ler sobre - Programa de Pós-Graduação em Bioprospecção Molecular

Transcrição

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UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR
HELENICY NOGUEIRA HOLANDA VERAS
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA E ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Lippia sidoides CHAM. (VERBENACEAE)
CRATO, CE
2011
1
ANTIMICROBIANA E ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA DO ÓLEO ESSENCIAL
DE Lippia sidoides CHAM. (VERBENACEAE)
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Bioprospecção Molecular da
Universidade Regional do Cariri- URCA, como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre
em Bioprospecção Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Botelho
Co-orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa
CRATO, CE
2011
2
V476c Veras, Helenicy Nogueira Holanda.
Caracterização química e avaliação da
atividade antimicrobiana e antiinflamatória tópica
do óleo essencial de Lippia sidoides Cham.
(Verbenaceae). [manuscrito] / por Helenicy
Nogueira Holanda Veras. – 2011.
142 f.: il.; 29 cm.
Cópia de computador (printout).
Dissertação (Mestrado em Bioprospecção
Molecular) – Programa de Pós-Graduação em
Bioprospecção Molecular da Universidade
Regional do Cariri – URCA.
Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Botelho
Co-orientador: Prof. Dr. José Galberto Martins
da Costa.
1. Lippia sidoides. 2. Timol. 3. Atividade
antimicrobiana. 4. Biofilme. 5. Atividade
antiinflamatória. I. Título.
CDD: 664.02
3
ANTIMICROBIANA E ANTIINFLAMATÓRIA TÓPICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Lippia sidoides Cham. (VERBENACEAE)
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em
Bioprospecção Molecular da Universidade Regional do Cariri – URCA, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em Bioprospecção Molecular. Área de
concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Prof. Dr. Marco Antonio Botelho - Orientador
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará- IFET-CE
_______________________________________________________
Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa – Co-orientador
Universidade Regional do Cariri- URCA
_______________________________________________________
Prof. Dr. Iri Sandro Pampolha Lima -Avaliador externo
Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte- FMJ
_______________________________________________________
Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho -Avaliador Interno
_______________________________________________________
Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes – Avaliador Interno (Suplente)
4
Dedico a meus pais, Pedro Ernesto Veras e Maria Odenicy Nogueira H. Veras,
e a meus irmãos, Helaine Nogueira H. Veras e Pedro Ernesto Veras Jr,
por me apoiarem em todas as minhas escolhas e
SEMPRE acreditarem em meus projetos.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, inteligência suprema e causa primária de todas as coisas, obrigado Senhor
por me dar forças quando precisei, por guiar e iluminar meus caminhos!
Ao meu pai, Pedro Ernesto Veras, professor que eu admiro tanto, meu exemplo de
profissional. Sei que concluindo essa etapa estou realizando um sonho seu! À minha mãe, Mª
Odenicy Nogueira H. Veras, minha amiga, exemplo de mulher e mãe... como diz Cora
Coralina: “ Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço que envolve, palavra que conforta,
silêncio que respeita, alegria que contagia, lágrima que corre, olhar que acaricia, amor que
promove”. Obrigado pelo amor incondicional e por serem responsáveis por tudo que tenho e
sou! Aos meus irmãos, Helaine Veras e Pedro Junior, por estarem sempre perto apesar de
muitos quilômetros separarem vocês de mim, obrigado pela força, carinho e incentivo! Amo
vocês!
A toda minha família, especialmente meus avós, Raimundo Hidelberto Veras da
Silva, Lirinda Maria de Souza Veras, José Holanda Guerra e meu anjo, Mª Terezinha
Nogueira Holanda (in memorian). Obrigada por serem meus pais quando precisei e por se
orgulharem dos meus estudos, essa vitória também é de vocês!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marco Antonio Botelho, pela irreverência, por ter me
dado esse presente que é o “alecrim pimenta”, por me ensinar a “andar com meus próprios
pés”, pelo otimismo e incentivo! Obrigado por confiar e acreditar em mim.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa, por ter me acolhido
no laboratório, agradeço pela pessoa que és e tenho eterna gratidão pelos ensinamentos,
dedicação, por saber elogiar e criticar do jeito e na hora certa. Obrigada por tudo!!!
À professora Msc. Fabiola Fernandes Galvão Rodrigues, pessoa muito importante
nesse trabalho, sou grata pela disponibilidade de sempre nos ajudar, pelo imenso auxílio nos
ensaios microbiológicos, pelo encorajamento transmitido e pela amizade!
Ao Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes, pela grande ajuda nos testes
farmacológicos e pelas sugestões, sou muito grata!!! Ao Prof. Dr. Henrique Douglas Melo
Coutinho pelas sugestões nos artigos, pela amizade e pelas brincadeiras...
Às minhas queridas professoras do curso de Farmácia, Dra. Gilvandete Maria
Pinheiro Santiago, Dra. Mary Anne Medeiros Bandeira, Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira
Leal e Dra. Rita de Cássia Carvalho Barbosa. Obrigado por me orientarem na graduação e me
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incentivarem para a pesquisa. Graças a vocês me encantei com as plantas medicinais e
despertei para a docência. Obrigado pela amizade!
Aos professores Dr. Iri Sandro Pampolha Lima, Dra. Marta Regina Kerntopf, Dr.
Henrique Douglas Melo Coutinho e Dr. José Galberto M. da Costa por aceitarem participar da
banca examinadora, obrigado pelas valiosas sugestões e por contribuírem para melhoria deste
trabalho!
À minha amiga Samara Alves Brito, pelo apoio, carinho, disponibilidade de sempre
me ajudar e me ouvir independente de dia e hora. Trabalhamos, nos ajudamos, rimos e
choramos, agradeço a Deus por ter colocado você na minha caminhada. Obrigado por se
preocupar sempre com minha felicidade, você é muito especial!
Aos demais membros do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN),
Aracélio Colares, Carla Karine, Eidla Mikaelle, Erlânio Oliveira, Fábio Galvão, George
Souza, Josniel Pires, Liana Oliveira, Leonardo Landim, Mário Eduardo, Manuele Eufrasio,
Samara Alves, Thiago Almeida, Stefânio Barreto e Walmir Emanuel pela ótima convivência,
receptividade e pelos momentos de descontração e amizade! A Luis Leandro da Silva (Sr.
Luis), pela ajuda nas coletas!!
Aos professores do Laboratório de Farmacologia e Química Molecular (LFQM), Dr.
Irwin Rose Alencar de Menezes e Dra. Marta Regina Kerntopf, e aos demais membros, em
especial, Mariana Késsia, pessoa fundamental na realização dos testes farmacológicos,
obrigado pela paciência, disponibilidade e amizade!
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Biosprospecção Molecular, em
especial Prof. Dr. Diniz Maciel de Sena Júnior, Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa,
Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho, Prof. Dr. Irwin Rose Alencar de Menezes, Profa.
Dra. Marta Maria de Almeida Souza, Profa. Dra. Marta Regina Kerntopf, Profa. Dra. Imeuda
Peixoto Furtado e Profa. Dra. Sirleis Rodrigues Lacerda, pelos conhecimentos transmitidos!
Aos amigos do mestrado, Heloísa Ferreira, Flaviana Morais, Morgana Delfino,
Teógenes Matias, Norma Fernandes, Renata Dias, Mariana Késsia e Samara Alves por
tornarem os momentos mais divertidos e pela amizade, me orgulho em fazer parte dessa
turma!
Às coordenadoras do Programa de Pós-graduação em Biosprospecção Molecular,
Dra. Sirleis Rodrigues Lacerda e Dra. Imeuda Peixoto Furtado, às secretárias Maria Andecieli
Rolim de Brito e Maria Lenira Pereira, pela solicitude!
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Ao Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima coordenado pela Profa. Dra.
Maria Arlene Pessoa da Silva, pela identificação da espécie em estudo, e em especial, aos
amigos Ana Cleide Morais e Carlito Santos.
Aos meus amigos por entenderem minha ausência, e que apesar da distância, sempre
me dão força e torcem por mim!
À Dinalva Brito de Queiroz (Farmácia Evidence®) pelo fornecimento do timol. Ao
Prof. Dr. Sidney Goncalves Lima, da Universidade Federal do Piaui – UFPI, pela obtenção
dos espectros do óleo essencial.
Ao CNPq, FUNCAP e CAPES, pelo suporte financeiro.
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“O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato não os despreza.
Uma espécie de madeira não adoçou o amargor da água?
Essa virtude chegou ao conhecimento dos homens.
O Altíssimo deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas;
e dela se serve para acalmar as dores e curá-las; o farmacêutico faz misturas agradáveis,
compõe ungüentos úteis à saúde, e seu trabalho não terminará,
até que a paz divina se estenda sobre a face da terra.”
Eclesiástico, 38: 4-8.
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RESUMO
A espécie Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) é utilizada na medicina popular como
anti-séptico de uso local em pele e mucosas e seu efeito terapêutico é atribuído à presença de
timol. O óleo essencial das folhas de L. sidoides (OELS) e timol foram avaliados quanto à
atividade antimicrobiana, moduladora de antibióticos e antiinflamatória tópica em modelos de
edema de orelha induzidos por diferentes agentes flogísticos em camundongos Swiss. O
OELS obtido por hidrodestilação (rendimento de 1,06%) e a análise por CG/EM identificou
os principais constituintes: timol (84,9%) e p-cimeno (5,33%). Não houve diferenças no
potencial antimicrobiano entre o OELS e timol determinado pelo método de microdiluição
frente às bactérias e fungos leveduriformes originários da ATCC. A atividade moduladora por
contato direto permitiu observar que o OELS e timol reduziram a Concentração Inibitória
Mínima (CIM) da gentamicina frente à Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa em
32 vezes e 4 vezes. Por outro lado, a CIM da Penicilina G foi reduzida de 128 µg/mL para 32
e 2 µg/mL quando associada ao OELS e timol, respectivamente, e houve reforço na atividade
da Ceftriaxona apenas na associação do OELS e timol frente a Enterococcus faecalis com
redução da CIM de 64 para 4 μg/mL. Verificou-se que o OELS e timol potencializaram a
atividade de todos as aminoglicosídeos testados por contato a vapor frente à P. aeruginosa e
Staphylococcus aureus e não houve diferença estatística entre a atividade do OELS e timol
contra P. aeruginosa, indicando ser este composto responsável por tal atividade frente a essa
cepa. Os resultados mais expressivos foram observados no aumento da atividade antibiótica
da gentamicina em 429,41% e 223,53% frente S. aureus, e 43,30% e 33,33% na atividade da
amicacina contra P. aeruginosa para o OELS e timol a 50% (v/v), respectivamente. O OELS
e timol foram capazes de reduzir in vitro as UFC em biofilmes de E. faecalis no tempo de
contato de 30 e 60 minutos em concentrações de 2,5 e 10%. A aplicação tópica de OELS e
timol (2 mg/orelha), reduziu significativamente (p < 0,001) em 45,1% e 47,4% o edema
induzido por AA e reduziu em 33,2% (p < 0,05) e 54,7% (p < 0,01) o edema provocado por
fenol, possivelmente reduzindo a produção de mediadores pro – inflamatórios. Além disso,
não houve diferença estatística entre a atividade antiedematogênica do OELS e timol. Os
resultados são relevantes e sugerem que o timol é o composto responsável pelas atividades
biológicas observadas pelo óleo essencial dessa espécie.
Palavras-chave: Lippia sidoides. Timol. Atividade antimicrobiana. Biofilme. Atividade
antiinflamatória.
10
ABSTRACT
The Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) species is used in folk medicine as an
antiseptic for local use on skin and mucous membranes. The therapeutic effect is attributed to
the presence of thymol. The essential oil of L. sidoides (LSEO) and thymol were evaluated for
antimicrobial activity, modulatory on antibiotics and topical anti-inflammatory in models of
ear edema induced by different phlogistic agents in Swiss mice. The LSEO was obtained by
hydrodistillation (yield 1.06%) and analyzed by GC / MS. The major constituents identified
were: thymol (84.9%) and p-cymene (5.33%). There were no differences in antimicrobial
activity between LSEO and thymol determined by microdilution method against bacteria and
yeast (ATCC). The synergistic activity direct showed that LSEO and thymol reduced the
minimum inhibitory concentration (MIC) of gentamicin against the Klebsiella pneumoniae
and Pseudomonas aeruginosa in 32 times and 4 times respectively. On the other hand, the
MIC of penicillin G was reduced from 128 µg/mL for 32 and 2 µg/mL when combined with
the LSEO and thymol, respectively. There was enhanced activity of ceftriaxone only the
association of LSEO and thymol against Enterococcus faecalis with a reduction in MIC from
64 to 4 µg/mL. LSEO and thymol potentiated the activity of all the aminoglycosides tested by
vapour contact to P. aeruginosa and Staphylococcus aureus and there was no statistical
difference between the activity of LSEO and thymol against P.aeruginosa, suggesting that
this compound is related for such activity. There was a increased activity of the antibiotic
gentamicin at 429.41% and 223.53% against S. aureus, and 43.30% and 33.33% in the
activity of amikacin against P.aeruginosa, for LSEO and thymol 50% (v/v), respectively. The
LSEO and thymol were able to inhibit in vitro CFU in biofilms of E. faecalis in contact time
of 30 to 60 minutes at concentrations of 2.5 and 10%. Topical application of LSEO and
thymol (2 mg/ear) significantly reduced (p <0.001) the edema induced by AA and reduced by
33.2% (p <0.05) and 54.7% (p <0.01) the edema caused by phenol. There was no statistical
difference between the antiedematogenic activity of LSEO and thymol. The results suggest
that thymol is related in biological activities observed by the essential oil of this species.
Key-words: Lippia sidoides. Thymol. Antimicrobial activity. Biofilm. Anti-inflammatory
activity.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 ‒ A espécie Lippia sidoides Cham.
30
Figura 2 ‒ Estrutura química do isopreno.
38
Figura 3 ‒ Estrutura química do timol.
39
Figura 4 ‒ Produção de eicosanóides a partir do ácido araquidônico
48
Figura 5 ‒ Método de extração do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides.
52
Figura 6 ‒ Microdiluição em caldo Brain Heart Infusion (BHI).
55
Figura 7 ‒ Visualização do crescimento após 72 h do biofilme de Enterococcus
faecalis.
56
Figura 8 ‒ Contato gasoso - Aplicação da amostra na tampa da placa.
58
Figura 9 ‒ Metodologias utilizadas para verificação de atividades biológicas do
óleo essencial de Lippia sidoides e timol.
63
Figura 10 ‒ Estruturas dos constituintes químicos identificados no óleo essencial
das folhas de Lippia sidoides Cham.
66
Figura 11 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de E. faecalis frente a desafios
antimicrobianos a 2,5% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato.
83
Figura 12 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de Enterococcus faecalis frente a
desafios antimicrobianos a 10% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato.
84
Figura 13 ‒ Efeito do OELS ou timol, administrados por via tópica, no edema de
orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton em camundongos.
87
Figura 14 ‒ Curva tempo-resposta do efeito do tratamento com OELS ou timol (2
mg/orelha) no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de
óleo de cróton em camundongos.
88
Figura 15 ‒ Aspecto da orelha direita de camundongos após 4 dias de tratamento
com OELS (2 mg/orelha, 2 vezes ao dia) no modelo de edema de orelha induzido
pela aplicação múltipla de óleo de cróton 5% (v/v) em acetona.
88
orelha crônico induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton em
camundongos.
89
orelha induzido pela aplicação de ácido araquidônico em camundongos.
91
12
orelha induzido pela aplicação intradérmica de histamina em camundongos.
91
orelha induzido pela aplicação de fenol em camundongos.
92
13
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 ‒ Atividades biológicas de espécies de Lippia no período entre 1981 a
2011.
32
Quadro 2 ‒ Atividades biológicas relacionadas ao timol no período entre 2000 a
2011.
40
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 ‒ Drogas e reagentes utilizados durante os procedimentos experimentais
farmacológicos.
59
Tabela 2 ‒ Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides
Cham.
65
Tabela 3 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) do óleo essencial das folhas de
L. sidoides (OELS) ou timol, sobre cepas microbianas originárias da ATCC.
68
Tabela 4 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida
Mínima (CFM) do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol pelo método de
microdiluição em caldo, sobre cepas originárias da ATCC.
70
Tabela 5 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de
aminoglicosídeos na presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e
timol em concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.
72
Tabela 6 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de ßlactâmicos na presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e timol em
concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.
73
Tabela 7 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) do
fluconazol na presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e timol em
concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.
76
Tabela 8 ‒ Atividade antibacteriana dos compostos voláteis do óleo essencial de
Lippia sidoides e timol por contato gasoso.
77
Tabela 9 ‒ Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos
constituintes voláteis do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol,
utilizando o método de contato gasoso sobre Staphylococcus aureus ATCC 12624.
80
Tabela 10 ‒ Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos
constituintes voláteis do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol,
utilizando o método de contato gasoso sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC
15442.
81
Tabela 11 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por ácido araquidônico em
camundongos e o efeito inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol ou
indometacina (2 mg/orelha).
90
Tabela 12 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por fenol em
camundongos e o efeito inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol (2
mg/orelha) ou dexametasona (0,08 mg/orelha).
92
15
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% ‒ Por cento; percentual
< ‒ Menor que
= ‒ Igual a
≈ – Aproximadamente
± ‒ Mais ou menos
® ‒ Marca registrada
µg/ mL ‒ Micrograma por mililitro
µL ‒ Microlitro
µm ‒ Micrômetro
μg- micrograma
5-LOX ‒ 5- Lipoxigenase
α ‒ Alfa
a. C. – Antes de Cristo
AA ‒ Ácido Araquidônico
AINEs ‒ Antiinflamatórios não- esteroidais
AMI ‒ Amicacina
ANOVA ‒ Análise de Variância
AP-1 – Proteína Ativadora-1
ATM ‒ Antimicrobianos
ATCC ‒ American Type Culture Collection
ATP – Adenosina Trifosfato
ß ‒ Beta
BHI ‒ Brain Heart Infusion (infusão de cérebro e coração, inglês)
BLA ‒ ß-lactâmicos
C+ ‒ Controle positivo
CE – Estado do Ceará (Brasil)
CEUA ‒ Comissão de Ética no Uso de Animais
CFM ‒ Concentração Fungicida Mínima
CG/EM ‒ Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
Cham. ‒ Chamisso
CIM ‒ Concentração Inibitória Mínima
16
CIM/8 ‒ Concentração subinibitória
CLSI ‒ Clinical and Laboratory Standards Institute
cm/seg ‒ Centímetro por segundo
cm3 ‒ Centímetro cúbico
COX ‒ Cicloxigenase
d. C. – Depois de Cristo
D/E – Dey e Engley
DEX ‒ Dexametasona
DIM ‒ Dose Inibitória Mínima
DMSO ‒ Dimetilsulfóxido
E.I.M ‒ Efeito Inibitório Médio da inflamação
E.P.M. – Erro Padrão da Média
EPS ‒ Substâncias poliméricas extracelulares
et al. ‒ E colaboradores
EUA ‒ Estados Unidos da América
eV ‒ Eletrovolt
γ ‒ Gama
g ‒ Gramas
GABAA ‒ Receptor do ácido gama aminobutírico
GEN ‒ Gentamicina
h ‒ Horas
HCDAL ‒ Herbário Caririense Dárdano de Andrade-Lima
i.d. ‒ Indicativo de densidade
i.p. ‒ Via intraperitoneal
IL ‒ Interleucina
IND ‒ Indometacina
iNOS – Óxido nítrico sintetase induzível
IR – Índice de Retenção
KPa – Quilopascal
L – Litro
LOX – Lipoxigenase
LTB4 – Leucotrieno B4
m – Metro
17
m/z – Relação massa/carga
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno
ml – Mililitro
mm – Milímetro
mmHg – Milímetros de mercúrio
mod – Massa do disco retirado da orelha direita
moe – Massa do disco retirado da orelha esquerda
MPEcont – Média do percentual de edema do grupo controle negativo
MPEtrat – Média do percentual de edema do grupo tratado com OELS, timol ou fármaco
n – Número da amostra
NaCl – Cloreto de sódio
NaOCl – Hipoclorito de sódio
NEO – Neomicina
NF- kB – Nucleus factor – kappa B (Fator de transcrição nuclear – capa B)
NO – Óxido nítrico
OC – Óleo de cróton
ºC – Grau Celsius
ºC/min – Grau Celsius/min
OELS – Óleo essencial de Lippia sidoides
p – Nível de significância
P.A. – Para análise
PBP – Proteínas Ligadoras de Penicilinas
PDA – Potato Dextrose Agar (Agar batata dextrose, inglês)
PE – Percentual de edema
PG – Prostaglandina
pH – Potencial hidrogeniônico
pKa – Potencial da constante de acidez
PKC – Proteína quinase C
PLA2 – Fosfolipase A2
ROS – Reative Oxygen Species (Espécies Reativas de Oxigênio, inglês)
TNF – Tumor Necrosis Factor (fator de necrose tumoral, inglês)
TPA – 13-acetato de 12-o-tetracanoilforbol
TR – Tratamento
18
TXA2 – Tromboxano A2
UFC – Unidade Formadora de Colônias
UNIFOR – Universidade de Fortaleza
URCA – Universidade Regional do Cariri
US$ ‒ United States dollar (Dólar dos Estados Unidos, inglês)
v/v – Volume/volume
VEGF – Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento do endotélio vascular,
inglês)
