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Alim. Nutr.= Braz. J. Food Nutr., Araraquara
2014 Jan-Mar; 25(1): 19-24
ISSN 0103-4235
e-ISSN 2179-4448
Formação de biofilme por Pseudomonas aeruginosa sobre
aço inoxidável em contato com leite e seu controle por
óleos essenciais
Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on stainless
steel in contact with milk and its control by essential oils
Nádia Nara BATISTA 1*
Natália Gonçalves CAMARGOS 2
Maíra Maciel Mattos de OLIVEIRA 3
Roberta Hilsdorf PICCOLI 4
Resumo
Abstract
Objetivo: Avaliar a ação bacteriostática e bactericida de
diferentes óleos essenciais sobre células planctônicas
de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, bem como
verificar a ação sanitizante, dos óleos essenciais que
apresentarem a menor Concentração Mínima Inibitória
(CMI), sobre o biofilme formado por esta espécie.
Material e Métodos: A ação bacteriostática foi realizada
por meio da determinação das CMIs dos óleos de Zingiber
officinale, Eugenia caryophyllus, Elettaria cardamomum,
Citrus limon e Citrus reticulata v. tangerine. O tempo de
morte bacteriana foi determinado utilizando-se as CMIs
de cada óleo essencial submetidos a diferentes tempos de
contato. O biofilme de P. aeruginosa foi desenvolvido em
cupons de aço inoxidável AISI 304 dispostos em placa de
Petri contendo leite tratado por Ultra Alta Temperatura
(UAT), sendo incubado sob agitação de 70 rpm, a 37
°C/96 horas. Células aderidas foram removidas através
de swabs e enumeradas por contagem em placas após
submissão a diferentes tratamentos. Resultados: Todos
os óleos essenciais apresentaram efeito bacteriostático, se
destacando Z. officinale, E. caryophyllus e E. cardamomum,
por apresentarem menor CMI. O tempo de morte de P.
aeruginosa foi de 10 minutos quando utilizadas soluções
a base de E. cardamomum e E. caryophyllus. No entanto,
quando testados em biofilme, apenas E. caryophyllus
eliminou as células bacterianas viáveis de P. aeruginosa.
Conclusão: E. caryophyllus é uma nova alternativa para
o controle do biofilme de P. aeruginosa na indústria de
alimentos, pois, além de sua alta atividade antimicrobiana,
é um composto natural, o que atende as exigências do
mercado consumidor.
Palavras-chave:
Atividade
antibacteriana;
óleos
essenciais; Pseudomonas aeruginosa.
Objective: To evaluate bacteriostatic and bactericidal
effects of various essential oils on planktonic cells of
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and to test the
sanitizing efficiency of these oils in terms of minimum
inhibitory concentration (MICs) toward the biofilm formed
by this species. Materials and Methods: To verify the
bacteriostatic action, we determined the MICs of essential
oils from Zingiber officinale, Eugenia caryophyllus,
Elettaria cardamomum, Citrus limon, and Citrus reticulata
v. tangerine. The time-kill curves for P. aeruginosa were
constructed from the MICs of each essential oil (various
contact periods). The P. aeruginosa biofilm was created
on coupons of stainless steel AISI 304, which were
placed in Petri dishes containing ultra-high-temperature
milk. The incubation lasted for 96 hours at 37 °C, with
agitation at 70 rpm. Adherent cells were removed with
swabs and counted by plating after various treatments.
Results: All the essential oils showed a bacteriostatic
effect, especially oils from Z. officinale, E. caryophyllus,
and E. cardamomum, which showed a lower MIC. The
P. aeruginosa time-kill was 10 minutes when we used a
solution containing E. cardamomum or E. caryophyllus
essential oil. Nevertheless, when we tested the essential
oils on the biofilm, only the E. caryophyllus oil eliminated
all the viable cells of P. aeruginosa. Conclusion: Essential
oil from E. caryophyllus is a promising bacteriostatic agent
for control of P. aeruginosa biofilms in the food industry
because this oil is a natural substance and has a strong
antimicrobial activity. This combination of properties
meets the requirements of the consumers.
Keywords: antibacterial activity; essential oil;
Pseudomonas aeruginosa.
