atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas e especiarias

Transcrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO
NAIANE DARKLEI DOS SANTOS SILVA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE
ESPECIARIAS SOBRE PATÓGENOS ISOLADOS DE CARNES
COMERCIALIZADAS EM JUAZEIRO-BA E PETROLINA-PE
Petrolina-PE
2015
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco –
UNIVASF,
Campus
Petrolina,
como
requisito para obtenção do título de Mestre
em Recursos Naturais do Semiárido.
Área
de
concentração:
Química
e
Atividade Biológica
Orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da
Costa
Petrolina-PE
2015
S586a
Silva, Naiane Darklei dos Santos
Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de especiarias sobre
patógenos isolados de carnes comercializadas em Juazeiro-BA e
Petrolina-PE / Naiane Darklei dos Santos Silva . -- Petrolina, 2015.
xv; 81f.: il. 29 cm.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina,
Petrolina, PE, 2015.
Orientador: Dr. Mateus Matiuzzi da Costa.
Banca examinadora: Profa. Dra. Xirley Pereira Nunes, Profa.
Dra.Francesca Silva Dias Nobre
1. Segurança alimentar. 2. Antimicrobiano. 3. Conservante alimentar.
I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 612.3
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF.
Bibliotecária: Luciana Souza Oliveira CRB5/1731
Dissertação apresentada como requisito
para obtenção do título de Mestre em
Recursos Naturais do Semiárido, pela
Universidade Federal do Vale do São
Francisco.
Aprovado em:_____ de ___________ de ______.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa
(Universidade Federal do Vale do São Francisco)
Orientador
Profª. Drª. Xirley Pereira Nunes
Examinadora Interna
Profª. Drª. Francesca Silva Dias Nobre
Examinadora Externa
Dedico aos meus pais, em especial à minha
mãe, uma grande mulher, meu exemplo de vida
e aos meus irmãos, pelo amor incondicional e
confiança.
Agradecimentos
 À Deus, pelo dom da vida, minha força e minha fortaleza nas dificuldades,
por se fazer presente em todos os momentos de minha vida, guiando
minhas decisões e iluminando minhas escolhas.
 À minha MÃE, Doraci, meu porto seguro, minha amiga, minha
companheira, pelo seu amor desmedido, por sua compreensão, minha
melhor torcida, meu exemplo de mulher. Te amo mamis linda!!
 Ao meu pai, Marcelino (in memorian) mas que está presente
constantemente em nossas vidas, cuidando e vigiando.
 Aos meus irmãos, William e Daiane, pelo amor, pela torcida, por serem o
melhor de mim e que amo imensamente, meus companheiros leais e fiéis.
 Às minhas sobrinhas lindas, Damarise e Damarília, que me fizeram provar
um dos sentimentos de amor mais lindo, um amor desmedido, de cuidado,
sincero e mais puro que existe.
 Ao meu cunhado, Raquildes e cunhada, Carla, pelo carinho e serem mais
do que especiais em minha vida.
 Ao meu querido orientador, Professor Dr. Mateus Matiuzzi da Costa, por
ser um exemplo de profissional e pessoa, pela compreensão e por tornar
o laboratório um ambiente em que todos desejam trabalhar.
 À professora Dr. Gisele Veneroni Gouvea, pela sua atenção e disposição
em ajudar sempre.
 Aos demais professores da pós-graduação pelos ensinamentos no
decorrer desses anos.
 À Universidade Federal do Vale do São Francisco (Univasf) onde estou
desde 2006.
 À CAPES pelo apoio financeiro durante o período do mestrado.
 Às minhas amigas de muitos anos atrás (rs), que mesmo distantes fazemse presentes a todo momento, e que o amor só aumenta cada vez mais,
Rafaella, Juliane, Cássia e Danusa.
 Às minhas amigas de todos os momentos e das melhores risadas, Késia,
Paola e Renata.
 À minha amiga do mestrado, Sandra, pelos dilemas compartilhados e por
ter se tornado tão especial e querida!
 À minha amiga Kiscyla, amiga chorona, que tenho um carinho muito
grande.
 Às minhas companheiras de mestrado pelo carinho (Sandra, Eriane, Ana
Paula, Amanda, Geórgia, Kiscyla, Jackeline, Paloma, Deize e Fernada).
 Aos meus mais que queridos amigos companheiros de laboratório,
Samira, Renilde, Ruan, Graciele, Jennifer, Isabella, Diego, Wilton, Uirá e
Evandro pelos maravilhosos cafés da manhã e almoços, pelas altas
risadas e pela convivência maravilhosa, por tornarem meu ambiente de
trabalho tão prazeroso.
 A todos meus colegas do laboratório de Microbiologia e Imunologia
Animal pela maravilhosa equipe, que torna o mesmo um ambiente
prazeroso para trabalhar.
 Aos professores da banca por terem aceitado estar presentes na defesa
e contribuírem para a finalização desse trabalho.
 Enfim a todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho.
“Onde quer que haja mulheres e homens, há sempre o
que fazer, há sempre o que ensinar, há sempre o que
aprender.”
(Paulo Freire)
RESUMO
Realizou-se a investigação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de
alecrim (Rosmarinus officinalis) e cravo da índia (Syzyguim aromaticum), limão
tahiti (Citrus latifolia) e manjericão (Ocimum basilicum L.), sobre bactérias
isoladas de amostras de carne proveniente do comércio do município de
Juazeiro-BA e Petrolina-PE. Analisou-se 17 amostras de carnes para a presença
de coliformes totais e termotolerantes, Salmonella spp. e Staphylococcus
aureus, onde observou-se que em todas as amostras analisadas foram
detectadas a presença de coliformes totais, com valor médio variando de 1,5x101
NMP/g a >1,1x103 NMP/g e quanto a presença de coliformes termotolerantes o
valor médio variando de 1,5x101 NMP/g a >1,1x103 NMP/g, onde 88,23% das
amostras apresentaram-se fora dos limites máximos estabelecidos pela
ANVISA, e quanto a presença de Escherichia coli confirmou-se em 13 (76,47%)
amostras. Na determinação de Salmonella spp., treze (76,47%) amostras de
carne analisadas apresentaram contaminação em 25g e para Staphylococcus
spp., observou-se que 5 (29,41%) amostras apresentaram-se com contagem
acima do limite máximo estabelecido pela Resolução RDC nº 12/2001 da
ANVISA, sendo a bactéria confirmada em todas as amostras. A avaliação da
atividade antimicrobiana foi realizada pelo método de microdiluição em caldo e
CBM, onde os óleos de manjericão e cravo da índia apresentaram os melhores
resultados quando comparados ao controle do diluente com CBM de
3.125µg/mL, apresentando atividade contra todos os isolados testados,
enquanto que os óleos de alecrim e limão tahiti apresentaram apenas contra os
isolados de Staphylococcus spp. com atividade de fraca a moderada. A partir
desses resultados foram selecionados os óleos de manjericão e cravo da índia,
devido aos melhores resultados e estabeleceu-se a concentração de 1% e 10%
p/v que foram adicionados em 100g de carne moída inoculada com
2,43x108UFC/g de Salmonella enterica ATCC 10708, 2,37x108UFC/g de
Escherichia coli ATCC 35218 e 1,36x107UFC/g de Staphylococcus aureus ATCC
25923 e estocadas por 24 horas a 8°C. utilizou-se como controle a carne sem
adição de óleo essencial. Nos tempos de 0, 4, 6, 20 e 24 horas de
armazenamento realizou-se a contagem bacteriana. Verificou-se que na
concentração de 1% os óleos não diminuíram a carga microbiana, já na
concentração de 10% ocorreu a diminuição de toda a carga microbiana, exceto
para o óleo de manjericão para o S. aureus, onde foi verificada apenas redução
da carga microbiana.
Palavras-chave: Segurança alimentar. Potencial antimicrobiano. Conservante
alimentar.
ABSTRACT
It was held to investigate the antimicrobial activity of essential oils of rosemary
(Rosmarinus officinalis) and clove (Syzygium aromaticum), limes (Citrus latifolia)
and basil (Ocimum basilicum L.) on bacteria isolated from meat samples from the
trade in the city of Juazeiro-BA and Petrolina. Analyzed 17 meat samples for the
presence of total and fecal coliforms, Salmonella spp. and Staphylococcus
aureus, where it was observed that in all analyzed samples were detected the
presence of total coliforms and an average value ranging from 1,5x101 NMP / g>
1,1x103 NMP / g for the presence of coliform the average value ranging of
1,5x101 NMP / g> 1,1x103 NMP / g, where 88.23% of the samples showed up
outside the ceilings set by ANVISA, and for the presence of Escherichia coli was
confirmed in 13 (76.47% ) samples. In the determination of Salmonella spp.,
Thirteen (76.47%) meat samples were contaminated in 25g and Staphylococcus
spp., Observed that 5 (29.41%) of the samples were presented with counts above
the ceiling established by Resolution RDC No. 12/2001 of ANVISA, being
confirmed the bacteria in all samples. Evaluation of the antimicrobial activity was
performed by microdilution broth method and CBM, where the basil oil and clove
showed better results when compared to solvent control with CBM 3.125μg / mL,
showing activity against all isolates tested while the rosemary oil and limes
showed only against Staphylococcus spp. with weak to moderate activity. From
these results we selected the basil oil and clove, due to better results and set the
concentration of 1% and 10% w / v were added to 100g of ground beef inoculated
with 2,43x108UFC / g Salmonella enterica ATCC 10708, 2,37x108UFC / g
Escherichia coli ATCC 35218 and 1,36x107UFC / g of Staphylococcus aureus
ATCC 25923 and stored for 24 hours at 8 ° C. It was used as control meat without
the addition of essential oil. In times of 0, 4, 6, 20 and 24 hours of storage there
was the bacterial count. It was found that at a concentration of 1% oils did not
diminish the microbial load, since the concentration of 10% was the reduction of
all the microbial load, except for the basil oil for S. aureus, which was observed
only reduction of microbial load.
Keywords: Food security. Antimicrobial potential. Food preservative.
Lista de Figuras
Figura 1: Características das colônias típicas de E.coli em ágar Mac
Conkey...............................................................................................................49
Figura 2: Morfologia da Escherichia coli pelo método de coloração de Gram:
cocobcilo gram negativo.....................................................................................49
Figura 3: Características das colônias de Salmonella spp. em ágar Xylose Lysine
Desoxycholate (XLD) .........................................................................................52
Figura 4: Morfologia da Salmonella spp. pelo método de coloração de Gram:
Bacilo gram negativo .........................................................................................52
Figura 5: Morfologia do Staphyloccocus spp. pelo método de coloração de
Gram: coco gram positivo...................................................................................55
Lista de Tabelas
Tabela 1: Óleos essenciais, composição química e estrutura dos constituintes
majoritários........................................................................................................43
Tabela 2: Qualidade microbiológica das amostras de carne bovina fresca
oriundas de feiras-livre e estabelecimentos frigoríficos da cidade de Juazeiro-BA
e Petrolina-PE....................................................................................................57
Tabela 3. Médias das contagens de Escherichia coli ATCC 35218, Salmonella
enterica ATCC 10718 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 na carne da
amostra controle e nos tratamentos com os óleos essenciais de cravo da índia e
manjericão a 1% e 10%p/v.................................................................................70
Lista de Gráficos
Gráfico 1. Número de isolados em valores absolutos de Escherichia coli,
Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima
(CBM) de óleo essencial de Alecrim (Rosmarinus officinalis) ............................58
Gráfico 2. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e
Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo
essencial de cravo da índia (Syzyguim aromaticum) .........................................62
essencial de limão tahiti (Citrus latifolia) ............................................................65
essencial de manjericão (Ocimum basilicum) ....................................................68
Gráfico 5. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e
manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Escherichia
coli ATCC 35218 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g)
...........................................................................................................................70
manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Salmonella
enterica ATCC 10708 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias
(UFC/g) .............................................................................................................71
manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com
Staphylococcus aureus ATCC 25923 na diminuição das Unidades Formadoras
de Colônias (UFC/g) ..........................................................................................71
Lista de Anexos
Anexo 1: Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais
sobre Escherichia coli ATCC 35218 e os isolados obtidos das amostras de carne
...........................................................................................................................94
sobre Salmonella enterica ATCC 10708 e os isolados obtidos das amostras de
carne .................................................................................................................95
sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 e os isolados obtidos das amostras
de carne .............................................................................................................96
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................17
2. OJETIVOS ..................................................................................................20
2.1.
2.2.
Objetivo Geral .........................................................................................20
Objetivos específicos ..............................................................................20
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................22
3.1.
3.2.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.6.1.
3.6.2.
3.6.3.
3.6.4.
Qualidade da carne.................................................................................22
Fontes de contaminação microbiana da carne ........................................23
Microrganismos responsáveis pelas alterações microbiológicas ............24
Escherichia coli .......................................................................................24
Salmonella spp. ......................................................................................26
Staphylococcus spp. ...............................................................................28
Controle dos microrganismos .................................................................29
Conservação de alimentos......................................................................31
Óleos essenciais .....................................................................................33
Alecrim (Rosmarinus officinalis) ..............................................................35
Cravo da índia (Syzygium aromaticum) ..................................................36
Limão Tahiti (Citrus latifolia) ....................................................................37
Manjericão (Ocimum basilicum) ..............................................................38
4. MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................41
4.1.
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.2.
4.3.
4.4.
Isolamento e identificação de linhagens bacterianas .............................41
Detecção e isolamento de Escherichia coli ............................................41
Detecção e isolamento de Salmonella spp. ............................................41
Detecção e isolamento Staphylococcus spp. .........................................42
Óleos essenciais .....................................................................................42
Teste de sensibilidade aos óleos essenciais ..........................................44
Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre bactérias
patogênicas em matriz alimentar de carne moída ..................................45
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................48
5.1.
5.1.1.
5.1.2.
5.1.3.
5.2.
Análise microbiológica ............................................................................48
Coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli ..............................48
Salmonella spp. ......................................................................................51
Staphylococcus spp. ...............................................................................54
Efeito antimicrobiano dos óleos essenciais .............................................58
5.2.1.
5.2.2.
5.2.3.
5.2.4.
5.3.
Alecrim (Rosmarinus officinalis) ..............................................................58
Cravo da índia (Syzygium aromaticum) ..................................................61
Limão Tahiti (Citrus latifolia) ....................................................................64
Manjericão (Ocimum basilicum) ..............................................................67
Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre bactérias
patogênicas em matriz alimentar de carne moída ...................................69
6. CONCLUSÕES ...........................................................................................77
7. REFERÊNCIAS ...........................................................................................79
8. ANEXOS .....................................................................................................94
18
SILVA, N. D.S. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de especiarias sobre patógenos
isolados de carnes comercializadas em Juazeiro-BA e Petrolina-PE
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é um grande produtor de carne bovina e tem no mercado interno o
principal destino de sua produção, e no 1º trimestre de 2015 foram obtidas 1,837
milhões de toneladas de carcaças bovinas, 794,214 mil toneladas de carcaças
de frango e 3,162 milhões de toneladas de carcaças de suínos, sendo 75% para
consumo interno (IBGE, 2015). Nosso país é o maior exportador do mundo,
desde 2008 e segundo o IBGE, no 2º trimestre de 2015, as exportações
brasileiras de carne bovina in natura aumentaram em volume e faturamento. E
de acordo com Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA)
continuará a crescer a uma taxa de 2,15% ao ano (BRASIL, 2014).
Isto, ocorre devido a nova legislação, que fiscaliza a qualidade da carne e os
esforços para erradicar doenças e favorecer o aumento da produção. Em 2008,
aproximadamente 59% do território nacional foram considerados pela
Organização Internacional de Epizootias (OIE) livres da febre aftosa (BRASIL,
2014).
A carne bovina é encontrada em diferentes cortes e apresentações e
empregada em inúmeros derivados cárneos, necessitando de uma alta
manipulação, que quando não realizada da forma adequada, favorece o
desenvolvimento
de
Enterobacteriaceae
microrganismos,
e
dos
gêneros
como
as
bactérias
Pseudomonas,
da
família
Enterococcus
e
Staphylococcus aureus, sendo as mais comuns e as patogênicas, Escherichia
coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus e Salmonella spp. e,
ocasionalmente, Yersinia enterocolitica, Clostridium botulinum e Bacillus cereus
(MARCHI et al., 2012; RIBEIRO, 2011).
