capítulo 1 - Pós-graduação - Universidade Federal da Paraíba

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capítulo 1 - Pós-graduação - Universidade Federal da Paraíba
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Otimização da síntese da meso-tetraquis(2-piridil)porfirina e
estudos de Mn e Fe-porfirinas como modelos biomiméticos da
enzima catalase
CLARISSA GOMES DE CARVALHO MAIA
JOÃO PESSOA- PB- BRASIL
MAIO/2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Otimização da síntese da meso-tetraquis(2-piridil)porfirina e
estudos de Mn e Fe-porfirinas como modelos biomiméticos da
enzima catalase
CLARISSA GOMES DE CARVALHO MAIA
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal da
Paraíba como requisito para obtenção
do título de Mestre em Química
ORIENTADOR: Prof. Dr. Júlio Santos Rebouças
CO-ORIENTADORA: Profª. Drª. Ines Batinić-Haberle
JOÃO PESSOA- PB- BRASIL
MAIO/2015
M217o
Maia, Clarissa Gomes de Carvalho.
Otimização da síntese da meso-tetraquis(2-piridil)porifirina e
estudos de Mn e Fe-porfirinas como modelos biomiméticos da
enzima catalase / Clarissa Gomes de Carvalho Maia.- João
Pessoa, 2015.
123f. : il.
Orientador: Júlio Santos Rebouças
Co-orientadora: Ines Batinic-Haberle
Dissertação (Mestrado) - UFPB/CCEN
1. Química. 2. Otimização da H2T-2-PyP. 3. Planejamentos
fatoriais. 4. Modelos da enzima catalase.
UFPB/BC
CDU: 54(043)
À Gabi por todos os anos dedicados,
Por estar sempre ao meu lado,
Com amor,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente quero agradecer a Deus pela vida maravilhosa que me é
concedida e por todas as dádivas recebidas durante a realização desse trabalho.
Aos meus pais, Carmem, João (in memoriam) e Caio, por todo o amor,
ensinamentos e dedicação. Obrigada por todo o sacrifício para que eu pudesse ter a
oportunidade de estudar e realizar meus sonhos.
À Aninha, por ser minha irmã preferida, por todo o amor e por estar ao meu
lado sempre que precisei.
À Gabi, por estar sempre ao meu lado, durante toda a minha jornada acadêmica
e pelo amor e carinho concedido diariamente.
Ao Prof. Júlio, por todo o apoio, confiança, ensinamentos e orientação durante
esses 6 anos de caminhada. Grata também aos conselhos, as longas conversas, por me
apresentar o mundo das porfirinas e por ser, para mim, a maior representação de
humildade que já conheci.
À minha co-orientadora Ines, pela oportunidade de conhecer umas das
melhores universidades do mundo (Duke University), pela confiança depositada e os
inúmeros conselhos durante a minha estadia em Durham.
À Higo, meu grande amigo, pela inspiração e por ser essa pessoa maravilhosa,
às vezes um chato, mas que eu tanto amo.
À Victor Hugo, um irmão que a vida me deu para deixar meus dias mais
felizes. Agradeço as longas conversas, os ensinamentos e as discussões a respeito da
química das porfirinas.
À Juliana Alves, pela amizade e pelo carinho, por compartilhar momentos de
muita alegria e por estar sempre ao meu lado, nos momentos bons e nos ruins também.
Agradeço também por ter me apresentado ao seu queridíssimo marido Júnior, na qual
tenho orgulho, de hoje, chamar de amigo.
Aos meus amigos Jacqueline de Jesus Bueno Cristina Sette e Israel, pessoas de
alto nível que moram no meu coração. Agradeço demais a amizade dos dois.
Aos amigos do DQ-UFPB: Ferreira, Natália Alvim, Nathália Falcão, Ivson,
Iran, Elaine, Geórgia, Paulo, Dariston, Katharinne, Yolanda, André, Dayvison,
Handerson, Juliana doida, Danilo, Helivaldo, Italo, Karla, Lucas, Dani, Matias, Ana
Luiza, Marcelinho, Sófacles.
Aos amigos Rossana e Erick pela amizade de sempre, por todo o carinho que
sempre me foi dado. Amo de graça esses dois.
Às professoras Ieda, Rita Coutinho e Elizete pela inspiração e por me
apresentarem o mundo da Química mais profundamente.
Aos professores Wagner, Wallace, e Cosme pelas contribuições dadas na
minha pré-defesa e defesa.
À Dido pelo seu brilhante álbum No Angel que me inspirou durante toda a
minha escrita.
Ao Pearl Jam pelo maravilhoso álbum Ten que também me acompanhou
durante a minha escrita da dissertação.
“Antes de tudo eu quero viver, do contrário
Seria melhor não existir”
(Fiódor Dostoiévski)
SUMÁRIO
A. Resumo.........................................................................................
i
B. Abstract........................................................................................
ii
C. Lista de Abreviações e Siglas.....................................................
iii
D. Lista de Equações........................................................................
v
E. Lista de Esquemas......................................................................
vi
F. Lista de Figuras...........................................................................
vii
G. Lista de Tabelas...........................................................................
xi
H. Organização da Dissertação.......................................................
xiii
1. Aspectos Gerais da Química de Porfirinas................................
2
1.1 Porfirinas................................................................................
2
1.2 Métodos Clássicos de Síntese de Porfirinas...........................
4
1.3 Porfirinas em Sistemas Biomiméticos...................................
6
1.3.1 Superóxido Dismutases (SOD).....................................
6
1.3.2 Citocromos P450...........................................................
8
1.3.3 Catalase.........................................................................
11
1.4 Objetivos Gerais.....................................................................
13
2. Otimização da síntese e purificação da meso-tetraquis(2piridil)porfirina...............................................................................
15
2.1 Introdução..............................................................................
15
2.1.1 Planejamentos Fatoriais................................................
17
2.2 Objetivos................................................................................
19
2.3 Parte Experimental.................................................................
20
2.3.1 Reagentes e Solventes...................................................
20
2.3.2 Equipamentos e Software ...........................................
20
2.3.2.1 Espectroscopia eletrônica de absorção na
região do Uv-vis.................................................................................
20
2.3.2.2 Espectroscopia de ressonância magnética
nuclear (RMN de 1H).........................................................................
20
2.3.2.3 pHmetro.............................................................
20
2.3.2.4 Centrífuga..........................................................
21
2.3.2.5 Pacote estatístico................................................
21
2.3.3 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em pequena
escala..................................................................................................
21
2.3.4 Quantificação in situ dos rendimentos da síntese da
H2T-2-PyP: Método de Adição de Padrão.........................................
22
2.3.5 Síntese e Purificação da H2T-2-PyP em escala
preparativa..........................................................................................
23
2.3.5.1 Reações em ácido butírico.................................
23
2.3.5.2 Reações em ácido acético..................................
24
2.4 Resultados e Discussão........................................................
27
2.4.1 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em pequena
escala: aspectos gerais.......................................................................
27
2.4.2 Reações exploratórias em ácido butírico como
solvente/catalisador............................................................................
31
2.4.3 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em ácido
butírico...............................................................................................
44
2.4.4 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em ácido
acético................................................................................................
55
2.4.5 Reações em escala preparativa e isolamento da H2T2-PyP .................................................................................................
2.5 Conclusões............................................................................
61
65
3. Atividade de Mn(III) e Fe(III) N- alquilpiridilporfirinas na
dismutação de peróxido de hidrogênio: Modelos das enzimas
catalase..............................................................................................
68
3.1 Introdução..............................................................................
68
3.2 Técnica Eletroanalítica – Coulometria..................................
70
3.3 Objetivos...............................................................................
72
3.4 Parte Experimental................................................................
73
3.4.1 Reagentes e Solventes.................................................
3.4.2 Equipamentos..............................................................
73
3.4.3 Metodologia ...............................................................
74
3.5 Resultados e Discussão........................................................
75
3.6 Conclusões.. ..........................................................................
79
4. Considerações Finais e Perspectivas..........................................
81
5. Referências Bibliográficas..........................................................
84
APÊNDICE.......................................................................................
94
73
A. RESUMO
Os complexos de Mn(III) derivados das N-piridilporfirinas, tais como MnTE-25+
PyP e MnTnHex-2-PyP5+ têm sido utilizados como modelos biomiméticos de diversas
metaloproteínas que desempenham papéis biológicos importantes e se destacam como
moduladores redox de estresse oxidativo. A síntese destes modelos requer a
derivatização da porfirina anfifílica H2T-2-PyP, cujo procedimento de obtenção, a partir
de pirrol e 2-piridinacarboxaldeído, permanece pouco estudado e não otimizado. Baixos
rendimentos (~1-5%) e baixa reprodutibilidade são comumente reportados. Neste
trabalho conduziu-se um estudo sistemático visando a otimização das etapas de síntese e
purificação da H2T-2-PyP usando técnicas quimiométricas, como planejamentos
fatoriais e superfície de resposta. Foi investigado um total de 10 fatores em 3 ou 4
níveis, e desenvolvida, concomitantemente, um procedimento espectrofotométrico para
quantificação rápida dos rendimentos dos ensaios. O rendimento da H2T-2-PyP passou
de 1 a 5 % (condições clássicas, não-otimizadas) para 25% da porfirina isolada.
Adicionalmente, realizou-se um estudo sistemático da atividade catalase de uma série de
compostos comumente utilizados como mímicos de SOD e/ou moduladores redox,
incluindo complexos de Mn(III) e Fe(III) derivados da H2T-2-PyP. Os níveis de
oxigênio produzido durante a dismutação do H2O2 foi medido através de um eletrodo de
Clark e a atividade de dismutação, expressa por kcat(H2O2) foi comparada com o valor
da enzima catalase (kcat(H2O2) = 1,5 x 106 mol-1 L-1 s-1). Para as treze MnPs derivadas
das N-piridilporfirinas, o valores de kcat(H2O2) foram entre 23-88 mol-1 L-1 s-1. As FePs
derivadas das N-piridilporfirinas são uma ordem de magnitude melhores do que as
MnPs. Mn(II) poliaminas cíclicas são potentes mímicos de SOD, porém essencialmente
não têm atividade catalase. A porfirina aniônica MnTBAP3- apresentou uma baixa
atividade catalase, com kcat(H2O2) = 5,8 mol-1 L-1 s-1. Nenhum dos compostos foi capaz
de se mostrar como mímico de catalase com qualquer relevância prática. Apesar da
classe das Mn e Fe porfirinas conter os exemplos mais relevantes de mímicos SOD e
moduladores redox de estresse oxidativo mais eficientes in vivo, determinou-se que a
capacidade de dismutação de H2O2 destes complexos de Mn e Fe foram, no máximo
0,006 e 0,06% da atividade da enzima catalase, respectivamente.
i
B. ABSTRACT
The Mn(III) complex derived from the ethylation or n-hexylation of Npyridylporphyrins to yield compounds, such as MnTE-2-PyP5+ and MnTnHex-2-PyP5+,
respectively, have been used as biomimetic models of various metalloproteins which
play important biological roles and stand as redox modulators of oxidative stress. The
synthesis of these models and experimental therapeutics requires derivatization of the
H2T-2-PyP building block, which, in turn, is currently prepared via pyrrole and 2pyridinecarboxaldehyde condensation. This reaction remains non-optimized, thus, low
yields (~ 1-5%) and low reproducibility are commonly reported. In this thesis, a
systematic study to optimize the synthesis and purification of H2T-2-PyP was carried
out using chemometric tools, such as factorial design and response surface. A total of 10
factors in 3 or 4 levels were investigated. A spectrophotometric procedure for rapid
quantification of the yields was also developed. The purification methods were
investigated and involved a combination of precipitation, liquid-liquid separation and
chromatographic steps. The use of optimized conditions resulted in H2T-2-PyP isolated
yields of 25%, which is comparable to the usual yields of meso-tetraphenylporphyrin
derivatives prepared by Alder Longo conditions. A systematic study of the catalase
activity of a series of compounds commonly used as mimics of SOD and/or redox
modulators, including of Mn(III) and Fe(III) complexes of H2T-2-PyP derivatives was
undertaken. Oxygen levels produced during dismutation of H2O2 was measured by a
Clark electrode, and the dismutation activity, expressed as kcat(H2O2) was compared
with that of the catalase enzyme (kcat(H2O2) = 1.5 x 106 mol-1 L-1 s-1). For 13 Mn(III) Npyridylporphyrins, the kcat(H2O2) values were between 23-88 mol-1 L-1 s-1, whereas the
Fe(III) analogues were about an order of magnitude better. Mn(II) cyclic polyamines are
potent SOD mimics, but have essentially no catalase activity. The anionic porphyrin
MnTBAP3- showed a low catalase activity, with kcat(H2O2) = 5.8 mol-1 L-1 s-1. Although
the class of Mn and Fe porphyrins include the most relevant examples of SOD mimics
and redox modulators, the ability of these Mn and Fe complexes to dismutate H2O2
were at most 0.006 and 0.06% of the catalase enzyme activity, respectively. None of the
compounds showed catalase activity of any practical significance, which is relevant for
ruling out such activity from the repertoire of putative mechanistic roles these
compounds play in biological systems.
ii
C. LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
H2T-2-PyP
meso-tetraquis(2-piridil) porfirina
H2T-3-PyP
meso-tetraquis(3-piridil) porfirina
H2T-4-PyP
meso-tetraquis(4-piridil) porfirina
MnTE-2-PyP5+
meso-tetraquis(N-etilpiridinio-2-il)
porfinatomanganês(III)
MnTnHex-2-PyP5+
meso-tetraquis(N-hexilpiridinio-2il)porfinatomanganês(III)
MnTBAP-3
meso-tetraquis(4-carboxifenil)
porfirinatomanganês(III)
H2TPP
meso-tetrafenilporfirina
SOD
Enzimas Superóxido dismutase
MnPs
Mn-porfirinas
FePs
Fe-porfirinas
CCD
Cromatografia de camada delgada
CYP450
Citocromos P450
UV-vis
Ultravioleta-Visível
ROS/RNS
Espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio
EtOAc
Acetato de etila
DDQ
2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona
GPx
Glutationa peroxidase
Prx
Peroxirredoxinas
GR
Glutationa redutase
iii
TrxR
Tiorredoxina redutase
Trx
Tiorredoxina
GSH
Glutationa reduzida
GSSG
Glutationa oxidada
TRIS
2-amino-hidroximetil-propano-1,3-diol
CAT
Enzima catalase
NHE
Eletrodo Normal de Hidrogênio
iv
D. LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1.1
11
Equação 1.2
12
Equação 1.3
12
Equação 1.4
12
Equação 1.5
12
Equação 2.1
36
Equação 2.2
36
v
E. LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 2.1
24
Esquema 2.2
25
Esquema 2.3
26
Esquema 2.4
27
vi
F. LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 - Estrutura da porfina...........................................................................
Figura 1.2 - Espectros UV-vis típicos de (a) uma porfirina base livre e (b) uma
metaloporfirina.......................................................................................................
Figura 1.3 - Esquema de síntese da H2TPP a partir das condições propostas por
Rothemund............................................................................................................
2
3
4
Figura 1.4 - Esquema proposto para a formação da porfirina e principais subprodutos via Método de Lindsey em duas etapas...................................................
5
Figura1. 5 - Estrutura da H2T-2-PyP.....................................................................
6
Figura 1.6- Dismutação do superóxido pelas enzimas SOD................................
7
Figura 1.7- Atividade SOD influenciada pelos efeitos eletrostáticos/
termodinâmicos na relação estrutura-atividade entre log kcat (O2•–) vs. potenciais
de redução MnIII/MnII de algumas Mn-porfirinas, MnCl2, aminas policíclicas
(M40403) e MnSalen e os potencias de redução das enzimas SOD e das
espécies envolvidas nas semi-reacões de dismutacão do superóxido. Adaptado
de Rebouças et al.(2008)........................................................................................
8
Figura 1.8 – Ferro (III) protoporfirina IX: grupo prostético das hemeproteínas e
citocromos P450.....................................................................................................
9
Figura 1.9 - Representação esquemática do mecanismo de reação para os
citocromos P450...................................................................................................
10
Figura 1.10 - Proposta do mecanismo catalítico da catalase. (BERTINI et al.,
2007).......................................................................................................................
13
Figura 2.1- Isômeros das N-piridilporfirinas.........................................................
15
Figura 2.2- Estruturas das Mn-porfirinas catiônicas (a) MnTE-2-PyP5+ e (b)
MnTnHex-2-PyP5+ derivadas da H2T-2-PyP e mímicos de SOD potentes............
16
Figura 2.3- Espectros eletrônicos de absorção na região do UV-vis da solução
de H2T-2-PyP comercial (curva azul) e de uma amostra proveniente diretamente
do meio de reação de síntese da H2T-2-PyP diluída em HCl(aq) (1,0 mol/L)
(curva vermelha), sem qualquer tratamento prévio. Espectros registrados em
HCl(aq) (1,0 mol/L)................................................................................................
29
Figura 2.4- Espectros obtidos para as soluções P0, P1, P2, P3 e P4 (ver parte
vii
experimental, item 2.3.4) e a respectiva curva de calibração com os 3
comprimentos de onda escolhidos para a determinação dos rendimentos para
uma reação típica de síntese da H2T-2-PyP. O intercepto em x (o) representa a
[H2T-2-PyP] oriunda da reação ..............................................................................
30
Figura 2.5- Efeitos principais do 1° Experimento.................................................
34
Figura 2.6- Efeito de interação AD do 1° Experimento........................................
35
Figura 2.7- Curvas de nível das variáveis A (pirrol) e B (relação aldeído/pirrol)
do 1° Experimento..................................................................................................
35
Figura 2.8-Diagrama das reações exploratórias com as variáveis pirrol e relação
molar aldeído/pirrol. Os números no exterior do círculo correspondem aos
ensaios na Tabela 2.5 e os números no interior do círculo são os
rendimentos.............................................................................................................
37
Figura 2.9- Efeitos principais do 2° Experimento................................................
40
Figura 2.10- Efeitos principais do 4° Experimento...............................................
46
Figura 2.11- Resposta do rendimento de H2T-2-PyP à concentração de água no
sistema. Condições: ácido butírico como solvente/catalisador; [Pirrol] = 0,05
mol/L; Relação molar aldeído/pirrol = 0,75:1; tempo de reação = 60 min. e
temperatura = 100 °C.............................................................................................
47
Figura 2.12- Diagrama do planejamento fatorial completo 23 do 5°
Experimento com os rendimentos. Para a variável temperatura, os níveis –1, 0 e
1 correspondem a 80 °C, 90 °C e 100 °C, respectivamente. Para [água], os
níveis –1, 0 e 1 correspondem a 0,5 mol/L, 1 mol/L e 1,5 mol/L. Para o fator
tempo de reação, os níveis –1, 0 e 1 correspondem a 1 h, 2h e 3 h,
respectivamente..................................................................................................
49
Figura 2.13- Efeitos principais do 5° Experimento...............................................
50
Figura 2.14- Estudo cinético com o pirrol mais concentrado (0,1mol/L).
Condições: relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração de água a 1,5
mol/L e temperatura de reação a 100 oC................................................................
51
Figura 2.15- Diagrama do 6° Experimento com os rendimentos (não isolados)
da H2T-2-PyP. Para a variável temperatura, os níveis –1, 0 e 1 correspondem a
80, 90 e 100 °C, respectivamente. Para o tempo de reação, os níveis –1, 0, 1 e
viii
√ correspondem a 1, 2, 3 e 3,26 h, respectivamente...........................................
53
Figura 2.16- Efeitos principais do 6° Experimento...............................................
54
Figura 2.17- Efeito de interação AB do 6° Experimento.....................................
54
Figura 2.18- Estudo cinético com o pirrol mais diluído (0,05 mol/L).
Condições: relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração de água a 1,5
mol/L e temperatura de reação a 100 oC.................................................................
55
Figura 2.19- Diagrama do 7° Experimento com os rendimentos. Para a variável
temperatura, os níveis -1, 0 e 1 correspondem a 80 °C, 90 °C e 100 °C,
respectivamente. Para [água], os níveis -1, 0 e 1 correspondem a 0,5 mol/L, 1
mol/L e 1,5 mol/L. Para o fator tempo de reação, os níveis -1, 0 e 1
57
correspondem a 1 h, 2h e 3 h, respectivamente......................................................
Figura 2.20- Efeitos principais do 7° Experimento..............................................
58
Figura 2.21- Diagrama do 8° Experimento com os rendimentos. Para a variável
temperatura, o nível -1 corresponde a 80 °C, o nível 0 a 90 °C e o nível +1
corresponde 100 °C. Para o tempo de reação, o nível -1 corresponde a uma hora,
o nível 0 a duas horas e o nível +1 corresponde a três horas..................................
60
Figura 2.22- Efeitos principais (esquerda) e de interação AB (direita) do 8°
Experimento...........................................................................................................
61
Figura 2.23- Espectro eletrônico de absorção na região do UV-vis da H2T-2PyP isolada em CHCl3...........................................................................................
63
Figura 2.24- Placa de CCD - SiO2 das amostras de H2T-2-PyP isolada (em
ácido butírico e ácido acético) e amostra autentica de H2T-2-PyP. As frações
foram eluídas com CHCl3:MeOH (9:1, v/v) até que a marca do solvente
atingisse 10 cm a partir dos pontos de aplicação...................................................
64
1
Figura 2.25- Espectro de RMN de H (200 MHz) da H2T-2-PyP (isolada e
comercial) em CDCl3 com atribuição.....................................................................
65
Figura 3.1- Esquema das reações e respectivas enzimas envolvidas na formação
de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. NOS: NO sintase; SOD:
superóxido dismutase; GPx: glutationa peroxidase; Prx: peroxirredoxinas; GR:
glutationa redutase; TrxR: tiorredoxina redutase; Trx: tiorredoxina; GSH:
glutationa reduzida; GSSG: glutationa oxidada (dímero). (BARBOSA, 2006).....
68
ix
Figura 3.2- Ciclo redox parcial das quinonas.(FERREIRA, 2003).......................
69
Figura 3.3- Mecanismo de oxidação do ascorbato por espécies radicalares
(BARBOSA, 2006)................................................................................................
70
Figura 3.4- Gráfico corrente versus tempo para coulometria de potencial
controlado. Adaptado de SKOOG, 2000................................................................
71
Figura 3.5- Estruturas de Mn(III)porfirinas cuja atividade catalase foi avaliada
nesse estudo............................................................................................................
72
Figura 3.6- Estruturas de outras classes de compostos com propriedades redox,
cuja atividade catalase foi avaliada nesse estudo...................................................
73
Figura 3.7 - Gráfico corrente vs tempo para cálculo da taxa de evolução de O2
(mol/L s-1). Condições: [CAT] = 1,5 x 10-10 mol/L, [H2O2]0 = 1 mmol/L, Tris 50
mmol/L, EDTA 0.1 mmol/L, pH = 7.4..................................................................
75
5+
Figura 3.8 - Atividade catalase da (a) MnTnBuOE-2-PyP e da (b) enzima
catalase. Para a catalase: coeficiente angular (kobs) = 7,32 × 102 , o que resulta
em kcat (=coeficiente linear × 2/0.001) de 1,46 × 106 mol/L s-1. Para a MnP,
coeficiente angular (kobs) = 4,6 x 10–2, o que resulta em kcat (=coeficiente
angular × 2/0.001) de 88.47 mol/L s-1....................................................................
76
x
G. LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1- Matriz de planejamento de um experimento fatorial 22.....................
18
Tabela 2.2- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 1°
Experimento............................................................................................................
32
Tabela 2.3- Matriz de Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 1°
Experimento com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.a......
32
Tabela 2.4- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Fracionário 27-3IV do 1° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP..........
33
Tabela 2.5- Condições das reações exploratórias com os níveis normalizados de
concentração de pirrol e relação aldeído/pirrol com os rendimentos (não isolados)
de H2T-2-PyP.........................................................................................................
36
Tabela 2.6- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 2°
Experimento............................................................................................................
38
Tabela 2.7- Matriz de Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 2°
Experimento com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP........
39
Tabela 2.8- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Fracionário 27-3 Iv do 2° experimento para a síntese da H2T-2-PyP..........
40
Tabela 2.9- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 25-1IV do 3°
Experimento.............................................................................................................
42
Tabela 2.10- Matriz de Planejamento Fatorial Fracionário 25-1IV do 3°
Experimento..............................................................................................................
43
Tabela 2.11- Condições das reações-teste e seus respectivos rendimentos.............
44
Tabela 2.12- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 2
4-1
IV
do 4°
Experimento para a síntese da H2T-2-PyP...............................................................
45
Tabela 2.13- Matriz do Planejamento Fatorial Fracionário 24-1IV do 4°
Experimento com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP..........
45
Tabela 2.14- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Fracionário 24-1IV do 4° experimento para a síntese da H2T-2-PyP.............
46
3
Tabela 2.15- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 2 do 5°
Experimento.............................................................................................................
48
xi
Tabela 2.16- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 23 do 5° Experimento
com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP...............................
48
Tabela 2.17- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Completo 23 do 5° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP....................
50
Tabela 2.18- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 22 do 6°
Experimento para a síntese da H2T-2-PyP...............................................................
52
Tabela 2.19- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 do 6° Experimento
com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP...............................
52
Tabela 2.20- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Completo 22 do 6° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP...................
53
3
Tabela 2.21- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 2 do 7°
Experimento............................................................................................................
56
Tabela 2.22- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 23 do 7° Experimento
com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP..............................
56
Tabela 2.23- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Completo 23 do 7° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP...................
57
2
Tabela 2.24- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 2 do 8°
Experimento.............................................................................................................
59
Tabela 2.25- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 do 8° Experimento
com os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.............................
59
Tabela 2.26- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento
Fatorial Completo 23 do 8° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP................
60
Tabela 3.1-. Atividade catalase (kcat (H2O2) e atividade de dismutação do
superóxido kcat(O2•–) de Mn-porfirinas...................................................................
77
Tabela 3.2 Atividade catalase (log kcat (H2O2)) e atividade de dismutação do
superóxido kcat(O2•–) de diferentes porfirinas e compostos de Mn.........................
77
xii
H. ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO
Com o objetivo de melhorar a distribuição do conteúdo, bem como de facilitar
a leitura, este trabalho foi dividido em quatro capítulos, conforme descrito a seguir.
No Capítulo 1 (Aspectos Gerais da Química de Porfirinas) são apresentados
alguns aspectos das porfirinas, métodos de síntese e aplicações com ênfase em sistemas
biomiméticos das enzimas superóxido dismutases (SOD), citocromos P450 e catalase.
Neste capítulo, estão apresentados também os objetivos gerais da dissertação.
O Capítulo 2, intitulado “Otimização da síntese e purificação da mesotetraquis(2-piridil)porfirina”, revisa brevemente a relevância da classe das Npiridilporfirinas sobre sistemas derivados das meso-tetrafenilporfirinas (H2TPP), e
destaca as limitações das rotas de síntese da H2T-2-PyP. Este Capítulo destaca os
esforços para otimização da síntese e isolamento da H2T-2-PyP utilizando ferramentas
quimiométricas.
O Capítulo 3 (Atividade de Mn(III) e Fe(III) N-alquilpiridilporfirinas na
dismutação de peróxido de hidrogênio: Modelos da enzima Catalase), apresenta o
estudo da atividade de catalase de uma série de complexos comumente empregados
como moduladores redox de estresse oxidativo, incluindo Fe(III) e Mn(III) Nalquilpiridilporfirinas derivadas da H2T-2-PyP.
No Capítulo 4 (Considerações Finais e Perspectivas), as conclusões gerais da
dissertação e sugestões para a continuidade deste trabalho são apresentadas.
No Capítulo 5 são reunidas todas as referências citadas ao longo da
Dissertação.
xiii
CAPÍTULO 1:
Aspectos Gerais da
Química de Porfirinas
CAPÍTULO 1
1 Aspectos Gerais da Química de Porfirinas
1.1 Porfirinas
Porfirinas são compostos macrocíclicos tetrapirrólicos altamente conjugados
derivados da porfina (Fig. 1.1). Tais compostos estão presentes em diferentes proteínas
exercendo funções indispensáveis para o organismo, tais como o transporte e o
armazenamento
de
oxigênio
promovidos
pela
hemoglobina
e
mioglobina,
respectivamente, o transporte de elétrons mediado por citocromos a, b e c (entre outros)
e a oxidação de substratos orgânicos e inorgânicos catalisada por enzimas
monooxigenases, como citocromos P450 e peroxidases, e a dismutação de peróxido de
hidrogênio catalisada pela catalase (MILGROM, 1997; EICHER; HAUPTMANN,
2003).
Figura 1.1 - Estrutura da porfina.
A nomenclatura adotada para porfirinas está baseada nas posições dos grupos
substituintes no anel porfirínico. Quando os átomos de hidrogênio dos carbonos das
posições 5, 10, 15 e 20 do anel porfirínico são substituídos por grupamentos orgânicos,
estas são chamadas de meso-porfirinas ou porfirinas meso substituídas (Fig. 1.1). As
posições 2, 3, 7, 8, 12, 13, 17 e 18 correspondem aos carbonos β pirrólicos. As
porfirinas que apresentam átomos de hidrogênio ligados aos nitrogênios centrais 21 e 23
são denominadas de base livre. Em meio fortemente ácido, ocorre a incorporação de
prótons aos nitrogênios 22 e 24, originando uma porfirina diácida (WIJESEKERA;
DOLPHIN, 1994; HAMBRIGHT; FLEISHER, 1970).
2
CAPÍTULO 1
Dos 22 elétrons π no macrociclo da porfirina, 18 participam na deslocalização.
Este sistema eletrônico altamente conjugado permite que as transições π–π* encontremse na faixa do visível e ultravioleta próximo, o que torna a espectroscopia de absorção
no visível uma ferramenta poderosa para investigar a estrutura das porfirinas
(WIJESEKERA; DOLPHIN, 1994). A substituição dos átomos de hidrogênio centrais
das porfirinas base livre por um cátion metálico dá origem às metaloporfirinas
(MILGROM, 1997).
Espectros típicos de uma porfirina base livre e de uma metaloporfirina são
mostrados na Figura 1.2. A maioria das porfirinas base livre apresenta uma banda de
absorção bastante intensa ( ~ 105 L mol-1 cm-1), em comprimentos de onda próximos a
410 nm, denominada de banda B ou Soret. O outro conjunto de bandas é constituído por
quatro bandas de menor intensidade denominadas de bandas Q, na região entre 500-700
nm (WIJESEKERA; DOLPHIN, 1994). O aumento de simetria de D2h na base livre
para D4h em uma metaloporfirina ou porfirina diácida (WIJESEKERA; DOLPHIN,
1994) é acompanhada por uma redução no número de bandas Q nesses sistemas. Em
geral, o espectro de metaloporfirinas ou porfirinas diácidas apresenta uma banda intensa
B (Soret) de 420-460 nm e duas bandas Q na região entre 550-600 nm.
Absorbância
1,0
Soret
b)
1,0
Absorbância
a)
0,5
Bandas do vísivel
IV
III II
400
500
nm
600
0,5