1 Pós-graduanda em Ciência dos Alimentos – Departamento de Ciência dos Alimentos – UFLA – 37200-000 – Lavras – MG– Brasil. E-mail: nadia.nb@
hotmail.com
2 Engenheira de Alimentos – Kerry Group – 37410-000 - Três Corações – MG – Brasil.
3 Professora – Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo – IFES – 29375-000 – Venda Nova do Imigrante - ES – Brasil.
4 Professora Associada – Departamento de Ciência dos Alimentos - UFLA – 37200-000 – Lavras – MG – Brasil.
Endereço para correspondência: Nádia Nara BATISTA, UFLA – 37200-000 – Lavras – MG– Brasil. E-mail: [email protected]
BATISTA, N.N. CAMARGOS, N.G. OLIVEIRA, M.M.M. PICCOLI, R.H.; Alim Nutr. = Braz J Food Nutr., 2014 Jan-Mar; 25(1): 19-24.
Introdução
Biofilmes podem ser definidos como comunidades
microbianas que se encontram aderidas a superfícies sólidas
e protegidas por uma matriz de exopolissacarídeos (15, 24).
Na indústria de alimentos o patógeno Pseudomonas
aeruginosa apresenta-se amplamente distribuído por
possuir características como a capacidade de sobreviver
a baixas concentrações de nutrientes e de se multiplicar
mesmo sob refrigeração, o que o torna conhecido como um
microrganismo psicrotrófico (19).
Conforme Shah (21), a maioria dos psicrotróficos
não sobrevive à pasteurização e ao tratamento por Ultra Alta
Temperatura (UAT). Contudo, durante seu crescimento,
produzem enzimas termoresistentes podendo causar
gelatinização do leite UAT, desenvolvimento de sabor e
aroma indesejáveis em leite pasteurizado, diminuição do
rendimento de queijos e alterações sensoriais em iogurte. A
presença de bactérias psicrotróficas na indústria de laticínio
pode ocorrer, entre outros fatores, devido a deficiências em
procedimentos de higienização (1, 2, 7, 8, 11, 18, 23).
Assim, diante da importância que a higienização
desempenha na obtenção de alimentos seguros e de
qualidade, além da adoção de práticas corretas para
execução da mesma, novos procedimentos ou produtos
nesta área vêm sendo pesquisados com intuito de tornar mais
eficiente a remoção de resíduos de alimentos e a eliminação
de microrganismos de superfícies industriais, evitando a
formação de biofilmes microbianos. A utilização de óleos
essenciais como sanitizantes naturiais, por exemplo, é uma
dessas novas alternativas (14). Possibilidade ainda pouco
estudada é a utilização em conjunto de óleos essenciais e
detergentes, o que poderia reduzir para apenas uma etapa o
procedimento de higienização.
Óleos essenciais, metabólitos secundários vegetais
voláteis, se destacam pelas propriedades antibacterianas
(14). Embora seu mecanismo de ação não seja plenamente
compreendido, possivelmente esteja inicialmente ligado
a perturbações dos compostos lipofílicos da membrana
citoplasmática (3, 6).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação
bacteriostática e bactericida de diferentes óleos essenciais
sobre células planctônicas de P. aeruginosa ATCC 27853,
bem como verificar a eficiência sanitizante, sobre o
biofilme formado por esta espécie, dos óleos essenciais de
Eugenia caryophyllus e Elettaria cardamomum, utilizados
em soluções com ou sem a adição de detergente alcalino.
Material e Métodos
Cepa bacteriana utilizada, padronização, estocagem
e preparo do inóculo
O microrganismo utilizado foi P. aeruginosa ATCC
27853. Para a padronização do número de células, a cepa
foi inicialmente inoculada em 200 mL de caldo Brain Heart
Infusion (BHI), o qual foi incubado a 37°C. Em seguida, a
partir do BHI, a curva de crescimento foi determinada pela
20
realização periódica de leituras da absorbância da cultura a
600 nm e de diluições seriadas em água peptonada (0,1%
p/v) com posterior plaqueamento em superfície para a
determinação do Log UFC/mL, utilizando-se como meio de
cultura ágar Triptona de Soja (TSA). Durante a realização de
todo o experimento, a cepa foi estocada congelada em meio
de cultura de congelamento (por 100 mL de água destilada:
15 mL de glicerol; 0,5 g de peptona bacteriológica; 0,3
g de extrato de levedura; 0,5 g de NaCl; pH 7,2). Para a
reativação e utilização, uma alíquota do meio de cultura de
congelamento foi transferida para tubos de ensaio contendo
BHI, incubados a 37°C por 24 horas. Em seguida, a cultura
foi estriada em TSA vertido em placas de Petri e incubada
a 37°C por 24 horas. Das colônias formadas na superfície
do TSA, uma alçada foi retirada e transferida para 200 mL
de BHI, o qual foi incubado a 37°C, até atingir o número
de células necessárias para a utilização no experimento,
aproximadamente 9 Log UFC/mL, correspondente a
densidade ótica de 1,01 a 600 nm.
