG, R.R. Molecular genetics of 72 bacterial pathogenesis, American Society for Microbiology. Washington, DC, 1994. p. 249-261. 46. FISCHER, S. G.; LERMAN, L. S. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory. Biochemistry. v. 80, 1983. p. 1579-1583. 47. FISHER, I. S. T. International trends in Salmonella serotypes 1998-2003 Eurosurveillance. v. 9, 2004. p. 45-47. 48. FITZGERALD, L.A.; CHANI, J.M.; DONADÍO, O.E. Tupinambis lizards in Argentina: implementing management of a traditionally exploited resource. In: Robinson, J.G.; Redford, K.H. (Eds). Neotropical Wildlife: use and conservation. Chicago-USA: University of Chicago press, 1991. p. 303 -316. 49. FLORES, R.R.M. Monitoreo de caceria de Tupinambis spp (Sauria: teiidae) em el Izozog, provincia cordillera, Santa Cruz - Bolívia. In: CABRERA, E.; MERCOLLI, C.; RESQUIN, R. (eds). Manejo de Fauna Silvestre en Amazônia y Latinoamérica. Asunción, Paraguai: CITES. 2000. p.103-106. 50. FLOWERS, R.S.; D'AOUST, J.Y.; ANDREWS, W.H.; BAILEY, J.S. Salmonella. In: VANDERZANT, C.; SPLITTSTOESSER, D.F. (eds.) Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 3.ed. Technical Committee of Microbiological Methods for Foods. Washington, DC: APHA, 1992. p. 372-422. 51. FRICKER, C.R. The isolation of salmonellas and campylobacters: a review. J. Appl. Bacteriol. v. 63, 1987. p. 99-116. 52. GEUE, L., LÖSCHNER, U. Salmonella enterica in reptiles of German and Austrian origin. Vet. Microbiol. v. 84, 2002. p. 79-91. 53. GIANELLA, R.A. Salmonella. In: MANDELL, G.L.; BENNETT, J.E.; DOLIN, R. Principles and Practice of Infectious Diseases. 5. ed. Philadelphia: Churchill Livingstone. 2000. 3263 p. 54. GONZALES, O.M; DE CARO, AE.J.; VIEITES, C.M. Conducción Zootécnica del Tupinambis Teguixin y analisis económico de la actividad. Arch. Zootec. v. 48, 1999. p. 343-346. 55. GOUWS, P.A,; VISSER, M.; BROZEL, V.S. A polymerase chain reaction procedure for the detection of Salmonella spp. within 24 hours. J. Food Protect. v. 61, n. 8, 1998 p. 1039-1042. 56. GRESPAN, A. Salmonelose humana causada por répteis. Anclivepa, São Paulo. Informativo, ano VI, n. 25, 2001. Disponível em: <http://www.anclivepasp.org.br/rev-6-25-02.htm>. Acessado em: 18 fev.2004. 73 57. GUTIÉRREZ-COGCO, L.; MONTIEL-VÁZQUEZ, E.; AGUILERA-PÉREZ, P.; GONZÁLEZ-ANDRADE, M.C. Sorotipos de Salmonella identificados en los servicios de salud de México. Salud Pública de México, v. 42, n. 6, 2000. p. 490-495. 58. HAMADA, K.; TSUJI, H.; OSHIMA, K. Identification and characterization of transferable integron-mediated antibiotic resistance among Salmonella serovar Typhimurium and Salmonella serovar Infantis from 1991 to 2002. Jpn. J. Infect. Dis. v. 55, 2002. p. 135-138. 59. HAMADA, K; OSHIMA. K.; TSUJI, H. Drug resistant genes encoded in integrons and extra-integrons: their distribution and lateral pathogenic Enterobacteriaceae including enterohemorragic Escherichia coli and Salmonella enterica serovars Typhimurium and Infantis. Jpn. J. Infect. Dis. v. 56, 2003. p. 123-126. 