INNO-LiPA HPV Genotyping Extra - Biometrix

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INNO-LiPA HPV Genotyping Extra - Biometrix
Rev. 01 – Jul/2013
INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra
Instruções de Uso
USO PRETENDIDO
O INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra é um ensaio de sondas em linha, para diagnóstico in vitro,
concebido para a identificação de 28 genótipos diferentes do vírus do papiloma humano
(HPV) através da detecção de sequências específicas na região L1 do genoma HPV.
PRINCÍPIO DO TESTE
O INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra baseia-se no princípio da hibridização reversa. Parte da
região L1 do genoma do vírus de papiloma humano (HPV) é amplificado com iniciadores
SPF10 e os produtos amplificados biotinilados são desnaturados e hibridizados com sondas
oligonucleítidas específicas. Um par de iniciadores adicionais para amplificação do gene
humano HLA-DPB1 é adicionado para monitorar a extração e a qualidade da amostra. Todas
as sondas são imobilizadas como linhas paralelas nas tiras de membrana. Depois da
hibridização e da lavagem rigorosa, a estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina é
adicionada e liga-se a quaisquer híbridos com biotina formados anteriormente.
A incubação com o cromógeno BCIP/NBT produz um precipitado púrpura que pode ser
interpretado visualmente ou com o software LiRAS® para LiPA HPV.
Está disponível um kit de amplificação (INNO-LiPA HPV Genotyping Extra Amp) para
preparação padronizada de material amplificado biotinilado. O kit de amplificação tem como
base a reacção em cadeia da polimerase (PCR) com os iniciadores SPF10.
A aplicação de SPF10 no INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra está protegida pela patente EP
1012348B da Innogenetics, a patente norte-americana 6,482,588B e equivalentes
estrangeiras.
Os produtos amplificados são subsequentemente hibridizados com uma tira de tipagem que
contém 28 linhas de sonda de ADN específicas de sequência e 4 linhas de controlo (ver
Figura 1).
ENSAIO INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra: etapas envolvidas
1ª
2ª
3ª
4ª
etapa
etapa
etapa
etapa
-
Amplificação do DNA extraído
Hibridização do produto amplificado na tira e uma lavagem rigorosa
Adição de conjugado e substrato, resultando na revelação da cor
Interpretação visual do sinal padrão ou com o software LiRAS® para LiPA HPV.
REAGENTES
Descrição, preparo para utilização e condições recomendadas de conservação
-
Os reagentes, abertos ou fechados, permanecem estáveis até à data limite de
validade do kit, se os mantiver a uma temperatura de 2 a 8 °C e forem armazenados
1
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-
nos frascos originais. Não utilize os reagentes para além da data de validade. Não
congele nenhum dos reagentes.
Não deve guardar reagentes junto de qualquer fonte de contaminação com DNA,
especialmente junto de produtos de amplificação.
A temperatura dos reagentes e do tubo com as tiras deve ser levada à temperatura
ambiente
(20 - 25°C) aproximadamente 60 minutos antes da utilização e deverão ser
recolocados imediatamente no freezer após a sua utilização.
Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou
deterioração.
Recomendamos que guarde o tubo horizontalmente para minimizar a possibilidade de
enrolamento das tiras antes da utilização.
REAGENTES FORNECIDOS
COMPONENTE
QUANTIDADE
Tiras
1 x 20
Solução de
desnaturação
1 x 1 mL
Solução de
hibridização
Solução para
lavagem rigorosa
1 x 80 mL
1 x 200 mL
Conjugado 100x
1 x 0,8 mL
Diluente do
conjugado
1 x 80 mL
Substrato
BCIP/NBT 100x
1 x 0,8 mL
Tampão substrato
1 x 180 mL
Solução de
lavagem 5x
1 x 80 mL
DESCRIÇÃO
Contém 20 tiras INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra
assinaladas com uma linha vermelha de marcação.
Solução alcalina contendo EDTA. Deve fechar o frasco
imediatamente após a utilização, a exposição prolongada
da solução ao ar resulta na rápida deterioração da força
de desnaturação.
Tampão SSC com sulfato láurico de sódio (SLS), préaquecido a uma temperatura entre 37°C e 49°C.