19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
22
2 OBJETIVOS
25
2.1 Objetivo geral
25
2.2 Objetivos específicos
25
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Considerações botânicas
32
3.1.1 Família Verbenaceae
32
3.1.2 O gênero Lippia
37
3.1.3 Lippia sidoides Cham.
29
3.2 Atividades biológicas do gênero Lippia
32
3.3 Óleos essenciais
37
3.4 Timol: um monoterpeno presente nas folhas de Lippia sidoides
39
3.5 Atividade antimicrobiana de produtos naturais
43
3.6 Resistência microbiana
43
3.7 Biofilme
45
3.8 Atividade antiinflamatória de produtos naturais
47
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
51
4.2 Obtenção do óleo essencial
51
4.3 Obtenção do timol
51
4.4 Análise química do óleo essencial
53
4.5 Atividade antimicrobiana
53
4.5.1 Cepas microbianas
53
4.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
54
4.5.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
55
4.5.4 Avaliação da inibição de biofilmes
55
4.5.4.1 Cepa bacteriana e preparo do inóculo
55
20
4.5.4.2 Formação do biofilme
56
4.5.4.3 Substâncias testadas
56
4.5.4.5 Inibição de biofilmes
56
4.5.5 Modulação da atividade antimicrobiana
57
4.5.1 Contato direto
57
4.5.2 Contato a vapor
57
4.5.2.1 Análise estatística
58
4.6 Atividade antiinflamatória tópica através de modelos de edema de orelha
induzidos por agentes irritantes
59
4.6.1 Aspectos éticos da pesquisa
59
4.6.2 Animais
59
4.6.3 Drogas, reagentes e soluções
59
4.6.4 Edema de orelha induzido pela aplicação única de óleo de cróton
60
4.6.5 Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton
60
4.6.6 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA) e fenol
60
4.6.7 Edema de orelha induzido pela injeção intradérmica de histamina
61
4.6.8 Quantificação do edema
61
4.6.9 Análise estatística dos dados
62
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
65
67
5.2.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)- Bactérias
67
5.2.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM)- Fungos leveduriformes
69
5.3 Modulação da atividade antibiótica
71
5.3.1 Contato direto- Bactérias
71
5.3.2 Contato direto – Fungos
75
76
5.4 Avaliação da inibição de biofilmes
81
5.5 Atividade do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol nos modelos de
inflamação cutânea
85
85
21
86
5.5.3 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA)
88
5.5.4 Edema de orelha induzido por histamina
89
5.5.5 Edema de orelha induzido por fenol
89
6 CONCLUSÕES
98
7 REFERÊNCIAS
100
22
INTRODUÇÃO
______________________________________________
23
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas com finalidades terapêuticas vem sendo praticado a milhares de anos.
A arte dos benzedores, curandeiros e xamãs, herdada de magos e feiticeiros, pode ser vista até
hoje, em teste, nos laboratórios científicos, os quais passaram a avaliar experimentalmente a
veracidade dessas informações (DI STASI, 1996; RIOS e RECIO, 2005).
O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com
mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (SIMÕES
et al., 2003). No entanto, a riqueza e diversidade desse banco genético e biomolecular se
encontram em um estágio inicial de conhecimento (CALIXTO, 2003).
A exploração da biodiversidade brasileira pode levar a identificação de metabólitos
secundários valiosos que podem servir como fitofármacos ou conduzir ao desenvolvimento de
novos fármacos semi-sintéticos ou sintéticos. Comparado ao desenvolvimento de um novo
medicamento sintético, que envolve vultosas somas de recursos (cerca de US$ 350 milhões e
10 a 15 anos de pesquisa), o desenvolvimento de um fitomedicamento requer menos recursos,
e também menor tempo de pesquisa. Estima-se que os custos para o desenvolvimento de um
fitomedicamento não devem ultrapassar 2 a 3 % daquele previsto para o desenvolvimento de
um novo medicamento sintético (CALIXTO, 2003).
Por outro lado, nos últimos anos, há um grande interesse e aumento na procura de
produtos naturais como recursos terapêuticos. Tal fato pode estar relacionado a diversos
fatores, como: efeitos indesejáveis e prejuízos causados pelo uso abusivo e/ou incorreto de
medicamentos sintéticos; o fato de que amplas camadas da população mundial não têm acesso
aos medicamentos e à medicina institucionalizada; a consciência ecológica e a crença popular
de que o natural é inofensivo (RATES, 2001). No entanto, mesmo diante da grande
biodiversidade brasileira, ainda faltam muitos estudos para comprovar a eficácia e a segurança
desses produtos naturais (CALIXTO, 2003).
O avanço da tecnologia associado à problemática do surgimento de microorganismos
cada vez mais resistentes aos antimicrobianos convencionais, fez com que a pesquisa buscasse
novas substâncias de origem natural, com eficácia superior ou igual aos da terapêutica usual
(OESTERHELT et al., 2005). Além disso, um dos maiores problemas enfrentados é a
formação de biofilmes pelas bactérias. Organismos vivendo em comunidades como em
biofilmes, podem suportar mudanças do pH, ação de radicais de oxigênio, desinfetantes e
24
antibióticos de uma forma mais favorável do que em células vivendo de forma livre
(JEFFERSON, 2004).
Nesse contexto, a atividade antimicrobiana de uma variedade de óleos essenciais é
documentada desde 1974 (GUENTHER, 1974) e torna-se importante a avaliação da atividade
dos seus constituintes majoritários para relacionar qual o composto é responsável por tal
atividade.
Algumas plantas utilizadas popularmente como antiinflamatórias possuem considerada
atividade antimicrobiana frente a vários patógenos, pois alguns traumas que comprometem a
integridade da barreira cutânea constituem-se na principal causa de mudança de
comportamento de bactérias que fazem parte da microbiota da pele para agente etiológico em
infecções cutâneas (CAETANO et al., 2002; ZAVADINACK NETTO et al., 2008).
O gênero Lippia é conhecido por apresentar, principalmente, atividade antimicrobiana,
antiinflamatória, antioxidante e larvicida (BOTELHO et al., 2007b; MENDES et al., 2010;
DAMASCENO et al., 2011). A espécie Lippia sidoides Cham., nativa da região do semi-árido
do Nordeste brasileiro, é amplamente empregada na medicina popular como anti-séptico de
uso local em pele e mucosas e está inserida no projeto Farmácias Vivas da Universidade
Federal do Ceará (MATOS, 2000; 2002).
Tendo em vista o uso popular, bem como registros na literatura comprovando algumas
atividades biológicas apresentadas por L. sidoides, resolveu-se analisar o potencial
antimicrobiano do óleo essencial das suas folhas e do timol, seu composto majoritário, por
contato direto, a vapor e a ação frente a biofilmes, bem como a possível interferência dos
mesmos na atividade de alguns antibióticos utilizados na clínica. Além disso, foi observado se
esse produto natural foi capaz de apresentar atividade antiinflamatória tópica in vivo.
25
OBJETIVOS
______________________________________________
26
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Verificar e comparar a atividade antimicrobiana, moduladora da atividade antibiótica e
antiinflamatória tópica entre o óleo essencial de L. sidoides e seu componente majoritário,
timol,
bem
como
investigar
os
possíveis
mecanismos
envolvidos
na
atividade
antiinflamatória.
2.2 Objetivos específicos

Obter o óleo essencial da espécie em estudo e caracterizá-lo quimicamente;

Verificar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OELS e timol frente a bactérias
e fungos;

Avaliar e comparar o efeito modificador da atividade antibiótica de aminoglicosídeos
e ß- lactâmicos exercido pelo óleo e timol frente a bactérias Gram-positivas e Gramnegativas;

Verificar a interferência do OELS e timol sobre a atividade do fluconazol frente a
espécies de Candida por contato direto;

Determinar a atividade antimicrobiana in vitro do OELS e timol frente a biofilmes de
Enterococcus faecalis;

Avaliar a atividade antiinflamatória do OELS e timol por via tópica através do modelo
de edema de orelha induzido por óleo de cróton (modelo agudo e crônico), ácido
araquidônico, fenol e histamina, bem como elucidar os possíveis mecanismos de ação.
27
REFERENCIAL TEÓRICO
______________________________________________
28
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Considerações botânicas
3.1.1 Família Verbenaceae
A Família Verbenaceae compreende aproximadamente 36 gêneros e cerca de 1000
espécies de distribuição pantropical, sendo que no Brasil ocorrem 17 gêneros e 250 espécies
com potencial econômico amplamente explorado (LORENZI e MATOS, 2002; SOUZA e
LORENZI, 2005).
Segundo Gonzáles (2006), essa família é caracterizada por ervas, arbustos, árvores ou
trepadeiras lenhosas, com ramos regulares ou serreadas. As espécies possuem folhas simples,
opostas e verticiladas, margens inteiras ou serreadas. Inflorescências racemosas ou cimosas,
cabeças, tirsos, espigas ou flores solitárias, ocasionalmente envolvidas por folhas. Flores leves
e evidentemente zigomórficas; bissexuadas ou unissexuadas, cálice tubular e apresenta 5
lobos persistentes, às vezes acrescido de frutos; a corola apresenta quatro a cinco logos, às
vezes bilabiada; androceu com dois a cinco estames, anteras dorsadas, às vezes presente dois
estaminódios (Stachytarpheta) cerca da metade do tubo da corola; gineceu sincárpico, ovário
inteiro e com quatro lóculos, dois carpelos (quatro aparências), placentação axilar, um óvulo
por lóculo. O fruto é carnoso e provido de núcleo ou múltiplo decomponível em frutos
simples com duas a quatro sementes e raramente a cápsula se abre em duas partes.
Algumas espécies dessa família são utilizadas como plantas ornamentais, como por
exemplo: Petrea subserrata (viuvinha) e Lantana camara (chumbinho). Outras espécies são
utilizadas pela população como plantas medicinais, na forma de infusão, por exemplo, Lippia
alba (erva-cidreira), Stachytarpheta cayennensis (jervão) e outras (RIBEIRO et al., 1999).
3.1.2 O gênero Lippia
O gênero Lippia é um dos dois maiores da família Verbenaceae, foi primeiramente
descrito em 1.753 por Linnaeu (BRANDÃO, 2003) e inclui muitas espécies medicinais e
29
aromáticas, sendo encontrado nas Américas do Sul, Central e na África Tropical (VICCINI et
al., 2006).
O número de espécies estimado neste gênero é 160, estando a maior parte no Brasil,
México, Paraguai e na Argentina, com poucas espécies endêmicas na África. O Brasil
apresenta a maior diversidade em espécies descritas do gênero Lippia, aproximadamente 111
espécies, sendo principalmente localizadas na Cadeia do Espinhaço, em Minas Gerais e na
Chapada da Diamantina, na Bahia (SALIMENA, 2000).
Segundo Troncoso (1974), o gênero Lippia pode ser caracterizado por apresentar
plantas arbustivas ou subarbustivas, com folhas decussadas, geralmente com indumento
glandular, florescências parciais capituliformes ou espiciformes, congestas, axilares, brácteas
membranáceas ou cartáceas, verdes ou coloridas, amarelas, róseas ou vináceas, ultrapassando
ou não o comprimento das flores; flores sésseis, cálice comprimido, alado, induplicado,
membranáceo, inconspícuo, persistente no fruto; corola hipocraterimorfa, alva, rósea,
magenta, lilás ou amarelas, tubo reto ou curvo, limbo de quatro a cinco lobado, lábio superior
ou adaxial lobado, lábio inferior ou abaxial único, dois lobos laterais; quatro estames; ovário
monocarpelar, bilocular, ovulado e estigma lateral. Possui fruto dividido na maturidade em
dois mericarpos.
O amplo emprego popular de espécies deste gênero ao redor do mundo concentra-se
no tratamento de disfunções gastrointestinais ou respiratórias e hipertensão (PASCUAL et al.,
2001a). Em muitos casos, as partes utilizadas são as folhas e flores, as quais são comumente
preparadas em infusão ou decocção, mas também utilizadas oralmente ou através de
emplastros e lavagens para ferimentos (LORENZI e MATOS, 2002).
Os principais constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais das espécies
deste gênero são: limoneno, ß-cariofileno, p-cimeno, cânfora, linalol, α-pineno e timol. Dentre
os componentes não-voláteis, foram registrados flavonóides, naftoquinonas, iridóides,
alcalóides, triterpenos e saponinas (PASCUAL et al., 2001a).
3.1.3 Lippia sidoides Cham.
Lippia sidoides Cham. (syn. L. multicapitata Mart.) (Figura 1, p. 30), popularmente
conhecida como “alecrim pimenta”, é um arbusto nativo da região do semi-árido do Nordeste
30
brasileiro, amplamente empregada na medicina popular como anti-séptico de uso local em
pele e mucosas (MATOS, 2000).
A espécie se apresenta como grande arbusto caducifólio, ereto, muito ramificado e
quebradiço, de dois a três metros de altura, próprio da vegetação do semiárido nordestino.
Possui folhas aromáticas e picantes, simples e pecioladas. Flores pequenas, esbranquiçadas,
reunidas em espigas de eixo curto nas exilas das folhas. Frutos do tipo aquênio, extremamente
pequenos, cujas sementes raramente germinam. Pode ser multiplicada por estaquia usando-se,
de preferência, os ramos mais finos. As mudas devem ser plantadas depois de bem enraizadas
(um a dois meses), com espaçamento de três a quatro metros (LORENZI e MATOS, 2002).
Após sua introdução nos programas de fitoterapia em atenção primária de saúde, passou a ser
cultivada em vários Estados (MATOS e OLIVEIRA, 1998).
O estudo fitoquímico dos extratos etanólicos de L. sidoides tem resultado no
isolamento de vários constituintes químicos, tais como: taxifolina, isolariciresinol, ácido 3-Oacetiloleanólico, benzoato de 3,4-dihidroximetila, lapachenol, tecomaquinona, tectoquinona,
tectol, tectol acetilado, quercetina, luteolina, glicoluteolina e lippisidoquinona (COSTA et al.,
2001; 2002).
Figura 1 ‒ A espécie Lippia sidoides Cham.
Fonte: da autora.
31
O efeito terapêutico de L. sidoides tem sido atribuído principalmente à presença do
timol, substância com alto poder antimicrobiano, sendo o componente majoritário do óleo
essencial e também encontrado em extratos hidroalcóolicos (MATOS e OLIVEIRA, 1998).
Outros constituintes encontrados no óleo essencial são p-cimeno, α-terpineno e ß-cariofileno.
O estudo toxicológico pré-clínico agudo com extrato hidroalcoólico das folhas de L.
sidoides demonstrou, por via intraperitoneal em camundongos, que a DL50 encontrada foi de
0,31 mg/mL, sendo considerada pelos autores uma alta toxicidade na via e forma utilizadas
(ALMEIDA et al, 2010b).
Além de possuir um amplo potencial biológico, como será demonstrado no Quadro 1
(p. 32), alguns produtos tecnológicos já estão sendo desenvolvidos a partir dessa espécie. Um
estudo duplo-cego utilizando enxaguatório bucal sem álcool a partir do seu óleo essencial
demonstrou que houve decréscimos nos índices de placa bacteriana e gengivite (BOTELHO
et al., 2009). Em outro trabalho, foi observado que o gel composto por óleo essencial de L.
sidoides e Myracrodruon urundeuva foi eficaz na periodontite, pois além de apresentar
atividade antiinflamatória, impediu o crescimento de patógenos orais e preveniu a reabsorção
óssea alveolar (BOTELHO et al., 2007b).
Paula et al. (2011) desenvolveram e caracterizaram nanoesferas encapsuladas com
quitosana e goma de cajueiro, contendo óleo essencial de L. sidoides no seu interior, para o
controle das larvas de Aedes aegypti. Também a partir do óleo essencial foram desenvolvidos
um gel e enxaguatório bucal para o controle de cárie em crianças entre 6 e 12 anos de idade, e
comprovaram nesse experimento que ambas formulações foram bastante efetivas (LOBO et
al., 2011). No entanto, apesar do futuro promissor, a exemplo de outras espécies nativas, L.
sidoides necessita de maior número de estudos para poder gerar um fitomedicamento ou
fitoterápico cientificamente validado.
32
3.2 Atividades biológicas do gênero Lippia
As espécies desse gênero se caracterizam por possuir notáveis atividades biológicas
comprovadas cientificamente, dentre estas, a mais registrada é a atividade antimicrobiana, a
qual está associada a sua constituição química, que na grande maioria é rica em constituintes
de natureza fenólica (LEMOS et al., 1990). O Quadro 1 mostra as publicações referentes às
atividades biológicas relacionadas ao gênero Lippia no período entre 1981 a 2011. Para este
fim, foi realizada uma busca dos artigos através do portal de periódicos da CAPES, bem como
em bancos de dados: Pubmed, Scielo e Science Direct. Foram utilizados os descritores Lippia,
atividade biológica e biological activities.
Quadro 1: Atividades biológicas de espécies de Lippia no período entre 1981 a 2011.
Atividade biológica
Espécies
Referência
Acaricida
L. sidoides Cham.
Alelopática
L. sidoides Cham.
Alves et al., 2004
Anestésica em peixes
L. alba (Mill.) N. E. Brown
Cunha et al., 2010
Cavalcanti et al., 2010
L. sidoides Cham.,
Antibacteriana
(Cont.)
L. alba (Mill.) N. E. Brown,
Lemos et al., 1990;
L. dulcis Trevir, L. formosa T. S.
Cáceres et al., 1991;
Brandegee, L. gracilis H.B.K.,
Dimayuga e Keer Garcia,
L. grandifolia Hochst.,
1991; Lemos et al., 1992;
L. javanica (N.L. Burm.) Spreng,
Kunle et al., 2003;
L. microphylla Cham.,
Bassole et al., 2003;
L. nodiflora (L.) Michx.,
Manenzhe et al.; 2004;
L. palmeri S. Wats. var. palmeri,
Oskay et al., 2005;
33
(Cont.)
L. ukambensis Vatke,
Pessoa et al., 2005.;
L. graveolens H.B.K.,
Botelho et al., 2007;
L. origanoides H.B.K, L. chevalieri
Oliveira et al., 2007;
Moldenke, L. triphylla (L'Her) O.
Mevy et al., 2007;
Kuntze, L. wilmsii H. H. W. Pearson;
Sánchez et al., 2010;
L. gracilis H.B.K.;
Shikanga et al., 2010;
L. multiflora Moldenke
Reis et al., 2011
Anticonvulsivante
Viana et al., 2000
Antidiarréica
Heinrich et al., 1992
L. sidoides Cham., L. grata Schauer,
Souza Brito e Souza
L. chamissonis D. Dietr., L. dulcis
Brito, 1993;
Trev.
Görnemann et al., 2008
L. sidoides Cham., L. palmeri S.
Duarte et al., 2005;
Wats, L. multiflora
Fontenelle et al., 2007;
Moldenke, L. rugosa A. Chev.,
Tatsadjieu et al., 2009;
L. scaberrima Sond., L. alba (Mill.)
Regnier et al., 2008,
N. E. Brown,
2010; Shukla et al., 2009;
L. rehmannii H.Pearson
Linde et al., 2010
L. sidoides Cham.
Camurça-Vasconcelos et
Antibacteriana
Antiespasmódica
Antifúngica
Anti-helmíntica
al., 2007, 2008
(Cont.)
34
(Cont.)
L. sidoides Cham.,
Pham Huu Chanh et al.,
L. multiflora Moldenke,
1988; Souza Brito e
L. chamissonis D. Dietr.
Souza Brito, 1993
Slowing Barillas, 1992;
L. geminata H.B.K,
Abena et al., 2003;
Antiinflamatória/
L. citriodora (Ort.) H.B.K,
Girão et al., 2003;
Analgésica
L. gracillis Schauer,
Pérez et al., 2005;
Anti-hipertensiva
L. sidoides Cham., L. dulcis Trevir,
Monteiro et al., 2007;
Mendes et al., 2010;
Guilhon et al., 2011
Antimalárica
L. multiflora Moldenke, L. chevalieri
Gasquet et al., 1993;
Moldenke, L. javanica (N.L. Burm.)
Valentin et al., 1995;
Spreng.