Óleos essenciais
Foram utilizados óleos essenciais da casca de
Citrus reticulata v. tangerine (tangerina) e Citrus limon
(limão siciliano), da raiz deZingiber officinale (gengibre),
dos botões florais de E. caryophyllus (cravo botão) e das
sementes de E. cardamomum (cardamomo), sendo estes
adquiridos da Ferquima Indústria e Comércio Ltda. Os
constituintes majoritários, dos mesmos, indicados pela
empresa fornecedora, foram, respectivamente: limoneno,
limoneno, zingibereno e beta-sesquifelandreno, eugenol e
α-terpineol.
Condução do experimento
O experimento foi conduzido em duas etapas. A
primeira testou a atividade antibacteriana de diferentes
óleos essenciais, com o objetivo de selecionar os mais
efetivos para o desenvolvimento de soluções a serem
utilizadas no controle do biofilme de P. aeruginosa. A
segunda objetivou a formação do biofilme sobre superfície
de aço inoxidável em contato com leite e a avaliação da
atividade antibacteriana de soluções contendo os óleos
essenciais selecionados, elaboradas com ou sem a adição
de detergente alcalino (SANDET 874).
Atividade antibacteriana dos óleos essenciais
contra células planctônicas
Concentrações Mínimas Inibitórias (CMIs)
As CMIs dos óleos essenciais de C. reticulata
v. tangerine, Z. officinale, C. limon, E. caryophyllus e
E. cardamomum foram determinadas pela técnica de
diluição em ágar de acordo com metodologia proposta por
Oussalah et al. (16), com adaptações. Foram preparados
50 mL de TSA acrescido de 0,5% de Tween 80 e os óleos
essenciais foram adicionados em diferentes concentrações
(0,0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 e 5,0 v/v).
Para cada concentração, foram feitas duas repetições,
cada qual representada por uma placa de Petri contendo,
BATISTA, N.N. CAMARGOS, N.G. OLIVEIRA, M.M.M. PICCOLI, R.H.; Alim Nutr. = Braz J Food Nutr., 2014 Jan-Mar; 25(1): 19-24.
aproximadamente, 25 mL de meio de cultura. A cepa da
P. aeruginosa foi transferida para caldo BHI e incubada
a 37ºC até atingir a concentração de aproximadamente 9
Log UFC/mL, sendo monitorada pelo espectrofotômetro.
O plaqueamento em superfície foi realizado transferindo
0,1 mL do inóculo para a placa de Petri, e espalhado com
alça de Drigalsky. A incubação foi realizada a 37°C por
24 horas. A menor concentração que resultou em ausência
de crescimento bacteriano na superfície do ágar foi
denominada CMI.
Curvas de morte bacteriana
As curvas de morte de P. aeruginosa foram
determinadas utilizando-se as CMIs de cada óleo essencial.
A cepa de P. aeruginosa foi inoculada em 200 mL de
caldo BHI e incubada a 37ºC até atingir a concentração
de aproximadamente 9 Log UFC/mL. Soluções foram
elaboradas com os óleos essenciais nas CMIs, completandose o volume referente ao óleo essencial para 10% (v/v) do
volume total da solução com etanol 95%. Água peptonada
0,1% (p/v) foi utilizada para completar o volume total da
solução para 100% (v/v). A solução controle, por sua vez,
continha apenas água peptonada e etanol. Em seguida, 1
mL do inóculo foi transferido para 25 mL de solução. As
soluções foram mantidas a temperatura ambiente (25°C). A
quantificação de P. aeruginosa foi realizada pela técnica da
microgota após 10, 20 e 30 minutos. Para tanto, diluições
seriadas foram realizadas em água peptonada 0,1% (p/v) e
10 µL das diluições adequadas foram inoculadas em placas
de Petri contendo TSA que foram incubadas a 37°C por
18 horas. O resultado foi expresso em Log UFC/mL. A
atividade bactericida foi detectada ao se obter resultados
abaixo do limite de detecção da técnica de plaqueamento
empregada (<3,00 Log UFC/mL).