60. HATA, M.; SUZUKI, M.; MATSUMOTO, M.; TAKAHASHI, M.; YAMASAKI, M.; HIRAMATSU, R.; MATSUI, H.; SAKAE, K.; SUZUKI, Y.; MIYAZAKI, Y. A new cIonalline of Salmonella Saintpaul having emerged and prevailed sinse 1999 in Aichi, Japan. Jpn. J. Infect. Dis. v. 56, 2003. p. 77-79. 61. HEADRICK, M.L.; WALKER, L.A.; FEDORKA-CRAY, P.J. Antimicrobial Resistance in Salmonella isolates from exotic animals. FDA Veterinarian Newsletter. v. 16, n. 4, July/August, 2001. 62. HEUER, H.; KRSEK, M.; BAKER, P.; SMALLA, K.; WELLINGTON, E.M.H. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel electrophoretic separation in denaturing gradients. Appl. Environ. Microbiol. v. 63, 1997. p. 3233–3244. 63. HIKER, J.H. Enrichment serology and fluorescent antibody procedures to detect salmonellae in foods. J. Milk Food Tech. v. 38, 1975. p. 227-231. 64. JAKABI, M.; BUZZO, A.A.; RISTORI, C.A.; TAVECHIO, A.T.; SAKUMA, H.; PAULA, A.M.R.; GELLI, D.S. Observações laboratoriais sobre surtos alimentares de Salmonella sp. ocorridos na grande São Paulo no período de 1994 a 1997. Rev. Inst. Adolfo Lutz. v. 58, n. 1, 1999. p. 47-51. 65. JAMES, J. Contagious Comments: Salmonella. The Children’s Hospital, v. 15, n. 8, dez. 2000. 66. JENÍKOVÁ, G.; PAZLAROVÁ, J.; DEMNEROVÁ, K. Detection of Salmonella in food samples by the combination of immunomagnetic separation and PCR assay. Int. Microbiol., v. 3, 2000. p. 225-229. 67. JOHNSON, E.H.; HIETALA S.; SMITH, B.P. Chemiluminescence of bovine alveolar macrophages as in indicator of developing immunity in calves 74 vaccinated with aromatic-dependent salmonella. Vet. Microbiol. v. 10, 1985. p. 451-465. 68. KONEMAN, E.W. ALLEN, S.D., JANDA, W.M., SCHRECKENBERGER, P.C., WINN, W.C. Diagnóstico Microbiológico: texto e atlas colorido. 5 ed. Rio de Janeiro: MEDSI, 2001. 1465 p. 69. KREUZER, H.; MASSEY, A. Engenharia genética e biotecnologia. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. 434 p. 70. LAGATOLLA, C, DOLZANI, L, TONIN, E, LAVENIA, A, DI MICHELE, M, TOMMASINI, T, MONTI-BRAGADIN, C. PCR ribotyping for characterizing Salmonella isolates of different serotypes. J. Clin. Microbiol. v. 34, n. 10, 1996. p. 2440-43. 71. LAIDLAW, R. Salmonella, captivity-related stress and the human implications of pet reptiles. World Society for the Protection of Animals. Disponível em: <http://www.wspa.ca/reptiles/reports/zoonoses/report.html>. Acesso em: 20 out. 2003. 72. LANTZ, P.G.; HAHN-HIGERDAL, B. RADSTRÖM, P. Sample preparation methods in PCR-based detection of food pathogens. Trends. Food Sci. Tech. v. 5, 1994. p. 384-389. 73. LEBLOND-BOURGET, N.; PHILIPPE, H.; MANGIN, I.; DECARIS, B. 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter- and intraspecific Bifidobacterium phylogeny. Int. J. Syst. Bacteriol. v. 46, n. 1, 1996. p. 102-111. 