Mallie e Bastide, 1995;
Clarkson et al., 2004
Antimutagênica
Antioxidante
Ramos et al., 2003
L. nodiflora Mich., L. graveolens
Stashenko et al., 2004;
H.B.K., L. berlandieri v. Schauer,
David et al.; 2007; Rocha-
Guzmán et al., 2007;
L. sidoides Cham., L. multiflora
Silva et al., 2009; ,
Moldenke; L. microphylla Cham.,
Almeida et al., 2010a;
L. javanica (N.L. Burm.) Spreng,
Ashokkumar et al., 2010;
L. wilmsii H.H.W Pearson,
Olivero-Verbel et al.,
L. schomburgkiana Schauer,
2010; Sanchéz et al.,
L. grandis Schauer
2010, Shikanga et al.,
2010; Arthur et al., 2011;
Damasceno et al., 2011
(Cont.)
35
(Cont.)
Antiulcerogênica
Antiviral
Pascual et al., 2001b
Abad et al., 1999;
Andrighetti-Frohner et al.,
L. citriodora (Ort.) H.B.K.
2005; Ocazionez et al.,
2010
Cardioestimulante
L. sidoides Cham.
Gilbert et al., 2005
Citotóxica
Costa et al., 2004
Conservante de
L. berlandieri Schauer
Sosa et al., 2010
Escabicida
Oladimeji et al., 2005
Gastroprotetora
L. sidoides Cham.
Monteiro et al., 2007
L. ukambensis Vatke, L. wilmsii H.
Mwangi et al., 1992;
H. W. Pearson, L. somalensis Vatke,
Govere et al., 2000;
L. javanica (N.L. Burm.) Spreng.,
Carvalho et al., 2003;
L. grandifolia Hochst., L. dauensis
Costa et al., 2005;
(Chiov.) Chiov., L. gracillis H.B.K.,
Silva et al., 2008
alimentos
Larvicida/ repelente
L. sidoides Cham.
(Cont.)
36
(Cont.)
Leishmanicida
L. sidoides Cham.
Medeiros et al., 2011
Moduladora da
L. sidoides Cham.
Oliveira et al., 2006
L. sidoides Cham., L. aristata
Craveiro et al., 1981;
Schauer, L. gracillis H.B.K.
Teles et al., 2010
L. microphylla Cham.
Omena, 2007
L. sidoides Cham.
Botelho et al., 2007
Vale et al., 1999
atividade de antibióticos
Moluscicida
Neuroléptica
Preventiva da
reabsorção do osso
alveolar
Sedativa
L. microphylla Cham., L. gracillis
Tóxica frente à Artemia
Schauer, L. alba (Mill.) N. E. Brown,
salina ou
L. schomburgkiana Schauer,
A. franciscana
L. grandis Schauer
Ajaiyeoba et al., 2006;
David et al., 2007; Silva
et al., 2009; Teles et al.,
2010; Olivero-Verbel et
al., 2010; Damasceno et
al., 2011
37
3.3 Óleos essenciais
Os óleos essenciais (também denominados óleos etéreos ou essências) são misturas
complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas, que podem
ser obtidos de várias partes da planta (flores, folhas, galhos, cascas, frutos, raízes, etc.)
(SIMÕES et al., 2003). Desde a antiguidade, os óleos essenciais são utilizados como
perfumes, flavorizantes e conservantes (BAUER e GARBE, 2001). O método de
hidrodestilação para extração de óleos essenciais foi realizada pela primeira vez no Oriente
(Egito, Pérsia e Índia) (LAVABRE, 1992).
A composição química desses óleos contidos em diferentes espécies é bastante
complexa e sofre influência tanto do material genético da planta, quanto das condições de
cultura e desenvolvimento (tipo de solo e clima), assim como de colheita e o processamento
pós-colheita (parte da planta da qual é extraído, horário e época do ano) (LAVABRE, 1992).
São
conhecidos
comercialmente
cerca
importantes,
de
3.000
óleos
especialmente
essenciais,
para
as
dos
quais
indústrias
300
são
farmacêutica,
agronômica, alimentícia, e principalmente para fabricação de cosméticos e perfumes
(BAKKALI et al., 2008). Drogas vegetais ricas em óleos essenciais são empregadas in natura
para a preparação de infusões e/ou sob a forma de outras preparações simples. Podem ser
utilizados na indústria farmacêutica para síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e
antissépticos (BRUNETON, 1995).
Os constituintes químicos dos óleos essenciais variam desde hidrocarbonetos
terpênicos, alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos,
peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos com enxofre. Na
mistura, tais compostos apresentam-se em diferentes concentrações, onde um deles é o
compostos majoritário, existindo outros em menores concentrações e alguns em baixíssimas
quantidades (traços) (SIMÕES et al., 2007).
Os terpenos constituem uma grande variedade de substâncias vegetais, que derivam de
unidades do isopreno (Figura 2, p. 38). A classificação dos terpenos é feita pelo número de
ligações de unidades de isopreno, onde o número de unidades incorporadas em determinado
terpenóide hidrocarbônico insaturado serve de base para esta classificação. Os compostos
terpênicos mais freqüentes nos óleos voláteis são os monoterpenos (cerca de 90 % dos óleos
voláteis) e os sesquiterpenos. Os monoterpenos são compostos de duas unidades e tem
38
fórmula molecular C10H16; os sesquiterpenos contêm três unidades e sua fórmula molecular é
C15H24. (SIMÕES et al., 2007).
Figura 2 ‒ Estrutura da unidade isopreno
C5H8
Os terpenos possuem um largo espectro de ações biológicas, vários foram isolados e
avaliados quanto à toxicidade frente aos insetos. A grande maioria de trabalhos científicos que
se referem à terpenóides com atividade inseticida faz referência à capacidade de inibir ou
retardar o crescimento, danos na maturação, redução da capacidade reprodutiva, supressores
de apetite, podendo levar os insetos à morte por inanição ou toxicidade direta (NDUMU et al.,
1999; BRUNO et al., 1999; NAKATANI et al., 2000).
Tem sido estabelecido cientificamente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem
propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (BHAVANANI e
BALLOW, 1992). Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Penicillium expansum, e
Geotrichum, os principais fungos responsáveis pela deterioração pós-colheita de maçã, foram
inibidos com vapor de citral e seus isômeros: geranial e neral (VENTURINI et al., 2002;
WURYATMO et al., 2003).
Outros monoterpenos como citronelal, L-carvona, isopullegol e α-pineno inibiram o
crescimento de fungos que causam contaminação em frutas como banana, mamão e abacaxi,
como Colletotrichum musae, Colletotrichum gloeosporioides e Fusarium subglutinans
(GARCIA et al., 2008). O óleo essencial de Malaleuca alternifolia tem como constituinte
majoritário o monoterpeno terpinen-4-ol, e atribuem a esse composto o amplo espectro da
atividade antibacteriana (TOGASHI et al., 2008).
Muitas espécies de Lippia contém monoterpenos como constituintes majoritários dos
óleos essenciais que exibem uma variedade de atividades biológicas, sendo o timol, carvacrol,
citral e p-cimeno os compostos mais freqüentemente encontrados e responsáveis pelas
atividades biológicas observadas.
39
3.4 Timol: um monoterpeno presente nas folhas de Lippia sidoides
O timol (Figura 3) é um monoterpeno fenólico, e é isômero do carvacrol. É encontrado
no óleo essencial das folhas de L. sidoides e nos extratos hidroalcoólicos (MATOS, 2000).
Também foi verificada sua presença em outras espécies do gênero Lippia e em espécies tais
como: Thymus vulgaris, Conobea scoparioides, Origanum compactum, Origanum vulgare e
Satureja montana.
Foi descoberto por Caspar Neumann em 1719 e purificado em 1853, por M.
Lallemand, o qual atribuiu o nome "timol" (King's American Dispensatory, 1868). Possui
fórmula C10H14O; massa molar 150, 2176; ponto de fusão 51,5°C; ponto de ebulição 232,5°C;
pKa 10,62; solubilidade em água 900 mg/L; pressão de vapor 0,0376 mmHg a 25°C;
densidade 0.974 g/cm3 (United States National Library of Medicine).
O timol tem sido encontrado em formulações de cremes e anti-sépticos bucais
(Euthymol® e Listerine®), pomadas descongestionantes (Vick®), pastilhas que aliviam tosse e
irritação da garganta (Valda®), adesivos antiinflamatórios (Salonpas®) e como anti-séptico
para higienização bucal de cães e gatos (Gelsept®).
Figura 3 ‒ Estrutura química do timol
OH
Foi realizado um levantamento sobre as publicações referentes às atividades biológicas
relacionadas ao timol no período entre 2000 a 2011 utilizando os seguintes descritores: timol,
thymol, atividade biológica e biological activities (Quadro 2, p. 40). Foram incluídos os
trabalhos que utilizaram o timol sintético bem como as espécies que o continham como
componente majoritário do óleo essencial das folhas. A maioria das publicações citou o timol
como a substância responsável pela atividade antimicrobiana frente às bactérias Grampositivas, Gram-negativas e fungos, atividade larvicida e antioxidante.
40
Quadro 2 ‒ Atividades biológicas relacionadas ao timol no período entre 2000 a 2011.
Atividade
Antibacteriana
Espécie/ Sintético
Referência
Thymus vulgaris L.,
Juliano et al., 2000; Bassole
Origanum vulgare L.,
et al., 2003; Nostro et al.,
L. chevalieri Moldenke,
2004, 2007; Hanbali et al.,
L. multiflora Moldenke ,
2005; Amin et al., 2005;
Satureja montana L.,
Nazer et al., 2005; Chung et
Carum copticum Benth. &
al., 2006; Kobilinsky et al.,
Hook; Oliveria decumbens
2007; Lebert et al., 2007;
Vent; Pulicaria odora L.;
Michiels et al., 2007;
Thymus hyemalis Lange;
Botelho et al., 2007a,b; Rota
Thymus zygis L.,
et al., 2008; Cávar et al.,
L. sidoides Cham.,
2008; Oroojalian et al.,
L. multiflora
2010; Rivas et al., 2010;
Moldenke; Sintético
Soković et al., 2010; Rúa et
al., 2011
Daferera et al., 2000;
T. vulgaris L., Satureja
Vázquez et al., 2001; Pina-
Antifúngica/
hortensis L.,
Vaz et al., 2004; López-
anti-micotoxina
Trachyspermum copticum
Malo et al., 2005; Svircev et
L., L. sidoides Cham.,
al., 2007; Fontenelle et al.,
Sintético
2007;
Razzaghi-Abyaneh
et al., 2008; Rasooli et al.,
2008; Dalleau et al., 2008;
Dambolena et al., 2011
Antiinflamatória/analgésica
(Cont.)
L. gracillis Schauer,
Loizzo et al., 2009;
Origanum ehrenbergii
Monteiro et al., 2009;
Boiss, L. sidoides Cham.
Mendes et al., 2010
41
(Cont.)
Conobea scoparioides
(Cham. & Schltdl.) Benth,
Antioxidante
L. grandis Schauer,
Milos et al., 2000; Tepe et
Thymus praecox subsp.
al., 2007; Cavar et al., 2008;
skorpilii (Velen.) Jalen var.
Loizzo et al., 2009; Rebelo
skorpilii, Clinopodium
et al., 2009; Sarikurkcu et
vulgare L., Origanum
al., 2010; Damasceno et al.,
syriacum L., Origanum
2011; Rúa et al., 2011; Ozen
ehrenbergii Boiss, Thymus
et al., 2011
longicaulis C. Presl subsp.
longicaulis var.
longicaulis, Origanum
vulgare L., Satureja
montana L., Sintético
Citotóxica
Sintético
Chang et al., 2000
Clastogênica
Sintético
Someya et al., 2008
Escabicida
Sintético
Toloza et al., 2006
Genotóxica
Sintético
Buyukleyla e
Rencuzogullari, 2009
Inibidora da formação de
Sintético
Prieto et al., 2007
L. sidoides Cham.,
Mühlbauer et al., 2003;
Sintético
peroxinitrito
Inibidora da reabsorção óssea
(Cont.)
42
(Cont.)
Carvalho et al., 2003;
Larvicida/ repelente
Thymus vulgaris L.,
Novelino et al., 2007; Knio
L. sidoides Cham.,
et al., 2008; Pavela et al.,
Thymus satureioides Coss.,
2009; Regnier e
Sintético
Combrinck, 2010a; Kim et
al., 2010; Zahran e
Abdelgaleil, 2011
Inibidora da reabsorção óssea
Moduladora do receptor
L. sidoides Cham.,
Mühlbauer et al., 2003;
Sintético
Sintético
García et al., 2006
Thymus broussonetii Boiss
Saad et al., 2010
Origanum compactum
Lahlou e Berrada, 2001;
Benth, Sintético
Ferreira et al., 2009
Zataria multiflora Boiss
Mahboubi e Bidgoli, 2010
Sintético
Oliveira et al., 2010
GABAA
Moduladora de antifúngicos:
fluconazol e anfotericina B
Moluscicida
Sinergismo com
vancomicina frente à
Staphylococcus aureus
Sinergismo com carvacrol,
ácido lático e ácido acético
frente a S. aureus
(Cont.)
43
(Cont.)
Tóxica frente à
L. grandis Schauer,
Rebelo et al., 2009;
Artemia salina
C. scoparioides (Cham. &
Damasceno et al., 2011
Schltdl.) Benth
3.5 Atividade antimicrobiana de produtos naturais
Muito antes da descoberta da existência de microorganismos, as idéias de que certas
plantas possuíam atividade cicatrizante e de que elas continham o que se podia caracterizar
como “princípios antimicrobianos” eram muito bem aceitas. Desde a antiguidade, o homem
utiliza as plantas para tratar doenças infecciosas e até hoje, algumas delas são incluídas como
parte do tratamento de várias enfermidades (RIOS e RÉCIO, 2005).
A atividade antimicrobiana de plantas medicinais tem sido pesquisada em diversas
espécies e registrada em muitos países que possuem uma flora diversificada e uma rica
tradição na sua utilização como Brasil, Cuba, Índia, México e Malásia (NASCIMENTO et al.,
2000; DI STASI et al., 2002).
Os principais produtos vegetais que possuem atividade antimicrobiana são os extratos,
os óleos essenciais, as frações látex e as proteínas (MATOS, 2000). Esses produtos naturais
são considerados pelas comunidades uma alternativa para aliviar e até mesmo curar processos
infecciosos e constituem uma importante fonte de novos compostos biologicamente ativos
(BASTOS, 2007).
3.6 Resistência microbiana
A resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético relacionado à existência de
genes contidos no microorganismo que codificam diferentes mecanismos bioquímicos que
impedem a ação das drogas (TAVARES, 1996). Uma bactéria é dita resistente a um
determinado antibiótico quando é capaz de crescer, in vitro, na presença da concentração
inibitória mínima que essa droga atinge no sangue (TAVARES, 2002). De acordo com
44
European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), um microorganismo é
considerado resistente quando existe uma alta probabilidade de falha na terapêutica
(MACGOWAN, 2008)
Apesar da disponibilização de novos antibióticos, o ritmo de desenvolvimento da
resistência bacteriana nos diferentes patógenos, Gram-positivos e negativos, representa um
constante desafio terapêutico. A seleção de antibióticos eficazes tem se tornado uma tarefa
difícil e desafiadora (ROSSI e ANDREAZZI, 2005).
Nesse sentido, a diversidade de moléculas encontradas em plantas faz das mesmas
fontes promissoras de novos agentes antimicrobianos (ESTEVAM et al., 2009). Óleos
essenciais extraídos de plantas medicinais há muito tempo têm servido de base para diversas
aplicações na medicina popular, entre elas, a produção de anti-sépticos tópicos. Muitos
estudos confirmam a atividade antimicrobiana de produtos naturais, tais como o óleo essencial
de Zanthoxylum rhoifolium (COSTA et al., 2008), Lippia alba (AGUIAR et al., 2008), entre
outros.
Segundo Daferera et al. (2003) o uso de óleos essenciais, como agentes
antimicrobianos, oferece um baixo risco de desenvolvimento de resistência microbiana, pois
sendo misturas de diferentes compostos, sua atividade antimicrobiana pode estar relacionada a
diferentes mecanismos de ação, o que dificulta a adaptação dos microrganismos.
Os compostos fenólicos presentes nos óleos essenciais têm propriedades
antibacterianas, bem como as propriedades antifúngicas e antivirais (RUSSEL et al., 1996). O
fenol foi utilizado há muito tempo como anti-séptico para feridas, mas atualmente seu uso se
tornou estrito apenas para desinfecção de superfícies em ambientes hospitalares, pois o
mesmo causa irritação na pele e danos teciduais (PAULI, 2001; RODRIGUES PÉREZ et al.,
2007). Dentre os monoterpenos fenólicos que possuem pronunciada atividade antimicrobiana,
podemos citar o timol, carvacrol, ß e γ- tujaplicina (PAULI, 2001).
A associação entre antimicrobianos tornou-se uma alternativa para o sucesso na
terapia frente aos patógenos resistentes, como ß- lactâmicos e inibidores da ß-lactamase. Os
produtos naturais também podem interagir com antibióticos modificando sua atividade, seja
potencializando ou antagonizando a ação dos mesmos. Alguns estudos comprovam a
modificação da atividade de aminoglicosídeos. Os componentes voláteis do óleo essencial de
Zanthoxylum articulatum aumentam a atividade antibiótica da gentamicina frente à
Pseudomonas aeruginosa (RODRIGUES et al., 2010) e os extratos de Cordia verbenaceae
45
diminuíram a concentração inibitória mínima frente à Escherichia coli e S. aureus
multirresistentes (MATIAS et al., 2010).
Os terpenos presentes nos óleos essenciais atuam sobre as estruturas da membrana
celular, causando danos às células (SIKKEMA, BONT e POOLMAN, 1994). Um estudo feito
por Togashi et al. (2008), demonstrou que o terpeno farnesol, presente no óleo essencial de
Melaleuca alternifolia, possui atividade antibacteriana frente à Staphylococcus aureus, cujo
mecanismo de ação envolve danos na membrana celular dessa bactéria. O farnesol, em
associação com outros dois terpenos, geraniol e geranilgeraniol, possui um efeito inibitório
maior contra a bactéria do que quando utilizado sozinho.
Então, diante da crescente resistência aos antimicrobianos, torna-se necessário o
estudo de novos produtos com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate
a esses microorganismos.
3.7 Biofilme
O biofilme é uma comunidade estruturada de células bacterianas embebidas em uma
matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e aderida a uma superfície inerte ou
viva (COSTERTON et al., 1999). Biofilmes podem colonizar implantes como válvulas
cardíacas, cateteres e alguns tecidos corpóreos, como dentes e gengivas, pulmões, ouvidos,
trato urogenital, entre outros (STEWART e COSTERTON, 2001). Dentre as bactérias que são
responsáveis pela formação de biofilme podemos citar: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, dentre outras
(YOSHIDA e KURAMITSU, 2002; ABDULLAH et al., 2005; ANTUNES et al., 2007;
TIBA et al., 2009; FREITAS et al., 2010).
As vantagens de uma célula bacteriana em se encontrar contida num biofilme são
numerosas, principalmente no que diz respeito à proteção contra agentes agressivos. Além de
ser resistentes a desinfetantes e antibióticos, os biofilmes demonstram também resistência à
radiação UV, à desidratação (a matriz de EPS é altamente hidratada) e a predadores como
protozoários (ELASRI e MILLER 1999; XAVIER et al., 2003)
Os Enteroccocus são cocos Gram-positivos que geralmente se dispõem aos pares e em
curtas cadeias, e são catalase negativos (MURRAY et al., 2005). A habilidade de formação de
biofilme por esse gênero permite a colonização de superfícies inertes e biológicas, protege
46
contra agentes antimicrobianos e ação de fagócitos, mediando adesão e invasão de células do
hospedeiro (BALDASSARRI et al., 2005).
Inicialmente, a colonização ou infecção por E. faecalis ocorre pela aderência e
formação de biofilme nas células epiteliais e a produção de hemolisina, lipase, caseinase que
atuam como fatores de virulência (FURUMURA et al., 2006). A citolisina, proteína de
superfície de enterococos, gelatinase e substância de agregação são outros fatores de
virulência relacionados ao E. faecalis (COBURN e GILMORE, 2003; KRITISH et al., 2004),
sendo que a proteína de superfície de enterococos aumenta a formação do biofilme
(TENDOLKAR et al., 2004).
Essa bactéria é uma das mais resistentes aos antimicrobianos no trato gastrointestinal e
é conhecida por causar infecções crônicas devido à formação de biofilme (CÂNDIDO et al.,
2010). É a mais comum e, ocasionalmente, a única bactéria mais freqüentemente isolada de
canais radiculares de dentes com lesões periapicais persistentes (RÓÇAS et al., 2004).
Diante disso, trabalhos são desenvolvidos no sentido de verificar a eficácia de
produtos naturais no controle de biofilmes. A maioria desses estudos se referem ao controle
do biofilme dental (placa bacteriana), como o gel e extrato de Punica granatum (romã)
(SALGADO et al., 2006; ALSAIMARY, 2009), L. sidoides (alecrim pimenta) (BOTELHO et
al., 2009), Coffea arabica (café) (LANDUCCI et al., 2003) e extrato de Rheedia brasiliensis
(bacupari) (ALMEIDA, 2008).