Os alimentos de origem animal são veículos de muitos microrganismos
responsáveis por intoxicações e/ou infecções alimentares, as chamadas
doenças transmitidas por alimentos (DTA) (Food and drug administration – FDA,
2013). As doenças de origem alimentar são de vital interesse para saúde pública,
o Food and Drug Administration (FDA) classifica as doenças transmitidas por
alimentos como a principal preocupação de segurança alimentar, visto que os
episódios de toxi-infecção alimentar ultrapassam em número qualquer outro tipo
de contaminação microbiana por alimento (SIZER & WHITNEY, 2003).
19
A carne bovina está frequentemente envolvida em surtos de toxi-infecções
alimentares, por ser um dos alimentos mais consumidos e suas características
intrínsecas propiciarem um ótimo habitat para desenvolvimento desses
microrganismos. Tornando-se necessário, preocupar-se com a qualidade e
sanidade de produtos de origem animal. Especial atenção deve ocorrer desde a
origem da matéria prima, com a manipulação industrial, artesanal e comercial,
seguindo com o transporte, armazenamento, estocagem e exposição para a
venda ao consumidor, minimizando a contaminação e/ou multiplicação
bacteriana (FERRIER & BUZBY, 2014).
Em destaque, tem-se a utilização de especiarias e ervas adicionadas aos
alimentos em quantidades suficientes, evitando desta forma, a deterioração dos
mesmos (CEYLAN & FUNG, 2004). Estas e seus produtos derivados (óleos
essenciais e extratos) apresentam um potencial relevante como agentes de
inibição do crescimento de microrganismos, os quais eram usados apenas como
vetores de aromas e gostos característicos, e hoje se apresentam como uma
nova perspectiva de emprego (SOUZA et al., 2003).
Esta ação inibitória das especiarias e de seus óleos sobre os diferentes
microrganismos tem sido relatada em diversos estudos (OATTARA et al., 1997;
DORMAN & DEANS, 2000; HAMMER et al., 1999). Também tem sido notado,
que em geral os óleos essenciais extraídos de plantas colhidas durante ou
imediatamente após o florescimento possuem atividade antimicrobiana mais
intensa (MARINO et al., 1999).
Por isso a necessidade de um estudo mais aprofundado quanto a esta
função dos óleos, que pode ser influenciada por vários parâmetros, como o tipo,
composição, concentração, processamento e estocagem. Assim como, o tipo de
microrganismo e composição do substrato utilizado para inibir o crescimento do
microrganismo também podem fornecer resultados distintos para esta
propriedade (BERTINI et al., 2005).
Portanto, busca-se o emprego destes óleos essenciais como conservantes
alimentares, como alternativas de métodos mais suaves, proporcionando um
produto sem muito processamento, que é a utilização dos métodos drásticos de
esterilização, assim como, aumentar o tempo de prateleira dos alimentos.
21
2. OBJETIVOS
2.1.
Geral
Avaliar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais de especiarias sobre
patógenos isolados de carnes comercializadas em Juazeiro-BA e Petrolina-PE
in vitro e em matriz alimentar de carne móida.
2.2.

Específicos
Isolar e identificar Salmonella spp., Staphylococcus spp. e Escherichia coli
de amostras de carne provenientes do comércio de Juazeiro-BA e
Petrolina-PE;

Avaliar pela técnica de microdiluição em caldo da atividade antibacteriana
in vitro dos óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), cravo
da índia (Syzygium aromaticum L. Merr & Perry), limão tahiti (Citrus
latifólia
Tanaka)
e
manjericão
(Ocimum
basilicum
L.)
sobre
microrganismos patogênicos;

Comparar a atividade dos óleos essenciais sobre isolados Salmonella
enterica ATCC 10708, Staphylococcus aureuus ATCC 25923 e
Escherichia coli ATCC 35218 com perfis de susceptibilidade;

Verificar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais em amostras de
carne contaminadas com Salmonella enterica ATCC 10708, Escherichia
coli ATCC 35218 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 partindo dos
valores de CBM (Concentração Bactericida Mínima) obtidos previamente
em estudos in vitro.
23
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1.
Qualidade da carne
A carne, assim como o leite e ovos, apresenta-se como alimento de melhor
composição nutricional, tornando-se de fundamental importância na alimentação
da população (OLIVEIRA et al., 2008). É constituída de 75% de seu peso em
água (variando entre 65 a 80%). As proteínas representam 19% (entre 16 a 22%)
e são um dos componentes mais importantes no aspecto nutricional. As
substâncias nitrogenadas não proteicas totalizam 1,5%, os lipídios representam
entre 1,5 e 13%, o teor de carboidratos varia de 0,5 a 1,3%, além dos numerosos
compostos inorgânicos que totalizam 1% (ALVES et al., 2005). Este alimento
que serve como fonte de energia, com alto teor de ferro, em consequência da
presença dos ácidos graxos essenciais e das vitaminas do complexo B
(OLIVEIRA et al., 2008).
A sua comercialização em feira livre é uma atividade tradicional, um comércio
móvel em centros urbanos, que é motivo de preocupação em decorrência de
suas deficiências higiênico sanitárias, considerando que estes alimentos de
origem animal e seus produtos derivados ficam expostos sob condições
insalubres, sujeitos às ações diretas dos microrganismos patogênicos ou
provenientes da contaminação do ambiente e poluição ambiental, como também
de insetos, quando não estão adequadamente acondicionados ou embalados
(LUNDGREN et al., 2009).
A deterioração é a maior responsável pelas perdas econômicas nas
indústrias processadoras de carne e de produtos derivados, que é causado por
reações químicas, desencadeadas pela ação da luz, do corte ou moagem, do
cozimento e do armazenamento que eventualmente levam à perda de qualidade
e consequente rejeição do consumidor (TAVARES & SERAFINI, 2003). Estas
reações formam vários compostos que alteram as características sensoriais dos
produtos, produzem odores e sabores desagradáveis, diminuem o valor
nutricional do alimento e podem até mesmo ser nocivos à saúde (OLIVEIRA,
2011). Os produtos cárneos são considerados de qualidade microbiológica
24
aceitável quando atendem critérios determinados pela legislação vigente
(BRASIL, 2001).
Análises físico-químicas e microbiológicas devem ser realizadas com o
objetivo de avaliar a qualidade do processo produtivo e do próprio alimento,
avaliando o grau de contaminação por microrganismos deteriorantes, que
orientam o monitoramento e indicam medidas corretivas em pontos críticos de
controle (OLIVEIRA et al., 2008).
Os microrganismos encontrados na carne podem ser provenientes do animal
ou da contaminação durante o processo de abate e/ou processamento
tecnológico (KUMAR et al., 2014). Durante o abate torna-se imprescindível
manter as condições higiênicas necessárias para que se obtenha um produto de
qualidade, assim como, a manutenção das condições de temperatura do
ambiente, estocagem e distribuição para posterior comercialização de um
produto que esteja com suas características físico-químicas, organolépticas e
nutricionais adequadas, as quais são determinadas e mantidas de acordo com
as
condições
de
higiene,
conservação,
exposição
e
comercialização
(LUNDGREN et al., 2009).
3.2.
Fontes de contaminação microbiana da carne
A microbiota de um alimento é constituída por microrganismos associados à
matéria-prima e por contaminantes, que foram adquiridos durante os processos
de manuseio e processamento e aqueles que tiveram condições de sobreviver
aos métodos aplicados durante o preparo do alimento e seu acondicionamento.
Assim, esses microrganismos podem contaminar alimentos em qualquer um dos
estágios
de
produção,
beneficiamento,
manuseio,
processamento,
acondicionamento, distribuição e preparo para o consumo (LUNDGREN et al.,
2009).
A maior parte dos alimentos está sujeita a várias fontes potenciais de
microrganismos, porém podem-se controlar os níveis de contaminação e manter
a microbiota em um número aceitável pela legislação vigente, através de
manuseio adequado, conhecimento e emprego de fatores que influenciam o
25
crescimento de microrganismos em alimentos, dentre outras ações (SOARES,
2010).
Assim, obtém-se uma maior validade do produto e uma menor probabilidade
de ocorrer uma infecção ou intoxicação, após o consumo. As fontes de
microrganismos em alimentos podem ser as plantas, que possuem uma
microbiota naturalmente presente, o ar, a água, o solo, os indivíduos (KUMAR et
al., 2014). Os animais têm microrganismos presentes nos pelos, penas, patas,
couro e no intestino, e a eliminação de microrganismos pelos animais contamina
o meio ambiente externo e recomeça todo o ciclo (NASCIMENTO et al., 2014).
A carne quando fresca serve como excelente substrato para o
desenvolvimento de microrganismos, por isso, o local de abate e manipulação
da carne deve seguir as normas higiênicas. A sanitização da carcaça pode ser
incluída, como operação de rotina, no processo de abate de animais para
consumo humano, no sentido de eliminar ou reduzir incidência desses
contaminantes (SIGARINI, 2004). O manuseio direto do produto em mercados
públicos contribui para o acréscimo nas contagens de S. aureus, esse
microrganismo está presente nas mãos, pele e fossas nasais do homem e nem
sempre os manipuladores cultivam hábitos higiênicos adequados (OLIVEIRA et
al., 2011)
Os microrganismos que causam doenças transmitidas por alimentos são
divididos em infecciosos, como Salmonella, Campylobacter e Eschericha coli
patogênicas e os intoxicantes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Clostridium botulinum. Os infecciosos multiplicam-se no trato intestinal, já os
intoxicantes são aqueles que produzem toxinas tanto nos alimentos quanto no
trato intestinal e os gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella
que constituem o grupo denominado coliformes totais, que avalia as condições
higiênicas, limpeza e sanitização e também contaminação fecal (PIRES &
PICCOLI, 2012).
3.3.
Microrganismos responsáveis pelas alterações microbiológicas
3.3.1. Escherichia coli
26
A Escherichia coli é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae
faz parte da microbiota entérica de mamíferos e aves, são bacilos gram
negativos, não esporulados, fermentam glicose com produção de gás e ácido.
Apresentam antígenos somáticos “O” relacionando-se com polissacarídeos da
membrana externa; antígenos flagelares “H” relacionados com proteínas de
flagelos e os antígenos “K” relacionados com polissacarídeos (HOLT et al.,
1994).
É uma bactéria comensal encontrada em maior quantidade no intestino
grosso. Existem variantes de E. coli que adquiriram virulência: E. coli
enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroinvasiva
(EIEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e
E.coli uropatogenica (UPEC) (KASNOWSKI, 2004).
A E.coli Enterotoxinogênicas (ETEC) causa a conhecida “diarréia do
turista”, quando ingerida em grande quantidade em comida mal cozida ou água
contaminada com fezes, infectam principalmente o intestino delgado,
apresentando dores violentas abdominais, vômitos, diarreias, náuseas e febre
baixa (LUNDGREN et al., 2014). Produzem enterotoxinas termoestável (ST) e
termolábil (LT) com atividade de adenilato ciclase, que ao aumentar o GMPc
dentro do enterócito ocasiona a secreção de eletrólitos, como cloro e sódio, para
o lúmen intestinal, seguidos de água por osmose, resultando em diarreia profusa
aquosa, tipo água de arroz, sem sangue (TANG et al., 2014; LUNDGREN et al.,
2014). Em crianças em decorrência da desidratação, torna-se perigosa, sendo
reconhecida como a segunda causa de mortalidade entre as doenças
infecciosas em crianças menores de 5 anos (BAKHSHI et al., 2013).
E.coli Enteropatogênicas (EPEC) causam diarreias não sanguinolentas
epidêmicas em crianças, possuindo fator de adesão aos enterócitos, produzem
enterotoxinas, destruindo os vilos do intestino delgado, levando a uma má
absorção dos nutrientes e consequentemente uma diarreia osmótica. Há
também febre, náuseas e vômitos (BOUZARI et al., 2000; PALMEIRA et al.,
2001). Os vegetais quando regados com água contaminada podem transmitir a
EPEC. A diarreia causada por EPEC é mais comum e mais grave na infância e
rara em adultos. Já o aparecimento de anticorpos circulantes segue curso
inverso: não são detectáveis na infância e atingem níveis mais elevados nos
adultos. Admite-se, portanto, que a exposição a EPEC durante infância produz
27
imunidade contra este patógeno (SOUSA, 2006; GAVILANES-PARRA et al.,
2013).
E.coli Enteroinvasivas (EIEC) são invasivas e destroem a mucosa
intestinal, causando úlceras e inflamação, ocasionando uma diarreia aquosa
inicial seguida em alguns casos de diarreia com sangue e muco (NEWELL et al.,
2010). E.coli Enterohemorragica (EHEC) causa diarreia aquosa inicial que pode
progredir em colitehemorrágica e síndrome hemolítico-urêmico. As EHEC
possuem fímbrias aderentes e produzem toxina semelhante à produzida pela
Shigella, a shigatoxina, provocam anemia, trombocitopenia e insuficiência renal
aguda (SIGARINI, 2004; MOMTAZ et al., 2013; BANG et al., 2014). As E.coli
Enteroagregativas (EAEC) possuem fímbrias, produzem toxinas semelhantes às
da ETEC, causando diarreia aquosa ou hemorrágica, apresentam-se com
aparência característica, aglutinando-se umas às outras. E.coli uropatogênica
(UPEC) causa frequentemente infecções do trato urinário (ITUs) em mulheres
jovens, por apresentarem receptores específicos na membrana de células do
epitélio da pelve renal (PLATELL et al., 2011).
A presença em alimentos de coliformes a 35ºC, indica condições
higiênicas precárias e de coliformes 45ºC indicadora de contaminação fecal e
presença de bactérias patogênicas que possuem o habitat no trato intestinal.
Qualquer alimento pode estar relacionado a surtos por E. coli quando exposto à
contaminação fecal, destacando-se as carnes cruas, frangos, leite cru, saladas.
O bovino é considerado reservatório natural, tornando a carne bovina o principal
veículo deste patógeno (KASNOWSKI, 2004).
Para crescimento e sobrevivência no alimento deste microrganismo é
necessário a interação de diversos fatores intrínsecos e extrínsecos.
Desenvolve-se em uma temperatura que pode variar de 7 a 46ºC, pH ótimo de
6,0-7,0 e atividade de água mínima é 0,95. É sensível ao aquecimento
dependendo da composição do alimento, pH e atividade de água (Aa), sendo
destruída a uma temperatura de 60ºC por poucos segundos (HOLT et al., 1994).
3.3.2. Salmonella spp.
São bactérias da família das Enterobactereaceae, dividida em três espécies,
a S. enterica, S. bongori e S. subterrânea, com aproximadamente 2.463
28
sorovares, entre os quais 1.367 pertencem a subespécie enterica (MALHEIROS,
2007). Estão amplamente difundidas na natureza e são capazes de infectar o
trato intestinal de todos os animais domésticos e selvagens e o homem (PIRES
& PICCOLI, 2012). São bactérias mesófilas, com temperatura de crescimento
ótimo entre 35 e 37ºC, possuem a forma de bacilos pequenos, a maioria dos
sorotipos é produtora de gás, H2S, lisina e ornitina descarboxilase positiva. São
urease e indol negativos e reduzem o nitrato a nitrito (HOLT et al., 1994). A
Salmonella spp. cresce em pH com intervalo de 4,5 a 9,0 e crescimento ótimo
na faixa de 6,5 a 7,5, pH da maioria dos alimentos de origem animal (HOLT et
al., 1994).
A Salmonella spp., bactéria entérica, é responsável por graves intoxicações
alimentares, nos últimos anos, a incidência de salmonelose aumentou em todo
o mundo, sendo considerado uma das causas mais comuns de doenças
transmitidas por alimentos a nível internacional (OLAIMAT & HOLLEY, 2015). A
maioria é patogênica ao homem, com diferenças de sintomatologia em
decorrência da variação no mecanismo de patogenicidade, idade e resposta
imune do hospedeiro (SILVA et al., 2010).
