1. INTRODUCÃO 1.1 INFECÇÕES DO TRATO URINARIO (ITU) A

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1. INTRODUCÃO
1.1 INFECÇÕES DO TRATO URINARIO (ITU)
A infecção do trato urinário (ITU) consiste na colonização microbiana da urina com a
invasão tecidual de qualquer estrutura do aparelho urinário que geralmente está associada à
bacteriúria e à piúria. (POLETTO & REIS, 2005). O termo “bacteriúria” se define como a
presença de bactérias na urina, em quantidade maior ou igual a 105 unidades formadoras de
colônias por mL (UFC/mL); e a “piuria” é definida como a presença de células brancas da
defesa imunitária na urina. A presença destes dois parâmetros laboratoriais na análise de urina
de um paciente com uma historia clínica de disúria, polaciúria, urgência miccional, dor
abdominal e/ou lombar associada ou não à resposta inflamatória sistémica, deve indicar a
possibilidade de ITU. Temos também o conceito de “bacteriúria assintomática”, que é a
presença de bactérias na urina com contagem maior ou igual a 105 UFC/mL (cultura positiva)
em pacientes sem sintomas associados à ITU, sendo este padrão clinico característico de
algumas doenças, grupos etários e de certas condições fisiológicas, como a gravidez
(ALVAREZ, 2007; CHUNG et al., 2010)
1.1.1 Epidemiologia
A infecção do trato urinário é a terceira infecção mais comum nos humanos ficando
atrás somente das infecções respiratórias e gastrointestinais (NAJAR et al., 2009). No mundo,
são descritos aproximadamente 150 milhões de casos por ano, com uma maior incidência em
mulheres jovens e sexualmente ativas. Nos Estados Unidos as ITU são a causa de cerca de 8
milhões de consultas médicas por ano, dando como resultado um gasto de mais de 6 milhões
de dólares anuais em atenção médica (STAMM & NORRBY, 2001; FOSTER, 2008). Esta
incidência permite entender o enorme impacto que tem este grupo de infecções bacterianas
em termos de morbidade e de custo econômico (WEICHHART et al., 2008). No Brasil, um
total de 80% das consultas clínicas está relacionada com infecção do trato urinário, com maior
numero de casos de cistites nas mulheres (POLETTO & REIS, 2005).
As ITU ocorrem em todas as faixas etárias, da neonatologia à geriatria. Na infância,
cerca de 5% das crianças de dois meses a dois anos de idade que apresentam febre sem causa
conhecida podem apresentar infecção urinária. As ITU são mais frequentes em crianças com
idade de zero até seis meses no sexo masculino e acima de seis meses no sexo feminino
1
(BIASSONI & CHIPPINGTON, 2008; GUIDONI et al., 2008). É importante indicar que uma
das complicações das ITU na faixa neonatal é a meningite, que ocorre em aproximadamente
10% dos pacientes bacteriémicos (BONACORSI et al., 2006). Estima-se que pelo menos um
8% das meninas e 2% dos meninos desenvolvem ao menos um episódio de infecção urinária
durante a infância, fato de grande importância clínica, já que pode produzir “cicatrizes” nos
rins, o que pode levar ao longo do tempo a uma insuficiência renal crônica com hipertensão
(MOHKAM et al., 2008; FARSHAD et al, 2011). Em geral, a incidência da ITU na infância
varia de acordo a idade e o sexo, tendo uma incidência acumulativa de 1,8% em meninos e
6,6% em meninas até os cinco anos, ressaltando que, durante os primeiros meses de vida, a
incidência em meninos e meninas é igual a 4,2%, diminuindo até 0,8% nos meninos e
permanecendo nessa faixa durante os anos seguintes. As ITU voltam a se apresentar na
adolescência, com o início da atividade sexual, com maior incidência nas mulheres (SOLIS,
2000).Na idade adulta, portanto, as ITU são importantes por sua alta prevalência na mulher
sexualmente ativa, que tem 50 vezes mais chance de adquirir a doença do que os homens
(JARBAS, 2010). Aproximadamente 50-70% das mulheres apresentam pelo menos um
episodio de ITU em suas vidas, sendo que 25 a 30% delas apresentam episódios recorrentes
não relacionados com nenhuma anomalia funcional ou anatômica do trato urinário
(HOOTON, 2000; WEICHHART et al, 2008) e 5% desenvolvem uma infecção crônica,
recorrente (ZHANG & FOXMAN, 2003).
Durante o período gestacional, aproximadamente 2-7% das mulheres apresentam ITU
em alguma etapa da gravidez ou ITU recorrentes durante todo o período gestacional. Além
disso, até 17-20% das mulheres grávidas apresentam bacteriúria assintomática que, se não
tratada, pode resultar em infecção urinaria acometendo as vias superiores. Este quadro ocorre
com maior frequência no segundo trimestre da gravidez, sendo o mais frequente a pielonefrite
aguda, aumentando a morbidade na gestante e o risco de parto prematuro com ruptura
prematura das membranas (MAC LEAN, 2001; VALLEJOS et al., 2010).
Os pacientes com doenças metabólicas como diabetes mellitus apresentam uma alta
prevalência e incidência de bacteriúria assintomática e infecção de trato urinário, com
predomínio no sexo feminino. Isto faz com que estes pacientes tenham um foco para
infecções sistêmicas, com aumento da morbidade e mortalidade (GEERLINGS et al., 2008;
LUDWIG E, 2008).
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Considerando-se as infecções hospitalares em Unidades de Tratamento Intensivo, as
ITU correspondem a 20 a 50% do total e estão associadas à presença de cateteres urinários.
Neste contexto as ITUs hospitalares,
em alguns hospitais,
são mais frequentes que a
pneumonia nosocomial e a bacteremia associada aos dispositivos intravasculares (LOPES &
CORTES, 2012)
Em geral, na população idosa, a ITU é a segunda maior causa de infecção e constitui
cerca de 25% de todas as infecções identificadas nesta idade. Da mesma forma, a bacteriúria
assintomática afeta cerca de 50% das mulheres idosas e 30% dos homens nesta faixa etária
(FOXMAN, 2002). Na população de idade avançada, as ITU são consideradas, por vezes,
como ITU complicadas, em um trato urinário que já não tem um funcionamento fisiológico
normal. Nas mulheres idosas, as cirurgias prévias do trato urinário e as anomalias tais como a
cistocele têm sido associadas à infecção urinária. Nos homens idosos, a hipertrofia prostática
é um importante fator de risco para a infecção urinária. Em ambos os sexos, fatores
neurológicos como a bexiga neurogênica contribuem para a infecção urinária (NICOLLE,
2001; MAGLIANO et al, 2012).
1.1.2 Patogênese
A interação entre a bactéria infectante e as características do epitélio do trato urinário
são a base da patogênese das ITU. Diversos fatores relacionados às bactérias são
predisponentes para o desenvolvimento e recorrência das ITU, incluindo a colonização
bacteriana periuretral e a virulência dos agentes patogênicos. Fatores de risco relacionados ao
comportamento do hospedeiro incluem disfunção de esvaziamento vesical, frequência de
relações sexuais, uso de anticoncepcional oral e uso de espermicidas (HOOTON et al, 1999).
Há também a possibilidade de uma predisposição genética por aumento da quantidade de
receptores para o agente etiológico, especialmente para Escherichia coli, na vagina e nas
células do epitélio bucal (SCHAEFFER et al, 1981). A colonização do introito vaginal por
agentes patogênicos é o passo inicial na patogênese da ITU. Estes agentes etiológicos
originam-se da flora fecal e entram na bexiga pela uretra, passando por uma fase de
colonização periuretral e da uretra distal (HOOTON, 2001). Ressalta-se que o tamanho curto
da uretra feminina é um fator importante para o maior número de casos de ITU nas mulheres
(CHUNG et al, 2010). Ademais, o próprio ato sexual favorece o ingresso das bactérias no
introito vaginal, pelo relaxamento da uretra durante a cópula (WURGAFT, 2010).
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1.1.2.1 Fatores do hospedeiro:
A obstrução ao fluxo urinário é um fator chave para o aumento da susceptibilidade à
ITU. A estase urinária resultante compromete os mecanismos de defesa renais e contribui para
o aumento da concentração de bactérias na urina, facilitando a aderência destas às células
uroepiteliais (SCHAEFFER, 2001).
A maior incidência é no gênero feminino, especialmente em mulheres jovens, nas
quais, além das causas anatômicas, temos outros fatores que aumentam o risco como: relações
sexuais mais frequentes, promiscuidade sexual, uso de diafragmas com espermicidas, uso de
antibióticos que alteram a flora vaginal e historia de ITU na infância. Nas mulheres pósmenopáusicas os fatores fisiológicos e mecânicos que afetam o esvaziamento da bexiga
também são fatores de risco, incluindo incontinência urinária, cistocele com volume residual
de urina na bexiga, vaginite atrófica, má higiene perineal e história de ITUs recorrentes antes
da menopausa. Outros fatores são: gravidez, urolitíase, refluxo vésico-ureteral, transplante
renal, imunossupressão, manipulação da via urinária, malformações congênitas e doenças
metabólicas como diabetes mellitus. Um aspecto muito importante relacionado a ITU reside
na genética, relacionada à secreção dos antígenos do grupo sanguíneo ABO, que é um fator
hereditário autossômico dominante. As mulheres “secretoras” do grupo sanguíneo ABO são
mais resistentes à infecção por uropatógenos. Estudos demostram que as mulheres “não
secretoras” são mais susceptíveis às ITUs recorrentes. Nas mulheres “não secretoras” do
grupo sanguíneo ABO, o epitélio vaginal expressa dois receptores glico-esfingolipídeos que
têm afinidade para os uropatógenos, facilitando deste jeito a colonização do trato urinário
pelas bactérias patogênicas (SCHAEFFER, 2001; FOXMAN 2002; VALDEVENITO, 2008;
CHUNG et al, 2010).
No gênero masculino, a ITU não é uma doença comum, devido à presença de alguns
fatores protetores, incluindo a distancia entre o ânus e o meato urinário e, o meio seco em
torno da uretra masculina. O maior comprimento da uretra (12 até 15 cm) e a atividade
antibacteriana do fluido prostático também contribuem para que o sexo masculino tenha uma
menor frequência de ITU. Algumas condições de risco aumentam a chance de homens
adquirirem
ITU, estes
fatores
são:
relações
sexuais
com
mulheres
com
ITU,
homossexualidade e falta de circuncisão. Entretanto, nenhum destes fatores parece aumentar o
risco de ITU em jovens saudáveis (BACHELLER & BERNSTEIN, 1997; HOOTON, 2000;
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WURGAFT, 2010). Na Tabela 1.1 temos os fatores de risco para o desenvolvimento das
ITU.
Tabela 1.1 Fatores de risco para o desenvolvimento de ITU
Alterações no fluxo de urina
Corpos estranhos
Sonda urinária
Tubo de nefrostomia
Stent ureteral / uretral
Instrumentação e manipulação da via urinária
Obstrutivas
Hipertrofia prostática
Câncer de próstata, tumores compressivos
Estenoses uretrais
Litíases vesical, pielocalicial e ureteral
Divertículos
Cistos renais
Funcionais
Gravidez
Disfunção vesical: bexiga neurogênica, incontinência
Refluxo vésico-ureteral
Estruturais
Malformações: estenoses uretral, ureter ectópico
Pós-operatório das vias urinárias: derivações, fistulas
Obstruções iatrogênicas
Fatores agravantes
Diabetes mellitus
Idade avançada
Insuficiência renal crônica
Espongiose medular renal
História de >2 ITU em menos de um ano
Pré-menopáusica sem tratamento
Imunossupressão: HIV, neoplasias, medicamentos, transplantes Idiopática.
Genética: condição secretora dos antígenos ABO.
Tratamento antibiótico recente
Fatores sociais/condutivos
Alta atividade sexual (mulheres)
Uso de diafragmas com espermicidas, tampões vaginais.
Sexo anal em associação ao vaginal no mesmo ato
Promiscuidade com pessoas infectadas e sem proteção
Homossexualidade
Falta de circuncisão
Fuente: Modificado de ECHEVARRÍA et al, 2006; NICOLLE, 2001
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O hospedeiro também apresenta mecanismos de defesa na presença de patógenos
urinários. O trato urinário é normalmente um meio estéril, com exceção do segmento distal
da uretra. É mantido livre de microorganismos pelo fluxo da urina, que é um dos mais
importantes mecanismos de defesa contra a proliferação das bactérias que invadem a bexiga,
pois estas são eliminadas pela micção. Ademais, a urina normal possui propriedades
antibacterianas tais como a alta osmolaridade, a elevada concentração de uréia e de ácidos
orgânicos, e o pH ácido. A urina tem também inibidores da aderência bacteriana, entre os
quais destacam-se a proteína de Tamm-Horsfall, que é uma glicoproteína uromucoide
produzida pelas células tubulares da alça de Henle ascendente, e secretada na urina em altas
concentrações (> 30 g/mL). Esta proteína inibe a aderência bacteriana por ser capaz de se
ligar à fímbria tipo 1 impedindo-a interação com os receptores de uroplaquina. O epitélio
urinário produz também peptídeos com ação antimicrobiana, como as defensinas, a
catelicidina e as lactoferrinas, que competem com os sideróforos do microrganismo pelo
ferro, que é um nutriente essencial para o desenvolvimento das bactérias uropatogênicas. A
presença da imunoglobulina do tipo IgA nos fluidos vaginais é também um fator protetor, já
que esta imunoglobulina se liga às fímbrias tipo1, inibendo a aderência da bactéria ao tecido
uroepitelial. Outro mecanismo de defesa na mulher reside na flora vaginal, constituída por
Lactobacilus, que forma uma barreira que impede a colonização dos microorganismos
uropatogênicos (SOBEL 1997; PAK et al, 2001; SCHAEFFER, 2001; CHUNG et al, 2010;
CRUZ et al, 2010).
1.1.2.2 Fatores bacterianos

Rotas de entrada das bactérias uropatogênicas:
Rota ascendente. É a principal via responsável pela invasão do trato urinário, ocorrendo
em mais do 95% dos casos. A maioria das bactérias que entra no trato urinário pertence à
microbiota fecal que coloniza a uretra. Os microorganismos ascendem até a bexiga, podendo
atingir os ureteres e ascender até aos rins. Como já mencionado, o comprimento da uretra
feminina é de 5 cm e a uretra masculina é de 12–15 cm, isto faz as mulheres mais suscetíveis
à ITU. Nesta migração, as bactérias podem invadir o epitélio urinário causando resposta
inflamatória em qualquer nível, o que resulta em diferentes tipos de ITU, de acordo com o
sítio de localização anatômica. Esta infecção ascendente do trato urinário é um processo
complexo, associado à adesão e outras propriedades de virulência da bactéria, à estrutura
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anatômica, à resposta humoral e aos fatores genéticos do hospedeiro (BACHELLER &
BERNSTEIN, 1997; CHUNG et al, 2010).
Rota hemática ou descendente. Trata-se de uma via menos frequente de invasão
bacteriana do trato urinário, ocorrendo em 5% dos casos. Está mais relacionada às infecções
causadas por Staphylococcus aureus, Candida spp., Salmonella spp. e Mycobacterium
tuberculosis, que causam infecções primárias em outras partes do corpo, podendo resultar em
abscessos focais renais. Candida albicans pode causar ITU também pela rota ascendente
(BACHELLER, & BERNSTEIN, 1997; GRABE et al, 2008).
Rota linfática. Atualmente não apresenta tanta importância, sendo mais aceitável uma via
linfoemática, na qual as bactérias podem ser transportadas pelos vasos linfáticos regionais a
partir do foco séptico para o conduto torácico, podendo alcançar os rins pela corrente
sanguínea (GRABE et al, 2008).

Mecanismo de ação dos uropatógenos
A interação entre as cepas infectantes e as células do epitélio urinário é facilitada pelos
fatores de aderência denominados pili ou fímbrias, das quais existem dois tipos, o pili tipo I
(manose sensível) e o pili P (manose resistente). Modelos in vitro demostram a interação de
uma adesina situada na extremidade do pili tipo I (denominada Fim H) com receptores da
superfície luminal do epitélio vesical conhecidos como uroplaquina. O pili P se apresenta na
maioria das cepas bacterianas patogênicas que produzem pielonefrite aguda e reconhece
receptores glicolipídicos renais. Os patógenos urinários como Escherichia coli, durante a
invasão do tecido, ativam vários fenômenos que ajudam a bactéria a adentrar à célula
epitelial. Uma vez dentro da célula hospedeira, as bactérias multiplicam-se rapidamente
formando grupos bacterianos chamados “comunidades bacterianas intracelulares” (CBI) que
avançam por várias etapas de desenvolvimento e terminam formando os biofilmes
bacterianos, que são grupos de bactérias unidas a superfície do epitélio urinário ou entre si.
No biofilme, as bactérias desenvolvem um comportamento comunitário que permite a evasão
da resposta imune do hospedeiro e da ação dos antibióticos. Assim, as bactérias podem
permanecer meses no tato urinário caracterizando os casos de infecções crônicas ou
recorrentes. E. coli também pode formar biofilmes em meios inertes como são as sondas
urinárias. Em alguns casos, as bactérias se soltam dos biofilmes e atravessam a membrana
celular podendo se ligar novamente ao epitélio urinário e iniciar uma nova formação de CBI.
Durante o processo de patogênese, as bactérias expressam outros mecanismos de virulência
7
como os sideróforos, que são sistemas de captação de ferro, as toxinas como a alfa-hemolisina
e o fator necrotizante tipo I (CNF-1). Estes fatores ajudam os patógenos urinários a ter êxito
na invasão do tecido, provocando uma resposta inflamatória urinária, causando ITU ou
bacteriúria assintomática (ISLAND et al, 1998; VALDEVENITO, 2008; WEICHHART et al,
2008; TIBA et al, 2009, CHIBEU et al, 2012). Gráfico 1.1
Figura 1.1 Mecanismos de invasão das bactérias uropatogênicas, Weichhart et al. 2008.
1.1.3 Classificação das Infecções do Trato Urinário
A infecção urinária é classificada tradicionalmente de acordo o sítio de infecção e
nível de gravidade. De acordo com o sítio de infecção se classifica em infecção do trato
urinário inferior, envolvendo bexiga (cistite), uretra (uretrite) ou próstata (prostatite) e
infecções do trato urinário superior, acometendo os ureteres ou o parênquima renal, causando
pielonefrite. De acordo com o grau de severidade, podem ser divididas em ITUs complicadas
ou não complicadas.
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A ITU não complicada ocorre em pacientes saudáveis cujo trato urinário apresenta
estrutura e função normais. A maioria destes pacientes são mulheres e os patógenos
geralmente são susceptíveis aos antimicrobianos e erradicados por uma terapia de baixo custo.
Este tipo de infecção urinária pode ser encontrada nas seguintes situações:
mulher não
gravida, ausência de alterações anatômicas do trato urinário, ausência de alterações funcionais
do trato urinário, ausência de cateteres urinários, ausência de alterações na imunidade. Em
geral são infecções adquiridas na comunidade (SCHAEFFER, 2001; VIEIRA, 2003; CHANG
& SHORTLIFFE, 2006)
A ITU complicada está associada a anormalidades anatômicas, funcionais ou
metabólicas do trato urinário que dificultam as defesas naturais. Estas anormalidades podem
ser intrínsecas, dentre elas a hiperplasia prostática benigna (anormalidade intrínseca
obstrutiva), as anormalidades congênitas como bexiga neurogênica e fistulas, ou extrínsecas,
associadas ao uso de cateteres ou corpos estranhos. As infecções associadas à obstrução por
litíase renal são resolvidas apos a correção da anormalidade (remoção do cálculo). Uma
característica da ITU complicada é a grande variedade de organismos causadores, que são
multirresistentes geralmente de origem hospitalar (NICOLLE, 2001, SCHAEFFER, 2001;
VIEIRA, 2003; CHANG & SHORTLIFFE, 2006; TABIBIAN et al, 2008 ).
As infecções do trato urinário podem ser também classificadas em mais duas
categorias. ITUs recorrentes, que são reinfecções (bactérias diferentes, de fora do trato
urinário; sendo cada infecçãoum novo evento) definidas como três episódios nos últimos doze
meses ou dois episódios nos últimos seis meses e, ITUs redicivantes, resultantes da
persistência do mesmo agente etiológico no trato urinário, que volta a aparecer antes de duas
semanas do término do tratamento com antibióticos, o que sugere falha do tratamento (ROLO
et al, 2006). As ITUs recorrentes ou redicivantes ocorrem em aproximadamente 10 a 40% das
mulheres, sendo relacionadas à inadequada duração do tratamento, e a doses e/ou
antimicrobianos inadequados (VIEIRA, 2003; VALDEVENITO, 2008; WURGAFT 2010).
1.1.4 Etiologia e Diagnóstico da ITU
As infecções clinicamente mais importantes são produzidas por bactérias, entretanto
fungos, vírus e parasitos também podem causar ITU. Infecções urinárias não associadas às
bactérias incluem a cistite hemorrágica causada pelos adenovírus e a infecção por Candida
nos pacientes com deficiência do sistema imunitário (ZORC, 2005).
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Os patógenos bacterianos mais comumente causadores das ITUs pertencem à família
das Enterobacteriaceae. Os membros dessa família incluem Escherichia coli, Klebsiella spp,
Proteus spp, Enterobacter spp, Serratia spp, Proteus mirabilis e Gram-negativos como a
Pseudomonas aeruginosa. Entre os agentes causadores da ITU temos também as bactérias
Gram-positivas como Enterococcus spp, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus
aureus e Streptococcus do grupo B. De todos estes, estima-se que a Escherichia coli–extra
intestinal (UPEC) é responsável por 85% a 90% dos casos de ITU comunitários e por 50%
dos casos de ITU hospitalares (ZORC 2005, LINDSAY 2001-2006, ECHEVARRÍA 2006).
Nas Tabelas 1.2 e 1.3 temos os agentes causadores das infecções urinárias comunitárias e
hospitalares.
Para o diagnóstico da ITU, consideram-se os seguintes parâmetros: presença de fatores
de risco, história clínica, exame físico e testes laboratoriais onde a análise da urina e a
urocultura são considerados o “padrão ouro” para o diagnóstico (ZORC 2005; FOSTER,
2008; WURGAFT 2010).