Tampão SSC com SLS, pré-aquecido a uma temperatura
entre 37°C e 49°C.
Estreptavidina marcada com fosfatase alcalina em
tampão Tris com estabilizadores proteicos e 0,01% de
MIT/0,098% CAA como conservante. Para a diluir 1/100
em diluente do conjugado: prepare2 mL de solução de
trabalho do conjugado por cada cavidade teste + 2 mL
em excesso para o teste manual. A solução de trabalho do
conjugado permanece estável durante 8 horas se for
armazenada no escuro e à temperatura ambiente (20 25°C).
Tampão fosfato contendo NaCl, Triton, estabilizadores
proteicos, e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservante.
BCIP e NBT em DMF. Para diluir a 1/100 em tampão de
substrato do substrato antes da utilização: prepare 2 mL
de solução de trabalho por cada cavidade teste + 2 mL
em excesso para o teste manual. A solução de trabalho do
conjugado permanece estável durante 8 horas se for
armazenada no escuro à temperatura ambiente (20 25°C).
Tampão tris com NaCl, MgCl2 e 0,01% MIT/0,1% CAA
como conservante.
Tampão de fosfato com NaCl, Triton ® e 0,05% MIT/0,5%
CAA como conservante. Para diluir a 1/5 em água
destilada ou desionizada antes da utilização: prepare 8 mL
de solução de trabalho de lavagem por cada cavidade
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teste + 10 mL em excesso para o teste manual. A solução
de lavagem de trabalho permanece estável durante 2
semanas a uma temperatura de 2 - 8°C.
Placas de
incubação
3
Cartão
Cartão de leitura
1
Para a identificação de sondas positivas.
Folha de relatório
de dados
1
Para guardar tiras processadas.
MATERIAL NECESSÁRIO,
NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO
-
INNO-LiPA HPV Genotyping Extra Amp.
Água destilada ou desionizada.
Luvas descartáveis.
Ponteiras de pipetas livres de DNA/Dnase (resistentes aos aerossóis), descartáveis.
Pinças para manipulação das tiras.
Provetas graduadas (10, 25, 50 e 100 mL).
Pipetas ajustáveis para fornecer 1-20 µL, 20-200 µL e 200-1000 µL
Vórtex ou agitador equivalente.
Microcentrífuga.
Materiais necessários apenas para procedimento manual:
- Banho-maria com plataforma agitadora (80 rpm; com tampa inclinada, temperatura
ajustável até aos 49°C ± 0,5°C).
- Sistema de aspiração.
- Termômetro calibrado.
- Plataforma agitadora orbital, recíproca ou osciladora.
Recomendações
Para um agitador orbital:
•
•
O diâmetro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm.
A velocidade recomendada para um movimento circular de 13 mm é de 160 rpm.
Para um agitador recíproco:
•
A velocidade recomendada para o movimento de ida e volta é de 80 movimentos por
minuto.
Para a plataforma agitadora de oscilação:
•
•
O ângulo de agitação não deve exceder os 13° para evitar derramar líquido
A velocidade recomendada é de 50 rpm.
-
Pipetas dispensadoras multicanal (Eppendorf, opcional).
Temporizador, 2 horas (± 1 minuto).
SEGURANÇA E AMBIENTE
Tóxico! (T) R61-20/21-36, S53-9-20-23-36/37/39-45-60
Contém
Contém N,NN,N-dimetilformamida: SUBS BCIP/NBT 100x.
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Irritante! (Xi)
(Xi R43, S23-24-37-60
Contém 22-cloroacetamida: RINSE SOLN 5x, SUBS BUF, CONJ DIL, HYBRIDIZ
SOLN, STRIN WASH SOLN.
Corrosivo! (C) R34, S20-23-26-36/37/39-45-60
Contém hidróxido de sódio: DENAT SOLN.
R20/21
Nocivo por inalação e em contato com a pele.
R34
R36
R43
R61
S9
S20
S23
S24
S26
S53
Provoca queimaduras.
Irritante para os olhos.
Pode causar sensibilização em contato com a pele.
Risco durante a gravidez com efeitos adversos na descendência.
Manter o recipiente em um local bem ventilado.
Não comer nem beber durante a utilização.
Não inalar vapor/aerossol.