As salmonelas ocasionam as doenças conhecidas por salmoneloses que são
divididas em três grupos, a febre tifoide (Salmonella typhi), as febres entéricas
(Salmonella paratyphi) e as enterocolites (demais sorovares), atravessam a
camada epitelial intestinal, alcançam a lâmina própria, onde proliferam. São
fagocitadas pelos monócitos e macrófagos, desencadeando uma resposta
inflamatória, decorrente da hiperatividade do sistema reticuloendotelial. Diferente
da febre tifóide, nas enterocolites a penetração de Salmonella spp. fica limitada
à lâmina própria, restrita à mucosa intestinal, raramente observa-se septicemia
ou infecção sistêmica (MALHEIROS, 2007; NASCIMENTO, 2007).
A resposta inflamatória está relacionada também com a liberação de
prostaglandinas, que são estimuladoras de adenilciclase, o que resulta em um
aumento de secreção de água e eletrólitos, provocando diarreia aquosa (SILVA
et al., 2010). Além disso, as Salmonella spp. podem utilizar mecanismos que
contribuem com a infecção, como a cápsula, protegendo contra a fagocitose, os
lipopolissacarídeos (LPS), que são indutores do choque séptico, e as fimbrias
que auxiliam à adesão da bactéria ao hospedeiro (MALHEIROS, 2007).
29
Vários alimentos podem ser contaminados com a Salmonella spp.,
principalmente aqueles que possuem alto teor de umidade, de proteína e de
carboidratos, como carne bovina, suínos, aves, ovos, leite e derivados, frutos do
mar e sobremesas recheadas, que são mais susceptíveis à deterioração (FAI et
al., 2011; SPECTOR & KENYON, 2012). Para ocorrência de uma gastroenterite
é necessário a ingestão de grande número de salmonelas, dependendo do
sorotipo isolado, a dose infectante se encontra entre 2,0x102 a 1,0x106 UFC/g,
assim como, o alimento envolvido e a espécie de Salmonella, pois espécies
adaptadas ao homem necessitam de doses infectantes menores que as não
adaptadas para provocar a mesma sintomatologia característica da doença
(LOUREIRO, 2007). Entretanto, algumas vezes a doença pode ser fatal em
crianças, idosos ou imunocomprometidos, devido à menor resistência às
infecções (SILVA, 2011).
Frutas e vegetais são alimentos que também podem também ser
veiculadores de salmoneloses, e essa contaminação é decorrente do controle
inadequado da temperatura, de práticas de manipulação incorretas ou
contaminação de alimentos crus pelos alimentos processados através do uso de
utensílios de cozinha propiciando a contaminação cruzada entre as carnes
contaminadas e vegetais consumidos in natura (PAULA, 2002). Portanto, o
desenvolvimento de um programa de controle e monitoramento proporciona
melhorias no controle da Salmonella spp., em produtos de origem animal (FILHO
et al., 2011).
3.3.3. Staphylococcus spp.
Staphylococcus é um gênero de bactérias gram positivas, em forma de cocos,
um dos patógenos mais comuns causadores de doença no homem. Na
microbiologia de alimentos, Staphylococcus aureus merece destaque devido a
frequência das intoxicações alimentares causadas pelo consumo de alimentos
contendo suas enterotoxinas termoestáveis, que ao encontrar condições
favoráveis à sua multiplicação no alimento, em poucas horas, a pessoa infectada
apresenta os sinais clínicos (HOLT et al., 1994).
Podem ser encontrados como microbiota de mamíferos, mas podem
sobreviver em diversos ambientes e a desidratação ou secagem. Existem mais
30
de 30 espécies reconhecidas de estafilococos e S. aureus é considerado o mais
patogênico para seres humanos e outros animais, devido à sua capacidade de
colonizar uma vasta gama de espécies, pode ser prontamente transmitido a partir
de uma espécie para outra, incluindo de humanos para outros animais e viceversa (CARVALHO et al., 2013).
As enterotoxinas são produzidas durante a fase de crescimento do
microrganismo no alimento, são peptídeos de pequeno peso molecular, não são
destruídas pelos processos de cocção e esterilização. São produzidas as toxinas
A, B, C (C1 e C2), D, E, F e G. A enterotoxina B encontra-se associada a cerca
de 50% dos casos de síndrome do choque tóxico (TSS), pois como
superantígeno, estas toxinas estimulam os linfócitos liberarem citocina as quais
provocam o choque. A toxina 1 (C1) da síndrome do choque tóxico (TSST-1)
pode causar desde intoxicações alimentares até desordens multissistêmicas
(SANTANA, et al., 2010; BRANDÃO et al., 2013).
As enterotoxinas estafilocócicas (SE) são os principais agentes de
intoxicação e são relatadas em vários surtos de doenças transmissíveis por
alimentos (BRANDÃO et al., 2013). Como são termoestáveis, tornam o período
de incubação bastante curto após a ingestão do alimento contaminado (DORES
et al., 2013), a cocção dos alimentos não a destrói, mesmo com o microrganismo
é destruído, mas uma vez formada no alimento pode causar intoxicação
(MEDEIROS et al., 2013).
Staphylococcus aureus também produz uma série de enzimas extracelulares,
onde a mais conhecida é a coagulase, enzima que caracteriza a espécie, esta
coagula o sangue ao transformar o fibrinogênio em fibrina, da mesma forma que
a trombina humana, formando coágulos à volta das bactérias dificultando o seu
reconhecimento e a fagocitose pelas células do sistema imunitário (SANTANA,
et al., 2010).
3.4.
Controle dos microrganismos
A carne por ser o alimento mais consumido, torna-se grande a preocupação
quanto ao seu fornecimento saudável, este produto mesmo sendo obtido de um
animal sadio, pode ser contaminado durante o abate e/ou durante o
31
processamento, comercialização e armazenamento inadequados, chegando ao
consumidor e oferecer risco à saúde (NASCIMENTO et al., 2014).
A adoção de medidas eficazes de limpeza e cuidados higiênicos durante todo
o processamento deste alimento, tem o intuito de, senão eliminar, reduzir a carga
microbiana presente. Além do cuidado com o ambiente, é necessário também
adoção de medidas de higiene com os manipuladores dos alimentos
(NASCIMENTO et al., 2014). É imprescindível o estabelecimento destas
medidas para minimização da contaminação, desde a diminuição da
contaminação de matéria-prima, limpeza e sanitização dos equipamentos,
controle de pragas, insetos e roedores, prevenção da contaminação cruzada
entre portadores assintomáticos e matéria-prima, estabelecimento de Boas
Práticas de Fabricação (BPF) entre outras medidas, garantindo a qualidade do
produto, segurança do consumidor e dos manipuladores (ALCANTARA et al.,
2012).
O controle da qualidade do produto final não oferece garantia de qualidade,
devido à dificuldade de analisarem amostras em quantidades suficientes para
obtenção de informações suficientes sobre o lote do produto, além do tempo
prolongado das análises microbiológicas e o alto custo. Portanto, torna-se
necessário uma intervenção na educação para que ocorra a manipulação
adequada dos alimentos, garantindo a segurança no manuseio e o fornecimento
de um alimento seguro à população (ANJOS, 2013).
Um alimento seguro é resultante da idoneidade, integridade e legalidade,
estes requisitos tornam-se fundamentais, pois, além de obter rentabilidade do
produto, há o cumprimento dos requisitos legais e satisfação e segurança do
consumidor. Além disto, seus constituintes ou contaminantes que podem causar
perigo à saúde estão ausentes ou em concentrações abaixo do limite de risco
(SOUZA et al., 2005)
Um alimento pode tornar-se de risco em decorrência de uma manipulação
inadequada, uso de matérias primas cruas e contaminadas, contaminação e/ou
crescimento microbiano, uso inadequado de aditivos químicos, adição acidental
de produtos químicos e poluição ambiental e degradação de nutrientes (FROTA,
2009).
32
3.5.
Conservação de alimentos
A conservação de alimentos é aplicada desde épocas pré-históricas em
decorrência da necessidade da estocagem dos alimentos para uso posteriores
fazendo surgir a secagem de carnes ao sol, um dos métodos mais antigos.
Posteriormente, percebeu-se que o uso do sal dos desertos associado à ação
do sol mantinha os alimentos por longos períodos. E a partir daí, iniciou-se o
processo de conservação de alimentos com técnicas empíricas, que se mantêm
até hoje. Mas, a evolução dos conhecimentos científicos e tecnológicos iniciouse a descoberta e o desenvolvimento de outros métodos de conservação
(CARDOSO & RUBENSAM, 2011).
Pesquisas na área da microbiologia de alimentos estimularam para
desenvolvimento de estudos voltados à conservação de alimentos para que
recebesse destaque no ramo da ciência dos alimentos (SOUZA et al., 2005;
BAJPAI et al., 2012). A conservação de alimentos tem como objetivos principais
manter os microrganismos sob controle, assim como, preservar a qualidade
sensorial e nutritiva dos mesmos (BARBOSA, 2010).
Os alimentos estão propícios a uma série de alterações desde sua obtenção
ou fabricação até sua aquisição e consumo, as quais irão influenciar na validade,
ou vida de prateleira, que é o período de tempo que o alimento se mantém seguro
para o consumidor, através da conservação de suas características sensoriais,
físicas, químicas, funcionais e nutricionais sob as condições de armazenagem
adequadas (AUN et al., 2011).
A velocidade das alterações microbiológicas é afetada por diversos fatores
que se relacionam com as características intrínsecas do alimento (atividade de
água, pH, composição química e o potencial redox) e os fatores extrínsecos
(temperatura, umidade relativa e a composição) (BARBOSA, 2010). Além da
contaminação por microrganismos, ocorrem também as alterações que podem
ser de natureza bioquímica através da ação de enzimas naturalmente presentes
nos alimentos (CARDOSO & RUBENSAM, 2011).
A conservação de alimentos baseia-se no uso de técnicas que reduzam as
taxas de alterações microbiológicas ligadas à segurança alimentar. São
utilizados vários métodos, como o uso de calor e radiação ionizante, que se
baseiam na inativação de microrganismos, reduzindo a carga microbiana e a
33
desnaturação das proteínas e têm os que possuem como princípio o controle do
crescimento, representado pelas fermentações e os baseados em redução de
temperatura, pH ou atividade de água (BARBOSA, 2010; ANJOS, 2013).
Apesar da diminuição da carga microbiana, estes processos térmicos
apresentam efeitos adversos nas propriedades sensoriais e nutricionais, entre
eles destacam-se, a esterilização, a pasteurização e o branqueamento. Já nas
técnicas que utilizam o frio, têm-se a refrigeração e congelamento, as quais
conservam melhor as propriedades sensoriais e nutricionais do alimento
(FRANCO & LANDGRAF, 2002).
Quando não se pode empregar tratamentos físicos e/ou biológicos na
conservação de alimentos, torna-se necessário o uso de conservantes, que
impedem ou retardam alterações provocadas por microrganismos (SOUZA,
2006). Esses conservantes possuem ação antimicrobiana com efeito no DNA,
membrana plasmática, parede celular, síntese proteica, atividade enzimática,
transporte de nutrientes. Por isso, a escolha do conservante deve ser baseado
no tipo de microrganismo, a facilidade de manuseio, o impacto no paladar, o
custo e a sua eficácia, onde o número de conservantes permitidos é bastante
reduzido (FRANCO & LANDGRAF, 2002). Portanto, faz-se necessário o
desenvolvimento e aplicação de produtos naturais com atividades antioxidante e
antibacteriana, especialmente em produtos cárneos, sendo útil para prolongar a
vida útil de armazenamento e prevenção de doenças alimentares (SOUZA,
2006).
O uso de óleos essenciais poderia surgir como alternativas economicamente
mais viável quando se pretende fazer o uso das propriedades antimicrobianas
destes compostos utilizados na conservação de alimentos. Os compostos ativos
das especiarias estão incluídos na classe dos conservantes de alimentos de
ocorrência natural e alguns tem sua inclusão permitida pelos órgãos reguladores
(ANVISA, 1999).
A avaliação do efeito antimicrobiano é de fundamental importância para a
realização do desenvolvimento de sistemas de bioconservação, que segundo
Trajano et al. (2009) é um sistema de preservação bem aceito, sendo um
procedimento natural para promover a extensão da vida útil e segurança
microbiológica dos alimentos.
34
São relativamente fáceis de obter, apresentam baixa toxicidade em
mamíferos e degradam-se rapidamente na água e no solo, os quais tornam-se
não poluidores do ambiente (KAVANAUGH & RIBBECK, 2012). São compostos
potencialmente utilizados no controle sanitário, que propiciam o desenvolvimento
de técnicas que possam diminuir os efeitos negativos de oxidantes, radicais e
microrganismos, o uso desses metabólitos secundários cresce cada vez mais,
devido a preferência dos consumidores pelos benefícios à saúde (PEREIRA et
al., 2008).
Por isso, a busca constante por produtos naturais como fontes de
antioxidantes com intuito de utilização nos alimentos como conservantes para
minimizar a oxidação dos mesmos, pois muitos antioxidantes naturais, como
extratos de alecrim e especiarias em estudos mostraram ser mais ativos do que
os antioxidantes sintéticos e suas aplicações em alimentos precisam ser
exploradas, assim como, a manutenção das qualidades sensoriais e nutricionais
do alimento (SHAH et al., 2014).
Além da diminuição do uso de aditivos químicos que possuem sua
aplicabilidade questionada quanto a sua segurança, sendo os óleos essenciais
alternativas naturais, assim como, a diminuição de sal ou açúcar por razões
dietéticas, favorecendo o uso de outros condimentos, que possuem como
alternativa o uso associado à combinação de vários óleos, diminuindo o efeito
sensorial e potencialização do efeito antimicrobiano, podendo ser utilizado de
forma segura e efetiva (ALVES, 2010).
3.6.
Óleos essenciais
Os óleos essenciais são substâncias derivadas do metabolismo secundário
das plantas, que podem ser classificados nos terpenos e os seus derivados
oxigenados, hidrocarbonetos cíclicos e seus derivados, álcoois de aldeídos
(BERTINI et al., 2005; OKOH, 2010) que possuem como função principal, a
proteção contra predadores (BERALDO et al., 2013).
Podem ser chamados de óleos voláteis, etéreos ou essenciais, as quais são
atribuídas em função de suas características físico-químicas, como serem
líquidos e de aparência oleosa à temperatura ambiente e evaporarem quando
35
expostos ao ar em temperaturas comuns, que os difere dos óleos fixos, além do
aroma intenso e agradável (TAVARES, 2007; BERALDO et al., 2013).
São compostos de composição complexa, com a presença de terpenos
(mono, sesqui e diterpenos) e fenilpropanóides (BRITO, 2007; SIMOES &
SPITZER, 2000), álcoois simples, aldeídos, cetonas, fenóis ésteres, éteres,
óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas e cumarinas até
compostos como enxofre, que podem variar conforme a parte da planta, o grau
de desenvolvimento, o horário e o ambiente que estão localizadas (ROCHA &
SANTOS, 2007).
Estão presente em diferentes concentrações, sendo o majoritário o composto
farmacologicamente ativo, o qual determina as propriedades biológicas
(SANTURIO, 2007; BARBOSA, 2010). Dentre as substâncias estão os
terpenóides e compostos fenólicos como timol, carvona, carvacrol, mentol,
muroleno, citral, eugenol, 1-8 cineol, limoneno, pineno, linalool e seus
precursores (OUSSALAH et al., 2006). Quanto ao mecanismo de ação, este não
está bem caracterizado, associando-se ao caráter lipofílico dos compostos, que
atua através do acúmulo em membranas e perda de energia pelas células
(DUARTE, 2006).
Apresentam atividade antisséptica, propriedades medicamentosas e
flavorizantes, detendo-se maior conhecimento de alguns dos mecanismos de
ação, principalmente quanto ao efeito antimicrobiano (BARBOSA, 2010). A
atividade antimicrobiana deve-se a presença e o nível de concentração dos
diferentes compostos fitoquímicos, como fenólicos, flavonóides, alcalóides,
saponinas, taninos, o carvacrol, terpenos e timol entre outros, os quais são
reconhecidos como a fonte potencial para esta atividade (FALOWO et al., 2014).