Tabela 1.2 Percentual de agentes causadores das ITU complicadas
Espécie bacteriana
Gram Negativos
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter species
Citrobacter species
Proteus mirabilis
Providencia species
Pseudomonas aeruginosa
Outros
Gram Positivos
Enterococcus sp
Streptococos do grupo B
Staphylococos coagulase negativo
Staphylococcus aureus
Fungos
Candida species
Fonte: Nicolle, 2001
10
Percentual
21-50
1,9-17
1,9-9,6
4,7-6,1
0,9-9,6
18
2-19
6,1-20
6,1-23
1,2-3,5
1,4-3,7
0,9-2,0
0-5,0
Tabela 1.3 Percentual de agentes Gram-negativos causadores da ITU não
complicada
Especie bacteriana
Percentual
Escherichia coli
91,80
Klebsiella sp
3,0
Enterobacter sp
0,90
Proteus mirabilis
2
Citrobacter sp
0,70
Pseudomona aeroginosa
0,30
Outros
0,50
Fonte: Nicolle et al., 2006.
1.2 Escherichia coli
Escherichia coli pertence ao reino Bacteria, filo Proteobacteria, classe Proteobacteria,
subclasse Gammaproteobacteria, ordem Enterobacteriales, família Enterobacteriaceae. É um
bacilo Gram-negativo, anaeróbio facultativo, não esporulado, com 0,5 µm de diâmetro e 1-3
µm de largura, apresenta flagelos peritríquios, sendo comumente móvel em líquidos. As
amostras desta espécie são indol-positivas, não utilizam citrato como fonte de carbono, não
apresentam a enzima urease, possuem a enzima lisina descarboxilase, podem ou não possuir
arginina e/ou ornitina descarboxilase, são fermentadoras de glicose e outros açucares,
produzem gás, são catalase positivas, oxidase negativas e reduzem nitrato a nitrito. No meio
eosina-azul de metileno (EMB), as colônias de E. coli apresentam-se com coloração negroesverdeadas com brilho metálico (KONEMAN et al., 2008).
E. coli é um habitante do trato gastrointestinal nos seres humanos e animais. Forma
uma relação simbiótica muito benéfica para o hospedeiro e tem um papel muito importante,
mantendo a estabilidade homeostática da flora bacteriana no lúmen intestinal normal. Como
uma bactéria comensal, E. coli permanece sem causar dano ao lúmen intestinal e somente em
casos especiais pode causar alguma enfermidade. Sem dúvida, em hospedeiros com déficit
imunológico ou quando as barreiras gastrointestinais são danificadas, as cepas comensais de
E. coli não patogênicas podem se tornar patogênicas e causar infeções (BIEN et al, 2012).
Embora 90% das cepas de E. coli sejam comensais e não patogênicas, 10% podem
adquirir características de patogenicidade que as tornam capazes de causar uma variedade de
doenças em humanos e animais. A patogenicidade pode se dar pela aquisição de genes que
codificam fatores de virulência que propiciam a colonização e a ocorrência de diversos
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eventos que alteram a fisiologia hospedeira, ocasionando o aparecimento de sinais e sintomas
que irão, finalmente, definir a doença. A aquisição destes genes de virulência é feita através
da transferência horizontal por três mecanismos conhecidos: conjugação, transformação e
transdução (SANTOS et al, 2009; MIDOLLI, 2009).
1.2.1 Classificação de Escherichia coli.
E. coli é uma espécie extremamente diversa de bactérias capazes de colonizar a
persistir em vários nichos, tanto no ambiente, quanto em hospedeiros animais e humanos.
Baseando-se nos critérios genéticos e clínicos, as cepas de E. coli podem ser classificadas em
três grupos principais: cepas comensais, cepas patogênicas intestinais ou diarreiogênicas e
cepas patogênicas extra-intestinais denominadas ExPEC “extraintestinal pathogenic E. coli”
(RUSSO & JOHNSON, 2000; BEKAL et al, 2003; PITOUT, 2012)
As cepas comensais são parte da flora fecal nos humanos saudáveis, outros mamíferos
e pássaros. As cepas de E. coli comensais não albergam em seu genoma genes codificadores
de fatores de virulência. Estas cepas estão também adaptadas à coexistência com a flora
intestinal do hospedeiro e não causam doenças no trato gastrointestinal e geralmente
tampouco causam patologias fora do trato intestinal exceto em casos onde o hospedeiro tenha
comprometimento do sistema imune (RUSSO & JOHNSON, 2000).
Cepas patogênicas intestinais, ao contrario das comensais, são raramente encontradas
na flora fecal de indivíduos sadios. São genericamente denominadas de DEC (“Diarrheagenic
Escherichia coli” – E. coli diarreiogênica) e podem ser divididas em patotipos, os quais são
geralmente definidos por uma variedade de características como modo de transmissão,
características do hospedeiro afetado, sorotipos e sorogrupos, fenótipos de interação com as
células epiteliais intestinais, mecanismos de patogenicidade e determinantes genéticos de
virulência. Os patotipos de E. coli diarreiogênica causam gastroenterite, mas raramente são o
agente etiológico de alguma doença fora do trato intestinal. Tendo por base estas
características, atualmente são reconhecidos os seguintes patotipos de DEC: E. coli
enterotoxigênica (ETEC), associada a diarreia dos viajantes, E. coli produtora de toxina Shiga
(STEC), associada a diarreia, colite hemorrágica e síndrome urêmico-hemolítica, E. coli
enteroinvasora (EIEC), associada com infecções intestinais que envolvem a invasão dos
enterócitos, diarreia aquosa e disenteria, E. coli enteroagregativa (EAEC), associada a diarreia
persistente em humanos; E. coli que adere difusamente (DAEC) e E. coli enteropatogênica
12
(EPEC), que causa diarreia em crianças (RUSSO & JOHNSON, 2000; BEKAL et al, 2003;
SANTOS et al, 2009; KONEMAN et al., 2008).
As cepas patogênicas extra-intestinais (ExPEC) são divididas em dois patotipos
principais: E. coli causadora da meningite neonatal (NMEC) e E. coli uropatogênica (UPEC)
(BIEN et al, 2012). As ExPEC têm a capacidade de colonizar o intestino sem causar doença,
porém são capazes de se disseminar e colonizar outros nichos no hospedeiro (WILES et al,
2008). São epidemiologicamente e filogeneticamente distintas das cepas comensais e
intestinais, causando infecções em qualquer lugar do corpo, devido à aquisição de genes que
codificam fatores de virulência. São capazes de produzir infecções do trato urinário,
meningite
(principalmente
nos
neonatos),
infecções
intra-abdominais,
pneumonia
(especialmente nos pacientes hospitalizados), infecções em pacientes com dispositivos
intravasculares, osteomielite, infecções dos tecidos moles (pele) e bacteremias. Desta forma,
E. coli permanece como uma das causas mais frequentes de infecções comunitárias e
nosocomiais, incluindo as infecções do trato urinário, as infecções entéricas, e as infecções
sistêmicas em humanos (RUSSO & JOHNSON, 2000; PITOUT, 2012).
Cada uma das distintas estirpes de E. coli apresenta diversos fatores de virulência, com
uma característica multifatorial. Estas estirpes podem ser distinguidas pela presença de
marcadores de virulência específicos que são expressos de acordo com o lugar onde se
encontram (DONNENBERG & WHITTAM, 2001; BEKAL et al 2003).
1.2.2 Filogenia em populações bacterianas de Escherichia coli.
Estudos filogenéticos baseados em uma coleção de referência de E. coli (ECOR),
constituída por um grupo de 72 cepas isoladas de uma variedade de hospedeiros animais e de
origem geográfica diversa mostram que as populações bacterianas de E. coli pertencem a
quatro grupos filogenéticos principais designados como: A, B1, B2 e D (HERZER et al,
1990). Estudos posteriores têm revelado que isolados de E. coli extraintestinais (ExPEC)
pertencem em sua maioria ao grupo B2 e, em menor escala, ao grupo D; as cepas comensais
(sem potencial patogênico) em sua maioria são agrupadas nos grupos filogenéticos A e B1,
enquanto que as amostras patogênicas intestinais agrupam-se igualmente nos grupos
filogenéticos A, B1 e D (CLERMONT et al, 2000; YAMAMOTO, 2007; KARISIK et al,
2008; SANTOS et al, 2009). Na Figura 1.2 temos a relação entre os patotipos e os grupos
filogenéticos.
13
As cepas de E. coli extraintestinais causadoras de infecções do trato urinário
pertencem em sua maioria aos grupos filogenéticos B2 e D, e expressam mais fatores de
virulência do que aquelas do grupo filogenético A e B1 (YAMAMOTO, 2007; KARISIK et
al, 2008). Os grupos B2 e D compreendem várias linhagens evolutivas que, devido a sua
associação com distintos tipos de infecções extra-intestinais, têm sido consideradas como
“clones virulentos”, tradicionalmente definidos com base nos sorotipos O: K: H (JOHNSON
& STELL, 2000).
Figura 1.2 Patotipos de E coli e grupos filogenéticos. Fonte: Ferreira, 2010
O estudo filogenético de populações bacterianas vem sendo realizado através de
métodos moleculares clássicos como a eletroforese de isoenzimas e a ribotipagem e, mais
recentemente, a partir de técnicas de sequenciamento genético. Entretanto, essas metodologias
são complexas, custosas e requerem tempo para ser executadas. Um método alternativo para a
investigação da relação filogenética em populações de E coli foi desenvolvido com base na
amplificação simultânea de sequências genéticas especificas com três genes que são: chuA
(outer membrane hemin receptor), yjaA (uncharacterized protein yjaA genome of E. coli K12) e um fragmento de DNA denominado TSPE4.C2 (anonymus DNA fragmente), como
marcadores específicos desses grupos filogenéticos (CLERMONT et al, 2000; SANTOS et al,
2009). Na figura 1.3 temos o esquema de como e feita a classificação filogenética por
amplificação de sequências genéticas especificas.
14
Figura 1.3: Arvore da classificação dos grupos filogenéticos de E coli na presença e ausência
dos genes chuA, yjaA e do fragmento TspE4.C2. Fonte: Clermont, et al., 2000
O gene chuA está presente nos grupos B2 ou D e ausente nos grupos A e B1,
permitindo o distinção entre estes pares de grupos filogenéticos. O gene yja possibilita a
separação entre os grupos B2 e D sendo detectado apenas no grupo B2. A presença do
fragmento TspE4.C2 caracteriza a amostra como pertencendo ao grupo filogenético B1,
enquanto a sua ausência está associada ao grupo filogenético A (CLERMONT,
BONARCORSI, BINGEN, 2000).
1.2.3 Escherichia coli uropatogenica (UPEC).
Entre as ExPEC, as cepas de E. coli uropatogênica (UPEC) são mais comumente
associadas à doenças em humanos. As UPEC são a principal causa de infecções do trato
urinário adquiridas na comunidade (ITU), aproximadamente 80-90% dos casos e das
infecções urinárias hospitalares, cerca de 50% dos casos (LINDSAY, 2006; WILES et al,
2008). É importante indicar também que a disseminação dos grupos clonais de cepas UPEC
dentro da comunidade pode ser feita através de alimentos contaminados e de outros meios de
consumo (MANGES et al, 2001; MANGES & JOHNSON 2012). A via sexual pode ser outra
forma de transmissão das UPEC (FOXMAN, 2002; WILES et al, 2008).
15
1.2.3.1 Fatores de virulência de Escherichia coli uropatogênica
Os genes de virulência estão localizados em elementos móveis como cassetes gênicos,
integrons, transposons, sequencias de inserção, plasmídeos ou em ilhas de patogenicidade
localizadas no cromossomo bacteriano (GALMOR & FINLAY, 2006; MIDOLLI 2009;
NORMAN et al, 2009).
No cromossomo, os atributos associados à virulência geralmente são codificados em
ilhas de patogenicidade (PAIs). Sua aquisição provem da transferência horizontal de genes
entre linhagens e mesmo entre espécies (DONNENBERG & WHITTAM, 2001; BEKAL et
al, 2003; LLOYD et al, 2009). As ilhas de patogenicidade consistem em extensos segmentos
de DNA cromossomal variando de 5 a 200 Kb, contendo um conjunto de genes associados a
virulência que estão inseridos dentro ou próximo aos genes de RNAt. PAIs são instáveis e
apresentam um conteúdo de C-G que difere do resto
do genoma (BLUM et al, 1994;
SCHMIDT & HENSEL, 2004; GAL-MOR & FINLAY, 2006 GAL-MOR & FINLAY, 2006;
MIDOLLI 2009). O termo PAI foi usado por Hacker et al. no ano de 1990 para descrever
duas grandes regiões instáveis no cromossomo de E. coli uropatogênica (GAL-MOR &
FINLAY, 2006). A presença de PAIs é uma característica de estirpes de UPEC associadas
com formas clinicamente graves da infecção (GAL-MOR & FINLAY, 2006).
Os fatores de virulência nas UPEC podem ser divididos em dois grupos: (i) fatores de
virulência associados com a superfície da célula bacteriana e (ii) fatores de virulência que são
secretados no sitio de ação (BIEN et al, 2012).
No grupo dos fatores de virulência associados à superfície da célula bacteriana, temos
as estruturas que promovem a união da bactéria aos tecidos no trato urinário. Neste grupo
estão às fímbrias e as adesinas: fímbria tipo 1, associada às ITU baixas, fimbria P, associada
às ITU altas (pielonefrite), fímbria S, as adesinas da família Dr. como as adesinas fimbriais e
as adesinas afimbrais (AFA I-II-III-IV) e o flagelo, que é responsável pela motilidade da
bactéria. As fímbrias e adesinas possuem um papel muito importante na patogênese da ITU,
contribuindo para a união das bactérias às células uroepiteliais na iniciação da infecção
urinaria. Neste grupo também se incluem os antígenos capsulares tipo K1, K5, K12 e os
lipopolissacarídeos (LPS) (MIDDENDORF et al, 2001; YAMAMOTO, 2007; ESPARIS et al
2009; OLIVEIRA et al, 2011; BIEN et al, 2012; PITOUT, 2012). E. coli uropatogênica tem
sido encontrada formando biofilme bacteriano, que confere importantes vantagens aos
16
microrganismos, como resistência à desidratação e à oxidação e maior tolerância a detergentes
e antibióticos (JUSTICE et al, 2004; TIBA et al, 2009).
No grupo dos fatores de virulência que são secretados no sítio de ação, temos as
toxinas, que são úteis na colonização do tecido uroepitelial, causando resposta inflamatória e
aparecimento de sintomas. Entre as toxinas temos a alfa-hemolisina, o fator necrotizante
citotóxico tipo I, a toxina secretora auto transportadora (SAT), o antígeno O, os sistemas de
consumo de ferro, como a aerobactina, a yersiniabactin e fatores que aumentam sua
resistência no soro (MIDDENDORF et al, 2001; SILVEIRA et al 2001; YAMAMOTO,
2007; WILES et al, 2008; OLIVEIRA et al 2011; BIEN et al, 2012; PITOUT, 2012). Na
Figura 1.4 temos fatores de virulência das UPEC no tecido uroepitelial.
Figura 1.4: Fatores de virulência da UPEC na superfície do tecido uroepitelial. OM:
membrana externa; CM: membrana citoplasmática, LPS: lipopolisacarídeos.
Fonte: Johnson, 1991.
1.2.3.2 Sorotipos de Escherichia coli uropatogênica
Tradicionalmente, a classificação dos sorotipos de E. coli está baseada na presença de
alguns antígenos como: antígeno somático “O”, polissacarídeo capsular “K” e antígeno
flagelar “H”, o que gera uma grande variedade de diferentes combinações de sorotipo O:K:H
(NIMMICH et al, 1997; WILES et al, 2008). A associação entre a expressão do antígeno
17
capsular específico e os patotipos de E. coli esta documentada embora ainda não seja
compreendido seu impacto patogênico. O antígeno somático “O” define mais de 176
sorogrupos, dos quais os mais comuns são O1, O2, O4, O6, O7, O8, O16, O18, O22, O25 e
O75. Entre as UPEC os antígenos específicos “K” e “H” têm um padrão menos definido
(BLANCO et al, 1995; WILES et al, 2008; EMAMGHORHI et al, 2011). O antígeno
capsular “K” esta associado com as ExPEC que causam meningite neonatal, já que melhora a
sobrevivência da bactéria dentro do endotélio microvascular do cérebro evitando a fagocitose;
entretanto, ainda não está definido um papel importante nas UPEC. O antígeno flagelar “H”
têm uma função definida nas cepas de E. coli uropatogênicas, já que facilita a ascensão das
UPEC da bexiga até os rins (WILES et al, 2008).
1.3 TRATAMENTO DA ITU.
Na terapêutica antimicrobiana da ITU deve-se ter em conta diferentes fatores, como o
tipo de ITU e o conhecimento do agente etiológico que provavelmente está na origem da
infecção. Igualmente importante é o conhecimento do perfil de susceptibilidade aos
antimicrobianos desse mesmo agente etiológico. No entanto, para um mesmo agente o perfil
de susceptibilidade aos antimicrobianos pode variar amplamente entre as regiões geográficas
de em um mesmo país ou em países diferentes, o que torna difícil fazer generalizações
(ROLO et al, 2006; AYPAK et al, 2009).
É importante selecionar um medicamento apropriado, inicialmente em forma empírica,
até se ter os resultados de urocultivo e antibiograma, procurando-se sempre um antibiótico
com alta eficácia sobre o agente suspeito, de alta concentração na via urinaria e baixa
toxicidade. Deve-se também procurar uma resposta rápida e eficaz e a prevenção da
recorrência e evitar a aparição de resistência ao antibiótico. Na ITU é importante também
procurar um antibiótico que apresente alta concentração no parênquima renal, na camada mais
profunda da parede da bexiga e da próstata (ECHEVARRÍA 2006).
Outro fator que concerne à terapêutica é a sua duração, devendo ter-se em conta que
regimes de curta duração são mais fáceis de seguir, têm menos elevado e as reações adversas
surgem menos frequentemente. Salvo algumas exceções, a terapia antimicrobiana em dose
única da ITU não complicada é menos eficaz que tratamentos mais longos com trimetoprimSulfametoxazol (TMP/SMX), trimetoprim, norfloxacina, ciprofloxacina, e -lactâmicos. No
entanto, todos estes antimicrobianos, à exceção dos-lactâmicos, quando em regime de três
18
dias são tão eficazes quanto regimes de duração mais longa, que levam também a uma maior
frequencia de reações adversas (NICOLLE et al, 2006; GRABE et al, 2008).
Embora na ITU não complicada tenha se utilizado, na rotina de tratamento, o
trimetroprim/sulfametoxazol, estudos recentes demonstram uma baixa susceptibilidade.
Podem-se também usar outros medicamentos como cefalosporinas de primeira e segunda
geração, amoxicilina/ácido clavulânico e em alguns casos, as quinolonas (ECHEVARRIA,
2006, NICOLLE et al, 2006). É importante salientar a importância de se fazer o antibiograma
para se conhecer o perfil de susceptibilidade aos antibacterianos nas diferentes áreas
geográficas. Caso a taxa de resistência para TMP/SMX seja maior que 20% em uma região
específica, deve-se deixar de usar estes antibióticos como primeira opção para o tratamento
empírico (GUAJARDO-LARA et al, 2009; NICOLLE et al, 2006).
Na ITU alta, como na pielonefrite não complicada, a terapia oral deve ser considerada
nos pacientes com sintomas leves a moderados e que possam tolerar esta via. Devido à
resistência atual para ampicilina, amoxicilina e cefalosporinas de primeira e segunda geração,
estes agentes não devem ser utilizados como tratamento empírico nesta patologia. Nestes
casos, o tratamento empírico deve ser feito com fluoroquinolonas, as quais são úteis tanto na
ITU complicada como na não complicada, sendo a ciprofloxacina e a norfloxacina os
antibióticos mais usados (ECHEVARRIA, 2006, NICOLLE et al, 2006; GRABE et al, 2008).
Podem também ser usados antibióticos aminoglicosídeos, como a gentamicina, nos casos de
infecções urinárias altas complicadas (ALOS et al, 2005). A Tabela 1.4 demonstra os esquemas
de tratamento das ITUs no adulto.
19
Tabela 1.4 Tratamento da Infecção do trato urinário no adulto.
Categoria
Cistite aguda
não
complicada
Patógenos principais
Escherichia coli
Staphylococcus saprophyticus
Proteus mirabilis
Outros
Cistite
recorrente na
mulher jovem
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Outros
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Outros
Cistite aguda
no homen
joven
Pielonefrite
aguda não
complicada
ITU
complicada
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Outros
Escherichia coli
K. pneumoniae
P. mirabilis
Enterococcus sp.
Pseudomonas aeruginosa
Outros
Bacteriuria
assintomática
na gravidez
Escherichia coli
Proteus mirabilis
ITU associada
ao cateter
Depende do tempo de
permanência do cateter
Terapia de primeira línea
Nitrofurantoína
Cefalosporinas de 1a geração
TMP-SMX
Ciprofloxacina
Norfloxacina
Amoxicilina/ácido clavulánico
Ciprofloxacina
Norfloxacina
Nitrofurantoína
Cefalexina
Cefadroxilo
TMP-SMX
Ciprofloxacina
Norfloxacina
Para Gram-negativos:
fluoroquinolonas.
Para Gram-positivos: amoxicilina
Se necessário a via parenteral:
Cefalosporinas ou fluoroquinolonas
Gentamicina, amicacina
No caso de Enterococcus sp:
amoxicilina com/ sem gentamicina.
Se é resistente usar linezolid
Para Gram-negativos: fluoroquinolonas
Se necessário a via parenteral:
Cefalosporinas antipesudomonas
e/ou una fluoroquinolonas
e/ou gentamicina, amicacina
En caso de Enterococcus sp:
amoxicilina com/sem gentamicina.
Si es resistente usar linezolid
Amoxicilina
Nitrofurantoína
Cefalexina
Aztreonam
Evitar tetraciclinas y fluoroquinolonas
Para Gram-negativos: fluoroquinolonas
Para Gram-positivos: usar
amoxicilina más gentamicina
Comentários
Três dias de terapia.
Quinolonas podem
ser usada nas área
onde não têm
resistência
Repetir a terapia,
por 7 a 10 dias,
baseada no
resultado do cultivo.
Usar profilaxia.
Terapia por 7 a 10
dias
Iniciar com iv,
depois trocar à vo.
Terapia de 14 dias a
1 mês.
Terapia por 10 a 14
dias
Terapia por 3 a 7
dias
Se possível remover
o cateter ou trocar.
Tratamento por 10
dias.