74. LI, H.; GYLLENSTEIN, V.B.; CUI, X.; SAIKI, R.K.; EHRLICH, H.; ARNHEIM, N. Amplification and analylis of DNA sequences in single humam sperm and diploid cells. Nature. v. 335, 1988. p. 414-417. 75. LIRIO, V.S.; SILVA, E.A.; STEFO NI, D.C.; RECCO, E.A.P.; MALUF, Y.T.; MIYZAWA, T.T.; NEVES, D.V.D.A.; OLIVEIRA, V.M.R. Freqüência de 17 sorotipos de Salmonella isolados em alimentos. Higiene Alimentar. São Paulo, v. 12, n.55, 1998. p. 36-41. 76. LITTELL, A.M. Plating Medium for differentiating Salmonella arizonae from other salmonellae. Appl. Environ. Microbiol. v. 33, n. 2, 1977. p. 485-487. 77. LUZ, S.P.; RODRIGUEZ-VALERA, F.; LAN, R.; REEVES, P.R. Variation of the ribosomal operon 16S-23S gene spacer region in representatives of Salmonella enterica subspecies. J. Bacteriol. v. 180, n. 8, 1998. p. 2144-51. 78. MACIEL, B.M.; ARGÔLO FILHO, R.C.; FREITAS, E.S.; KRUSCHEWSKY, F.F.; SANTOS, B.F.; ROCHA, G.D.; WETLER, R.M.C.; MARTINS, L.A.F. 75 Ocorrência de sorotipos exóticos de Salmonella encontrados em cães assintomáticos nos distritos do município de Ilhéus/BA-Brasil. Braz. J. Vet. Res. v. 41, n. 4, 2004. p. 247-253. 79. MACIOROWSKI, K. G.; PILLAI, S. D.; JONES, F. T.; RICKE, S. C. Polymerase chain reaction detection of foodborne Salmonella spp. in animal feeds. Crit. Rev. Microbiol. v. 31, n. 1, 2005.p. 45-53. 80. MALORNY, B.; HOORFAR, J.; BUNGE, C.; HELMUTH, R. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towardsan international standard. Appl. Environ. Microbiol. v. 69, n. 1, 2003. p. 290296. 81. MARTINO, G. Información: animale em cautiverio. The Humane Society of the United States, 22 dez. 1999. 82. MASTROENI, P.; RAMOS, B.V.; HORMAECHE, C.E. Adoptive transfer of immunity to oral challenge with virulent salmonellae in innately susceptible BALB/c mice requires both immune serum and T cells. Infect. Immun. v. 61, 1993. p. 3981-3984. 83. McAULIFFE, L., ELLIS, R.J.; LAWES, J.R.; AYLING, R.D.; NICHOLAS, R.A.J. 16s rDNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis: a single generic test for detecting and differentiating Mycoplasma species. J. Med. Microbiol. v. 54, 2005. p. 731-739. 84. McEVOY, J.M.; DOHERTY, A.M.;SHERIDAN, J.J.; BLAIR, I.S.; MCDOWELL, D.A. The prevalence of Salmonella spp. in bovine faecaI, rumen and carcass samples at a commercial abattoir. J. Appl. Microbiol., v. 94, 2003. p. 693700. 85. McEWAN N.R.; ABECIA, L.; REGENSBOGENOVA, M.; ADAM, C.L.; FINDLAY, P.A.; NEWBOLD, C.J. Rumen microbial population dynamics in response to photoperiod. Lett. Appl. Microbiol. v. 41, 2005. p. 97-101. 86. MEEHAN, S.K. Reptile-related salmonellosis. JAMVA, v. 209, n. 3, 1996. p. 531. 87. MERMIN, J.; HUTWAGNER, L. VUGIA, D. SHALLOW, S.; DAILY, P.; BENDER, J.; KOEHLER, J.; MARCUS, R.; ANGULO, F.J. Repiles, amphibians and human Salmonella infection: a population-based, case-control study. Clin. Infect. Dis. v. 38, n. 3, 2004. p. 253-261. 