Estes
compostos
exercem
seus
efeitos
diretamente
na
membrana
citoplasmática, provocando alterações na sua estrutura e funções dos
microrganismos (HOLEY & PATEL, 2005). São também utilizados como
antibióticos, analgésicos, sedativos, anti-inflamatório, antiespasmódico e
anestésico local (BHOWMIK et al., 2012; DIAS, 2008).
O uso indiscriminado de drogas ocasiona a resistência de patógenos
humanos e animais, os quais são bem documentados da evolução biológica,
sendo um sério problema tanto em países desenvolvidos como em
desenvolvimento, por isso busca-se por novas substâncias antimicrobianas
36
provenientes de fontes naturais, apresentando-se importante nas companhias
farmacêuticas, considerando que muitas plantas não são estudadas e que
podem ser avaliadas quanto à ação antimicrobiana (DUARTE, 2006).
3.6.1. Alecrim (Rosmarinus officinalis L.)
O alecrim (Rosmarinus officinalis L.) é uma espécie da família Lamiaceae,
uma planta que cresce em Países do Mediterrâneo, sul da Europa e na região
litorânea através de áreas da Ásia Menor. Sua erva e óleo são usados como
agentes de especiarias e aromatizantes em processamento de alimentos por
estabelecer um sabor desejável, e tem sido objeto de estudo para atividade
antioxidante, antimicrobiana, inseticida, anti-inflamatória, antinociceptiva e
antifúngico, além da sua utilização na medicina tradicional para o tratamento de
depressão, insônias e dores articulares (DERWICH et al., 2011).
Diferentes partes de plantas têm sido usados para obter óleos essenciais,
entre estes incluem as flores, folhas, sementes, raízes, vapores, cascas e
madeira, rica em compostos fenólicos, com alta atividade antimicrobiana contra
microrganismos gram positivos e negativos, mas esta atividade não está bem
caracterizada, devido a quantidade de diferentes compostos químicos presentes
nos óleos essenciais, sendo assim, atribui-se que a atividade antimicrobiana
esteja associada a diversos mecanismos (ROŽMAN & JERŠEK, 2009).
A composição química do óleo essencial da planta de um modo geral,
depende de um número de fatores, como hereditariedade, parte e idade da
planta, método de isolamento, condição ambiental, temporada da coleta,
procedimento de desidratação e condição de armazenamento sob o qual a planta
coletada é mantida até que o óleo essencial seja extraído (OUSSALAH et al.,
2007).
O óleo essencial contém vários compostos em diferentes concentrações,
sendo caracterizado por dois ou três componentes principais, que se apresentam
em concentrações mais elevadas. Estes componentes em maior concentração
são os responsáveis pelas propriedades biológicas dos óleos essenciais, que
atuam sinergicamente ou regulando uns aos outros (VERMA et al., 2011).
37
3.6.2. Cravo da índia (Syzygium aromaticum L. Merr & Perry)
Syzygium aromaticum é uma árvore pertencente à família Myrtaceae,
cultivada nas ilhas da Tanzânia, Madagascar, Indonésia, Ilhas Comores, Brasil
e SriLanka (PINTO et al., 2009), mas o maior produtor é a Indonésia com 50.000
- 60.000t por ano. Uma planta tropical que exige clima quente e úmido, com
precipitação de 2500-3000 mm3, planta perene, chegando a 30 m de altura, o
brotamento das flores ocorre após 5 anos e alcança a plena produção após 1520 anos. Sendo que nos últimos 10 anos a sua produção diminuiu devido a
questões agronômicas, que é influenciada pela precipitação de chuva, a
exposição a baixas e altas temperaturas, o comprimento do período seco e
outros parâmetros fisiológicos e ecológicos, além dos econômicos e sociais
(BAIETTO, 2014).
A colheita dos botões de flores é manual para não danificar os ramos, que
afetaria o crescimento, botões são expostos em sol direto por um período de
quatro a cinco dias ou quatro horas em aparelhos de secagem. No entanto, o
principal problema associado com a colheita dos botões de flores intactas
associa-se a falta de qualificação e tempo para separação dos talos. Mesmo que
a fase juvenil de árvores de cravo tenha a duração de cerca de 5 anos, a
produção total ocorre em plantas mais elevadas e vigorosa (BAIETTO, 2014).
A determinação do tempo de colheita é também crucial para otimizar o
rendimento e a concentração de óleos essenciais no produto seco. Seu óleo
essencial é composto de 18 componentes que representam mais de 99% do óleo
essencial de cravo, sendo os principais: eugenol (87%), eugenilo acetato (8%),
β-cariofileno (3,5%) (BAIETTO, 2014), além de outros importantes componentes
que incluem vanilina, ácido crategolico, taninos, ácido gallotanico, salicilato de
metila (analgésico), os flavonóides eugenina, kampferol, ramnetina e eugenitina,
triterpenóides como o ácido oleanólico, estigmasterol e campesterol e vários
sesquiterpenos (HEMA et al., 2010).
Seu óleo essencial tem sido associado a efeitos antisépticos, analgésicos e
anestésicos úteis, sendo amplamente utilizado na medicina dental. Outras
atividades são relatadas, como atividade contra leveduras e fungos filamentosos
e várias espécies de fungos de origem alimentar e patogênico para humanos e
38
estudos
têm
demonstrado
potente
efeitos
antifúngicos,
antivirais
e
antibacterianos (SAEED & TARIQ, 2008).
Em relação ao espectro de atividade antifúngica e a relação com a
composição química, torna-se necessário complementar os estudos da atividade
antimicrobiana e sua relação com os compostos isolados. Em decorrência dos
estudos realizados com os extratos das plantas, acredita-se que a ação dos
compostos majoritários do óleo essencial se fundamente na membrana celular
do microrganismo (PINTO et al., 2009). Na Europa, o cravo tornou-se popular
devido à sua capacidade de preservar os alimentos, e mascarar o cheiro de
alimentos mal conservados (BHOWMIK et al., 2012).
3.6.3. Limão tahiti (Citrus latifolia Tanaka)
O gênero Citrus foi classificado em 1875 por Hoocke em somente quatro
espécies, enquanto Engler, em 1931, propôs 11 espécies para o gênero e
Swingle, em 1943, subdividiu o gênero Citrus em dois subgêneros: Papeda e
Citrus, com 16 espécies. Tanaka em 1961 propôs a existência de 159 espécies
para os citros. Essas diferenças com relação ao número de espécies deveramse ao fato de Swingle considerar muitos dos representantes desse grupo como
híbridos,
enquanto
Tanaka
os
considera
como
espécies
verdadeiras
(BASTIANEL et al., 2001).
Os Citrus estão entre as frutas mais produzidas e consumidas no mundo,
destacando-se as laranjas, tangerinas, limas e limões (OLIVEIRA et al., 2008).
O limão 'Tahiti' (Citrus latifolia Tanaka) é um hibrido de citros, cultivado no
México, América do Sul, América Central, EUA e na Índia. No Brasil é uma
variedade comercial importante, onde são vendidos frescos tanto em mercados
como para indústrias para uma produção de concentrado de suco e óleo
essencial (STENZEL & NEVES, 2004).
Citrus pertence à família Rutaceae, considerado um gênero cosmopolita,
abundante na região tropical, gênero bem conhecido, não só para o consumo,
mas também pelas suas propriedades medicamentosas, devido a presença de
fenóis, incluindo flavonóides, que são potentes antioxidantes, propriedades que
se concentram em extratos obtidos a partir de frutas, além das folhas. Estas
39
plantas frutificam apenas uma vez por ano, no entanto, têm as folhas ao longo
deste tempo como parte das estratégias de cultivo e constituem um material de
resíduos (KAEWSUKSAENG et al., 2011).
As cascas dos frutos possuem diversos metabólitos secundários, produzidos
em decorrência da proteção contra fatores bióticos e abióticos, destacando-se
os terpenoides, carotenoides, cumarinas, furanocumarinas e flavonoides,
principalmente flavononas e flavonas polimetoxiladas, raras em outras plantas
(SIGARINI, 2004), os quais estão presentes em extratos e óleos, que despertam
interesse em diversas áreas de bioatividade, como atividade antibacteriana
(FISHER & PHILLIPS, 2008), antifúngica (LIU et al., 2012), antioxidante (PATIL
et al., 2009), inseticida (SISKOS et al., 2008) entre outras atividades.
As características antimicrobianas dos óleos dos Citrus só foram exploradas
recentemente, apesar da extensa bioatividade (FISHER & PHILLIPS, 2008).
Antimicrobianos naturais parecem ser alternativas viáveis na substituição de
conservantes ou desinfetantes químicos (ASHOK KUMAR et al., 2011), estes
muitas vezes poluidores e até alérgenos que possuem pouca aceitação dos
consumidores. Óleos compõem diversas preparações farmacêuticas pelas suas
propriedades antissépticas, nas áreas de ginecologia, oftalmologia e cirurgia,
mas pouco utilizados em alimentos (GERHARDT et al., 2012).
3.6.4. Manjericão (Ocimum basilicum L.)
O manjericão (Ocimum basilicum L.), pertence à família Lamiaceae,
possuindo entre 50 e 150 espécies (MAZUTTI et al., 2006) é uma planta
herbácea, anual ou perene, que ocorre de forma subespontânea no Brasil, atinge
até 1 m de altura e possui caule muito ramificado faz parte de um grupo de
plantas medicinais e aromáticas de grande valor econômico e tornou-se
importante por apresentar utilização cosmética, na alimentação e indústria
farmacêutica (COSTA et al., 2009), são vulgarmente utilizados como
condimentos em salsicha e indústrias de alimentos congelados, e também na
sua forma natural (OLIVEIRA et al., 2013), originárias de regiões tropicais e
subtropicais da Ásia, da África e da América Central e do Sul (MARTINS et al.,
2010).
40
O teor de óleo essencial contido nesta planta encontra-se na faixa entre 1,5
e 3% dependendo da região geográfica e da espécie (MAZUTTI et al., 2006).
Além deste, destacam-se os flavonóides, taninos, saponinas, ácido caféico e
cânfora. A atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjericão está
associada a seus constituintes metil chavicol e linalol, sendo assim, amplamente
utilizado na medicina popular no combate às infecções bacterianas. (FREIRE et
al., 2014).
A composição dos óleos essenciais extraídos das folhas e dos ápices com
inflorescência do manjericão varia de acordo com a espécie e a localização
geográfica, sendo classificados em quatro quimiotipos, de acordo com os
componentes majoritários do óleo: quimiotipo linalol-metil chavicol, metil
chavicol, metil cinamato e quimiotipo eugenol (MARTINS et al., 2010).
Entre os constituintes majoritários de uma espécie para outra ocorre
variações quanto a constituição, principalmente pelo fato dos componentes do
óleo essencial de Ocimum basilicum L. serem produzidos por duas rotas
bioquímicas diferentes: rota do ácido chiquímico e rota do ácido mevalônico. Na
primeira, os maiores constituintes da espécie são metil cavicol, eugenol, metil
eugenol e cinamato de metila, enquanto que na segunda os componentes
majoritários são linalol e geraniol (MAZUTTI et al., 2006; VENÂNCIO et al., 2011;
LUZ et al., 2013).
Amplamente utilizado na medicina popular como antiespasmódico,
antitérmico, auxiliando também na digestão e no combate de infecções
bacterianas e parasitárias intestinais. A atividade antimicrobiana do óleo
essencial do manjericão tem sido relatada como sendo predominantemente
associada aos seus constituintes majoritários, o metil chavicol e o linalol
(MARTINS et al., 2010).
42
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Isolamento e Identificação de linhagens bacterianas
Foi realizado a coleta de 17 amostras de carne bovina em feiras livres e
estabelecimentos comerciais no período de agosto/2013 a janeiro/2014, 100 g
de cada amostra foram pesados em sacos plásticos estéreis e levadas ao
laboratório de Microbiologia e Imunologia Animal do campus de Ciências
Agrárias da Univasf, onde foram submetidas à análise microbiológica para
isolamento e identificação de Staphylococcus aureus, Salmonella spp. e
Escherichia coli.
4.1.1. Detecção e Isolamento de Escherichia coli
Foram pesados 25g da amostra de carne e adicionados 225mL de água
peptonada e homogeneizada, onde obteve-se a diluição 10-1, e a partir desta
foram obtidas as diluições 10-2 e 10-3. Logo após, foram transferidos 1mL destas
diluições em tubo contendo 9mL de caldo LST (Lauril Sulfato de Sódio) + Durhan
e incubados a 35-37ºC por 24-48h. Os tubos que apresentaram produção de gás
e turbidez, transferiu-se uma alçada para tubos com 10mL de caldo EC e
incubados a 44,5ºC por 24-48h. Os tubos positivos foram estriados em placas
com ágar Mac Conkey e incubados a 35ºC por 24h. Realizou-se a coloração de
Gram para avaliação morfológica das colônias. Duas colônias características
foram transferidas para meio TSA para confirmação através das provas
bioquímicas, onde inoculou-se as colônias típicas em SIM (produção de H2S,
Indol e Motilidade), vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP) e citrato e
incubados a 35°C por 24 +/- 2 horas (Food and drug administration – FDA, 2013).
4.1.2. Detecção e Isolamento de Salmonella spp.
peptonada tamponada e homogeneizada, obtendo uma concentração de 10 -1 e
incubado a 37°C por 18+/-2 horas. Logo após, realizou-se o enriquecimento
seletivo, onde transferiu-se 0,1mL para 10mL de RV (Rapapport Vasiliadis) e
43
incubados a 41,5°C em banho-maria por 24+/-3h e 1mL para 10 mL de caldo TT
(Tetrationato) a 37°C por 24+/-3h. Após este período, realizou-se o estriamento
por esgotamento em XLD (Xilose Lisina Desoxicolato) e BS (Bismuto Sulfito) e
incubadas invertidas em estufa a 37+/-1°C por 24+/-3h. Verificou-se colônias
típicas e realizou-se a coloração de Gram para verificar a característica
morfológica da bactérias. Realizou-se o isolamento das colônias típicas para
realização da série bioquímica para identificação, através dos testes com TSI
(Agar Tríplice Açúcar Ferro) e LIA (Lisina Iron Ágar), SIM (produção de H2S, Indol
e Motilidade), vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP) e citrato e
incubados a 35°C por 24 +/- 2 horas (Food and drug administration – FDA, 2013).
4.1.3. Detecção e Isolamento Staphylococcus aureus
peptonada tamponada e homogeneizada, obtendo uma concentração de 10 -1,
logo após, retirou-se alíquotas de 1mL e adicionou em tubos com 9mL de Água
peptonada tamponada (APT), obtendo diluições de 10 -2 e 10-3. Em seguida,
realizou-se a inoculação na superfície de placas contendo Ágar Baird-Parker.
Sendo inoculado 0,3mL da diluição 10-1 em três placas e 0,1mL em outra, bem
como 0,1mL das diluições 10-2 e 10-3 em outras duas placas. Após a secagem
do inóculo as placas foram invertidas e incubadas a 35-37ºC por 48 horas. Após
esse período identificou-se colônias típicas, as quais apresentam-se como
colônias circulares, pretas ou cinzas escuras, convexas, bordas perfeitas,
rodeadas por uma zona opaca ou halo transparente. Destas colônias típicas
foram escolhidas três colônias características e estriou em ágar Tryptose Soya
Ágar (TSA), em seguida foi realizado coloração de gram para caracterização
morfológica e os testes de catalase, DNAse e PAB (Purple Ágar Base) (Food
and drug administration – FDA, 2013).
4.2. Óleos essenciais
Os óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), cravo da índia
(Syzygium aromaticum L. Merr & Perry) e manjericão (Ocimum basilicum L.)
44
foram extraídos através da destilação a vapor d’água e limão tahiti (Citrus latifolia
Tanaka) extraído através da prensagem a frio das cascas, os quais foram
adquiridos da empresa Laszlo Aromaterapia, situada na cidade de Belo
Horizonte-MG, com composição mostrada na tabela 1.