Atividade antibacteriana dos óleos essenciais
contra células em biofilme
Formação do biofilme bacteriano
A cepa de P. aeruginosa foi inoculada em 200 mL de
caldo BHI e incubada a 37ºC até atingir a concentração de
aproximadamente 8 Log UFC/mL. Em seguida, 0,6 mL do
inóculo foi transferido para 59,4 mL de leite integral tratado
por UAT. Posteriormente, os 60 mL foram transferidos para
uma placa de Petri de 15 cm de diâmetro que continha 20
cupons de aço inoxidável AISI 304 (0,1 x 0,8 x 1,8 cm)
devidamente higienizados (limpos individualmente em
acetona, detergente alcalino, álcool 70% e enxaguados
em água destilada estéril) e esterilizados (121°C por 15
minutos em autoclave). O sistema foi incubado a 37°C por
48 horas sob agitação de 70 rpm.
Após as 48 horas iniciais, os cupons foram lavados
três vezes em água peptonada, para remoção das células
não aderidas, e transferidos para uma nova placa de Petri
estéril contendo 60 mL de leite UAT integral sem o inóculo
bacteriano. O sistema foi novamente mantido sob agitação
de 70 rpm a 37°C por 48 horas para permitir a formação
completa do biofilme.
Tratamento dos cupons de aço inoxidável
Os óleos essenciais de E. caryophyllus e E.
cardamomum foram utilizados por apresentar maior efeito
antibacteriano nos testes iniciais. As composições das
soluções de tratamento encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Composição das soluções de tratamento dos
cupons de aço inoxidável que continham células sésseis de
P. aeruginosa.
Solução
1
Composição (%)
AP1
E2
DA3
OE4
Controle A
90,00
Controle B
89,00
10,00
-
-
10,00
1,00
-
Tratamento A de E. cardamomum
89,75
Tratamento B de E. cardamomum
88,75
10,00
-
0,25
10,00
1,00
Tratamento A de E. caryophyllus
0,25
89,75
10,00
-
Tratamento B de E. caryophyllus
0,25
88,75
10,00
1,00
0,25
Água peptonada, 2Etanol, 3Detergente alcalino, 4Óleo essencial
Os cupons foram lavados três vezes em água
peptona, para eliminação de qualquer célula planctônica,
e submetidos aos tratamentos durante 15 e 30 minutos de
contato em condições estáticas e a temperatura ambiente
(25°C).
Enumeração das células bacterianas aderidas
Após 96 horas de formação do biofilme, o
número de células aderidas aos cupons de aço inoxidável
foi determinado após os tratamentos com as soluções
sanitizantes à base de óleos essenciais com ou sem detergente
alcalino e solução controle. Cupons não submetidos a
nenhum tratamento também foram enumerados, o que
caracterizou a contagem do biofilme.
Após a exposição das células aderidas aos
tratamentos, os cupons foram lavados três vezes em
solução de água peptonada e as células foram retiradas
utilizando swab previamente esterilizados. Os swabs
foram transferidos para 10 mL de água peptonada e
agitados por 2 minutos em vórtex. Posteriormente,
foram realizadas as diluições necessárias, as quais foram
inoculadas em TSA utilizando a técnica de microgota (10
µL) com incubação a 37°C por 18 horas. Os resultados
foram obtidos em Log UFC/cm2 com limite de detecção
de 2,84 Log UFC/cm2.
Análise estatística
Foram realizadas três repetições e a variável
resposta foi o Log de redução obtido após tratamento
do biofilme com as soluções controle e antibacterianas.
Foi utilizado Delineamento Inteiramente Casualizado
(DIC) em esquema fatorial 6 x 2 (tratamentos controle e
antibacterianos x tempos de contato). Foi realizada análise
de variância (ANOVA) e, após detectar a existência de
diferença estatística significativa entre os tratamentos, as
médias foram comparadas pelo teste de Tukey. O nível de
significância adotado foi de 5%.