I

0,0
0,0
300
Soret
700
300
400
500
/nm
600
700
Figura 1.2 - Espectros UV-vis típicos de (a) uma porfirina base livre e (b) uma
metaloporfirina.
3
CAPÍTULO 1
1.2 Métodos Clássicos de Síntese de Porfirinas
Porfirinas meso-substituídas foram sintetizadas pela primeira vez em 1936, por
Rothemund, dentre as quais se destaca a meso-tetrafenilporfirina (H2TPP), obtida
através do aquecimento de pirrol e benzaldeído em piridina a 220 °C durante 48 horas
em condições anaeróbicas (Fig. 1.3). Os produtos foram obtidos com rendimentos em
torno de 5% e encontravam-se contaminados com a respectiva clorina (2,3dihidroporfirina) (ROTHEMUND, 1939).
Figura 1.3 - Esquema de síntese da H2TPP a partir das condições propostas por
Rothemund.
Várias propostas estão sendo investigadas para aprimorar o processo de síntese
destes compostos de modo que melhores rendimentos sejam obtidos e a eliminação de
subprodutos contaminantes seja eficaz. Adler e Longo alteraram as condições de
condensação, propondo uma reação em meio ácido e condições aeróbicas. Assim, a
H2TPP foi sintetizada a partir da condensação de pirrol e benzaldeído sob refluxo em
ácido propiônico por 30 minutos. Embora o rendimento da H2TPP tenha sido melhorado
(~20% de rendimento isolado), os baixos rendimentos e a presença de contaminantes,
tais como polímeros de pirrol e clorina, dificultavam a purificação (ADLER et al.,
1967).
Duas décadas depois, Lindsey e colaboradores (LINDSEY et al., 1987)
desenvolveram um novo método de síntese baseado nas condições reacionais de Adler e
Longo, porém em duas etapas: condensação seguida de oxidação (Fig. 1.4). Apesar
desse método ser executado em dois passos distintos, o processo é realizado em um
único recipiente, sem a necessidade de qualquer procedimento de purificação entre as
duas etapas. A primeira etapa consiste na condensação anaeróbia de pirrol e aldeído em
4
CAPÍTULO 1
diclorometano seco, na presença de um catalisador ácido, tal como BF3, ácido
trifluoroacético (TFA) ou BCl3, à temperatura ambiente, para dar origem ao
porfirinogênio que é conduzido à segunda etapa sem isolamento. O porfirinogênio é
oxidado à porfirina in situ por oxidantes tais como p-cloranil ou 2,3-dicloro-5,6dicianobenzoquinona (DDQ). Os rendimentos obtidos para H2TPP encontravam-se em
torno de 40%.
R
Ar
N
H
N
R'
Ar
Ar
ArCHO +
N
H
N
H
N
H
Ar
OH
H
3
H
NH HN
Ar
NH
Oxidação
N
Ar
Ar
NH HN
H
N
H
Ar
H
N
Ar
Ar
CONDENSAÇÃO
Ar
H
N
H
HN
Ar
Ar
OH
H
n
Oxidação
N
Ar
N
Ar
n
H
Figura 1.4 - Esquema proposto para a formação da porfirina e principais sub-produtos
via Método de Lindsey em duas etapas.
Mesmo com o constante esforço dedicado ao desenvolvimento de rotas de
síntese de porfirinas, os baixos rendimentos ainda constituem uma característica
marcante na obtenção destes compostos. Isso se deve a problemas relacionados às
etapas de condensação e ciclização do anel, na qual é necessário 4 moléculas de pirrol e
4 de aldeído, se juntarem alternadamente, para permitir a formação do anel porfirínico.
Quando isso não ocorre, observa-se a presença de polímeros de pirrol, ocasionando a
baixa de rendimentos e dificuldade na purificação e isolamento da porfirina.
As condições dos métodos tradicionais, que incluem os procedimentos de
Rothemund, Adler-Longo, Lindsey, não são universais e precisam ser geralmente
adaptadas caso a caso. Por exemplo, enquanto a H2TPP pode ser obtida por qualquer
dos três métodos clássicos (embora com rendimentos bastante diferentes entre si), a 2N-piridilporfirina (H2T-2-PyP) (Fig. 1.5) tem sido preparada apenas pelo método de
Adler-Longo com rendimentos geralmente inferiores a 6 %. Com o uso do método de
5
CAPÍTULO 1
Lindsey para a síntese da H2T-2-PyP, nem sequer traços dessa porfirina foi detectado.
Deve-se ressaltar que a H2T-2-PyP tem se destacado como uma estrutura de partida para
a síntese de modelos biomiméticos hidrossolúveis importantes para enzimas superóxido
dismutases, citocromos P450 e catalase que é o tema de estudo do Capítulo 3.
Figura 1. 5 - Estrutura da H2T-2-PyP.
1.3 Porfirinas em Sistemas Biomiméticos
Devido à grande ocorrência e importância biológica das porfirinas, são muitos
os trabalhos desenvolvidos na tentativa de sintetizar porfirinas que mimetizem as
características eletrônicas, estruturais ou de reatividade dos sistemas biológicos
(MEUNIER, 1992; MILGRON, 1997). Dentre esses estudos, pode-se citar o interesse
em desenvolver sistemas modelo de SOD, de enzimas monooxigenases, tais como os
citocromos P450 e catalase.
1.3.1 Superóxido dismutases (SOD)
Metaloporfirinas estão sendo exploradas no tratamento de patologias em que o
desequilíbrio redox associado ao estresse oxidativo resulta em danos oxidativos a
biomoléculas e compromete a integridade metabólica de células, tecidos e/ou órgãos
(TOVMASYAN et al., 2014, BATINIC-HABERLE et al., 2011, BATINIC-HABERLE
et al., 2010). Dentre as espécies envolvidas no estresse oxidativo, pode-se destacar o
superóxido (O2•–), o peróxido de hidrogênio (H2O2), o óxido nítrico (•NO) e o
peroxinitrito (ONOO–). Essas espécies têm sido amplamente reconhecidas como
espécies que afetam o equilíbrio redox celular e desempenham um papel central na
maioria dos processos de estresse oxidativo e são comumente chamadas espécies
6
CAPÍTULO 1
reativas de oxigênio e/ou nitrogênio (ROS/RNS, do inglês reactive oxygen/nitrogen
species) (BATINIC-HABERLE et al., 2011).
Embora algumas dessas espécies estejam envolvidas em processos fisiológicos
importantes (por exemplo, controle da pressão arterial), a produção exacerbada e
descontrolada de ROS/RNS resulta em oxidação/nitração de proteínas, lipídeos, ácidos
nucléicos, entre outros, alterando a integridade física da célula, seus processos
metabólicos e as vias de transdução de sinal celular; isto conduz eventualmente a
condições patológicas (BATINIC-HABERLE et al., 2011). Uma vez que ROS/RNS são
sensíveis à modulação redox, há um grande interesse no desenvolvimento de complexos
metálicos redox-ativos como fármacos em potencial.
As enzimas superóxido dismutase têm papel essencial no controle do nível
celular de ROS (via modulação direta de O2•–) e de RNS (via modulação indireta de
ONOO–) e, por conseguinte, na regulação do nível de estresse oxidativo de células,
órgãos e tecidos (BATINIC-HABERLE et al., 2009). Essas enzimas existem em quatro
isoformas: Cu,ZnSOD, MnSOD, FeSOD e NiSOD, porém apenas duas isoformas estão
presentes em humanos (CuZnSOD e MnSOD).
O controle de O2•– nos sistemas biológicos é realizado por meio de uma rápida
dismutacão do O2•– em O2 e H2O2 (WAGNER et al., 1993) como mostrado na Figura
1.6.
Figura 1.6- Dismutação do superóxido pelas enzimas SOD.
Uma vez que o estresse oxidativo pode ser resultado da inativação ou baixa
expressão dessas enzimas, compostos de massa molecular pequena que apresentem
atividade SOD elevada (constante de velocidade para dismutacão do superóxido, kcat),
seriam, potencialmente, candidatos excelentes a fármacos para o controle de patologias
e/ou disfunções associadas a desequilíbrios celulares oxidativos (BATINIC-HABERLE
et al., 2011).
7
CAPÍTULO 1
A dismutação do superóxido pelas enzimas SOD ocorre com constante de
velocidade (log kcat) de aproximadamente 9 e potencial de redução (E½) de
aproximadamente +300 mV vs NHE (BATINIC-HABERLE et al., 2013). Embora as
enzimas SOD não contenham o anel porfirínico como grupo prostético, o planejamento
de modelos biomiméticos à base de porfirinas foi estimulado pela possibilidade de
modulação do potencial redox de metaloporfirinas sintéticas a partir da escolha
adequada dos substituintes no anel porfirínico dos modelos (BATINIC-HABERLE et
al., 2011). A correlação entre as propriedades redox e a atividade catalítica (log kcat) de
metaloporfirinas neutras, aniônicas e catiônicas foi investigada (REBOUÇAS et al.,
2008). Observou-se que as Mn-porfirinas catiônicas dão origem a mímicos promissores
de SOD, sendo alguns complexos capazes de oxidar e reduzir o superóxido com
constantes de velocidade de dismutação próximas às da enzima SOD (Fig. 1.7).
Porfirinas
catiônicas
9
SOD
Mn
8
MnTE-2-PyP5+
5+
MnTnHex-2-PyP
M40403
7
[MnTCl2SPP]
3-
6
MnCl2
MnBr8T-2-PyP+
[MnBr8TSPP]3[MnBr8TCPP]3-
MnIIIP5+/MnIIP4+
MnIIIP+/MnIIP
MnIIIP3-/MnIIP4-
log kcat
O2
MnSalen+
5
[MnTF2SPP]
3-
O2
Porfirinas
aniônicas
4
[MnTSPP]3[MnTBAP]3-
3
800
600
400
200
Mn
x
0
-200
E1/2 /mV vs NHE
Figura 1.7- Atividade SOD influenciada pelos efeitos eletrostáticos/termodinâmicos na
relação estrutura-atividade entre log kcat (O2•–) vs. potenciais de redução MnIII/MnII de
algumas Mn-porfirinas, MnCl2, aminas policíclicas(M40403) e MnSalen e os potencias
de redução das enzimas SOD e das espécies envolvidas nas semi-reacões de dismutacão
do superóxido. Adaptado de Rebouças et al.(2008).
1.3.2 Citocromos P450
Os citocromos P450 constituem uma grande família de hemeproteínas,
encontradas em todas as formas de vida (bactérias, fungos, plantas, mamíferos, entre
outros). Nos mamíferos, eles estão presentes em vários tecidos e órgãos, principalmente
8
CAPÍTULO 1
no fígado, desempenhando o papel fundamental no metabolismo de moléculas
endógenas e exógenas (MEUNIER et al., 2004; HRYCAY, BANDIERA 2012). O sítio
ativo destas enzimas constitui-se em uma cavidade hidrofóbica contendo um grupo
prostético, a Fe(III) protoporfirina IX (Fig. 1.8). Essas enzimas dão origem a oxidantes
potentes, sendo capazes de promover reações de oxidação em seres vivos com bons
rendimentos, seletividade e estereoespecificidade (MEUNIER et al., 2004).
Figura 1.8 - Ferro(III) protoporfirina IX: grupo prostético das hemeproteínas e
citocromos P450.
Desde a sua descoberta, em meados da década de 60, os citocromos P450 têm
atraído grande interesse de pesquisadores devido à variedade de reações de oxidação
que estas enzimas conseguem catalisar de modo eficiente e seletivo. Em particular,
chama a atenção o fato desses sistemas biológicos serem capazes de promover a
ativação de ligações C-H inertes de alcanos utilizando oxigênio molecular sob pressão e
temperatura ambiente. Dentre essas reações catalisadas pelos citocromos P450,
destacam-se as hidroxilações alifáticas, hidroxilações aromáticas, epoxidações,
sulfoxidação, N-desalquilações, O-desalquilações, S-desalquilações, N-oxidação e
desalogenação (MEUNIER et al., 1992; CHE; HUANG, 2009; SUSLICK, 2000).
O ciclo catalítico desta família de enzimas tem sido intensamente estudado há
mais de três décadas, a partir de diferentes estudos baseados em sistemas biológicos,
sínteses de sistemas modelo e análises espectroscópicas (Figura 1.10). Várias propostas
têm sido descritas (MEUNIER et al., 2004; DOLPHIN et al., 1997; NAKAGAKI et al.,
2006).
9
CAPÍTULO 1
O ciclo catalítico (Fig. 1.9) envolve a redução do metal do estado férrico
(estado fundamental) para ferroso (etapa 2), sendo este, capaz de se ligar ao oxigênio
molecular. Em seguida (etapa 3), ocorre a coordenação do oxigênio molecular ao FeII
que por transferência eletrônica pode ser descrita como uma espécie Fe III coordenada ao
íon superóxido. Na etapa 5 ocorre a redução do sistema por um segundo elétron,
formando um intermediário chamado de complexo peróxidoférrico. Na etapa 5 acreditase que se forme uma espécie intermediaria de alta valência, um complexo radical ferril
porfirina π-cátion, [FeIV(O)(P)]+ ou seu análogo eletrônico [FeV(O)(P)]+, freqüentemente
denominada espécie ferro-oxo. Acredita-se que este complexo seja a espécie catalítica
ativa, responsável pela oxidação de substratos pelo citocromos P450.
Figura 1.9 - Representação esquemática do mecanismo de reação para os citocromos
P450.
Inúmeros estudos com compostos modelo à base de Fe-porfirinas (FePs) e Mnporfirinas (MnPs) sintéticas, em sistema homogêneo ou heterogeneizado em suportes
inertes, têm sido desenvolvidos (MEUNIER et al., 2004). Esses estudos mostram que
Fe- e Mn-porfirinas meso-aril substituídas são capazes de estabilizar, na ausência da
parte protéica, característica de reatividade dos citocromos P450, incluindo as espécies
ativas de alta valência metal-oxo. Com isso, observa-se que esses sistemas
10
CAPÍTULO 1
biomiméticos podem atuar como catalisadores de reações de oxidação típicas dos
citocromos P450 de forma eficiente e seletiva, sob condições brandas, utilizando
doadores de oxigênio, tais como: iodosobenzeno (PhIO), peróxido de hidrogênio,
hidroperóxidos, hipoclorito e persulfato, entre outros (MEUNIER, 1992; SUSLICK,
2000; EZHOVA; JAMES, 2003).
1.3.3 Catalase
Enzimas que contêm grupos heme, tais como: catalase, peroxidase e
citocromos P450 utilizam o oxigênio e suas formas parcialmente reduzidas para a
oxidação de substratos (catalase e peroxidase) ou a incorporação de átomos de oxigênio
em substratos orgânicos (citocromo P450). A maioria das enzimas catalase apresenta
como grupo prostético, a ferro (III) protoporfirina IX e, por essa razão, muitas
metaloporfirinas, com diferentes substituintes e íons metálicos centrais, tem sido
sugeridas como modelos biomiméticos de catalase (LIU et al., 2002). O planejamento
de modelos porfirínicos de catalase constitui o tema central do Capítulo 3, na qual
aspectos mais relevantes que norteiam os estudos mais recentes nesse tema serão
apresentados em maiores detalhes.
A onipresença da catalase e a facilidade de estudo envolvendo um substrato
barato e prontamente disponível, o H2O2, se combinam para torná-la um alvo atraente
para bioquímicos e biólogos moleculares (CHELIKANI et al., 2003).
As catalases são enzimas que, ao degradar o peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio, impedem o dano oxidativo celular (Eq. 1.1).
(1.1)
Essas enzimas estão divididas em 3 classes distintas a partir da seqüência de
aminoácidos e características estruturais e de reatividade. A classe mais comum na
natureza e que tem sido extensivamente caracterizada é a catalase monofuncional,
contendo o grupo heme. A segunda classe, menos comum, é a catalase bifuncional
(catalase-peroxidase) que também contém grupo heme. E por fim, a terceira classe é
constituída de grupos não heme e são conhecidas como Mn-catalases (CHELIKANI
et al., 2003).
11
CAPÍTULO 1
As reações com catalases com grupo heme (monufuncional e bifuncional)
apresentam em comum duas etapas de mecanismo para a degradação do H2O2 (Eqs.
1.2 e 1.3). Na etapa 1, a ligação O-O do peróxido é clivada de modo heterolítico,
resultando em água e em um complexo oxidado por dois elétrons, sendo um elétron
do ferro e um segundo elétron do anel da porfirina, formando o composto
oxoferril(IV) com o radical porfirínico  cátion (composto 1). Na etapa 2, a segunda
molécula de peróxido de hidrogênio é utilizada como um redutor do composto 1 para
regenerar o estado inicial da enzima, formando água e oxigênio.(CHELIKANI et al.,
2003; BERTINI et al., 2007; ALFONSO-PRIETO et al., 2009).
(1.2)
(1.3)
Para a classe das catalases-peroxidases (bifuncional), o mecanismo para a
dismutação do H2O2 tem mais duas etapas (Equações 1.4 e 1.5) (CHELIKANI et al.,
2003; ALFONSO-PRIETO et al., 2009). Na etapa 3 (Eq. 1.4), o substrato é reduzido,
doando um elétron para o anel porfirínico, o que dá origem ao composto 2 e ao
substrato na forma radicalar. Na última etapa (Eq. 1.5), o centro (FeIV=O) do
composto 2 é reduzido por uma segunda molécula do substrato, regenerando o estado
inicial da enzima e formando H2O (BERTINI et al., 2007)
(1.4)
(1.5)
O mecanismo catalítico detalhado para a catalase esta apresentado na Figura
1.10. A formação do composto 1 é similar ao das peroxidases, exceto pelo sítio ativo.
O que separa as catalases das peroxidases é que o H2O2 é o redutor do composto 1,
formando H2O e O2. As catalases não formam o composto 2 como parte do ciclo
catalítico normal (BERTINI et al., 2007).
12
CAPÍTULO 1
Figura 1.10 - Proposta do mecanismo catalítico da catalase. (BERTINI et al., 2007).
1.4 Objetivos gerais
As metaloporfirinas catiônicas derivadas das N-piridilporfirinas têm sido
intensamente estudadas como modelos de diversas enzimas, na qual se pode destacar: a
SOD, citocromos P450 e catalases. Dentro desse contexto, esse trabalho tem como
objetivos gerais:


A otimização da síntese da H2T-2-PyP.
Estudo da atividade catalase de porfirinas de Mn e Fe derivadas da H2T-
2-PyP e alguns compostos biomiméticos correlatos.
13
CAPÍTULO 2:
Otimização da síntese e
purificação da mesotetraquis(2-piridil)porfirina
CAPÍTULO 2
2 Otimização da síntese e purificação da
meso-tetraquis(2-piridil)porfirina
2.1 Introdução
As N-piridilporfirinas podem existir na forma de três isômeros – orto (H2T-2PyP), meta (H2T-3-PyP) e para (H2T-4-PyP) – dependendo da posição do nitrogênio do
grupo piridil (Fig. 2.1). Essas porfirinas neutras são hidrofóbicas e solúveis em meio
orgânico, porém em meio ácido (pH < 4), ocorre a protonação dos átomos de nitrogênio
dos grupos piridilas, resultando em um sal hidrofílico. O efeito indutivo retirador de
elétrons sobre o macrociclo associado à carga positiva, resultante da protonação ou da
alquilação do átomo de nitrogênio nos grupos piridilas, torna essas porfirinas mais
ácidas e com propriedades bem distintas quando comparada com as porfirinas derivadas
da meso-tetrafenilporfirina (H2TPP) (KALYANASUNDARAM, 1984).
Figura 2.1- Isômeros das N-piridilporfirinas.
As N-piridilporfirinas constituem uma classe importante de porfirinas para o
desenho de modelos biomiméticos por darem origem a sistemas hidrossolúveis. Embora
os derivados do isômero para (H2T-4-PyP) sejam tradicionalmente os mais utilizados, o
isômero orto (H2T-2-PyP) tem se destacado, nas últimas décadas, como uma porfirina
atraente para o “design” de catalisadores biomiméticos para reações de oxidação e para
o desenvolvimento de fármacos em potencial (IAMAMOTO et al., 1994; IAMAMOTO
et al., 1995; ABATTI et al., 1997; REBOUÇAS et al., 2002, BATINIC-HABERLE et
al, 2011).
A funcionalização da H2T-2-PyP via alquilação dos grupos piridilas e/ou
halogenação das posições -pirrólicas deu origem a compostos que, após metalação
15
CAPÍTULO 2
com Mn ou Fe, se mostraram excelentes modelos dos citocromos P450 para a
hidroxilação do ciclohexano ou epoxidação do ciclohexeno, mais eficientes que o
análogo precursor MnT-2-PyPCl. Alguns desses complexos foram estudados tanto em
meio homogêneo como em sistemas heterogeneizados em suportes inertes (sílicas e
vermiculita) ou na forma de filmes Langmuir-Blodgett (IAMAMOTO et al., 1994;
IAMAMOTO et al., 1995; ABATTI et al., 1997; REBOUÇAS et al., 2002, PINTO,
2013).
Os complexos de Mn(III) derivados das N-piridilporfirinas alquiladas
(BATINIC-HABERLE et al., 2011) e/ou halogenadas (KACHADOURIAN et al., 1999;
DeFREITAS-SILVA et al., 2008), em especial os derivados do isômero orto MnTE-2PyP5+, MnTnHex-2-PyP5+ (Fig. 2.2) apresentam-se como uns dos melhores modelos
biomiméticos das enzimas SOD e têm se destacado, em estudos pré-clínicos, como uma
das classes mais importantes de reguladores redox catalíticos (BATINIC-HABERLE et
al., 2009). Esses compostos têm se mostrado, por exemplo, capazes de minimizar os
efeitos nocivos e danos causados por radiação (ação radioprotetora), de inibir o
crescimento de tumores (via ação antiangiogênica), de aumentar a eficácia de
radioterapia e hipertermia no tratamento de câncer (ação sinergética) e de proteger
órgãos e tecidos em transplantes e/ou processos de isquemia/reperfusão (BATINICHABERLE et al., 2010; BATINIC-HABERLE et al., 2011). Alguns desses sistemas
derivados das N-piridilporfirinas encontram-se sob análise do “Food and Drug
Administration” (FDA, agência reguladora de medicamentos dos Estados Unidos), para
testes clínicos em humanos (BATINIC-HABERLE et al., 2011).
MnTE-2-PyP5+
MnTnHex-2-PyP5+
Figura 2.2 - Estruturas das Mn-porfirinas catiônicas (a) MnTE-2-PyP5+ e (b)
MnTnHex-2-PyP5+derivadas da H2T-2-PyP e mímicos de SOD potentes.
16
CAPÍTULO 2
A síntese destas metaloporfirinas, relevantes como modelos biomiméticos,
requer a derivatização da porfirina anfifílica meso-tetraquis(2-piridil)porfirina (H2T-2PyP), cujo procedimento de obtenção, a partir de pirrol e 2-piridinacarboxaldeído,
permanece pouco estudado e não otimizado. Baixos rendimentos (~1-5%) e baixa
reprodutibilidade são comumente reportados para a síntese da H2T-2-PyP (KIM et
al.,1971; IAMAMOTO et al., 1994). A exploração do potencial desses sistemas à base
de H2T-2-PyP em química biomimética e, em particular, as aplicações farmacológicas e
terapêuticas de derivados da H2T-2-PyP se encontram limitadas pelos baixos
rendimentos e por não haver qualquer estudo sistemático do efeito das condições de
reação no rendimento da síntese do composto de partida H2T-2-PyP.
Nesse contexto, a otimização da metodologia de síntese da H2T-2-PyP se
mostra uma necessidade atual em virtude da potencialidade dos seus derivados. Com
isso, propõe-se neste trabalho um estudo sistemático visando a otimização das etapas de
síntese e purificação da H2T-2-PyP usando técnicas quimiométricas.
2.1.1 Planejamentos Fatoriais
Dentre as várias técnicas quimiométricas para planejamento e otimização de
experimentos, encontram-se os planejamentos fatoriais e as análises por superfície de
resposta. O planejamento fatorial é um método matemático para o estudo e avaliação
tanto de fatores isolados como da interação entre eles, que podem apresentar alguma
influência sobre as características de um produto. Ele é classificado como um método
do tipo simultâneo, onde todas variáveis são avaliadas ao mesmo tempo (BARROS
NETO et al., 2010).
Para realizar um planejamento fatorial, escolhem-se as variáveis a serem
estudadas e efetuam-se ensaios em diferentes níveis. Um experimento fatorial com k
fatores em dois níveis é denominado de planejamento fatorial 2k onde envolve o estudo
de k variáveis em apenas dois níveis. O processo experimental desta técnica consiste em
realizar testes com cada uma das combinações da matriz experimental, para em seguida,
determinar e interpretar os efeitos principais e de interação dos fatores investigados e,
assim, poder identificar as melhores condições experimentais (MONTGOMERY et al.,
2001).
Para ilustrar o procedimento dessa técnica, considere um experimento com dois
fatores (x1, x2) em dois níveis (–1, +1). Assim, a matriz de planejamento para o
17
CAPÍTULO 2
experimento fatorial 22 é representada na Tabela 2.1. As respostas de cada ensaio são
descritas na coluna yi.
Tabela 2.1- Matriz de planejamento de um experimento fatorial 22
Ensaios
Fatores
x1
x2
Respostas (yi)
1
–1
–1
y1
2
+1
–1
y2
3
–1
+1
y3
4
+1
+1
y4
Na matriz de planejamento, as colunas representam o conjunto de fatores
investigados (x1, x2, x3, ..., xk), e as linhas representam os diferentes níveis ou as
combinações dos fatores em níveis codificados –1 (mínimo) e +1 (máximo) (DEVOR et
al., 1992). Com esse tipo de planejamento, é possível determinar os efeitos principais e
de interação que as variáveis independentes produzem nas respostas. Esses efeitos
podem ser calculados utilizando diferentes softwares, tais como, planilha EXCEL,
STATISTICA, MINITAB, etc.
Para uma grande quantidade de fatores, a realização de um planejamento
completo, necessita de um grande número de ensaios, o que representa, na maioria dos
casos, a sua principal desvantagem (MONTGOMERY, 2003; BARROS NETO et al.,
2010). Desta maneira, faz-se necessário o planejamento fatorial fracionário que é uma
técnica de planejamento experimental que usa um fator de redução de forma a limitar o
número de ensaios a um número mais baixo do que o obtido pelo planejamento fatorial
completo (BARROS NETO et al, 2010). Assim, é possível obter informações daqueles
efeitos mais importantes e tirar, na maioria das vezes, as mesmas conclusões caso fosse
realizado um fatorial completo (MONTGOMERY; RUNGER 2003). Montgomery
(2001) ressalta a importância da utilização de um fatorial fracionário quando o número
de fatores aumenta, pois também ocorre um aumento no número de efeitos de ordens
superiores, cuja importância tende a ser menor do que efeitos de ordens inferiores. O
uso principal de um planejamento fatorial fracionário é para selecionar quais fatores tem
os efeitos significativos. Na etapa inicial de um planejamento com muitas variáveis
independentes, as mais importantes são detectadas e um novo planejamento é realizado
considerando apenas as variáveis de maiores efeitos. Montgomery e Runger (2003)
descrevem como exemplo, um planejamento fatorial completo de 4 fatores (24), sendo a
18
CAPÍTULO 2
necessária a realização de 16 ensaios. Porém, se, por algum motivo, não se puder
realizar todos os ensaios, deve-se pegar uma meia-fração que corresponde a 8 ensaios,
chamando-se esse planejamento de 24-1,onde 1 no expoente significa meia-fração.
A resolução de um planejamento é representada por um numeral romano
subscrito, por exemplo, 23-1III representa o planejamento fatorial de resolução III de
fração um meio do planejamento 23 (MONTGOMERY, 2001). Os planejamentos de
resolução III, IV e V são particularmente importantes e são detalhados a seguir
(MONTGOMERY; RUNGER, 2003):

Planejamento de resolução III: estes são planejamentos nos quais os
efeitos principais estão confundidos com interações de segunda ordem e
interações de segunda ordem podem estar confundidas entre si.

Planejamento de resolução IV: estes são planejamentos nos quais
nenhum efeito principal está confundido com qualquer interação de
segunda ordem, mas sim com as interações de três fatores, que em
principio
são
menos
significativas,
fornecendo
assim
ótimas
aproximações dos efeitos principais na resposta.