TMP-SMX = trimetoprim-sulfametoxazol; UFC= unidade formadora de colônias; iv= intravenoso
vo= via oral. Modificado de Fonte: Echevarría et al., 2006
20
1.4 ANTIBIÓTICOS LACTÂMICOS
Após setenta anos em uso na medicina clínica, que teve início com a utilização em um
paciente com sepse estafilocóccica na década de 40, os betalactâmicos são os antimicrobianos
mais administrados tanto na atenção primária como nos hospitais (MARÍN & GUDIOL,
2003). O primeiro antibiótico lactâmico usado foi a penicilina, no ano de 1940. Desde
então, uma grande variedade de lactâmicos tem sido desenvolvida na indústria
farmacêutica, sendo todos estruturalmente relacionados, com a presença de um anel
lactâmico (WILLANS, 1990).
Os lactâmicos são parte dos esquemas de tratamento para as diferentes formas
clínicas de ITU, pois apresentam baixa toxicidade, larga diversidade de compostos e boa
eficácia terapêutica (WILKE et al, 2005). Entretanto, nos esquemas curtos de tratamento de
ITU não complicada por três dias não dão resultados satisfatórios, de modo que se devem usar
em tratamentos que duram entre 7 e 10 dias (GRABE et al, 2008). Os lactâmicos, incluindo
as cefalosporinas orais, são utilizados para o tratamento das infecções urinárias, especialmente
em áreas com maior resistência às quinolonas, na gravidez e em pediatria (HORCAJADA &
FARIÑAS, 2005).
1.4.1 Classificação e estrutura química
A presença do anel lactâmico define quimicamente esta família de antibióticos.
Entre eles encontram-se as penicilinas, as cefalosporinas de primeira, segunda, terceira e
quarta geração, os monobactâmicos e os carbapenêmicos. Os lactâmicos compreendem o
maior grupo de antimicrobianos, geralmente com ação bactericida. O anel lactâmico é
chave para o mecanismo de ação na parede celular, através da ligação às enzimas, inativando
o conjunto de transpeptidases que catalisam ligações cruzadas na fase final da síntese do
peptideoglicano (WILLANS, 1999; MARÍN & GUDIOL, 2003). Na tabela 1.5 temos a
classificação dos antibióticos lactâmicos.
21
Tabela N. 1.5 Classificação dos antibióticos lactâmicos.
Penicilinas
I. Penicilinas Naturais
Penicilina G (im, iv)
Penicilina V (vo)
Feneticilina (vo)
II. Penicilinas resistentes às
penicilinases
Meticilina (im, iv)
Oxacilina (im, iv)
Cloxacilina (vo, im, iv)
III. Aminopenicilinas
Amoxicilina (vo,im,iv)
Ampicilina (vo)
Bacampicilina (vo)
Ampicilina/sulbactam (vo,im,iv)
Amoxicilina/ácido clavulânico
(vo, im,iv)
IV. Carboxipenicilinas
Carbenicilina (iv)
Ticarcilina (im,iv)
Ticarcilina/ácido clavulánico (iv)
V. Ureidopenicilinas
Azlocilina (iv)
Mezlocilina (im,iv)
Piperacilina (im,iv)
Piperacilina/tazobactam (iv)
Cefalosporinas
Primeira geração
Cefalotina (im,iv) Cefalexina (vo)
Cefazolina (im,iv) Cefradina
(Cefemas)
(vo,im,iv)
Cefapirina (im,iv) Cefadroxilo
(vo)
Segunda geração
Cefaclor (vo) Cefamandol (im,iv)
Cefuroxima (im,iv) Cefonicid
(im,iv)
Cefuromima-axetil (vo)
Terceira geração
Cefixima (vo) Ceftibuteno (vo)
Cefotaxima (im,iv) Ceftizoxima
(im,iv)
Ceftriaxona (im,iv) Ceftazidima
(im,iv)
Moxalactam (im,iv)
Cefepima (im,iv) Cefpiroma
Quarta geração
(im,iv)
Cefamicinas
Cefoxitina (im,iv)
Cefmetazol (im,iv)
Cefminox (im,iv)
Carbapenemas
Imipenem (im,iv) Meropenem (im,iv)
Faropenem (vo) Ertapenem (iv)
Monobactâmicos Aztreonam (im,iv)
vo=via oral; im=intramuscular; iv=intravenoso
Fonte: Calvo et al., 2009.
22
A estrutura química do grupo das penicilinas é composta por um anel betalactâmico e
um anel de tiazolidina, formando o ácido 6-aminopenicilânico, que deriva da condensação de
uma molécula de valina e uma de cisteína, para dar lugar ao duplo anel característico.
Ademais, têm uma cadeia lateral, que varia na posição 6 do anel lactâmico, o qual define as
propriedades dos diferentes tipos de penicilinas (MARÍN & GUDIOL, 2003).
As cefalosporinas são fármacos com estrutura similar às penicilinas, nos quais a
estrutura básica está constituída pelo núcleo cefem, que consiste na fusão de um anel
dihidrotiacínico (em lugar do anel tiazolidínico característico das penicilinas) e um anel
lactâmico. A modificação nas cadeias laterais origina os diferentes tipos de cefalosporinas
(MARÍN & GUDIOL, 2003).
A estrutura dos carbapenêmicos consiste em um anel lactâmico ligado a um anel
pirrolidínico compartilhando um átomo de nitrogênio. Estas modificações e as cadeias laterais
condicionam a maior afinidade pelas proteínas fixadoras de penicilinas (PBP) alvo,
incrementando o espectro antibacteriano e de resistência às betalactamases. Este grupo de
lactâmicos são os de maior espectro e atividade antibacteriana (MARÍN & GUDIOL,
2003). Os monobactâmicos são derivados do ácido 3-aminomonobactâmico (3-AMA). Têm
uma estrutura monocíclica simples, em que o anel lactâmico não está ligado a outro anel
secundário (MARÍN & GUDIOL, 2003). Na figura 1.5 temos a estrutura química dos quatro
grupos de antibióticos lactâmicos.
Figura 1.5. Estrutura química dos antibióticos lactâmicos Fonte: Bush & Fisher, 2011.
23
1.4.2 Mecanismos de ação dos lactâmicos
Os antibióticos lactâmicos são agentes que inibem a síntese da parede celular
bacteriana e induzem um efeito autolítico. A destruição da parede bacteriana ocorre como
consequência da inibição da última etapa da síntese do peptideoglicano. A parede celular
bacteriana é composta de uma rede macromolecular denominada peptideoglicano, que está
presente isoladamente ou em combinação com outras substâncias. A peptideoglicana consiste
em um dissacarídeo repetitivo unido por polipeptídeos para formar uma rede que circunda e
protege a célula. Na maioria das bactérias Gram-positivas há uma membrana celular com uma
camada espessa e rígida de peptideoglicano. Em contraste, as bactérias Gram-negativas
apresentam uma camada fina de peptideoglicano entre a membrana plasmática interna e a
membrana celular lipoproteica externa (MARÍN & GUDIOL, 2003; KONEMAN et al., 2006)
Nas bactérias Gram-positivas, os lactâmicos não precisam atravessar a membrana
plasmática para exercer sua atividade, passando pela camada de peptideoglicano e agindo nas
transpeptidases, na formação da parede celular. Nas bactérias Gram-negativas as duas
membranas servem de barreira para os antimicrobianos lactâmicos, já que seu alvo de ação
fica no interior da célula, após a membrana externa e o espaço periplasmático. Mesmo
substâncias altamente lipofílicas têm dificuldade de se difundir para o interior da célula,
devido à natureza polarizada e assimétrica da membrana celular externa. Os compostos
lactâmicos são transportados para o interior da célula Gram-negativa através,
principalmente, de proteínas denominadas porinas. O tamanho,carga e hidrofobicidade das
moléculas que tentam entrar na célula influenciam a velocidade e efetividade deste transporte
(MARÍN & GUDIOL, 2003; KONEMAN et al., 2006)
O peptideoglicano está constituído por longas cadeias de glucido (glicano), formadas
pela repetição de moléculas de ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglucosamina. O ácido
murâmico fixa as cadeias de tetrapeptideos (peptídeo) que são unidas para formar uma rede,
bem diretamente (Gram-negativos) ou por um pentapeptideo de glicina (Gram-positivos). Os
lactâmicos inibem esta união, ou transpeptidação, que é a ultima etapa da síntese da parede
celular. Assim a parede formada fica débil, e pode ser quebrada com o aumento da pressão
osmótica intracelular. Para a ação dos lactâmicos é necessário que as bactérias se
encontrem na fase de multiplicação, na qual a parede está sendo sintetizada (MARÍN &
GUDIOL, 2003; MARTÍNEZ & SÁNCHEZ, 2007)
24
Os componentes de peptideoglicano são sintetizados no citoplasma e transportados
através da membrana citoplasmática até o espaço periplasmático. Neste espaço periplasmático
existem proteínas (transpeptidases e carboxipeptidases) que são encarregadas de formar os
tetrapeptidos. Estas enzimas se fixam às penicilinas e aos outros betalactâmicos, sendo
chamadas PBPs (penicillin-binding proteins). Os anéis dos lactâmicos possuem uma
estrutura similar aos dois últimos aminoácidos do pentapeptido (D-alanina-D-alanina), o que
permite uma união covalente no sítio ativo da transpeptidase. As PBPs são diferentes em
microorganismos Gram-negativos e Gram-positivos e em espécies anaeróbias, o que explica
os diferentes espectros de atividade dos lactâmicos em diferentes tipos bacterianos
(MARÍN & GUDIOL, 2003; MARTÍNEZ & SÁNCHEZ, 2007). A Figura 1.6, apresenta a
estrutura da parede das bactérias.
Figura 1.6 Estrutura da parede das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
Fonte: Sánchez, 2006
1.5 RESISTÊNCIA BACTERIANA
A resistência aos antimicrobianos faz parte da história das bactérias, mas só se tornou
uma ameaça aos tratamentos a partir do momento em que o homem começou a utilizar os ßlactâmicos clinicamente. Estas drogas rapidamente promoveram uma seleção natural,
eliminando as bactérias susceptíveis, mas deixando as resistentes sobreviver. Pode-se
considerar o aparecimento da resistência bacteriana como uma ação de causa efeito. Após a
25
utilização da penicilina no tratamento de infecções por Staphylococcus aureus, surgiram os
primeiros isolados com resistência, devido à produção de penicilinases plasmídicas, que
rapidamente se estenderam entre a mesma espécie, bem como a outras espécies de
Staphylococcus. Esta resistência levou à necessidade de desenvolvimento de novos fármacos
estáveis à ação destas enzimas. No entanto, as bactérias são versáteis e rapidamente
desenvolveram novos meios de resistir (JUNIOR et al., 2004; HORCAJADA & FARIÑAS,
2005).
As bactérias podem ter resistência intrínseca a um ou mais agentes antimicrobianos,
mas podem também adquirir a resistência por mutações de novo ou por genes de resistência
de outros micro-organismos, e ainda por adaptações metabólicas aos fármacos (BECERRA et
al., 2009; MARTINEZ & CALVO, 2010).
Os genes que codificam fatores de resistência bacteriana variam de acordo com sua
localização, tipo de transferência e expressão. Os genes de resistência estão localizados no
cromossomo bacteriano, o que confere certa estabilidade genética ao microorganismo, ou nos
plasmídeos extra-cromossomiais (GAL-MOR & FINLAY, 2006; MIDOLLI 2009; NORMAN
et al., 2009). Sob certas condições, os plasmídeos são uma vantagem para as células. Os
plasmídeos, além das funções essenciais, podem transportar genes para atividades de
resistência aos antibióticos, tolerância a metais tóxicos, produção de toxinas e síntese de
enzimas (MARTÍNEZ, 2006; NORMAN et al., 2009; CARATTOLI, 2009)
Elementos genéticos móveis, como plasmídeos podem ser transmitidos para bactérias
da mesma espécie e também entre espécies distintas, através de mecanismos específicos de
recombinação e troca, denominados de transferência horizontal (NORMAN et al., 2009)
Entre os elementos móveis temos cassetes gênicos, integrons, transposons, sequências
de inserção, plasmídeos ou ilhas de patogenicidades localizadas no cromossomo bacteriano
(GONZALES et al., 2004; GAL-MOR & FINLAY, 2006; MIDOLLI 2009 – NORMAN et
al., 2009).
Os integrons são elementos dinâmicos que contêm os determinantes genéticos dos
componentes de um sistema de recombinação especifica de sítio que reconhece e captura
genes em cassetes móveis (DI CONZA & GUTKIND, 2010). A estrutura mínima de um
integron é: i) o gene da integrase (intl); ii) um sítio de recombinação (attl) e; iii) um promotor
(Pc-P2) com direção para a expressão dos genes capturados. Atualmente, os integrons são
divididos em dois grandes grupos (i) os integrons de resistência antibiótica ou chamados
26
“integrons móveis”, que são de classe 1, 2 e 3 e ii) os integrons presentes no cromossoma
bacteriano, chamados “superintegrons” (GONZALES et al, 2004; DI CONZA & GUTKIND,
2010).
Os integrons de classe 1 são os mais comuns e de maior interesse, por sua relação com
a resistência antibiótica, já que transportam cassetes gênicos contendo genes de resistência a
vários grupos de antibióticos, especialmente aos lactâmicos (WILKE et al, 2005). Os
integrons podem passar de uma bactéria a outra formando parte de transposons ou plasmídeos
(MARTÍNEZ, 2006; DI CONZA & GUTKIND, 2010). Figura 1.7
Figura 1.7 Elementos genéticos móveis. Fonte, Norman et al., 2009.
Existem alguns importantes mecanismos de transferência de material genético nas
bactérias: i) conjugação, ii) transformação, iii) transdução e, iv) transposição. A conjugação é
o mecanismo mais comum pelo qual os genes de resistência são transferidos e requer contato
célula a célula (Figura 1.8). Para que aconteça a conjugação, é necessário o contato célula a
célula através de um pilus sexual especializado, codificado por um plasmídeo denominado F.
Uma vez que o contato é estabelecido, o plasmídeo F é replicado em uma das cadeias simples
de DNA plasmidial e passa para a célula receptora através do pilus. A cadeia simples começa
a ser replicada à medida em que entra na célula, havendo, ao final do processo, duas células
contendo plasmídeos conjugativos completos. O plasmídeo pode ser incorporado ao
cromossoma bacteriano (JUNIOR et al 2004; MARTÍNEZ, 2006; NORMAN et al, 2009;
27
BECERRA et al, 2009; MIDOLLI 2009; CARATTOLI, 2009). No caso da transformação, há
captação de DNA solúvel no meio por células receptoras competentes. O mecanismo de
transdução compreende a transferência genética com auxílio de bacteriófagos; enquanto que a
transposição é a transferência de genes dentro de uma mesma célula através de transposons
(DNA) (MIDOLLI 2009).
Figura 1.8 Microfotografia eletrônica de duas Escherichia coli em processo de conjugação
Fonte: Junior et al., 2004
A resistência bacteriana aos antibióticos lactâmicos, especificamente, é feita por
quatro mecanismos: i) Alteração da permeabilidade, na qual a presença da membrana externa
nos Gram-negativos dificulta a entrada de sustâncias hidrofílicas, como os lactâmicos, que
precisam das porinas para atravessar a membrana; neste caso a resistência é secundaria à
alteração das porinas, ii) Modificação dos alvos, onde os lactâmicos devem se ligar às
PBPs para exercerem efeito bactericida; as mudanças nas PBPs implicam uma perda de
afinidade aos lactâmicos, levando à diminuição na atividade do fármaco, iii) Produção de
enzimas, que na atualidade constitui o principal mecanismo de resistência aos lactâmicos,
principalmente nas baterias Gram-negativas. As betalactamases são enzimas catalíticas de
natureza proteica e atuam rompendo o enlace amídico do anel lactâmico, prévia à união ao
grupo carbóxilo, o que faz com que os antibióticos lactâmicos perdam a capacidade de
união às PBPs e iv) Expressão de bombas de efluxo, mecanismos de expulsão dependentes de
28
energia que bombeiam o antibiótico para o exterior da bactéria (MARÍN & GUDIOL, 2003;
CASELLAS, 2011). Figura 1.9
Figura 1.9 Mecanismos de resistência aos antibióticos nas bactérias Gram-negativas.
Fonte, Peleg & Hooper, 2010
1.6 ENZIMAS ß-LACTAMASES
A produção de ß-lactamases é o mais importante mecanismo de resistência aos
antibióticos lactâmicos (DALMARCO et al, 2006). Uma vez expressas, as ß-lactamases
são secretadas no espaço periplásmico (em bactérias Gram-negativas) e atua hidrolisando o
anel ß-lactâmico por hidroxilação irreversível da ligação amida, inativando-os e
impossibilitando a atividade antibacteriana (JUNIOR et al, 2004; WILKE et al, 2005,
MARTINEZ, 2006). Estas enzimas apresentam afinidades distintas para os diferentes grupos
de anéis ß-lactâmicos. Determinados tipos de ß-lactamases podem ser produzidos por
diferentes espécies bacterianas, mas uma única espécie também pode produzir diferentes tipos
de ß-lactamases (JUNIOR et al 2004). A especificidade destas enzimas aos anéis ß-lactâmicos
determina a eficácia da hidrólise dos mesmos. A capacidade ou não das ß-lactamases de
conferir resistência aos antimicrobianos lactâmicos de amplo espectro irá depender da
quantidade de enzima produzida pelo microorganismo, da habilidade dessa enzima em
29
hidrolisar o antimicrobiano e da velocidade com que o lactâmico penetra pela membrana
externa (LIVERMORE, 1991).
As ß-lactamases foram originadas, provavelmente, pela pressão seletiva exercida por
microorganismos naturalmente produtores de compostos ß-lactâmicos existentes no solo,
(BRADFORD, 2001). A síntese desta enzima pode ser cromossômica (constitutiva) ou
mediada por plasmídeos (indutiva). A mobilidade genética pode ser ampliada por meio de
elementos móveis como integrons, transposons, plasmídeos (MARTINEZ, 2006; NORMAN
et al, 2009; CARATTOLI, 2009).
As ß-lactamases foram classificadas baseando-se em critérios do perfil de substrato da
enzima e na localização dos seus genes codificadores. A primeira classificação foi feita em
1973 por Richmond e Sykes. Em 1989, Bush fez a segunda classificação das ß-lactamases,
com posterior atualização no ano 1995, baseando-se na preferência pelos substratos
lactâmicos e pela inibição pelo clavulanato. Atualmente, esta proposta está baseada nas
propriedades bioquímicas, estrutura molecular e sequência de nucleotídeos, separando-se as
enzimas em quatro grupos funcionais e subgrupos. Em 1980, Ambler propôs outra
classificação baseada na estrutura molecular e na homologia das sequências de aminoácidos,
dividindo as enzimas em quatro grupos (A, B, C, D) (LIVERMORE, 1995). Na atualidade,
têm sido consideradas as duas classificações, propostas por Ambler e por Bush, Jacoby &
Medeiros, como demonstrado na Tabela 6.
No esquema da classificação de Ambler, as classes A, C e D agem através do
mecanismo baseado nas “Serinas”, enquanto a classe B ou metalo-beta-lactamases necessitam
de zinco (Zn) para sua ação. A maioria das ESBLs está contida na classe molecular “A” de
Ambler, caracterizada pela presença do sítio ativo “serina” e pela massa molecular de
aproximadamente 29.000 KDa e pela preferência (afinidade) de hidrólise sobre as penicilinas
(LIVERMORE, 1995; DALMARCO et al, 2006).
Entre as ß-lactamases, as ESBL (Extended-Spectrum -Lactamases) e as AmpC ßlactamases são as mais comuns (PARVEEN, et al., 2010)
30
Tabela 1.6 Classificação das ß-lactamases
Bush-Jacoby
group
Molecular
class
1
C
1e
C
2a
A
2b
A
2be
A
2br
A
2ber
A
2c
A
2d
D
2de
D
2df
D
2e
A
2f
A
3a
B
3b
B
Defining characteristic(s)
Selected enzymes
Hidrolise cefalosporinas, cefamicinas
penicilinas. Não são inibidas por CLA e TZB.
Afinidade elevada para aztreonam
Hidrolise penicilinas, cefamicinas,
cefalosporinas amplo espectro e
monobactâmicos. Não inibida pelo CLA e TZB
Eficiente hidrólise de penicilinas. Inibida pelo
CLA e TZB
Hidrolise penicilinas, cefalosporinas de primeira
geração (cefazolina, cefalotina, cefaloridine) .
Inibida pelo CLA e TZB
Hidrolise eficiente de penicilinas, cefalosporinas
amplo espectro, monobactâmicos.
Inibida pelo CLA e TZB
Hidrolise eficiente de penicilinas e
cefalosporinas de primeira geração. Inibição
deficiente pelo CLA
Hidrolise eficiente de penicilinas, cefalosporinas
amplo espectro, monobactâmicos. Inibição
deficiente pelo CLA e TZB
Hidrolise eficiente de carbenicilina. Inibida pelo
CLA
Hidrolise eficiente de cloxacilina ou oxacilina.
Levemente inibida por CLA
Hidrolise de penicilinas e cefalosporinas de
amplo espectro. Levemente inibida por CLA
Hidrolise de carbapenêmicos e cloxacilina ou
oxacilina. Levemente inibida por CLA
Hidrolise eficiente de cefalosporinas. Inibida
pelo CLA e TZB, mas não pelo aztreonam.
Hidrolise de carbapenêmicos, cefalosporinas e
penicilinas e cefamicinas. Pobre inibição pelo
CLA; baixa inibição por TZB
Hidrolise de todos os b-lactâmicos exceto
monobactâmicos. Inibida por EDTA e agentes
quelantes de iões metálicos, não inibida pelo
CLA e TZB.
Afinidade hidrolise para carbapenêmicos.
Inibida por EDTA e agentes quelantes de iões
metálicos, não inibida pelo CLA e TZB.
Escherichia coli E Pseudomonas aeruginosa
AmpC. CMY-2, FOX-1, MIR-1
GC1, CMY-37
PC1 e outras staphylococcal penicillinases
SHV-1, TEM-1, TEM-2, TLE-1 (TEM-90)
ESBLs: CTX-M-15, CTX-M-44 (Toho-1),
PER-1, SFO-1, SHV-5, TEM-10, TEM-26,
VEB-1
IRTs: TEM-30, TEM-76, TEM-103, SHV10, SHV-26
CMTs: TEM-50, TEM-68, TEM-89
PSE-1, CARB-3
OXA-1, OXA-10
ESBLs: OXA-11, OXA-15
OXA-23, OXA-48
CepA
IMI-1, KPC-2, KPC-3, SME-1, GES-2
IMP-1, L1, NDM-1, VIM-1
CphA, Sfh-1
Observações: CLA, acido clavulânico; CMT, complexo mutante TEM; ESBL, β-lactamase de amplo espectro;
IRT, resistência ao inibidor TEM; TZB, tazobactam. Modificado de Fonte: Bush & Fisher, 2011.