Tabela 1: Óleos essenciais, composição química e estrutura dos constituintes majoritários.
Condimento
Alecrim
Nome
Composição
Constituinte
Estrutura do constituinte
cientifico
química
majoritário
majoritário
Rosmarinus
Cânfora (20-
Pineno (25-30%)
2,6,6-Trimetil
officinalis L.
25%),
biciclo[3.1.1]hept-2-eno ((−)-
1,8-cineol (15-
α-Pineno)
20%),
CH3
Mirceno (2-3%),
Pineno (25-30%),
Verbenona (23%), Borneol (34%),
Acetato de
H3C
bornila (1-3%) e
Cimeno (2-3%)
Cravo da
Syzygium
Eugenol (90-
Eugenol (90-
índia
aromaticum
95%),
95%)
L. Merr &
β -cariofileno (<
Perry
1-3%), Acetato
CH3
2-metoxi-4- (2-propenil) fenol
HO
CH3
O
de eugenila (<
1%),
β-cariofileno (< 13%),
α-humuleno (<
1%) e Oxido de
cariofileno (< 1%)
CH2
45
Limão Tahiti
Citrus
Pineno (15-20%),
Limoneno (50-
1-metil-4- (1-metiletenil)-
latifólia
γ-terpineno (3-
55%)
ciclohexano
Tanaka
7%), Bisaboleno
(< 4%),
CH3
H2C
Limoneno (5055%), Cimeno (69%), Mirceno (<
2%), Acetato de
Piperitol (1-2%) e
Bergamoteno (23%)
CH3
Manjericão
Ocimum
Linalol (52-58%),
basilicum L.
1,8 Cineol (6-
Linalol (52-58%)
3,7-dimetil-1-6-octadien-3-ol
9%), Eugenol (35%), Cadineno
H3C
OH
(2-5%), Murolol
(2-6%),
Cariofileno (12%),
CH2
Bergamoteno (59%) e
Germacreno (24%)
H3C
CH3
4.3. Teste de Sensibilidade aos óleos essenciais
Foram pesados 0,25 g de cada óleo essencial e diluídos em 5mL de DMSO e
5mL de metanol, obteve-se uma solução estoque na concentração de 25mg/mL.
A técnica de microdiluição em caldo teve como princípio as instruções contidas
no documento M07-A9 (CLSI, 2012), que consistiu na distribuição de 200μL de
caldo Mueller-Hinton em placas de microtitulação, a seguir, 200μL da solução
estoque do óleo essencial foram acrescidos ao primeiro poço e, após
homogeneização, transferidos para o segundo e assim sucessivamente, sendo
obtidas as seguintes concentrações: 12.500μg/mL; 6.250μg/mL; 3.125μg/mL;
1.562,5μg/mL; 781,2μg/mL; 390,6μg/mL; 195,3μg/mL e 97,6μg/mL.
46
Na preparação dos inóculos utilizou-se solução salina para obtenção de
suspensão bacteriana com turvação estabelecida através da leitura em
espectrofotômetro na absorbância de 600nm, obtendo uma densidade óptica de
0,190 para os isolados de Escherichia coli (2,37x108 UFC/mL), 0,145 para os
isolados de Salmonella spp. (2,43x108 UFC/mL) e na absorbância de 546 nm,
com uma densidade óptica de 0,035 para os isolados de Staphylococcus spp.
(1,36x107 UFC/mL), valores obtidos pelo método de contagem utilizando
plaqueamento em profundidade em meio de cultura Plate Count Ágar (PCA).
Desta suspensão retirou-se 100μL e adicionou em 9,9mL de caldo MuellerHinton, da qual retirou-se 10μL que foram inoculados nos poços de microplacas
contendo a diluição dos óleos essenciais de manjericão (Ocimum basilicum L.),
limão tahiti (Citrus latifoliaTanaka), alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e cravo da
índia (Syzyguim aromaticum L.). As microplacas foram incubadas a 37°C por
24h, em condições de aerobiose.
Com a utilização de um replicador retirou-se alíquota de 10μL que foi semeada
em superfície de ágar Mueller-Hinton e incubou-se por 24 horas a 37ºC onde
determinou-se a concentração bactericida mínima (CBM), definida como, a
menor concentração do óleo essencial em estudo capaz de causar a morte do
inóculo. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
4.4.
Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre
bactérias patogênicas em carne moída
Realizou-se os ensaios de contaminação artificial em carne moída utilizando
culturas de bactérias patogênicas cultivadas em Triptose Soya ágar (TSA) por
24 horas a 35ºC, as quais foram padronizadas em espectrofotômetro com leitura
de densidade óptica de 0.145, 0.190 e 0.035 obtendo concentração bacteriana
ao redor de 2,43x108 UFC/g de Salmonella enterica ATCC 10708, de 2,37x108
UFC/g de Escherichia coli ATCC 35218 e de 1,36x107 UFC/g de Staphylococcus
aureus ATCC 25923, respectivamente, contagem estas que foram obtidas
previamente
pelo
método
de
contagem
utilizando
plaqueamento
em
profundidade em meio de cultura Plate Count Ágar (PCA). Utilizou-se como
47
controle positivo a carne moída com a adição de bactéria e sem adição dos óleos
essenciais.
A introdução de cada bactéria foi realizada diretamente na carne, que foi
previamente esterilizada em recipiente de vidro estéril, desta carne esterilizada
retirou-se 10g e realizou-se a contagem para verificação da ausência de bactéria
e assim, utilizada como controle negativo. Logo após homogeneizou-se a
bactéria no alimento, onde realizou-se a contagem bacteriana, estabelecendo
assim o controle positivo, em seguida adicionou-se o volume do respectivo óleo
essencial correspondente aos valores de 1% e 10% p/v. Após adicionar e
misturar os óleos nas amostras estas foram mantidas em temperatura de 8ºC
por período três horas para realização da primeira contagem (BARBOSA et al.,
2009 com modificações).
Logo após, realizou-se a contagem bacteriana nos tempos de 0, 4, 6, 20 e 24
horas de armazenamento da carne à temperatura de 8ºC, visando verificar a
influência do tempo de contato entre os óleos essenciais e bactérias. Para a
contagem bacteriana utilizou-se diluições seriadas de cada amostra de alimento,
partiu-se da diluição inicial de 10g em 90mL de água peptonada tamponada
estéril obtendo-se a diluição 10-1 e a partir desta realizou-se diluições seriadas
até 10-6, em seguida o plaqueamento em profundidade em meio de cultura Plate
Count Agar (PCA) e incubou a 37oC/24 horas e após este período realizou-se a
contagem de colônias nas placas contendo entre 25 e 250 colônias, com o auxílio
de um contador de colônia. Para o resultado final, o número de colônias foi
multiplicado pelo fator inverso da diluição da respectiva placa de contagem e o
resultado expresso em UFC/g.
49
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Análise microbiológica
5.1.1. Coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli
A Tabela 2 apresenta os valores do número mais provável (NMP/g)
encontrados para coliformes totais e termotolerantes nas amostras das carnes.
Observou-se que em todas as amostras analisadas foram detectadas a presença
de coliformes totais com valor médio >1,1x103 NMP/g em 88,24%, 1,1x103 NMP/g
em 5,88% e 1,5x101 NMP/g em 5,88%. Quanto a presença de coliformes
termotolerantes o valor médio foi >1,1x103 NMP/g em 82,36%, 2,1x102 NMP/g em
5,88%, 1,1x103 NMP/g em 5,88% e 1,5x101 NMP/g em 5,88%. Das amostras
analisadas, 88,23% apresentaram-se fora dos limites máximos estabelecidos
pela ANVISA, através da Resolução RDC n°12 de 02/01/2001 que apresenta
limite de 5,0x103 a 104 NMP/g de coliformes a 45°C (BRASIL, 2001).
Quanto a presença de E.coli confirmou-se em 76,47% (13/17) amostras,
observando-se as características das colônias em ágar Mac Conkey (figura 1) e
identificação através da coloração de Gram, onde apresentaram-se em como
cocobacilos gram negativos (figura 2), e das provas bioquímicas de VM, VP, SIM,
GOF e citrato, onde obteve-se os resultados, positivo, negativo, H2S negativo,
indol positivo e motilidade positiva, fermentativo e negativo, respectivamente.
Sendo este o padrão bioquímico esperado para a espécie (FRANCO e
LANDGRAF, 2002).
50
Figura 1. Características das colônias típicas de E.coli em ágar Mac Conkey.
Fonte: SILVA, N.D.S, 2015.
Figura 2. Morfologia da Escherichia coli pelo método de coloração de Gram: cocobcilo gram
negativo
51
A ocorrência em alimentos de coliformes totais a 35°C indica condições
higiênicas precárias e de coliformes termotolerantes a 45°C é considerada
indicadora de contaminação fecal e da possibilidade da presença de bactérias
patogênicas que tem seu habitat no trato intestinal. Segundo Lundgren et al.
(2009) em todas as amostras de carne bovina analisadas foram detectadas a
presença de coliformes totais com valor médio de 1,8x10 3 NMP/g e
termotolerantes, predominando o valor >2,4x103 NMP/g, equivalendo a 70% das
amostras analisadas.
Silva et al. (2006) mostraram que o grupo dos coliformes totais é utilizado
como indicador geral das condições higiênico sanitárias do ambiente de
processamento de alimentos e que a contagem de E. coli é utilizada como
indicador de contaminação fecal recente. Conclusões que confirmam os estudos
do presente trabalho, onde evidenciou-se que a presença de coliformes totais e
termotolerantes e E.coli pode estar diretamente ligada a manipulação e
conservação inadequadas das amostras de carne analisadas.
Nascimento et al. (2014) encontraram para coliformes a 45°C o valor de
≥1,5x103 NMP/g em 50% das amostras analisadas e ≥2,4x103 NMP/g em 37,5%
para coliformes a 35°C, sugerindo que tais resultados ocorrem em consequência
de as carnes terem sido armazenadas em condições higiênico-sanitárias
inadequadas, ou contaminadas devido às condições de higiene deficitárias dos
locais de abate, processamento, exposição e comercialização, bem como dos
manipuladores em geral.
Foi observado durante a coleta das amostras, principalmente em feiras livres,
que as carnes eram depositadas em barracas sem refrigeração, os
manipuladores não utilizam luvas para manusear, assim como, o local de
comercialização sem estrutura alguma para estabelecer as condições mínimas
de higiene. Assim como, diversos autores que falam da contaminação da carne
bovina e subprodutos nos estabelecimentos comerciais de varejo pode ser
observada de norte a sul do Brasil, onde observa-se que o processamento da
carne, sua moagem e a manipulação nos pontos de venda são feitos em
condições de higiene deficientes (BALBANI & BUTUGAN, 2001; MOURA et al.,
2007; SOARES, 2011; LIMA et al., 2013; NASCIMENTO et al., 2014).
Moura et al. (2007) observaram que 62,50% (15/24) das amostras
encontravam-se fora dos padrões, apresentando-se em condições sanitárias
52
insatisfatórias para o consumo humano, apresentando contagem acima dos
limites
estabelecidos
de
1,2x104
a
2,5x107
UFC/g
para
coliformes
termotolerantes, já os coliformes totais, em 79,16% (19/24) as contagens
variaram de 1,1x104 a 3,7x107, sendo insatisfatórias para o consumo.
A qualidade da carne in natura é reduzida significativamente, uma vez que
este é um alimento perecível, que no seu processamento até a chegada ao
consumidor, sofre elevada manipulação, mesmo com o uso de várias técnicas
de conservação (SOARES, 2011). Bezerra et al. (2010) encontraram entre as
carnes de hambúrguer avaliadas, onze (31,4%) fora dos padrões de higiene,
onde mostraram níveis de coliformes fecais acima dos permitidos pela legislação
em decorrência do manejo inadequado.
No presente trabalho notou-se que o manuseio inadequado e as práticas
higiênicas deficientes possivelmente levam à contaminação dos alimentos com
esses microrganismos, bem como, confirmam Tan et al. (2014) que verificaram
a prevalência de E. coli nas mãos de manipuladores de alimentos, que variou de
9,41-14,12% e identificaram alta prevalência deste microrganismo nos alimentos
após preparação, em decorrência da contaminação cruzada entre as mãos dos
manipuladores, constatando que, possivelmente, não mantêm uma higiene
pessoal adequada ao manusear os alimentos.
5.1.2. Salmonella spp.
Das amostras de carne analisadas, 13 (76,47%) apresentaram contaminação
por Salmonella spp. em 25g, sendo confirmada através de provas tintoriais e
bioquímicas, a partir de colônias características (figura 3) onde verificou-se que
através da coloração de Gram as bactérias analisadas apresentaram-se
morfologicamente como bacilos gram negativos (figura 4) e nas provas
bioquímicas de TSI, LIA, VM, VP, SIM e citrato confirmou-se a identificação da
Salmonella spp., padrão bioquímico esperado para a espécie (FRANCO e
LANDGRAF, 2002).
O padrão exigido pela legislação de acordo com a Resolução RDC n°12 de
02/01/2001 determina que o padrão microbiológico adotado no Brasil seja a
ausência de Salmonella spp. em 25g do alimento analisado (BRASIL, 2001). A
inconformidade verificada pela presença de Salmonella spp. na carne,
53
caracteriza-lhe como imprópria para o consumo, por não estar de acordo com o
que é preconizado, onde sua presença pode ocasionar infecções alimentares
severas.
Figura 3. Características das colônias de Salmonella spp. em ágar Xylose Lysine Desoxycholate
(XLD)
Figura 4. Morfologia da Salmonella spp. pelo método de coloração de Gram: Bacilo gram
negativo.
54
A detecção desse microrganismo significa risco à saúde do consumidor,
consequência de um produto que não foi adequadamente conservado e
preparado, sendo fundamental que haja um canal de comunicação entre o
fomento e a indústria, através de medidas sanitárias e tecnológicas eficientes,
influenciando na redução da prevalência de Salmonella spp. no produto
(TESSARI et al., 2008).
Moura et al. (2007) observaram que em 7(29,1%) das amostras de carne
caprina analisadas estavam contaminadas por Salmonella spp., assim como,
Nascimento et al. (2014) que detectaram Salmonella spp. em 50% das amostras
de carne moída fresca obtidas em mercado, onde sua presença pode estar
associada a dejetos dos animais no ambiente dos matadouros ou contaminação
da água utilizada nos abatedouros ou nos locais de manipulação do produto.
No presente trabalho, onde foi observado durante a coleta, a manipulação e
armazenamento inadequado dos produtos cárneos, nota-se a importância de
uma higiene adequada no momento da manipulação. Assim como, Gunel et al.
(2015) identificaram Salmonella ssp. em hortaliças na Turquia e verificaram
percentuais em salsa, alface e pimentão de 3,2%, 1,6% e 0,4%,
respectivamente. E o sorotipo Anatum detectado na amostra de salsa
geralmente está associado à carne e produtos de aves, devido a uma
contaminação ocorrida com fezes de animais ou na comercialização,
consequente de uma manipulação inadequada.
Muluneh e Kibret (2015) analisaram os fatores de risco da presença de
Salmonella spp. em carcaças de bovinos em matadouro e verificaram alta
prevalência desta bactéria nas diversas partes da carcaça, possivelmente
associadas com as práticas higiênicas, as quais foram manipuladas por homens
sem o vestuário adequado, não possuíam o hábito de lavar as mãos após a
evisceração
do
intestino,
uso
de
facas
mal
higienizadas,
além
do
estabelecimento não higienizado corretamente.
Park et al. (2015) compararam a qualidade microbiológica das cascas de
ovos de galinha obtidos a partir de um mercado tradicional e um supermercado
moderno, e observaram que a taxa de sobrevivência de S. enterica em ovos
aumentou significativamente com a presença de fezes, sendo que, lavar os ovos
com a água diminuiu os níveis microbiológicos, onde observa-se que as
55
condições higiênicas inadequadas, assim como, as características intrínsecas
do alimento são favoráveis ao desenvolvimento de bactérias.