Planejamento de resolução V: nestes planejamentos nenhum efeito
principal ou interação de segunda ordem está associado com qualquer
outro efeito principal ou interação de segunda ordem, mas interações de
segunda ordem estão associadas com interações de terceira ordem.
2.2 Objetivos
Neste capítulo descreve-se a otimização da síntese da meso-tetraquis(2piridil)porfirina (H2T-2-PyP) de modo sistemático via condensação de pirrol e 2piridinacarboxaldeído em meio ácido e a investigação de procedimentos de isolamento
da porfirina do meio de reação. Dentre os objetivos específicos podem-se destacar:
1) O desenvolvimento de uma estratégia de quantificação espectofotométrica
da H2T-2-PyP, sem necessidade de isolamento, para possibilitar uma análise rápida da
produção de H2T-2-PyP.
2) A otimização da síntese da H2T-2-PyP em pequena escala (3 mL), usando
técnicas quimiométricas de planejamento dos experimentos, tais como planejamentos
fatoriais, fatoriais fracionados e análise por superfície de resposta.
3) Estudos de estratégias de isolamento da H2T-2-PyP em escala preparativa
(50 ou 100 mL) sob condições ótimas.
19
CAPÍTULO 2
2.3 Parte Experimental
2.3.1 Reagentes e Solventes
Pirrol (Sigma-Aldrich), 2-piridinacarboxaldeído (Alfa Aesar), NaOH (Vetec),
CHCl3 (Vetec), acetato de zinco dihidratado (Vetec), ácido butírico (Carlo Erba), ácido
acético (Neon), MeOH (Neon), o ácido clorídrico (Neon), NaCl (FMaia), acetato de
etila (FMaia); hexano (Synth), iodo (Reagen), KI (Vetec), KIO3 (Carlo Erba), Na2S2O3
(Vetec) e amido (Reagen) foram adquiridos em grau P.A. e utilizados sem purificação
prévia. A concentração de oxidante ativo nas soluções comerciais de peróxido de
hidrogênio (30%, Vetec) foi determinada periodicamente por iodometria, através de
titulações com uma solução padrão de KIO3 a 0, 0017 mol/L.
Em todas as reações com ácido tricloroacético (Vetec), este foi adicionado a
partir de uma solução aquosa ~ 8,2 mol/L.
Para a preparação das soluções-padrões da H2T-2-PyP foram utilizadas
amostras da Frontier Scientific Inc. (Logan, UT, EUA).
2.3.2 Equipamentos e Software
2.3.2.1 Espectroscopia eletrônica de absorção na região do UV-vis
Os espectros eletrônicos de absorção na região do UV-vis (300-800 nm) foram
registrados no espectofotômetro Shimadzu modelo UV-1800, com resolução de 1 nm,
utilizando cubetas de quarto com 10 mm de caminho óptico.
2.3.2.2 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN de 1H)
Os espectros de RMN de 1H foram registrados na Central Analítica da
Universidade Federal da Paraíba em um espectrômetro VARIAN Mercury operado na
frequência de 200 MHz.
2.3.2.3 pHmetro
Para as medidas de pH foi utilizado um pHmetro digital portátil da marca
Instrutherm modelo PH-1900.
20
CAPÍTULO 2
2.3.2.4 Centrífuga
A centrífuga utilizada foi da marca CENTRIBIO (modelo 80-2B) operando a
3000 rpm.
2.3.2.5 Pacote estatístico
Os planejamentos quimiométricos e análises estatísticas foram efetuados
através do pacote estatístico MINITAB 16 (Minitab Inc., State College, PA, EUA).
2.3.3 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em pequena escala
Os ensaios para otimização da síntese da H2T-2-PyP foram efetuados conforme
as condições (tempo, temperatura, natureza e quantidades de reagentes e aditivos)
propostas em cada planejamento. Em geral, foram adicionados em um tubo de ensaio de
15 mL, os reagentes pirrol e 2-piridinacarboxaldeído, o solvente (ácido butírico ou ácido
acético) e, por último, alguns aditivos, como o ácido tricloroacético, o iodo, acetato de
zinco, H2O, entre outros (de acordo com cada planejamento), totalizando um volume de
3 mL. Esse sistema foi fechado e agitado manualmente à temperatura ambiente por 1
minuto.
Em seguida, o tubo foi imediatamente imerso em um banho de óleo a uma
determinada temperatura, o que marcou o início da contagem do tempo da reação. Após
um tempo apropriado, o tubo foi removido do banho de óleo e resfriado rapidamente
para temperatura ambiente com o auxílio de um fluxo de água à temperatura ambiente.
Após 5 minutos do estabelecimento do equilíbrio térmico à temperatura ambiente,
adicionou-se, aproximadamente70 μL de H2O2 (aq) 4,28 mol/L de modo que a
concentração do H2O2 no sistema fosse 0,1 mol/L..
O sistema foi agitado manualmente por 1 minuto e deixado em repouso por 30
minutos. A formação de H2T-2-PyP foi monitorada por inspeção visual (fluorescência
da porfirina quando excitada por lâmpada UV de comprimento de onda longo, ~365
nm). Alíquotas do meio de reação foram usualmente analisados por cromatografia em
camada delgada (CCD) em sílica-gel, utilizando CHCl3:MeOH (9:1) como eluente. A
quantificação da H2T-2-PyP formada foi efetuada espectrofotometricamente, conforme
descrito a seguir.
21
CAPÍTULO 2
2.3.4 Quantificação in situ dos rendimentos da síntese da H2T-2PyP: Método de Adição de Padrão
Para as reações realizadas em ácido acético, os 3 mL da mistura de reação
foram quantitativa e diretamente transferidos para um balão volumétrico de 100 mL,
com o auxílio de 20,0 mL de HCl(aq) 5 mol/L. Já para as reações realizadas em ácido
butírico, os 3 mL da mistura de reação foram agitados vigorosamente com 1,0 mL de
HCl(aq) 5 mol/L; o sistema foi centrifugado, a fase orgânica foi eliminada e a fase
aquosa foi quantitativamente transferida para um balão volumétrico de 100 mL com o
auxílio de 19,0 ml de HCl(aq) a 5 mol/L. Em todos os casos, o volume total de HCl(aq)
5 mol/L utilizado para a extração e/ou subseqüente transferência foi de 20,0 mL. O
balão de 100 mL foi aferido até a marca com água destilada, resultando em uma solução
da amostra de interesse em HCl(aq) 1 mol/L, a qual foi denominada de “solução
estoque”.
Uma alíquota da “solução estoque” foi transferida para um balão volumétrico
de 10 mL, o qual foi aferido até a marca com HCl(aq) 1,00 mol/L. Essa solução
resultante foi chamada de “solução de trabalho”. A alíquota da “solução estoque”
utilizada era tal que o espectro de absorção UV-vis da “solução de trabalho”, em uma
cubeta de caminho óptico de 1 cm, resultava em uma absorção de cerca de 0,8 no
comprimento de onda de 439 nm.
Cinco soluções de 2 mL para a leitura no UV-vis (denominadas P0 a P4) foram
preparadas misturando 1,0 mL da “solução de trabalho” com 1,0 mL de soluções
padrões de H2T-2-PyP comercial preparadas em HCl(aq) 1,00 mol/L. Especificamente,
foram utilizadas quatro soluções padrões de H2T-2-PyP comercial em 1,00 mol/L
HCl(aq) com as concentrações dadas a seguir: 1,07 μM (Padrão 1), 2,15 μM (Padrão 2),
3,22 μM (Padrão 3), e 4,30 μM (Padrão 4). Assim, para se obter a solução P0, misturouse 1,0 mL da “solução de trabalho” com 1,0 mL de HCl(aq) 1,00 mol/L. Para a
preparação das soluções P1 a P4 foram misturados 1,0 mL da “solução de trabalho”
com 1,0 mL da solução padrão 1 a 4 correspondente. Os espectros das soluções
resultantes P0 a P4 foram, então, registrados para quantificação espectrofotométrica da
H2T-2-PyP nas reações.
A concentração de H2T-2-PyP foi determinada a partir de uma curva de
calibração e os rendimentos das reações foram calculados considerando todas as
diluições do processo de quantificação. Vale ressaltar, que, para cada reação, uma curva
de calibração foi construída.
22
CAPÍTULO 2
2.3.5 Síntese e Purificação da H2T-2-PyP em escala preparativa
2.3.5.1 Reações em ácido butírico
Uma representação das etapas sintéticas para obtenção da H2T-2-PyP está
ilustrada no Esquema 2.1 O procedimento iniciou adicionando 100 mL de ácido butírico
em um balão de 250 mL acoplado a um condensador. O ácido foi aquecido em um
banho de óleo. Quando a temperatura interna do sistema se estabilizou em 100 °C,
foram adicionados, rapidamente, sob agitação magnética e nesta ordem, 350 μL de
pirrol (5,06 mmol), 358 μL de 2-piridinacarboxaldeído (3,74 mmol) e 1800 μL de água
destilada (100 mmol), para se obter uma mistura de reação de 0,051 mol/L de pirrol,
0,037 mol/L de aldeído e 1,00 mol/L de água. Após alguns segundos, o meio de reação
adquiriu coloração roxa. Após 3 horas de reação, uma alíquota de 5 μL foi retirada para
aquisição de espectro UV-vis e comprovação da formação da H2T-2-PyP.
O aquecimento da reação foi, então, interrompido e o balão de reação foi
resfriado, com o auxílio de um fluxo d’água, para que atingisse a temperatura ambiente.
Após estabelecido o equilíbrio térmico, foi adicionado 1166 μL de H2O2(aq) 4,28 mol/L
ao balão para que a concentração de H2O2 no sistema fosse 0,1 mol/L. O sistema foi
agitado manualmente por 1 minuto e deixado em repouso por 30 minutos. Transcorrido
este tempo, foram adicionados 50 mL de HCl(aq) 5 mol/L, o que levou à formação de
duas fases.
Após vigorosa agitação para extração líquido-líquido, esperou-se a
coalescência das fases, as quais foram, então, separadas, sendo a fase orgânica
descartada. A fase aquosa foi diluída com 50 mL de H2O e o pH foi ajustado para 5,0
com a adição, sob vigorosa agitação magnética, de aproximadamente 520 mL de
NaOH(aq) 1 mol/L; esta neutralização parcial do sistema foi acompanhada de
precipitação de um sólido. Após deixar o sistema em repouso por cerca de 1 hora, o
sólido foi filtrado em um funil de Büchner, lavado com aproximadamente 3 alíquotas de
100 mL de NaHCO3(aq) 0,1 mol/L e, depois, com água destilada até neutralidade.
O sólido foi seco inicialmente por sucção e, posteriormente, em estufa a 60 °C
por aproximadamente 2 horas. A esse material foi adicionado 60 mL de CHCl3 e a
suspensão resultante foi filtrada a vácuo. O sólido obtido foi descartado. Ao
sobrenadante foram adicionados 60 mL de EtOAc e 60 mL de hexano e o sistema foi
deixado em repouso por um período de aproximadamente 1,5 h, durante o qual houve a
formação de um precipitado que foi eliminado por filtração a vácuo. O sobrenadante foi
23
CAPÍTULO 2
recolhido e levado à secura em um evaporador rotatório. O sólido resultante foi
purificado por cromatografia em coluna utilizando CHCl3:MeOH (9:1) como eluente. A
banda roxa correspondente à H2T-2-PyP (Rf ~ 0,9) foi recolhida e levada à secura em
um evaporador rotatório. Este procedimento de síntese e purificação em escala de 100
mL resultou em rendimentos isolados de H2T-2-PyP da ordem de 60 a 130 mg (11 a
23%). Todas as etapas de síntese e purificação foram monitoradas por CCD-SiO2
(CHCl3:MeOH, 9:1) e espectroscopia eletrônica de absorção UV-vis.
Esquema 2.1- Etapas da reação de obtenção da H2T-2-PyP em ácido butírico.
2.3.5.2 Reações em ácido acético
Uma representação das etapas sintéticas para obtenção da H2T-2-PyP está
ilustrada no Esquema 2.2. Em um balão de 100 mL acoplado a um condensador, 40 mL
de ácido acético foram aquecidos em um banho de óleo. Quando a temperatura do ácido
atingiu 100°C, procedeu-se o preparo de uma solução, à temperatura ambiente,
24
CAPÍTULO 2
contendo: 10 mL de ácido acético, 175 μL de pirrol (2,53 mmol), 179 μL de 2piridinacarboxaldeído (1,87 mmol) e 1350 μL de água destilada (75 mmol). Esta
solução em 10 mL de ácido acético foi adicionada rapidamente e sob agitação
magnética ao balão de reação contendo 40 mL de ácido acético a 100 oC, resultando em
uma mistura de reação contendo 0,051 mol/L de pirrol, 0,037 mol/L de aldeído e 1,5
mol/L de água. Após alguns segundos, o meio de reação adquiriu coloração preta
azulada.
Após 1,5 h, o balão de reação foi removido do banho de óleo e resfriado, com o
auxílio de um fluxo d’agua, para temperatura ambiente. Após estabelecido o equilíbrio
térmico, foi adicionado 1166 μL de H2O2(aq) 4,28 mol/L ao balão para que a
concentração de H2O2 no sistema fosse 0,1 mol/L. O sistema foi agitado manualmente
por 1 minuto e deixado em repouso por 30 minutos.
Esquema 2.2- Etapas de síntese da H2T-2-PyP em ácido acético.
Para isolamento da H2T-2-PyP preparada em ácido acético, foram estudados
dois métodos de purificação:
Método 1. Uma representação das etapas de purificação está ilustrada no
Esquema 2.3. Os 50 mL do meio de reação foram diluídos com 50 mL de água e o
sistema resultante foi parcialmente neutralizado com uma solução de NaOH(aq) (1
mol/L) até que o pH do sistema atingisse 4,1. Esta neutralização foi acompanhada da
formação de um precipitado, o qual foi isolado por filtração a vácuo. O sólido resultante
foi lavado com 3 alíquotas de 50 mL de NaHCO3(aq) 0,1 mol/L e, depois, com água
destilada até neutralidade.
25
CAPÍTULO 2
O sólido foi seco inicialmente por sucção e, posteriormente, em estufa a 60 °C
por aproximadamente 2 horas. A esse material foi adicionado 40 mL de CHCl3 e a
suspensão resultante foi filtrada a vácuo. O sólido obtido foi descartado. Ao
sobrenadante foram adicionados 40 mL de EtOAc e 40 mL de hexano e o sistema foi
deixado em repouso por um período de aproximadamente 1,5 h, durante o qual houve a
formação de um precipitado de polipirrol que foi eliminado por filtração a vácuo. O
sobrenadante foi recolhido e levado à secura em um evaporador rotatório. O sólido
resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel 60 Å utilizando
CHCl3:MeOH (9:1) como eluente. Este procedimento de isolamento (método 1) foi
desenvolvido pelo aluno de iniciação cientifica José Ferreira Sarmento Neto do nosso
grupo de pesquisa (Grupo de Porfirinas Aplicadas a Problemas Químicos, Medicinais e
Tecnológicos) (UFPB). Este procedimento resultou tipicamente em 40-75 mg de H2T-2PyP (rendimento:15-25%).
Esquema 2.3- Etapas do método 1 para a purificação da H2T-2-PyP em ácido acético.
Método 2. Uma representação das etapas de purificação está ilustrada no
Esquema 2.4. Os 50 mL do meio de reação em ácido acético foram diluídos com 50 mL
de água e a solução resultante foi extraída com CHCl3 (3 alíquotas de 50 mL). As fases
orgânicas foram recolhidas, combinadas e lavadas com 3 alíquotas de 50 mL de
26
CAPÍTULO 2
NaHCO3 0,1 mol/L e depois com água destilada até a neutralidade. A fase orgânica
resultante foi seca com Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada para 40 mL de CHCl3. A
essa solução foram adicionados 40 mL de EtOAc e 40 mL de hexano. Essa mistura foi
deixada em repouso por um período de 1,5 horas, durante o qual se observou a
formação de um precipitado, o qual foi filtrado e descartado. O sobrenadante foi
coletado e levado à secura em evaporador rotatório.
O sólido resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel 60
Å utilizando CHCl3:MeOH (9:1, v/v) como fase móvel. A fração roxa correspondente à
H2T-2-PyP foi recolhida e levada à secura em um evaporador rotatório. Este
procedimento resultou em rendimentos semelhantes àqueles reportados para o Método
1, acima.
Esquema 2.4- Etapas do método 2 para a purificação da H2T-2-PyP em ácido acético.
2.4 Resultados e Discussão
2.4.1 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em pequena escala:
aspectos gerais
O procedimento de obtenção da H2T-2-PyP a partir de pirrol e aldeído
permanece pouco estudado. Utilizam-se, em geral, adaptações dos métodos
tradicionalmente usados para a síntese de H2TPP e os baixos rendimentos isolados de
27
CAPÍTULO 2
H2T-2-PyP (~1-5 %) (KIM et al., 1971; IAMAMOTO et al., 1994) sugerem, portanto,
que as condições para esta porfirina não estão otimizadas.
Nesse contexto, pode-se questionar se os baixos rendimentos estão associados
a problemas na formação da H2T-2-PyP, no procedimento de isolamento da porfirina,
ou em ambos. A otimização da obtenção da H2T-2-PyP neste trabalho foi, portanto,
dividida em duas etapas: a otimização da síntese da H2T-2-PyP em si e o melhoramento
nas condições de isolamento da porfirina, minimizando ou simplificando os
procedimentos de purificação.
Uma vez que a purificação e o isolamento da H2T-2-PyP são bastante
trabalhosos (particularmente em sistema com baixo rendimento), desenvolveu-se um
método espectrofotométrico que permitisse a avaliação rápida do rendimento de síntese
sem a necessidade de isolamento e purificação, para viabilizar o estudo de muitas
reações em condições de síntese diversas. Adicionalmente, visando um estudo
sistemático com número grande de reações, as condições de reações foram adaptadas
para sistemas em pequena escala, cujo volume total escolhido foi de 3 mL. Isto permitiu
não só a economia de reagentes/solventes, mas também a obtenção rápida de resultados
em um momento em que a importância real das variáveis e níveis selecionados era ainda
duvidosa.
O procedimento desenvolvido para as quantificações dos rendimentos sem
isolamento de material envolve a utilização da espectroscopia eletrônica de absorção na
região do UV-vis, através do “Método de Adição de Padrão”. O método de adição de
padrão foi escolhido para diminuir os efeitos de matriz associados com a contaminação
da H2T-2-PyP com polipirróis e outros sub-produtos (“tars”), cujas naturezas e
quantidades variam de um ensaio para outro. Impurezas, como os polipirróis, muitas
vezes afetam a linha de base do espectro e, embora estudos de síntese de porfirina com
quantificação espectrofotométrica de rendimento, sem isolamento da porfirina, sejam
descritos na literatura (LINDSEY et al., 1987), estes tem sido efetuados utilizando a lei
de Lambert-Beer diretamente no comprimento de onda da Soret, sem qualquer
estratégia para se eliminar ou minimizar o efeito de matriz.
Na Figura 2.3, observam-se os espectros de uma amostra padrão de H2T-2-PyP
e uma amostra bruta obtida diretamente do meio de reação sem qualquer purificação; as
diferenças na linha de base caracterizam o efeito de matriz presente nas amostras brutas.
28
CAPÍTULO 2
H2T-2-PyP comercial
em meio reacional
Figura 2.3- Espectros eletrônicos de absorção na região do UV-vis da solução de H2T2-PyP comercial (curva azul) e de uma amostra proveniente diretamente do meio de
reação de síntese da H2T-2-PyP diluída em HCl(aq) (1,0 mol/L) (curva vermelha), sem
qualquer tratamento prévio.Espectros registrados em HCl(aq) (1,0 mol/L).
O método de adição de padrão utilizando apenas 1 comprimento de onda, não
corrige o efeito de matriz (linha de base) nesses sistemas (ver Apêndice A). Para a
definição de uma linha de base de referência, foram escolhidos 2 comprimentos de onda
equidistantes do comprimento de onda máximo da Soret a 439 nm (ponto A, Fig. 2.4).
Foram escolhidos, especificamente, os comprimentos de onda 418 nm (ponto B, Fig.
2.4) e 460 nm (ponto C, Fig. 2.4). A reta que une os pontos B e C define um ponto D no
comprimento de onda 439 nm (Fig. 2.4).
Na Figura 2.4, observam-se os espectros das soluções correspondentes a P0,
P1, P2, P3 e P4 para uma reação típica e a sua respectiva curva de calibração para a
quantificação do rendimento. Utilizou-se o tratamento matemático do método de adição
de padrão relacionando a diferença de absorbância entre os pontos Ai e Di com as
concentrações de padrão adicionado em cada solução Pi (onde i = 0 a 4, ver Seção
2.3.4). Dessa forma, a diferença de absorbância (Ai – Di) guarda também informação
sobre influência do efeito de matriz sobre a linha de base de cada solução padrão (ver
Apêndice A) e reduz o efeito dos contaminantes polipirróis sobre o rendimento da H2T2-PyP.
29
CAPÍTULO 2
0,5
0,4
Absorbância
0,8
A
P0
0,6
P1
0,5
P2
P2
0,2
P1
0,1P0
P3
0,4
P3
0,3
ΔAbs
0,7
P4
P4
0
0,3
-2,E-06
-1,E-20
2,E-06
0,2
C
0,1
D
[H 2T-2-PyP]cubeta
B
0
350
400
λ (nm) 418
450
439
500
460
Figura 2.4- Espectros obtidos para as soluções P0, P1, P2, P3 e P4 (ver parte
experimental, item 2.3.4) e a respectiva curva de calibração com os 3 comprimentos de
onda escolhidos para a determinação dos rendimentos para uma reação típica de síntese
da H2T-2-PyP. O intercepto em x (o) representa a [H2T-2-PyP] oriunda da reação.
O planejamento da otimização da síntese da H2T-2-PyP iniciou-se com a
escolha das variáveis e níveis que poderiam eventualmente influenciar na formação da
porfirina, baseando-se nas condições do método de Adler e Longo (ADLER et al.,
1967) com algumas modificações. Decidiu-se substituir o ácido propiônico pelo ácido
butírico (um ácido com maior ponto de ebulição, 163,5 °C versus 141,0 °C), o que
permitiria o estudo em uma faixa de temperatura de reação mais ampla. Decidiu-se
estudar também a influência da adição de um co-oxidante exógeno ao final da reação
para eliminar possíveis contaminações com clorinas, tipicamente presentes nas
preparações pelo Método de Adler e Longo (ADLER et al., 1967), em que o oxigênio
atmosférico é o oxidante final. Optou-se por testar o uso de peróxido de hidrogênio,
H2O2, por ser um oxidante verde e de baixo custo. Destaca-se que no método de
Lindsey (LINDSEY; WAGNER, 1989) o oxidante utilizado são quinonas (tais como,
2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona, DDQ) que, apesar de bastante eficientes para
sínteses
em
sistemas
apolares,
são,
contudo,
de
alto
custo,
e
geram
coprodutos/subprodutos que trazem possíveis dificuldades para a purificação da
porfirina (HOFFMANN et al., 1992) além de serem tóxicos. O uso de H2O2 para a
oxidação de intermediários da síntese de porfirinas tais como porfirinogênios e clorinas,
foi documentado anteriormente (JOHNSTONE et al. 1996).
30
CAPÍTULO 2
Baseando-se em estudos da literatura, foram escolhidos variáveis e níveis que
fariam parte das reações iniciais exploratórias para posterior definição das variáveis e
níveis na otimização da síntese. Diferentes concentrações de pirrol e relação molar
aldeído/pirrol foram testadas. Testou-se também a presença/ausência de ácido
tricloroacético, visto que alguns estudos reportaram a utilização de ácido
trifluoroacético como co-catalisador (LINDSEY; WAGNER, 1989; GONSALVES et
al., 1991). Uma variável que também foi investigada trata-se da adição de acetato de
zinco, utilizado como “template” para a síntese de porfirinas (KIM et al., 1971).
Avaliou-se também a presença de iodo como co-catalisador, diferentes concentrações de
água, o ácido butírico e o ácido acético como solvente/catalisador, e o tempo de reação
e a temperatura.
2.4.2 Reações exploratórias em ácido butírico como
solvente/catalisador
Com as variáveis e níveis definidos, iniciou-se os experimentos para
investigação dos efeitos de sete variáveis em dois níveis cada. Com essa quantidade de
fatores há 4 opções de design de planejamentos fatoriais fracionários: a realização de 8,
16, 32 ou 64 ensaios. O experimento com 64 ensaios seria inviável devido ao grande
número de ensaios em um momento onde a importância real de todos os fatores
selecionados era ainda duvidosa. Uma vez que os designs com 16 e 32 ensaios
conduzem a um planejamento de resolução IV, preferiu-se a realização de um
planejamento fatorial fracionário 27-3IV (16 ensaios) devido ao menor número de
experimentos. O experimento com 8 ensaios, embora experimentalmente mais atraente,
foi descartado, pois resultaria em uma baixa resolução (III), cuja estrutura de
confundimento muito provavelmente impossibilitaria a análise sem ambigüidade da
relevância dos fatores.
Todos os planejamentos foram simulados com o auxílio do pacote estatístico
MINITAB. Os fatores e os níveis escolhidos para o 1° Experimento e as condições de
cada ensaio estão mostrados nas Tabelas 2.2 e 2.3. Todas as reações tiveram duração de
60 min. Os rendimentos de cada ensaio foram determinados espectrofotometricamente e
apresentados na Tabela 2.3. Em todas as reações contendo zinco, a porfirina obtida no
final da reação encontrava-se metalada, na forma de ZnT-2-PyP. Desse modo, todas as
reações contendo zinco foram diluídas com HCl(aq) (1,0 mol/L) e deixadas em repouso
31
CAPÍTULO 2
por, no mínimo 12 hs, para que a hidrólise da Zn-porfirina se completasse e resultasse
no ligante livre para quantificação.
Tabela 2.2- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 1°
Experimento
Fatores
A- Concentração de pirrol
B- Temperatura
C- Concentração de ácido tricloroacético
D- Relação molar aldeído/pirrol
E- Relação molar Zn2+/pirrol
F- Relação molar H2O2/pirrol
G- Concentração de Água
Nível (–)
0,1 mol/L
100 °C
0 mol/L
1:1
0:4
1:4
0 mol/L
Nível (+)
0,5 mol/L
150 °C
10 mmol/L
1,5: 1
1:4
3:4
1 mol/L
Tabela 2.3- Matriz de Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 1° experimento com
os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.a
Ensaios
A
B
C
D
E
F
G
1
2
–
–
–
–
–
–
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
+
–
–
+
+
–
–
+
+
–
–
+
+
–
–
–
+
+
+
+
–
–
–
–
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
–
–
+
–
+
+
–
+
–
–
+
–
+
+
+
+
–
–
+
+
–
–
–
–
+
+
+
–
+
+
–
+
–
+
–
+
–
–
+
–
+
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Rendimentos
(%)
13
2
10
2
3
2
5
3
3
1
3
1
1
1
5
1
a
Fatores: A = [Pirrol]; B = Temperatura; C = [CCl3CO2H]; D = Relação molar
aldeído/pirrol; E = Relação molar Zn+2/pirrol; F = Relação molar H2O2/pirrol; G = [H2O].
32
CAPÍTULO 2
A principal forma de se verificar a relevância dos fatores avaliados em um
planejamento é através da análise dos efeitos principais e de interações. Na tabela 2.4,
observa-se os efeitos principais e de interações de segunda ordem do 1° Experimento.
As interações de terceira a sétima ordem para estes experimentos estão apresentadas na
matriz de confundimento presente no APÊNDICE B1.
Tabela 2.4- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Fracionário 27-3IV do 1° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
EFEITOS
A
-3,25
B
1,00
C
-1,25
D
-2,50
E
-0,50
F
0,25
G
-1,50
AB+CE+FG
-0,75
AC+BE+DG
1,50
AD+CG+EF
1,25
AE+BC+DF
0,75
AF+BG+DE
-0,50
AG+BF+CD
1,25
BD+CF+EG
0
a
Fatores: A = [Pirrol]; B = Temperatura; C = [CCl3CO2H]; D = Relação molar
aldeído/pirrol; E = Relação Zn+2/pirrol; F = Relação molar H2O2/pirrol; G =
[H2O].
Analisando a Tabela 2.4, percebe-se que os fatores A (concentração de pirrol) e
D (relação aldeído/pirrol) apresentam os efeitos mais significativos para esses
experimentos. O valor negativo dos efeitos de A e D indicam que ensaios com níveis
mais baixos de concentração de pirrol e relação aldeído/pirrol contribuem para aumentar
o rendimento da reação.
33
CAPÍTULO 2
[pirrol]
5,0
temperatura
[CCl3CO2H]
Média dos redimentos (%)
3,5
2,0
-1
5,0
1
-1
Rel. aldeído/pirrol
1
-1
Rel. Zn/pirrol
1
Rel. H2O2/pirrol
3,5
2,0
-1
1
-1
1
-1
1
[água]
5,0
3,5
2,0
-1
1
Figura 2.5- Efeitos principais do 1° Experimento
Analisando os rendimentos destes experimentos (Tabela 2.3 e Figura 2.5),
percebe-se que com o uso de pirrol mais diluído (nível –1, 0,1 mol/L,) e evitando o
excesso de aldeído com uso da relação pirrol/ aldeído 1:1 (nível –1, condição
estequiométrica) obtiveram-se rendimentos melhores (ensaios 1 e 3). Quando se utiliza
um sistema mais concentrado (pirrol no nível +1) e se passa do nível –1 para +1 da
relação aldeído/pirrol, o rendimento diminui bastante. Isso mostra que há efeito de
interação entre estes fatores, uma vez que o efeito da relação molar aldeído/pirrol
depende do nível em que se encontra o pirrol (Figura 2.6).
Os valores máximos de rendimento (13% no ensaio 1 e 10% no ensaio 3,
Tabela 2.3) são observados quando C (concentração de ácido tricloroacético) e G
(concentração de água) estão no nível –, o que significa que estes fatores também são
relevantes para a otimização, como mostra a Figura 2.5. Finalmente, é a temperatura
(fator B) no nível – que responde pelo rendimento de 13% no ensaio 1 contra 10% no
ensaio 3. Do ponto de vista de rendimento químico, uma vez que os rendimentos são
baixos, um efeito de 1,5% para o fator G (concentração de água) a essa altura, parece
bastante significativo.
34
CAPÍTULO 2
7
[pirrol]
-1
1
Média dos rendimentos (%)
6
5
4
3
2
1
-1
1
Rel. aldeído/pirrol
Figura 2.6- Efeito de interação AD do 1° Experimento
Diante das observações feitas com os experimentos e com uma modelagem da
superfície de resposta (Figura 2.7), observa-se que o caminho ótimo segue na direção de
concentrações mais baixas de pirrol e menor relação molar aldeído/pirrol. Então,
decidiu-se realizar algumas reações exploratórias variando a concentração de pirrol e a
relação molar aldeído/pirrol e mantendo as outras variáveis em seus níveis mais baixos,
já que estes são seus níveis ótimos. Esse procedimento ignora possíveis interações entre
os demais fatores com A (concentração de pirrol) e D (relação aldeído/pirrol), que
podem mudar seus efeitos em outro domínio experimental, mas uma vez que torna a
análise mais simples, e será adotado nessa etapa. Em tempo oportuno, os demais fatores
voltarão a ser considerados.
Figura 2.7- Curvas de nível das variáveis A (pirrol) e B (relação aldeído/pirrol) do 1°
Experimento.
35
CAPÍTULO 2
As condições dos ensaios estão dispostas na Tabela 2.5, juntamente com os
rendimentos não-isolados determinados espectrofotometricamente. As equações
utilizadas para a normalização da concentração de pirrol (Eq. 2.1) e para a relação
aldeído/pirrol (Eq. 2.2) estão mostradas abaixo:
Tabela 2.5- Condições das reações exploratórias com os níveis normalizados de
concentração de pirrol e relação aldeído/pirrol com os rendimentos (não isolados) de
H2T-2-PyP.
Ensaios
[Pirrol] Rel. Aldeído
mol/L
/Pirrol
Níveis Codificados
[Pirrol]
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
0,10
0,05
0,05
0,10
0,075
0,10
0,05
0,075
0,02
0,02
1:1
1:1
0,75:1
0,75:1
0,875:1
0,5:1
0,5:1
0,625:1
0,5:1
0,75:1
1
-1
-1
1
0
1
-1
0
-2,2
-2,2
Rel.
Aldeído/Pirrol
1
1
1
-1
0
-3
-3
-2
-3
-1
Rend.
(%)
13
12
12
10
12
9
16
15
2
9
Na Tabela 2.5 são apresentados dados, na qual sugere que o ensaio 23, cujos
níveis de pirrol e relação aldeído/pirrol são 0,05 mol/L e 0,5:1, respectivamente,
representa aquele de maior rendimento obtido. No entanto, apesar dessas condições
serem as melhores, é economicamente inviável para a indústria a utilização da relação
aldeído/pirrol 0,5:1, pois uma grande quantidade de pirrol seria desprezada, visto que
apenas metade do pirrol adicionado ao meio reacional reage para a formação da
porfirina.
Diante
disso,
continuou-se
a
busca
por
condições
que
fossem
economicamente viáveis e de rendimentos aceitáveis. Logo, a nossa condição ótima até
o momento corresponde a relação aldeído/pirrol de 0,75:1.
36
CAPÍTULO 2
A Figura 2.8 apresenta a análise evolutiva dos rendimentos em função dos
níveis codificados de pirrol e da relação molar aldeído/pirrol que gerou o planejamento
da Tabela 2.5.
(17)
(18) 12%
(a)
Rel. aldeído/pirrol
13%
(b)
0,8
0,3
[pirrol]
(21)
0,8
0,3
[pirrol]
12%
-3
-2
-1
-0,2 0
1
-3
-2
-0,2 0
-1
1
-0,7
-0,7
(19) 12%
10%
-1,2
(19)
12%
10%
-1,2
(20)
-1,7
-1,7
-2,2
-2,2
15%
(24)
-2,7
-2,7
-3,2
(23)
-3,2
(22)
9%
16%
Rel. aldeído/pirrol
Rel. aldeído/pirrol
(c)
0,8
[pirrol]
0,3
-3
-2
-1
(19)
-0,2 0
1
-0,7
(25)
9%
12%
-1,2
-1,7
-2,2
(24)
2%
(23)
-2,7
16%
-3,2
Figura 2.8- Diagrama das reações exploratórias com as variáveis pirrol e relação molar
aldeído/pirrol. Os números no exterior do círculo correspondem aos ensaios na Tabela
2.5 e os números no interior do círculo são os rendimentos.
A região da Figura 2.8a (laranja) foi definida a partir do ensaio 1 (Tabela 2.3),
assumindo agora os níveis 0,10 mol/L para A (concentração de pirrol) e 1:1 para D
(relação aldeído/pirrol) como níveis superiores e estabelecendo novos níveis inferiores
em 0,05 para A (concentração de pirrol) e 0,75:1 para D (relação aldeído/pirrol). Foi
observado que não houve melhora nos rendimentos quando comparado com aqueles
obtidos nos ensaios do 1° Experimento. Em seguida, evoluiu-se o domínio para a região
da Figura 2.8b (verde) que corresponde ao deslocamento do domínio da Figura 2.8a na
direção de diminuir a variável D (relação molar aldeído/pirrol) em duas unidades de
nível codificado. Nesse domínio pôde-se verificar que o pirrol mais diluído (0,05
37
CAPÍTULO 2
mol/L) e uma relação molar aldeído/pirrol mais baixa melhora os rendimentos (16%). E,
por fim, analisando o domínio Figura 2.8c (azul), percebe-se uma piora em relação aos
rendimentos obtidos anteriormente, quando utilizou-se concentrações bem diluídas de
pirrol.
Concluídos os experimentos acima, foram definidos os níveis de pirrol (0,05 e
0,10 mol/L) e relação molar aldeído/pirrol (0,75:1 e 1:1) a serem investigados em maior
detalhe em um novo planejamento fatorial fracionário. Observou-se que a presença de
zinco no 1o Experimento (Tabelas 2.3 e 2.4) não trazia grandes melhoras nos
rendimentos e como a presença de zinco implicaria uma etapa de desmetalação
adicional para obtenção da H2T-2-PyP livre decidiu-se substituir a variável relação
[Zn+2]/pirrol por relação iodo/pirrol no novo planejamento. Esta substituição foi baseada
no estudo de Boens e colaboradores (2010) que reportaram o uso de iodo, em diferentes
concentrações, como catalisador da condensação de pirrol e aldeído no método de
Lindsey modificado para a síntese da H2TPP.
A região de concentração de ácido tricloroacético foi aumentada de 0 – 0,01
mol/L (1º Experimento) para 0 – 1,0 mol/L neste novo planejamento. A concentração de
H2O2 foi fixada em 0,1 mol/L, adicionada ao final da reação após o sistema atingir a
temperatura ambiente. Decidiu-se incluir no planejamento a investigação da variável
tempo de reação, que havia sido fixada em 60 minutos no 1º Experimento.
Com os novos 7 fatores definidos e seus respectivos níveis estabelecidos
(Tabela 2.6), um 2º experimento foi planejado, cujas condições de cada ensaio estão
mostrados na Tabela 2.6. Todas as reações foram realizadas em pequena escala (3 mL) e
os
rendimentos
não
isolados
foram
determinados
espectrofotometricamente
(Tabela 2.7), sendo possível atingir rendimentos da ordem de 21 % neste planejamento.
Tabela 2.6- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 2°
Experimento.
Fatores
A- Concentração de pirrol
B- Relação molar aldeído/pirrol
C- Temperatura
D- Tempo de Reação
E- Concentração de Ácido Tricloroácetico
F- Relação molar Iodo/Pirrol
G- Concentração de Água
Nível (–)
0,05 mol/L
0,75:1
100 °C
30 min.
0 mol/L
0
0 mol/L
Nível (+)
0,10 mol/L
1:1
120 °C
60 min.
1 mol/L
0,2:1
1 mol/L
38
CAPÍTULO 2
Tabela 2.7- Matriz de Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV do 2° Experimento com
os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.a
Ensaios
A
B
C
D
E
F
G
Rendimentos
(%)
–
–
–
–
–
–
–
13
27
+
–
–
–
+
–
8
28
+
–
+
–
–
+
+
–
17
29
+
+
–
–
–
+
9
30
+
–
–
+
–
+
+
20
31
+
+
–
+
–
–
+
–
13
32
–
+
+
–
–
–
14
33
+
+
+
+
–
+
–
–
8
34
–
–
–
+
–
+
18
35
+
+
–
–
+
+
+
–
14
36
–
+
–
+
+
–
+
16
37
+
+
–
+
–
–
–
12
38
–
–
+
+
+
–
–
21
39
+
–
+
+
–
–
14
40
+
–
+
+
+
–
+
–
19
41
+
+
+
+
+
+
12
42
+
0
0
0
0
0
0
0
16
43
a
Fatores: A= [Pirrol]; B= Relação molar aldeído/pirrol; C= Temperatura; D= Tempo
de reação; E= [CCl3CO2H]; F= Relação molar iodo/pirrol; G= [H2O]
Com o 2° experimento concluído, a relevância dos fatores foi avaliada através
da análise dos efeitos (Tabela 2.8). Foram avaliados os efeitos principais e de interação
de segunda ordem. As interações de ordem superior (3a a 7a ordem) estão apresentadas
na matriz de confundimento do Planejamento Fatorial Fracionário 27-3IV (Apêndice B1).
Analisando a Tabela 2.8 e Figura 2.9, pode-se concluir que os fatores A
(concentração de pirrol) e D (tempo de reação) são os efeitos mais significativos para
esses experimentos. O valor negativo do efeito do fator A indica que ensaios com níveis
mais baixos de concentração de pirrol contribuem para aumentar o rendimento da
reação. Enquanto que, para o fator D, o valor positivo sugere que experimentos com
níveis maiores de tempo de reação contribuem para o aumento do rendimento.
39
CAPÍTULO 2
Tabela 2.8- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Fracionário 27-3 Iv do 2° experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
A
B
C
D
E
F
G
AB+CE+FG
AC+BE+DG
AD+CG+EF
AE+BC+DF
AF+BG+DE
AG+BF+CD
BD+CF+EG
EFEITOS
-6,00
-1,75
1,75
3,00
0,50
2,00
-0,75
-0,25
-0,75
0,50
-2,00
-0,50
-0,25
-0,25
a
Fatores: A= [Pirrol]; B= Relação molar aldeído/pirrol; C= Temperatura; D= Tempo
de reação; E= [CCl3CO2H]; F= Relação molar iodo/pirrol; G= [H2O].
[ pirrol ]
Rel. aldeído/pirrol
temperatura
16
Média dos rendimentos (%)
14
12
-1
0
tempo de reação
1
-1
0
[ CCl3CO2H ]
1
-1
0
Rel. iodo/pirrol
1
-1
0
[ água ]
1
-1
0
1
-1
0
1
-1
0
1
16
14
12
16
14
12
Figura 2.9- Efeitos principais do 2°Experimento.
Analisando a Figura 2.9, é possível extrair algumas conclusões a respeito dos
fatores avaliados no 2º Experimento:

O fator A (pirrol): os rendimentos são geralmente melhores quando se
tem um sistema mais diluído (0,05 mol/L).
40
CAPÍTULO 2

O fator B (relação molar aldeído/pirrol): os rendimentos são geralmente
piores quando se usa a relação 1:1 (aldeído estequiométrico). Portanto, usar a relação
aldeído/pirrol baixa pode beneficiar os rendimentos.

O fator C (temperatura): quando esta a 120 °C leva a rendimentos
geralmente no mínimo melhores que a 100 °C.

O fator D (tempo de reação): os rendimentos são melhores com um
tempo de reação mais longo (60 min.) quando comparado a um tempo mais curto (30
min).

O fator E (concentração de ácido tricloroacético): a presença do ácido
tricloroacético nos níveis escolhidos parece não influenciar no rendimento da reação.

O fator F (relação molar iodo/pirrol): a presença de iodo geralmente leva
a um melhor rendimento.

O fator G (concentração de água): a presença de água nos níveis
escolhidos neste planejamento não teve efeito significativo no sistema.
A partir das conclusões obtidas com o 2° experimento, decidiu-se realizar
alguns ensaios exploratórios para avaliar mais detalhadamente apenas aqueles fatores
julgados mais relevantes no final do 2° experimento. Observa-se uma melhora de
rendimento ao se utilizar a concentração de pirrol mais diluída (0,05 mol/L), a relação
molar aldeído/pirrol mais baixa (0,75:1) e a temperatura mais baixa (100 °C). Já para a
relação molar iodo/pirrol, os rendimentos melhoram em níveis mais altos, e como a
variável concentração de ácido tricloroacético não apresentou efeito significativo nos
níveis avaliados, decidiu-se testar níveis mais altos desse ácido. Optou-se por não testar
níveis mais baixos de pirrol, pois concentrações mais diluídas de pirrol, mesmo com
rendimento maior representariam maiores problemas para escalonamento da síntese e
maior demanda energética para as etapas de purificação; é de interesse otimizar
condições mais concentradas de reagentes. A relação molar aldeído/pirrol não foi
reduzida, sendo mantidos os níveis investigados anteriormente, pois quanto mais
distante da relação estequiométrica, maior o gasto com reagente em excesso.
Assim, realizaram-se alguns testes para definir quais seriam os níveis avaliados
de ácido tricloroacético e relação molar pirrol/iodo no próximo experimento.
Primeiramente, testou-se reações com níveis da relação iodo/pirrol 0,2:1 e 1:1 (níveis –
e +, respectivamente) e níveis de ácido tricloroacético em 1 e 2 mol/L (níveis – e +,
respectivamente), porém não foi possível a total dissolução de iodo no sistema. Assim,
41
CAPÍTULO 2
os níveis da relação iodo/pirrol foram reduzidos para 0,1:1 e 0,3:1 (níveis – e +,
respectivamente). Posteriormente, ao realizar alguns testes nessas condições de iodo e
no nível mais alto do ácido tricloroacético, percebeu-se que a porfirina não estava sendo
formada, assim, desconfiou-se que as concentrações do ácido tricloroacético estavam
alta, então se definiu novos níveis e desse modo um 3º experimento foi planejado para
avaliar o efeito de apenas 5 fatores. Com essa quantidade de fatores, optou-se por
realizar um planejamento fatorial fracionário 25-1IV. Os fatores e níveis estão mostrados
na Tabela 2.9, sendo a matriz de planejamento (condições) de cada ensaio apresentados
na Tabela 2.10.
Tabela 2.9- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 25-1IV do 3°
Experimento.
Fatores
A- Concentração de pirrol
B- Relação molar aldeído/pirrol
C- Temperatura
D- Concentração de ácido tricloroácetico
E- Relação molar Iodo/Pirrol
Nível (–)
0,05 mol/L
0,75:1
80 °C
0,5 mol/L
0,1:1
Nível (+)
0,1 mol/L
1:1
100 °C
1,5 mol/L
0,3:1
Quatro ensaios (53, 54, 56 e 59, Tabela 2.10) foram realizados, mas, apesar de
se verificar a presença de porfirina com rendimentos em torno de 6-7 %, observou-se
também a formação de um filme intratável de polipirrol que dificultava os processos de
purificação. Esses ensaios correspondem ao nível mais alto do ácido tricloroacético (1,5
mol/L), onde a concentração desse ácido era também maior que o nível mais alto (1,0
mol/L) utilizado no 1º e no 2º Experimentos.
Suspeitou-se que a presença de ácido tricloroacético ou do iodo poderia estar
afetando negativamente o bom andamento das reações. Assim, interrompeu-se o 3º
Experimento e optou-se por investigar brevemente o efeito do ácido tricloroacético e do
iodo. As condições das reações-teste estão mostradas na Tabela 2.11.
42
CAPÍTULO 2
Tabela 2.10- Matriz de Planejamento Fatorial Fracionário 25-1IV do 3° Experimento.
Ensaios
A
B
C
D
E
–
–
–
–
+
44
+
–
–
–
–
45
–
+
–
–
–
46
+
+
–
–
+
47
–
–
+
–
–
48
+
–
+
–
+
49
–
+
+
–
+
50
+
+
+
–
–
51
–
–
–
+
–
52
+
–
–
+
+
53
–
+
–
+
+
54
+
+
–
+
–
55
–
–
+
+
+
56
+
–
+
+
–
57
–
+
+
+
–
58
+
+
+
+
+
59
0
0
0
0
0
60
Fatores: A= [Pirrol]; B= Relação aldeído/pirrol;
C= Temperatura; D= [CCl3CO2H]; E= Relação iodo/pirrol.
Uma reação nas melhores condições, até então, na ausência de ácido
tricloroacético e iodo (ensaio 61, Tabela 2.11) leva a rendimento (não isolado) de 17 %.
Na presença de uma pequena quantidade de iodo (relação molar iodo/pirrol = 0,1:1),
observa-se uma redução no rendimento (ensaio 62); a permanência do rendimento em
torno de 9 % sugere que o iodo pode ter um efeito negativo nessas concentrações fixas
de pirrol, aldeído e temperatura, mas não deve necessariamente estar associado à queda
brusca de rendimento observada nos ensaios 53, 54, 56 e 59 acima. A formação da
porfirina não foi, no entanto, sequer detectada em reações na presença de ácido
tricloroacético a 0,5 ou 1,0 mol/L (ensaios 63 e 64, Tabela 2.11).
A partir das informações desse suposto 3° experimento e reações-testes (Tabela
2.11), resolveu-se interromper o 3° Experimento do Planejamento Fatorial Fracionário
25-1IV e excluir do sistema o ácido tricloroacético e o iodo. Embora o papel que o ácido
tricloroacético e o iodo exerce na inibição da formação da H2T-2-PyP possa ter,
eventualmente, alguma importância mecanística, optou-se por não dar continuidade à
investigação desses fatores pelas seguintes razões: 1) por se tratarem de aditivos ao
sistema sem benefícios justificáveis até o presente momento, uma vez que qualquer
43
CAPÍTULO 2
quantidade a ser incluída na reação representaria um gasto possivelmente dispensável e
com consequências para a etapa de purificação nas reações em maior escala; 2) devido à
limitação de tempo, priorizou-se a busca de fatores e condições que efetivamente
contribuíssem para um aumento apreciável no rendimento da H2T-2-PyP.
Tabela 2.11- Condições das reações-teste e seus respectivos rendimentos. a
Ensaios
[CCl3CO2H]
(mol/L)
Rel.
Iodo/
pirrol
Rendimento
(%)
61
0
0:1
17
62
0
0,1:1
9
63
0,5
0:1
0
64
1,0
0:1
0
a
As reações foram realizadas nas seguintes condições:
ácido butírico como solvente, [pirrol] = 0,05 mol/L,
relação molar aldeído/pirrol = 0,75:1, tempo de reação
= 60 min. e temperatura = 100 °C.
2.4.3 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em ácido butírico
Com o término das reações exploratórias iniciais, os níveis e os fatores que
serão avaliados na otimização encontram-se pré-definidos. Após o 3° experimento,
decidiu-se por excluir o ácido tricloroacético e o iodo do sistema, assim, retomou o
estudo do efeito da água, explorando um faixa de concentração de água maior. O 4°
planejamento foi, então, planejado para avaliar quatro fatores: a concentração de pirrol,
a relação molar aldeído/pirrol, a temperatura e novas concentrações de água. Com essa
quantidade de fatores há 2 opções de design de planejamentos fatoriais: a realização de
um fatorial completo com 16 ensaios ou um fatorial fracionário com 8 ensaios. Optouse por um Planejamento Fatorial Fracionário 24-1 IV, uma vez que a maioria dos fatores
estudados nesse planejamento já deveria se encontrar em condições relativamente
aceitáveis. O planejamento foi simulado com o auxílio do pacote estatístico MINITAB.
Os fatores e os níveis escolhidos para o 4° Experimento do Planejamento Fatorial
Fracionário 24-1 IV e a matriz de planejamento com as condições de cada ensaio estão
mostrados nas Tabelas 2.12 e 2.13. Novamente, os rendimentos (não isolados) de cada
ensaio foram determinados espectrofotometricamente e são apresentados na Tabela
2.12.
44
CAPÍTULO 2
Tabela 2.12- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Fracionário 24-1IV do 4°
Experimento para a síntese da H2T-2-PyP.
Fatores
A- Concentração de pirrol
B- Relação aldeído/pirrol
C- Temperatura
D- Concentração de Água
Nível (–)
0,05 mol/L
0,75:1
80 °C
0,5 mol/L
Nível (+)
0,1 mol/L
1:1
100 °C
1,5 mol/L
Tabela 2.13- Matriz do Planejamento Fatorial Fracionário 24-1IV do 4° Experimento com
os respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.a
Ensaios
A
B
C
D
Rendimentos
(%)
–
–
–
–
14
65
+
–
–
+
7
66
–
+
–
–
12
67
+
+
–
–
6
68
–
–
+
+
29
69
+
–
+
–
17
70
–
+
+
–
14
71
+
+
+
+
14
72
0
0
0
0
11
73
a
Fatores: A = [Pirrol]; B = Relação molar aldeído/pirrol; C = Temperatura; D = [Água].
Os ensaios foram realizados em ácido butírico e com um tempo de reação de 60 min.
Com o 4° experimento concluído, a relevância dos fatores foi avaliada através
da análise dos efeitos (Tabela 2.14). Foram avaliados os efeitos principais e de interação
de segunda ordem. As interações de ordem superior (3a a 4a ordem) estão apresentadas
na matriz de confundimento do Planejamento Fatorial Fracionário 24-1IV (Apêndice B2).
Os efeitos principais dos fatores estudados no 4° Experimento (Tabela 2.14 e
Figura 2.10) mostram que os fatores A (concentração de pirrol), B (relação
aldeído/pirrol) e C (temperatura) apresentam efeitos significativos para esse
experimento. O valor negativo do efeito dos fatores A e B indicam que ensaios com
níveis mais baixos de concentração de pirrol e relação aldeído/pirrol contribuem para
aumentar o rendimento da reação. Porém, níveis mais baixos já foram avaliados (Tabela
2.5 e Figura 2.8), e percebe-se uma queda nos rendimentos. Analisando o fator C, notase que a temperatura é o efeito dominante nesse planejamento. No entanto, o uso da
45
CAPÍTULO 2
temperatura mais alta (120 e 150 oC) prejudica consideravelmente o rendimento da H2T2-PyP e pode estar mascarando contribuições importantes dos outros fatores durante a
investigação das melhores condições de síntese da porfirina.
Tabela 2.14- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Fracionário 24-1IV do 4° experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
EFEITOS
A
-6,25
B
-5,25
C
8,75
D
2,75
AB+CD
3,25
AC+BD
0,25
AD+BC
-3,75
a
Fatores: A = [Pirrol]; B = Relação molar aldeído/pirrol; C = Temperatura; D = [Água].
[ pirrol ]
Rel. aldeído/pirrol
18
Média dos rendimentos (%)
16
14
12
10
-1
0
Temperatura
1
-1
0
[ água ]
1
-1
0
1
-1
0
1
18
16
14
12
10
Figura 2.10- Efeitos principais do 4° Experimento
O efeito da água (fator D) não foi estatisticamente significativo, o que pode
indicar que: 1) a água não é mesmo uma variável importante, ou 2) é importante, mas os
níveis escolhidos não são significativamente diferentes entre si, ou 3) os efeitos da água
são mascarados por interações. Decidiu-se, então, realizar algumas reações para avaliar
concentrações maiores de água (Figura 2.11). Com as condições ótimas de pirrol (0,05
mol/L), relação molar aldeído/pirrol (0,75:1) e temperatura (100 °C), já foram estudadas
concentrações de água a 0 mol/L (ensaio 1), 0,5 mol/L (ensaio 75), 1,0 mol/L e 1,5
mol/L (ensaio 81). Foram realizadas, então, 4 reações exploratórias adicionais para
46
CAPÍTULO 2
avaliar concentrações maiores de água (2 mol/L, 3 mol/L, 4 mol/L e 5 mol/L). Os
rendimentos variaram entre 13-28%.
Rendimentos (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
[H2O] mol/L
Figura 2.11- Resposta do rendimento de H2T-2-PyP à concentração de água no sistema.
Condições: ácido butírico como solvente/catalisador; [Pirrol] = 0,05 mol/L; Relação
molar aldeído/pirrol = 0,75:1; tempo de reação = 60 min. e temperatura = 100 °C.
Analisando a Figura 2.11, pode-se observar que após 1,5 mol/L de
concentração de água, os rendimentos diminuem e permanecem constantes,
considerando o erro sistemático dos ensaios. Estabeleceu-se, assim, que a concentração
de água a ser utilizada na síntese da H2T-2-PyP deveria ser 1,5 mol/L.
De um modo geral, as análises feitas neste experimento indicam que o uso de
pirrol na condição diluída (0,05 mol/L) e de uma relação molar aldeído/pirrol não
estequiométrica (0,75:1) melhora os rendimentos de H2T-2-PyP. Pode-se concluir
também que se deve procurar manter a temperatura em torno de 100° C e a
concentração de água em 1,5 mol/L. O melhor rendimento obtido ao longo dessas
reações passou de 21 % (2°experimento) para 29 % (ensaio 69, Tabela 2.13). Esta é
uma condição de ótimo “parcial”, uma vez que a investigações nas condições diluídas
de pirrol (0,05 mol/L) serão retomadas ao final do 6º experimento (adiante), resultando
em rendimentos maiores.
Apesar dos resultados dos planejamentos até então indicarem que o pirrol
deveria ser utilizado em concentração baixa (0,05 mol/L), insistiu-se na busca de
condições que pudessem melhorar os rendimentos da síntese da H2T-2-PyP a partir de
pirrol em uma condição mais concentrada (0,1 mol/L). O uso de pirrol mais concentrado
se justifica pelas seguintes razões: 1) menor volume de solvente implica menor custo
intrínseco e a necessidade de reatores de tamanhos menores, 2) processos de purificação
operacionalmente mais simples, e 3) se a concentração de pirrol é dobrada e desde que o
47
CAPÍTULO 2
rendimento percentual na condição concentrada seja, no mínimo, metade daquela na
condição diluída, a massa de H2T-2-PyP por batelada seria, no mínimo, equivalente
àquela da situação mais diluída.
Assim, a concentração de pirrol foi fixada em 0,1 mol/L e o 5° Experimento
foi, então, projetado para avaliar três fatores: a temperatura, a concentração de água e o
tempo de reação. Com esse novo planejamento pretendeu-se avaliar se esses três fatores
melhorariam o rendimento com pirrol mais concentrado. A relação molar aldeído/pirrol
foi fixada em 0,75:1, pois os resultados dos experimentos anteriores indicaram que a
relação molar aldeído/pirrol não estequiométrica (0,75:1) representam uma condição
ótima para esse fator.
Tabela 2.15- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 23 do 5°
Experimento.
Fatores
A- Temperatura
B- [Água]
C- Tempo de reação
Nível (–)
80 °C
0,5 mol/L
1 hora
Nível (+)
100 °C
1,5 mol/L
3 horas
Tabela 2.16- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 23 do 5° Experimento com os
respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.a
Ensaios
A
B
C
Rend.
(%)
–
–
–
74
9
+
–
–
75
17
–
+
–
76
7
+
+
–
77
15
–
–
+
78
19
+
–
+
79
29
–
+
+
80
18
+
+
+
81
24
0
0
0
82
18
a
Fatores: A = Temperatura; B = [Água]; C =Tempo de reação.
Condições: ácido butírico como solvente/catalisador; [Pirrol] =
0,1 mol/L e Relação molar aldeído/pirrol = 0,75:1.
Com apenas 3 fatores e dois níveis, decidiu-se realizar um Planejamento
Fatorial Completo 23 com um ponto central. Os fatores e os níveis escolhidos para o 5°
48
CAPÍTULO 2
Experimento e as condições de cada ensaio estão mostrados nas Tabelas 2.15 e 2.16.
Novamente, os rendimentos (não isolados) de cada ensaio foram determinados
espectrofotometricamente e são apresentados na Tabela 2.16 e Figura 2.16.
Analisando a Figura 2.12 e a Tabela 2.16, algumas conclusões podem ser
destacadas: percebe-se que quando se passa do nível –1 (80 °C) para +1 (100 °C) da
temperatura, os rendimentos aumentaram (ensaios 75, 77, 79 e 81). O mesmo ocorre
quando se passa do nível –1 (1 h) para +1 (3 h) do tempo de reação, onde observa-se um
aumento nos rendimentos (ensaios 78, 79, 80 e 81).
29
17
Temperatura
100°C
80°C
24
15
18
19
18
3h
9
7
1h
0,5M
Tempo
de reação
1,5M
[Água]
Figura 2.12- Diagrama do planejamento fatorial completo 23 do 5° Experimento com os
rendimentos. Para a variável temperatura, os níveis –1, 0 e 1 correspondem a 80 °C, 90
°C e 100 °C, respectivamente. Para [água], os níveis –1, 0 e 1 correspondem a 0,5
mol/L, 1 mol/L e 1,5 mol/L. Para o fator tempo de reação, os níveis –1, 0 e 1
correspondem a 1 h, 2h e 3 h, respectivamente.
Os efeitos principais dos fatores estudados no 5° Experimento são apresentados
na Tabela 2.17 e Figura 2.13, onde percebe-se que os fatores A (temperatura) e C
(tempo de reação) apresentam efeitos mais significativos nesses experimentos. Os
valores positivos dos efeitos de A e C indicam que experimentos com níveis mais altos
de temperatura e tempo de reação contribuem para aumentar o rendimento da reação.
Uma vez que a temperatura da reação acima de 100 oC poderia levar a uma perda de
água do sistema (por destilação/evaporação), conclui-se que, para a variável
temperatura, 100 oC seria um limite prático aceitável.
49
CAPÍTULO 2
Tabela 2.17- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Completo 23 do 5° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
EFEITOS
A
8,0
B
-2,5
C
10,5
AB
-1,0
AC
0,0
BC
-0,5
a
Fatores: A = Temperatura; B = [Água]; C = Tempo de reação.
temperatura
24
[ água ]
Média dos rendimentos (%)
21
18
15
12
-1
0
1
-1
0
1
tempo de reação
24
21
18
15
12
-1
0
1
Figura 2.13- Efeitos principais do 5° Experimento.
O efeito da água (fator B) não foi estatisticamente significativo, o que pode
estar relacionado com o fato da faixa de concentração de água estudada (0,5 a 1,5
mol/L) já esta perto da condição ótima.
Como a temperatura se encontra no limite, decidiu-se avaliar o efeito do
aumento do tempo de reação, conforme sugerido pelos efeitos principais (Figura 2.13),
num sistema univariado, mantendo-se constantes os demais fatores: concentração de
pirrol a 0,1 mol/L, relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração de água a 1,5
mol/L e temperatura de reação a 100 oC. Nesse sistema univariado, o tempo de reação
foi estendido até 6 h. Os rendimentos para reações de 1, 3, 4, 5 e 6 h foram 15 %, 24 %,
28 %, 25 e 28 %, respectivamente, o que indica que o rendimento se torna
essencialmente constante após 4 h de reação e sugere que não há ganhos relevantes em
reações acima de 3 horas (Figura 2.14). Adicionalmente, percebe-se que a porfirina,
uma vez formada, é relativamente estável no meio de reação.
50
CAPÍTULO 2
30
Rendimentos (%)
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
Tempo de reação (h)
Figura 2.14- Estudo cinético com o pirrol mais concentrado (0,1mol/L). Condições:
relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração de água a 1,5 mol/L e temperatura
de reação a 100 oC.
O maior rendimento nesse planejamento com alta concentração de pirrol foi de
29% (ensaio 79, Tabela 2.16), sendo semelhante ao melhor rendimento obtido
anteriormente com baixa concentração de pirrol (ensaio 69, Tabela 2.13; Fig. 2.15).
Desse modo, sugere-se que, para reações na concentração de pirrol de 0,1 mol/L e com
relação molar aldeído pirrol de 0,75:1, as mesmas sejam realizadas a 100 oC por 3 h,
utilizando uma concentração de água em torno de 1,5 mol/L.
Neste ponto, decidiu-se interromper as otimizações em concentração maior de
pirrol (0,1 mol/L) e retomar a investigação da concentração mais diluída de pirrol (0,05
mol/L).
As análises do 4° Experimento indicaram que rendimentos bons de H2T-2-PyP
poderiam ser obtidos com reações de 1 hora usando pirrol a 0,1 mol/L, relação molar
aldeído/pirrol não estequiométrica (0,75:1) e procurando-se manter a temperatura em
torno de 100° C e a concentração de água em 1,5 mol/L. No 6° Experimento decidiu-se
investigar em maior detalhe o efeito da temperatura e do tempo de reação, mantendo-se
a condição de pirrol mais diluída (0,05 mol/L), a relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1 e
a concentração de água a 1,5 mol/L. Com apenas dois fatores, projetou um
Planejamento Fatorial Completo 22 e um ponto central. Os fatores e os níveis escolhidos
para o 6° Experimento e as condições de cada ensaio estão mostrados nas Tabelas 2.17
51
CAPÍTULO 2
e 2.18. Novamente, os rendimentos (não isolados) de cada ensaio foram determinados
espectrofotometricamente e são apresentados na Tabela 2.18 e Figura 2.19.
Tabela 2.18- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial 22 do 6° Experimento para a
síntese da H2T-2-PyP.
Fatores
Nível (–)
Nível (+)
A- Temperatura
80 °C
100 °C
B- Tempo de reação
1 hora
3 horas
Tabela 2.19 - Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 do 6° Experimento com os
respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.
Ensaios
A
B
83
–
–
84
+
–
85
–
+
86
+
+
87
0
0
a
Fatores: A = temperatura; B = tempo de reação.
Rend. (%)
16
29
28
41
27
A Figura 2.15 ilustra as respostas em função dos níveis da temperatura e do
tempo de reação, incluindo o ponto central. Analisando os rendimentos dos ensaios
deste experimento (Tabela 2.17, Figura 2.15), percebe-se que com a temperatura mais
baixa (nível –1, 80 °C) e o tempo de reação menor (nível –1, 1h) há uma diminuição do
rendimento (ensaio 85). Porém, quando se usa o nível +1 para ambos os fatores (100 °C;
3h, respectivamente) ocorre um aumento acentuado do rendimento, ultrapassando os
valores obtidos nos experimentos anteriores. Em particular, o rendimento máximo
obtido passou de 29 % (4° Experimento) para 41 % (ensaio 86, 6º Experimento).
52
CAPÍTULO 2
Temperatura
+1
29
0
-1
41
27
16
-1
30
28
0
+1
Tempo de reação
Figura 2.15- Diagrama do 6° Experimento com os rendimentos (não isolados) da H2T2-PyP. Para a variável temperatura, os níveis –1, 0 e 1 correspondem a 80, 90 e 100 °C,