Evitar o contato com a pele.
Em caso de contato com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e
consultar um especialista.
Usar vestuário de proteção, luvas e equipamento protetor para os olhos/face
adequados.
Usar luvas adequadas.
Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente o médico (se
possível mostrar-lhe o rótulo).
Evitar a exposição — obter instruções específicas antes da utilização.
S60
Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos.
S36/37/39
S37
S45
-
-
•
•
•
As amostras devem ser sempre manipuladas como potencialmente infecciosas. Deste
modo, todos os componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser
considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados como
tal. Este teste só deve ser efetuado por técnicos com formação adequada.
Todos os componentes de sangue e os materiais biológicos devem ser descartados
de acordo com um dos seguintes procedimentos de segurança:
Autoclavagem a 121°C, no mínimo durante 15 minutos.
Incineração do material descartável.
Misture os resíduos líquidos com hipoclorito de sódio para que a concentração final
seja de ± 1% de hipoclorito de sódio. Deixar repousar durante a noite antes de
eliminar os resíduos.
CUIDADO: Neutralize o líquido residual que contenha ácido antes de adicionar o hipoclorito
de sódio.
-
É necessário utilizar equipamento de proteção pessoal: utilize luvas e óculos de
segurança quando manipular agentes perigosos ou infecciosos.
Os resíduos devem ser manuseados de acordo com as diretrizes de eliminação de
resíduos da instituição. Cumpra também os regulamentos legais sobre este assunto.
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AMOSTRAS
Visto que o teste INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra utiliza material de DNA biotinilado
amplificado como amostra, está disponível um kit de amplificação, INNO-LiPA HPV
Genotyping Extra Amp, que serve de ferramenta adicional.
OBSERVAÇÕES E PRECAUÇÕES
-
Não misture reagentes de kits diferentes, exceto se os componentes tiverem códigos
de lote idênticos.
Não reutilize material de laboratório descartável.
Todos os recipientes usados para preparar as soluções de conjugado e de substrato
devem ser limpos e cuidadosamente enxaguados com água destilada.
Evite a contaminação microbiana dos reagentes.
Utilize uma ponteira de pipeta livre de DNA/DNase nova por cada alíquota de
amostra.
Recomendamos a utilização de ponteiras de pipetas descartáveis resistentes aos
aerossóis.
PROCEDIMENTOS DE PREPARO E MANIPULAÇÃO
Manipulação das tiras
-
As tiras foram concebidas para utilização única!
Não pegue as tiras com as mãos, utilize pinças limpas.
Utilize um lápis para identificar as tiras do teste. Não utilize canetas, etc. Escreva a ID
(identificação) acima da linha de marcação das tiras.
Coloque as tiras de teste, com o lado da membrana virado para cima (este lado está
assinalado) nas cavidades.
As tiras de teste devem permanecer na mesma cavidade durante as várias etapas de
incubação.
As tiras não utilizadas ou processadas devem ser mantidas ao abrigo de luz forte e do
calor.
Para interpretar, tapar ou armazenar as tiras reveladas, aguarde até que estas
estejam completamente secas.
Tiras processadas e secas devem, de preferência, ser armazenadas no escuro, em
temperatura ambiente (20- 25°C).
Não reutilize as cavidades.
PROCEDIMENTO PARA TESTE MANUAL
Instruções de incubação
-
As incubações de hibridização e de lavagem rigorosa devem ser realizadas a uma
temperatura exata
exata de 49°C e são as etapas mais importantes para evitar falsos
positivos (temperatura demasiado baixa) ou falsos negativos/sinais muito fracos
(temperatura demasiado elevada). Um de banho de água de agitação com tampa
inclinada garante um melhor controle das variações de temperatura. É necessário
realizar um controle rigoroso da temperatura (com uma margem de 0,5°C a volta da
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-
-
-
-
temperatura fixada de 49°C) com um termômetro calibrado.
Deve sempre fechar a tampa do banho-maria para evitar sinais positivos falsos
durante a incubação.
Não utilize um agitador de ar quente para efetuar
efetuar a hibridização
hibridização e a lavagem rigorosa.
rigorosa.