Assim, óleos essenciais ou substâncias isoladas de plantas medicinais ou de outros
produtos encontrados na natureza podem ser pesquisados como alternativas terapêuticas para
reverter à resistência aos antimicrobianos, para o controle de patógenos causadores de
infecções, bem como no controle de biofilmes microbianos.
47
3.8 Atividade antiinflamatória de produtos naturais
O processo inflamatório está envolvido em diversas patologias, tais como contusões,
tendinites, infecções respiratórias, asma e doenças auto-imunes. Apresenta-se como um
mecanismo de defesa do organismo, cujo objetivo é a eliminação da causa inicial da lesão
celular, provocada por patógenos ou por ação de agentes físicos (COTRAN et al., 2000).
Nos antigos papiros egípcios (≈ 3000 a.C.) já constavam registros das características
clínicas deste processo. Os sinais cardinais da inflamação foram descritos na era clássica por
Aulus Celsus (30 a.C. – 38 d.C.): rubor (eritema), calor (temperatura elevada), tumor (edema)
e dor. Um quinto sinal, perda da função, foi acrescentado por Rudolf Virchow. No século
XVIII, Jonh Hunter verificou a dilatação dos vasos sanguíneos e Julius Cohnhein associou
inflamação à emigração de leucócitos através das paredes da microvasculatura. No final do
século XIX, Eli Metchnikoff enfatizou o papel da fagocitose no processo inflamatório,
enquanto a importância dos mediadores químicos foi descrito posteriormente por Thomas
Lewis em 1927 (WEISSMAN, 1992; MURPHY e WARD, 2006).
De acordo com o tempo de permanência do processo inflamatório no organismo, a
inflamação pode ser aguda, a qual se observa uma resposta rápida a um agente nóxico de
modo que ocorra uma estimulação na síntese de mediadores de defesa e o direcionamento dos
mesmos ao local da lesão. Na inflamação crônica, o processo pode se prolongar por períodos
mais extensos e está associada com outros processos de alterações histológicas como fibrose e
necrose do tecido afetado, proliferação de vasos sanguíneos e, principalmente, a participação
de linfócitos e macrófagos (COLLINS, 1999; MCDONALD et al., 1999).
As substâncias endógenas que modificam bioquímica e fisiologicamente a estrutura do
local afetado pelo processo inflamatório são geralmente chamadas de mediadores. Os
principais mediadores envolvidos na inflamação incluem histamina, serotonina bradicinina,
metabólitos do ácido araquidônico (AA) (Figura 4, p. 48), citocinas, neuropetídeos, óxido
nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS), dentre outros (RANG et al., 2007).
Inicialmente, estes mediadores são liberados no local onde se deflagrou o processo. Os
macrófagos locais sinalizam a presença de material estranho ou lesão através destes
mediadores e/ou citocinas que irão recrutar células circulantes (leucócitos polimorfonucleares,
macrófagos, eosinófilos, linfócitos) que apresentam um papel amplificador no processo
(FERREIRA, 1993).
48
Figura 4: Produção de eicosanóides a partir do ácido araquidônico.
Fosfolipídeos de membrana
Estímulo físico,
químico, inflamatório
Fosfolipase A2
Ácido araquidônico
Ciclooxigenases
Prostaglandinas e
Tromboxanos
Lipooxigenases
Leucotrienos
Adaptada de Krummer e Coelho (2002).
A pele é a primeira linha inata de defesa contra muitos invasores microbianos e é
dividida, basicamente, em duas camadas principais, a derme e a epiderme, separadas por uma
fina membrana basal. A maioria das funções de defesa da epiderme localiza-se no estrato
córneo, que limita a colonização por patógenos devido ao baixo teor de água, pH ácido,
presença de microflora residente normal, bem como lipídios e peptídeos antimicrobianos de
superfície (ELIAS, 2007).
Injúrias externas à epiderme podem provocar inflamação por estimular a produção de
citocinas pelos queratinócitos. Após ruptura aguda da barreira epidérmica, ocorre aumento na
expressão de interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-6 (IL6), os quais são potentes mitógenos epiteliais e estimuladores da síntese de lipídios. Essas
citocinas parecem ser fundamentais para o reparo da barreira cutânea. No entanto, se a ruptura
da barreira é prolongada com aumento crônico na produção de citocinas, poderá ocorrer um
efeito prejudicial sobre a inflamação e a proliferação epidérmica (PROKSCH; BRANDNER e
JENSEN, 2008).
As dermatites são dermatoses inflamatórias mediadas por fatores imunológicos locais
ou sistêmicos, embora as causas de muitas delas permaneçam desconhecidas. Em geral, as
49
lesões agudas permanecem por alguns dias a semanas e se caracterizam por inflamação,
edema e, em algumas, lesão epidérmica, vascular e subcutânea (MURPHY, 2006).
Plantas que são utilizadas tradicionalmente na cicatrização, febre, infecção, edema ou
doenças reumáticas são indicadores da presença de compostos com propriedades
antiinflamatórias e, assim, devem ser investigadas e a sua eficácia comprovada. A evolução
no entendimento dos aspectos moleculares da fisiopatologia da inflamação favoreceu o
estabelecimento de novos sistemas de testes para a seleção de diversas substâncias que
permitem a identificação de novos compostos antiinflamatórios (CARVALHO, 2004).
O screening de compostos com propriedades antiinflamatórias é possível graças a uma
infinidade de técnicas in vitro (cultura de células e dosagem de mediadores inflamatórios;
inibição de enzimas) e in vivo (indução de inflamação por substâncias denominadas agentes
flogísticos ou irritantes em modelos animais variados), amplamente utilizados na pesquisa
pré-clínica (SARAIVA, 2009).
A indução de edema em orelhas de camundongos por diferentes substâncias irritantes
oferece uma boa avaliação sobre a eficácia de produtos naturais e outras drogas sobre o
processo inflamatório tópico. Esse modelo possui muitas vantagens, tais como: rapidez e
simplicidade; reprodutibilidade e baixa possibilidade de erro (GÁBOR, 2000).
Plantas utilizadas na medicina tradicional demonstraram potencial antiinflamatório
tópico in vivo, tais como o óleo-resina de Copaifera duckei (copaíba) (CARVALHO et al.,
2005), óleos das sementes de Helianthus annus (girassol) e Vitis vinifera (uva) (NABAS et
al., 2009) e extrato acetato de etila obtido das folhas de Memecylon edule (NUALKAEW et
al., 2009).
A aplicação tópica do extrato hidroalcóolico e frações de Serjania erecta (cipó-cincofolhas) revelaram atividade significativa sobre o processo inflamatório, causando uma
redução dose-dependente do edema de orelha induzido por óleo de cróton. Além disso, houve
diminuição da atividade da mieloperoxidase tissular, parâmetro indicativo do influxo de
polimorfonucleares. As frações diclorometano, acetato de etila e hexânica demonstraram
inibição máxima de 81%, 78% e 83% para o edema de orelha e 56%, 52% e 69% para
atividade da mieloperoxidase, respectivamente (GOMIG et al., 2008).
Os resultados promissores encontrados nesses estudos demonstram possibilidades da
utilização de plantas
antiinflamatórios tópicos.
medicinais
e
seus
metabólitos
secundários
como
agentes
50
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________
51
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
As folhas de Lippia sidoides foram coletadas no mês de Agosto/2010, às 13 h no
Horto de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Regional do Cariri (URCA), em
Crato (CE). Uma amostra representativa da espécie encontra-se depositada no Herbário
Caririense Dárdano de Andrade-Lima (HCDAL) do Departamento de Ciências Biológicas
(URCA), sob registro nº 3038.
4.2 Obtenção do óleo essencial
O óleo essencial foi obtido utilizando-se o sistema de hidrodestilação em aparelho tipo
Clevenger modificado por Gottlieb (1960). As folhas frescas de L. sidoides foram colocadas
em balão de vidro de 5 L, acrescida de 3 L de água destilada e aquecidas por 2 h. Após esse
período, a mistura água/óleo obtida foi separada, tratada com sulfato de sódio anidro, filtrada
e o óleo obtido (OELS) foi mantido sob refrigeração até o momento das análises (Figura 5, p.
52).
4.3 Obtenção do timol
O timol foi obtido através da Farmácia de Manipulação Evidence, marca SigmaAldrich (St. Louis-EUA).
52
Figura 5 ‒ Método de extração do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides Cham.
Folhas frescas
Extração em doseador tipo Clevenger
Hidrolato
Óleo/Água
Separação
Óleo
Solução aquosa
1. Sulfato de sódio anidro
2. Filtração
Óleo essencial
Identificação
53
A análise da composição química do óleo essencial foi realizada em cromatógrafo
gasoso acoplado a espectrômetro de massas (CG/EM Shimadzu, modelo QP5050A) e provido
de uma coluna capilar DB-5HT de sílica fundida com 30 m de comprimento, 0,25 mm de
diâmetro interno e filme 0,25 µm, tendo o hélio como gás de arraste e fluxo de 0,8 mL/min. A
temperatura do injetor foi 250 ºC e a temperatura do detector (ou interface) foi 200 ºC. A
temperatura da coluna foi programada de 35 ºC para 180 ºC em 4 ºC/min e em seguida 180 ºC
para 250 ºC em 10 ºC/min. Os espectros de massas foram gravados a partir de 30 - 450 m/z.
Os componentes individuais foram identificados por correspondência de seus
espectros de massa, com energia de impacto de 70 eV, com os da base de dados usando a
biblioteca construída através do espectrômetro (Wiley, 229) e outros dois computadores
utilizando índices de retenção como uma pré-seleção (ALENCAR, CRAVEIRO e MATOS,
1984; ALENCAR et al., 1990), bem como por comparação visual da fragmentação padrão
com aqueles relatados na literatura (STENHAGEN, ABRAHAMSON e MCLAFFERTY,
1974; ADAMS, 2001).
4.5.1. Cepas microbianas
Foram utilizadas cepas microbianas provenientes da “American Type Culture
Collection” (ATCC) doadas pelo Laboratório de Materias de Referência da Fiocruz:
Staphylococcus aureus ATCC 12624, Streptococcus mutans ATCC 446, Enterococcus
faecalis ATCC 4083, Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter cloacae ATCC 23355,
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Providencia
rettigeri ATCC 29944, Candida albicans ATCC 40006 e Candida tropicalis ATCC 40042.
Todas as cepas foram estocadas em ágar BHI sob refrigeração, de forma a conservarem
inalteradas todas as suas características bioquímicas e perfil de sensibilidade a
antimicrobianos.
54
4.5.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A determinação da CIM foi realizada através da técnica de microdiluição em caldo
utilizando placas esterilizadas com 96 poços de fundo redondo de acordo com a Norma M7A6 (CLSI, 2003) (Figura 6, p. 55). Culturas microbianas mantidas em ágar estoque sob
refrigeração foram repicadas em caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubadas a
35°C durante 24 h. Após esse período, procedeu-se a padronização do inóculo, que consistiu
na preparação de uma suspensão em BHI, cuja turvação fosse similar ao tubo 0,5 da escala
McFarland (1 x 108 UFC/mL). Essa suspensão foi diluída 100 vezes, em meio BHI, o que
corresponde aproximadamente a uma suspensão contendo 1 x 106 UFC/mL, da qual foi
retirado 100 µL e adicionado em cada poço da placa acrescido de diferentes concentrações do
OELS ou timol. Para as linhagens fúngicas, utilizou-se caldo Sabouraud para padronização do
inoculo.
As soluções do OELS e timol foram preparadas separadamente utilizando 10 mg das
amostras solubilizadas em 1 mL de dimetilsufóxido (DMSO) obtendo uma concentração
inicial de 10 mg/mL. A partir desta concentração, realizaram-se diluições em água destilada
estéril para obter uma solução estoque de 1024 μg/mL. As concentrações finais das amostras
no meio de cultura foram 512, 256, 128, 64, 32, 16 e 8 μg/mL.
Os testes foram realizados em duplicata. As placas foram incubadas a 35 ± 2 ºC,
durante 24 h. Após esse período, as placas foram reveladas com corante específico, a
resazurina, um indicador calorimétrico de óxido-redução (SALVAT et al., 2001) e as placas
contendo as cepas fúngicas foram reveladas através de visualização da turvação no meio.
Uma solução foi preparada com resazurina sódica e água destilada na concentração de 0,01%,
onde 25 μL da solução indicadora foram adicionados em cada cavidade, e após 1 h procedeuse com a leitura do teste. A leitura dos resultados para determinação da CIM foi determinada
através da coloração do meio de cultura, sendo considerada positiva para os poços que não
apresentaram crescimento microbiano, ou seja, permaneceram com a coloração azul e
negativa os que obtiveram coloração vermelha (SALVAT et al., 2001). O controle negativo
do teste foi realizado com os meios de cultura contendo o inóculo.
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida como a menor concentração
capaz de inibir completamente o crescimento microbiano, nos poços de microdiluição
conforme detectado macroscopicamente.
55
Figura 6 ‒ Microdiluição em caldo Brain Heart Infusion (BHI).
Fonte: da autora.
4.5.3 Determinação da Concentração Fungicida Mínima (CFM)
A concentração fungicida mínima foi realizada em duplicata a partir de cada poço do
teste anterior que não apresentou crescimento. Uma alçada foi subcultivada em placas de
Potato Dextrose Agar (PDA), devidamente identificadas. Após 24 h de incubação a
temperatura ambiente realizou-se a leitura, com a finalidade de observação do crescimento
das colônias, sendo considerada CFM, a menor concentração da droga que impediu
crescimento visível do subcultivo ou produziram menos de três colônias por placa
(SHADOMY, ESPINELINGROFF e CARTWRIGHT, 1985).
4.5.4 Avaliação da inibição de biofilmes
O preparo do inóculo, formação e inibição do biofilme foi baseado na técnica de Spratt
et al., 2001 e Abdullah et al., 2005 modificada.
4.5.4.1 Cepa bacteriana e preparo do inóculo
A cultura pura de E. faecalis foi subcultivada em placa contendo Agar BHI e
incubada por 24 h a 35°C em aerobiose. Após o crescimento, colônias isoladas foram
suspensas em tubos contendo 5 mL de caldo BHI. Após agitação, a suspensão foi ajustada até
atingir a concentração equivalente a 6.0 da escala McFarland.
56
4.5.4.2 Formação do biofilme
Filtros de membranas de nitrocelulose (13 mm de diâmetro) foram posicionados sobre
placas contendo ágar BHI e em seguida, 50 µL da suspensão bacteriana foram inoculados
sobre cada membrana. As placas foram incubadas durante 72 h em aerobiose a 35°C (Figura
7).
4.5.4.3 Substâncias testadas
O OELS ou timol foram dissolvidos em DMSO, em seguida, foram diluídos em água
destilada estéril para atingir concentrações de 2,5% e 10%. Foi utilizado como controle
positivo o hipoclorito de sódio, e como controle negativo o DMSO, ambos nas mesmas
concentrações das amostras analisadas.
4.5.4.4 Inibição de biofilmes
Após o tempo de incubação, os biofilmes foram imersos em 3 mL de cada solução, nas
diferentes concentrações, por 30 e 60 minutos. Após o tempo de contato, as membranas foram
cuidadosamente transferidas para 3 mL de caldo de neutralização D/E (para OELS, timol e
DMSO) ou para 3 mL de tiossulfato de sódio 1% (para o hipoclorito de sódio) a fim de
interromper a possível atividade antimicrobiana do agente testado. Em seguida, as membranas
foram agitadas em misturador vórtex por 30 segundos para ressuspender os microorganismos.
Posteriormente, procedeu-se com a diluição em escala decimal para contagem de unidades
formadoras de colônia (UFC/mL) utilizando D/E Agar (DEY e ENGLEY, 1983).
Figura 7 ‒ Visualização do crescimento após 72 h do biofilme de Enterococcus faecalis.
Fonte: da autora.
57
4.6 Modulação da atividade antimicrobiana
4.6.1 Contato direto
Para avaliação da atividade moduladora as CIMs dos antibióticos aminoglicosídeos
(gentamicina e neomicina), Penicilina G, ceftriaxona e fluconazol foram determinadas na
presença e ausência do OELS ou timol pelo método de microdiluição em caldo (CLSI, 2003).
As linhagens utilizadas foram inoculadas em caldo BHI a 10% e incubadas em estufa
bacteriológica a 35 ± 2ºC por 24 h. As cepas leveduriformes foram inoculadas em caldo
Sabouraud a 10% e mantidas em temperatura ambiente até o momento do ensaio. O teste foi
monitorado com um controle positivo contendo apenas os antibióticos e os microorganismos.
As soluções dos antibióticos foram preparadas com a adição de água destilada estéril
de forma a obter uma concentração correspondendo a 1.024 μg/mL. Um volume de 100 μL de
cada solução dos antibióticos foi diluído seriadamente nos poços contendo o meio de cultura a
10% e a suspensão com o inóculo contendo OELS ou timol na concentração subinibitória
(CIM/8) (COUTINHO, 2008). As concentrações finais dos antibióticos no meio de cultura
foram de 512 a 0,5 μg/mL. As placas foram incubadas por 24 h a 35 ± 2 ºC e a atividade foi
evidenciada pelo uso de resazurina sódica para bactérias e visualização da turvação, onde o
aumento da turbidez ou opacidade no meio indica o crescimento das leveduras.
Previamente ao teste, as cepas Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa
foram inoculadas em placas de Petri contendo agar BHI e incubadas por 24 h a 35±2 ºC. Após
esse período, as linhagens foram suspendidas em tubo de ensaio com água destilada estéril de
forma a obter uma suspensão com turvação equivalente a 0,5 da escala de McFarlland (1 x 108
UFC/mL).
Os ensaios foram realizados em triplicata utilizando concentrações de 50, 25, 12, 6 e
3% do OELS ou timol diluídos em DMSO. Um swab estéril foi imerso na suspensão
bacteriana, retirou-se o excesso do inóculo através da compressão do swab nas paredes do
tubo, em seguida, foi semeado através do método de esgotamento em placas de Petri contendo
ágar Mueller Hinton. Após esse processo, foram adicionados discos com antibióticos
aminoglicosídeos amicacina (30 μg/disco), gentamicina (10 μg/disco) e neomicina (10
μg/disco). Posteriormente, as placas foram invertidas e um volume de 50 μL de cada
58
concentração foi colocado no interior da tampa, de forma que os constituintes voláteis do óleo
essencial e timol pudessem interagir com os antibióticos (Figura 8). Placas sem o óleo
essencial ou timol e com DMSO foram utilizadas como controles positivo e negativo,
respectivamente (RODRIGUES et al, 2010). Após esse procedimento, as placas foram
incubadas por 24 h a 35 ± 2 ºC e a leitura dos halos de inibição foi realizada com auxilio de
uma régua milimetrada, sendo os diâmetros dos halos dos controles positivos comparados aos
Padrões Interpretativos dos Diâmetros dos Halos Inibição estabelecidos pela CLSI (2003).
Figura 8 ‒ Contato gasoso - Aplicação da amostra na tampa da placa.
Fonte: da autora.
4.6.3 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média dos halos de inibição (mm) ± desvio
padrão da média, avaliados estatisticamente utilizando Análise de Variância (ANOVA)
seguido do teste de Tukey, onde as diferenças foram consideradas significativas quando p <
0,05.
59
4.7 Atividade antiinflamatória tópica através de modelos de edema de orelha
induzidos por agentes irritantes
4.7.4 Aspectos éticos da pesquisa
O projeto com protocolos referentes a este estudo foi submetido e aprovado pela
Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade de Fortaleza (CEUA-UNIFOR) com
parecer nº 010/2010.
4.7.3. Animais
Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss, adultos, de
ambos os sexos, pesando entre 20-30g, provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de
Juazeiro do Norte (FMJ), mantidos em caixas de propileno, a temperatura média de 26 ± 2°C,
com ciclos claro/escuro de 12/12 h, recebendo ração (Labina, Purina®) e água “ad libitum”.
4.7.4 Drogas, reagentes e soluções
Tabela 1 ‒ Drogas e reagentes utilizados durante os procedimentos experimentais
farmacológicos.
Droga/ Reagente
Origem
Acetona P.A.