88. MIT Green Chemistry. Case Study: Substitution of Ethidium Bromide with SYBR Safe®. MIT: Massachusetts Institute of Technology. March, 2006. Disponível em: <http://web.mit.edu/ENVIRONMENT/pdf/SYBR.pdf> Acesso em: 26 de janeiro de 2007. 76 89. MITCHELL, M.A.; SHANE, S.M. Preliminary findings of Salmonella spp. in captive green iguanas (Iguana iguana) and their environment Prevent. Vet. Med. v. 45, 2000. p. 297-304. 90. MICHETTI, P.; MAHAN, M.J.; SLAUCH, J.M.; MEKALANOS, J.J.; NEUTRA, M.R. Monoclonal secretory immunoglobulin A protects mice against oral challenge with the invasive pathogen Salmonella typhimurium. Infect. Immun. v. 60, 1992. p. 1786-1792. 91. MOLLA, B.; ALEMAYEHU, D.; SALAH, W. Sources and distribution of Salmonella serotypes isolated from food animals, slaughterhouse personnel and retail meat products in Ethiopia: 1997-2002. Ethiop. J. Health Dev. v. 17, n. 1, 2003. p. 63-70. 92. MUYZER, G.; WAAL, E.C.; UITTERLINDEN, A.G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol. v. 59, n. 3, 1993. p. 695-700. 93. MUYZER, G.; SMALLA, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradiente gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Anton. Leeuw. v. 73, 1998. p. 127-141. 94. NASCIMENTO, M.S.; BERCHIERI JR, A.; BARBOSA M.D.; ZANCAN F.T.; ALMEIDA W.A.F. Comparação de meios de enriquecimento e de plaqueamento utilizados na pesquisa de Salmonella em carcaças de frango e fezes de aves. Rev. Bras. Cienc. Avic. v.2, n. 1, 2000. 95. NOGUEIRA FILHO, S.L.G.; NOGUEIRA, S.S.C. Análise econômica da criação comercial de animais silvestres. ln: FANG, T.G.; MONTENEGRO, O.L.; BODMER, RE. (eds.) Manejo y conservação de fauna silvestre en America Latina, La Paz, Bolívia: Instituto de Ecologia. 1999. p. 189-193. 96. NORIEGA, T.T.; FOGLIATTO, O.; MIGNOLA, L.; MANES, Y.M. Ciclo biológico y patrones de comportamiento en una población de iguanas overas Tupinambis teguixin (L.) (Sauria: teiidae) adaptada aI cativeirio. Rev. Agron. N.O. Argent. v. 28, 1996. p.114-125. 97. OLSEN, J.E.; AABO, S.; ROSSEN, S.; RAMUSSEN, O.F. Salmonella identification by the polymerase chain reaction. US n. 6004747, 11 mar. 1996, 21 dez. 1999. 98. OLSEN, S.J.; BISHOP, R.; BRENNER, F.W.; ROELS, T.H.; BEAN, N.; TAUXE, R.V.; SLUTSKER, L. The changing epidemiology of Salmonella: trends in serotypes isolated from humans in the United States, 1987-1997. J. Infect. Dis. v. 183, 2001. p. 753-761. 77 99. OSTE, C. Product aplication focus: polymerase BioTechniques, v. 6, n. 2, 1988. p. 162-167. chain reaction. 100. PARK, H.-S.; KILBANE II, J.J. Rapid detection and high-resolution discrimination of the genus. Streptomyces. based on 16S–23S rDNA spacer region and denaturing gradient gel electrophoresis. J. Ind. Microbiol. Biothecnol. v. 33, 2006. p. 289-297. 101. PASMANS, F.; MARTEL, A.; BOYEN, F.; VANDEKERCHOVE, D.; WYBO, I.; IMMERSEEL, F.V.; HEYNDRICKX, M.; COLLARD, J.M.; DUCATELLE, R.; HAESEBROUCK, F. Characterization of Salmonella isolates from captive lizards. Vet. Microbiol. v. 110, n. 3/4, 2005. p. 285-91. 