Li et al. (2015) avaliaram se a presença de Salmonella spp. em nódulos
linfáticos atuavam como fontes de contaminação na produção de carnes moídas,
assim como, as intervenções antes da pré-colheita, como vacinação, se
interfeririam na diminuição da carga microbiana presente nesses nódulos e
consequentemente na carne moída produzida, onde observou-se que esses
cuidados com os animais antes do abate e um manejo realizado de forma
adequado interfere na qualidade do produto final.
Mas alguns estudos mostraram resultados contrários ao do presente estudo,
como os realizados por Lundgren et al. (2009) que não detectaram a presença
de Salmonella spp. em nenhuma das amostras de carne bovina comercializada
em feiras livres e mercados, assim como, Bezerra et al. (2010) que não
detectaram a presença de Salmonella spp. em nenhuma das amostras de
sanduíche analisadas.
5.1.3.
Staphylococcus spp.
Todas as amostras de carnes analisadas apresentaram presença de
Staphylococcus spp., onde 12 (70,59%) estavam com contagem abaixo da
permitida, enquanto que 5 (29,41%) das amostras apresentaram-se com
contagem acima do limite máximo estabelecido pela Resolução RDC nº 12/2001,
da ANVISA, que é de 5,0×103 UFC/g (BRASIL, 2001), sendo tais valores
expressos na tabela 3. As colônias características foram identificadas através de
coloração de Gram, onde observou-se cocos gram positivos (figura 5) e testes
de catalase, DNAse e PAB (Purple Ágar Base).
56
Figura 5. Morfologia do Staphyloccocus spp. pelo método de coloração de Gram: coco gram
positivo.
A alta incidência de Staphylococcus spp. em carnes comercializadas em feiras
livre é indicativo que esses produtos foram manipulados, e sendo possivelmente
de origem clandestina, sem fiscalização veterinária, não sendo possível
assegurar precisamente as condições higiênico sanitárias dessas carnes e dos
produtos derivados (TAN et al., 2014).
Existe um grande potencial para contaminação com Staphylococcus aureus
durante o processamento dos alimentos, porque os seres humanos são o
principal reservatório, pois este microrganismo está presente nas diversas partes
do corpo, entre elas as mãos e narinas, sendo estas o local primário de
colonização (WU e SU, 2014; BOER et al., 2009; NASCIMENTO et al., 2014,
RESTA & OLIVEIRA, 2013). Sendo de fundamental importância garantir a
segurança microbiológica dos alimentos, evitando a transmissão destes agentes
patogênicos para o consumidor (PESAVENTO et al., 2007).
A detecção destes microrganismos está ligada diretamente a forma de
manipulação deste alimento, onde observou-se que durante a coleta das
amostras de carne não ocorreu adequadamente. Foram manipulados sem o uso
de luvas, sem higiene adequada, favorecendo assim, a contaminação.
57
Nascimento et al. (2014) observaram em seu estudo os locais de
comercialização onde verificaram condições higiênicas insatisfatórias, longe da
considerada ideal para manter os alimentos em condições adequadas para o
consumo, principalmente quando trata-se do comércio em feira-livre, fatos estes
também evidenciados por Lundgren et al. (2009) que retrataram condições
mínimas de estrutura e higiene no ambiente de venda de carnes.
Soares (2011) mostra que o S. aureus é o microrganismo mais patogênico do
gênero e apresenta-se com alto grau de tolerância a compostos como telurito,
neomicina, polimixina, cloreto de mercúrio, usados como agentes seletivos em
meios de cultura e que no Brasil é considerado o segundo patógeno de maior
ocorrência em surtos de intoxicação alimentar, apresentando menor frequência
que a Salmonella spp.
É relatado que surtos de intoxicações ou gastrenterite estafilocócicas são
provocados devido falhas na conservação dos alimentos e contaminação
decorrente de manipulação incorreta, bem como, a manutenção da saúde dos
manipuladores, devendo ser adotado as medidas necessárias evitando assim a
multiplicação bacteriana e consequentemente intoxicações (SOARES, 2011;
BOER et al., 2009). Lundgren et al. (2009) detectaram em todas as amostras
analisadas a presença de Staphylococcus coagulase positiva, com contagem
média de 2,7x105 UFC/g, sendo sua presença confirmada pelo teste da
coagulase.
Os resultados obtidos por Tan et al. (2014) mostraram que a prevalência de
S. aureus em mãos de manipuladores de alimentos variou de 65,88 - 74,12%,
sendo maior que a da E. coli, evidenciando que a higiene pessoal dos
manipuladores não estava sendo suficiente. Bezerra et al. (2010) encontraram
entre as carnes de hambúrguer avaliadas, onze (31,4%) encontravam-se fora
dos padrões de higiene, com níveis de Staphylococcus spp. acima dos
permitidos pela legislação brasileira.
Lima et al. (2013) realizaram uma investigação epidemiológica da ocorrência
de S. aureus em alimentos responsáveis por intoxicações alimentares e
constataram que se devia ao armazenamento de mais de 2 horas dos alimentos
à temperatura ambiente, refrigeração inadequada, cozimento inadequado e
reaquecimento impróprio de produtos alimentares, bem como o uso de matéria-
58
prima sem inspeção, principalmente carnes e ovos, os quais podem ser fontes
de perigos microbiológicos para a saúde pública.
Sendo no presente trabalho, observado que principalmente no comércio de
feira-livre as carnes eram mantidas em barracas, expostas a insetos, sem
refrigeração, condições de armazenamento inadequado o que vai de encontro à
Resolução RDC n. 275/2002 do Ministério da Saúde que dispõe sobre o
regulamento técnico com relação às condições higiênico sanitárias e de boas
práticas de fabricação (BPF) para estabelecimentos de alimentos, bem como em
relação à Portaria nº 304/96, que estabelece critérios para introdução de
modificações nas atividades de distribuição e comercialização de carne bovina,
bubalina, suína e avícola, visando à saúde do consumidor.
Tabela 2: Qualidade microbiológica das amostras de carne bovina fresca oriundas de feiraslivre e estabelecimentos frigoríficos da cidade de Juazeiro-BA e Petrolina-PE.
CT
CTs
Contagem
E. coli
Salmonella
Amostras
NMP/g
NMP/g
spp.
Staphylococcus
spp. (UFC/g)
A1
>1,1x103
>1,1x103
-
1,0.104
-
A2
>1,1x103
>1,1x103
-
6,0.102
-
A3
>1,1x103
>1,1x103
-
1,7.104
-
A4
>1,1x103
>1,1x103
-
2,0.103
+
A5
>1,1x103
2,1x102
+
2,0.103
+
A6
>1,1x103
>1,1x103
+
2,05.105
+
A7
>1,1x103
>1,1x103
+
2,0.102
+
A8
1,1x103
1,1x103
+
7,0.102
+
A9
>1,1x103
>1,1x103
+
1,7.104
+
A10
>1,1x103
>1,1x103
+
9,0.103
+
A11
>1,1x103
>1,1x103
+
2,0.103
+
A12
>1,1x10
3
3
>1,1x10
+
4,0.103
+
A13
1,5x101
1,5x101
+
1,0.101
+
A14
>1,1x103
>1,1x103
+
1,5.102
+
A15
>1,1x103
>1,1x103
+
7,0.102
+
A16
>1,1x103
>1,1x103
+
4,0.103
+
A17
>1,1x103
>1,1x103
+
3,0.103
-
Total: 17 amostras
*CT: Coliformes Totais; CTs: Coliformes Termotolerantes; NMP/g: Número Mais Provável;
*UFC/g: Unidade Formadora de Colônia por grama
59
5.2. Efeito antimicrobiano dos óleos essenciais
5.2.1. Alecrim (Rosmarinus officinalis)
Os testes de atividade antimicrobiana in vitro pelo método de microdiluição
em caldo (gráfico 1) demonstraram que o óleo essencial de alecrim não
apresentou ação inibitória contra nenhum dos isolados de Escherichia coli e
ATCC 35218 (anexo 1), bem como Salmonella spp. e Salmonella enterica ATCC
10708 (anexo 2) quando comparados ao controle do diluente que apresentou
média de 3.125, µg/mL. Já para os isolados de Staphylococcus spp. e
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (anexo 3) observou-se atividade
antimicrobiana para 1 (5,55%) a partir da concentração de 390,62µg/mL, 3
(16,67%) a partir de 781,25µg/mL, 2 (11,11%) a partir de 1.041,67µg/mL, 7
(38,89%) a partir de 1.562,50µg/mL e 5 (27,78%) a partir de 3.125, µg/mL, com
média de 1.743,34µg/mL, apresentando atividade de fraca a moderada.
Gráfico 1. Número de isolados em valores absolutos de Escherichia coli, Salmonella spp. e
Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de Alecrim
(Rosmarinus officinalis)
15
Escherichia coli
Staphylococcus spp.
Número de isolados
Salmonella spp.
10
5
0
390,6
781,25
1.041,60
1.562,50
2.604
3.125
4.167
6.250
Concentração µg/mL
Silva et al. (2009) demonstraram que os valores obtidos do óleo essencial
de alecrim para inibição do crescimento de E.coli ultrapassaram os 3% v/v, que
foi o maior valor utilizado naquele estudo, enquanto que o S. aureus apresentou
60
maior susceptibilidade, apresentando valores extremamente baixos, entre 0,3 e
0,6% v/v. Isto deve-se a possível diferença observada quanto a sensibilidade
bacteriana aos óleos em decorrência da existência de diferenças na estrutura da
parede bacteriana, pela presença de lipopolissacarídeo (LPS) nas bactérias
gram negativas e ausência nas gram positivas, que pode permitir ou não a
entrada de substâncias no interior da bactéria (BERTINI et al., 2005).
Esta característica da presença de LPS confere maior resistência as
bactérias gram negativas por evitar a difusão e acúmulo de óleo essencial na
célula bacteriana (PROBST, 2012), assim como ocorreu com os isolados do
presente estudo, onde observou-se a diferença de sensibilidade entre as
bactérias gram negativas e gram positivas, sendo as positivas mais sensíveis,
em decorrência dessa diferença estrutural da parede.
Na avaliação realizada por Probst et al. (2012) das possíveis diferenças no
perfil de sensibilidade de óleos essenciais sobre linhagens de Salmonella spp.
isoladas de alimentos e de infecções humanas, verificaram que não houve
diferenças significativas, para o R. officinalis que apresentou valores de
9,18mg/ml para Salmonella spp., 9,17mg/ml S. enteritidis isoladas de alimentos
e 9,19mg/ml para S. typhimurium provenientes de infecção. Dados estes que se
diferenciam do presente estudo, onde o mesmo óleo essencial não apresentou
atividade contra os isolados testados provenientes de alimentos. Fato que pode
estar ligado a concentração do óleo essencial, o método de avaliação da
atividade antimicrobiana, assim como, a proporção dos compostos químicos
presentes no óleo (JORDÁN et al., 2013a).
Enfatizando o quimiotipo do óleo de R. officinalis, Jordán et al. (2013b)
verificaram que a atividade antimicrobiana depende da ordem de abundância
dos componentes (eucaliptol, cânfora, a-pineno), notando que os quimiotipos
mostraram forte atividade contra os patógenos alimentares. A presença de
eucaliptol e α-pineno inibiram Salmonella typhimurium, já uma proporção
elevada de α-pineno aumenta a eficácia contra Staphylococcus aureus,
enquanto
que
a
presença
de
eucaliptol
como
majoritário
diminui
consideravelmente a eficiência, resultados que contradizem ao presente estudo,
pois na avaliação da atividade antimicrobiana, o óleo essencial não apresentou
atividade contra os isolados gram negativos, mesmo apresentando o α-pineno
61
como constituinte majoritário, ou até pela influência da técnica utilizada para
avaliação da sensibilidade (HAYOUNI et al., 2008)
Jordán et al. (2013b) avaliaram a composição química dos óleos essenciais
de R. officiinalis em dois estádios fenológicos e sua atividade antimicrobiana foi
testada pelo método de difusão em disco contra o patógeno E. coli, o qual não
apresentou atividade com zona de inibição <12 mm e contra S. typhimurium
apresentando atividade moderada com zona de inibição <12-20 mm. A E.coli
apresentou-se resistente ao alecrim, em decorrência da influência da
composição química do óleo, que pode variar com a época de colheita,
localização geográfica, método de extração (ZAOUALI et al., 2010). Estes
resultados confirmam os do presente estudo, onde o óleo também não
apresentou atividade antimicrobiana contra os isolados testados.
Na avaliação realizada por Ribeiro (2011) os valores de concentração
inibitória mínima do óleo essencial das folhas frescas de R. officinalis foram
capazes de inibir o desenvolvimento das cepas de E. coli na concentração de
200 μL/mL (20% v/v) e para as cepas de Salmonella spp. de 200 μL/mL (20%
v/v) e 400 μL/mL (40% v/v) e para cepa de Staphylococcus coagulase positiva
de 200 μL/mL (20% v/v).
OKOH et al. (2010) demonstraram que a atividade antibacteriana dos óleos
essenciais de R. officinalis apresentou-se ampla contra os microrganismos
testados, inibindo as bactérias gram positivas, como S. aureus e Bacillus subtilis
e as gram negativas, como E. coli e Klebsiella pneumoniae, com valores de
concentração inibitória mínima variando entre 0,23 mg/ml-1 e 7,5 mg/ml-1. Mas
ocorreu uma maior atividade sobre bactérias gram positivas do que em gram
negativas, assim como, o presente trabalho que evidenciou atividade contra os
isolados gram positivos.
Pesavento et al. (2015) através do teste de difusão em disco, não
conseguiram estabelecer quais foram as bactérias mais inibidas entre gram
negativas e gram-positivas, através da CIM100 e CIM90, mostrando mudanças
na carga bacteriana em função do tempo com as bactérias Listeria
monocytogenes e S. Enteritidis, patógenos importantes na segurança dos
alimentos, observando que R. officinalis foi o mais eficaz contra bactérias gram
negativas em concentrações mais baixas do que as bactérias gram positivas.
62
Packer e Luz (2007) verificaram pelo método de difusão em ágar que o óleo
essencial de alecrim apresentou atividade antimicrobiana contra S. aureus com
formação de halo <10mm e E. coli com halo variando de 10 a 60mm, resultados
contrários aos do presente estudo, onde não foi verificada atividade contra os
isolados de E. coli testados. Vários fatores influenciam no potencial
antimicrobiano dos óleos essenciais, como a época de colheita da planta, a
localização geográfica, o método de extração, a metodologia empregada para
avaliação, sendo este último um fator limitante na comparação com outros
resultados (PIRES & PICCOLI, 2012).
Hentz e Santin (2007) observaram baixa sensibilidade de Salmonella spp.
frente ao óleo essencial de R. officinalis verificando que não houve formação de
halo de inibição, exceto com o óleo essencial puro, quando comparado com a
ação do antibiótico sulfametoxazol. Celiktas et al. (2007) mostraram que o R.
officinalis apresentou atividade moderada contra os isolados de S. aureus ATCC
6.538 P e S. epidermidis ATCC 12228. Trajano et el. (2009) na avaliação da
atividade antimicrobiana do óleo de R. officinalis verificaram baixo espectro de
ação sobre os isolados testados.
Hayouni et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana de S. offcinalis e
S. molle pela presença ou ausência de zonas de inibição e os valores de CIM e
evidenciaram que essa atividade antimicrobiana dos óleos é difícil de
correlacionar com um composto específico, devido à sua complexidade e
variabilidade. Tanto no óleo de S. offcinalis quanto no de R. officinalis
apresentam-se com composição semelhante, mostrando que não é somente a
ação do constituinte majoritário, mas sim a interação entre os constituintes do
óleo essencial, principalmente pela presença de hidrocarbonetos oxigenados.