Dinâmica, Brasil
Dinâmica, Brasil
®
Cloridrato de cetamina 10% (Cetamin )
Syntec, Brasil
Cloridrato de xilazina 2% (Xilazin®)
Syntec, Brasil
Dexametasona (Decadron®)
Ache, Brasil
Fenol 99%
Sigma-Aldrich, EUA
Histamina
Sigma, EUA
®
Indometacina (Indocid )
Merck Sharp e Dohme, Brasil
Óleo de cróton
Sigma, EUA
Solução fisiológica de NaCl 0,9%
Farmace, Brasil
60
Para avaliar a atividade tópica por tratamento agudo do OELS ou timol neste modelo,
grupos de camundongos Swiss (n = 7) tiveram suas orelhas direitas tratadas topicamente, com
20 μL de acetona, indometacina 100 mg/mL (2 mg/orelha), dexametasona 4 mg/mL (0,08
mg/orelha), OELS ou timol na concentração 100 mg/mL (2 mg/orelha), esperando 15 minutos
para absorção. Em seguida, 20 μL de óleo de croton 5% (v/v) em acetona foram aplicados
topicamente na orelha direita e 20 μL do veículo acetona na orelha esquerda. Após 6 horas, os
animais foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6 mm de diâmetro foram
obtidos das orelhas através de um punch (perfurador de couro metálico) para avaliação do
edema, conforme item 5.7.6 (TUBARO, 1985).
4.7.3 Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de croton
O processo inflamatório crônico foi induzido pela aplicação de 20 μL de óleo de
croton 5% (v/v) em acetona em dias alternados, durante 9 dias, em camundongos Swiss (n =
7/grupo). O OELS ou timol (2 mg/orelha) e a dexametasona (0,08 mg/orelha, controle
positivo) foram aplicados por via tópica durante 4 dias (2 vezes ao dia) a partir do 5º dia do
experimento, sendo o edema avaliado diariamente através de medição da espessura da orelha
direita com auxílio de um paquímetro digital. No 9° dia do experimento, os animais foram
sacrificados e círculos de 6 mm de tecido das orelhas foram coletados para avaliação do
edema (STANLEY et al., 1991).
4.7.4 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA) e fenol
Para avaliar a atividade tópica do OELS ou timol nestes modelos, as orelhas direitas
dos camundongos (n = 7/ grupo) foram tratadas, topicamente, com 20 μL dos agentes
irritantes: ácido araquidônico 0,1 mg/μL e fenol 10% (v/v), ambos em acetona. Quinze
minutos antes da aplicação do agente irritante, as orelhas direitas foram tratadas topicamente
com 20 µL do OELS ou timol 100 mg/mL, acetona (controle negativo), indometacina 2
mg/orelha (controle positivo para AA) ou dexametasona 0,08 mg/orelha (controle positivo
para fenol). Após 1 h, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e discos de 6
61
mm de diâmetro foram obtidos das orelhas para avaliação do edema, conforme item 5.7.6
(YOUNG et al, 1984; CRUMMEY et al, 1987).
4.7.5 Edema de orelha induzido pela injeção intradérmica de histamina
Inicialmente, cada animal (n = 7 / grupo) foi anestesiado com cloridrato de cetamina
0,02 mL (i.p.) e cloridato de xilazina 0,01 mL (i.p.). Em seguida, os animais foram prétratados topicamente com 20 μL de salina, dexametasona 4 mg/mL (0,08 mg/orelha), OELS
ou timol (2 mg/orelha). Após 30 minutos, administrou-se um volume de 5 μL de uma solução
de histamina (100 mg/mL em salina), intradermicamente, na região ventral da orelha direita
dos camundongos com o auxílio de uma agulha hipodérmica 29 G, enquanto que a orelha
esquerda recebeu o mesmo volume de salina, também intradermicamente. Após 2 h, os
animais foram sacrificados por deslocamento cervical e para posterior avaliação do edema a
partir das massas dos discos obtidos, conforme item 5.7.6 (BRAND et al, 2002).
4.7.6 Quantificação do edema
Para quantificar o percentual de inflamação em cada animal analisado, foram obtidos
discos de 6 mm de diâmetro: um da orelha direita (tratada com agente irritante) e outro da
orelha esquerda (tratada com veículo do agente irritante). Em seguida, cada disco obtido teve
sua massa mensurada com a utilização de balança analítica. O edema de orelha, expresso em
percentual de aumento da massa da orelha, foi calculado utilizando a fórmula:
% inflamação 
mod  moe
 100
moe
onde mod é a massa (em gramas) do disco obtido da orelha direita e moe é a massa (em gramas)
do disco obtido da orelha esquerda. O cálculo do efeito inibitório médio da inflamação (EIM,
em %) de cada tratamento, procedeu-se aplicando a fórmula a seguir:
EIM (%) =
62
onde MPEtrat é a média do percentual de edema do grupo submetido a tratamento com
OELS, timol ou controle positivo e MPEcont é a média do percentual de edema do grupo
controle negativo (tratado com salina ou acetona).
4.8 Análise estatística dos dados
Os dados apresentados foram expressos em média ± erro padrão da média (EPM). Para
os ensaios que possuíram três ou mais grupos e uma única avaliação das amostras, as
diferenças obtidas entre os grupos foram submetidas à análise de variância (ANOVA) de uma
via, seguindo-se do teste de Student-Newman-Keuls. Para o ensaio que possuiu três ou mais
grupos e cuja avaliação das amostras se deu em vários intervalos de tempo (edema de orelha
induzido pela aplicação múltipla de óleo de croton), as diferenças entre os grupos foram
submetidas à ANOVA de duas vias, com medidas repetidas, seguindo-se do teste de
Bonferroni. Foram consideradas diferenças significativas valores de p < 0,05.
63
Figura 9 ‒ Metodologias utilizadas para verificação de atividades biológicas do óleo
essencial de Lippia sidoides e timol.
Material vegetal
(folhas frescas de L. sidoides)
Extração do óleo
essencial (OELS)
Timol
Atividades
biológicas
Atividade
antimicrobiana
CIM
CFM
Atividade
moduladora de ATM
Biofilme
Contato direto
Atividade
antiinflamatória
Edema de orelha induzido
por agentes irritantes
Contato gasoso
64
RESULTADOS E DISCUSSÕES
______________________________________________
65
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
O óleo essencial obtido por hidrodestilação apresentou rendimento de 1,06% (p/v). O
estudo da composição química do OELS foi realizado por cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas (CG/EM) e os componentes foram identificados através de
comparação dos seus espectros de massas e tempo de retenção (Tr) com os existentes na
literatura (ADAMS, 2001). Os índices de retenção de Kovats (IK) foram determinados
utilizando uma série homóloga de n- alcanos injetados nas mesmas condições cromatográficas
das amostras. Dessa forma, foi possível a identificação de 97,82% dos constituintes (Figura
10, p. 66), sendo o timol (84,9%), p-cimeno (5,33%) e carvacrol etil éter (3,01%) os
majoritários (Tabela 2).
Tabela 2 ‒ Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Lippia sidoides Cham.
Composto
Tr(min)
IK*
(%)
p-cimeno
4.2
1020
5.33
1,8-cineol
4.4
1031
1.68
γ-terpineno
5.0
1060
1.32
Carvacrol etil éter
9.7
1164
3.01
Timol
11,8
1288
84,9
Carvacrol
12,9
1292
0.41
ß-cariofileno
15,1
1418
1.17
Total
Tr: Tempo de retenção; IK: índice de Kovats
97.82
66
Figura 10 – Estruturas química dos constituintes identificados no óleo essencial das folhas de
Lippia sidoides Cham.
O
p-cimeno
1,8-cineol
O
γ-terpineno
Carvacrol etil éter
OH
OH
Timol
Carvacrol
H
ß-cariofileno
67
Em alguns estudos, o teor de timol presente no óleo essencial das folhas de L. sidoides
(OELS) pode variar entre 34,2 a 95,1% (GIRÃO et al., 2003; FONTENELLE et al., 2007).
Essa variação do teor de constituintes no óleo essencial pode sofrer influência das condições
de cultura e desenvolvimento (tipo de solo e clima), de colheita e o processamento póscolheita (horário e época do ano) (LAVABRE, 1992).
Os resultados encontrados na análise química do óleo essencial estão de acordo com
estudos anteriores, que mostram que a maioria dos constituintes do gênero Lippia é,
geralmente, da classe dos monoterpenos, sendo o p-cimeno e timol os mais encontrados
(PASCUAL et al., 2001; ABENA et al., 2003; MENDES et al., 2010). A maioria dos
constituintes químicos do OELS também foi encontrada em outros trabalhos com essa espécie
coletada em diferentes lugares do Brasil como em Fortaleza (CE), Mossoró (RN), Limoeiro
do Norte (CE), Poço Redondo (SE) e Teresina (PI) (GIRÃO et al., 2003; CAVALCANTI et
al., 2010; MEDEIROS et al., 2011).
5.2.1 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)- Bactérias
A utilização de óleos essenciais na pesquisa de novos compostos antibacterianos tem
obtido resultados satisfatórios em vários trabalhos (FONTENELLE et al., 2007;
RODRIGUES et al., 2010; REIS et al., 2011). Os óleos essenciais possuem em sua
composição química uma mistura complexa de vários componentes bioativos, por isso, faz-se
necessário identificar qual composto é responsável pela atividade antimicrobiana.
Os resultados mostram que não houve diferenças no potencial antimicrobiano entre o
OELS e timol determinado pelo método de microdiluição frente às bactérias em estudo
(Tabela 3, p. 68). O OELS e timol apresentaram uma CIM de 128 µg/mL para S. aureus, 256
µg/mL para S. mutans, K. pneumoniae, P. rettigeri e E. cloacae, e 512 µg/mL para E.
faecalis, P. aeruginosa e E. coli.
A bactéria Gram-positiva S. aureus foi a mais sensível comparada às demais cepas.
Por outro lado, a Gram-positiva E. faecalis e as Gram-negativas E. coli e P. aeruginosa foram
mais resistentes apresentando uma CIM maior que as demais. Estes resultados concordam
com os encontrados na literatura os quais demonstram que as bactérias Gram-negativas são
68
mais resistentes à ação de produtos naturais, como extratos e óleos essenciais, pois a
membrana externa presente nessas bactérias forma um envelope complexo, protegendo-as
contra a ação desses agentes antimicrobianos (OLADIMEJI, ORAFIDIYA e OKEKE, 2004;
HOLLEY e PATTEL, 2005). Comumente encontrada em canais radiculares, E. faecalis
apresenta baixa sensibilidade a agentes microbianos e alta habilidade em inativá-los
(PORTENIER et al., 2002), explicando maior CIM que as demais Gram-positivas.
Gochev e Girova (2009) analisaram o óleo essencial de Thymus vulgaris (contendo
43,4% de timol) e realizaram uma avaliação comparativa entre a atividade antimicrobiana do
óleo essencial das suas folhas e seu composto majoritário, timol, frente a P. rettigeri, P.
aeruginosa, S. aureus e E. coli isoladas de produtos alimentícios (carnes) pelo método de
microdiluição em caldo e difusão em disco. Os autores demonstraram que a atividade
antimicrobiana do óleo é dependente do teor de timol, pois como o óleo essencial apresentou
apenas 43,4% de timol, foi menos efetivo que o composto puro.
Tabela 3 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) do óleo essencial das folhas de L. sidoides
(OELS) ou timol, sobre cepas microbianas originárias da ATCC.
CIM (µg/mL)
Bactérias
OELS
Timol
S. aureus
128
128
S. mutans
256
256
E. faecalis
512
512
E. coli
512
512
E. cloacae
256
256
K. pneumoniae
256
256
P. aeruginosa
512
512
P.rettigeri
256
256
A atividade antimicrobiana dos compostos isolados de óleos essenciais depende de sua
estrutura química (DORMAN e DEANS, 2000; INOUYE et al., 2001; JIROVETZ et al.,
2007). Os constituintes que possuem um grupamento fenólico ou alcoólico, como o timol e
69
carvacrol, e o aumento no número de ligações duplas permitem maiores efeitos inibitórios
sobre o crescimento microbiano, seguidos dos aldeídos e cetonas (GRIFFIN et al., 1999;
DORMAN e DEANS, 2000). Alguns estudos mostram que o timol e carvacrol (isômero
constitucional do timol) demonstram atividade antimicrobiana frente a bactérias Grampositivas e Gram-negativas em igualdade, o que significa que a posição da hidroxila não tem
efeito sobre a atividade dos compostos (BOTELHO et al., 2007; GOCHEV e GIROVA,
2009).
O OELS contém em sua composição química, além do timol, outros compostos com
atividade antimicrobiana comprovada, tais como carvacrol, p-cimeno, ß-cariofileno e 1,8cineol (KALPOUTZAKIS et al., 2001; DELGADO et al., 2004; SABULAL et al., 2006;
KORDALI et al., 2008). Esses componentes podem agir sinergicamente aumentando o
potencial antimicrobiano (BURT, 2004). No entanto, nossos resultados demonstraram que o
timol é o composto responsável pela atividade antibacteriana apresentada pelo OELS.
Devido ao grande número de componentes químicos, os óleos essenciais não possuem
alvos específicos na célula. Sua estrutura lipofílica permite a permeabilização das membranas,
resultando em perda de íons, citocromo C, radicais, proteínas e redução do potencial de
membrana, com consequente colapso da bomba de prótons e depleção de ATP (SIKKEMA et
al., 1994; YOON et al., 2000; TURINA et al., 2006). A permeabilização da membrana
externa e das membranas mitocondriais leva à morte celular por apoptose e necrose
(ARMSTRONG, 2006).
5.2.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Fungicida Mínima (CFM)- Fungos leveduriformes
Espécies de Candida são responsáveis por causar infecções oportunistas em pacientes
imunocomprometidos e podem causar desde infecções superficiais até infecções sistêmicas
(SHAO et al., 2007). As classes de antifúngicos apresentam baixa eficácia, alta toxicidade e
freqüentemente levam à resistência (ANDERSON, 2005). Diante disso, a busca por produtos
naturais com atividade antifúngica frente a espécies de Candida vem sendo alvo de muitos
estudos (GIORDANI et al., 2004; DUARTE et al., 2005).
A concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a menor concentração capaz
de inibir completamente o crescimento microbiano nos poços de microdiluição, enquanto que
70
a concentração fungicida mínima (CFM) é a menor concentração em que o composto é capaz
de agir como fungicida (MURARI et al., 2008).
A Tabela 4 mostra que a atividade antifúngica exercida pelo OELS é devido ao seu
composto majoritário, timol, pois os mesmos apresentaram uma CIM de 64 µg/mL e uma
CFM de 128 µg/mL frente a C. albicans e C. tropicalis, respectivamente. Em outro estudo
comparativo entre o OELS e compostos isolados majoritários (timol e carvacrol) frente a uma
cepa de C. albicans (ATCC), utilizando o método de microdiluição em caldo, Botelho et al.
(2007) encontraram uma CIM de 2,5 e 0,625 mg/mL para o OELS e timol, respectivamente e
uma CFM de 5 mg/mL para ambos.
Tabela 4 ‒ Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM)
do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol pelo método de microdiluição em caldo,
sobre cepas originárias da ATCC.
CIM (µg/mL)
CFM (µg/mL)
Fungos
OELS
Timol
OELS
Timol
Candida albicans
64
64
128
128
Candida tropicalis
64
64
128
128
Fontenelle et al. (2007) avaliaram o efeito do óleo essencial de L. sidoides (teor de
timol 59,65%) sobre cepas de C. albicans e C. tropicalis através do método de microdiluição
em caldo. A CIM e CFM para C. albicans foi 1250 mg/mL e 2500 mg/mL, respectivamente.
Para a cepa de C. tropicalis, foi encontrado uma CIM de 2500 mg/mL e uma CFM de 5000
mg/mL. Pina-Vaz et al. (2004) encontraram uma CIM e CFM para o timol de 0,16 µL/mL e
0,32 µL/mL frente a C. albicans e C. tropicalis utilizando o método de macrodiluição em
caldo. Nos estudos anteriores, as CIM e CFM foram maiores que os valores encontrados por
nosso estudo, no entanto, deve-se existir uma padronização dos métodos de extração dos óleos
essenciais e dos ensaios antimicrobianos in vitro, para que a prospecção possa ser sistemática
e objetiva, e haver uma melhor interpretação e comparação dos resultados.
Trabalhos desenvolvidos com óleos essenciais têm indicado o potencial destes no
controle de fitopatógenos, tanto por ação fungitóxica direta, inibindo o crescimento micelial e
a germinação de esporos, quanto pela indução de fitoalexinas (STANGARLIN et al., 1999)
causando granulação citoplasmática, desorganização dos conteúdos celulares, ruptura da
71
membrana plasmática e inibição de enzimas fúngicas (LO et al., 1996; ZAMBONELLI et al.
1996).
Estudos realizados por Ahmad et al. (2010) sugerem que o timol pode interagir
diretamente com a enzima H+- ATPase frente a espécies de Candida, o que explica sua
atividade antifúngica. Esta enzima desempenha um papel crucial na fisiologia da célula
fúngica, pois permite o equilíbrio do gradiente de prótons através da membrana das células,
regula o pH intracelular e o crescimento celular (SET-YOUNG et al., 1997; PERLIN et al.,
2006). Os grupos hidroxilas no anel aromático são bastante reativos e formam pontes de
hidrogênio com sítios ativos de enzimas-alvo, inativando-as. O efeito indutivo do grupo
isopropil presente no timol deve ser considerado ao lado da aromaticidade da molécula para o
favorecimento da atividade antimicrobiana (FARAG et al., 1989; PORTE e GODOY, 2001).
5.3 Modulação da atividade antibiótica
Produtos naturais de origem vegetal e animal podem alterar o efeito de antibióticos,
seja aumentando ou reduzindo a atividade antibiótica, e podem ser denominados de
Modificadores da Atividade Antibiótica (COUTINHO et al., 2008; RODRIGUES et al.,
2009). Para avaliar a modulação da atividade de antibióticos pode-se utilizar o contato direto
entre o inoculo e o produto natural associado ao antibiótico através do método de
microdiluição em caldo (COUTINHO et al., 2009) ou através do contato entre os
constituintes voláteis do óleo essencial com discos de antibióticos padronizados (INOUYE et
al., 2001; RODRIGUES et al., 2009). A redução da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
do antibiótico na presença do produto natural indica que o mesmo é capaz de atuar
sinergicamente favorecendo o efeito antimicrobiano, e o aumento do halo de inibição indica
potencialização da atividade do antibiótico pelos constituintes voláteis do óleo essencial.
5.3.1 Contato direto- Bactérias
A Tabela 5 (p. 72) e a Tabela 6 (p. 73) mostram a interferência do óleo essencial e
timol, em concentrações subinibitórias (CIM/8) sobre a atividade de aminoglicosídeos e ßlactâmicos, respectivamente, demonstrando uma interferência na atividade antibiótica sobre
algumas cepas. O OELS e timol não foram capazes de modificar a atividade da Gentamicina e
Neomicina frente a S. mutans, E. faecalis, E. coli, E. cloacae e P. rettigeri. Por outro lado, o
OELS e timol reduziram a CIM da Gentamicina frente a K. pneumoniae e P. aeruginosa em
72
32 vezes (1µg/mL) e 4 vezes (8 µg/mL), respectivamente. Também houve redução da CIM da
Gentamicina frente a S. aureus em 4 vezes (8 µg/mL) quando associada ao OELS e em 16
vezes (2 µg/mL) quando associada ao timol (Tabela 5).
Tabela 5 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de aminoglicosídeos na
presença e ausência do óleo essencial de Lippia sidoides e timol em concentrações
subinibitórias (CIM/8) sobre cepas originárias da ATCC.
Gentamicina
Bactérias
Neomicina
C+
OELSa
Timolb
C+
OELSa
Timolb
S. aureus
32
8
2
128
32
4
S. mutans
8
8
8
32
32
32
E. faecalis
64
64
64
32
32
32
E. coli
64
64
64
128
128
128
E. cloacae
16
16
16
64
64
64
K. pneumoniae
32
1
1
16
16
16
P. aeruginosa
32
8
8
128
128
128
P. rettigeri
32
32
32
128
128
128
C+: Controle positivo (antibiótico + inóculo); OELSa: CIM do Óleo essencial de L. sidoides
combinado com o antibiótico; Timolb: CIM do timol combinado com o antibiótico.
A associação entre o OELS e timol com a Neomicina reduziu sua CIM em 4 vezes (32
µg/mL) e 32 vezes (4 µg/mL) frente a S. aureus, respectivamente. Nas demais cepas
analisadas não houve sinergismo ou antagonismo entre a associação do OELS e timol com o
aminoglicosídeo supracitado.
Na Tabela 6 (p. 73), a CIM da Penicilina G foi reduzida de 128 µg/mL para 32 e 2
µg/mL quando associada ao OELS e timol, respectivamente. Observou-se um reforço na
atividade da Ceftriaxona apenas na associação do OELS e timol frente a E. faecalis com
redução da CIM de 64 para 4 μg/mL.
Nos últimos anos, a resistência aos antimicrobianos utilizados na clínica tem
aumentado consideravelmente, representando um problema mundial. Cerca de 90 a 95% das
cepas de S. aureus são resistentes a penicilina (CASAL et al., 2005). Em virtude do aumento
73
da resistência aos antibióticos, a seleção dos mesmos na terapêutica tem se tornado uma tarefa
difícil e desafiadora (ROSSI e ANDREAZZI, 2005).