respectivamente. Para o tempo de reação, os níveis –1, 0, 1 e √ correspondem a 1, 2, 3
e 3,26 h, respectivamente.
Os efeitos principais dos fatores estudados no 6° Experimento (Tabela 2.20 e
Fig. 2.16) sugerem que a temperatura e o tempo de reação são efeitos relevantes nesse
experimento. Porém, o uso de uma temperatura mais alta (acima de 100 oC) torna-se
inviável, já que acima de 100 °C, poderia ocorrer a evaporação/destilação da água
presente no sistema. Assim, a temperatura foi limitada a 100 °C.
Tabela 2.20- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Completo 22 do 6° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
EFEITOS
A
13
B
12
AB
0
a
Fatores: A = temperatura; B = tempo de reação.
53
CAPÍTULO 2
Temperatura
36
Tempo de reação
Média dos rendimentos (%)
34
32
30
28
26
24
22
-1
0
1
-1
0
1
Figura 2.16- Efeitos principais do 6°Experimento.
Analisando a Tabela 2.18, Figura 2.17, percebe-se que não existe efeito de
interação entre os fatores temperatura e tempo de reação (AB), logo, conclui-se que
esses fatores são independentes.
Temperatura
-1
0
1
Média dos redimentos (%)
40
35
30
25
20
15
-1
0
Tempo de reação
1
Figura 2.17- Efeito de interação AB do 6° Experimento.
Com o experimento finalizado, resolveu-se realizar mais uma reação, fixando a
temperatura no nível 0 (90 °C) e o tempo de reação no nível √ (3,26 h). O rendimento
obtido nesta reação foi de 40 % (Fig. 2.15).
De modo análogo ao efetuado para a concentração alta de pirrol (5º
Experimento), decidiu-se avaliar univariavelmente o efeito do aumento do tempo de
reação, conforme sugerido pelos efeitos principais (Figura 2.15), mantendo-se
constantes os demais fatores: concentração de pirrol a 0,05 mol/L, relação molar
54
CAPÍTULO 2
aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração de água a 1,5 mol/L e temperatura de reação a 100
o
C. Novamente, o tempo de reação foi estendido até 6 h. Os rendimentos para reações
de 1, 3, 4, 5 e 6 h foram 29 %, 41 %, 41 %, 41 % e 43 %, respectivamente, o que indica
que o rendimento se torna essencialmente constante após 3 h de reação (Figura 2.18).
Apesar de um aumento de 2 % no rendimento, conclui-se que esse ganho não é
relevante em reações mais longas que 3 h. Desse modo, para reações na concentração de
pirrol de 0,05 mol/L e com relação molar aldeído pirrol de 0,75:1, sugere-se que as
mesmas sejam realizadas a 100 oC por 3 h, utilizando uma concentração de água em
torno de 1,5 mol/L.
Rendimentos (%)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
Tempo de reação (h)
Figura 2.18- Estudo cinético com o pirrol mais diluído (0,05 mol/L). Condições:
relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração de água a 1,5 mol/L e temperatura
de reação a 100 oC.
2.4.4 Otimização da síntese da H2T-2-PyP em ácido acético
Finalizadas as reações com ácido butírico como solvente/catalisador, decidiuse investigar a otimização em ácido acético. Essa decisão foi norteada pelas seguintes
razões: 1) ácido acético é economicamente mais viável do que o ácido butírico e 2)
possui um odor menos desagradável (o ácido butírico lembra manteiga rançosa). Com
esse objetivo, foram projetados 2 planejamentos (denominados 7º e 8º experimentos,
abaixo) baseados nos últimos experimentos (5º e 6º experimentos) das otimizações em
ácido butírico.
55
CAPÍTULO 2
Baseado no 5° experimento, um novo experimento foi projetado para avaliar os
fatores temperatura, concentração de água e tempo de reação com a concentração de
pirrol fixada no nível 0,1 mol/L e na presença de ácido acético como
solvente/catalisador. Os fatores e os níveis escolhidos para o 7° Experimento e a matriz
do Planejamento Fatorial Completo 23 do 7° Experimento com as condições de cada
ensaio estão mostrados nas Tabelas 2.21 e 2.22. Os rendimentos (não isolados) de cada
ensaio foram determinados espectrofotometricamente e são apresentados na Tabela
2.22.
Tabela 2.21- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 23 do 7° Experimento.
Fatores
A- Temperatura
B- [Água]
C- Tempo de reação
Nível (–)
80 °C
0,5 mol/L
1 hora
Nível (+)
100 °C
1,5 mol/L
3 horas
Tabela 2.22- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 23 do 7° Experimento com os
respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP. a
Ensaios
A
B
C
Rend. (%)
–
–
–
88
13
+
–
–
89
24
–
+
–
90
17
+
+
–
91
20
–
–
+
92
22
+
–
+
93
31
–
+
+
94
25
+
+
+
95
26
0
0
0
96
30
a
Fatores: A = Temperatura; B = [Água]; C = Tempo de reação.
Analisando a Figura 2.19 e a Tabela 2.22, percebe-se que quando se passa do
nível –1 (80 °C) para +1 (100 °C) da temperatura, os rendimentos aumentam (ensaios
89, 91, 93 e 95). O mesmo ocorre quando se passa do nível –1 (1 h) para +1 (3 h) do
tempo de reação, onde os rendimentos também aumentam (ensaios 92, 93, 94 e 95).
56
CAPÍTULO 2
31
100°C
26
24
20
30
22
25
3h
80°C
13
17
1h
0,5M
Tempo
de reação
1,5M
[Água]
Figura 2.19- Diagrama do 7° Experimento com os rendimentos. Para a variável
temperatura, os níveis -1, 0 e 1 correspondem a 80 °C, 90 °C e 100 °C, respectivamente.
Para [água], os níveis -1, 0 e 1 correspondem a 0,5 mol/L, 1 mol/L e 1,5 mol/L. Para o
fator tempo de reação, os níveis -1, 0 e 1 correspondem a 1 h, 2h e 3 h, respectivamente.
A análise dos efeitos principais dos fatores estudados no 7° Experimento
(Tabela 2.23 e Figura 2.20) confirma que os fatores A (temperatura) e C (tempo de
reação) são mais significativos e que o ponto ótimo deste sistema já se encontra em
torno das condições do ponto central.
Tabela 2.23- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Completo 23 do 7° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
EFEITOS
A
6,0
B
-0,5
C
7,5
AB
-4,0
AC
-1,0
BC
-0,5
a
Fatores: A = Temperatura; B = [Água]; C = Tempo de reação.
57
CAPÍTULO 2
temperatura
[ água ]
30,0
Média dos rendimentos (%)
27,5
25,0
22,5
20,0
-1
0
tempo de reação
1
-1
0
1
-1
0
1
30,0
27,5
25,0
22,5
20,0
Figura 2.20- Efeitos principais do 7° Experimento.
Assim, comparando esse planejamento com aquele realizado com o ácido
butírico como solvente/catalisador (5° Experimento), percebe-se que o uso de ácido
acético leva a rendimentos semelhantes àqueles obtidos com o ácido butírico. O
rendimento máximo desse experimento foi de 31% (ensaio 93, Tabela 2.22),
correspondendo a um dos vértices do cubo do experimento, cujas condições de reação
são: relação molar aldeído pirrol de 0,75:1, concentração de água a 1,5 mol/L,
temperatura a 100 oC e tempo de reação de 3 h.
Embora os resultados do experimento indiquem que o fator A (temperatura)
deva ser aumentado, destaca-se que já se está próximo ao ponto de ebulição do ácido
acético (118 oC), e que o uso de temperatura maior que 100 oC pode levar à
destilação/evaporação da água. Isto implica em uma limitação prática para a
investigação de temperaturas superiores a 100 ºC.
Decidiu-se, então, verificar se haveria ganho de rendimento com o aumento do
tempo de reação. Assim, foi efetuada uma reação de 4 h na seguinte condição:
concentração de pirrol a 0,1 mol/L, relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração
de água a 1,5 mol/L e temperatura de reação a 100 oC. Os rendimentos para reações de
1, 3 e 4 h, nas mesmas condições, foram 20 % (ensaio 91, Tabela 2.22), 26 % (ensaio
95, Tabela 2.22) e 30 %, respectivamente, o que indica que o rendimento aumenta após
1 h de reação. Desse modo, para reações em ácido acético com concentração de pirrol
de 0,1 mol/L e com relação molar aldeído pirrol de 0,75:1, sugere-se que as mesmas
sejam realizadas a 100 oC por 3 h, utilizando uma concentração de água em torno de 1,5
mol/L.
58
CAPÍTULO 2
Uma vez que para o ácido butírico os ensaios de otimização indicaram que um
valor máximo de rendimento poderia ser obtido na concentração mais diluída de pirrol
(0,05 mol/L), conforme resultados do 6º Experimento, decidiu-se investigar as
condições deste experimento para o caso do ácido acético. Assim, o 8° Experimento foi
construído analisando os fatores tempo de reação e temperatura, em um Planejamento
Fatorial Completo 22 e um ponto central. Os fatores e os níveis escolhidos para o 8°
Experimento e a sua respectiva matriz de planejamento com as condições de cada
ensaio estão mostrados nas Tabelas 2.24 e 2.25. Foram mantidas fixas a concentração de
pirrol a 0,05 mol/L, a relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1 e a concentração de água a
1,5 mol/L. Os rendimentos (não isolados) de cada ensaio foram determinados
espectrofotometricamente e são apresentados na Tabela 2.25.
Tabela 2.24- Fatores e níveis do Planejamento Fatorial Completo 22 do 8°
Experimento.
Níveis(–)
Níveis(+)
A- Temperatura
80 °C
100 °C
B- Tempo de reação
1 hora
3 horas
Fatores
Tabela 2.25- Matriz do Planejamento Fatorial Completo 22 do 8° Experimento com os
respectivos rendimentos (não isolados) de H2T-2-PyP.
Ensaios
A
B
Rend.
(%)
–
–
97
22
+
–
98
40
–
+
99
29
+
+
100
31
0
0
101
32
Fatores: A= temperatura; B= tempo de reação. Condições: pirrol 0,05 mol/L,
a relação aldeído/pirrol foi fixada em 0,75:1, a concentração de água a 1,5
mol/L e o ácido acético como solvente/catalisador.
A Figura 2.21 ilustra as respostas em função dos níveis da temperatura e o
tempo de reação, incluindo o ponto central. Analisando os rendimentos desse
experimento (Figura 2.21), quando se usa o nível –1 (80 °C) da temperatura e do tempo
de reação (1h), percebe-se uma diminuição do rendimento (ensaio 97). Porém, quando
59
CAPÍTULO 2
se usa o nível + para ambos os fatores (100 °C; 3hs), ocorre um aumento do rendimento.
Observa-se que, enquanto as condições ótimas para reações com concentração de pirrol
a 0,1 mol/L resultam em rendimentos da ordem de 31 % (7° Experimento), as condições
ótimas para a concentração mais diluída de pirrol (0,05 mol/L; 8º Experimento) os
rendimentos atingiram 40 % (ensaios 98).
Temperatura
+1
40
0
-1
31
32
22
-1
29
0
+1
Tempo de reação
Figura 2.21- Diagrama do 8° Experimento com os rendimentos. Para a variável
temperatura, o nível -1 corresponde a 80 °C, o nível 0 a 90 °C e o nível +1 corresponde
100 °C. Para o tempo de reação, o nível -1 corresponde a uma hora, o nível 0 a duas
horas e o nível +1 corresponde a três horas.
Analisando a Tabela 2.26 e Figura 2.22 A, percebe-se que apenas o fator A
(temperatura) foi significativo. A Figura 2.22 B mostra que há efeito de interação AB
entre os fatores A e B, uma vez que o efeito da temperatura depende do nível em que se
encontra o tempo de reação.
Tabela 2.26- Efeitos principais e de interação entre os fatores do Planejamento Fatorial
Completo 23 do 8° Experimento para a síntese da H2T-2-PyP.a
TERMOS
EFEITOS
A
10,0
B
-1,0
AB
-8,0
Fatores: A= temperatura; B= tempo de reação
60
CAPÍTULO 2
temperatura
temperatura
-1
0
1
40
tempo de reação
Média dos rendimentos (%)
Média dos rendimentos (%)
35,0
32,5
30,0
27,5
35
30
25
20
25,0
-1
-1
0
1
-1
0
1
0
tempo de reação
1
Figura 2.22- Efeitos principais (esquerda) e de interação AB (direita) do 8°
Experimento
Apesar dos efeitos principais mostrarem que para melhorar o rendimento devese investigar níveis maiores da temperatura, esta já se encontra essencialmente em um
nível máximo prático, conforme discutido no experimento anterior.
De modo a confirmar que o fator tempo de reação já se encontra em níveis
ótimos e não tem efeito significativo nas condições estudadas, decidiu-se, então,
verificar se haveria ganho de rendimento com o aumento do tempo de reação. Assim,
foram efetuadas três reações com os tempos de 2, 4 e 6 h na seguinte condição:
concentração de pirrol a 0,05 mol/L, relação molar aldeído/pirrol a 0,75:1, concentração
de água a 1,5 mol/L e temperatura de reação a 100 °C. Os rendimentos para essas
reações foram 38, 43 e 41 %, respectivamente, o que indica que o rendimento, de fato, é
essencialmente constante após 1 h. Não há ganhos relevantes, portanto, em reações mais
longas que 1 h. Desse modo, para reações na em ácido acético com concentração de
pirrol de 0,05 mol/L e com relação molar aldeído pirrol de 0,75:1, sugere-se que as
mesmas sejam realizadas a 100 oC por 3 h, utilizando uma concentração de água em
torno de 1,5 mol/L.
2.4.5 Reações em escala preparativa e isolamento da H2T-2-PyP
Com a otimização da síntese H2T-2-PyP em pequena escala finalizada, iniciouse o escalonamento da síntese de H2T-2-PyP em escala preparativa para isolamento.
Foram realizadas duas reações em ácido butírico e três reações em ácido acético.
As reações em ácido butírico, em escala de 100 mL, foram realizadas a 100 °C
por 1 h com concentrações de pirrol a 0,05 mol/L, de 2-piridinacarboxaldeído a 0,0374
mol/L (relação molar aldeído/pirrol de 0,75:1) e de água a 1,0 mol/L. Os rendimentos
obtidos para essas condições foram entre 11-23%.
61
CAPÍTULO 2
Para as reações em ácido acético, os ensaios foram realizados em escala de 50
mL a 100 °C por 1,5 horas, utilizando 2,53 mmol de concentrações de pirrol a 0.05
mol/L, de 2-piridinacarboxaldeído a 0,0374 mol/L e de água a 1,5 mol/L. Os
rendimentos foram entre 15-25%.
Os rendimentos isolados para as duas condições (ácido butírico e acético)
correspondem aproximadamente à metade daqueles estimados (não isolados) em
pequena escala. Apesar desta diferença, destaca-se que estes são bastante superiores
àqueles regularmente obtidos para a H2T-2-PyP em condição da literatura (longe das
condições ótimas desenvolvidas no presente estudo, e que se comparam àqueles de
muitas porfirinas derivadas da tetrafenilporfirina, cujas síntese e purificação são mais
simples. Essa diminuição de rendimento entre os sistemas em pequena escala (não
isolados) e os rendimentos isolados pode estar relacionada com as várias etapas de
purificação presentes durante todo o processo, como por exemplo, uma etapa de
precipitação, algumas filtrações, uma etapa de extração e, por fim, uma etapa
cromatográfica. Outro fator importante pode ser o escalonamento em si, uma vez que
alguns procedimentos são difíceis de reproduzir ao se passar de pequena para larga
escala (por exemplo, etapas de aquecimento e resfriamento de um volume grande
solvente) e que poderiam afetar a síntese da H2T-2-PyP.
Apesar da cromatografia ser o método mais efetivo de purificação da classe de
N-piridilporfirinas, a evaporação do solvente de reação e tratamento direto do resíduo
total por cromatografia é trabalhoso, sendo necessárias várias etapas cromatográficas
para se eliminar todas as impurezas que se formam na síntese. Na tentativa de
minimizar o uso de cromatografia, procurou-se iniciar as etapas de purificação via
separação entre porfirina e demais impurezas utilizando precipitação (HAMBRIGHT et
al., 1985) ou extração líquido-líquido (ZAKAVI et al., 2012). Esses procedimentos
foram estudados para reações em ácido acético e deram origens a rotas de purificação
que foram denominadas método 1 e método 2. Eventualmente concluiu-se que os dois
métodos eram igualmente eficientes para o isolamento da H2T-2-PyP.
No método 1, a purificação foi iniciada com o ajuste do pH da mistura
reacional para 4,1, levando ao aparecimento de um precipitado roxo. Filtração resultou
em um sólido rico em H2T-2-PyP (contaminado com algum polipirrol) e na eliminação
do ácido acético do sistema. Já no método 2, água foi adicionada diretamente ao meio
de reação resultando em uma mistura com pH ~2,0, e a purificação da porfirina foi
iniciada com uma etapa de extração com CHCl3 (ou diclorometano) (ZAKAVI et al.,
62
CAPÍTULO 2
2012); a fase orgânica resultante mostrou-se rica em H2T-2-PyP, enquanto a fase aquosa
mostrou-se rica em polipirrol. Posteriormente, ocorreu uma etapa de lavagem (NaHCO3
e água), comum aos 2 métodos, para a possível retirada de algum resquício de ácido que
ainda esteja presente no precipitado (método 1) ou na solução (método 2). A próxima
etapa consistiu em uma purificação parcial do sistema em ambos os métodos, na qual
foram adicionados solventes orgânicos ao precipitado (método 1) e à solução em CHCl3
(método 2). Por fim, na última etapa, fez-se necessário a realização de uma coluna
cromatográfica para a eliminação total de impurezas. As amostras de H2T-2-PyP
isoladas apresentaram características espectrais e comportamentos cromatográficos
idênticos àqueles da amostra comercial.
Com o término das purificações, a H2T-2-PyP foi caracterizada por
espectroscopia eletrônica na região do UV-vis, por RMN de 1H e por CCD (SiO2,
CHCl3:MeOH, 9:1, v/v).
Para as reações em ácido butírico, o método de purificação apresentou poucas
diferenças daqueles desenvolvidos para as reações em ácido acético, exceto que a
eliminação do ácido butírico foi efetuada por extração líquido-líquido com HCl 5
mol/L), uma vez que o ácido butírico não é solúvel em HCl concentrado. Com a
eliminação do ácido, iniciou-se a etapa de precipitação, na qual o pH foi ajustado para
aproximadamente 5,0, conforme o método 1 descrito para o ácido acético.
Figura 2.23- Espectro eletrônico de absorção na região do UV-vis da H2T-2-PyP
isolada em CHCl3.
63
CAPÍTULO 2
A presença de H2T-2-PyP foi confirmada por espectroscopia UV-vis , onde se
observa um espectro com uma banda Soret em 416 nm em CHCl3 (Fig. 2.23) e um
espectro com uma banda Soret em 439 nm em HCl 1 mol/L (Figura 2.3). Ambos os
dados são coincidentes com os reportados na literatura (KALYANASUNDARAM,
1984).
As análises por CCD (Figura 2.24) mostram a co-eluição dos produtos (reação
em ácido butírico e acético) com uma amostra autêntica de H2T-2-PyP. Percebe-se a
presença de apenas uma mancha na CCD para cada produto isolado e sua fluorescência
vermelha característica quando observado sob a lâmpada UV de comprimento de onda
longo (λmáx~365 nm) em câmara escura.
Figura 2.24- Placa de CCD-SiO2 das amostras de H2T-2-PyP isoladas (em ácido
butírico e ácido acético ) e da amostra autêntica de H2T-2-PyP. As frações foram eluídas
com CHCl3:MeOH (9:1, v/v) até que a marca do solvente atingisse 10 cm a partir dos
pontos de aplicação.
A H2T-2-PyP foi também caracterizada por RMN de 1H (Fig. 2.25). Para
confirmar a estrutura, o espectro da amostra isolada foi comparado a um espectro de
uma amostra comercial e observou-se um mesmo perfil espectral. Analisando o
espectro, pode-se destacar um singleto –2,83 ppm referente aos hidrogênios internos
NH que são altamente blindados pela corrente  do anel porfirínico. Na região de baixo
campo um singleto referente aos hidrogênios β-pirrólicos (8,87 ppm) sendo os dados
coincidentes com os reportados na literatura (KAMP;. SMITH, 1996).
64
CAPÍTULO 2
Figura 2.25- Espectro de RMN de 1H (200 MHz) da H2T-2-PyP (isolada e comercial)
em CDCl3 com atribuição.
2.5 Conclusões
Os planejamentos e a otimização da síntese da H2T-2-PyP foram realizados
através de técnicas quimiométricas, envolvendo planejamentos fatoriais completos,
fatoriais fracionários, bem como a análise por superfície de resposta. Ao todo, 10 fatores
foram investigados: concentração de pirrol, cuja faixa investigada compreende
concentrações entre 0,02 – 0,5 mol/L; a relação molar aldeído/pirrol que foi estudada
com valores entre 0,5:1 – 1,5:1; a temperatura que foi avaliada entre 80 – 150 °C; a
concentração de ácido tricloroacético que compreendeu valores entre 0 – 2 mol/L;
relação molar Zn+2/pirrol cuja faixa compreende valores entre 0 – 1:4; o tempo de
reação foi investigado com valores entre 0,5 – 6 horas; concentração de água cuja faixa
estudada compreende concentrações entre 0 – 5 mol/L; a relação molar iodo/pirrol foi
investigada com valores entre 0:1 – 1:1; relação molar H2O2/pirrol com faixa entre 1:4 –
3:4 e o solvente/catalisador testados foram o ácido butírico e o ácido acético.
Com a realização de 6 experimentos na presença de ácido butírico como
solvente/catalisador, as melhores condições de síntese envolvem:
65
CAPÍTULO 2
1) [pirrol]= 0,1 mol/L, a relação molar aldeído/pirrol 0,75:1, a temperatura a
100 °C, com a concentração de água a 1,5 mol/L e com um tempo de
reação de 3 horas. O rendimento obtido em pequena escala foi de 29%.
Mas, nessas condições, não testou a síntese em escala preparativa (50 ou
100 mL).
2) [pirrol]= 0,05 mol/L, a relação molar aldeído/pirrol 0,75:1, a temperatura a
100 °C, com concentração de água a 1,5 mol/L e com um tempo de reação
de 3 horas. O rendimento obtido em pequena escala foi de 41%, porém em
escala grande (100 mL), o rendimento para a H2T-2-PyP isolada
correspondeu a 23% de rendimento com aproximadamente 130 mg de
massa.
Com o emprego do ácido acético como solvente/catalisador foram realizados 2
experimentos, as melhores condições de síntese compreendem:
1) [pirrol]= 0,1 mol/L, a relação molar aldeído/pirrol 0,75:1, a temperatura a
100 °C, com a concentração de água a 1,5 mol/L e com um tempo de
reação de 3 horas. Para a síntese em pequena escala, o rendimento foi de
31%, porém a reação em escala preparativa (50 ou 100 mL) não foi
realizada.
2) [pirrol]= 0,05 mol/L, a relação molar aldeído/pirrol 0,75:1, a temperatura a
100 °C, com concentração de água a 1,5 mol/L e com um tempo de reação
de 3 horas. O rendimento obtido em pequena escala foi de 40%, porém em
escala grande (50 mL), o rendimento para a H2T-2-PyP isolada
correspondeu a 25% de rendimento com aproximadamente 75 mg de
massa.
Além da otimização da síntese, foram desenvolvidos 2 métodos para o
isolamento e a purificação da H2T-2-PyP, na qual comprovou-se a eficiência em ambos
os métodos. Também foi desenvolvido um procedimento analítico espectrofotométrico