21
BATISTA, N.N. CAMARGOS, N.G. OLIVEIRA, M.M.M. PICCOLI, R.H.; Alim Nutr. = Braz J Food Nutr., 2014 Jan-Mar; 25(1): 19-24.
Resultados
Todos os óleos essenciais apresentaram atividade
bacteriostática, sendo os óleos essenciais de Z. officinale,E.
caryophyllus e E. cardamomum os que apresentaram maior
efeito inibitório sobre P. aeruginosa (Tabela 2).
O tempo de morte de P. aeruginosa em contato
com soluções à base de óleo essencial foi menor quando
utilizados os óleos essenciais de E. cardamomum e E.
caryophyllus, os quais apresentaram atividade bactericida
em 10 minutos. Os óleos essenciais de C. reticulata v.
tangerine e C. limon apresentaram efeito bactericida em
30 minutos e Z. officinale apresentou apenas redução das
células viáveis (Tabela 3).
Na Tabela 4 pode-se notar que houve diferença
estatística apenas entre os tratamentos empregados aos
cupons de aço inoxidável, apontando que o efeito das
soluções foi independente do tempo de contato, bem como
não foi verificada interação entre os fatores estudados.
O biofilme de P. aeruginosa apresentou resistência
ao tratamento A de E. cardamomum e ao controle A
(p<0,05). Para o controle B e demais tratamentos o óleo
essencial apresentou atividade bactericida (Tabela 5). Os
melhores tratamentos foram os constituídos de detergente
alcalino e óleo essencial de Eugenia caryophyllus (p<0,05).
Tabela 2. Concentrações mínimas inibitórias (CMIs) dos
óleos essenciais.
Óleos essenciais
CMIs (% v/v)
Z. officinale
0,25
C. reticulata v. tangerine
1,00
C. limon
0,50
E. caryophyllus
0,25
E. cardamomum
0,25
Tabela 3. Sensibilidade de P. aeruginosa aos óleos
essenciais em Log UFC/mL.
Tempo de contato (minutos)#
Tratamento
10
20
30
Controle
7,86
8,26
7,63
Z. officinale
6,55
6,14
4,61
C. reticulata v. tangerine
6,38
5,56
<3,00
C. limon
#
4,05
3,45
<3,00
E. caryophyllus
< 3,00
< 3,00
< 3,00
E. cardamomum
< 3,00
< 3,00
< 3,00
média de três replicatas
Discussão
Óleos essenciais são reconhecidos na literatura
científica por sua propriedade antimicrobiana, sendo
utilizados no controle de microrganismos patogênicos e
deteriorantes (4). Todos os óleos essenciais empregados
apresentaram, ao menos, efeito bacteriostático contra o
microrganismo alvo. No entanto, as células do biofilme
de P. aeruginosa apresentaram-se mais resistentes aos
óleos essenciais do que as células planctônicas (Tabelas
3 e 5). Sabe-se que vários fatores são responsáveis pela
maior resistência a antimicrobianos químicos de células
em biofilme, tais como: difusão limitada de agentes
antimicrobianos por meio da matriz extracelular (EPS)
do biofilme, interações de agentes antimicrobianos com a
matriz, resistência mediada por enzimas, níveis de atividade
metabólica dentro do biofilme, adaptação genética e outras
estruturas da membrana (5). O presente estudo destaca
que esta diferente capacidade de resistência entre células
planctônicas e sésseis também pode ocorrer quando
utilizados óleos essenciais, compostos antimicrobianos
naturais.
Nas indústrias de alimentos, contaminações durante
o processamento podem ocorrer devido ao desprendimento
de células de biofilmes formados nos equipamentos e
tubulações, acarretando em risco a saúde do consumidor e/
ou prejuízos para a indústria. Após 96 horas de formação
do biofilme de P. aeruginosa, a concentração de células
aderidas aos cupons de ácido inoxidável foi de 5,40 Log
UFC/cm2 (Tabela 5). Concentrações acima de 3 Log UFC/
cm2 já podem ser consideradas biofilmes maduros (25,20),
22
Tabela 4. Tabela Resumo da análise de variância (ANOVA).