A amplitude do movimento gerado tanto pela agitação do banho-maria (procedimento
de hibridização e lavagem rigorosa) como pelo agitador orbital, recíproco ou oscilador
(procedimento da revelação da cor) é extremamente importante para obter máxima
sensibilidade e coloração homogênea. A amplitude deve ser a mais elevada possível,
para que o líquido e as tiras de teste se movimentem completamente dentro da
cavidade. No entanto, deve evitar o derramamento de líquido pelos cantos da
cavidade.
Para a hibridização e a lavagem rigorosa, deve colocar as cavidades na plataforma
agitadora do banho-maria. Ajuste o nível da água entre 1/3 e 1/2 da altura da
cavidade. Certifique-se que as cavidades não fiquem a boiar na água. A água deve
estar em contato direto com as cavidades.
As etapas de incubação para a revelação da cor devem decorrer entre os 20 e os
25°C. Uma temperatura inferior aos 20°C pode causar resultados mais fracos. Uma
temperatura superior aos 25°C pode causar uma cor de fundo acentuada e/ou sinais
positivos falsos.
O tempo de incubação especificado deve ser rigorosamente respeitado para garantir
a realização correta do ensaio.
Não tape a placa. Durante as incubações de hibridização e de lavagem rigorosa pode
deixar as cavidades destapadas no banho-maria. Tapar as cavidades com
microplacas pode causar a contaminação cruzada.
Instruções de mudança do líquido nas cavidades
-
-
Aspire o líquido da cavidade com uma pipeta, de preferência ligada a uma bomba de
vácuo. Incline a placa para um ângulo para permitir que o líquido flua para uma
extremidade da cavidade.
Adicione 2 mL da solução apropriada a cada cavidade de teste e siga o protocolo.
NOTA:
OTA:
• Uma multipetta dispensadora (Eppendorf) é útil para esta aplicação.
-
Repita esta etapa tantas vezes quantas as indicadas no procedimento de teste.
NOTA:
OTA:
• Não permita que as tiras sequem entre as etapas de lavagem.
• Preste atenção para não danificar a superfície das tiras durante a aspiração. De
preferência, aspire o líquido a partir da parte superior da tira por cima da linha de
marcador.
• Certifique-se de que a tira foi cuidadosamente lavada por submersão completa na
solução de lavagem.
• Adapte a velocidade do agitador, quando necessário.
Hibridização
NOTA:
OTA:
• Use luvas descartáveis e pinças.
1.
Aqueça um banho-maria de agitação à temperatura exata
exata de 49°.
49° Verifique a
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temperatura com um termômetro calibrado e ajuste-a, se necessário. Pré-aqueça a solução
de hibridização e a solução de lavagem rigorosa até atingir uma temperatura mínima de
37°C e não superior aos 49°C. Mistura-as antes de usar.
2.
Utilize pinças para retirar o número necessário de tiras de teste do tubo (1 tira por
cada amostra) e com um lápis escreva um número de identificação acima da linha de
marcação da tira.
3.
Coloque em uma bandeja o número de cavidades de teste (1 cavidade para cada tira)
necessário.
Com uma pipeta, dispense 10 µL de Solução de desnaturação nos cantos superiores
4.
das cavidades.
NOTA:
OTA:
• Feche o frasco imediatamente depois de o utilizar.
5.
Adicione 10 µL de produto amplificado biotinilado à solução de desnaturação e
misture com cuidado, pipetando várias vezes para cima e para baixo. Utilize sempre
ponteiras livres de DNA/DNase e resistentes aos aerossóis. Permita a desnaturação durante
5 minutos à temperatura ambiente (20 - 25°C).
Agite a solução de hibridização pré6.
pré-aquecida e com cuidado adicione 2 mL ao produto
amplificado desnaturado presente em cada cavidade. Tenha cuidado para não contaminar as
cavidades vizinhas durante as operações com a pipeta.
7.
Coloque imediatamente a tira na cavidade. As tiras devem de ficar totalmente
submersas na solução.
8.
Coloque a bandeja no banho agitador de água a 49°C
49°C (80 rpm; ver Instruções para a
incubação), feche a tampa e incube durante 60 minutos.
NOTA:
OTA:
• Evite respingar a cavidade com água do banho-maria. Ajuste o nível da água entre
1/3 e 1/2 da altura da cavidade.