102. PELCZAR Jr., M.J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2ª ed. São Paulo: Makron Books. v. 2, 1997. 229 p. 103. PELKONEN, S.; ROMPPANEN, E.L.; SIITONEN, A.; PELKONEN, J. Differentiation of Salmonella serovar Infantis isolates from humn and animal sources by fingerprinting IS200 and 16S rrn loci. J. Clin. Microbiol. v. 32, n. 9, 1994. p. 2128-33. 104. PEPE, O.; BLAIOTTA, G.; MOSCHETTI, G.; GRECO, T.; VILLANI, F. Ropeproducing strains of Bacillus spp. from wheat bread and strategy for their control by acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. v. 69, 2003. p. 2321-29. 105. PORTNOY, D.A. Innate immunity to a facultative intracellular bacterial pathogen. Curr. Opin. Immunol. v. 4, 1992. p. 20-24. 106. RAHN, K.; DE GRANDIS, S.A.; CLARKE, R.C.; MCEWEN, S.A.; GALÁN, J.E.; GINOCCHIO, C.; CURTISS III, R.; GYLES, C.L. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella Typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of detection of Salmonella. Mol. Cell. Probe. v. 6, 1992. p. 271-279. 107. REED, W.M.; OLANDER, H.J.; THACKER, H.L. Studies on the pathogenesis of Salmonella typhimurium and Salmonella chloeraesuis var kunzendorf infection in weaning pigs. Am. J. Vet. Res. v. 47, 1986. p. 75-83. 108. RHEAULT, N.; QUESSY, S. Sampling of enviroment and carcasses for the detection of Salmonella in swine abattoirs. In: Internacional Simposium on the Epidemiology and Control of Salmonella in Pork, 3, 1999, Washington DC. Trabalho apresentado, Washington DC, 1999. 109. RODÍCIO, M.R.; MENDOZA, M.C. Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. v. 22, n. 4, 2004. p. 238-45. 78 110. SÁ, I.V.A.; SOLARI, C.A. Salmonella in brazilian and imported pet reptiles. Braz. J. Microbiol. v. 32, n. 4, oct./dez., 2001. p. 293-297. 111. Salmonella spp. FCF/USP, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, São Paulo. Disponível em: <http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/Exclusivo/ Inserir/Anexos/LinkAnexos/Salmonella%5B1%5D.pdf> Acesso em: 29 de Janeiro de 2007. 112. SCHAT, K.A. Cell-mediated immune effector function in chickens. Poult. Sci. v. 73, 1994. p. 1077-1081. 113. SCOTT, T.; FOSTER, B.G. Salmonella spp. in free-ranging and farmed alligators (Alligator mississippiensis) from Texas and Lousiana, USA. Aquaculture, v. 156, 1997. p. 179-181. 114. SHEFFIELD, V.C.; COX, D.R.; LERMAN, L.S.; MYERS, R.M. Attachment of a 40-base-pair G + C - rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. v. 86, n. 1, 1989. p.232-236. 115. SIBLEY, J.; YUE, B.; HUANG, F.; HARDING, J.; KINGDON, J.; CHIRINOTREJO, M.; APPLEYARD, G.D. Comparison of bacterial enriched-broth culture, enzyme linked immunosorbent assay, and broth culture-polymerase chain reaction techniques for identifying asymptomatic infectons with Salmonella in swine. Can. J. Vet. Res., v. 67, 2003. p. 219-224. 