Fonte de variação
gl
SQ
QM
F
p
Tratamento
5
150,402
30,080
1580,410
<0,001
Tempo de contado
1
0,001
0,001
0,037
0,848
Tratamento X Tempo de
contato
5
0,011
0,002
0,116
0,988
Erro
24
0,457
0,019
Tabela 5. Log de redução (média±desvio-padrão) do
biofilme de P. aeruginosa submetido a tratamentos com
diferentes soluções.
Solução
Tempo de contato (minutos)
Total
15
30
Controle A
1,03±0,27
0,95±0,00
0,99±0,17 a
Tratamento A de
E. cardamomum
1,12±0,34
1,15±0,20
1,13±0,24 a
Controle B
5,40±0,00
5,40±0,00
5,40±0,00 b
Tratamento A de
E. caryophyllus
5,40±0,00
5,40±0,00
5,40±0,00 b
Tratamento B de
E. caryophyllus
5,40±0,00
5,40±0,00
5,40±0,00 b
letras iguais indicam similaridade estatística pelo teste de Tukey para α=5%.
a,b
O biofilme apresentou 5,4 Log UFC/cm2.
BATISTA, N.N. CAMARGOS, N.G. OLIVEIRA, M.M.M. PICCOLI, R.H.; Alim Nutr. = Braz J Food Nutr., 2014 Jan-Mar; 25(1): 19-24.
o que mostra que a cepa bacteriana utilizada é capaz de
formar biofilmes se práticas corretas de higiene não forem
realizadas.
O controle de biofilmes bacterianos deve ser realizado
utilizando práticas rigorosas de limpeza e sanitização. Neste
estudo, realizado tendo como alvo a bactéria P. aeruginosa,
o detergente alcalino apresentou atividade bactericida sobre
as células sésseis, com Log de redução de 5,4 (Tabela 5).
Por suas características de ação, o mesmo pode ter atuado
em proteínas e lipídeos do envoltório celular bacteriano
(13). Contudo, destaca-se o resultado obtido quando
utilizado o óleo essencial de E. caryophyllus, que foi capaz
de eliminar as células viáveis enumeráveis por contagem
em placas do biofilme de P. aeruginosa. Verificou-se
também que o mesmo apresentou maior efeito do que o
óleo essencial de E. cardamomum (Tabela 5), o que pode
ter ocorrido devido ao elevado potencial antimicrobiano do
seu componente majoritário, o eugenol, composto fenólico
que tem demonstrado atividade bactericida contra diversos
microrganismos, devido à inibição da respiração e divisão
celular (4, 9, 10, 12, 17, 22).
biofilms formed by two Pseudomonas species on stainless
steel surface. Ciênc Tecnol Aliment. 2012;32(1):142-50
Conclusão
11. Jay JM. Modern food microbiology. 5th ed. New York:
Chapman & Hall; 1996. p. 661.
Os óleos essenciais de C. reticulata v. tangerine,
Z. officinale, C. limon, E. caryophyllus e E. cardamomum
apresentaram atividade antibacteriana contra as células
planctônicas de P. aeruginosa, com destaque aos óleos
essenciais de E. caryophyllus e E. cardamomum. A
utilização de soluções contendo detergente alcalino e/ou
óleo essencial de E. caryophyllus a temperatura ambiente
foi suficiente para eliminar as células bacterianas viáveis
do biofilme de P. aeruginosa, sendo o óleo essencial uma
nova alternativa natural para o controle do biofilme de P.
aeruginosa na indústria de alimentos.
Referências
1. Andrade NJ, Pinto CL O, Rosado MS. Controle da
higienização na indústria de alimentos. In: Andrade NJ,
editors. Higiene na Indústria de Alimentos: avaliação e
controle da adesão e formação de biofilmes bacterianos.
São Paulo: Varela; 2008. p. 181-226.
2. Andrade NJ, Pinto CLO, Rosado MS. Adesão e formação
de biofilmes microbianos. In: Andrade NJ, editors. Higiene
na Indústria de Alimentos: avaliação e controle da adesão
e formação de biofilmes bacterianos. São Paulo: Varela,
2008. p. 15-65.
6. Cox SD, Mann CM, Markham JL, Bell HC, Gustafson
JE, Warmington JR, Wyllie SG. The mode of antimicrobial
action of the essential oils of Melaleuca alternifolia (tea
tree oil). J Appl Microbiol. 2000;88(1):170-5.
7. Eneroth A, Ahrné S, Molin G. Contamination of milk
with Gram negative spoilage bacteria during filling of retail
containers. Int J Food Microbiol. 2000; 57(1):99-106.