31
1.6.1 ß-lactamases de Espectro Estendido (ESBL)
O primeiro microrganismo produtor de uma ESBL foi isolado em 1983, em Frankfurt,
na Alemanha. Em 1985 e no início da década de 90 ocorreram os primeiros surtos
hospitalares na França e depois nos EUA, respectivamente. Atualmente, comprovando a sua
capacidade de adaptação, o número de variantes de ESBLs identificadas tem aumentado
significativamente por todo o mundo (BRADFORD, 2001; PATERSON & BONOMO, 2005;
DALMARCO, 2006).
As ESBL estão classificadas dentro do grupo funcional 2, segundo Bush et al. (1995) e
da classe A de Ambler (1980). Estas enzimas são capazes de hidrolisar e causar resistência ou
sensibilidade diminuída às penicilinas, oximino-cefalosporinas (cefotaxima, ceftriaxona,
ceftazidima, cefepime) e monobactâmicos (aztreonam), mas não às cefamicinas (cefotaxima)
e aos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem); são inibidas por compostos como
o ácido clavulânico (clavulanato), o sulbactam e o tazobactam (BRADFOR, 2001;
PATERSON & BONOMO, 2005; BUSH & JACOBY, 2010; PEIRANO & PITOUT, 2010;
NAVARRO et al., 2011; DHILLON & CLARK, 2012).
As ESBLs, na sua maioria, originaram-se de mutações pontuais ocorridas no centro
ativo das ß-lactamases clássicas TEM (TEM-1 e TEM-2) e SHV (SHV 1), que resultaram na
substituição de aminoácidos, alterando assim seus substratos específicos. As ESBL diferem
de suas enzimas de origem por uma a sete substituições e algumas deleções de aminoácidos
que alteram a configuração e as propriedades do seu sitio de ação (BRADFORD, 2001;
DALMARCO, 2006; BUSH & JACOBY, 2010; DHILLON & CLARK, 2012). Embora as
enzimas ESBL possuam, geralmente, localização plasmidial, as mesmas podem ter sido
originadas nos cromossomas, já que muitas enterobactérias contêm enzimas cromossômicas
constitutivas. Os plasmídeos que carreiam os genes codificadores de ESBL podem conter
também determinantes genéticos de resistência para outros grupos de antimicrobianos, como
quinolonas, sulfonamidas, trimetroprim, cloranfenicol, tetraciclinas e aminoglicosídeos
(BRADFORD, 2001; WILKE et al, 2005; CARATTOLI, 2009). Desta forma, a produção de
ESBL é frequentemente acompanhada por multirresistência aos antibióticos, de forma que as
opções terapêuticas ficam, muitas vezes, limitadas aos carbapenêmicos.
As enzimas ESBL são classificadas e denominadas de acordo com a similaridade com
outras enzimas precursoras e/ou com grupos já conhecidos. A maioria delas é derivada das
32
lactamases dos tipos TEM e SHV. Outros tipos de ESBL não relacionados com TEM e
SHV e com relevância clinica são: CTX-M, OXA, PER, VEB, CMT, TLA, SFO, GES e BES
(BUSH & JACOBY, 2010; MARTINEZ & CALVO, 2010; NAVARRO et al., 2011;
CHONG et al., 2011; DHILLON & CLARK, 2012).
As ESBLs têm sido descritas em uma variedade de Enterobacteriaceae e
Pseudomonadaceae de diferentes lugares do mundo, mas são, mais frequentemente,
identificadas em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli. A importância das ESBLs deriva
da sua expansão clonal, da sua localização plasmidial e de repetidos eventos mutacionais
(JUNIOR et al 2004).
Inicialmente, as bactérias produtoras de ESBL foram isoladas de pacientes
hospitalizados, preferencialmente nos serviços de terapia intensiva. Esta bactérias podem
sobreviver por longos períodos de tempo nos hospitais, ocasionando surtos. Atualmente,
cepas produtoras de ESBL são encontradas também em pacientes da comunidade
(MARTINEZ & CALVO, 2010; DHILLON & CLARK, 2012; PEIRANO & PITOUT, 2010).
É importante destacar que foram identificadas Enterobacteriaceae produtoras de ESBL em
diversas amostras ambientais,em fezes de indivíduos saudáveis, em alimentos, em fazendas de
agropecuária, e em esgotos, o que sugere que a comunidade pode funcionar como reservatório
de cepas produtoras destas enzimas, fato que alerta para a possibilidade de sua expansão
global (MESA et al., 2006)
Ao nível mundial, é difícil estimar a proporção de microorganismos produtores de
ESBLs, principalmente, por diferenças entre os métodos de detecção e interpretação utilizados
por cada um dos países e instituições de saúde envolvidos que também diferem muito em
relação à notificação do aparecimento de tal fenômeno. Por estes motivos, a ocorrência de
ESBL é mundialmente subestimada. Infecções causadas por microorganismos produtores de
ESBL são associados com aumento da morbidade, da mortalidade e dos gastos em saúde
publica (DALMARCO, 2006; PEIRANO & PITOUT, 2010)
1.6.1.1 TEM
As ESBLs do tipo TEM (primeiramente descritas em E. coli isoladas a partir de
material clínico de uma paciente chamada Temoneira) são derivadas de TEM-1 e TEM-2
(PATERSON & BONOMO, 2005). Entre as bactérias Gram-negativas, TEM-1, que confere
33
resistência às penicilinas e as cefalosporinas de primeira geração, é a ß-lactamase mais
frequentemente encontrada, sendo responsável por mais de 90% da resistência, em estirpes de
E. coli.. A substituição de um único aminoácido na -lactamase TEM-1 deu origem a um
novo tipo, TEM-2. A modalidade TEM-3, originalmente descoberto em 1989, foi a primeira
ß-lactamase que apresentou o fenótipo ESBL (BRADFORD, 2001). Após isso, muitos outros
derivados de TEM foram relatados, sendo alguns resistentes aos inibidores de -lactamases e
a grande maioria com fenótipos ESBL (LIVERMORE, 1995; BRADFORD, 2001). O fato de
TEM-1 e outros derivados serem mediados por plasmídeos e transposons facilita a
disseminação para outras espécies de bactérias.
Atualmente existem mais de 100 mutações da TEM original (DHILLON & CLARK,
2012). Algumas destas novas ß-lactamases são enzimas resistentes ao inibidor (IRT) e a sua
maioria são ESBLs (NAVARRO et al., 2011). As substituições de aminoácidos ocorrem entre
as enzimas TEM em número limitado de posições e as combinações destas mudanças de
aminoácidos resultam em várias alterações na hidrólise de oximino-cefalosporinas
específicas, como cefotaxima e ceftazidima (BRADFORD, 2001). As TEM--lactamases
resistentes aos inibidores, em sua maioria, surgem independentemente da ação de ESBL,
sendo relativamente inativas contra oximino-cefalosporinas. Porém algumas variantes (TEM50 e TEM-68) retêm ambas as atividades (PATERSON & BONOMO, 2005)
Apesar da maior frequência de ß-lactamases TEM se verificar em estirpes de E. coli e
K. pneumoniae, também são encontradas, cada vez com maior frequência, em outras espécies
de bactérias Gram-negativas como Enterobacter spp., Proteus spp., Salmonella spp.
(BRADFORD, 2001).
1.6.1.2 SHV
A SHV (sulfidrila variável) é a ß-lactamase mais frequentemente isolada em estirpes
de K. pneumoniae e é responsável, nestas espécies, por mais de 20% das resistências à
ampicilina mediadas por plasmídeos (BRADFORD, 2001). Em várias estirpes de K.
pneumoniae, o gene blaSHV-1, encontra-se integrado no cromossoma bacteriano. Apesar de ter
sido posta a hipótese de que o gene que codifica para SHV-1 pode existir fazendo parte de um
transposons, isto nunca foi demonstrado (BRADFORD, 2001). Ao contrário dos tipos TEM,
há relativamente poucas descendências das SHV-1
34
Além disso, as mudanças observadas no gene blaSHV ocorrem em um número menor de
posições dentro do gene estrutural. A maioria das beta-lactamases SHV têm fenótipo ESBL,
com exceção da SHV-4, SHV-10 e SHV-11, e são caracterizadas pela substituição de uma
serina por uma glicina, na posição 238 (PATERSON & BONOMO, 2005). Por outro lado, as
variantes relacionadas às ß-lactamases SHV- 5 também apresentam uma substituição da lisina
por glutamato, na posição 240. O resíduo de serina na posição 238 é fundamental para a
hidrólise eficaz da ceftazidima e o resíduo de lisina é vital para a hidrólise eficiente da
cefotaxima (BRADFORD, 2001).
As ESBLs do tipo SHV, tem sido encontradas em uma ampla variedade de
Enterobacteriaceae e foram reportados surtos de SVH produzidos por Pseudomonas
aeroginosa e Acinetobater spp (PATERSON & BONOMO, 2005).
É importante destacar que SVH-38 tem fraca atividade carbapenemase e produz
moderados aumentos na concentração mínima inibitória (CMI) de imipenem; SHV-2 em
cepas de K. pneumoniae deficientes de porinas pode causar uma diminuição na sensibilidade
ao imipenem (MARTINEZ & CALVO, 2010).
1.6.1.3 CTX-M
Na família de ESBLs plasmídicas, CTX-M, é mais frequente entre isolados de
Salmonela enterica e E. coli, sendo observada também em outras espécies de
Enterobacteriaceae. Esta enzima tem como substrato preferencial a cefotaxima e a
ceftriaxona. As CTX-M-lactamases apresentam cerca de 40% de similaridade com as ßlactamases TEM e SHV. Provavelmente foram originadas a partir da enzima cromossômica
AmpC de Kluyvera ascorbata, uma vez que possuem alto grau de homologia entre
si
(BRADFORD, 2001; BONNET, 2004). Outra característica desta enzima é o fato de ser
melhor inibida pelo tazobactam do que pelo sulbactam ou pelo ácido clavulânico (BONNET,
2004). As CTX-M-lactamases são codificadas por genes transportados por elementos
móveis, tais como sequências de inserção ISCcp1e ISCR1 (PEIRANO & PITOUT, 2010).
A primeira CTX-M-lactamase (CTX-M-1) foi isolada em Munich, na Alemanha
(CefoTaXima – Munich), em1989 tendo, em seguida, ocorrido uma rápida disseminação na
Europa. No continente americano, foi descrita no ano 1990 na Argentina (CTX-M-2) em
cepas de Salmonella resistentes à cefotaxima; no Brasil foram descritas na cidade do Rio de
35
Janeiro, no ano 1998, as enzimas CTX-M-2 em P. mirabilis, CTX-M-9 e CTX-M-16, em E.
coli e CTX-M-8 em E. cloacae, Enterobacter aerogenes e Citrobacter amalonaticus
(BONNET, 2004).
Estudos filogenéticos sobre a família CTX-M reportam 6 principais tipos desta
enzima: i) CTX-M-1 (CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-10, CTX-M-12, CTX-M-15, e FEC-1,
CTX-M-22, CTX-M-23, CTX-M-28), ii) CTX-M-2 (CTX-M-2, CTX-M-4, CTX-M-4L,
CTX-M-5, CTX-M-6, CTX-M-7, CTX-M-20, e TOHO-1), iii) CTX-M-8 (CTX-M-8), iv)
CTX-M-9 (CTX-M-9, CTX-M- 13, CTX-M-14, CTX-M-16, CTX-M-17, CTX-M-19, CTXM-21, CTX-M-27, Toho-2, CTX-M-24), v) CTX-M-25 (CTX-M-25, CTX-M-26) e vi) CTXM-45 (BONNET 2004; ROSSOLIN et al., 2008; LIVERMORE 2012; SENNATI et al, 2012).
Entre os grupos de ESBL, as CTX-M são as mais bem sucedidas em termos de
disseminação e seu impacto é atualmente comparável ou mesmo superior ao impacto das
ESBL tipo SHV e TEM (BONNET, 2004). Atualmente existem mais de 133 variantes de
CTX-M (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1) que têm sido associadas a surtos de
infecções diversas, tanto nos hospitais como na comunidade, sendo particularmente isoladas
em cepas de E. coli de origem urinária (DHILLON & CLARK, 2012). Na atualidade,
diferentes famílias dominantes de CTX-M têm sido encontradas: CTX-M-15 (grupo 1), é
predominante na maior parte da Europa, América do Norte, Oriente Médio e Índia, CTX-M14 (grupo 9) é mais comum na China, Sudoeste da Ásia, e na Espanha e CTX-M-2 (grupo 2) é
predominante na Argentina, Israel e Japão (HAWKEY & JONES, 2009; LIVERMORE,
2012), como sumarizado na Figura 1.10
A CTX-M-15-lactamase tem associação com outras lactamases tais como TEM1 e OXA-1, e com enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMA) tipo aac(6´)-Ib-cr. O
gene aac(6´)-Ib-cr tem a habilidade adicional de acetilar antibióticos do grupo das
fluoroquinolonas, tais como ciprofloxacina e norfloxacina (PEIRANO & PITOUT, 2010;
ROGERS et al., 2011; LIVERMORE, 2012).
O clone chamado ST131 foi identificado por MLST em cepas de E. coli produtoras da
enzima CTX-M-15 e, atualmente, está disseminado ao nível mundial,
sendo reportado na
Europa, em alguns países de Ásia, na África, na América do Norte, na América do Sul e na
Austrália (PEIRANO & PITOUT, 2010; CHONG et al., 2011; LIVERMORE, 2012). Este
clone pandêmico ST131, altamente virulento, tem associação com o sorotipo O25 de E. coli e
pertence ao grupo filogenético B2 (PEIRANO & PITOUT, 2010). Este clone tem a
36
capacidade de causar infecções com padrões de multirresistência antibiótica aos níveis
hospitalar e comunitário, estando associado a cepas de E. coli uropatogênica,s especialmente
(ROGERS et al., 2011; PEIRANO & PITOUT, 2010).
Figura 1.10 Distribuição mundial dos genótipos CTX-M.
Fonte, Hawkey & Jones, 2009
1.6.2 AmpC
Foi a primeira lactamase a conferir resistencia à penicilina, já observada nos anos
de 1940, foi posteriormente chamada AmpC (JACOBY, 2009). São lactamases da clase
molecular C de Ambler (grupo 1 da classificação de Bush-Jacoby-Medeiros) e são chamadas
cefalosporinases. Hidrolizam cefalosporinas de primeira e segunda gerações, incluídas as
cefamicinas, tem menor ação sobre cefalosprinas de terceira geração e são pouco eficazes
sobre cefalosporinas de quarta geração e carbapenêmicos. A cloxacilina, o aztreonam e o
ácido borônico (ácido fenil borônico) inibem as lactamases tipo AmpC, enquanto os
inibidores de lactamases como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam não as
inibem (MARTINEZ, 2009; JACOBY, 2009; BUSH & JACOBY, 2010; NAVARRO et al.,
2011).
Certas bactérias possuem, de forma natural, lactamases tipo AmpC, como
Enterobacter spp., Providencia spp., Morganella morganii, Serratia marcescens, Citrobacter
freundii e Hafnia alvei, assim como bacilos Gram-negativos não fermentadores como
37
Pseudomonas aeroginosa. Estas bactérias produzem AmpC cromossômica induzível e são
naturalmente resistentes às aminopenicilinas, às cefalosporinas de primeira geração, às
cefamicinas (cefoxitina, cefotetan) e às aminopenicilinas combinadas com inibidores de
lactamases (amoxicilina-ácido clavulânico, ampicilina-sulbactam) (MARTINEZ, 2009). E
coli, Shigella spp e Acinetobacter baumannii também possuem lactamases tipo AmpC
cromossômicas, que são constitutivas (não induzíveis). E. coli carece do gene regulador de
expressão ampR, de modo que a expressão de AmpC é regulada por promotores e
mecanismos atenuadores (JACOBY, 2009; MARTINEZ, 2009).
A produção de AmpC pode ser de codificação plasmídica induzível ou não induzível
e cromossômica induzível ou constitutiva (a bactéria carece dos genes ampD ou ampR, que
são reguladores da expressão de AmpC). Quando o gene ampC se expressa de
forma
constitutiva, pode fazê-lo em níveis basais, dando uma característica fenotípica de resistência
natural ou selvagem, ou pode fazê-lo em niveis muito altos (superexpressão de AmpC por
mutações no sistema atenuador e/ou promotor do gen AmpC, ou aquisição de promotores
fortes para a expressão do gen) o que leva a uma produção de grandes quantidades de AmpC
(hiperprodução de AmpC) (NAVARRO et al., 2011). Nas bactérias que expressam o gene
AmpC de forma induzível, a produção de AmpC pode estar desreprimida de forma parcial ou
total (por mutações nos genes reguladores de tipo ampD e ampR), o que leva a uma produção
estável de grandes quantidades de AmpC (hiperprodução total ou parcial de AmpC)
(JACOBY, 2009; MARTINEZ, 2009; NAVARRO et al., 2011).
As cepas desreprimidas ou hiperprodutoras de AmpC, apresentam resistência a todas
as penicilinas, combinações com inibidores de lactamases, cefalosporinas de primeira,
segunda e terceira gerações, cefamicinas e monobactâmicos. Apenas não são afetadas as
cefalosporinas de quarta geração e os carbapenêmicos (PÉREZ & HANSON, 2002;
MARTINEZ, 2009; NAVARRO et al., 2011)
Diferenças nas sequências de aminoácidos deram origem às famílias de AmpC, entre
os quais temos atualmente 95 variantes para CMY, 5 variantes para ACC, 19 variantes para
ACT, 1 variante para CFE, 8 variantes para DHA, 10 variantes para FOX, 1 variante para
LAT,
5
variantes
para
MIR
e
8
variantes
para
MOX
(http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1) (PÉREZ & HANSON, 2002; JACOBY,
2009). De todas as variantes encontradas até o momento, a variante CMY-2 é a mais
prevalente e amplamente distribuída no mundo (JURE et al., 2011).
38
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Estabelecer as características moleculares e de resistência bacteriana aos antibióticos
lactâmicos de estirpes de Eschericha coli uropatogênica (UPEC) isoladas de cultura de
urina recuperadas na cidade de Quito – Equador.
1.2 Objetivos específicos
 Determinar o perfil fenotípico de resistência das UPEC aos antibióticos usados no
Equador para tratamento das ITU.
 Pesquisar a produção fenotípica de lactamases (ESBL- AmpC)
 Realizar a classificação dos grupos filogenéticos das UPEC por técnicas moleculares
como PCR.
 Pesquisar a presença dos genes codificadores das betalactamases tipo blaTEM, blaSHV,
blaCTX-M, blaAMPC através de técnicas moleculares como PCR e sequenciamento
genômico.
 Avaliar o polimorfismo genético das amostras de E. coli uropatogênica através da
análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após eletroforese em
campo pulsado (PFGE).
39
3. MATERIAIS E METODOS.
3.1 Coleta e transporte das amostras
Foram analisadas 156 amostras de Escherichia coli uropatogênicas, obtidas no período
compreendido entre 01 de julho de 2010 a 31 de dezembro de 2011, pertencentes e estocadas
no Departamento de Microbiologia do Instituto Nacional de Higiene e Medicina Tropical
“Leopoldo Izquieta Perez”, Regional Norte, na cidade de Quito, Equador (INHMT-LIP-RN),
com autorização prévia da direção da instituição. Estas amostras de E. coli uropatogênica
foram recuperadas de cultura de urina de pacientes com sexo, idade e origem diferentes
(comunitária e hospitalar), provenientes de Unidades Médicas da Saúde e hospitais
pertencentes ao Ministério da Saúde do Equador. Todas as amostras de urina estocadas
apresentaram contagem de bactérias igual ou superior a 105 UFC/mL e foram identificadas
através de testes bioquímicos convencionais, sendo realizados também testes de
susceptibilidade aos antibióticos lactâmicos usados no tratamento de infecções urinárias.
As 156 cepas de E. coli uropatogênicas selecionadas apresentavam resistência a dois ou mais
dos antibióticos testados.
Para o transporte das amostras do Laboratório do INHMT-LIP-RN em Quito, Equador
até o Laboratório de Pesquisa em Infecções Hospitalar no IOC/FIOCRUZ, as cepas foram
estocadas em meio de transporte de agar nutriente em microtubos,
empacotadas em
embalagem com isolamento triplo e rotuladas devidamente, cumprindo com as normas de
transporte recomendadas pela IATA. As embalagens usadas para o transporte foram as
indicadas pela CIBIO - IOC e fornecidos pelo IOC/FIOCRUZ.
A obtenção das cepas de E. coli uropatogênicas, foi autorizada pela Direção Nacional
do Instituto de Higiene e Medicina Tropical “Leopoldo Izquieta Perez” Regional Norte-Quito,
mediante ofício 01732-2011-DINHMT-RN, com data 26 de agosto do ano 2011. O transporte
das cepas do Equador ao Brasil foi autorizado pela Subsecretaria Nacional de Vigilância e
Controle Sanitário do Ministério de Saúde Pública do Equador, mediante ofício 000228, com
data de 24 de janeiro do ano 2012.
40
3.2 Identificação de Escherichia coli uropatogênica
No Laboratório de Pesquisa em Infecção Hospitalar do IOC, as amostras foram
semeadas em ágar EMB (Ágar Eosina Azul de Metileno), que é o meio adequado para a
detecção e diferenciação de bactérias Gram-negativas. As placas foram incubadas na estufa a
37 oC por 24 horas para crescimento bacteriano.
Foram analisadas a morfologia e a coloração apresentadas pelas colônias, observandose na maioria o brilho metálico característico de E coli.
Figura 3.1 Morfologia das colônias de E. coli. Fonte, LAPIH
Uma das colônias de cada placa foi selecionada para ser submetida às provas
bioquímicas básicas de identificação para Enterobactérias, tais como: fermentação de glicose,
lactose ou sacarose e produção de gás visualizadas no meio de TSI (Agar-Ferro-Triplo
Açúcar) - OXOID, prova da mobilidade, produção de H2S e produção de Indol, realizadas no
meio de SIM (Sulfato-Indol-Motilidade) – OXOID, prova de utilização do citrato como fonte
de carbono realizada no Ágar Citrato de Simmons – OXOID, prova de produção de urease
no meio de Ágar Uréia - OXOID e prova da Oxidase. Após as semeaduras nestes meios,
incubou-se novamente e colocou-se na estufa a 37 oC por mais 18 a 24 horas, para serem
lidas no próximo dia, confirmando-se a identificação. Para o controle de qualidade dos testes
foi realizado utilizanda a cepa padrão E. coli ATCC® 25922, P. aeruginosa ATCC® 27853 e
E.faecalis ATCC® 29212).