Lavagem rigorosa
1.
Depois da hibridização, retire a placa do banho-maria.
2.
Incline a placa a um ângulo ligeiro e aspire o líquido da cavidade com uma pipeta, de
preferência ligada a uma bomba de vácuo. Adicione 2 mL de solução de lavagem rigorosa
pré-aquecida a cada cavidade e lave oscilando a bandeja durante 10 a 20 segundos à
temperatura ambiente. Aspire a solução de cada cavidade.
3.
Repita esta etapa de lavagem mais uma vez (ver também Instruções para mudar o
líquido nas cavidades).
4.
Por último, aspire a solução e incube cada tira em 2 mL de solução de lavagem
rigorosa pré-aquecida em um banho-maria de agitação a uma temperatura de 49°C durante
30 minutos. Feche a tampa do banho-maria.
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NOTA:
OTA:
• Prepare as soluções de lavagem e de conjugado durante a incubação de lavagem
rigorosa (Ver reagentes).
Revelação da cor
Todas as incubações subsequentes devem ser realizadas em um agitador a uma
1.
temperatura de 20 - 25°C.
2.
Lave cada tira duas vezes durante 1 minuto com 2 mL de solução de lavagem diluída
(veja as Instruções para mudar o líquido nas cavidades). Aspire.
Adicione 2 mL de solução de conjugado a cada cavidade e incube agitando por 30
3.
minutos.
4.
Aspire.
NOTA:
OTA:
• Prepare a Solução de substrato 10 minutos antes do fim da incubação (ver
Reagentes).
5.
Lave cada tira duas vezes durante 1 minuto com 2 mL da solução de lavagem diluída
e lave mais uma vez com 2 mL de tampão substrato. Aspire.
Adicione 2 mL de solução de substrato a cada cavidade e incube agitando por 30
6.
minutos. Aspire.
7.
Pare a revelação da cor lavando as tiras duas vezes com 2 mL de água destilada e
agitando pelo menos durante 3 minutos.
8.
Utilize as pinças para retirar as tiras das cavidades e coloque as mesmas em papel
absorvente. Espere até as tiras estarem totalmente secas e fixe-as à folha de relatório de
dados. A linha superior é a linha de marcação.
A linha de controle de conjugado ajuda a alinhar corretamente as tiras na folha de relatório
de dados.
PROCEDIMENTO DE TESTE AUTOMATIZADO
O procedimento de teste automatizado está disponível. Contate a Biometrix para obter mais
informações.
RESULTADOS
Leitura
A figura 1 mostra a posição das diferentes sondas oligonucleotídicas nas tiras de INNOINNO-LiPA
HPV Genotyping Extra. Uma linha é considerada positiva quando no final do teste aparecer
uma faixa de cor púrpura/castanho nítida.
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Figura 1: Local das sondas específicas nas tiras INNO-LiPA HPV Genotyping Extra.
A linha de marcação existente na parte superior da tira serve para orientação.
Interpretação dos resultados
Leia as tiras quando estiverem totalmente secas.
Classifique todas as linhas visíveis com o cartão de leitura do INNOINNO-LiPA HPV Genotyping
Extra. Compare os padrões das linhas com a tabela de interpretação do INNOINNO-LiPA HPV
Genotyping Extra fornecida com o kit. Este diagrama indica as linhas positivas (linhas) para
os diferentes tipos de HPV (colunas) com um “X”.
Classifique todos os tipos de HPV cujo padrão da linha específico do tipo (as colunas do
Diagrama de interpretação) é um subconjunto do padrão da linha total observado na tira
como presentes ou possivelmente presentes na amostra. Existe, possivelmente, um
determinado tipo de HPV na amostra se todas as linhas da sonda pertencentes ao padrão de
hibridização já fizerem parte de um ou vários padrões de hibridação específicos de outros
tipos de HPV. Este é o caso para o HPV18-(HPV39); HPV 31-(HPV 52)-(HPV 54); HPV 33-(HPV
52)-(HPV 54); HPV 40-(HPV 52); HPV 53-(HPV 52); HPV 56-(HPV 74); HPV 58-(HPV 52); HPV
68-(HPV 39) e HPV 73-(HPV 39)-(HPV 68). Os genótipos entre parênteses estão
possivelmente presentes como co-infecção.