8. Eneroth A, Ahrné S, Molin G. Contamination routes
of Gram-negative spoilage bacteria in the production
of pasteurized milk, evaluated by randomly amplified
polymorphic DNA (RAPD). Int Dairy J. 2000;10(5):325-31.
9. Escobar RG. Eugenol: propiedades farmacológicas
y toxicológicas. Ventajas y desventajas de su uso. Rev
Cubana Estomatol. 2002;39(2):139-56.
10. Greay SJ, Hammer KA. Recent developments in
the bioactivity of mono- and diterpenes: anticancer and
antimicrobial activity. Phytochem Rev. 2011;14:1-6. doi:
10.1007/s11101-011-9212-6.
12. Knobloch K, Weigand H, Weis N, Schwarm HM,
Vigenschow H. Action of terpenoids on energy metabolism.
In: Brunke EJ, editors. Progress in Essential Oil Research:
Proceedings of the 16th International Symposium on
Essential Oils; 1985 Sept 18-21; Holzminden/Neuhaus,
Germany. Berlin: De Gruyter; 1986. p. 429-45.
13. Knobloch K, Paulia A, Iberla B, Weiganda H, Weisa
N. Antibacterial and antifungal properties of essential oil
components. J Essent Oil Res. 1989;1(3):119-28.
14. Mattos JKA. Plantas medicinais: aspectos orgânicos.
Brasília: Edição do Autor; 1996. p. 51.
15. Nikolaev YA, Plakunov VK. Biofilm: “City of
Microbes” or an analogue of multicelular organisms?.
Microbiology. 2007;76(2):125-38.
16. Oussalah M, Cailleta S, Saucier L, Lacroix M.
Inhibitory effects of selected plant essential oils on the
growth of four pathogenic bacteria: E. coli O157:H7,
Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus and
Listeria monocytogenes. Food Control. 2007;18(5):414-20.
3. Black JG. Microbiologia fundamentos e perspectivas. 4th
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2002. p. 316-45.
17. Oyedemi SO, Okoh AI, Mabinya LV, Pirochenva G,
Afolayan AJ. The proposed mechanism of bactericidal
action of eugenol, α-terpineol and -terpinene against Listeria
monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Proteus vulgaris
and Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2009;8(7):1280-6.
4. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties
and potential applications in foods. Int J Food Microbiol.
2004;94:223-53.
18. Patel TR, Bartlett FM, Hamid J. Extracellular heatresistant proteases of psychrotrophic pseudomonads. J
Food Prot. 1983;46(2):90-4.
5. Caixeta DS, Scarpa TH, Brugnera DF, Freire DO, Alves
E, Abreu LRD, Piccoli RH. Chemical sanitizers to control
19. Pirnay JP, Matthijs S, Colak H, Chablain P, Bilocq F,
Van Eldere J, Cornelis P. Global Pseudomonas aeruginosa
23
BATISTA, N.N. CAMARGOS, N.G. OLIVEIRA, M.M.M. PICCOLI, R.H.; Alim Nutr. = Braz J Food Nutr., 2014 Jan-Mar; 25(1): 19-24.
biodiversity as reflected in a Belgian river. Environ
Microbiol. 2005;7(7):969-80.
20. Ronner AB, Wong ACL. Biofilm development and
sanitizer inactivation of Listeria monocytogenes and
Salmonella typhimurium on stainless steel and buna-n
rubber. J Food Prot. 1993;56(9):750-8.
21. Shah NP. Psychrotrophs in milk: A review.
Milchwissenschaft. 1994;49(3):432-7.
22. Sikkema J, Bont JAM, Poolman B. Interactions of
cyclic hydrocarbons with biological membranes. J Biol
Chem. 1994;269(11):8022-8.
23. Silva EA. Manual de controle higiênico-sanitário em
alimentos. 4th ed. São Paulo: Varela; 1995. p.475.
24. Sutherland IW. The biofilm matrix: an immobilized
but dynamic microbial environment. Trends Microbiol.
2001;9(5):222-7.
25. Wirtanen G, Husmark U, Mattila-sandholm T.
Microbial evaluation of the biotransferpotencial from
surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaning
procedures in closed food-processing systems. J Food Prot.
1996;59(7):727-33.
24