41
Figura 3.2 Testes bioquímicas de identificação de E. coli. Fonte, LAPIH
3.3 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos.
A susceptibilidade dos micro-organismos isolados foi testada através de difusão em
ágar (disco-difusão), seguindo-se as recomendações do Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI, 2011). Para os testes de difusão em ágar, uma alçada das colônias do meio de
TSI foi transferida para uma solução salina e a suspensão foi comparada com o padrão de
turvação 0,5 da escala de Mac Farland. Em seguida, foi realizada a semeadura no meio de
ágar Muller-Hinton e os discos de antibióticos (Oxoid/Basingstoke, Hampshire, England)
próprios para bactérias Gram-negativas foram introduzidos.
Os antimicrobianos testados foram: cefepime, cefotaxima, ceftazidima, aztreonam,
cefoxitina,
ampicilina,
cefalotina,
ertapenem,
amoxicilina/ácido
clavulânico,
trimetoprim/sulfametoxazol, ciprofloxacina e gentamicina. Na Tabela 7, estão listados os
antibióticos lactâmicos utilizados.
42
Tabela 3.1 Antibióticos lactâmicos utilizados nos teste
de resistência.
Antibióticos
Concentração (ug)
Amoxicilina/ ácido clavulânico
20/10
Ampicilina
10
Aztreonam
30
Cefalotina
30
Cefepime
30
Cefotaxima
30
Cefoxitina
30
Ceftazidima
30
Ciprofloxacina
5
Ertapenem
30
Gentamicina
10
Trimetoprim/Sulfametoxazol
1,25/23,75
As placas foram colocadas em estufa a 35 oC por 16 a 18 horas. O resultado do teste
de difusão em ágar para avaliação da resistência aos antibióticos foi obtido através da medida
do halo de inibição de crescimento provocado pelos discos de antibióticos colocados nas
placas semeadas. De acordo com o diâmetro do halo de inibição foi possível verificar se a
bactéria era sensível, apresentava resistência intermediária ou era resistente aos antibióticos
lactâmicos testados. Os diâmetros da zona de inibição são particulares para cada droga e
micro-organismo, sendo comparados com os diâmetros padronizados pelo CLSI 2011. É
importante ressaltar que os resultados de resistência intermediária foram considerados como
resistentes e foram analisados conjuntamente com as cepas que apresentaram resistência.
A resistência fenotípica ao trimetoprim/sulfametoxazol (SXT), ciprofloxacina (CIP) e
gentamicina (CN) também foi avaliada, já que estes antibióticos são medicamentos utilizados
comumente no tratamento empírico das infecções do trato urinário não complicado. A Figura
3.3 ilustra resultados dos testes de sensibilidade realizados.
43
Figura 3.3 Antibiograma realizado pelo método de difusão em ágar. Fonte, LAPIH
3.4 Detecção fenotípica de ESBL e AmpC
Para a detecção fenotípica da produção de ESBL foi empregado o teste de Jarlier
(1988) e as recomendações do CLSI 2011. No teste de Jarlier, o preparo da suspensão e o
inóculo em placa Agar Muller-Hinton-OXOID são realizados da mesma maneira como no
teste de susceptibilidade descrito anteriormente. Foi colocado no centro da placa um disco de
amoxicilina/ ácido clavulânico (AMC 20/10 µg) e ao entorno do disco de AMC foram
colocados discos de ceftazidima (CAZ 30 µg), cefotaxima (CTX 30 µg), cefepime (FEP 30
µg) e aztreonam (ATM 30 µg) a uma distância de 2 cm. Foi acrescentado o disco de
cefoxitina (FOX 30 µg) para as possíveis estirpes produtoras da lactamase AmpC (Figura
3.4-A) As placas foram colocadas na estufa a 35 oC por 16 a 18 horas. Após a incubação foi
realizada a leitura.
A suspeita de produção de ESBL foi dada pela resistência ou diminuição dos halos de
inibição para cefalosporinas de amplo espectro CTX, CAZ e ATM seguindo a recomendações
do CLSI 2011 (Tabela 3.2) e pelo efeito sinérgico produzido entre as cefalosporinas de amplo
espectro e/ou monobactâmicos (ATM) com o disco de amoxicilina/ácido clavulânico
estrategicamente colocado, (Figura 3.4-B).
44
Tabela 3.2 Halos de inibição sugestivos de ESBL para E coli (CLSI 2011).
Antibiótico
Concentração
Interpretação convencional dos halos
Halos sugestivos de
dos discos
de inibição (mm)
ESBL
R
I
S
Aztreonam
30 ug
</=15
16-21
>/=22
</=27 mm
Cefotaxima
30 ug
</=14
15-22
>/=23
</=27 mm
Ceftazidima
30 ug
</=14
15-17
>/=18
</=22 mm
A produção da lactamase tipo AmpC foi suspeitada pela sensibilidade intermediaria
ou resistência à cefoxitina (FOX), amoxicilina/ácido clavulânico, e/ou cefalosporinas de
terceira geração, junto com sensibilidade a cefepime (FEP). O aztreonam é um inibidor da
lactamase tipo AmpC, de modo que interrompe a continuidade do halo de resistência à
cefoxitina, sendo este um critério de suspeita de produção desta lactamase. É importante
indicar que os isolados produtores de AmpC plasmidial apresentam colônias dispersas pelos
bordos dos halos de inibição do aztreonam (Figura 3.4-C).
A
B
C
Figura 3.4 Detecção fenotípica de: ESBL (B) e AmpC (C).
ATM, aztreonam; FOX, cefoxitina, CTX, cefoxitina; CAZ, ceftazidima, FEP, cefepime;
AMC, amoxicilina/ácido clavulânico). Fonte, LAPIH
45
3.5 Quantificação da concentração minima inibitoria (CMI)
A CMI ou MIC é a concentração mínima de uma antibiótico necessária para inibir o
crescimento bacteriano de 105 UFC/µL de um microorganismo após a inoculação e
incubação. Para a determinação da CMI, o preparo da suspensão e o inóculo em placa de Ágar
Mueller-Hinton marca OXOID são realizados da mesma maneira como no teste de
susceptibilidade descrito anteriormente. Usaram-se tiras de Etest BioMérieux para o
diagnóstico in vitro, contendo os antibióticos cefotaxima e ceftazidima em diferentes
gradientes de concentração (0,016 – 256 µg/mL). As tiras foram colocadas juntas na mesma
placa de ágar para avaliação das cepas produtoras de ESBL e incubadas na estufa a 35 oC, por
16 a 18 horas. Após a incubação foi realizada a leitura da área de inibição elíptica dos
antibióticos. Para a interpretação dos resultados, usaram-se as recomendações do CLSI 2011.
Figura 3.5 Avaliação do CMI para cefotaxima (CT) e ceftazidima (TZ). Fonte, LAPIH.
Para a ceftazidima, foram considerados resistentes aos resultados com valores de CMI
igual ou maior a 16 ug/mL, intermediaria com variações de CMI acima 4 e abaixo de 16
µg/mL e sensível os valores de CMI menores ou iguais a 4 ug/mL.
Para cefotaxima foram considerados resistentes aos resultados com valor de CMI igual
ou maior a 4 ug/mL, intermediários com variações acima de 1 e abaixo de 4 ug/mL, e
sensíveis os valores iguais ou menores que 1 ug/mL, como demonstrado na Figura 3.5
46
3.6 Extração e quantificação de DNA
A extração de DNA foi realizada pelo método do tiocianato de guanidina (CaetanoAnolles e Gresshoff, 1997). Uma colônia de cada amostra fenotipicamente caracterizada
como produtora de ESBL e/ou AmpC, proveniente de ágar Muller-Hinton, foi inoculada em 3
ml de caldo BHI (Brain Heart Infusion ) com agitação “overnight” a 37oC para o crescimento
bacteriano. Ao segundo dia, as bactérias em caldo BHI foram transferidas para um microtubo
e centrifugadas a 10.000 RPM por 10 minutos, desprezando-se o sobrenadante. Adicionou-se
1ml de NaCl 1M no microtubo, agitando-se no vórtex para ressuspender-se o “pellet”,
centrifugou-se novamente eliminou-se o sobrenadante (este processo foi repetido por duas
vezes). O pellet foi ressuspendido em 100 ul de tampão TE (TRIS-HCl 10 mM pH 8.0,
EDTA 0,1 mM pH 8.0), adicionou-se 500uL de solução de guanidina e homogeneizou-se por
inversão (mais ou menos 20 vezes). Após este procedimento, incubou-se no freezer por 5
minutos. Adicionou-se 500 uL de solução de Clorofórmio-Álcool-Isoamílico, agitou-se no
vórtex até homogeneizar e obter-se uma solução leitosa. Centrifugou-se esta solução leitosa a
13000 RPM por 10 minutos. Retirou-se 750uL da parte superior da solução centrifugada e
transferiu-se a um novo eppendorf que continha 380uL de isopropanolol. Os tubos foram
deixados no freezer a -20 oC “overnight”. No terceiro dia, a solução foi centrifugada a 13.000
RMP por minuto e o sobrenadante desprezado. O DNA obtido localiza-se no fundo do
eppendorf como um pequeno “pellet”. Seguiu-se a adição de 150 uL de álcool 70% e
centrifugação nas mesmas condições, desprezando-se o sobrenadante (repetiu-se por 2 vezes).
O último sobrenadante foi desprezado, permitindo-se que o “pellet” secasse naturalmente em
temperatura ambiente no eppendorf. Como último passo, o “pellet” foi dissolvido em 100 uL
de TE (TRIS-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 0,1 mM pH 8.0) e incubado em estufa ou banho
maria a 37 oC por 3 horas. O DNA extraído foi finalmente acondicionado em freezer -20 oC.
Realizou-se a quantificação do DNA extraído de todas as amostras, em
espectrofotômetro “GeneQuant pro”, usando a cubeta 80-2103-69 e com diluição de amostra
de 1/10, calibração (pathlength 5mm; unidades, ng/uL), obtendo-se a concentração e pureza
do DNA de cada amostra. Após as leitura das concentrações de DNA fez-se estoque com uma
concentração de 25ng em 5 uL (25ng/5uL). Um volume de 5uL, a partir do estoque de DNA,
foi utilizado em cada reação de PCR. A leitura e a diluição do DNA para o estoque de cada
amostra estão apresentadas na Tabela 3.3.
47
Tabela 3.3 Concentração e pureza do DNA das 35 cepas positivas
fenotipicamente como produtoras de lactamases.
CEPAS
CONCENTRAÇÃO DNA
(ng/ul)
PUREZA ADN
Absorvência
260/280
9241
9246
9247
31
87
73
9252
9264
9267
9269
9271
9276
9278
9279
9286
9292
9293
9307
9308
9309
9318
9319
9323
9328
9332
9334
9338
9348
9358
9360
9365
9371
9372
9379
9386
9389
9390
9397
27
25
65
58,5
106
30
30
33
57
100
34
99
48,5
54
72
105
66
51
60,5
42,5
35,5
40
83,5
64,5
52
39
114,5
31
37
29
108,5
116,5
Diluição de ADN
Volumem
Concentração
DNA (uL)
água MiliQ
(uL)
Volumem
STOCK
(25ng/5uL)
1,203
1,5
2,147
16,1
5,7
6,8
83,9
94,3
93,2
100,0
100,0
100,0
2
1,923
1,9
2,127
1,9
2
1,906
2,539
2,111
2,041
2,06
2,157
1,902
2,25
2
2,143
2,2
2,318
1,63
2,073
2,088
2
2,114
1,897
1,094
1,529
1,59
1,348
1,947
2,32
1,709
1,607
18,5
20,0
7,7
8,5
4,7
16,7
16,7
15,2
8,8
5,0
14,7
5,1
10,3
9,3
6,9
4,8
7,6
9,8
8,3
11,8
14,1
12,5
6,0
7,8
9,6
12,8
4,4
16,1
13,5
17,2
4,6
4,3
81,5
80,0
92,3
91,5
95,3
83,3
83,3
84,8
91,2
95,0
85,3
94,9
89,7
90,7
93,1
95,2
92,4
90,2
91,7
88,2
85,9
87,5
94,0
92,2
90,4
87,2
95,6
83,9
86,5
82,8
95,4
95,7
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
48
3.7 Reações de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
3.7.1 Reação de PCR para classificação filogenética
A reação da PCR (reação em cadeia da polimerase) foi realizada em um volume final
de 25uL. As reações individuais foram compostas de: 12,5uL de READYMIXES SIGMA
(Buffer 10X, 25mM de MgCl2, 0,2 mM DE dNTP, 0,75 U da enzima Taq polimerase), 15
pmol de cada iniciador, 5,5uL de água milliq e 25ng (5uL) de DNA obtido pelo método do
tiocianato de Guanidina. As reações de PCR foram realizadas de forma individual para cada
gene, usando o BIO-RAD T100TM Thermal cycler. Os iniciadores (“primers”) utilizados na
classificação filogenética das UPEC estão apresentados na tabela 3.4.
Tabela 3.4 Iniciadores utilizados na classificação filogenética de E. coli.
1
Sequência do iniciador
( 5’  3’)
GACGAACCAACGGTCAGGAT
2
TGCCGCCAGTACCAAAGACA
1
TGAAGTGTCAGGAGACGCTG
Genes
chuA
Tamanho
(pb)
Referência
Bibliográfica
279
YjaA
211
2
ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC
1
GAGTAATGTCGGGGCATTCA
2
CGCGCCAACAAAGTATTACG
TspE4C2
CLERMONT. et al,
2002
152
As condições de PCR foram: Desnaturação inicial, 1 ciclo de 94oC por 5 minutos; 30
ciclos: desnaturação a 94oC por 30 segundos; anelamento a 55oC por 30 segundos; extensão a
72 oC por 30 segundos; seguidos de uma extensão final a 72 oC por 7 minutos. Dois produtos
(amostras) positivas para cada gene, chuA, yjaA, e TspE4C2 foram purificados com GFX e
sequenciados na Plataforma DNA- PDTIS do Laboratório de Sequenciamento e
Bioinformática do IOC- FIOCRUZ.
Foi realizado PCR para o gene chuA a todas as cepas positivas fenotipicamente para
lactamases, o que permite distinguir entre os grupos B2 ou D. Nas cepas positivas para
chuA, foi realizada PCR para o gene yjaA, poisa presença deste gene permite classificar as
cepas positivas dentro do grupo filogenético B2 e as cepas negativas dentro do grupo
filogenético D. Nas amostras negativas para chuA foi realizada PCR para o gene TspE4.C2,
49
pois a presença deste fragmento de DNA permite classificar as cepas dentro do grupo
filogenético B1 e a sua ausência permite classificá-las no grupo A. (Tabela 15)
3.7.2. Detecção de blaTEM, blaSHV, blaCTX-M., blaCTX-M.-15
A reação da PCR foi realizada em um volume final de 25uL. As reações individuais
foram compostas de: Tampão de reação 1X (5uL); 1,5mM de MgCl2 (1,5uL); 0,25mM de
dNTP (1uL); 2,5U da enzima Taq polimerase (0,25uL); 20 pmol (1uL) de cada iniciador;
10,25uL de água MilliQ e 25ng (5uL) de DNA. As reações de PCR foram realizadas de
forma individual para cada gene, usando o BIO-RAD T100TM Thermal cycler. Os iniciadores
“primers” utilizados na amplificação das lactamases tipo ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M.,
blaCTX-M.-15) estão apresentados na tabela 3.5; e as condições de PCR para cada gene estão
indicadas na tabela 3.6
Tabela 3.5 Iniciadores utilizados nas reações de PCR para lactamases tipo ESBL
-
Genes
lactamases
Tamanho
Referência
( 5’  3’)
(pb)
Bibliográfica
F ATGTGCAGYAACCAGTAARGTKATGG
CTX-M
blaCTX-M
593 pb
R TGGGTRAARTARGTSACCAGAAYCAGCGG
SHV
TEM
CTX-M-15
blaSHV
blaTEM
blaCTX-M15
F
TTATCTCCCTGTTAGCCACC
797 pb
R
GATTTGCTGATTTCGCTCGG
F
GCGGAACCCCTATTTG
859 pb
R
ACCAATGCTTAATCAGTGAG
F
GGAATCTGACGCTGGGTAAA
R
AGAATAAGGAATCCCATGGTT
50
875 pb
MULVEY et
al., 2003
HASMAN et al,
2005
HASMAN et al,
2005
MENDONÇA
et al, 2007
Tabela 3.6 Condições de PCR para amplificação dos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M,,
blaCTX-M-15,
Gene
Condições de PCR.
blaCTX-M
Desnaturação inicial: 94ºC / 5 minutos.
30 ciclos: desnaturação (94ºC / 45 seg),
anelamento (61ºC / 45 seg) e extensão (72ºC /
45 seg)
Extensão final (72ºC / 10 min)
MULVEY et al., 2003
blaCTX-M-15
Desnaturação inicial: 94ºC / 5 minutos
30 ciclos: desnaturação (94ºC / 45 seg),
anelamento (50ºC / 45 seg) e extensão (72ºC /
45 seg)
HASMAN et al., 2005
blaSHV
35 ciclos: desnaturação (94ºC / 1 min),
anelamento (51ºC / 1 min) e extensão (72ºC /
1 min)
HASMAN et al., 2005
blaTEM
35 ciclos: desnaturação (94ºC / 1 min),
anelamento (53ºC / 1 min) e extensão (72ºC /
1 min)
HASMAN et al., 2005
Referência Bibliográfica
Os produtos positivos dos genes blaCTX-M, blaCTX-M.-15 foram purificados com Kit GFX
(GE) e sequenciados na Plataforma DNA- PDTIS do Laboratório de Sequenciamento e
3.7.3 Detecção de blaAMPC
A reação da PCR foi realizada em um volume final de 25uL. As reações individuais
foram compostas de: 12,5uL de READYMIXES SIGMA (Buffer 10X, 25mM de MgCl2, 0,2
mM DE dNTP, 0,75 U da enzima Taq polimerase); 5,5uL de água MilliQ; 25ng (5uL) de
DNA obtido pelo método do tiocianato de guanidina; 6 pmol dos primers MOXM, CITM,
DHAM; 5 pmol dos primers AACM, EBCM; e 4 pmol do primer FOXM. As reações de PCR
foram realizadas de forma individual para cada gene, usando o BIO-RAD T100TM Thermal
cycler. Os iniciadores utilizados na amplificação da de lactamases tipo AmpC (blaAMPC)
estão apresentados na tabela 3.7
51
Tabela 3.7 Iniciadores utilizados nas reações de PCR para lactamases tipo AmpC
lactamase
Enzima
MOX-1,
MOX-2,
CMY-1,
CMY-8 a
CMY-11
LAT-1 a
LAT-4,
CMY-2
CMY-7
BIL-1
Primers
MOXMF
Tamanho
Referência
( 5’  3’)
(pb)
Bibliográfica
GCT GCT CAA GGA GCA CAG GAT
520
MOXMR
CAC ATT GAC ATA GGT GTG GTG C
CITMF
TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA
462
CITMR
TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC
DHAMF
AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T
DHA-1,
DHA-2
405
DHAMR
CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC
ACCMF
AAC AGC CTC AGC AGC CGG TTA
2002.
AMPC
ACC
346
ACCMR
TTC GCC GCA ATC ATC CCT AGC
EBCMF
TCG GTA AAG CCG ATG TTG CGG
MIR-1
ACT-1
FOX-1 a
FOX-5b
Perez & Hanson,
302
EBCMR
CTT CCA CTG CGG CTG CCA GTT
FOXMF
AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G
190
FOXMR
CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG
As condições de PCR para amplificação do gene blaAMPC foram: 1 ciclo de 94oC por 3
minutos; 25 ciclos térmicos: 94oC por 30 segundos; 64oC por 30 segundos; 72 oC por 60
segundos; 1 ciclo de 72oC por 7 minutos para a extensão final.
Todos os produtos positivos dos genes blaAMPC foram purificados com Kit GFX (GE)
e sequenciados na Plataforma DNA- PDTIS do Laboratório de Sequenciamento e
52
3.7.4 Eletroforese em gel de agarose.
Todos os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose. Os géis foram
preparados dissolvendo-se a agarose em um tampão TBE 0,4X de modo a obter-se uma
concentração de 1,5%. Foram utilizados 6uL do produto amplificado de cada gene para esta
análise. A eletroforese ocorreu a 90 V por 70 minutos em tampão TBE 0,4X. Usou-se peso
molecular de 100pb DNA lader (GIBCO BRL Life Technologies). Os géis foram corados em
brometo de etídio (0,5ug/ml) durante 15 minutos e descorados em água por mais 15 minutos,
visualizados sob luz ultravioleta e fotografados, utilizando-se o equipamento Image Quant
300-GE- Healthcare.
3.8 Análise do polimorfismo do DNA genômico.
Com o objetivo de se avaliar o polimorfismo genético das amostras de E. coli
uropatogênica através de eletroforese em campo pulsado (Pulsed-Field Gel Electrophoresis –
PFGE), foram selecionadas todas as amostras com um padrão fenotípico de produção de
lactamases tipo ESBL e AmpC. Foi processado e analisado um total de 35 amostras.
Os isolados foram semeados em tubos com ágar nutriente inclinado e incubados a
37oC por 24 horas para crescimento bacteriano. Após a incubação, foi preparada uma
suspensão bacteriana, adicionando 1 mL de BSC (EDTA 0,5M pH 8.0; TRIS-HCI 1M pH 8)
até alcançar-se o padrão de turvação 3 da escala de Mac Farland. Em seguida, 200uL da
suspensão foram transferidos para
microtubos contendo 5uL de proteinase K (50mg/uL).