A amostra cujo padrão de linha obtido não possa ser atribuído a nenhum padrão de genótipo
ou que não tenha nenhuma linha específica do tipo (linhas 1 -28), mas tenha pelo menos
uma linha de controle HPV positiva, deve ser classificada como HPV positivo, mas não é
tipificável (HPVX).
Uma amostra em que apenas com uma parte do padrão de linha obtido possa ser atribuída a
um ou mais genótipos específicos, contém HPV X (um tipo HPV não tipicável) e estes
genótipos específicos.
Considere uma reatividade em todas as linhas da sonda como não interpretável. Repita o
procedimento completo a partir da extração de DNA para amostras que apresentem este
padrão.
Resultado
HPV
-
Resultado hDNA
Interpretação
-
Resultado inválido
Um resultado negativo na linha de controlo hDNA indica a
coleta inadequada de amostras, o processamento ou a
presença de inibidores no DNA extraído. No caso posterior,
o teste de uma diluição de 1:10 do DNA extraído pode
melhorar o desempenho da amplificação. Se não tiver
sucesso, inicie o procedimento com uma nova alíquota da
amostra.
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-
+
+
-
+
+
HPV não detectado
Um resultado negativo nas linhas de controle HPV e nas
linhas específicas do tipo indica a ausência de DNA HPV,
mas não pode pré-concluir a presença de uma infecção
HPV.
HPV detectado
Um resultado positivo em pelo menos uma linha específica
do tipo ou nas linhas de controle HPV indica a presença do
DNA HPV. A presença de genótipos HPV adicionais não
pode ser completamente excluída.
HPV detectado
Um resultado positivo em pelo menos uma linha específica
do tipo ou nas linhas de controle HPV indica a presença do
DNA HPV. A presença de genótipos HPV adicionais não
pode ser completamente excluída.
Controle
Controle de qualidade
-
-
-
-
A primeira linha (imediatamente abaixo da linha de marcação) é a linha de controle
do conjugado. Esta linha controla a adição do conjugado reativo e da solução de
substrato durante o processo de detecção. Esta linha deve estar sempre positiva e ter
aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas durante a
mesma série de testes.
A segunda linha de controle é uma linha de controle do DNA humano. Os iniciadores
de amplificação de um fragmento do gene humano HLA-DPB1 são adicionados ao kit
de amplificação HPV para monitorizar a qualidade da amostra e a eficiência da
extração. Esta linha deve ser sempre positiva, exceto quando a amplificação do DNA
humano é ultrapassada pela presença de uma elevada quantidade de DNA HPV na
amostra.
Uma amostra é considerada positiva para o HPV quando pelo menos uma das linhas
específicas de tipo ou uma das linhas de controle do HPV for positiva.
Inclua sempre um controle positivo no teste: por exemplo, o controle de amplificação
positiva incluído no kit INNO-LiPA HPV Genotyping Extra Amp. O controle positivo
contém HPV6 e HLA_DPB1 e deverá reagir nas seguintes linhas: Controle de
conjugado, controle hDNA, controle HPV 1 e linha 1 (HPV6).
Inclua sempre um controle negativo no teste que é processado simultaneamente com
as amostras do doente na extração do DNA e no passo PCR. Se obtiver uma banda
positiva (exceto para o controle hDNA em caso de uma amostra clínica negativa do
HPV) no LiPA para o controle negativo, deve rejeitar o ensaio completo e repetir o
procedimento completo.
SOFTWARE DE INTERPRETAÇÃO: LiRAS para LiPA HPV
-
-
O software LiRAS para LiPA HPV foi concebido para facilitar a interpretação dos
resultados dos testes INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra. Contate p.f. o seu distribuidor
local para obter a versão mais atual.
Compare sempre o padrão da tira e a informação do paciente do relatório com a tira
original para se assegurar que a tira foi identificada, alinhada e lida corretamente.
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LIMITES DO PROCEDIMENTO
-
-
O INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra não permite discriminar entre HPV69 e HPV71.