5.2.2. Cravo da índia (Syzygium aromaticum)
No presente estudo, na avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do óleo
essencial de cravo da índia (Syzygium aromaticum) (gráfico 2) demonstraram
que houve ação inibitória sobre os 14 (100%) isolados de Escherichia coli e
ATCC 35218, os quais apresentaram-se com ação moderada. Onde observouse a atividade antibacteriana para 2 (14,29%) isolados ocorreu a partir da
63
concentração de 520,83 µg/mL e 12 (85,71%) a partir de 781,25µg/mL. Quanto
aos isolados de Salmonella spp. e Salmonella enterica ATCC 10708, o S.
aromaticum apresentou atividade sobre os 14 (100%) isolados, onde para 2
(14,28%) isolados ocorreu a partir da concentração de 651,04µg/mL e 12
(85,72%) a partir de 781,25µg/mL, apresentando uma ação moderada. Já para
os isolados de Staphylococcus spp. e Staphylococcus aureus ATCC 25923, os
18 (100%) isolados foram inibidos pela ação do óleo essencial, onde 4 (22,22%)
ocorreram a partir de 390,62µg/mL, 2 (11,11%) a partir de 325,52µg/mL, 1
(5,56%) a partir de 455,7 µg/mL, 2 (11,11%) a partir de 651,04µg/mL, 2 (11,11%)
a partir de 520,83µg/mL e 7 (38,89%) a partir de 781,25µg/m, apresentando
variação entre os isolados, com ação de elevada a moderada quando
comparados ao controle do diluente que apresentou média de 3.125, µg/mL.
Gráfico 2. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por
Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de cravo da índia (Syzygium
aromaticum).
Número de isolados
15
Escherichia coli
Staphylococcus spp.
12
Salmonella spp.
9
6
3
0
325,5
390,6
455,7
520,8
585,9
651,04 716,1
781,25
Probst (2012) demostrou que o óleo essencial de cravo da índia
(Caryophyllus aromaticus) tem excelente potencial antibacteriano, tendo sua
eficácia associada ao composto majoritário eugenol e acetato de eugenila em
concentrações que variaram de 2,4 a 3,0 mg/ml, inibindo E. coli, Salmonella spp.,
S. enteritidis de alimentos, S. typhimurium provenientes de infecção e o S.
aureus. Espécie de cravo diferente do presente estudo, mas na composição o
64
mesmo constituinte majoritário, o eugenol, que vai exercer uma permeabilização
inespecífica na membrana citoplasmática aumentando o potássio e ATP para
fora das células, inibindo a atividade de enzimas essenciais (GAVILANESPARRA et al., 2012).
Mazzarrino et al. (2015) também evidenciam a atividade do cravo
(Caryophyllus aromaticus) diferente da espécie do estudo, mas apresenta em
sua composição o mesmo constituinte majoritário, o qual mostrou atividade
intermediária contra Salmonella spp. e uma ação mais forte sobre L.
monocytogenes, sendo a este constituinte atribuída tal atividade, assim como a
presença de compostos fenólicos. Scopel et al. (2014) avaliaram em quatro
condições diferentes de extração que o óleo essencial de S. aromaticum inibiu o
crescimento de E.coli na concentração de 1,0 mg/mL e de S.aureus na
concentração de 4,0, 6,0 e 10 mg/mL, variando de acordo com o método de
extração.
Fior Silvestri et al. (2010) observaram pelo método de difusão em placas e o
método indireto de crescimento bacteriano diferenças significativas entre os
halos de inibição das bactérias avaliadas e demonstraram que o óleo de cravo
da índia (Eugenia caryophyllata) teve maior atividade inibitória sobre as gram
positivas. Tal espécie é diferente do presente trabalho, porém o composto
majoritário é o mesmo, eugenol, logo, atribui-se esta atividade a tal composto,
por isso o óleo essencial de cravo apresentou atividade antimicrobiana sobre
todos os isolados testados.
Trajano et al. (2009) em uma avalição de 11 óleos essenciais de especiarias
quanto a atividade antimicrobiana, observou também que alguns óleos
essenciais têm um espectro de ação maior em relação a outro, a exemplo do
óleo de E. caryophyllata (cravo) que inibiu todas as bactérias testadas, com
formação de halos de inibição de até 30 mm de diâmetro.
Pereira et al. (2008) observaram que o óleo de cravo da índia apresentou os
melhores resultados de inibição do crescimento tanto para E. coli quanto para S.
aureus entre os óleos avaliados, porém não apresentou variação significativa
entre as concentrações 0,1, 0,5, 1 e 5%, que diferiram das concentrações de 10,
20, 30, 40 e 50%, ocorrendo formação do halo de inibição das bactérias E.coli
ATCC 8739 e S. aureus ATCC 8739 em todas as concentrações.
65
Beraldo et al. (2013) encontraram diferentes CIMs para o óleo essencial de
cravo da índia, que apresentou atividade contra S. aureus ATCC 14458,
Escherichia coli ATCC 11229 e Salmonella spp. ATCC 13314 que variaram de
0,04 a 0,06%. Constatando que esta atividade se deve ao composto majoritário
que tem como ação primária promover a ruptura da membrana plasmática,
aumentando a permeabilidade não especifica, que promove o extravasamento
de íons e proteínas intracelulares, inibindo o metabolismo celular, causando a
morte celular (SEPÚLVEDA, 2012; DEVI et al. 2010).
Rodríguez et al. (2014) mostraram que o óleo de cravo apresentou atividade
antimicrobiana contra Streptococcus mutans a partir de concentrações de 1000
até 125μg/ml com comportamento bactericida. E relataram que essa atividade
se deve ao composto majoritário eugenol, que de acordo com o tipo de extração
sua percentagem pode sofrer variação. Assim como, no presente estudo, o qual
apresentou uma atividade moderada, mesmo apresentando uma composição de
90-95% de eugenol.
5.2.3. Limão tahiti (Citrus latifolia)
Nos testes de atividade antimicrobiana in vitro demonstraram que o óleo
essencial de limão tahiti (Citrus latifolia) não apresentou ação inibitória contra
nenhum do isolados de isolados de Escherichia coli e ATCC 35218 (anexo 1),
Salmonella spp. e Salmonella enterica ATCC 10708 (anexo 2) e contra os
isolados de Staçhylococcus ssp. e Staphylococcus aureus ATCC 25924
apresentou ação moderada, com média de 1.208,04 µg/mL (anexo 3) quando
comparados ao controle do diluente que apresentou média de 3.125, µg/mL.,
sendo representado no gráfico 3 o número de isolados por concentração.
66
Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de limão tahiti (Citrus latifolia).
12
Número de isolados
Escherichia coli
Staphylococcus spp.
9
Salmonella spp.
6
3
0
195,3 390,6 651
781,25 1.171 1.302 1.562 2.343 2.604 3.125 4.167 5.208 6.250
No presente trabalho não pode ser evidenciado uma ação inibitória eficaz
contra os isolados de Salmonella spp. e E. coli, apenas para os isolados de
Staphyloccoccus spp e S. aureus ATCC 25923, onde essa ação pode sofrer
variação de acordo com o método e o isolado bacteriano utilizados, estudos
contrários aos realizados por Pires e Piccoli (2012) que demonstraram bons
resultados do óleo essencial de limão tahiti quanto à inibição do crescimento de
E. coli ATCC 8739, S. aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC
25853 na concentração de 160 μL/mL, mas nas concentrações de 10, 20, 40 e
80 μL/mL não apresentaram significativa variação na formação de halo, o qual
apresentou-se mais eficaz em inibir o crescimento de S. aureus.
Ao realizar uma investigação in vitro da atividade antimicrobiana precisa-se
de métodos que produzam resultados confiáveis e possam ser reproduzidos e
validados, contudo, encontra-se dificuldade pelas peculiaridades dos óleos
essenciais, como volatilidade, insolubilidade em água e complexidade,
características que interferem nos resultados. Por isso, nos testes de
susceptibilidade microbiana, leva-se em consideração a técnica usada, o meio
de cultura, o microrganismo e o óleo essencial testados (NASCIMENTO et al.,
2007).
67
A atividade dos óleos essenciais relaciona-se com a respectiva composição
majoritária, além da configuração estrutural dos componentes constitutivos e os
seus grupos funcionais, assim como, as possíveis interações sinérgicas entre os
componentes, os quais devem ser bastante estudados quando são relacionados
com a atividade antimicrobiana (DORMAN & DEANS, 2000).
No teste in vitro, o presente trabalho demostrou que o óleo essencial de limão
tahiti, com composição de 50-55 % de limoneno não apresentou atividade contra
os isolados testados, o qual pode sofrer variação de acordo com o tipo extração
e quantidade apresentada no óleo estudado. Mesmo alguns estudos
demostrarem alguns componentes eficazes, como os estudos de Chen et al.,
(2008) e Sandasi et al. (2008) que evidenciam cinco os compostos
antimicrobianos comuns, α-pineno, cineol, limoneno, linalol e acetato de geranil,
que têm sido eficazes contra alguns agentes patogênicos de origem alimentar e
resistente aos antibióticos, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Escherichia coli e Campylobacter jejuni.
Hu et al. (2014) avaliando os efeitos da exposição do limoneno sobre o
crescimento de Microcystis aeruginosa e a libertação de substâncias tóxicas
microcistina intracelular verificaram que este monoterpeno a medida do tempo
reduziu o número de células. Microrganismo diferente dos analisados neste
trabalho, mas em comum a substância testada, o limoneno, o constituinte
majoritário do limão tahiti que não apresentou atividade significativa, devido a
diferença de diversos fatores, como o tipo de microrganismo, a substância por
ter sido testada pura, enquanto que no óleo além desta, outras estão presentes.
Bonaccorsi et al. (2012) avaliaram técnicas de identificação e caracterização
dos compostos dos óleos essenciais de limão. Tais dados são fundamentais para
melhorar a disponibilização de informação sobre esses óleos. E com essa
investigação verificaram que alterações químicas são provocadas pela
tecnologia de extração, assim como, a variação sazonal. Somando aos
resultados encontrados no presente estudo, onde o limão tahiti não demonstrou
atividade contra bactérias gram negativas, que pode ser em decorrência da
concentração do composto químico majoritário, devido a técnica empregada,
como a estrutura bacteriana, pois o mesmo apresentou atividade contra alguns
isolado gram positivos.
68
Fisher e Phillips (2008) em sua revisão sobre a utilização de óleos essenciais
com potenciais antimicrobianos em alimentos, notaram que a composição e
mistura de componentes em proporções específicas determina o sabor e
também os possíveis efeitos antimicrobianos dos óleos cítricos, e através de
microscopia eletrônica demonstraram que na presença de óleos cítricos
espécies de Enterococcus sofreram alterações morfológicas, sendo tais
mecanismos de ação não totalmente elucidados, os quais podem ocorrer de
diversas formas, conforme a substância, microrganismo, entre outros fatores.
A intensidade dos óleos diminuir ao longo do tempo devido ao a maioria dos
componentes voláteis, como linalol e limoneno, evaporando primeiro, e os
componentes ativos podem ser perdidos, mudando a atividade antimicrobiana,
diminuindo ao longo do tempo (FISHER e PHILLIPS, 2008).
5.2.4. Manjericão (Ocimum basilicum)
Nos testes de atividade antimicrobiana in vitro demonstraram que houve ação
inibitória do óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum) sobre os 14
(100%) isolados de Escherichia coli e ATCC 35218, com atividade para 13
(92,86%) a partir de 781,25µg/mL e 1 (7,14%) de 1.562,50µg/mL, apresentandose com ação moderada (anexo 1 e gráfico 1). Quanto a atividade antimicrobiana
do óleo essencial para os isolados de Salmonella spp. e S. enterica ATCC 10708
observou-se para 12 (85,72%) a partir de 781,25 µg/mL, 1 (7,14%) a partir de
1.041,67µg/mL e 1 (7,14%) a partir de 1.302,08µg/mL, com ação de elevada a
moderada (gráfico 2). Para os isolados de Staphylococcus spp. o O. basilicum
apresentou atividade para 1 (5,55%) a partir de 390,62 µg/mL, 1 (5,55%) a partir
de 455,73 µg/mL, 1(5,55%) a partir de 651,04µg/mL, 7 (38,89%) a partir de
781,25µg/mL, 4 (22,22%) de 1.041,67µg/mL, 3 (16,67%) de 1.562,50µg/mL e 1
(5,55%) a partir de 2.343,75 µg/mL, os quais apresentaram-se com ação
elevada, moderada e fraca (gráfico 3) quando comparados ao controle do
diluente que apresentou média de 3.125, µg/mL.
69
Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum).
Número de isolados
15
Escherichia coli
Staphylococcus spp.
Salmonella spp.
10
5
0
390,6
455,7
651
781,25 1.041,6
1.302
1.562,5 2.343,7
3.125
Alves (2010) verificou que a partir de um gradiente de concentrações do óleo
essencial de O. basilicum realizado por diluições seriadas, o efeito inibitório
sobre E.coli, Salmonella spp. e S. aureus foi de concentrações iguais ou
superiores de 3,13%, onde notou-se que à medida que se aumentou a
concentração ocorreu também o aumento do halo de inibição, mas observou0se
que os halos formados para o S.aureus quando comparados com o tamanho do
halo das demais bactérias foram maiores nas mesmas concentrações.
Evidenciando a sensibilidade maior de bactérias gram positivas.
Em estudo realizado por Hussain et al. (2008) mostraram que o óleo
essencial de O. basilicum apresentou forte atividade antimicrobiana contra todos
os microrganismos testados, através do método de difusão em disco, seguido da
concentração inibitória mínima (CIM) indicaram que o S. aureus foi um dos
microrganismos mais sensíveis mostrando maiores zonas de inibição entre 22,2
-24,4 mm e CIM de 0,9 mg/mL.
Trajano et al. (2009) na avaliação da atividade antimicrobiana do óleo de O.
basilicum verificaram baixo espectro de ação, o qual apresentou atividade
apenas sobre o isolado de E.coli com halo de inibição de 13 mm, assim como no
presente trabalho, o qual também apresentou atividade contra os isolados de
E.coli. Nedorostova et al. (2009) em seus testes verificaram que o O. basilicum
apresentou atividade antimicrobiana contra S.aureus em uma concentração de
70
CIM de 0.53 µl/cm3 na fase de vapor, mostrando que dependendo do método de
extração essa atividade pode também ser diferenciada.
Freire et al. (2014) em seus estudos demonstram que os produtos naturais
avaliados apresentaram propriedades biológicas ativas frente a inibição S.
mutans e S. aureus. Mas o óleo essencial de manjericão apresentou os valores
de atividade mais alto, indicando uma ação menor em relação aos outros,
avalição contrária ao presente estudo, onde o mesmo óleo essencial apresentou
atividade satisfatória sobre os isolados testados. Sendo que, tal atividade pode
sofrer variação de acordo com o método utilizado, os isolados testados, até
mesmo o método e época de extração do óleo essencial.
No presente trabalho os isolados oriundos de carne foram sensíveis ao óleo
essencial de manjericão, sendo tais resultados semelhantes, apesar dos
alimentos serem diferentes, a Martins et al. (2010) que demonstraram que os
sorogrupos de E. coli EPEC testados apresentaram sensibilidade frente à ação
do óleo essencial do manjericão, com halos de inibição variando entre 11,2mm
e 11,6mm e de 11,0mm a 12,0mm para os isolados das alfaces orgânicas e
hidropônicas.
5.3. Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre
bactérias patogênicas em matriz alimentar de carne moída
De acordo com os resultados apresentados na tabela 3 e nos gráficos 5, 6 e
7, os óleos essenciais de cravo e manjericão adicionados à carne na
concentração de 1% p/v, partindo da concentração inibitória mínima encontrada
nos testes in vitro com média de 723,37 μg/mL e 928,8 μg/mL para os isolados
de Escherichia coli, para os isolados de Staphylococccus spp. foi de 582,3 μg/mL
e 1.009 μg/mL e para os isolados de Salmonella spp. foi de 762,6 μg/mL e 837
μg/mL, dos óleos de cravo da índia e manjericão para os isolados,
respectivamente, não proporcionou uma redução da população bacteriana à
medida que aumentou o tempo de contato do óleo essencial com o
microrganismo na matriz alimentar de carne. Já na concentração de 10% p/v o
óleo essencial de cravo da índia em todos os tempos causou a morte microbiana
71
de todos os isolados testados, enquanto que o manjericão não apresentou
atividade apenas frente a ATCC de S. aureus 25923.
Tabela 3. Médias das contagens de Escherichia coli ATCC 35218, Salmonella enterica ATCC
10718 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 na carne da amostra controle e nos tratamentos
com os óleos essenciais de cravo da índia e manjericão a 1% e 10%p/v.