Muitas drogas utilizadas no tratamento de doenças infecciosas foram isoladas e
purificadas a partir de plantas medicinais. Dessa forma, é possível se pensar nas plantas como
fontes de novos agentes terapêuticos contra bactérias resistentes aos antimicrobianos
(BUTTLER, 2006). É conhecida a ação sinérgica de produtos naturais junto a antimicrobianos
normalmente utilizados na clínica, determinando uma diminuição na sua CIM (MATIAS et
al., 2010; SOUSA et al., 2011).
Tabela 6 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) de ß-lactâmicos na
Penicilina G
Bactérias
Ceftriaxona
C+
OELSa
Timolb
C+
OELSa
Timolb
S. aureus
≥1024
≥1024
≥1024
64
64
64
S. mutans
128
32
2
8
8
8
E. faecalis
0,5
0,5
0,5
64
4
4
E. coli
≥1024
≥1024
≥1024
16
16
16
E. cloacae
≥1024
≥1024
≥1024
8
8
8
K. pneumoniae
≥1024
≥1024
≥1024
32
32
32
P. aeruginosa
≥1024
≥1024
≥1024
16
16
16
P. rettigeri
≥1024
≥1024
≥1024
0,5
0,5
0,5
C+: Controle positivo (antibiótico + inóculo); OELSa: CIM do Óleo essencial de L. sidoides
combinado com o antibiótico; Timolb: CIM do timol combinado com o antibiótico.
Uma estratégia empregada para reverter os mecanismos de resistência das bactérias é
utilizar a combinação entre drogas, como a associação entre ß-lactâmicos e inibidores da ßlactamase. Miranda-Novales et al. (2006) demonstraram que a combinação entre amicacina e
cefalotina ou dicloxacilina foi sinérgica contra a maioria das cepas resistentes de S. aureus e
Staphylococcus coagulase-negativo.
74
Algumas classes de metabólitos secundários também foram caracterizadas como
modificadores da atividade antibiótica, tais como terpenos (NICOLSON, EVANS e
O'TOOLE, 1999), taninos, alcalóides (MATIAS et al., 2010),
flavonóides e derivados
(SATO et al., 2004). A associação entre produtos naturais também tem demonstrado efeitos
antimicrobianos sinérgicos, como os óleos essenciais das folhas de Thymus vulgaris e
Pimpinella anisum, os quais apresentaram sinergismo frente a bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas pelo método de contato direto (AL-BAYATI, 2008).
Os mecanismos pelos quais óleos essenciais podem interagir com os antibióticos
envolvem diferentes interações entre os compostos presentes no óleo e a membrana
bacteriana. O timol e carvacrol podem ser eficazes contra os microorganismos através de uma
ação lipofílica na membrana celular, ocasionando a dispersão da cadeia de polipeptídeos da
membrana celular e desestabilizando a célula contra a qual estão desempenhando a sua
atividade (COWAN, 1999; NOSTRO et al., 2004). Estudos utilizando o óleo essencial do
orégano (Origanum vulgare) permitiram a observação de timol e carvacrol acumulados na
membrana plasmática de P. aeruginosa e S. aureus, resultando em aumento de 90% na
permeabilidade celular desses microorganismos (LAMBERT et al., 2001; KNOWLES et al.,
2005).
Os resultados desse estudo demonstraram um aumento na atividade dos
aminoglicosídeos frente a algumas bactérias Gram– positivas e Gram– negativas quando
associados ao OELS ou timol. Os aminoglicosídeos atuam inibindo a síntese protéica
bloqueando a subunidade 30S do ribossomo (JANA e DEB, 2005). A atividade sinérgica
verificada é atribuída ao timol, o qual pode estar favorecendo a entrada do antibiótico através
da membrana plasmática.
Devido a absorção para o espaço intracelular, a toxicidade celular é comum para todos
os aminoglicosídeos (exceto a estreptomicina). Nefrotoxicidade, ototoxicidade e bloqueio
neuromuscular são os mais importantes efeitos tóxicos dos aminoglicosídeos (VALLEJO et
al., 2001; OLIVEIRA, 2006). A freqüência relatada destes efeitos colaterais é muito variável
devido aos diferentes critérios utilizados para diagnóstico. Bloqueios neuromusculares são
raros, a ototoxicidade varia entre 0-62% (coclear) e 0-19% (vestibular) e nefrotoxicidade varia
de 0 a 50% (GILBERT, 1995).
O efeito sinérgico entre a associação do OELS e timol com os aminoglicosídeos pode
ser uma alternativa para minimizar os efeitos colaterais dessa classe de antimicrobianos, uma
75
vez que tal combinação reduz consideravelmente a CIM do antibiótico, diminuindo então a
dose necessária para que haja sucesso terapêutico.
Os ß-lactâmicos (BLA) atuam bloqueando a síntese da parede celular bacteriana. Os
mecanismos mais importantes de resistência aos BLA é a clivagem por ß-lactamases e
mudanças nas Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBP) (LEVINSON e JAWERT, 2005).
Muitos produtos naturais são capazes de interagir sinergicamente com BLA. A
epigalocatequina galato, presente no chá verde (Santolina chamaecyparissus), age
sinergicamente no mesmo sítio alvo, na síntese da parede celular (YAM et al., 1998; ZHAO
et al., 2001). A corilagina, um polifenol extraído de Arctostaphylos uva-ursi, é capaz de inibir
a produção ou atividade da PBP2a, uma proteína com baixa afinidade para os ß-lactâmicos
presente em estirpes de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) (SHIMIZU et al., 2001).
O OELS e timol apresentaram um efeito sinérgico quando associados com a
Penicilina, reduzindo consideravelmente sua CIM frente a S. mutans, e quando associados
com a Ceftriaxona frente a E. faecalis. Tal fato pode ser justificado devido à capacidade do
timol em provocar distorções na estrutura física da célula, causando expansão e conseqüente
desestabilização da membrana, desnaturando enzimas essenciais e alterando a força motriz de
prótons através de variações no pH e no potencial elétrico, atuando sinergicamente com esses
antibióticos (HELANDER et al., 1998; BURT, 2004).
Muitos antibióticos BLA conseguem penetrar em bactérias Gram- negativas através de
canais protéicos presentes em sua membrana externa. Através desses canais, as drogas
conseguem atingir seu receptor na parede celular e exercer sua ação bactericida (NIKAIDO,
1994). Apesar de atuar como barreira para compostos anfipáticos, a membrana externa pode
sofrer alteração em sua permeabilidade provocada pelo OELS e timol (HELANDER et al.,
1998; LEWIS e LOMOVSKAYA, 2001). No entanto, as cepas Gram-negativas em estudo
não foram susceptíveis a associação entre as amostras e os antibióticos. Tal fato pode ser
justificado por outros mecanismos de resistência presentes nessas bactérias como bomba de
efluxo, produção de enzimas que clivam o anel ß-lactâmico (ß-lactamases), mudanças nas
PBP, entre outros (BUSH, 2002; ENRIGHT et al., 2002).
76
5.3.2 Atividade moduladora por contato direto – fungos
Os tratamentos de escolha para infecções oportunistas por espécies de Candida são
limitados e muitos antifúngicos existentes apresentam efeitos colaterais indesejáveis, como
nefrotoxicidade, ou podem induzir a resistência fúngica, principalmente em indivíduos
imunodeprimidos (FICA, 2004). O Fluconazol, um composto triazólico, atua inibindo a
enzima lanosterol 14-desmetilase no complexo do citocromo P-450 de fungos, inibindo a
conversão do lanosterol para ergosterol. Com a consequente diminuição do ergosterol, há
perda da integridade da membrana plasmática fúngica (GHANNOUM e KUHN, 2002).
Imidazóis e triazóis, em graus variados, também interagem com o complexo P-450 da espécie
humana, causando interferência com certos hormônios ou interações metabólicas com drogas
metabolizadas através desse sistema (FICA, 2004).
A Tabela 7 mostra que a associação entre o OELS ou timol em concentrações
subinibitórias (CIM/8) com o fluconazol frente a espécies de Candida não interferiu na
atividade antifúngica, pois a CIM do fluconazol permaneceu a mesma.
Tabela 7 ‒ Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM µg/mL) do fluconazol na
Fluconazol
Fungos
CIM
OELS
Timol
C. albicans
≥1024
≥1024
≥1024
C. tropicalis
512
512
512
Guo et al. (2009) demonstraram sinergismo entre a associação do timol com
fluconazol frente a cepas de C. albicans resistentes a este antifúngico, no entanto não foram
utilizadas concentrações subinibitórias do timol. Outro estudo feito com Anfotericina B
demonstrou que houve sinergismo quando associada ao óleo essencial de Thymus vulgaris
(teor de timol 63,22%) frente à Candida albicans (GIORDANI et al., 2004). No entanto, a
concentração do timol e do OELS testada na associação destes com o fluconazol não foi capaz
de interferir na atividade deste antifúngico.
77
Na avaliação da atividade moduladora de antibióticos pelos constituintes voláteis do
OELS e pelo timol, os diâmetros da zona de inibição obtidos para as duas cepas em estudo
foram classificados como sensíveis segundo comparação com o padrão estabelecido pela
CLSI (2003). Não houve interferência na atividade dos antibióticos testados na concentração
de 3% das amostras e com 100% de DMSO, controle negativo.
A Dose Inibitória Mínima (DIM) é definida como a menor dose capaz de inibir o
crescimento bacteriano por unidade de espaço em um sistema fechado. A DIM, expresso em
mg/L ar pode não representar necessariamente a concentração real do vapor, a qual pode
sofrer mudanças durante o tempo de incubação, como decomposição espontânea de alguns
constituintes voláteis (INOUYE et al., 2001; KASHIWAGI et al., 2010). A Tabela 8 mostra a
atividade antibacteriana do OELS e timol por contato gasoso. Os resultados mostram a DIM,
onde P. aeruginosa é menos susceptível à ação do OELS e timol (DIM > 1 mg / L ar para
ambos) que S. aureus (DIM 0,0625 mg / L ar para ambos).
Tabela 8 ‒ Atividade antibacteriana do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol por
contato gasoso.
OELS
DIM (mg/L ar)
0.25
0.125
Bactéria
1
0.5
S. aureus
ATCC 12624
-
-
-
P. aeruginosa
ATCC 15442
+
+
S. aureus
ATCC 12624
-
P. aeruginosa
ATCC 15442
+
0.0625
0.03125
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
Timol
Nota: +: Não houve inibição do crescimento -: Inibição do crescimento; DIM: Dose Inibitória
Mínima.
Alguns estudos demonstraram atividade antibacteriana do OELS e timol por contato
direto (método de microdiluição) frente a S. aureus e P. aeruginosa, no entanto, não existem
registros de atividade exercida pelo método de contato gasoso (NOSTRO et al., 2004;
OLIVEIRA et al., 2006; GOCHEV e GIROVA, 2009). Nossos resultados estão de acordo
78
com estudos anteriores que indicam que bactérias Gram-negativas são mais resistentes à ação
de óleos essenciais quando comparadas com bactérias Gram-positivas (COWAN, 1999;
PAULI, 2001; MURARI et al., 2008).
A Tabela 9 (p. 80) mostra que a atividade antibiótica dos aminoglicosídeos frente a
S.aureus foi aumentada na presença do OELS e timol. Os resultados demonstraram que houve
aumento de 429,41; 349; 256,82 e 21.53% na atividade antibiótica da Gentamicina nas
concentrações 50, 25, 12 e 6% do OELS, respectivamente. Também foi observado aumento
de 246,15; 198,7; 30,77 e 5,11% na atividade antibiótica da Amicacina e aumento de 322,22;
305,55; 214,77 e 42,55% na atividade da Neomicina nas concentrações testadas do OELS.
Por outro lado, o timol foi menos efetivo frente a S. aureus quando comparado ao
OELS. A Tabela 9 (p. 80) mostra aumento de 155,11; 152,54 e 79,46% na atividade
antibiótica da Amicacina nas concentrações 50, 25 e 12%; uma potencialização da Neomicina
em 216,66; 211,11; 175,89 e 33,33% e um aumento de 223,53; 192,12; 168,59 e 35,29% da
atividade da Gentamicina nas concentrações testadas. Houve diferença estatística (p<0,05)
entre a interferência do OELS e timol sobre os aminoglicosídeos testados frente a S. aureus.
Estes resultados demonstram que os outros compostos presentes no óleo essencial
desempenham papel importante para a atividade antimicrobiana frente a essa cepa.
A Tabela 10 (p. 81) mostra que para a maioria dos resultados frente a P. aeruginosa,
não houve diferença estatística (p<0,05) entre a atividade sinérgica do OELS e timol com os
aminoglicosídeos. Para o OELS, foi observado um aumento de 43,30; 36,65 e 25% na
atividade antibiótica da amicacina; um aumento de 31,06; 28,86 e 20% na atividade da
gentamicina; e 31,06 e 26,66% na atividade da neomicina. A potencialização da atividade da
amicacina pelo timol foi de 33,3; 31,5 e 30%; da gentamicina foi de 33,33; 28,86 e 24,4%; e
da neomicina foi de 31,06 e 20%. O timol foi o composto responsável pela atividade
antimicrobiana do OELS frente a P. aeruginosa, pois não foi observada diferença estatística
quando comparada ao OELS.
Os mecanismos pelos quais os óleos essenciais podem interagir com os antibióticos
envolvem diferentes interações entre os compostos presentes no óleo e a membrana bacteriana
(BURT, 2004). No método de contato gasoso, a atividade antimicrobiana resulta em uma
combinação entre a absorção direta dos constituintes voláteis pelos microorganismos e a
absorção indireta do vapor através do meio de cultura (MOLEYAR e NARASINHAM, 1986;
INOUYE et al., 2001).
79
Alguns estudos também relataram a atividade modificadora de antibióticos através do
contato gasoso. Os óleos essenciais de Zanthoxylum articulatum, Vanillosmopsis arborea,
Croton zehntneri e Lantana camara foram capazes de interagir com antibióticos promovendo
o aumento da atividade dos mesmos frente S. aureus e P. aeruginosa (RODRIGUES et al.,
2009; 2010; SANTOS et al., 2010; SOUZA et al., 2011). Entretanto, nossos resultados são
mais expressivos quando comparados aos encontrados nos trabalhos na menor concentração
do óleo essencial. Além disso, em nosso estudo, o principal componente do óleo essencial foi
testado com a finalidade de elucidar os compostos responsáveis pelas atividades observadas.
Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa são as bactérias mais comumente
isoladas em escarro (VALENZA et al., 2008). S. aureus pode atuar não apenas como um
colonizador simples da mucosa nasal, mas é capaz de criar um reservatório no interior da
mucosa, levando à infecções de repetição (CORRIVEAU et al., 2009). Por outro lado, além
de estar associada à muitas infecções do trato respiratório, como a fibrose cística, P.
aeruginosa tem sido um dos mais prevalentes agentes de infecções hospitalares em todo o
mundo (FERRAREZE et al., 2007; MILAGRES et al., 2008).
Nossos resultados sugerem que os componentes voláteis do óleo essencial de L.
sidoides e seu principal componente o timol pode suprimir o crescimento de patógenos
causadores de infecções respiratórias. No entanto, estudos pré-clínicos e clínicos são
necessários para verificar a biodisponibilidade e a possível toxicidade dessa associação com
aminoglicosídeos a fim de elucidar os mecanismos de ação envolvidos nessa interação.
80
Tabela 9 – Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos constituintes voláteis do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol,
utilizando o método de contato gasoso sobre Staphylococcus aureus ATCC 12624.
Amostras
OELS
Timol
TR
C+
DMSO
50%
25%
12%
6%
AMI
26,00±0,00a
26,00±0,00a
≥90,00±0,00b
77,66±1,15c
34,00±0,00d
27,33±1,15a
Aumento
-
-
≥246,15%
198,70%
30,77%
5,11%
GEN
17,00±0,00a
17,00±0,00a
≥90,00±0,00b
76,33±1,15c
60,66±1,15d
20,66±0,57e
Aumento
-
-
≥429,41%
349,00%
256,82%
21,53%
NEO
18,00±0,00a
18,00±0,00a
76,00±0,0b
73,00±0,00c
56,66±0,57d
25,66±0,57e
Aumento
-
-
322,22%
305,55%
214,77%
42,55%
AMI
26,00±0,00a
26,00±0,00a
66,33±1,15b
65,66±0,57b
46,66±1,15c
27,00±0,00a
Aumento
-
-
155,11%
152,54%
79,46%
3,84%
GEN
17,00±0,00a
17,00±0,00a
55,00±0,00b
49,66±0,57c
45,66±1,15d
23,00±0,00e
Aumento
-
-
223,53%
192,12%
168,59%
35,29%
NEO
18,00±0,00a
18,00±0,00a
57,00±0,00b
56,00±0,00b
49,66±1,15c
24,00±0,00d
Aumento
-
-
216,66%
211,11%
175,89%
33,33%
Médias seguidas de mesma letra, na linha, não diferem significativamente entre si (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Médias seguidas de letras diferentes, na
linha, diferem significativamente quando comparados entre si e seus respectivos controles (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Os resultados são expressos como
média do diâmetro do halo de inibição ± desvio padrão (mm). Dimetilsulfóxido (DMSO), Amicacina (AMI), Gentamicina (GEN), Neomicina (NEO); TR:
Tratamento; C+: Controle positivo, apenas o antibiótico.
81
Tabela 10 ‒ Modificação da atividade antibiótica de aminoglicosídeos pelos constituintes voláteis do óleo essencial de L. sidoides (OELS) e timol,
utilizando o método de contato gasoso sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442.
Amostras
OELS
Timol
TR
AMI
C+
20,00±0,00a
DMSO
20,00±0,00a
50%
28,66±1,15b
25%
27,33±1,15b
12%
25,00±0,00c
6%
20,00±0,00a
Aumento
-
-
43,30%
36,65%
25,00%
-
GEN
15,00±0,00a
15,00±0,00a
19,66±1,56b
19,33±1,15b
18,00±0,00b
15,00±0,00a
Aumento
-
-
31,06%
28,86%
20,00%
-
NEO
15,00±0,00a
15,00±0,00a
19,66±1,56b
19,00±1,0b
15,00±1,00a
15,00±0,00a
Aumento
-
-
31,06%
26,66%
-
-
AMI
20,00±0,00a
20,00±0,00a
26,66±1,15b
26,33±0,57b
26,33±0,57b
26,00±0,00b
Aumento
-
-
33,30%
31,50%
31,50%
30,00%
GEN
15,00±0,00a
15,00±0,00a
20,00±1,73b
19,33±1,15b
18,66±1,15b
18,66±1,15b
Aumento
-
-
33,33%
28,86%
24,40%
24,40%
NEO
15,00±0,00a
15,00±0,00a
19,66±0,57b
18,00±0,00b
15,66±1,15c
15,00±0,00c
Aumento
-
-
31,06%
20,00%
4,40%
-
Médias seguidas de mesma letra, na linha, não diferem significativamente entre si (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Médias seguidas de letras diferentes, na
linha, diferem significativamente quando comparados entre si e seus respectivos controles (n = 3, p <0,05 - Teste de Tukey). Os resultados são expressos como
média do diâmetro do halo de inibição ± desvio padrão (mm). Dimetilsulfóxido (DMSO), Amicacina (AMI), Gentamicina (GEN), Neomicina (NEO); TR:
Tratamento; C+: Controle positivo, apenas o antibiótico.
82
5.4 Avaliação da inibição de biofilmes
A média de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por disco de biofilmes de E.
faecalis após o tempo de contato (30 ou 60 minutos) com soluções a 2,5% e 10% de OELS,
timol, DMSO e hipoclorito de sódio (NaOCl) estão apresentadas nas Figuras 8 (p. 83) e 9 (p.
84). O NaOCl foi o agente antimicrobiano mais efetivo, desestruturando o biofilme e
eliminando 99,99% das UFC nas concentrações e nos tempos de contato utilizados nesse
estudo. Este resultado está de acordo com os encontrados na literatura (SPRATT et al., 2001;
SENA, 2004; ABDULLAH et al., 2005).
Na Figura 8, o DMSO a 2,5%, controle negativo, permitiu o crescimento em todos os
tempos testados, resultando em 6,5 × 108 e 1,5 × 108 UFC em 30 e 60 minutos de exposição.
Após o contato do OELS por 30 e 60 minutos, a contagem de UFC em relação ao controle
negativo foi significativamente reduzida (p < 0,001) para 6,4 × 106 e 2,2 × 106 UFC. O timol
também foi capaz de reduzir significativamente (p < 0,001) as UFC para 8,3 × 106 e 5,2 × 106.
Não houve diferenças estatísticas (p > 0,05) entre a ação do OELS e timol nos tempos de
contato designados.