As infecções do genótipo HPV misto são comuns. O kit INNO-LiPA HPV Genotyping
Extra Amp utiliza um conjunto de iniciadores que amplificam todos os genótipos
simultaneamente. Devido à competição no PCR e à ausência de genótipos específicos
na tira, é possível que determinados genótipos presentes na amostra co-infectada
não sejam detectados.
A amplificação sub-ótima com o PCR de consenso SPF10 foi demonstrada para o
genótipo 59, resultando em um limite de detecção mais elevado.
DESEMPENHO DO TESTE
O desempenho do teste, com interpretação visual, do INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra foi
avaliado em um total de 200 suspensões de células cervicais recolhidas em fluído
conservante Surepath® (BD – Tripath). Foi efetuado um método de referência para estas
amostras, que tinha o LINEAR ARRAY HPV Genotyping (Roche) ou este teste combinado com
o iniciador de consenso (Iniciadores MY09-MY11) e os PCRs específicos do tipo.
Com estes métodos de referência, 97 amostras tiveram resultados positivos para o HPV (das
quais 93 positivas para o HPV com um genótipo que pode ser detectado com o ensaio LiPA)
enquanto 103 amostras tiveram resultados negativos para o HPV.
Taxa de sucesso da amplificação
Os resultados do teste LiPA positivos, indicados pelo menos por uma linha de controle
positiva para o HPV ou uma linha específica do tipo foram obtidos em 91 das 93 amostras
positivas para o HPV (97,8%, 95% Cl [92.0%; 99.9%]). Este resultado foi obtido após o teste
e a amplificação iniciais em LiPA e após a repetição do teste LiPA em duplicado a partir da
extração.
Especificidade
Especificidade clínica
Um resultado de teste negativo para o HPV, conforme indicado por uma linha de controle hDNA
positiva e nenhuma outra linha positiva, foi obtido em 99 das 103 amostras negativas para o
HPV após a amplificação e o teste iniciais em LiPA (96.1%; 95% Cl [90.1%, 98.8%]). Todas as 4
amostras com resultados LiPA positivos foram amplificadas e testadas novamente em duplicata
a partir da extração. Apenas 2 das 4 amostras foram positivas, resultando em uma
especificidade clínica de 98,1% (101/103; 95% Cl [92.8%, 99.9%]) após a repetição do teste.
Estas 2 amostras foram identificadas como HPV74, um genótipo que não pode ser detectado
pelo LINEAR ARRAY HPV Genotyping. Ambas as amostras foram também consideradas negativas
pelo PCR de consenso e o PCR específico do tipo para HPV74.
Concordância do genótipo de elevado risco após o teste de discrepância
Das 200 amostras testadas, 91 amostras deram um resultado LiPA inicial positivo e foram
consideradas positivas para o HPV pelo teste LINEAR ARRAY HPV Genotyping ou o método
PCR. O método PCR específico do tipo foi efetuado em caso de discrepância entre o
resultado do LiPA e o resultado do LINEAR ARRAY HPV Genotyping para um genótipo de
elevado risco (provável) (15 genótipos de elevado risco e 3 genótipos de elevado risco
provável). O resultado do genótipo de elevado risco de referência final da amostra foi
baseado no resultado de consenso de 3 ensaios diferentes.
11
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A concordância dos genótipos de elevado risco foi calculada através da comparação do
resultado inicial do INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra (ou o resultado do consenso de 3
resultados LiPA, se for efetuado um teste novo) e o resultado do genótipo de referência. Para
este estudo, os resultados foram considerados concordantes se foram obtidos genótipos de
elevado risco idênticos em ambos os ensaios, independentemente da concordância para
genótipos de baixo risco.
A concordância do genótipo de elevado risco após o teste de discrepância foi de 92,3%
(84/91; 95% Cl [84.7%, 96.5%]). 6 das 7 amostras discordantes continham vários genótipos
HPV e tem pelo menos um genótipo de elevado risco em comum utilizando ambos os
métodos de genotipagem. O HPV 59 não foi detectado em 2 ocasiões em 2 amostras
concordantes parciais.
Software LiRAS para LiPA HPV
Todas as 200 amostras foram interpretadas visualmente e pelo software LiRAS para LiPA
HPV V2.0. A concordância inicial entre os resultados obtidos a partir da interpretação visual
LiPA e os resultados LINEAR ARRAY HPV Genotipagem não foi significativamente diferente da
concordância entre os resultados obtidos a partir da interpretação do software LiPA e os
resultados LINEAR ARRAY HPV Genotipagem (p = 1).