para a quantificação rápida dos rendimentos dos ensaios, sem a necessidade de
isolamento ou purificação, bem como permitiu a realização de reações em pequena
escala.
66
CAPÍTULO 3:
Atividade de Mn(III) e Fe(III) Nalquilpiridilporfirinas na dismutação
de peróxido de hidrogênio: Modelos
da enzimas Catalase
CAPÍTULO 3
3 Atividade de Mn(III) e Fe(III) Nalquilpiridilporfirinas na dismutação de peróxido
de hidrogênio: Modelos das enzimas catalase1
3.1 Introdução
O estresse oxidativo é definido como a situação na qual a formação de espécies
reativas excede significativamente a capacidade de defesa antioxidante e de reparo do
organismo, tendo como conseqüência o aumento de danos a biomoléculas (DNA,
lipídios, proteínas) (BARBOSA, 2006).
O metabolismo aeróbio apresenta uma série de reações que podem formar
espécies reativas (radicais livres) de oxigênio e nitrogênio, elevando os níveis de
estresse oxidativo (Fig. 3.1). As enzimas SOD têm um papel essencial na regulação
desses níveis nas células, órgãos e tecidos, sendo a primeira linha de defesa do
organismo (BATINIC-HABERLE et al., 2009a). Durante o ciclo das SOD, o H2O2 é
produzido, podendo ser facilmente reduzido a H2O via peroxidases (tal como a
glutationa peroxidase, GPx) ou dismutado via catalase, formando O2 e H2O.
Figura 3.1- Esquema das reações e respectivas enzimas envolvidas na
formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. NOS: NO sintase; SOD:
superóxido dismutase; GPx: glutationa peroxidase; Prx: peroxirredoxinas; GR:
glutationa redutase; TrxR: tiorredoxina redutase; Trx: tiorredoxina; GSH: glutationa
reduzida; GSSG: glutationa oxidada (dímero). (BARBOSA, 2006).
1
Os dados apresentados neste Capítulo foram recentemente publicados: Artak Tovmasyan,Clarissa G. C.
Maia, Tin Weitner,Romulo S. Sampaio,Dominik Lieb, Robert Ghazaryan, Ivana Ivanovic-Burmazovic,
Julio S. Reboucas,Ludmil Benov, and Ines Batinic-Haberle. A comprehensive evaluation of the catalase
like activity of different classes of redox-active therapeutics.Free Radical Bio. Med., 2015, 86, 308–321.
doi 10.1016/j.freeradbiomed.2015.05.018.
68
CAPÍTULO 3
O peróxido de hidrogênio (H2O2) participa de várias vias redox em sistemas
fisiológicos e patológicos (FORMAN et al., 2010). Além disso, H2O2 e seus derivados
estão envolvidos no tratamento do câncer via quimioterapia e radioterapia (ZHANG et
al., 2009; HOLLEY et al., 2014). São inúmeros os sistemas presente no organismo para
manter os níveis de H2O2 em concentrações da ordem de nmol/L, concentração
suficiente para que o H2O2 exerça o seu papel na sinalização celular sem maiores efeitos
oxidativos globais. Dentre esses sistemas de controle dos níveis de H2O2 celular, podese citar glutationa peroxidases (GPx), glutationa redutases, catalases, entre outros.
Drogas sintéticas com atividade redox, como metaloporfirinas, Mn(III) Salens, e
drogas naturais, como flavonóides e catecol, podem interferir direta ou indiretamente
nos processos oxidativos celulares (BUETTNER et al., 2013). Estudos recentes
confirmam que, pelo menos, uma das ações desses compostos é pró-oxidante, o que
pode levar a uma resposta adaptativa e supra-regulação de sistemas de defesa endógenos
que podem resultar em efeito essencialmente antioxidante (COHEN et al., 2013;
FORMAN et al., 2013; BATINIC-HABERLE et al., 2014). Durante estes eventos, o
H2O2 pode ser produzido e/ou utilizado na oxidação de biomoléculas, como no ciclo
quinonas/catecóis, onde radicais semiquinonas podem ser oxidados à quinona enquanto
reduzem O2 para O2•–, que, na presença de SOD, é dismutado a H2O2 (Fig. 3.2).
Subsequentemente, o H2O2 pode efetuar a oxidação de tióis de proteínas de sinalização,
afetando a transcrição celular. Em sistemas biomiméticos, algumas dessas reações de
oxidação podem ser catalisadas por compostos metálicos usualmente desenvolvidos
como mímicos de SOD, inclusive metaloporfirinas.
Figura 3.2- Ciclo redox parcial das quinonas.(FERREIRA, 2003).
69
CAPÍTULO 3
Mímicos da SOD contendo centros porfirínicos são antioxidantes poderosos,
reduzindo O2.-, ONOO-, CO3.-, sendo também eficazes na oxidação de biomoléculas.
Enquanto mímicos SOD catalisam a dismutação de O2•– com taxas elevadas que se
aproximam das enzimas, a sua estrutura menor em relação à das enzimas SOD lhes
permitem interagir rapidamente com muitos outros alvos. Particularmente, durante o
processo de dismutação do O2•–, mímicos de SOD oxidam O2•– a O2. Além disso,
mímicos de SOD à base de metaloporfirinas podem oxidar ascorbato ao radical ascorbil
(Figura 3.3) e tióis a dissulfetos em ciclos acoplados com a redução de O2 para O2•–
(que, por sua vez, pode ser dismutado em H2O2 e O2) (BATINIC-HABERLE et al.,
2014).
Figura 3.3- Mecanismo de oxidação do ascorbato por espécies radicalares (BARBOSA,
2006).
3.2 Técnica Eletroanalítica – Coulometria
Há 3 métodos eletroanalíticos que se baseiam na oxidação ou redução de um
analito por período suficiente que assegure sua conversão quantitativa a um novo estado
de oxidação (SKOOG, 2000; BARD; FAULKNER, 2001). Tais métodos são a
coulometria à potencial constante, a coulometria a corrente constante ou titulação
coloumétrica e a eletrogravimetria. A forma mais simples para promover uma eletrolise
é manter constante o valor do potencial na célula.
Os métodos coulométricos são realizados por meio da medida da quantidade de
carga elétrica requerida para converter uma amostra de um analito quantitativamente a
um diferente estado de oxidação (SKOOG et al., 2002).
Na coulometria de potencial controlado, o potencial do eletrodo de trabalho é
mantido em um nível constante de forma que apenas o analito seja responsável pela
condução de carga na interface eletrodo/solução. Então, a carga requerida para
converter o analito ao seu produto de reação é determinada registrando-se e integrandose a curva corrente versus tempo, durante a eletrólise (WANG, 2000).
70
CAPÍTULO 3
Nesta técnica, a corrente diminui exponencialmente à medida que a
concentração do analito em análise diminui. Como a corrente não é constante, a carga é
medida pela integração da corrente sobre o tempo da reação.
Para uma corrente que varia com o tempo, a quantidade de carga Q em um
tempo t é a área sombreada sob a curva, obtida pela integração da curva corrente-tempo
(Figura 3.4).
Figura 3.4 - Gráfico corrente versus tempo para coulometria de potencial
controlado. Adaptado de SKOOG, 2000.
Uma corrente significativa flui entre os eletrodos auxiliar e de trabalho. Uma
corrente desprezível flui ate o eletrodo de referência; seu potencial, portanto, não é
afetado pelo potencial ohmico, pela polarização de concentração e pela sobrevoltagem.
Ele realmente mantém um potencial de referência constante. Em uma eletrólise com
potencial controlado, o potencial entre os eletrodos de referencia e de trabalho é
mantido constante por um sistema eletrônico chamado potenciostato. Na coulometria
com potencial controlado, a eletrólise é considerada completa quando a corrente decai
ate 99% do seu valor inicial.
71
CAPÍTULO 3
3.3 Objetivos
Uma vez que a dismutação de superóxido resulta na formação de H2O2, é de
interesse se avaliar se compostos que atuam como mímicos da SOD podem agir também
como eficientes mímicos da enzima catalase. Desse modo, descreve-se, nesse Capítulo,
um estudo sistemático da atividade catalase de uma série de compostos comumente
utilizados como mímicos de SOD e/ou moduladores redox, pertencentes a diferentes
classes de metaloporfirinas sintéticas e compostos de coordenação, além de alguns
sistemas orgânicos. Os compostos investigados neste estudo estão apresentados nas
Figuras 3.5 e 3.6.
Figura 3.5- Estruturas de Mn(III)porfirinas cuja atividade catalase foi avaliada nesse
estudo.
72
CAPÍTULO 3
Fe porfirinas
Fe corrol
Nitrona
Mn(II) Salen
Nitróxido
Mn(II) poliaminas cíclicas
Figura 3.6- Estruturas de outras classes de compostos com propriedades redox, cuja
atividade catalase foi avaliada nesse estudo.
3.4 Parte Experimental
3.4.1 Reagentes e Solventes
Todas as metaloporfirinas (MnP e FeP) catiônicas e Mn Salen (EUK-8) foram
sintetizados pelo grupo da Drª. Batinić-Haberle (Duke University, EUA). A MnTBAP3–
foi sintetizada pelo Dr. Rebouças (UFPB). As Mn(II) poliaminas cíclicas foram
sintetizadas pelo grupo da Drª. Ivanovic-Burmazovic (Friedrich-Alexander Universitat,
Alemanha). A nitrona NXY-059 (Selleckchem), o nitróxido Tempol (Enzo), a enzima
catalase (Sigma-Aldrich), o composto de selênio Ebselen (Cayman Chemical Company)
foram de origem comercial. Todos os compostos foram analisados para confirmar
identidade e pureza e usados como recebidos. Tris, EDTA e H2O2 foram adquiridos da
Sigma e usados sem purificação adicional.
3.4.2 Equipamentos
Para aquisição dos dados eletroquímicos foi utilizado o potenciostato CH
Instruments modelo 600, acoplado a um eletrodo Clark seletivo para O2.
73
CAPÍTULO 3
3.4.3 Metodologia
As análises foram baseadas na medição direta de O2 produzido pela reação da
de dismutação de H2O2 (2H2O2 → 2H2O + O2). Análises de diferentes concentrações
das amostras (MnPs, FePs, catalase,entre outros) foram realizadas eletroquimicamente
por um eletrodo de O2 de Clark, ligado a um potenciostato.
Os experimentos foram iniciados com a adição de 1,7 mL de tampão TRIS (50
mmol/L, 0,1 mmol/L de EDTA, pH 7,4) em solução saturada de ar (21% de O2). Foi
utilizado um eletrodo de O2 de Clark (0,1 mol/L de KCl) ligado a um potenciostato. Um
potencial de E = - 0,8 V vs Ag/AgCl foi aplicado ao eletrodo e a corrente inicial foi
estabilizada (Imax, corresponde a uma concentração de O2 de 0,255 mmol/L). Após a
corrente inicial ser estabilizada, a solução foi purgada com N2 e esperou-se até que a
corrente (Imin, corresponde a [O2] ≈ 0 mmol/L) fosse novamente estabilizada. Isso
permite o calculo da concentração de O2 na solução em μmol/L com a seguinte
expressão: [O2]obs = ((Iobs – Imin) × 255) / (Imax – Imin), onde Iobs é a corrente observada
após a purga. Este processo de calibração é seguido pela adição de H2O2 de modo que a
concentração de na cela de medida fosse 1 mmol/L. Posteriormente, o sistema foi
rapidamente fechado e o N2 foi cessado. Então, os compostos foram adicionados com
concentrações que variaram entre 2-20 μmol/L e a catalase entre 0,1-1 pmol/L. O
aumento na corrente (Iobs) corresponde ao aumento da concentração de O2 (Δ[O2]) e foi
monitorado por pelo menos 300 s. A taxa de reação, ν0 = kcat [catalisador]0 . [H2O2]0 foi
calculada através do coeficiente linear com ν0 = ([O2]obs(t2) - [O2]obs(t1)) / (t2-t1), onde
kcat [H2O2]0 = kobs, e ν0 = kobs [catalisador]0. Quando os valores de ν0 foram
representados graficamente com a concentração do catalisador, o kobs é obtido.
Finalmente, uma vez que Δ[H2O2] = 2 Δ[O2], então a constante de velocidade de
segunda ordem em mol/L, pode ser calculada como kcat = 2 kobs / [H2O2]0.
Um experimento típico para a determinação de kcat é exemplificado para a
enzima catalase (Figura 3.7). O gráfico mostra as etapas para o procedimento de
quantificação da concentração de O2 produzida a partir da dismutação do H2O2
adicionado ao sistema como substrato.
74
CAPÍTULO 3
1,E-06
Imax
9,E-07
8,E-07
Purga da solução com N2
Corrente, A
7,E-07
6,E-07
Purga com N2 cessada
5,E-07
H2O2
4,E-07
3,E-07
Adição do composto modelo
2,E-07
Imin
1,E-07
0,E+00
0
100
200
300
400
500
600
Tempo, s
Figura 3.7 - Gráfico corrente vs tempo para cálculo da taxa de evolução de O2 (mol/L
s-1). Condições: [CAT] = 1,5 x 10-10 mol/L, [H2O2]0 = 1 mmol/L, Tris 50 mmol/L,
EDTA 0.1 mmol/L, pH = 7.4.
3.5 Resultados e Discussão
As Mn-porfirinas que foram avaliadas quanto à atividade catalase, através da
capacidade de catalisar a dismutação de H2O2, incluíram derivados hidrossolúvies
catiônicos e aniônicos (Fig. 3.4). Dentre esses compostos, destacam-se particularmente
as porfirinas derivadas da 2-N-piridilporfirina, que possuem elevada atividade de
dismutação do superóxido kcat(O2•–), semelhante à das enzimas SOD. Nota-se, no
entanto, que a seleção de compostos incluiu também a MnTBAP3– (REBOUÇAS et al.
2008) e a MnTE-2-PyPhP5+ (TOVMASYAN et al., 2014) que não são consideradas
mímicos de SOD. Apesar da inatividade como modelo de SOD, a MnTBAP3– tem
apresentado atividade biológica em alguns modelos experimentais in vivo e in vitro
(CELIC et al., 2014; LEE et al., 2013).
As classes dos outros compostos com atividade redox moduladora (Fig. 3.5)
incluem mímicos de SOD, tais como Fe-porfirinas (FeP), bem como compostos como
nitronas e nitróxidos que não são mímicos de SOD, mas participam do ciclo de outras
espécies reativas, que eventualmente, eliminam O2•–.
A partir da taxa de evolução de O2 medida em várias concentrações dos
compostos de interesse, foi possível calcular a atividade catalase para cada sistema.
Gráficos típicos desses estudos são apresentados Figura 3.8 para a MnTnBuOE-2-PyP5+
e para a enzima catalase (CAT). Percebe-se que a atividade catalase da MnTnBuOE-275
CAPÍTULO 3
PyP5+, kcat (H2O2), foi de 88,47 mol/L s-1, o que é quatro ordens de magnitude inferior
que a da enzima catalase, cuja atividade foi de 1,46 x 106 mol/L s-1.
a)
kobs (s-1)
1,E-06
v0, mol/L s-1
8,E-07
y = 0,046x - 4E-08
R² = 0,9991
6,E-07
4,E-07
2,E-07
0,E+00
0,E+00
1,E-05
2,E-05
3,E-05
[MnP], mol/L
kobs (s-1)
1,E-06
b)
vo, mol/L s-1
8,E-07
y = 732,1x + 6E-08
R² = 0,9921
6,E-07
4,E-07
2,E-07
0,E+00
0
2E-10
4E-10
6E-10
8E-10
1E-09 1,2E-09
[CAT], mol/L
Figura 3.8 - Atividade catalase da (a) MnTnBuOE-2-PyP5+e da (b) enzima catalase.
Para a catalase: coeficiente angular (kobs) = 7,32 × 102 , o que resulta em kcat
(=coeficiente linear × 2/0.001) de 1,46 × 106 mol/L s-1. Para a MnP, coeficiente angular
(kobs) = 4,6 x 10–2, o que resulta em kcat (=coeficiente angular × 2/0.001) de 88.47 mol/L
s-1.
Todos os dados da catálise da dismutação do H2O2 pelas Mn-porfirinas em
estudo são apresentados na Tabela 3.1, juntamente com a atividade SOD. Com exceção
das metaloporfirinas, outros compostos à base de não-metais não são capazes de
dismutar o H2O2 (Tabela 3.2). Analisando a Tabela 3.1, percebe-se que nenhum dos
compostos pode ser considerado um mímico funcional de catalase, tendo apenas 0,006 a
0,06% da atividade da enzima.
76
CAPÍTULO 3
Tabela 3.1- Atividade catalase (kcat (H2O2) e atividade de dismutação do
superóxido kcat(O2•–) de Mn-porfirinas.
Compostos
MnTE-2-PyP5+
MnTnHex-2-PyP5+
MnTnOct-2-PyP5+
MnTE-3-PyP5+
MnTnHex-3-PyP5+
MnTnOct-3-PyP5+
MnTE-4-PyP5+
MnTnHex-4-PyP5+
MnTnHexOE-2-PyP5+
MnTnBuOE-2-PyP5+
MnTE-2-PyPhP5+
MnTPhE-2-PyP5+
MnTDE-2-ImP5+
kcat
(H2O2)
pH 7.8
63.32
28.31
27.62
61.65
46.21
67.44
52.08
59.05
34.66
88.47
21.10
23.54
23.78
log kcat
(O2•–)
pH 7.8
7.76
7.48
7.71
6.65
6.64
6.53
6.86
6.6
7.92
7.83
5.55
7.66
7.83
5.84
3.16
MnTBAP3-
Tabela 3.2 Atividade catalase (log kcat (H2O2)) e atividade de dismutação do
superóxido kcat(O2•–) de diferentes porfirinas e compostos de Mn.
Compostos
FeTE-2-PyP5+
FeTnOct-2-PyP5+
FeTrF5Ph-(SO3)2-corrol*
MnCl2
MnSalen, EUK-8
M40403
M40404
Nitróxido, Tempol
Nitrona, NXY-059
Ebselen
Enzima catalase
log kcat
(H2O2)
log kcat
(O2.-)
803.48
368.36
8.05
7.09
6400
6.48
0
6.11-6.95
13.45
8.18
6.49
0
0
0
1.49 x 106
6.36
0
<3 at pH 7.8
*Os dados do Fe corrol foram obtidos da literatura (BATINICHABERLE et al. 2010, BATINIC-HABERLE et al. 2012,
MAHAMMED et al. 2010, HABER et al. 2012.
77
CAPÍTULO 3
Entre as Mn-porfirinas, apenas as catiônicas derivadas do isômero orto das Npiridilporfirinas, apresentam alguma atividade catalase. Apesar das atividades catalase
destas Mn-porfirinas se destacarem com relação às outras MnPs, os valores são muito
baixos para serem de qualquer relevância prática. A MnTBAP3- apesar de apresentar a
capacidade de reduzir o ONOO–, não é um mímico de SOD e nem da enzima catalase.
(CELIC et al, 2014; BATINIC-HABERLE et al., 2009b; BATINIC-HABERLE et al.,
2009b; DOYLE et at., 2009; BATINIC-HABERLE et al., 2011), mas vêm sendo
freqüentemente utilizada como uma ferramenta para provar o papel de diferentes
espécies (CELIC et al., 2014; MUSCOLI et al., 2007) em vias metabólicas envolvidas
no estresse oxidativo.
Porfirinas de Fe (Fig. 3.5; Tabela 3.2) são uma ordem de magnitude melhores
modelos da catalase do que as porfirinas de Mn, aproximando-se dos valores de Fe
corrol (Tabela 3.2) No entanto, as porfirinas de Fe são muito mais sensíveis à
degradação oxidativa pelo H2O2 e, portanto, são capazes de resistir a apenas alguns
ciclos (baixo turnover).
Enquanto o H2O2 pode estar envolvido nas ações de mímicos de SOD in vivo,
nenhum dos mímicos SOD (exceto o Fe corrol) (Figura 3.5) parece ser um mímico
funcional de catalase para dismutação de H2O2. Dentre os compostos mímicos de SOD,
o Fe corrol apresenta uma atividade catalase um pouco mais expressiva. A razão para tal
atividade catalase é a natureza tri-aniônica do ligante corrol que dá origem a um
complexo extremamente estável à degradação oxidativa. Embora ele tenha uma
atividade intrínseca apenas um pouco maior do que análogo da classe de Fe porfirinas
(Figura 3.5), a maior estabilidade oxidativa da Fe corrol lhe permite resistir à
degradação por H2O2, resultando em um maior número de ciclos (turnovers).
As Mn(II) poliaminas cíclicas são potentes mímicos de SOD, porém
essencialmente não têm atividade catalase (Tabela 3.2). Quando comparado com as
metaloporfirinas, sabe-se que as poliaminas têm Mn no estado de oxidação +2, que por
ter uma densidade eletrônica possivelmente alta, não deve favorecer a coordenação de
H2O2 para dar origem à dismutação. O mesmo raciocínio pode aplicar-se a MnCl2.
Além disso, a estabilidade de metal/ligante da Mn (II) M40403 poliamina cíclica é
apenas logK = 13,6, o que favorece a dissociação do ligante e possível degradação
oxidativa por H2O2.
Em sistemas aquosos, como nesse estudo, a catálise de dismutação do H2O2
provavelmente ocorre via par redox MnIIIP/O=MnVP como sugerido para a MnTDE-278
CAPÍTULO 3
ImP5 + (JIN et al., 2010); porém a oxidação da MnIIIP ao cátion radical O=MnIVP•+ (em
analogia a alguns sistemas dos citocromos P450) (NAM et al., 2002; SPASOJEVIC et
al., 2002; SPASOJEVIC et al., 2006) não pode ser excluída. Devido ao papel irrelevante
das metaloporfirinas como substitutos funcionais da catalase, não foi a intenção desse
estudo explorar o possível mecanismo envolvido na dismutação do H2O2.
3.6 Conclusões
O estudo da dismutação de H2O2 em 23 compostos de diferentes classes de
mímicos de SOD indicou que nenhum deles foi capaz de se mostrar como mímico de
catalase com qualquer relevância prática.
Quando as constantes de velocidade foram avaliadas, pôde-se perceber que as
maiores atividades foram encontradas entre as metaloporfirinas de Fe, mas estes se
mostram sensíveis à degradação oxidativa pelo H2O2 e não resistem a muitos ciclos de
reação.
Apesar da classe das Mn e Fe porfirinas conter os exemplos mais relevantes de
mímicos SOD e moduladores redox de estresse oxidativo mais eficientes in vivo,
determinou-se que a capacidade de dismutação de H2O2 destes complexos de Fe e de
Mn foram, no máximo 0,006 e 0,06% da atividade da enzima catalase, respectivamente.
Os efeitos de remoção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) reportadas para esses
complexos não devem ser relacionadas, portanto, com a dismutação de H2O2.
79
CAPÍTULO 4:
Considerações Finais
e Perspectivas
CAPÍTULO 4
4 Considerações Finais e Perspectivas
Para a síntese do isômero orto da N-piridilporfirina investigou-se a influência
de dez fatores, em no mínimo dois níveis cada. Em particular, foram avaliados os
fatores: concentração de pirrol, relação molar aldeído/pirrol, temperatura, concentração
de ácido tricloroacético, relação molar Zn2+/pirrol, tempo de reação, concentração de
água, relação molar iodo/pirrol, relação molar H2O2/pirrol e a natureza do
solvente/catalisador. Planejamentos fatoriais completos e fracionários e metodologias de
superfície de resposta estão entre as técnicas quimiometricas empregadas neste estudo.
Rendimentos de 25% foram alcançados para a H2T-2-PyP isolada. Vale destacar que
rendimentos em torno de 25%, são suficientes para tornar o desenvolvimento de
moduladores redox baseados em N-piridilporfirinas economicamente viáveis.
Métodos de isolamento e purificação da H2T-2-PyP foram desenvolvidos,
visando minimizar o uso da cromatografia. Para os dois métodos desenvolvidos nesse
trabalho, concluiu-se que os dois métodos eram igualmente eficientes para o isolamento
da H2T-2-PyP, mas uma coluna cromatográfica ainda se fez necessária para obtenção de
uma amostra pura.
Além da otimização da síntese, uma metodologia analítica espectrofotométrica
foi desenvolvida para a quantificação rápida dos rendimentos dos ensaios, sem a
necessidade de isolamento ou purificação, bem como permitiu a realização de reações
em pequena escala.
Para o estudo da dismutação de H2O2, foram avaliados 23 compostos de
diferentes classes de mímicos de SOD, além da catalase como controle positivo. Desses
estudos, concluiu-se que nenhum dos compostos avaliados foi capaz de se mostrar como
mímico de catalase com qualquer relevância prática. Dentre esses compostos, aqueles
que apresentaram maiores atividades foram encontrados nas Fe-porfirinas.
Dentre a classe das Mn e Fe porfirinas, determinou-se que a capacidade de
dismutação de H2O2 destes complexos de Fe e de Mn foram, no máximo 0,006 e 0,06%
da atividade da enzima catalase, respectivamente.
81
CAPÍTULO 4
Dentre as perspectivas desse trabalho, podem ser citadas:

A otimização da síntese e da purificação dos isômeros meta e para das
N-piridilporfirinas, utilizando os seguintes métodos de otimização:
 Empregar Plackett-Burman para a triagem das variáveis
 Realizar planejamentos experimentais completos
 Aplicar superfície de resposta

Efetuar uma comparação entre as condições ótimas de síntese dos
isômeros e verificar uma possível influência da contribuição da posição
relativa do nitrogênio do grupo piridil na reatividade do sistema.

A realização da síntese da H2T-2-PyP em escala preparativa (50 mL)
com as condições ótimas do sistema mais concentrado (pirrol a 0,1
mol/L).
82
CAPÍTULO 5:
Referências
Bibliográficas
CAPÍTULO 5
5 Referências Bibliográficas
ABATTI, D.; ZANIQUELLI, M. E. D.; IAMAMOTO, Y.; IDEMORI, Y. M. Porphyrin
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310, p. 296-302, 1997.
ADLER, A. D.; LONGO, F. R.; FINARELLI, J. D.; GOLDMACHER, J.; ASSOUR, J.;
KORSAKOFF, L. A Simplified synthesis for meso-Tetraphenylporphin. Journal of
Organic Chemistry, Washington, v.32, p. 476, 1967.
ALFONSO-PRIETO, M.; BIARNÉS, X.; VIDOSSICH, P.; ROVIRA, C. The
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92
APÊNDICE
APÊNDICE
APÊNDICE A
Quantificação da H2T-2-PyP através do Método de Adição de Padrão

Sem a correção da linha de base: utilização de apenas 1 comprimento de onda
(439 nm)
Considerando que existe uma impureza que contribui com absorbância Aimp no
λ= 439 nm, temos que:
A0 = AH2P + Aimp
A1 = (AH2P + AP1) + Aimp
A2 = (AH2P + AP2) + Aimp
A3 = (AH2P + AP3) + Aimp
A4 = (AH2P + AP4) + Aimp
Onde: A0 corresponde à absorbância da alíquota oriunda da reação + a
absorbância da impureza presente no sistema; A1, A2, A3 e A4 correspondem
à absorbância da alíquota oriunda da reação + a absorbância da impureza e as
absorbâncias dos padrões P1, P2, P3 e P4, respectivamente.
Pela lei de Lambert-Beer, temos que:
AH2P = εH2P . CH2P . d
APn = εH2P . CPn . d
Onde: AH2P e APn correspondem às absorbâncias da H2T-2-PyP e dos padrões,
respectivamente.
94
APÊNDICE
Para calcular, por exemplo, A4, temos que:
A4 = εH2P . CH2P . d + εH2P . CP4 . d + εimp. Cimp . d
A4 = εH2P (CH2P + CP4) + εimp. Cimp
d
A = εH2P CP + (εH2P CH2P + εimp. Cimp)
d
y
a
x
b
Através da equação da reta, relacionando o coeficiente linear (a) e angular (b),
calcula-se a concentração de H2T-2-PyP:
0 = ax + b
x=
-b
a
= + εH2P . CH2P + εimp. Cimp
εH2P
x = CH2P + εimp. Cimp
εH2P
Então, para determinar a CH2P considerando apenas o comprimento de onda
máximo da Soret a 439 nm só é possível se :

Cimp = 0 ou
εimp
=0
ou
εimp
εH2P
= 0
95
APÊNDICE

Considerando agora os 3 comprimentos de onda 418 nm, 439 nm (Soret) e 460
nm é possível fazer a correção da linha de base:
Para o ponto A (439 nm):
AA = εH2PA . CH2P . d + εimpA. Cimp . d
AA (+P) =
εH2PA . CH2P . d + εH2PA . CP . d + εimpA. Cimp . d
Onde: AA corresponde à absorbância da H2T-2-PyP + a absorbância das
impurezas. AA (+P) corresponde à absorbância da H2T-2-PyP + a absorbância
das impurezas + a absorbância dos padrões em 439 nm.
Para o ponto B (418 nm):
AB (+P) = εH2PB . CH2P . d + εH2PB . CP . d + εimpB. Cimp . d
Onde: AB (+P) corresponde à absorbância da H2T-2-PyP + a absorbância das
impurezas + a absorbância dos padrões em 418 nm.
Para o ponto C (460 nm):
AC (+P) = εH2PC . CH2P . d + εH2PC . CP . d + εimpC. Cimp . d
Onde: AC (+P) corresponde à absorbância da H2T-2-PyP + a absorbância das
impurezas + a absorbância dos padrões em 460 nm.
A partir das expressões acima e considerando que o ponto D é eqüidistante dos
pontos B e C, temos que:
D = AB + AC
2
C
D
C
B
96
APÊNDICE
Relacionando a diferença de absorbância entre os pontos Ai e Di com as
concentrações de padrão adicionado em cada solução Pi (onde i = 0 a 4), pode-se
calcular a concentração de H2T-2-PyP, pois Ai – Di permite guardar a informação sobre
a influencia do efeito de matriz.
Assim, temos que: (A – D)
A – D = AA
AB + AC = 2 AA
AB
2
AC
2
onde a absorbância no ponto A (439 nm) é:
AA = εH2PA . CH2P . d + εH2PA . CP . d + εimpA. Cimp . d
Substituindo AA na expressão A – D = AA
AB + AC = 2 AA
AB
AC
2
2 (A – D) = 2 εH2PA . CH2P + 2 εH2PA . CP + 2 εimpA. Cimp –
εH2PB . CH2P
d
εH2PC . CP
–
–
εH2PB . CP
–
εimpB. Cimp – εH2PC . CH2P
–
εimpC. Cimp
2 (A – D) = (2 εH2PA – εH2PB – εH2PC) CP + (2 εH2PA – εH2PB – εH2PC) CH2P
d
+ (2 εimpA –
εimpB – εimpC) Cimp
Pela equação da reta e relacionando o coeficiente linear e angular, temos que:
x= -b
a
= (2 εH2PA – εH2PB – εH2PC) CH2P
(2 εH2PA – εH2PB – εH2PC)
+ (2 εimpA –
εimpB – εimpC) Cimp
(2 εH2PA – εH2PB – εH2PC)
97
APÊNDICE
x= -b
= CH2P + (2 εimpA –
εimpB – εimpC) Cimp
(2 εH2PA – εH2PB – εH2PC)
a
Analisando a expressão acima, pode-se observar a contribuição da impureza na
concentração da H2T-2-PyP, fato que não era observado quando considerava apenas as
absorbâncias em um único comprimento de onda (439 nm). Sendo os valores dos ε da
impureza nos 3 comprimentos de onda, muito pequeno quando comparado aos valores
dos ε da H2T-2-PyP , pode-se dizer que x tende a CH2P.
Na ausência de impureza:
A – D ≈ 0,8 AA
εH2PA – εH2PB + εH2PC
≈ 0,8 AA
2
2 εH2PA – εH2PB – εH2PC ≈ 0,8 AA
2
2 εH2PA – εH2PB – εH2PC ≈ 1,6 AA ≈ 1,6 εH2PA
2 εimpA –
εimpB – εimpC
1,6 εH2PA
98
APÊNDICE
APÊNDICE B
Matrizes de confundimento dos Planejamentos Fatoriais Fracionários
Tabela B.1- Estrutura de confundimento de um Planejamento Fatorial
Fracionário 2IV7-3.
I + ABCE + ABFG + ACDG + ADEF + BCDF + BDEG + CEFG
A + BCE + BFG + CDG + DEF + ABCDF + ABDEG + ACEFG
B + ACE + AFG + CDF + DEG + ABCDG + ABDEF + BCEFG
C + ABE + ADG + BDF + EFG + ABCFG + ACDEF + BCDEG
D + ACG + AEF + BCF + BEG + ABCDE + ABDFG + CDEFG
E + ABC + ADF + BDG + CFG + ABEFG + ACDEG + BCDEF
F + ABG + ADE + BCD + CEG + ABCEF + ACDFG + BDEFG
G + ABF + ACD + BDE + CEF + ABCEG + ADEFG + BCDFG
AB + CE + FG + ACDF + ADEG + BCDG + BDEF + ABCEFG
AC + BE + DG + ABDF + AEFG + BCFG + CDEF + ABCDEG
AD + CG + EF + ABCF + ABEG + BCDE + BDFG + ACDEFG
AE + BC + DF + ABDG + ACFG + BEFG + CDEG + ABCDEF
AF + BG + DE + ABCD + ACEG + BCEF + CDFG + ABDEFG
AG + BF + CD + ABDE + ACEF + BCEG + DEFG + ABCDFG
BD + CF + EG + ABCG + ABEF + ACDE + ADFG + BCDEFG
ABD + ACF + AEG + BCG + BEF + CDE + DFG + ABCDEFG
Tabela B.2- Estrutura de confundimento de um Planejamento Fatorial
Fracionário 2IV4-1.
I + ABCD
A + BCD
B + ACD
C + ABD
D + ABC
AB + CD
AC + BD
AD + BC
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