83
Figura 11 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de Enterococcus faecalis frente a desafios
antimicrobianos a 2,5% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato. OELS, óleo essencial de
Lippia sidoides; DMSO, dimetilsulfóxido (controle negativo), NaOCl, hipoclorito de sódio
(controle positivo). As barras verticais representam o desvio padrão (n=3). *** p <0,001
comparado ao controle negativo, DMSO (ANOVA de duas vias seguido do Teste de
Bonferroni).
10 8
*** ***
***
***
UFC/disco
10 6
30 min
60 min
10 4
10 2
10 0
OELS
Timol
DMSO
NaOCl
Desafios antimicrobianos a 2,5%
Após 30 e 60 minutos de exposição, o DMSO a 10% permitiu o crescimento dos
biofilmes, resultando em 6,4 × 108 e 9,0 × 108 UFC, respectivamente (Figura 9, p. 84). A
contagem de UFC dos biofilmes expostos ao OELS e timol a 10% em relação ao controle
negativo foi significativamente reduzida (p < 0,001) para 3,3 × 106 e 2,6 × 106, e para 3,5 ×
108 e 6,7 × 107 UFC, respectivamente. Houve diferença estatística (p < 0,001) na média de
UFC entre o OELS e timol no tempo de 30 minutos. Por outro lado, o contato do OELS e
timol com os biofilmes durante 60 minutos não diferiram quando comparados entre si (p >
0,05).
84
Figura 12 ‒ Susceptibilidade de biofilmes de Enterococcus faecalis frente a desafios
antimicrobianos a 10% (v/v) por 30 ou 60 minutos de contato. OELS, óleo essencial de
Lippia sidoides; DMSO, dimetilsulfóxido (controle negativo), NaOCl, hipoclorito de sódio
(controle positivo). As barras verticais representam o desvio padrão (n=3). *** p <0,001
comparado ao controle negativo, DMSO (ANOVA de duas vias seguido do Teste de
Bonferroni).
***
***
10 8
***
***
UFC/disco
10 6
30 min
60 min
10 4
10 2
10 0
OELS
Timol
DMSO
NaOCl
Desafios antimicrobianos a 10%
A maioria dos microrganismos não existe como uma cultura de células que vivem
livremente, e sim associados a uma superfície viva ou inerte formando uma comunidade
estruturada de células envoltas por uma matriz polissacarídica (COSTERTON et al., 1999).
Existem várias metodologias utilizadas em laboratório para avaliar a efetividade de agentes
antimicrobianos frente a biofilmes, porém os resultados mostram-se conflitantes em trabalhos
que utilizaram as mesmas substâncias, os mesmos microrganismos e metodologias diferentes
(SPRATT et al., 2001; SEABRA et al., 2005; ARIAS-MOLIZ et al., 2009). Os protocolos
utilizados nesse estudo foram adaptados de Spratt et al. (2001) e Abdullah et al. (2005). Essa
metodologia é acessível e rápida, além de permitir a comparação entre vários desafios
antimicrobianos frente a microorganismos presentes no biofilme.
85
Enterococcus faecalis está associado a infecções do trato urinário, endocardite,
infecções intra-abdominais e pélvicas, feridas cirúrgicas, infecções no sistema nervoso
central, formação de biofilme em cateteres, válvulas, lentes de contato e é a bactéria mais
comumente isolada em canais radiculares devido à formação de biofilme (MOHAMED e
HUANG, 2007).
A virulência de E. faecalis em canais radiculares pode estar relacionada à sua
capacidade de resistir a medicações intracanal, e a sua habilidade de sobreviver no canal
radicular como único microorganismo sem o suporte de outras bactérias, formando biofilmes
(PARADELLA e KOGA-ITO, 2007). A irrigação dos canais radiculares é um importante
passo na desinfecção e é parte integrante dos procedimentos do tratamento endodôntico. O
irrigante atualmente mais utilizado é o hipoclorito de sódio (NaOCl) devido sua forte
atividade antimicrobiana, porém a principal desvantagem do seu uso no tratamento dentário
advém da sua toxicidade sobre os tecidos biológicos (BOWDEN et al., 2006).
As bactérias estruturadas em biofilme se comportam de maneira diferente quando
expostas às substâncias químicas, pois as substâncias poliméricas que compõem a matriz do
biofilme retardam a difusão das substâncias químicas e antibióticos (STOODLEY et al.,
2002, XAVIER et al., 2003). A susceptibilidade do biofilme está diretamente relacionada ao
tempo de exposição e a quantidade da substância, além da fase de desenvolvimento do
biofilme (SPRATT et al., 2001). A velocidade de penetração da substância varia de acordo
com o microrganismo formado e composição da matriz de exopolissacarídeo (COSTERTON
et al., 1999).
Diante disso, nossos resultados demonstraram que o OELS e timol são capazes de
reduzir in vitro as UFC em biofilmes de E. faecalis (tempo de maturação de 72 horas) no
tempo de contato de 30 e 60 minutos em concentrações de 2,5 e 10%. Na concentração de
2,5% não houve diferenças estatísticas (p > 0,05) entre o tempo de contato e as amostras
analisadas, sendo o timol responsável pela atividade antimicrobiana do OELS frente ao
biofilme. Por outro lado, uma maior concentração do timol (10%) não é tão eficaz como em
uma concentração menor (2,5%), o que não é o mesmo para o OELS, que apresenta a mesma
atividade em ambas às concentrações e nos mesmos intervalos de tempo. O mecanismo pelo
qual o OELS e timol são capazes de inibir microorganismos presentes em biofilmes ainda não
está bem esclarecido.
Uma preparação à base de óleos essenciais de Eucalyptus globulus, Melaleuca
alternifolia, Thymus sp. e Syzygium aromaticum, contendo principalmente monoterpenos em
86
sua composição, demonstrou, in vitro, redução da aderência e formação do biofilme de
Staphylococcus epidermidis (AL-SHUNEIGAT et al., 2005). A associação entre o timol e
gluconato de clorexidina demonstrou atividade sinérgica frente a biofilmes de S. epidermidis
(KARPANEN et al., 2008). Braga et al. (2008) verificaram que o timol também foi capaz de
interferir com a aderência de C. albicans nas células da mucosa, e os autores sugerem que
este composto pode interferir significativamente não só com as fases iniciais da formação do
biofilme, mas também com a maturação, uma vez que inibe eficazmente a atividade
metabólica do biofilme.
Segundo Nostro et al. (2007), o timol possui tanto propriedade hidrofílica como
hidrofóbica, o que pode favorecer a difusão deste composto através da camada de
polissacarídeo do biofilme e permitir seu acesso às células bacterianas, onde irá exercer sua
atividade antimicrobiana alterando a permeabilidade da membrana. Esta hipótese é apoiada
pelos resultados encontrados em diversos estudos clínicos com enxaguatórios bucais ou
cremes dentais contendo OELS em sua composição, os quais têm demonstrado a diminuição
da placa bacteriana e conseqüente formação de biofilme dental (NUNES et al., 2006;
BOTELHO et al., 2007; BOTELHO et al., 2009; LOBO et al., 2011).
Diante disso, nosso estudo propicia uma base para a possível utilização do OELS
como adjuvante no tratamento de canais radiculares que apresentam colonização por E.
faecalis. No entanto, são necessários estudos pré-clínicos para avaliar a real eficácia e a
concentração do OELS capaz de inibir e desestruturar esse biofilme in vivo.
5.5 Atividade do óleo essencial de Lippia sidoides (OELS) e timol nos modelos de inflamação
cutânea
A Figura 13 (p. 87) mostra o que o OELS ou timol (2 mg/orelha) não mostraram efeito
antiedematogênico após 6 horas da aplicação tópica do óleo de cróton, quando comparados
com o grupo tratado com acetona (controle negativo). Neste modelo, apenas o grupo tratado
com o controle positivo, dexametasona (0,08 mg/orelha), demonstrou redução significativa
quando comparado com o controle negativo, com efeito inibitório médio da inflamação de
76,5% (p < 0,001).
87
Figura 13 ‒ Efeito do OELS ou timol, administrados por via tópica, no edema de orelha
induzido pela aplicação única de óleo de cróton em camundongos. Os animais foram
previamente tratados com acetona (controle), dexametasona 0,08 mg/orelha (DEX), OELS ou
timol (2 mg/orelha) e após 15 minutos receberam topicamente óleo de cróton 5% (v/v) em
acetona. Os gráficos representam a média do edema de orelha (%) e as barras verticais o
E.P.M de 7 animais registrados após 6h da aplicação tópica do óleo de cróton. *** p<0,001
vs controle (ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).
Percentual edema (%)
200
ns
ns
150
100
***
50
0
Controle
DEX
OELS
Timol
Óleo de cróton
Conforme demonstrado na Figura 14 (p. 88), a aplicação tópica do OELS ou timol (2
mg/orelha, 2 vezes ao dia, durante 4 dias) na orelha dos camundongos promoveu um aumento
significativo da espessura da orelha após cinco dias (96 horas) do desafio com esse agente
irritante (p < 0,001), causando necrose das orelhas tratadas (Figura 15, p. 88), quando
comparados ao grupo controle. Não houve diferenças significativas entre o efeito do OELS e
timol. Por outro lado, a dexametasona (0,08 mg/orelha, 2 vezes ao dia, durante 4 dias) foi
capaz de reduzir significativamente o edema após 1, 2, 3 e 4 dias (p < 0,001) do início do
tratamento, sendo confirmado pela avaliação do percentual de edema no último dia do
experimento (Figura 16, p. 89) e efeito inibitório médio de 45,7% (p<0,01).
88
Figura 14 ‒ Curva tempo-resposta do efeito do tratamento com OELS ou timol (2
mg/orelha) no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de
cróton (OC) em camundongos. A orelha direita dos animais recebeu topicamente o agente
irritante em dias alternados e acetona (veículo) na orelha esquerda. A espessura da orelha
(µm) foi mensurada com auxílio de paquímetro digital antes da aplicação do OC, quarto horas
após a primeira aplicação (fase aguda) e 2,3,4,5,6,7,8 e 9 dias após a primeira aplicação de
OC. No quinto dia do experimento, os animais receberam topicamente o tratamento com
acetona (veículo), dexametasona (DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha), duas vezes por dia e o
tratamento continuou por mais 4 dias (setas na figura indicam os dias de tratamento). O efeito
antiedematogênico dos compostos foi verificado através da variação da espessura da orelha
Os pontos representam a média de 7 animais e as barras verticais o E.P.M. *** p <0.001 vs
veículo (ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni).
Tratamento tópico
 Espessura da orelha (m)
1800
1500
Acetona
DEX 0,08 mg/orelha
OELS 2 mg/orelha
Timol 2 mg/orelha
***
1200
*** ***
600
*** *** ***
*** ***
300
*** *** ***
***
900
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tempo (dias)
Figura 15 ‒ Aspecto da orelha direita de camundongos após 4 dias de tratamento com OELS
(2 mg/orelha, 2 vezes ao dia) no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação múltipla
de óleo de cróton 5% (v/v) em acetona.
Fonte: da autora.
89
Percentual de edema (%)
crônico induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton em camundongos. A aplicação
de óleo de cróton foi realizada em dias alternados, durante 9 dias. A partir do 5º dia do
experimento, a orelha direita dos animais recebeu acetona (controle), dexametasona 0,08
mg/orelha (DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha) 2 vezes ao dia. Os gráficos representam a
média do edema de orelha (%) e as barras verticais o E.P.M de 7 animais registrados após 9
dias da primeira aplicação tópica do óleo de cróton. ** p< 0,01; *** p<0,001 vs controle
(ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).
200
***
**
OELS
Timol
150
100
**
50
0
Controle
DEX
Óleo de cróton (crônico)
5.5.3 Edema de orelha induzido por Ácido Araquidônico (AA)
O ácido araquidônico promoveu a formação do edema após 1 hora da sua aplicação
tópica, da mesma forma que descrito na literatura (YOUNG et al., 1984; CRUMMEY et al.,
1987). Nesse modelo, o OELS e timol (2 mg/orelha) foram capazes de reduzir
significativamente o percentual de edema de orelha após 1 hora da aplicação do AA, quando
comparados com o grupo controle (Figura 14, p. 91). O efeito inibitório médio foi de 58,4%,
45,1% e 47,4% (p< 0,001) para a indometacina (2 mg/orelha), OELS e timol, respectivamente
(Tabela 11, p. 90). Não houve diferenças significativas entre o grupo tratado com
indometacina, OELS e timol.
90
Tabela 11 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por ácido araquidônico em
camundongos e o efeito inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol ou
indometacina (2 mg/orelha).
Tratamento
Percentagem de edema
EIM
89,97±10,10
-
Indometacina
37,42±4,70***
58,4%
OELS
49,42±3,16***
45,1%
Timol
47,30±8,64***
47,4%
Controle negativo
Dados expressos como média ± E.P.M. *** p< 0,001 quando comparados com o
grupo controle negativo (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keuls).
5.5.4 Edema de orelha induzido por histamina
O tratamento com OELS ou timol administrado por via tópica (2 mg/orelha) após 2
horas da aplicação intradérmica de solução de histamina não foi capaz de reduzir
significativamente o edema de orelha comparado ao grupo controle tratado com salina. A
dexametasona (0,08 mg/orelha) inibiu o edema (p<0,001), com efeito inibitório médio de
46,5% (Figura 18, p. 91). Não houve diferenças estatísticas entre o tratamento com o OELS e
timol.
5.5.5 Edema de orelha induzido por fenol
O OELS ou timol, aplicados por via tópica (2 mg/orelha), demonstraram redução
significativa no percentual de edema de orelha após 1 hora da aplicação tópica de fenol 10%
(v/v) em acetona, quando comparados com o grupo controle negativo (Figura 19, p. 92). A
Tabela 12 (p. 92) mostra o efeito inibitório médio de 33,2% (p<0,05) para OELS, de 54,7%
(p<0,01) para timol e de 52,6% (p<0,01) para a dexametasona (0,08 mg/orelha). Não houve
diferenças significativas entre o tratamento tópico com dexametasona, timol ou OELS.
91
induzido pela aplicação de ácido araquidônico em camundongos. Os animais foram
previamente tratados com acetona (controle), indometacina (IND), OELS ou timol (2
mg/orelha) e após 15 minutos receberam topicamente ácido araquidônico 0,1 µg/mL em
acetona. Os gráficos representam a média do edema de orelha (%) e as barras verticais o
E.P.M de 7 animais registrados após 1h da aplicação tópica do ácido araquidônico. ***
p<0,001 vs controle (ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).
150
100
50
***
***
***
OELS
Timol
0
Controle
IND
AA
induzido ptela aplicação intradérmica de histamina em camundongos. Os animais foram
previamente anestesiados, pré-tratados com salina (controle), dexametasona 0,08 mg/orelha
(DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha) e após 15 minutos receberam intradermicamente 5 µL
de solução de histamina 100 mg/mL em salina. Os gráficos representam a média do edema
de orelha (%) e as barras verticais o E.P.M de 7 animais registrados após 2h da aplicação da
histamina. *** p<0,001 vs controle (ANOVA e Teste de Student- Newman- Keuls).
100
ns
ns
OELS
Timol
80
60
***
40
20
0
Controle
DEX
Histamina
92
Tabela 12 ‒ Porcentagem do edema de orelha induzido por fenol em camundongos e o efeito
inibitório médio após aplicação tópica do OELS, timol (2 mg/orelha) ou dexametasona (0,08
mg/orelha).
Fenol
Tratamento
Porcentagem de edema
EIM
Controle negativo
99,68±14,70
-
Dexametasona
47,27±6,83**
52,6%
OELS
66,62±6,31*
33,2%
Timol
45,13±9,60**
54,7%
Dados expressos como média ± E.P.M. * p<0,05; ** p< 0,01 quando comparados
com o grupo controle negativo (ANOVA e Teste de Student-Newman-Keuls).
induzido pela aplicação de fenol em camundongos. Os animais foram previamente tratados
com acetona (controle), dexametasona 0,08 mg/orelha (DEX), OELS ou timol (2 mg/orelha) e
após 15 minutos receberam topicamente 20 µL de fenol 10% (v/v) em acetona. Os gráficos
representam a média do edema de orelha (%) e as barras verticais o E.P.M de 7 animais
registrados após 1h da aplicação tópica do fenol. * p<0,05; **p<0,01 vs controle (ANOVA e
Teste de Student- Newman- Keuls).
150
100
*
**
**
50
0
Controle
DEX
OELS
Fenol
Timol
93
Vários modelos experimentais de inflamação podem ser utilizados para avaliar a
atividade antiinflamatória de drogas. No presente estudo, foi analisado o possível efeito
antiinflamatório do OELS e do seu constituinte majoritário, o timol, em modelos
experimentais de inflamação aguda e crônica induzidos por agentes irritantes (óleo de cróton,
ácido araquidônico, fenol e histamina) em camundongos Swiss. Estes modelos permitem
identificar compostos com atividade antiinflamatória que possam ser potencialmente úteis no
tratamento de doenças inflamatórias que acometem a pele, pois promovem condições que se
assemelham com alguns tipos de dermatites observadas em humanos (BOUCLIER et al.,
1990).
A dexametasona, um corticosteróide usado clinicamente no tratamento das desordens
da pele, é conhecido por sua potente atividade antiinflamatória e imunossupressora, no
entanto seu efeito tópico pode causar intensa atrofia da pele, um dos principais efeitos
colaterais do seu uso em doenças crônicas (ASHWELL et al., 2000).
O agente irritante óleo de cróton, extraído das sementes de Croton tiglium, tem como
constituinte majoritário o 13-acetato de 12-o-tetracanoilforbol (TPA) (LAPA, 2003). A
aplicação tópica de TPA induz uma resposta inflamatória cutânea caracterizada por
vasodilatação e formação de eritema nas primeiras duas horas, seguido do aumento da
espessura da orelha como resultado do extravasamento celular que atinge um pico máximo na
sexta hora e tende a diminuir, atingindo os valores basais após 24 horas. A aderência dos
leucócitos polimorfonucleares na parede dos vasos e a degranulação de mastócitos é
verificada entre a 4ª e 6ª hora. No entanto, a infiltração máxima de leucócitos no tecido é
atingida somente 24 horas após a aplicação tópica do TPA (YOUNG et al., 1983).
O mecanismo pelo qual o TPA exerce seu efeito é devido à ativação da Proteína
quinase C (PKC), bem com da ativação seqüencial da via MAP quinase (MAPK), fosfolipase
A2 (PLA2), indução da expressão da COX-2 e translocação/ativação da LOX, que por sua vez
culmina na síntese e liberação de diversos mediadores pró-inflamatórios responsáveis pela
formação do edema, migração de leucócitos para a derme e hiperproliferação celular, sendo
estas as características da resposta inflamatória induzida pela aplicação tópica do TPA
(MURAKAWA et al., 2006; DE BERNARDIS et al., 1994).
A ativação da MAPK pela PKC promove a ativação de alguns fatores de transcrição
nuclear, como NF-kB e a AP-1, os quais tem um papel central na regulação de diversas
proteínas pró-inflamatórias, tais como algumas citocinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α),
enzimas pró-inflamatórias (COX-2, iNOS) e moléculas de adesão (PASCUAL e GLASS,
94
2006; GLASS e OGAWA, 2006; GARCIA-PIÑERES et al., 2001). Por outro lado, a
fosforilação da PLA2 pela PKC resulta na liberação de Ácido araquidônico (AA) seguida da
produção de prostaglandinas (PG) e leucotrienos (LT) via COX e LOX, respectivamente
(WANG et al., 2000).
A aplicação única de óleo de cróton fornece dados quanto à atividade
antiedematogênica de uma substância num processo inflamatório agudo, enquanto que a
aplicação múltipla, em dias alternados, avalia a atividade antiedematogênica num processo
inflamatório já estabelecido, com características semelhantes a uma inflamação crônica
(SARAIVA, 2009). Os resultados mostram que o OELS e timol não promoveram supressão
do edema induzido pela aplicação única e múltipla de óleo de cróton na dose testada (Figuras
10, 11 e 13). Durante o experimento crônico, foi observado que tanto o OELS como o timol
foram capazes de promover o aumento da espessura das orelhas após 24 horas do início do
tratamento, aumentando o percentual de edema consideravelmente no último dia do
experimento (Figura 11).
A aplicação tópica do AA gera uma resposta inflamatória rápida caracterizada por
intenso eritema e edema com pequeno acúmulo de neutrófilos, quando comparado com a
migração celular verificada no modelo de óleo de cróton, cujos principais mediadores
envolvidos são PGE2, LTC4 e LTD4 (YOUNG et al., 1983; HUMES et al., 1986; CRUMMEY
et al., 1987). Os antiinflamatórios não- esteroidais (AINEs) inibem a via da COX, impedindo,
portanto a síntese das PGs (RANG et al., 2007). Assim, o fármaco de referência utilizado
neste modelo experimental foi a indometacina, um AINE cuja ação antiinflamatória está
relacionada com a inibição não-seletiva das isoformas da COX (COX-1 e COX-2) e que
reverte efetivamente o edema induzido pela aplicação tópica do AA, conforme descrito na
literatura (GABOR, 2000). Da mesma forma que a indometacina, o OELS e timol também se
mostraram efetivos na inibição da formação do edema neste modelo.