116. SIGLER, W.V.; MINIACI, C.; ZEYER, J. Electrophoresis time impacts the denaturing gradient gel electrophoresis-based assessment of bacterial community structure. J. Microbiol. Meth. v. 57, 2004. p. 17-22. 117. STRACHAN, T.; READ, A. P. Genética Molecular Humana. 2ª edição. Porto Alegre: Artmed, 2002. p. 119-122. 118. SOLARI, C.A.; MANDARINO, J.R.; PANIZZUTTI, M.H.M.; FARIAS, R.H.G. A new serovar and a new serological variant belonging to Salmonella enterica subespécie diarizonae. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v. 98, 2003. p. 501-502. 119. SONNE-HANSEN, J.; JENABIAN, S.M. Molecular serotyping of Salmonella: identification of the 1H antigen based on partial sequencing of the fliC gene. AMPIS. v. 113, 2005. p. 340-348. 120. SUKHNANAND, S.; ALCAINE, S.; WARNICK, L.D.; SU, W.; HOF, J.; CRAVER, M.P.J.; McDONOUGH, P.; BOOR, K.J.; WIEDMANN, M. DNA Sequence-Based subtyping and evolutionary analysis of selected Salmonella enterica serotypes. J. Clin. Microbiol. v. 43, n. 8, 2005. p. 3688-98. 79 121. SURVEILLANCE REPORT: Small ruminants. Vet. Lab. Agency. v. 6, n. 1, jan/mar. 2002. 122. TACÃO, M.; MOURA, A.; ALVES, A.; HENRIQUES, I.; SAAVEDRA, M.J.; CORREIA, A. Evaluation of 16S-rDNA and gyrB-DGGE for typing members of the genus Aeromonas. FEMS Microbiol. Lett. v. 246, n.1, 2005. p. 11-18. 123. TADDEI, F.; RADMAN, M.; MAYNARD-SMITH, J.; TOUPANCE, B.; GOUYON, P. H.; GODELLE B. Role of mutator alleles in adaptive evolution. Nature. v. 387, 1997. p. 700-702. 124. TANG, Y.-W.; ELLIS, N.; HOPKINS, M. K.; SMITH, D. H.; DODGE, D. E.; PERSING, D. H. Comparison of phenotypic and genotypic techniques for identification of unusual aerobic pathogenic gram-negative bacilli. J. Clin. Microbiol. v. 36, 1998. p. 3674-3679. 125. TAVECHIO, A.T.; GHILARDI, A.C.; PERESI, J.T.; FUZIHARA, T.O.; YONAMINE, E.K.; JAKABI, M.; FERNANDES, S.A. Salmonella serotypes isolated from nonhuman sources in São Paulo, Brazil, from 1996 throug 2000. J. Food Prot. v. 65, n. 6, 2002. p.1041-44. 126. THRELFALL, E.J.; FROST, J.A.; WARD, L.R.; ROWE, B. Epidemic in cattle and humans of Salmonella typhimurium DT104 with chromosomally integrated multiple drug resistence. Vet. Rec. v. 134, 1994. p. 577. 127. THRELFALL, E.J.; FROST, J.A. WARD, L.R.; ROWE, B. Increasing spectrum of resistence in multiresistant Salmonella Typhimurium. The Lancet. v. 347, 1996. p. 1053-1054. 128. TINDALL, B.J.; GRIMONT, P.A.D.; GARRITY, G.M.; EUZÉBY, J.P. Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella. Int. J. Syst. Evol. Micr. v. 55, 2005. p. 521-524. 129. TRKOV, M.; AVGUSTIN, G. An improved 16S rRNA based PCR method for specific detection of Salmonella enterica. Int. J. Food Microbiol. v. 80, 2003. p. 67-75. 130. VAN BEEK, S.; PRIEST, F.G. Evolution of the lactic acid bacterial community during malt whisky fermentation: a polyphasic study. Appl. Envirom. Microbiol. v. 68, 2002. p. 297-305. 131. VAN DER ZEE, H.; HUIS, J.H.J. Rapid and alternative screening methods for microbiological analysis. J. AOAC Int. v. 80, 1997. p. 934-940. 