Foram adicionados à suspensão de células 200uL de agarose 1% (0,1g de agarose low
melting, 0,5 mL de SDS 1%; 9,4 mL de TE [TRIS-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 0,1 mM Ph
8.0]). Esta mistura é homogeneizada e distribuída em molde. Após a solidificação dos blocos
de agarose contendo DNA bacteriano (insertos), os mesmos foram transferidos para tubos
falcon contendo 2 ml de solução de lise (NaCl 1M, TRIS-HCl 6mM pH 7.6, EDTA 100 mM
pH 8.0, BRIJ-58 0,5%, desoxicolato 0,2%, sarcosina 0,5%, lisozima 1mg/mL) e 5 uL de
proteinase K (50mg/uL) e incubados em banho maria a 50oC por 2 horas. Após a incubação,
os blocos foram lavados 3 vezes com 10mL de água MilliQ a 50oC por 15 minutos e uma vez
com 8mL de tampão TE a 50oC por 15 minutos. Finalmente os insertos foram deixados nos
tubos falcon com 2mL de TE e guardados na geladeira.
53
Os blocos foram transferidos para microtubos contendo solução de tampão da enzima
XbaI (90 uL de água MilliQ e 10 uL de solução de tampão da enzima) e incubada a 4 oC por
30 minutos. Posteriormente, os insertos foram tratados com enzima de restrição XbaI (40U)
(Roche / Fermentas) por 3 horas a 37oC. Os fragmentos de restrição foram separados em gel
de agarose a 1,1% preparado em TBE 0,4X (TRIS 44,5 mM ácido bórico 44,5 mM, EDTA 1
mM pH 8.3), através de eletroforese de campo pulsado, utilizando-se o sistema CHEFFDRIII (Bio-Rad, Richmond, EUA). Foram utilizadas as seguintes condições para a
eletroforese: tempo de pulso crescente 0,5 a 35 segundos, por 16 horas a 6V/cm, na
temperatura de 14oC. Foram utilizados padrões de peso molecular Lambda DNA Leader pulse
(50-1000 Kb – Sigma) em cada corrida
Após as corridas, os géis foram corados com brometo de etídio, visualizados sob luz
ultravioleta e fotografados, utilizando-se ferramentas de fotodocumentação Image Master
VDS (Pharmacia Biotech). As análises dos géis e a confecção dos dendrogramas foram
realizadas com o software GelCompar II (Applied Maths, KortrijK, Belgium). Os
agrupamentos foram realizados utilizando o coeficiente de Dice (Opt:1,5%) (Tol:1,5% 1.5%).
3.9 Análise dos dados
Os dados obtidos nos experimentos e nos testes realizados neste trabalho foram
processados e analisados com auxilio do software Epi Info versão 3.5.1 (Center for Desease
Control and Prevention, Atlanta, EUA) e Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft).
54
4. RESULTADOS
4.1 Análise de dados dos pacientes
Foram coletados os dados dos 156 pacientes, os quais estavam registrados nos
informes diários do Laboratório de Microbiologia do Instituto de Higiene da cidade de Quito.
Os dados coletados de cada paciente foram: sexo, idade e origem (comunitária ou hospitalar).
As amostras de E. coli uropatogênicas obtidas no exame de cultura de urina destes pacientes
foram estocadas no laboratório do INHMT-LIP. As amostras de origem hospitalar são
provenientes de sete hospitais, todos da cidade de Quito, com um total de 23,1% (36/156) e a
maioria é proveniente do Hospital Eugenio Espejo, com 58,3% (21/36). As amostras
comunitárias são provenientes das Unidades de Saúde Pública, e representam 76,9%
(120/156) do total da amostragem. Na Tabela 4.1 temos a origem das amostras.
Tabela 4.1. Distribuição da origem das cepas de E. coli uropatogênicas
36 (23,1)
Hospitais
Hospital Eugenio Espejo
21
Hospital Gineco-Obstétrico Isidro Ayora
2
Hospital Gonzalo Gonzáles
3
Hospital San Lazaro
4
Hospital Regimiento Quito No1 - Policia
2
Hospital Militar
2
Hospital de Nanegalito
1
Hospital Jose Maria Velasco Ibarra
1
120 (76,9)
Comunitárias
TOTAL
156
As infecções urinárias afetam principalmente as mulheres, classificando-se as
amostras analisadas por sexo, observou-se que 87,8% (137/156) pertenciam a mulheres,
12,2% (19/156) eram de homens. Quanto aos grupos etários, a idade compreendida entre os
15 e 49 anos foi mais representada com 52,6% (82/156).
Nos homens, a ITU tem relação com a idade avançada e com alterações da fisiologia
das vias urinárias. Observamos casos de ITU nos pacientes em pessoas do sexo masculino
55
acima dos 50 anos com 6,4% (10/156). Na Tabela 4.2 temos a distribuição dos casos de ITU
por idade e sexo.
Idade
<1
1 a 14
15 a 49
> 50
Total
Tabela 4.2 Distribuição da ITU por grupos etários
Homens
%
Mulheres
%
Total
3
(1,9)
8
(5,1)
11
2
(1,3)
6
(3,8)
8
4
(2,6)
78
(50,0)
82
10
(6,4)
45
(28,8)
55
19
(12,2%)
137
(87,8)
156
%
(7,1)
(5,1)
(52,6)
(35,3)
(100)
4.2 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
Quanto aos testes de susceptibilidade, estes foram realizados nas 156 amostras. Os
resultados possibilitaram estimar o percentual de susceptibilidade das E. coli uropatogênicas
aos antibióticos lactâmicos. Estes dados contribuem para o estabelecimento de critérios
para escolha do antibiótico apropriado para o tratamento empírico nas infecções do trato
urinário. Os resultados sugerem, na amostra estudada, uma alta taxa de resistência para
ampicilina, com 87,8% (137/156), para trimetroprim/sulfametoxazol, com 77,5% (121/156),
para ciprofloxacina, 50,6% (79/156) e para cefalotina, com 48,1% (75/156), o que sugere que
estes antibióticos não devam ser utilizados, na região onde foram obtidas as amostras, como
tratamento empírico das ITU. As amostras com resistência intermediária foram incluídas
como resistentes. Tabela 4.3
Tabela 4.3 Frequência de resistência nas 156 cepas de E. coli uropatogênica.
Resistência
51
137
23
75
12
30
12
20
79
0
35
121
Antibiótico
Amoxicilina/Ácido clavulânico
Ampicilina
Aztreonam
Cefalotina
Cefepime
Cefotaxima
Cefoxitina
Ceftazidima
Ciprofloxacina
Ertapenem
Gentamicina
Trimetroprim/Sulfametoxazol
56
(%)
(32,6)
(87,8)
(14,7)
(48,1)
(7,7)
(19,2)
(7,6)
(12,8)
(50,6)
0
(22,4)
(77,5)
Foi
realizado
o
perfil
de
co-resistência
entre
antibióticos
lactâmicos,
ciprofloxacina, gentamicina e trimetroprim/sulfametoxazol, observando-se um perfil de
resistência mista em várias cepas, principalmente na resistência aos antibióticos
lactâmicos/SXT, com 30,8% (48/156), aos lactâmicos/SXT/CIP, com 22,4% (35/156)
e aos lactâmicos/SXT/CN/CIP, com 14,7% (23/156), como demonstrado naTabela 4.4.
Tabela 4.4 Perfil de co-resistência aos antibióticos nos 156 isolados de
Escherichia coli
No cepas
Origem
Perfil co-resistência antibiótica
N (%)
Hospital Comunitário
lactâmicos
14 (9,0)
1
13
lactâmicos-CIP
9 (5,8)
3
6
lactâmicos-CN
2 (1,3)
0
2
lactâmicos -CN-CIP
4 (2,6)
2
2
lactâmicos -SXT
48 (30,8)
7
41
lactâmicos -SXT-CIP
35 (22,4)
12
23
lactâmicos -SXT-CN
5 (3,2)
1
4
23 (14,7)
9
14
CIP
3 (1,9)
0
3
SXT
7 (4,5)
0
7
SXT-CIP
5 (3,2)
1
4
SXT-CN-CIP
1 (0,6)
0
1
lactâmicos -SXT-CN-CIP
156
36
120
Total
CIP, ciprofloxacina; CN, gentamicina; SXT, trimetroprim/Sulfametoxazol
A resistência foi classificada pela origem das amostras, encontrando-se uma
frequência maior de resistência para antibióticos lactâmicos, SXT e ciprofloxacina nas
amostras
provenientes
amoxicilina/acido
dos
hospitais.
clavulânico,
Entretanto,
cefalosporinas
antibióticos
de
como
ampicilina,
primeira
geração,
trimetoprim/sulfametoxazol e ciprofloxacina apresentaram taxas deresistência muito altas
tanto nos hospitais e quanto na comunidade. Quanto aos resultados dos testes de significância,
há diferença estatística significativa entre as freqüências de resistência entre as amostras
hospitalares e comunitárias, principalmente na resistência à amoxicilina/acido clavulânico, à
cefalotina, à cefotaxima, à ceftazidima e à ciprofloxacina. Todas as amostras hospitalares e
comunitárias foram sensíveis para o carbapenêmico testado (ertapenem). Na Tabela 4.5 temos
57
a resistência aos antibióticos testados, nos níveis hospitalar e comunitário e a significância
estatística da comparação.
Tabela 4.5 Frequência da resistência antibiótica nos hospitais e na comunidade
Hospital
(n=36)
Resistencia (%)
20 (55,6)
Comunidade
(n-=120)
Resistencia (%)
31 (25,8)
Ampicilina
34 (94,4)
Aztreonam
Total
Valor
de p
51
0.000855
103 (85,5)
137
0.2734
10 (27,8)
13 (10,8)
23
0.0119
Cefalotina
25 (69,4)
50 (41,7)
75
0.0034
Cefepime
6 (16,7)
6 (5,0)
12
0.0515
Cefotaxima
13 (36,1)
17 (14,2)
30
0.0034
Cefoxitina
4 (11,1)
8 (6,7)
12
0.6023
Ceftazidima
9 (25,0)
11 (9,2)
20
0.0272
Ciprofloxacina
27 (75)
52 (43,3)
79
0.000892
0
0
0
-
Gentamicina
12 (33,3)
23 (19,2)
35
0.07487
Trimetroprim/Sulfametoxazol
30 (83,3)
91 (75,8)
121
0.3441
Antibiótico
Amoxicilina/Ácido clavulânico
Ertapenem
4.3 Deteção fenotipica de ESBL e AmpC
Das 156 cepas submetidas ao teste fenotípico, 22,4% (35/156) apresentaram um perfil
de resistência com possível produção de -lactamases de tipo ESBL e/ou AmpC. Na triagem
fenotípica geral foram encontradas 14,7% (23/156) positivas para ESBL, 3,2% (5/156)
positivas para AmpC e 4,5% (7/156) das amostras apresentaram co-resistência fenotípica para
as duas -lactamases estudadas. O valor de p mostra significância estatística em relação à
maior freqüência de positividade fenotípica para produção de -lactamases nas amostras
hospitalares (p = 0,0249). A Tabela 4.6 indica a porcentagem de cepas produtoras de ESBL
nos hospitais e na comunidade.
58
Tabela 4.6 Frequência fenotípica das -lactamases nos hospitais e na comunidade
Hospitais
Comunidade
Total
Valor de
-lactamases
n=36 (%)
n=120 (%)
n=156 (%)
p
ESBL
9 (25,0)
14 (11,7)
23 (14,7)
0.0478
AmpC
0 (0,0)
5 (4,2)
5 (3,2)
0.485
ESBL/AmpC
4 (11,1)
3 (2,5)
7 (4,5)
0.0836
Total
13 (36,1)
22 (18,3)
35 (22,4)
0.0249
Foi testada a resistência nas cepas fenotipicamente produtoras de ESBL, observandose os seguintes resultados: 40% (12/30) de resistência para cefepime; 100% (30/30) para
cefotaxima; 66,7% (20/30) para ceftazidima; 76,7% (23/30) para aztreonam; 23,3% (7/30)
para cefoxitina; 83% (25/35) para amoxicilina/ácido clavulânico; 100% (30/30) para
ampicilina; 83,3% (25/30) para cefalotina; 90% (27/30) para trimetoprim/Sulfametoxazol;
43,3% (13/30) para gentamicina e 90% (27/30) para ciprofloxacina. É importante destacar que
todas as cepas produtoras de ESBL foram sensíveis para o carbapenêmico testado
(ertapenem). Em resumo, os maiores percentuais de resistência foram observados para
ampicilina, cefalotina, cefotaxima, amoxicilina/ácido clavulânico, trimetoprim/sulfametoxazol
e ciprofloxacina, como pode ser visto naFigura 4.1
Frequência de resistência e sensibilidade entre as 30 cepas
produtoras de ESBL
10
SXT
90,0
CN
43,3
10
CIP
Antibióticos
ERT
90,0
100
0,0
16,7
CF
AM
83,3
0
100,0
16,7
AMC
FOX
66,7
0
100,0
FEP
40,0
0,0
Resistentes
76,7
33,3
CAZ
Sensíveis
83,3
76,7
23,3
23,3
ATM
CTX
56,7
20,0
40,0
60
60,0
80,0
100,0
120,0
Frequência (%)
Figura 4.1 Frequência de resistência em cepas produtoras de ESBL
FEP, cefepime; CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima; ATM, aztreonam; FOX, cefoxitina;
AM, ampicilina; CF, cefalotina; ERT, ertapenem; AMC, amoxicilina/ácido clavulânico;
SXT, trimetoprim/Sulfametoxazol; CIP, ciprofloxacina; CN, gentamicina.
59
Quanto à resistência nas cepas que apresentaram produção fenotípica de AmpC temos
os seguintes resultados: 8% (1/12) para cefepime; 58,3% (7/12) para cefotaxima; 50% (6/12)
para ceftazidima; 58,3% (7/12) para aztreonam; 100% (12/12) para cefoxitina; 91,7% (11/12)
para amoxicilina/ácido clavulânico; 100% (12/12) para ampicilina; 100% (12/12) para
cefalotina; 91,7% (11/12) para trimetoprim/Sulfametoxazol, 25% (3/12) para gentamicina e,
100% (12/12) para ciprofloxacina. Todas as cepas produtoras de AmpC foram sensíveis ao
carbapenêmico testado (ertapenem). Resumindo, podemos observar maior resistência para
cefoxitina, ampicilina, cefalotina, amoxicilina/ácido clavulânico, trimetoprim/sulfametoxazol
e ciprofloxacina, como demonstrado na Figura 4.2.
Frequência de resistência e sensibilidade das 12 cepas
produtoras de AmpC
8,3
SXT
91,7
Antibióticos
CN
25,0
CIP
0,0
ERT
0,0
CF
0,0
AM
0,0
100,0
100,0
100,0
100,0
8,3
AMC
FOX
75,0
Sensíveis
91,7
0,0
Resistentes
100,0
41,7
ATM
58,3
50,0
50,0
CAZ
41,7
CTX
FEP
58,3
91,7
8,3
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
Frequência (%)
Figura 4.2 Frequência de resistência nas cepas produtoras de -lactamases tipo AmpC
FEP, cefepime; CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima; ATM, aztreonam; FOX, cefoxitina;
AM, ampicilina; CF, cefalotina; ERT, ertapenem; AMC, amoxicilina/ácido clavulânico;
SXT, trimetoprim/Sulfametoxazol; CIP, ciprofloxacina; CN, gentamicina.
60
4.4 Concentração minima inibitória - CMI
A CMI foi determinada para todas as cepas que apresentaram resistência à cefotaxima
e à ceftazidima. Para a interpretação dos resultados usaram-se as recomendações do CLSI
2011. Os resultados da CMI confirmam a resistência às cefalosporina de amplo espectro como
a cefotaxima e a ceftazidima. A CMI para ceftazidima aponta para os seguintes resultados
50% (10/20) resistentes, 40% (8/20) sensibilidade intermediária e 10% (2/20) com
sensibilidade ao antibiótico. Os resultados para cefotaxima foram 86,7% (26/30) e 13,3%
(4/30) para resistência e sensibilidade intermediária, respectivamente. Na Tabela 4.7 estão
apresentados os resultados do CMI para os dois antibióticos.
Tabela 4.7 Resultados da CMI para ceftazidima (TZ) e cefotaxima (CT)
CMI
Cefotaxima (CT)
ug/mL
n (%)
1,5
1 (3,3)
Ceftazidima (TZ)
ug/mL
n (%)
2
1 (5)
2
2 (6,7)
3
1 (5)
3
1 (3,3)
6
3 (15)
4
3 (10,0)
8
3 (15)
8
1 (3,3)
12
2 (10)
12
3 (10,0)
16
2 (10)
32
1 (3,3)
24
4 (20)
48
1 (3,3)
32
4 (20)
>256
Total
17 (56,6)
30
>256
0
20
Na análise da CMI para cefotaxima é importante destacar que 56,6% (17/30) têm
resistência, com CMI >256 ug/mL e 43,4% (13/30) apresentaram sensibilidade intermediária
ou resistência, com faixas de CMI que variaram entre >1 e <48 ug/mL. Nenhuma amostra foi
sensível.
No análise para ceftazidima, nenhuma amostra apresentou resistência com CMI >256
ug/Ml; 90% (18/20) das amostras apresentaram sensibilidade intermediária ou resistência,
com faixas que variaram entre >4 e < 32 ug/mL.
Observou-se ainda que 10% (2/20) das
amostras apresentaram sensibilidade, com leituras de CMI entre 2 e 3 ug/mL.
61
4.5 Deteção genotipica de ESBL/AmpC e classificação filogenética
4.5.1 Caracterização dos genes de resistência
A detecção dos genes de resistência em E. coli foi realizada em 35 isolados
identificados através de testes fenotípicos como produtores de enzimas -lactamases tipo
ESBL e/ou AmpC. A metodologia empregada foi a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
para os genes que codificam as principais enzimas (TEM, SHV, CTXM, AMPC). Os produtos
amplificados correspondem aos genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaAMPC.
Os resultados da análise genética foram os seguintes: 68,6%(24/35) positivas para
SHV, 37,1%(13/35) positivas para TEM, 60%(21/35) positivas para CTX-M e 11,4%(4/35)
para AmpC. Na Tabela 4.8 temos a frequência das -lactamases.
Tabela 4.8 Frequência dos genes produtores de -lactamases nas 35 cepas
positivas fenotipicamente
ESBL
Cepas
positivas
blaCTX-M
n (%)
21 (60,0)
blaTEM
n (%)
13 (37,1)
AmpC
blaSHV
n (%)
24 (68,6)
blaAmpC
n (%)
4 (11,4)
As cepas portadoras de genes de resistência tipo ESBL e/ou AmpC foram distribuídas
pelo origem, observando-se que nas amostras hospitalares estão presentes
maiores
porcentagens de genes resistência. Os valores de p apontam diferenças estatísticas
significativas nas freqüências de produção de -lactamases entre as amostras hospitalares e
comunitárias (Tabela 4.9).
Tabela 4.9 Distribuição genotípica das -lactamases pela origem das cepas
-lactamases
Hospitais (n=36)
n (%)
blaAmpC
blaCTX-M
blaSHV
blaTEM
Total
2 (5,6)
10 (27,8)
10 (27,8)
3 (8,3)
25 (69,4)
Comunidade
(n=120)
n (%)
2 (1,7)
11 (9,2)
14 (11,7)
10 (8,3)
37 (30,6)
62
Total
Valor de p
4
21
24
13
0.0096
0.0188
0.7310
0.000033
A caracterização de dois ou mais genes codificadores de -lactamases de amplo
espectro foi observada na maioria das amostras, com maior produção concomitante das lactamases CTX-M e SHV, com freqüência de 34,3% (12/28). Foi encontrada produção
concomitante de -lactamases tipo ESBL e AmpC em 4 cepas. Na Tabela 4.10 estão descritos
os perfis de produção concomitante de -lactamases.
Tabela 4.10 Perfis de genes de resistência nas 35 cepas
produtoras de lactamases
-lactamases tipo ESBL
n (%)
blaCTX-M
2 (5,7)
blaCTX-M, blaSHV
12 (34,3)
blaCTX-M, blaSHV, blaTEM
4 (11,4)
blaCTX-M, blaTEM
3 (8,6)
blaSHV
2 (5,7)
blaSHV, blaTEM
3 (8,7)
blaTEM
2 (5,7)
blaAmpC, blaSHV
3 (8,6)
blaAmpC, blaTEM
1 (2,9)
NÃO ESBL/AMPC
3 (8,6)
Total
35
Entre os 35 isolados que apresentaram positividade fenotípica para -lactamases tipo
ESBL e/ou AmpC, em 91,4% (33/35) foram identificados genes codificadores de lactamases, sendo e 8,6% (3/35) negativos. Isto sugere que outros mecanismos de resistência
podem estar presentes nestas três cepas que foram negativas para genes produtores de lactamases.
Devido à importância mundial atual, as 21 amostras que apresentaram positividade
para blaCTX-M foram submetidas à PCRusando-se primers específicos para blaCTX-M-15,
obtendo-se resultados positivos em 80,9% (17/21) das cepas.
63
Todos os produtos positivos para blaCTX-M, blaCTX-M-15 e blaAMPC foram purificados
com Kit GFX (GE) e enviados à Plataforma DNA-PDTIS do Laboratório de Sequenciamento
e Bioinformática do IOC-FIOCRUZ. O resultado de sequênciamento para os genes blaCTX-M,
blaCTX-M-15 e blaAmpC estão apresentados na Tabela 4.11
Tabela 4.11 Resultados de sequênciamento blaCTX-M, blaCTX-M-15 blaAmpC
CTX-M (n=21)
blaCTX-M-15
n (%)
Cepas positivas
17 (80,9)
AmpC (n=4)
blaCTX-M-14
n (%)
blaCTX-M-2
n (%)
CMY-2
n (%)
3 (14,3)
1 (4,8)
4 (100)
O sequênciamento para os genes blaCTX-M
revelou que
80,9%(17/21) foi
caracterizado como blaCTX-M-15; 14,3%(3/21) como blaCTX-M-14, e 4,8%(1/21) como blaCTX-M-2.
Em relação ao blaAMPC, 100% (4/4) foi caracterizado como pertencente à classe CMY-2.
4.5.2 Classificação filogenética.
A classificação filogenética de E. coli foi realizada nos 35 isolados identificados como
produtores de -lactamases tipo ESBL e AmpC, através de PCR para os genes chuA, yjaA e
TspE4C2. A presença ou ausência destes genes define o grupo filogenético ao qual pertence
cada cepa, como foi descrito anteriormente em Matériais e Métodos. A Tabela 4.12 contém os
resultados da classificação filogenética de cada uma das cepas de acordo com a presença ou
ausência dos genes analisados.