E. coli ATCC 35218
CI 1%
CI 10%
6,8x105
4,2x104
2,7x105
0
2,9 x105
0
2,5 x105
0
2,0 x105
0
MA 1%
MA 10%
0h
6,8x105
1,02x108
5
4h
8,2x10
0
6h
5,6x105
0
20h
3,0x105
0
24h
3,2x105
0
*MA: Manjericão / *CI: Cravo da índia
0h
4h
6h
20h
24h
S.enterica ATCC 10718
S aureus ATCC 25923
CI 1%
1,54x106
5,5 x105
3,1 x105
4,6 x105
3,5 x105
MA 1%
1,54x106
1,02 x106
8,2 x105
7,6x105
6,1 x105
CI 1%
1,52x106
1,28x106
1,88x106
9,7x105
1,30x106
MA 1%
1,52x106
1,2x106
9,1x105
8,8 x105
8,5 x105
CI 10%
1,14x105
0
0
0
0
MA 10%
1,07x106
0
0
0
0
CI 10%
9,0x105
0
0
0
0
MA 10%
5,9x106
5,0x104
1,4x105
3,0x104
2,0x104
Unidades formadoras de colônia
(UFC/g x 105 )
Gráfico 5. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a
1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Escherichia coli ATCC 35218 na diminuição
das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g).
10
CI 1%
CI 10%
MA 1%
MA 10%
3.2
1
0.3
0.1
0
4
8
12
Tempo (h)
16
20
24
72
(UFC/g x 10 5 )
1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Salmonella enterica ATCC 10708 na
diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g).
15.0
CI 1%
CI 10%
MA 1%
MA 10%
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
0
4
8
12
16
20
24
Tempo (h)
(UFC/g x 10 5 )
1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Staphylococcus aureus ATCC 25923 na
diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g).
60
CI 1%
CI 10%
MA 1%
MA 10%
50
40
30
20
10
0
0
4
8
12
Tempo (h)
16
20
24
73
Na análise in vitro notou-se inviável realizar os testes com o óleo essencial de
R. officinalis e Citrus latifolia na carne, os quais não apresentaram atividade
antimicrobiana, apenas contra alguns isolados de Staphylococcus spp. logo,
também não apresentariam atividade quando em contato com a matriz alimentar
de carne, Já Ribeiro (2011) que analisou ao longo de 168 horas (sete dias) o
óleo essencial R. officinalis em queijo contaminado por E.coli observou que
houve uma redução de 2,3 ciclos logarítmicos na amostra nas primeiras 24h de
armazenamento e esta redução manteve-se, praticamente, estável.
A atividade antimicrobiana não é afetada apenas pelas propriedades
intrínsecas dos alimentos (proteína, teor de gordura, água, antioxidantes,
conservantes, pH, sais e outros aditivos), mas as características extrínsecas
(Temperatura, a embalagem a vácuo, gás, ar e as características do
microrganismo) também pode influenciar (HAYOUNI et al., 2008).
Mendonça (2004) na avaliação realizada do efeito do óleo essencial de cravo
da índia sobre o S. aureus ATCC 25923 testado em diversas concentrações até
a concentração de 50% nos testes in vitro apresentou excelente propriedade
antimicrobiana, mas na matriz alimentar a concentração utilizada foi de 1%, em
decorrência da influência do flavor, o qual ficaria muito evidente quando
adicionado na ricota cremosa, matriz alimentar diferente da do estudo, mas que
evidencia a importância da avaliação da interferência do flavor do óleo essencial
a ser adicionado, associando com sua atividade antimicrobiana.
Já quanto a avaliação do manjericão na concentração de 1% foi observada
baixa atividade, sendo necessário, um aumento da concentração para 10%,
valor elevado devido a aromatização do alimento, e nessa concentração o óleo
foi capaz de diminuir a carga microbiana totalmente, exceto para o S. aureus
ATCC 25923, mas outou-se uma diminuição da carga microbiana à níveis em
que a população bacteriana não seja capaz de produzir toxinas, sendo na
literatura identificadas 14 tipos de enterotoxinas estafilocócicas (SE): SEA, SEB,
SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ (CARMO et al., 2002),
SEK (ORWIN et al.,2001), SEL e SEM (JARRAUD et al., 2001), das quais
algumas dessas podem ser produzidas em alimentos em contagens superior a
106 UFC/g (RIBEIRO, 2011).
O presente trabalho mostrou que os óleos essenciais na concentração de 1%
p/v não foram capazes de reduzir a carga microbiana na matriz alimentar de
74
carne, já Almeida et al. (2013) que também avaliaram o potencial antimicrobiano
dos óleos essenciais de alfavacão (Ocimum gratissimum L.) e de cravo-da-índia
(S. aromaticum) em carne moída de ovinos contaminadas experimentalmente
com S. aureus ATCC 25923 observaram que com o aumento do tempo de
contato do óleo na matriz de carne, os óleos diminuíram a carga microbiana
presente, sendo o cravo da índia o que apresentou o maior efeito.
Os resultados do presente trabalho mostraram que concentração de 1% o
óleo essencial de cravo não apresentou diminuição da carga microbiana, apesar
da boa atividade antimicrobiana in vitro, mas na concentração de 10% ocorreu
diminuição total da carga microbiana presente na carne moída em todos os
tempos. Resultados evidenciados por Bergdoll (1990) mostrou que na atividade
contra S. aureus ocorreu uma redução em torno de 0,5 ciclo logarítmico no
número de células viáveis, essa menor redução do número de células deve-se à
maior resistência dessa bactéria a fatores como o sal, a baixa atividade de água
(aW), mas sem diferença significativa no número de UFC/g nos embutidos do
tratamento com adição de 0,2% de cravo e sem adição de cravo, em nenhum
dos tempos de amostragem.
Magnani (2001) constatou que tanto nos salames tipo italiano fabricados com
a adição de 0,2% de cravo e nos salames sem cravo, houve um decréscimo no
número de células viáveis de Salmonella spp. de 1 a 2 ciclos logarítmicos durante
o período de fermentação, em função do declínio de pH e da associação de
outros fatores do embutido. E depois de 20 dias de processamento do salame
tipo italiano adicionado de 0,2% de cravo não foi possível detectar a presença
de Salmonella spp., apenas no tratamento controle, sem a adição de cravo.
Sepúlveda (2012) avaliou a atividade antimicrobiana do óleo essencial de S.
aromaticum adicionado em amostras de leite achocolatado, onde verificou uma
boa resposta à inibição do crescimento de Rhodotorula mucilaginosa durante o
armazenamento ao longo do tempo, tornando-se uma alternativa na indústria
alimentar por sua inibição eficaz do crescimento desta levedura, mas não
mostrou nenhum efeito significativo, em percentagem de inibição, sugerindo que
doses baixas seria o mais apropriado para utilização neste tipo de produto, em
decorrência das características do óleo essencial, forte flavor.
As fontes naturais são alternativas de compostos antimicrobianos eficazes e
seguros, mas são áreas estratégicas para investigações tanto na indústria de
75
alimentos quanto na área da medicina. Há um interesse crescente na busca do
conhecimento da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais e seus
mecanismos de ação, a cinética de inativação ou sobrevivência, o crescimento
de bactérias expostas a estes produtos (MAZZARRINO et al., 2015).
Observou-se que são necessárias concentrações mais elevadas dos óleos
essenciais utilizados nas amostras de carne, e também ao comparar com os
ensaios in vitro, para obtenção de atividade antimicrobiana satisfatória,
semelhante aos estudos relatados por Burt (2004) e Tajkarimi et al. (2010), que
deve ser levado em consideração, principalmente, o aroma e sabor do alimento
após a adição do óleo essencial. Este é o grande desafio do uso de conservantes
naturais em alimentos, pois, busca-se produtos que agridam menos, que
apresentem propriedade antimicrobiana em baixas concentrações e não
exerçam efeitos sobre as propriedades organolépticas e na composição.
Apesar, dos pontos positivos em relação ao uso de plantas com potencial
antimicrobiano natural, essas questões são confrontadas quanto a esta
aplicação de antimicrobianos de origem vegetal em matrizes alimentares, além
dos custos destes materiais, mas são alternativas saudáveis e funcionais
(PROESTOS et al, 2008; SILVA et al., 2007).
Grosso et al. (2008) registraram baixos efeitos antimicrobianos de extratos
de plantas em produtos de carne contaminados, resultado semelhante ao
presente trabalho, onde evidenciou-se que na matriz alimentar de carne não
houve diminuição significativa da carga microbiana com a adição dos óleos
essenciais na concentração de 1%, porém, na concentração de 10% foi
verificada redução total da carga microbiana de todos os isolados,
principalmente do óleo essencial de manjericão.
Alguns autores relatam que essa ausência de atividade deve ao fato de os
produtos cárneos apresentarem em sua composição gordura, que pode interferir
nos efeitos da aplicação do óleo essencial (BURT, 2004; LIS-BALCHIN et al.,
2003).
Lis-Balchin et al. (2003) usando uma combinação de 1% de óleo
essencial de cravo e orégano em caldo de cultura mostraram efeito inibidor
contra a Listeria monocytogenes, no entanto, na mesma concentração não se
mostrou eficaz ao ser introduzido na pasta de carne.
As atividades antimicrobianas têm sido atribuídas à presença de alguns
constituintes nos óleos essenciais, que são os componentes majoritários, sendo
76
grande a variedade de compostos que possuem essa ação, onde se destacam
os monoterpenos fenólicos (carvacrol, timol, eugenol) ou hidrocarbonetos
monoterpênicos (p-cimeno, c-terpineno, a-pineno ou limoneno), álcoois, tais
como
terpenóides
(borneol,
linalol,
1,8-cineol
ou
geraniol),
aldeídos
(cinamaldeído, geranial ou citronnellal) e cetonas (piperitona ou carvona)
(GYAWALI & IBRAHIM, 2014; OUSSALAH et al.2006).
Estes metabólitos secundários possuem vários benefícios, entre eles
propriedades
antimicrobianas
contra
microrganismos
patogênicos
e
deterioradores. A diversidade estrutural de compostos oriundos de plantas é
imensa, e, o impacto da ação antimicrobiana que produzem contra
microrganismos depende da sua configuração estrutural. É o grupo hidroxilo nos
compostos fenólicos, o responsável pela ação inibitória (LAI & ROY, 2004), os
quais podem interagir com a membrana celular da bactéria, rompe as estruturas
da membrana e ocorre a perda dos constituintes da célula (GYAWALI &
IBRAHIM, 2014).
Os óleos que contêm componentes com estrutura fenólica apresentam alto
potencial antimicrobiano, sendo conhecidos por serem agentes bactericidas ou
bacteriostáticos dependendo da concentração utilizada (OUSSALAH et al.,
2006). Assim como foi observado nos testes na matriz alimentar de carne do
presente estudo, que a atividade do óleo essencial na concentração de 1% p/v
não foi suficiente para diminuir a carga microbiana presente, sendo
consequência da interação com as características do próprio alimento, como, a
porcentagem de gordura.
Os processadores de alimentos e consumidores manifestam o desejo de
reduzir o uso de produtos químicos sintéticos na conservação de alimentos.
Havendo um interesse considerável em extratos e óleos essenciais de ervas
culinárias, especiarias e plantas aromáticas, e que apresentam uma atividade
antimicrobiana notável, diminuindo ou inibindo o desenvolvimento de
microrganismos patogênicos e/ou produtores de toxinas em alimentos
(HAYOUNI et al., 2008).
78
SILVA, N. D. S. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas e especiarias sobre
patógenos de carnes comercializadas em feiras-livres e frigorífico de Juazeiro-BA e Petrolina-PE.
6. CONCLUSÕES
Quanto à qualidade microbiológica os resultados mostram que os alimentos
se encontram com irregularidades nas condições higiênico sanitário que implica
em condições insatisfatórias de exposição, manipulação e comercialização do
produto, evidenciado pela detecção de Salmonella spp., Staphylococcus spp. e
Escherichia coli. Isto reflete o problema de saúde pública que a contaminação
dos alimentos significa para o Brasil e todo o mundo.
Já na avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais in vitro, os
óleos de cravo da índia e manjericão foram os que apresentaram os melhores
resultados contra os isolados Salmonella spp., Staphylococcus spp. e
Escherichia coli, enquanto que o de alecrim e limão tahiti apresentaram atividade
apenas para os isolados de Staphylococcus spp.
Nos resultados obtidos na avaliação dos óleos de S. aromaticum (cravo da
índia) e O. basilicum (manjericão) na concentração de 1% p/v na carne, onde foi
observado que a carga microbiana não diminuiu a medida do aumento de tempo
de contato com os óleos. Mas na concentração de 10% p/v ocorreu a morte
bacteriana durante todo o armazenamento, exceto para o óleo de manjericão
contra os isolados de S.aureus, onde ocorreu apenas a diminuição da contagem
bacteriana.
Nota-se que a utilização de óleos essenciais como inibidores de crescimento
bacteriano é uma boa opção para a substituição de aditivos químicos em
alimentos, principalmente dos que apresentaram boa atividade antimicrobiana.
Porém, são necessários estudos quanto à análise sensorial e aceitação do
produto acrescido do óleo essencial, pois, torna-se inviável eliminar os agentes
contaminantes do alimento, mas alterar sabor, aroma e as propriedades
nutritivas.
80
7. REFERÊNCIAS
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95
Anexos:
Anexo 1. Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre
Escherichia coli ATCC 35218 e os isolados obtidos das amostras de carne.
Óleos essenciais (µg/mL)
Cravo da índia
E. coli ATCC 35218
A5 1
A6 2
A7 3
A8 3
A9 1
A10 4
A11 4
A12 1
A13 1
A14 1
A15 4
A16 1
A17 1
Total: 14 Isolados
781,25
Alecrim
Limão tahiti
Manjericão
4.167
6.250
781,25
520,83
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
4.167
781,25
781,25
3.125
6.250
781,25
520,83
3.125
4.167
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
1.562,5
781,25
3.125
4.167
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
744,04
3.125
3.199
3.125
3.795
781,25
837,05
96
Salmonella enterica ATCC 10708 e os isolados obtidos das amostras de carne.
Cravo da índia
Alecrim
Limão tahiti
Manjericão
S. enterica ATCC 10708
A4 1
A5 1
A6 2
A7 3
A8 4
A9 1
A10 2
A11 1
A12 2
A13 2
A14 7
A15 5
A16 6
Total: 14 isolados
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
2.604
2.604
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
651,04
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
6.250
781,25
781,25
3.125
3.125
781,25
781,25
3.125
5.208
1.302,08
651,04
3.125
3.125
1.041,66
781,25
1.563
1.302
781,25
781,25
762,65
1.563
2.865
3.125
3.330
781,25
837,08
97
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e os isolados obtidos das amostras de carne.
Cravo da índia
Alecrim
Limão tahiti
Manjericão
S. aureus ATCC 25923
520,83
1.562,50
1.562,50
1.562,50
A1 1
781,25
1.562,50
781,25
781,25
A2 1
390,62
1.041,67
1.171,87
1.041,67
A3 8
651,04
1.562,50
1.302,08
781,25
A4 5
781,25
3.125,00
1.302,08
1.562,50
A5 1
455,73
781,25
781,25
455,73
A6 4
520,83
1.562,50
2.604,17
781,25
A7 1
781,25
3.125,00
3.125,00
1.562,50
A8 1
325,52
781,25
651,04
390,62
A9 1
781,25
781,25
781,25
651,04
A10 1
390,62
1.562,50
390,62
1.041,67
A11 2
781,25
3.125,00
2.343,75
2.343,75
A12 1
390,62
1.562,50
781,25
1.041,67
A13 1
781,25
3.125,00
2.343,75
781,25
A14 1
390,62
3.125,00
651,04
781,25
A15 1
325,52
1.041,67
195,31
781,25
A16 1
781,25
1.562,50
781,25
1.041,67
A17 1
651,04
390,62
195,31
781,25
Total: 18 isolados
582,32
1.743,34
1.208,04
1.099,11

atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas e especiarias

Transcrição

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