132. VAN DER WOLF, O.J. Salmonella infections in finishing pigs in the Netherlands: bacteriological herd prevalence, serogroup and antibiotic resistance of isolates and risk factors for infection. Vet. Microbiol. v. 57, 1999. 80 p. 263-275. 133. VELONAKIS, E.-N.; MARKOGIANNAKIS, A.; KOND, L.; VARJIOTI, E.; MAHERA, Z.; DEDOULI, E.; KARAITIANOU, A.; VAKALIS, N.; BETHIMOUTI, K. Evolution of antibiotic resistance of non-typhoidal Salmonellae in Greece during 1990-97. Eurosurvillance. v. 6, n. 7/8, july/Aug, 2001. p.117-12. 134. VASCONCELLOS, S.A. Zoonoses e saúde pública: riscos causados por animais exóticos. Biológico. São Paulo, v. 63, n. 1/2, 2001. p. 63-65. 135. YERGEAU, E.; FILION, M.; VUJANOVIC, V.; St-ARNAUD, M. A PCRdenaturing gradient gel electrophoresis approach to assess Fusarium diversity in asparagus. J. Microbiol. Meth. v. 60, 2005, p. 143-154. 136. ZHAO S., DATTA A.R., AYERS S., FRIEDMAN S., WALKER R.D. Antimicrobial-resistant Salmonella serovars isolated from imported foods. Int. J. Food Microbiol. v. 84, 2003. p. 87-92. 137. WALL, P.G.; MORGAN, D.; LAMDEN, K.; GRIFFIN, M.; THRELFALL, E.J.; WARD, L.R.; ROWE. B. Transmition of multi-resistant strains of Salmonella typhimurium from cattle to man. Vet. Record. v. 136, 1995. p.591-592. 138. WARD, B.B. How many species of prokaryotes are there? PNAS. v. 99, n. 16, 2002. p. 10234-36. 139. WEIL, B.J.; MARTENS, P.B.; HARTE, J.S. Iguana-associated salmonellosis in a young adult. J. Adolesc. Health. v. 17, 1995. p. 120-122. 140. WEISBURG, W.G.; BARNS, S.M.; PELLETIER, D.A.; LANE, D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. v.173, n. 2, 1991. p. 697-703. 141. WILLIAMS, RJ. Globalization of antimicrobial resistence: epidemiologicaI chalIengens. Clin. Infect. Dis. v. 33 , 2001. p. 116-117. 142. WOESE, C.R. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. v. 51, 1987. p. 221-271. 143. WOO, P.C.Y.; FUNG, A.M.Y.; WONG, S.S.Y.; TSOI, H.W.; YUEN, K.Y. Isolation and characterization of a Salmonella enterica serotype Typhi variant and its clinical and public health implications. J. Clin. Microbiol. v. 39, n. 3, 2001. p. 1190-1194. 144. WOODWARD, D.J.; KHAKHRIA, R.; JOHNSON, W.M. Human salmonellosis associated with exotic pets. J. Clin. Microbiol. v. 35, 1997. p. 2786-2790. 81 145. WOOLEY, R.E.; RITCHIE, B.W.; CURRIN, M.F.; CHITWOOD, S.W.; SANCHES, S.; CRANE, M.M. In vitro inhibition of Salmonella organisms isolated from reptiles by an inactivated culture of microcin-producing Escherichia coli. Am. J. Vet Res. v. 62, 2001. p. 1399-1401. 146. WRAY, C.; SOJKA W.J. Reviews of progress in dairy science: bovine salmonellosis. J. Dairy Res. v. 44, 1997. p. 383-425. 82 ANEXO Anexo A – Artigo intitulado: “Prevalence, serotype and antibiotic sensitivity of Salmonella spp. isolated in a population of captive tegus (Tupinambis merianae)”. Submetido para publicação pelo periódico Research in Veterinary Science. 83