64
Tabela 4.12 Classificação filogenética das 35 cepas produtoras de lactamases
CEPA
9241
9246
9247
9252
9264
9267
9269
9271
9276
9278
9279
9286
9292
9293
9307
9308
9309
9318
9319
9323
9328
9332
9334
9338
9348
9358
9360
9365
9371
9372
9379
9386
9389
9390
9397
chuA
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Genes
yjaA
TspE4.C2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
65
Grupo
Filogenético
A
A
B1
A
B1
B2
B2
B2
B2
A
B2
A
B1
A
B2
B1
D
B2
D
B2
B2
B1
B1
A
B2
B2
A
B2
D
D
A
B1
A
A
D
Os resultados da classificação filogenética de E coli demonstra maior frequência do
grupo B2 com 34,3% (12/35), seguidos do grupo A com 31,4% (11/35), do grupo B1 com
20% (7/35) e do grupo D com 14,3% (5/35). Tabela 4.13.
Tabela 4.13 Distribuição dos grupos filogenéticos das 35 cepas de E coli uropatogênicas
produtora de -lactamases
Grupo Filogenético
A
n (%)
B1
n (%)
B2
n (%)
D
n (%)
Total (n=35)
11 (31,4)
7 (20,0)
12 (34,3)
5 (14,3)
Os grupos filogenêticos foram classificados de acordo com a origem, observando-se
que os quatro grupos estão presentes tanto no ambiente hospitalar quanto no comunitário, com
predominância dos grupos A na area hospitalar (46,2%) e B2 na área comunitária (40,9%).
Tabela 4.14
Tabela 4.14 Distribuição dos grupos filogenéticos das 35 cepas
produtoras de -lactamases na comunidade e nos hospitais
Hospital
Comunidade
n(%)
n(%)
A
6 (46,2)
5 (22,7)
11
B1
2 (15,4)
5 (22,7)
7
B2
3 (23,1)
9 (40,9)
12
D
2 (15,3)
3 (13,6)
5
Total
13
22
35
Grupo filogenêtico
Total
A correlação entre o perfil dos determinantes genéticos de resistência blaTEM, blaSHV,
blaCTX-M, blaAMPC e os grupos filogenéticos de E. coli estão apresentadas na Tabela 4.15.
Observou-se que cepas com produção concomitante de -lactamases CTX-M e SHV
pertencem em sua maioria aos grupos filogenêticos A (36,4% [4/11]) e B2 (41,7% [5/11]).
66
Tabela 4.15 Relação do perfil dos determinantes de resistência blaTEM, blaSHV,
blaCTX-M, blaAmpC com os grupos filogenéticos.
Grupos filogenêticos
-lactamases
Total
blaCTX-M
A
n (%)
1 (9,1)
B1
n (%)
1 (14,3)
B2
n (%)
-
D
n (%)
-
blaCTX-M, blaSHV
4 (36,4)
1 (14,3)
5 (41,7)
2 (40)
12
blaCTX-M, blaSHV, blaTEM
2 (18,2)
0
2 (16,7)
-
4
blaCTX-M, blaTEM
1 (9,1)
1 (14,3)
-
1 (20)
3
blaSHV
-
-
1 (8,3)
1 (20)
2
blaSHV, blaTEM
-
-
2 (16,7)
1 (20)
3
blaTEM
-
2 (28,6)
-
-
2
blaAmpC, blaSHV
2 (18,2)
-
1 (8,3)
-
3
blaAmpC, blaTEM
-
-
1 (8,3)
-
1
NÃO ESBL/AmpC
1 (9,1)
2 (28,6)
-
-
3
Total
11
7
12
5
35
2
Em relação à produção de CTX-M pelos diferentes grupos filogenéticos, temos maior
produção desta enzima nos grupos B2 e A (Tabela 4.16).
Tabela 4.16 Distribuição das lactamases de acordo com os grupos
filogenéticos
Grupo
Filogenêtico
CTX-M-15
n (%)
CTXM14
n (%)
CTX-M-2
n (%)
TEM
n (%)
SHV
n (%)
CMY-2
n (%)
A
6 (35,3)
2 (75,0)
-
3 (23,1)
8 (33,3)
2 (50,0)
B1
1 (5,9)
1 (25,0)
1 (100,0)
3 (23,1)
1 (4,2)
-
B2
7 (41,2)
-
-
5 (38,4)
11 (45,8)
2 (50,0)
D
3 (17,6)
-
-
2 (15,4)
4 (16,7)
-
Total
17
3
1
13
24
4
67
4.6 Análise do polimorfismo do DNA genômico
A eletroforese em campo pulsado (PFGE) é reconhecidamente uma importante
ferramenta para análise de genomas bacterianos e para o estudo da diversidade entre cepas de
uma mesma espécie. Foram selecionadas as 35 cepas de E. coli uropatogênica que
apresentaram produção fenotípica de -lactamases, para análise de polimorfismos genéticos,
procurando clones comuns. O ensaio de PFGE para estas amostras gerou perfis nítidos
(Figura 5.4), o que permitiu fazer análises de possíveis similaridades genéticas.
A análise do dendrograma (Figura 5.5) revela um alto grau de polimorfismos entre as
cepas estudadas. A análise permite identificar claramente quatro clones predominantes. As
cepas que pertencem aos mesmos grupos filogenêticos (A, B1, B2, D) formam agrupamentos
clonais muito próximos. Existe também agregação dos isolados bacterianos de acordo com a
origem, já que estão formando agrupamentos clonais relacionados, seja hospitalar ou
comunitário. Dezessete genótipos foram caracterizados com similaridade mínima acima de
83% entre os perfis gerados no dendrograma e dois genótipos foram caracterizados com
similaridade de 96.3%, sendo estas duas últimas amostras provenientes de um mesmo hospital
(H3) e com um perfil de resistência similar.
Quanto aos isolados produtores de ESBL é interessante observar que os genótipos
produtores da enzima CTX-M-15 estão agrupados em três grandes clones, sendo um deles
com grau de similaridade de 85,2%, pertencentes ao grupo filogenético B2 e de diferente
origem (hospitalar ou comunitário). Este clone também apresenta co-produção com outras lactamases como SHV e TEM.
Figura 4.3 Gel com perfis de eletroforese em campo pulsado (PFGE) das cepas de E.
coli uropatogênica
68
C
F
20
SHV
TEM -
-
9279
B2
C
F
<1
SHV
-
-
-
9379
A
H1 M 63
SHV
-
CTX-M14 -
9264
B1
C
F
67
-
TEM -
9338
A
C
F
29
-
-
9307
B2
C
F
51
SHV
TEM CTX-M15 -
100
95
90
85
80
75
85.2%
9348
B2
C
F
35
SHV
-
CTX-M15 -
9318
B2
H6 F
53
SHV
-
CTX-M15 -
9328
B2
H6 F
47
SHV
-
CTX-M15 -
85.7
%
9371
D
H1 F
56
-
TEM CTX-M15 -
9365
B2
H1 F
21
SHV
-
-
CMY-2
9390
A
C
F
20
SHV
-
-
CMY-2
84.8%
9308
B1
C
F
39
-
-
-
-
9309
D
C
F
41
SHV
-
-
-
9319
D
H1 F
60
SHV
-
CTX-M15 -
9267
B2
C
F
61
SHV
TEM -
-
9247
B1
C
F
73
-
-
-
9389
A
C
F
1
SHV
TEM CTX-M14 -
83.8%
9269
B2
C
F
26
SHV
TEM CTX-M15 -
9276
B2
C
F
59
SHV
-
9323
B2
C
F
60
-
TEM -
9358
B2
C
F
69
SHV
-
CTX-M15 -
9372
D
C
M 53
SHV
-
CTX-M15 -
9332
B1
C
M 44
SHV
-
CTX-M15 -
9386
B1
H1 F
61
-
TEM CTX-M14 -
9334
B1
C
F
33
-
-
9292
B1
C
M 74
-
TEM -
9246
A
C
F
23
-
TEM CTX-M15 -
83.8%
9286
A
H1 F
70
SHV
-
-
96.3%
9293
A
H3 M 27
SHV
-
CTX-M15 -
9278
A
H 3 M 21
SHV
TEM CTX-M15 -
9241
A
C
SHV
-
CTX-M15 -
9252
A
H1 M 63
-
-
-
9360
A
H1 F
41
SHV
-
CTX-M15 -
9397
D
C
74 M
SHV
TEM -
Idade
Grupo Filogen.
B2
PFGE_16horas
70
65
60
55
PFGE_16horas
Origem
Sexo
Cepa
9271
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
M 83
-lactamases
CTX-M15 -
-
CTX-M15 -
CTX-M2
Figura 4.4 Dendrograma de E.coli uropatogênicas produtoras de lactamases
H1, hospital Eugenio Espejo; H3, hospital Gonzalo Gonzáles; H6, hospital Militar;
C, comunidade.
69
-
CMY-2
CMY-2
-
5. DISCUSSÃO
As ITUs se encontram entre as infecções bacterianas mais comuns na população,
segundo NAJAR et al. (2009), ficam atrás apenas das infecções respiratórias e
gastrointestinais, representando uma das causas principais de consulta médica nas unidades de
saúde. Segundo WEICHHART et al. (2008) e FOSTER (2008), aproximadamente 150
milhões de casos de ITU ocorrem anualmente em todo o mundo e, só nos Estados Unidos,
ocasionam gastos de mais de 6 milhões de dólares anuais. Isto faz entender o enorme impacto
que têm as infecções do trato urinário em termos de morbidade e custo econômico.
Quanto ao agente causador das infecções do trato urinário, ANDREU et al. 2005,
NICOLLE et al. 2006 e ANDRADE et al. 2006 indicam que E. coli é o principal agente
causador das infecções do trato urinário, causando 85 – 90% das ITUs comunitária e 50% das
ITUs hospitalares.. O presente trabalho foi realizado com isolados de E. coli uropatogênica.
No presente estudo, as amostras foram classificadas pela origem, observando-se que,
das 156 amostras de E. coli uropatogênicas estudadas, 76,92% (120/156) foram de origem
comunitária e 23,1% (36/156) de origem hospitalar. Isto reflete a grande numero de casos de
ITU não complicadas que são comuns na comunidade, especialmente os casos de cistite como
indica HOOTON et al. (2004) e POLETTO & REISS (2005). Quanto às amostras de origem
hospitalar, estas foram provenientes de sete hospitais da cidade de Quito, sendo a maioria das
amostras do Hospital Eugenio Espejo. Este hospital é de referência nacional no Equador,
concentrando grande numero de pacientes. Os dados de cada paciente, obtidos dos registros
de Laboratório de Microbiologia do Instituto de Higiene da cidade de Quito, não permitem
conhecer o serviço de origem de cada amostra, dentro do hospital.
Observando-se a distribuição dos casos de ITU por gênero e idadedos 156 isolados de
E. coli estudadas, 87,8% (137/156) pertenciam a pacientes do sexo feminino, sendo apenas
12,2% (19/156) de pessoas do sexo masculino. Este fato pode ser explicado pela maior
susceptibilidade das mulheres às infecções urinárias, concordando com os resultados
reportados por KIFFER et al., 2007 e MAGLIANO et al., 2012. Quanto aos grupos etários,
observamos predominaram as idades compreendidas entre 15 a 49 anos. Dentro deste grupo
etário, o sexo feminino apresenta 50% (78/156) do total das ITU. Isto está de acordo com
estudos realizados, os quais indicam que a infecção do trato urinário é uma doença comum na
mulher jovem e sexualmente ativa, já que um dos mais importantes fatores de risco para o
70
desenvolvimento de ITU na mulher é a relação sexual (FOSTER R., 2008; VALDEVENITO
J, 2008). Observa-se também que o grupo de mulheres acima dos 50 anos de idade também
foi bem representado, o que poderia refletir a predisposição e os fatores de risco nesta faixa,
como esvaziamento ineficaz da bexiga por prolapso uterino, má higiene por incontinência
fecal e alterações hormonais da menopausa (NICOLLE, 2001). A maior frequência de ITU
no sexo masculino ocorreu na faixa acima dos 50 anos, o que poderia estar relacionado com
perda da funcionalidade do aparelho urinário e pode dever-se à hipertrofia da próstata e/ou
instrumentação, como sinalam a maioria dos estudos, que indica aumento da incidência de
ITU complicada em homens idosos e sujeitos à manipulação da via urinária, sondagem
vesical e hipertrofia prostática (NICOLLE L, 2001). É importante mencionar que nosso
estudo não pôde dispor de todos os dados dos pacientes, razão pela qual não se conhece a
doença de base de cada um deles.
Em relação ao tratamento das ITU, o primeiro antibiótico utilizado na era moderna foi a
sulfanilamida, no ano de 1937, seguido pela nitrofurantoina no ano de 1953, que foi
substituída posteriormente, antes dos anos 80s por trimetoprim/sulfametoxazol (SXT) e pelos
antibióticos -lactâmicos,. O último grupo de antibióticos, as fluoroquinolonas, chegou no
final da década de 1980(FOSTER, 2008). É importante salientar que o conhecimento do
agente etiológico é de fundamental importância para a escolha adequada de antibióticos no
tratamento das ITU, não devendo ser incluídos no tratamento os antimicrobianos que tenham
taxas de resistência acima de 10 a 20% (WARRENT et al., 1999; VALDEVENITO, 2008).
Em 1999 a Sociedade Americana de Infectologia (IDSA) recomendou o uso de
trimetoprim/sulfametoxazol como antibiótico de primeira escolha para o tratamento de
infecção urinária não complicada, com apenas três dias de tratamento (WARRENT et al.,
1999). No caso de pielonefrite aguda pode se realizar o tratamento com lactâmicos e, nas
infecções urinárias complicadas que requeiram hospitalização, o tratamento pode ser feito
com fluoroquinolonas, aminoglicosídeos ou antibióticos lactâmicos de amplo espectro,
segundo os resultados das provas de sensibilidade.
Segundo HORCAJADA & FARIÑAS, 2005, os antibióticos lactâmicos, incluindo as
cefalosporinas orais, são utilizados com frequência para o tratamento das infecções urinárias,
especialmente em áreas com maior resistência às quinolonas, na gravidez e em pediatria.
PATERSON & BOMONO em 2005, recomendaram o uso da combinação amoxicilina/ácido
clavulânico como segunda alternativa para o tratamento de infecções do trato urinário
71
causadas por microorganismos produtores de betalactamases de amplo espectro. SANCHEZ.
e colaboradores, no ano 2008, reportam que, na América Latina, 50% das infecções
hospitalares são tratadas com antibióticos lactâmicos, especialmente cefalosporinas de
terça geração e 70% das infecções extra-hospitalares (comunitárias) são tratados com
cefalosporinas de primeira e segunda geração. Nosso estudo demostrou-se que a taxa de
resistência ao SXT apresentada pela E. coli uropatogênica atinge 77,5% (121/156),
ciprofloxacina 50,6% (79/156), gentamicina 22,4% (34/156). Para os antibióticos lactâmicos estas taxas foram: 7,7%(12/156) para cefepime; 19,2% (30/156) para cefotaxima;
12,8% (20/156) para ceftazidima; 14,7% (23/156) para aztreonam; 7,6% (12/156) para
cefoxitina; 32,6% (51/156) para amoxicilina/ácido clavulânico; 87,8% (137/156) para
ampicilina; 48,1% (75/156) para cefalotina; todas as amostras foram sensíveis para
ertapenem.
É preconizado que quando a prevalência de resistência a um medicamento for maior que
20%, este não deve ser utilizado como droga de primeira escolha para tratamento empírico de
infecção urinária. Alguns dos medicamentos testados neste trabalho apresentam taxas de
resistência acima de 20%, principalmente a droga SXT, que esta indicada como primeira
escolha no tratamento de ITU. Isto indica que este fármaco já não deve ser utilizado no
tratamento das infecções urinárias não complicadas, devendo procurar-se outros esquemas de
tratamento com antibióticos que tenham menor porcentagem de resistência. Destaca-se assim
a importância da realização do teste de susceptibilidade aos antimicrobianos para estirpes
como E. coli, que são aptas a sobreviver em diferentes condições ambientais.
A resistência aos antibióticos lactâmicos, ciprofloxacina, gentamicina e SXT, tem
evoluído ao longo do tempo em vários lugares no mundo. Antes de 1990 a resistência a SXT
era de 0,5% - 5% (HOOTON et al., 2004), GUPTA et al., 1999, nos Estados Unidos
estudando 454 amostras de E. coli uropatogênicas coletadas entre 1989 – 1997 reportam
aumento da freqüência de resistência de 7% - 18% para SXT, 29%-35% para ampicilina,
11%-7% para cefalotina, e ausência de resistência às fluoroquinolonas. Estudo realizado por
KARLOWSKY et al., 2002 nos Estados Unidos, em 286.187 amostras coletadas de 1995 a
2001, de mulheres em tratamento ambulatorial, reportou aumento na resistência à SXT de
14,8% em 1995 para 16,1% em 2001; à ciprofloxacina de 0,7% em 1995 para 2,5% no 2001,
e nos lactâmicos como a ampicilina de 36,% em 1995 para 37% em 2001. KAHLMETER.
em 2003, no primeiro estudo internacional de vigilância da resistência aos antimicrobianos
72
usados no tratamento das ITU (Projeto ECO-SENS), abrangendo 17 países da Europa e o
Canadá, com 4734 amostras, relatou resistência de E. coli à SXT de 4,9% - 21% na maioria
dos países Europeus, exceto na Espanha em que a taxa foi de 25,7% e em Portugal, onde
atingiu 26,7%. A resistência à ciprofloxacina variou entre 0% - 14%; à gentamicina de 0% 4,7%; à AMC de 0 – 9,3%; e à ampicilina entre 15,5 – 53,9%, considerando-se todos os
países do estudo. JUNQUERA, et al., 2004 em um estudo espanhol de sensibilidade
antibiótica realizado com 14.319 amostras de E. coli uropatogênicas coletadas entre 1994 a
2001, reportou sensibilidade a SXT de 67,9% em 1994 e 66,2% em 2001; gentamicina com
sensibilidade de 94,6% em 1998 e 93% no 2001; AMC com 96% em 1998 e 96,9% em 2001;
cefotaxima com 100% em 1994 e 98,5% em 2001; ceftazidima 99,6% em 1994 e 97,8% em
2001 e ampicilina de 42,30% em 1994 e 39,80% em 2001. SANCHES et al., 2008, em
estudo realizado com amostras de E. coli coletadas da comunidade nos anos de 2002 a 2007
na Espanha, reportou aumento na resistência a SXT de 28,5% em 2002 a 32,4% em 2007;
ciprofloxacina com 22,9% em 2002 a 32,5% no 2007; AMC 6,9% em 2002 a 20,6% em 2007
e ampicilina de 56% em 2002 a 62,6% em 2007.
Estudos de resistência na América Latina, realizados por ANDRADE et al., 2007, como
parte do SENTRY (estudo epidemiológico designado a monitorar o percentual de resistência
entre os patógenos mais associados à infecções nosocomiais e da comunidade no Brasil e na
América Latina), com 403 isolados de E. coli coletados em 5 países (Argentina, Chile, Brasil,
México e Venezuela),
reportou taxas de 40,4% de resistência a SXT; 21,6% para
ciprofloxacina; 8,4% para gentamicina; 53,6% para ampicilina; 1,2% para AMC; 1,2% para
cefoxitina; 1,5% para ceftazidima; 1% para cefepime; 1,7% para aztreonam. KIFFER et al.,
2007, em 26693 amostras coletadas em São Paulo de 2000 – 2003 reporto resistência de
43,4% a ampicilina; 13,9% a cefalotina; 33,7% a SXT; 11,9% ciprofloxacina e 3,0%
resistentes para gentamicina. Um estudo mais recente, de MOLINA-LOPEZ et al., 2011 no
México, em 119 cepas de E. coli uropatogênicas coletadas entre 2004 e 2007, reporto 54,6%
resistentes a SXT; 55,5% a ciprofloxacina; 23,9% a gentamicina; 83,7% ampicilina; 20,5
cefazolina; 19,6% AMC; 8,5% ceftazidima; 7,6 cefepime. MAGLIANO et al., 2012, na Itália,
em 9344 amostras de E. coli uropatogênicas coletadas entre março de 2008 e dezembro de
2009, reporta 72,9% de susceptibilidade a SXT; 48% a ampicilina; 77,5% a AMC; e 84,3 para
cefazolina; 76,8% para ciprofloxacina e 91,0% de susceptibilidade para gentamicina.
O Equador não dispõe de muitas informações referentes ao perfil de resistência em E. coli
uropatogênica. Estudo conduzido por SANTANA, no ano de 2008 em 33 uroculturas
73
positivas para E. coli obtidas de mulheres grávidas, reportou resistência antibiótica de 73%
para ampicilina; 39% para AMC; 24% para amoxicilina; 15% para cefotaxima e 12% para
SXT. Não é possível encontrar outras informações referentes a trabalhos de resistência
antibiótica no Equador, devido possivelmente ao fato que não tenham sido publicados e
estejam documentados apenas em cada instituição de saúde.
Na co-resistência antibiótica é importante destacar os perfis, principalmente para
lactâmicos/SXT
(30,8%
[48/156]),
lactâmicos/SXT/CP
(22,4%
[35/156])
e
lactâmicos/SXT/CN/CIP (14,7% [23/156]). Os resultados refletem a multirresistência
antibiótica e as poucas opções terapêuticas para tratamento nestes pacientes; mas também
indicam o uso irracional de antibióticos, seja por auto-medicação ou por prescripção médica.
Quanto à distribuição da resistência pela origem das amostras (hospitalar e comunitária),
os resultados obtidos indicam mais altos percentuais de resistência nas amostras de origem
hospitalar, com diferenças estatisticamente significativas, especialmente para antibióticos
como amoxicilina/ácido clavulânico, aztreonam, cefalotina, cefotaxima, ceftazidima e
ciprofloxacina, aos quais há mais resistência nos hospitais, concordando com estudos
realizados por PAZ et al e o grupo RESISNET no ano de 2001 no Brasil, JUNQUERA (2004)
em Espanha e GOMEZ (2009) na Colômbia.
Como observamos, os resultados deste trabalho demostram altos percentuais de
resistência para lactâmicos, em especial para ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico,
cefalotina (cefalosporina de primeira geração), trimetoprim/sulfametoxazol e ciprofloxacina.
É recomendável testar outros grupos de antibióticos e conhecer o seu perfil de sensibilidade,
de forma, a saber, qual antibiótico é mais apropriado para o tratamento. Uma possível
explicação para esta grande taxa de resistência poderia ser que, no Equador, o Ministério de
Saúde fornece medicamentos básicos a todas as unidades de saúde comunitárias e hospitalares
de todo o país, entre os quais se encontra, destacadamente, SXT. além de outros antibióticos
lactâmicos aos quais nosso trabalho identificou grande freqüência de resistência.