Na inflamação causada pelo modelo de óleo de cróton, corticosteróides e inibidores
da LOX demonstram atividade nesse modelo, enquanto que os inibidores da COX e antihistamínicos demonstram pouco ou nenhum efeito (GREEN e SHUSTER, 1987). Diante
disso, nossos resultados sugerem que possivelmente o OELS e timol não são capazes de inibir
a LOX nem a PLA2, mas apresentam importante ação sobre as COX.
O modelo de edema de orelha induzido por TPA e AA são extremamente úteis na
detecção in vivo de inibidores da COX/LOX (CARLSON et al., 1985). No entanto, os
metabólitos do AA também promovem a degranulação de mastócitos, de forma que a
95
liberação de histamina contribui parcialmente na formação do edema neste modelo (CAMP,
1982). Assim, deve-se considerar que o modelo do AA não é específico para identificação de
compostos que inibem exclusivamente a COX e/ou LOX, pois outros agentes antagonistas da
histamina e antioxidantes também reduzem o edema induzido por AA (CRUMMEY, 1987).
Em geral, os corticóides não promovem nenhum efeito pelo AA, ao passo que alguns
monoterpenos inibem o metabolismo do AA (JUERGENS et al., 2003).
O timol é capaz de inibir significativamente a agregação plaquetária induzida por
ácido araquidônico (ENOMOTO et al., 2001). Em estudos feitos por Marsik e colaboradores
(2005) demonstraram que o timol presente nas sementes de Nigella sativa, pode apresentar
atividade antiinflamatória devido à inibição da COX-1, e sugeriram mais estudos relacionados
a este composto para o possível uso como antiinflamatório não-esteroidal. O óleo essencial de
Lippia gracilis, contendo timol como composto majoritário (32,68%), foi capaz de reduzir a
inflamação no edema de pata induzido por carragenina e demonstrou efeito antinociceptivo no
modelo de contorções abdominais induzido por ácido acético (MENDES et al.,2010).
A inflamação induzida por carragenina envolve migração celular e produção de
mediadores como óxido nítrico, PGE2, IL-1, IL-6 e TNF-α. (LORAM et al., 2007). No
modelo de dor visceral, há liberação de ácido araquidônico e através das ciclooxigenases, há
biossíntese de prostaglandinas que possuem um papel importante no mecanismo nociceptivo,
como a PGE2. Então nesse estudo, o timol foi o composto responsável pelas atividades
farmacológicas observadas sendo possivelmente ativo na inibição das ciclooxigenases
(MENDES et al., 2010).
Também foi avaliado o efeito do OELS ou timol sobre outros modelos de inflamação
cutânea como o modelo de edema de orelha induzido por fenol e histamina, que mimetizam a
dermatite de contato irritativa e reação alérgica do tipo imediata, respectivamente. O fato do
OELS e timol inibirem o edema induzido por um agente irritante como o fenol demonstra a
possível eficácia destes no tratamento da dermatite de contato frente a agentes irritantes. Em
resposta a estímulos exógenos, como o fenol, os queratinócitos produzem mediadores
químicos importantes na irritação primária de contato, incluindo citocinas associadas a
propriedades pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-8 e TNF-α (WILMER et al., 1994; LIM et
al., 2004). Um dos mecanismos pelos quais o fenol promove a irritação cutânea seria a
ruptura da membrana plasmática dos queratinócitos por efeito direto, resultando na liberação
da IL-1, além de outros mediadores inflamatórios como os metabólitos do AA. As citocinas
pró-inflamatórias são induzidas nesse modelo por um mecanismo distinto daquele observado
96
no modelo de inflamação cutânea induzido por TPA, onde a indução de citocinas ocorre via
ligação a receptores específicos, através de vias dependentes da PKC, nas quais envolvem
fatores de transcrição nuclear (WILMER et al., 1994). No entanto, apesar da resposta
inflamatória ser desencadeada por diferentes vias, ambos os modelos compartilham do
envolvimento dos metabólitos do AA na resposta inflamatória instalada. Assim, esses dados
sugerem que o OELS e seu constituinte majoritário, o timol, podem estar exercendo sua ação
antiinflamatória por atuar sobre esses mediadores, como eficientemente demonstrado no
modelo de AA (MONTEIRO et al., 2007; OZEN et al., 2011).
Os mastócitos desencadeiam reações imediatas do tipo alérgica em resposta a
diversos alérgenos, através da interação dos seus receptores de superfície com a IgE,
conduzindo a degranulação e liberação de diversos mediadores vasoativos, pró-inflamatórios
e nociceptivos, como a histamina, citocinas (IL-6, IL-8, IL-13), prostaglandinas (PGD2),
leucotrienos (LTC2), TNF-α e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)
(THEOHARIDES et al., 2007). A histamina causa vasodilatação e um aumento na
permeabilidade vascular, promovendo uma resposta edematogênica em poucos minutos, além
de estimular fibras nervosas sensitivas através de mecanismos H1-dependentes que resulta em
prurido (BRAND et al., 2002). Uma das principais funções fisiopatológicas da histamina é a
sua ação como mediador das reações de hipersensibilidade do tipo I, como a urticária (RANG
et al., 2007; BRAND et al., 2002).
O OELS e timol não foram capazes de reduzir significativamente o edema induzido
por histamina, comparados ao controle negativo (salina) (p > 0,05). Esse resultado sugere que
não há envolvimento do OELS e timol na inibição da histamina produzida na ação
edematogênica induzida por AA, e sim na influência da produção de eicosanóides
inflamatórios (PGs e LTs).
Nossos resultados demostraram que, no modelo de edema de orelha crônico, como
observado em doenças inflamatórias crônicas, o tratamento em dias seguidos com OELS ou
timol promoveu o efeito pró-inflamatório e dano cutâneo. Eventualmente, o mecanismo de
ação envolvido neste processo pode ser explicado pela envolvimento de enzimas LOX. Nas
doenças crônicas, como artrite reumatóide e psoríase, há uma alteração na liberação de
citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, interleucinas), fatores de crescimento e enzimas
pró-inflamatórias como COX e LOX que geram PGs e LTs, respectivamente, resultantes da
infiltração de leucócitos no tecido cutâneo (células T, neutrófilos e mastócitos) (KRUEGER e
BAWCOCK, 2006).
97
O estudo feito por Roschek et al. (2009) foi demonstrado que o extrato de farelo de
arroz SRB-AI (apresentando timol em sua composição química) foi capaz de promover uma
inibição dose-dependente da COX-1 e COX-2, e seletivamente inibiu a COX-2 10 vezes mais
que a COX-1. Não foi detectada inibição da 5-LOX pelo SRB-AI. A 5-LOX catalisa a
biotransformação do ácido araquidônico em hidroperóxidos de ácidos graxos, lipoxinas e
leucotrienos (como LTB4), os quais estão envolvidos em processos alérgicos e dor. Sahouo et
al. (2003) mostraram que
a função das ciclooxigenases foi inibida pelos constituintes
químicos do óleo essencial de O. gratissimum, que apresenta timol como componente
majoritário (70,8 %), com IC50 de 125 µg/mL.
Elhabazi et al. (2006) demonstraram que os extratos Thymus broussonetti (rico em
timol) foram capazes de aumentar o número de neutrófilos, linfócitos totais, linfócitos T CD4
+, CD8 + e células NK. Os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro contra
microorganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies
reativas de oxigênio (ROS), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo
oxidativo dos neutrófilos. As ROS produzidas, tais como HO., NO, H2O2, que são essenciais
para eliminar os microrganismos fagocitados, podem ser liberadas para o meio extracelular e
causar lesões aos tecidos do hospedeiro (KABEYA, 2002). O estímulo da liberação de
eicosanóides (através da 5-LOX) e citocinas, como IL-1 e TNF-α ativa neutrófilos e
macrófagos, aumentando a produção e liberação de ROS, as quais têm sido relacionados ao
dano tecidual local observado no modelo de edema de orelha crônico induzido por OC.
Diante disso, um possível mecanismo de ação anti-inflamatória (edema agudo de
orelha) do óleo essencial de L. sidoides e do timol, pode estar associado às enzimas COX,
como demonstrado nos modelo de AA e fenol. No entanto, o efeito pró-inflamatório
observado no edema crônico da orelha pode ser relacionado pelo aumento da atividade da
enzima 5-LOX na biotransformação do AA em hidroperóxidos de ácidos graxos, lipoxinas e
leucotrienos os quais induzem a formação de ROS pelos polimorfonucleares. Os resultados
são relevantes e promissores e sugerem que o timol é o composto responsável pelas atividades
biológicas observadas pelo óleo essencial dessa espécie.
98
CONCLUSÕES
______________________________________________
99
6 CONCLUSÕES

A composição química do óleo essencial de L. sidoides é caracterizada por conter o
timol o componente majoritário, apresentando 84,9% da composição química, que está
em conformidade com outros trabalhos relatados para essa espécie.

A atividade antibacteriana e antifúngica verificada pelo OELS parece ser determinada
pela presença do timol, pois os mesmos apresentaram os mesmos valores de
Concentração Inibitória Mínima (CIM) frente aos microrganismos testados, sendo
mais relevantes frente à Staphylococcus aureus ATCC 12624, Candida albicans
ATCC 40006 e Candida tropicalis ATCC 40042.

Foi observado sinergismo com aminoglicosídeos e ß- lactâmicos quando os mesmos
foram associados ao OELS e timol, por contato direto, frente a algumas bactérias. Os
componentes voláteis do óleo e o timol foram capazes de interferir na atividade de
aminoglicosídeos por contato gasoso, potencializando a ação desses antibióticos. Por
outro lado, a associação entre o OELS ou timol com o fluconazol frente a espécies de
Candida não foi capaz de interferir na atividade antifúngica.

O OELS e timol são capazes de reduzir in vitro as UFC em biofilmes de E. faecalis
(tempo de maturação de 72 horas) no tempo de contato de 30 e 60 minutos em
concentrações de 2,5 e 10%, não havendo diferenças estatísticas entre a ação
antimicrobiana dos mesmos.

A aplicação tópica de OELS e timol (2 mg/orelha), demonstrou eficácia na redução do
edema induzido por ácido araquidônico e fenol. Possivelmente sua ação pode estar
relacionada à redução da produção de mediadores pro – inflamatórios, por inibição da
COX. Além disso, não houve diferença estatística entre a atividade antiedematogênica
do OELS e timol.
100
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128
ANEXOS
______________________________________________
129
ANEXO A – Produção científica vinculada ao projeto de mestrado
Artigos submetidos:
1. Periódico: Journal of Endodontics.
Toxic effect of essential oil of Lippia sidoides Cham. and thymol
on Enterococcus faecalis biofilm.
Helenicy NH Veras, MSc *†, Fabíola FG Rodrigues, MSc ‡, Marco A Botelho, PhD*, Irwin
RA Menezes, PhD*, Henrique DM Coutinho, PhD* and José Galberto M Costa, PhD*‡
ABSTRACT
Introduction: The species Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is utilized in popular
medicine as a local antiseptic on the skin and mucosal tissues and its therapeutic effect is
attributed to the presence of thymol. Enteroccocus faecalis is the bacterium most frequently
isolated from root canals of teeth with persistent periapical lesions and has the ability to form
biofilm, which protects it against antimicrobial against, where it is responsible for the failure
of endodontic treatments. Methods: the essential oil of the leaves of L. sidoides (EOLS) and
its major component, thymol, were evaluated with respect to antimicrobial activity against
Enterococcus faecalis biofilm. The leaves of L. sidoides were subjected to hydrodistillation,
and the essential oil extracted was examined with respect to the chemical composition, by gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS). EOLS and thymol were evaluated for reduced
the CFU in biofilms of E. faecalis in vitro. Results: The overall yield of essential oil obtained
by hydrodistillation was 1.06%. The GC-MS analysis has led to the identification of the main
components thymol (84.9 %) and p-cymene (5.33%). EOLS and thymol reduced the CFU in
biofilms of E. faecalis in vitro (time of maturation of 72 h), with an exposure time of 30 and
60 min at concentrations of 2.5 and 10%. There was no statistical difference in effect
between EOLS and thymol, demonstrating that this phenolic monoterpene was the compound
responsible for the antimicrobial activity of EOLS. This is the first report of the action of
EOLS against E. faecalis biofilm. Conclusions: our study provides a basis for the possible
utilization of EOLS as an adjuvant in the treatment of root canals that show colonization by E.
faecalis. However, pre-clinical studies are necessary to determine the true efficacy and
concentration of EOLS capable of killing biofilm bacteria in vivo.
Key-words: Lippia sidoides, thymol, biofilm, Enterococcus faecalis
130
131
2. Periódico: Phytomedicine
Topical anti-inflammatory activity of essential oil
from Lippia sidoides Cham.: possible mechanism of action.
Helenicy N.H. Veras1, Mariana K.A. Araruna2, José G.M. Costa1, Henrique D.M.
Coutinho3*, Marta R. Kerntopf2, Marco A. Botelho1, Irwin R.A. Menezes2
ABSTRACT
Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae), known as “alecrim pimenta”, is a shrub easily found in
Brazilian Northeast, widely used in folk medicine as antiseptic for local use in skin and
mucous. This work reports the L. sidoides essential oil chemical composition and comparative
evaluation of topical effect of this essential oil (EOLS) and thymol (major constituent) against
different irritant agents in vivo, in order to verify its antiedematogenic effect as well to
unravel its tentative mechanisms of action. The essential oil was obtained by hydrodistillation
(yield of 1.06%) and the GC/MS analysis identified the main constituents: thymol (84.9 %)
and p-cymene (5.33%). The anti-inflammatory activity was evaluated, using a mice ear
inflammation model induced by croton oil, arachidonic acid, phenol and histamine. The
topical application of EOLS or thymol at dose of 2 mg/ear, significantly reduced (P < 0.001)
in 45.1% and 47.4% the ear edema induced by arachidonic acid and reduced in 33.2% (P
<0.05) and 54.7% (P <0.01) the ear edema induced by phenol in acute ear edema. However,
was evidenced pro-inflammatory effect in chronic era edema induced by croton oil. There
were not statistical differences between EOLS and thymol for the antiedematogenic activity.
In conclusion, the results obtained showed that thymol is the constituent responsible for the
topical anti-inflammatory activity of EOLS in the models of arachidonic acid and phenol in
mice, possibly reducing the production of pro-inflammatory mediators and can be a source of
active compounds with activity antiedematogenic.
Key- words: Lippia sidoides; thymol; anti-inflammatory activity; ear edema; essential oil
132
133
3. Periódico: European Journal of Medicinal Chemistry
Synergistic antibiotic activity of volatile compounds from the essential oil of
Lippia sidoides and thymol.
Helenicy N.H. Verasa, Fabíola F.G. Rodriguesa, Aracélio V. Colaresa, Irwin R. Alencar
de Menezesb, Henrique D. Melo Coutinhoc*, Marco A. Botelhoa, José G. M. da Costaa
Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is used in the folk medicine as topical antiseptic in skin
and mucous membranes and its therapeutic effect is attributed to the thymol presence. The
objective of this work was verify the chemical composition and antibiotic modifying activity
of the essential oil extracted from the leaves of L. sidoides and its major component thymol.
The essential oil was obtained by hydrodistillation (yield of 1.06%) and the GC / MS analysis
identified the main constituents: thymol (84.9%) and p-cymene (5.33%). The antibiotic
modifying activity was verified using the minimal inhibitory doses method and gaseous
contact. It was verified that the essential oil and thymol interfered with all tested
aminoglycosides. There were not statistical differences between the activity of the essential
oil and thymol against P. aeruginosa, indicating to be this responsible composition for such
activity. However, the oil was shown more effective when compared to the thymol against S.
aureus. The essential oil of L. sidoides and its major component thymol influences the activity
of aminoglycosides and may be used as adjuvant in antibiotic therapy against respiratory tract
bacterial pathogens.
Keywords: Lippia sidoides, thymol, antibiotic activity, gaseous contact, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus.
134
135
4. Periódico: Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis
Enhancement of aminoglycosides and ß- lactams antibiotic activity by essential oil
of Lippia sidoides Cham.
H.N.H. Verasa, F.F.G. Rodriguesa, M.A. Botelhoa, I.R.A. Menezesb, H.D.M. Coutinhoc*,
J.G.M. Costaa
ABSTRACT
Natural products from plants can alter the effect of antibiotics, increasing or reducing its
activity. Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) is a bush found in the Northeastern region of
Brazil. In the popular medicine, L. sidoides has been used as antiseptic. In this work we report
the chemical composition of the essential oil from L. sidoides and to determine the
potentiation of the activity of aminoglycosides and ß - lactams. The essential oil showed as
major compounds the thymol (84.9%), Etil-methyl-carvacrol (5.33%) and p-cymene (3.01%).
The determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by microdiluition
demonstrated none difference in the antimicrobial activity between the essential oil (EOLS)
and thymol. There was reduction in the MIC of the amynoglicosides gentamicin and
neomycin when associated to EOLS and thymol. When the natural products were associated
with the ß - lactam Penicillin G and Ceftriaxone, the MIC was reduced against Streptococcus
mutans and Enterococcus faecalis. The results demonstrated that the thymol is the compound
responsible by the antimicrobial and modifying of antibiotic activity in vitro of the EOLS.
More studies are necessary in order to evaluate the behavior of that association alive in to
verify the biodisponibility and the possible toxic effects.
Keywords: Lippia sidoides, thymol, Antibacterial activity, modifying antibiotic activity.
136
137
ANEXO B– Produção científica não vinculada ao projeto de mestrado
Artigo aceitos para publicação:
1. Periódico: Journal of Essential Oil Bearing Plants
Lippia alba (Mill.) N.E. essential oil interfere with aminoglycosides effect against
Staphylococcus aureus
Helenicy N. H. Veras1, Adriana R. Campos1,2, Fabíola F. G. Rodrigues2, Marco A. Botelho1,
Henrique D.M. Coutinho1 and José G. M. da Costa1*
ABSTRACT: Lippia sp essential oils have been popularly used to treat infectious diseases
and some studies have shown their effect on microorganisms control. Lippia alba (Mill.) N.E.
Brown, known as “cidreira”, is a shrub easily found in Brazilian Northeast. The traditional use
of their leaves, used as tea to treat some affections, justify the investment in further
investigations. This work reports the L. alba essential oil chemical composition and its
aminoglycosides modifying effect against Staphylococcus aureus ATCC 6538, S. aureus
ATCC 25923 and S. aureus ATCC 12692. The essential oil was obtained by hydrodistillation
(yield of 0.52%) and the GC/MS analysis identified the main constituents: Geranial (31.4 %),
Neral (29.5 %), β-elemene (16.5 %) and geranyl acetate (13.3 %). It was verified that the
essential oil interfered with all tested aminoglycosides. The antibiotic activity of gentamicin
against S. aureus ATCC 25923 was enhanced (275%) in the presence of 12% essential oil.
The 3% essential oil increased the effect against S. aureus ATCC 25923 (41.6%) and S.
aureus ATCC 6538 (58.3 %).
Key words: Lippia alba, essential oil, chemical composition, aminoglycosides, modulatory
activity.
138
2. Periódico: Pharmacognosy Magazine
Enhancement of the antibiotic activity of erythromycin by volatile compounds of Lippia
alba (Mill.) N.E. Brown against Staphylococcus aureus
Helenicy N. H. Veras, Adriana R. Campos, Fabíola F. G. Rodrigues, Marco A. Botelho,
Henrique D. M. Coutinho, Irwin R. A. Menezes and José Galberto M. da Costa.
ABSTRACT
Background: Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, popularly known as “erva-cidreira,” is
commonly found in northeastern Brazil. The leaves tea is used to treat digestive disturbances,
nausea, cough, and bronchitis. Objective: This work reports the chemical composition and
erythromycin-modifying activity by gaseous contact against Staphylococcus aureus.
Materials and Methods: The leaves of L. alba were subjected to hydrodistillation, and the
essential oil extracted was examined with respect to the chemical composition, by gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the essential oil extracted was evaluated
for antibacterial and antibiotic-modifying activity by gaseous contact. Results: The overall
yield of essential oil obtained by hydrodistillation was 0.52%. The GC-MS analysis has led to
the identification of the main components: geranial (31.4%) and neral (29.5%). It was verified
that the essential oil interfered with erythromycin antibiotic activity against S. aureus ATCC
25923 was enhanced (221.4%) in the presence of 12% essential oil. The 3% essential oil
increased the effect against S. aureus ATCC 25923 (41.6%) and S. aureus ATCC 6538
(58.3%). Conclusion: The essential oil of L. alba influences the activity of erythromycin and
may be used as an adjuvant in antibiotic therapy against respiratory tract bacterial pathogens.
Key words: Chemical composition, erythromycin, essential oil, Lippia alba, modulatory
activity
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