Medicamentos como ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefalexina e
SXT se encontram em todas as unidades médicas de saúde comunitária para serem usadas nos
esquemas e protocolos de tratamento como AIEPI (atenção integrada das doenças evitáveis da
infância) aprovados pelo Ministério de Saúde. Isto faz que este grupo importante de
antibióticos sejam utilizados em pacientes de todas as idades para tratamento de várias
doenças como infecções respiratórias, cutâneas, diarreicas e urinárias. Este uso empírico de
74
medicamentos pode ter levado ao aparecimento da grande freqüência de resistência em E. coli
uropatogênica e outras espécies bacterianas.
Em relação à detecção fenotípica de lactamases no presente estudo, das 156 cepas
testadas 14,7% (23/156) foram fenotipicamente produtoras de betalactamases de amplo
espectro (ESBL), 3,2% (5/156) de tipo AmpC e 4,5% (7/156) apresentaram co-resistência
fenotípica para as duas lactamases. Atualmente, a resistência a antibióticos lactâmicos
em E. coli é mais freqüênte, e na grande maioria é devida à produção de enzimas
betalactamases, entre as que estão as ESBL, associadas à alta morbidade e mortalidade devido
às reduzidas opções terapêuticas. No estudo de WINOKUR e colaboradores (2001), avaliouse a prevalência de ESBLs entre cepas da família Enterobacteriaceae oriundas de diversas
regiões geográficas e, na espécie E. coli, o percentual de cepas produtoras de ESBLs foi de
8,5% na América Latina, 7,9% na Região Oeste do Pacífico, 5,3% na Europa, 3,3% nos
Estados Unidos e 4,2% no Canadá. TURNER, 2005 reporto o porcentual de cepas de E. coli
com perfil de ESBL em 7,5% na Norte América; 18,1% na América do Sul; 6,2% no Norte de
Europa; 16,0% no Sul de Europa; 28,9% no Oeste de Europa e 14,2% na região Ásia-Pacífico.
Em outro estudo multicêntrico de vigilância epidemiológica, REINERT, no ano de 2007,
reporta dados de produção de ESBL em E. coli, com variações de 12,5% para a região da
Ásia-Pacífico; 13,5% na América Latina; 2,2% na Norte América e 7,6% na Europa.
Na América Latina, as ESBL são um problema de Saúde Pública muito sério e alarmante,
razão pela qual vários estudos têm sido realizados: MARTINEZ et al., (2005) num estudo
feito na Colômbia com amostras hospitalares reporta 10% de cepas de E. coli com perfil de
ESBL. MORALES et al., (2005), em 137 amostras hospitalares de Peru, reportam 2,9% de
cepas de E. coli produtoras de ESBL. MATTAR & MARTINEZ (2007), fazem uma revisão
geral da produção de ESBL em países de América Latina e reportam que o Peru tem o maior
percentual, com 63%, ao passo que a Argentina tem a menor taxa, com 5% e Brasil tem 12%.
VILLEGAS et al, 2008, reportam para a América o Sul, uma produção maior de 30% de
ESBL em enterobacterias, com 8,5% – 18,1% em E. coli . Num estudo multicêntrico na
América Latina para Monitoramento de Resistência aos Antimicrobianos (SMART), com
amostras de Venezuela, Brasil, Chile, Colômbia, República Dominicana, Guatemala, México,
Panamá, Peru e Venezuela, reporta-se 26,8% de produção de ESBL em cepas de E. coli
(VILEGAS et al., 2011). PAVON et al., (2011) em um estudo realizado no México com 29
amostras de E. coli hospitalares reporta 17,2% como produtoras de ESBL.
75
O Equador não dispõe de muitas informações quanto à produção fenotípica e genotípica
de ESBL em E. coli, mas MATTAR & MARTINEZ (2007), em artigo de revisão, reportam
que o país têm 27% de produção de ESBL tipo SHV5 e SHV-4 em cepas de E. coli. Um
estudo feito no Equador por NORDBERG et al. em 2011 em 160 amostras de enterobactérias
(E. coli e K. pneumoniae) provenientes de um hospital de terceiro nível da área de
neonatologia, reporta 55% das amostras com resultado fenotípico positivo para ESBL, dos
quais 80,3% correspondem a E. coli. Atualmente, o Equador não tem reportado outros dados
de pesquisas de ESBL em E. coli. Isto reforça a importância deste estudo para aportar dados
epidemiológicos e moleculares, que contribuam para futuras pesquisas a serem desenvolvidas
no Equador. Conforme a revisão da literatura, nossos resultados apresentam porcentagens
quase similares às reportadas em estudos de outros países da América Latina, especialmente
da Colômbia e do Peru, que são países vizinhos, com populações semelhantes e com
migrações permanentes entre eles.
Quanto à produção fenotípica de lactamases tipo AmpC, que conferem resistência
às cefalosporinas de primeira esegunda gerações (incluídas às cefamicinas) e em menor
medida às de terceira geração, também têm sido realizados vários trabalhos. DING H. et al.,
em estudo feito entre 2005 e 2006 em um hospital de crianças na China, reporta 2,0% de
produção de AmpC em cepas de E coli. SINGTOHIN et al., 2010, na Tailândia, reporta
freqüência de produção de 2,5% de AmpC em E. coli, com maior produção do tipo CMY-2.
Jacoby apresenta uma revisão detalhada das pesquisas realizadas sobre a produção de
lactamase tipo AmpC no mundo (JACOBY, 2009).
A enzima AmpC lactamase tem sido classificada de acordo com diferenças na
sequência de aminoácidos, em varias famílias, das quais CMY-2 é a mais comum no mundo e
pode ser encontrada entre pessoas e animais (HAWKEY & JONES, 2009; MAMMERI et al.,
2010). É importante ressaltar a associação entre AmpC e perda de porinas no mesmo
microorganismo, já que esta leva ao aparecimento de resistência aos antibióticos
carbapenêmicos. Estudos feitos no Brasil por PAVES et al., em 2008, e MAMMERI et al.,
2010, reportam esta associação. Na América Latina, JURÉ et al., 2011 reporta na Argentina a
presença de CMY-2 em cepas de E. coli.
Quanto à distribuição fenotípica das -lactamases pela origem das amostras temos que
36,1% (13/36) são de origem hospitalar e 18,6% (22/120) são de origem comunitária, com
uma diferença estatisticamente significativa (p = 0.0249). Estes resultados mostram que as
76
cepas de E. coli uropatogênicas hospitalares têm porcentagens de resistência maiores em
relação às cepas comunitárias, o que concorda com estudos feitos por MARTINEZ et al.,
(2005), na Colômbia, MORALES et al. 2005 no Peru e NORDBERG, et al. (2011) no
Equador, que reportam maior produção de -lactamases de tipo ESBL em cepas de E. coli
hospitalares. Os genes determinantes de resistência também estão presentes em amostras
originárias da comunidade. Isto demonstra que genes de resistência antibiótica estão
espalhados no meio ambiente, onde as bactérias estão intercambiando material genético entre
si. CHAGAS et al. (2011) no Rio de Janeiro, reportam produção de ESBL em cepas de E.
coli recuperadas de esgotos hospitalares, mostrando a ligação existente entre a comunidade e
os hospitais, facilitando desta forma a transmissão de cepas multirresistentes clinicamente
importantes entre estes dois ambientes.
Observou-se também que, nas amostras produtoras de ESBL e AmpC, os níveis de
resistência aos antibióticos -lactâmicos testados foram altos, especialmente para a
cefotaxima 100% (30/30); ampicilina 100% (30/30); amoxicilina/ácido clavulânico 83%
(25/30); cefalotina 83% (25/30); para SXT foi de 90% (27/30), e para ciprofloxacina foi de
97% (27/30). Estes resultados têm similaridade com aqueles obtidos em outros estudos
publicados e indicam que não devem-se usar antibióticos -lactâmicos em cepas produtoras
de ESBL. As opções de tratamento para estas cepas produtoras de ESBL são os antibióticos
carbapenêmicos, fosfomicina ou tigeciclina (CASELLAS, 2011).
Em relação à CMI, foram feitos ensaios em todas as amostras com perfil de resistência
fenotípica para cefotaxima e ceftazidima (cefalosporinas de amplo espectro). Os resultados
para cefotaxima estão em 100% (30/30) dos casos em variações entre 1,5 ug/mL e >256
ug/mL, mostrando sensibilidade intermediária e resistência. Para ceftazidima 90% (18/20) das
amostras têm variações entre 6 ug/mL e > 250 ug/mL tendo os mesmo critérios da
classificação. Estes resultados confirmam a resistência fenotípica encontrada e a produção de
lactamase em cepas de E. coli uropatogênicas trazidas de Equador, especialmente com
cepas produtoras de cefotaximasas (CTX-M). Em 2/30 (10%) das amostras temos CMI <4
ug/mL para ceftazidima, o que confere uma aparente sensibilidade a este antibiótico,
entretanto, estas amostras tinham CMI maior a 256 ug/mL para cefotaxima, com produção
genotípica de CTX-M, o que confirma que, contra as cepas produtoras de ESBL, não devemse usar antibióticos -lactâmicos nos tratamentos.
77
Quanto aos resultados de detecção dos determinantes genotípicos de produção de
lactamase 68,6% (24/35) foram positivos para blaSHV; 60% (21/35) para blaCTX-M, 37,1%
(13/35) para blaTEM e 11,4% (4/35) foram positivas para blaAmpC. Na distribuição pela origem
das amostras observamos que as provenientes do meio hospitalar apresentam maior
porcentagem de determinantes de resistência com 69,4% (25/36) em relação às de origem
comunitária, que apresentam 30,6% (37/120) com diferença estatisticamente significativa (p =
0.000033) na presença de genes de resistência. Pelos resultados obtidos em nosso estudo,
observamos que a as variantes SHV e CTX-M são mais frequentes, o que concorda com os
relatos realizados por MATTAR & MARTINEZ 2007 e VILLEGAS et al., 2008, os quais
indicam que as ESBL mais comumente achadas na América Sul são de tipo SHV e CTX-M.
Como observamos, temos a presença de determinantes genéticos de resistência disseminados
nas amostras de ambos os ambientes (hospitalar e comunitário), concordando com o estudo
realizado por PARK et al., 2012, na Coréia do Sul com 139 amostras de E. coli comunitárias
e hospitalares, reportando a presença de ESBL em ambos os ambientes.
Pela importância mundial atual, foram purificados e sequenciados as amostras
positivas para CTX-M, CTX-M-15 e AmpC, obtendo-se 80,9% (17/21) para a variante
CTX-M-15; 14,3% (3/21) para a variante CTX-M-14; 4,8% (1/21) para a variante CTX-M-2.
O resultado de sequenciamento para o gene AmpC resultou em 100% (4/4) para variante
CMY-2. Os resultados indicam a predominância da variante CTX-M15 e de CMY-2 (AmpC),
concordando com atuais estudos epidemiológicos e de resistência realizados, os quais
reportam predominância da variante CTX-M-15 em cepas de E. coli uropatogênica
relacionada com o clone ST131 do grupo filogenêtico B2, sorotipo O25:H4, que atualmente
esta se espalhando por todo o mundo (PEIRANO & PITOUT 2010; ROGERS et al., 2011;
PITOUT J, 2012). A predominância da lactamase CMY-2 (AmpC) é igualmente a mais
comum no mundo (JACOBY, 2009; PITOUT J, 2012). As enzimas CTX-M têm sido
classificadas em seis grupos: CTX-M-1; CTX-M-2; CTX-M-8; CTX-M-9; CTX-M-25; CTXM-45 (BONNET R, 2004; ROSSOLIN et al., 2008; SENNATI et al, 2012). No Equador,
segundo os resultados achados neste trabalho, temos a predominância do grupo 1 (CTX-M-15
pertence a este grupo). Atualmente existem 133 variantes da enzima CTX-M e 95 variantes da
enzima CMY (http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1).
Com relação à produção concomitante das ESBL num mesmo microorganismo, foi
identificada presença dos genes de resistência blaCTX-M, e blaSHV em 34,3% (12/35) das
78
amostras. A produção concomitante destas enzimas aumenta o perfil de resistência às
cefalosporinas de amplo espectro, como cefotaxima-ceftriaxona (CTX-M) e cefotaximaceftazidima (SHV) (CASELLAS J, 2011). Em 11,4% (4/35) das amostras estudadas
observamos a coprodução dos três determinantes genéticos de resistência (blaTEM, blaSHV,
blaCTX-M). Da mesma forma, observamos concomitância entre AmpC e ESBL (blaAMPC,
blaSHV, e blaAMPC, blaTEM), o que amplia o espectro de resistência dos microorganismos às
cefamicinas e inibidores das lactamases, deixando limitada as opçõesde antibióticos para o
tratamento das infecções causadas pelos microorganismos que contêm estes determinantes de
resistência juntos. Uma opção de tratamento para estes casos seriam os antibióticos
carbapenêmicos, embora já tenha sido documentado que, em associação com outros
mecanismos de resistência, como perda de porinas, estes patógenos podem também tornar-se
resistentes a este grupos de antibióticos (PAVES et al., 2008; MAMMERI et al., 2010).
Também observamos que 8,6% (3/35) das amostras foram negativas para os determinantes de
resistência pesquisados (não ESL/AmpC), isto demonstra que outros mecanismos de
resistência como alteração ou perda de porinas, mutações das PBP ou das bombas de
efluxo,poderiam estar envolvidos nestas três cepas com resistência aos lactâmicos.
Em relação à classificação filogenêtica de E. coli, temos
que 34,3% (12/35)
pertencem ao grupo filogenêtico B2; 31,4% (11/35) pertencem ao grupo A; 20,0% (7/35) são
do grupo B1 e 14,3% (5/35) pertencem ao grupo filogenêtico D. Observamos a predominância
do grupos filogenêticos B2 que têm relação com maior expressão de determinantes de
virulência e de resistência e são comumente achados. Tradicionalmente os grupos
filogenêticos B2 e D são chamados de “patogênicos” e os grupos A e B1 são comensais sem
potencial patogênico (SANTOS et al., 2009). Em nossos resultados os quatro grupos
filogenéticos produzem lactamases de tipos ESBL e AmpC, predominantemente nos
grupos B2 e A. Cepas pertencentes ao grupo filogenêtico A estão produzindo CTX-M15 em
35,3% (6/21), e o grupo B2 com 41,2% (7/21). Este resultado é importante, já que as cepas de
E. coli pertencentes ao grupo A são conhecidas como cepas comensais “não patogênicas”,
mas neste caso, estão produzindo enzimas lactamases. Isto indica a facilidade de
disseminação da resistência entre as bactérias, fazendo que cepas aparentemente “sem
potencial patogênico” estejam agora produzindo enzimas que vão hidrolisar antibióticos
lactâmicos de amplo espectro. Estudos atuais na América do Sul respaldam nossos
resultados. PEIRANO et al., 2011, no Rio de Janeiro, Brasil, em 25 amostras de E coli,
reportam a predominância do grupo filogenêtico A com 52%, junto com a produção da
79
enzima CTX-M-15, SENNATI et al, (2012) na Argentina, reportam cepas de E. coli do grupo
A produzindo CTX-M-15.
Na correlação entre presença de determinantes de resistência e grupos filogenéticos,
temos que os genes blaCTX-M, blaSHV estão nos grupos filogenéticos A (36,4% [4/11) e B2
(41,7[5/12]) principalmente. De igual forma, os quatro grupos filogenéticos estão espalhados
no ambiente comunitário e hospitalar, com predomino do grupo A na área hospitalar com
46,2% (6/13), e do grupo B2 na comunidade com 40,9% (9/22). Um dado importante é a coprodução de ESBL e AmpC (blaAmpC, blaSHV) no grupo filogenêtico A (18,2%), isto aumenta
o espectro de resistência para mais antibióticos como as cefamicinas e as combinações de
antibiótico com inibidores de lactamases, confirmando também o aparecimento de
resistência em grupos filogenéticos comensais.
slactamases, especialmente de tipo ESBL, são um problema se Saúde Pública
mundial com maior impacto nas ultimas dois décadas. Desde o primeiro informe de
aparecimento na década de 1980, as ESBL foram evoluindo, tornando-se mais resistentes aos
antibióticos usados comumente, deixando um limitado numero de antibióticos para a
erradicação dos microorganismos que contêm estes determinantes de resistência. A
prevalência e a produção de ESBL mudam geograficamente segundo os reportes achados, e
em América Latina os estudos mostram uma elevada prevalência, isto tem muitas causas,
entre as que podemos citar: i) Condições socioeconômicas deficientes; ii) administração, uso
indiscriminado e sim controle de antibióticos de amplo espectro, nos hospitais e na consulta
privada; iii) identificação limitada de bactérias produtoras de ESBL nos laboratórios de
microbiologia devido às limitações econômicas, iv) falta de politicas estatais que impedem a
venta libre dos antimicrobianos como acontece na maioria de países da América do Sul.
O método de PFGE foi realizado em 35 amostras com produção fenotípica de ESBL,
demonstrando considerável grau de diversidade dentro de E. coli uropatogênica. No entanto
no analises de agrupamento dos perfis gerados pela PFGE demostra relação de clones entre
cepas do mesmo grupo filogenêtico e das mesmas origens, já que estão formando
agrupamentos clonais muito próximos entre elas. As cepas produtora de lactamases tipo
CTX-M-15 principalmente, estão agrupadas de acordo com o grupo filogenêtico em sua
maioria.
80
6. CONCLUSÕES
 Os perfis de resistência para trimetoprim/sulfametoxazol, ciprofloxacina e alguns dos
antibióticos lactâmicos testados como penicilina, cefalotina e a associação de
amoxicilina/ácido clavulânico, estão acima dos 20% que é a porcentagem permitida para
o uso de qualquer antibiótico no tratamento das ITU. Visto estas porcentagens, os
medicamentos de primeira escolha para o tratamento empírico das ITU deverá ser alvo
de correção, procurando antibióticos com taxas de resistências menores.
 A resistência fenotípica e a detecção de genes de resistência foram maiores nas amostras
de origem hospitalar, com significância estatística.
 As enzimas ESBL caracterizadas (CTX-M, TEM, SHV) estão presentes em amostras de
ambientes hospitalares e comunitários, mostrando a fácil disseminação dos
determinantes de resistência nas bactérias.
 Dentro das cepas produtoras de lactamases foram encontrados os genes blaTEM,
blaSHV, blaCTX-M e blaAMPC, com predominância de blaSHV e blaCTX-M.
 No grupo das lactamases CTX-M, foram encontrados alto porcentagem das variante
CTX-M-15 com 80,9%, seguido de CTX-M-14 com 14,3% e CTX-M2 com 4,8%.
 Foi detectado a variante CMY-2 em 100% das amostras positivas para lactamase tipo
AmpC.
 Os grupos filogenéticos mais prevalentes foram os grupo B2 e A, seguido por B1 e D.
Todos estes grupos foram produtores de lactamases, especialmente o grupo A
considerado de não patogênico, produz 35% do total das enzimas CTX-M-15.
 Os resultados da análise do DNA genômico mostraram um grande polimorfismo de E.
coli uropatogênica.
81
7. PESPECTIVAS FUTURAS.
 Continuação da monitorização dos perfis de resistência em cepas de E. coli
uropatogênicas.
 Procurar novas alternativas de tratamento nas infecções do trato urinário,
especialmente com o grupo de antibióticos das fluoroquinolonas e aminoglicosídeos,
os quais são comumente utilizados para o tratamento das ITU no Equador, procurar os
determinantes de resistência para este grupo de antibióticos.
 Fazer estudos de genotipagem com outras técnicas moleculares, nas cepas de E. coli
uropatogênicas de Equador, para ter conhecimento da epidemiologia molecular em
relação aos clones reportados em outros países.
 Continuar neste campo de pesquisa relacionado com a resistência antibiótica nas
bactérias; procurando novos agentes causadores de doenças que são de inteires na
saúde pública no Equador; aplicando os procedimentos moleculares aprendidos
durante a elaboração deste Projeto.
.
82
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS.
Este é um dos primeiros trabalhos de caracterização molecular de E. coli
uropatogênica realizados em amostras originarias de Equador, com um enfoque clinico e de
resistência antibiótica
As informações geradas neste trabalho, trazem novos conhecimentos sobre a
ocorrência de ESBL e AmpC em Equador, o qual ainda não são estudados completamente, e
onde pode-se observar resistência antibiótica dos microorganismos nos ambientes hospitalares
e comunitários. Os resultados mostram a importância e a emergência da difusão de bactérias
resistentes produtoras de lactamases, especialmente as ESBL e AmpC, as quais conferem
altas taxas de resistência contra a maioria dos antibióticos lactâmicos de amplo espectro.
Atualmente, a resistência antibiótica é um tema de importância na área da saúde
pública, o qual tem relação com o uso incorreto dos antimicrobianos na prática clínica,
levando ao consequente aumento do número de bactérias multirresistentes, especialmente nos
hospitais do serviço público. A isto se suma a falta de estudos de sensibilidade antibiótica
local, desconhecendo o perfil de resistência das bactérias, o que leva a tomar decisões erradas
no momento de escolher o medicamento apropriado para início de tratamentos empíricos de
várias doenças, não só em casos de infecções urinárias. Levando também a manter esquemas
de tratamento que deveriam ser reconsiderados e elaborar novos esquemas terapêuticos na
área da resistência em geral
Na atualidade Equador não conta com informação relacionada à resistência antibiótica
molecular, desconhecendo as causas genéticas que levam aos fracassos de tratamentos
clínicos de muitas doenças nos hospitais e na comunidade. O conhecimento genético da
resistência bacteriana vai ajudar a ter um melhor controle e vigilância epidemiológica, já que
ajudam a entender as formas de dispersão dos determinantes de resistência, os quais são genes
causadores e o perfil molecular de resistência de cada um de esses genes.
A pesquisa desenvolvida contribui para difusão dos conhecimentos na área de
resistência molecular, e deixa abertas novas interrogantes em relação à resistência no
Equador, para que serem feitos novos estudos com novas agentes causadores de outras
doenças. Igualmente a informação gerada neste trabalho fica como uma fonte de ajuda para os
futuros estudos a realizar-se neste campo da pesquisa.
83
Considerando os objetivos propostos e os resultados obtidos é possível concluir que os
mesmos foram atingidos neste trabalho. E que todos os procedimentos e técnicas moleculares
aprendidas poderão ser aplicados no Equador para realização de futuras pesquisas na área de
resistência molecular.
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1. INTRODUCÃO 1.1 INFECÇÕES DO TRATO URINARIO (ITU) A

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