Sensibilidade analítica
O limite de detecção foi determinado para os genótipos HPV 16, 18, 31, 45 e 52,
representando cinco dos genótipos dominantes. O DNA plasmídeo (na presença do DNA
humano de fundo), foi diluído (1/3) abrangendo 5000 cópias/reação PCR e 2 cópias/reação
PCR. Cada diluição foi testada 8 vezes. O limite de detecção foi definido como um valor de
probit de 95% (previsão do ponto) e abrangeu de 20 a 70 cópias/reação do PCR dependendo
do genótipo testado. A reatividade das diferentes linhas das sondas presentes no padrão
específico do genótipo para o HPV 18 e o HPV 31 mostraram diferenças inferiores a 62
cópias/PCR e resultaram em uma interpretação incorreta (HPV 39 e 52, respectivamente).
Isto não foi observado durante a avaliação de desempenho com amostras clínicas.
Inclusividade dos genótipos
O kit INNOINNO-LiPA HPV
HPV Genotyping Extra identifica 28 genótipos diferentes. Isto foi avaliado
através do teste de um painel de amostras de plasmídeo (28 genótipos diferentes) com
cerca de 1000 cópias ou 10000 cópias por reação do PCR na presença de DNA humano de
fundo, em duplicata. Para todos os genótipos, exceto para o HPV 59, ambas as amostras
testadas foram positivas em 1000 cópias/reação do PCR. Para o HPV 59, ambas as amostras
foram positivas em 10000 cópias/reação do PCR.
Precisão
A precisão do INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra foi analisada com 8 DNAs extraídos obtidos
em amostras clínicas, testadas em 14 amostras: em três lotes do INNO-LiPA HPV Genotyping
Amp Extra e do INNOINNO-LiPA HPV Genotyping Extra, em um local, em diferentes ensaios, em
dois dias diferentes, por dois operadores diferentes e em três instrumentos Auto-LiPA
diferentes. As 8 amostras incluíam 4 amostras de genótipos individuais e 4 amostras com
uma infecção HPV mista.
Um resultado 111/112 (99.1%; 95%Cl [94.6%, 99.9%]) de concordância de inter e
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Rev. 01 – Jul/2013
intraensaio, interpessoa, interinstrumento e interlote foi alcançada. Para uma replicação de
uma amostra, um possível genótipo (HPV52) não foi detectado, mas os genótipos
predominantes foram detectados.
RECOMENDAÇÕES SOBRE A CONCEPÇÃO E PROCEDIMENTOS DO LABORATÓRIO
Recomendamos a seguinte sequência de operações:
1.
Preparação e divisão em alíquotas das misturas de PCR.
2.
Preparação das amostras (isolamento de DNA)
Reação em cadeia da polimerase.
3.
Análise de produtos de PCR biotinilados mediante a hibridação reversa. O pessoal
4.
envolvido nas etapas 3 e 4 não deve participar no trabalho das etapas 1 e 2 no mesmo dia.
Similarmente, depois de estar envolvido na etapa 2, não deve participar no trabalho da
etapa 1 no mesmo dia.
Para evitar a contaminação das amostras (por exemplo, com produtos de amplificação) e
evitar resultados positivos falsos, o procedimento deve ser realizado fisicamente em três
salas diferentes, cada sala equipada com equipamento e pipetas próprias. Uma sala para
preparo de reagentes, outra sala para a preparo das amostras e uma terceira sala para
amplificação e detecção de produtos de amplificação. Todo o equipamento deve permanecer
na sala em que é utilizado e não ser transferido para outras salas.
Deve utilizar ponteiras resistentes aos aerossóis para evitar a contaminação entre amostras.
Pelo mesmo motivo, utilize luvas descartáveis e mude-as frequentemente.
Sala 1 - armazenamento e preparação
preparação de reagentes
Tanto a sala como o equipamento da sala deve permanecer livre de DNA.
DNA Esta sala deve ser
utilizada apenas para preparar reagentes para PCR. O controle positivo para o PCR de
controle não deve entrar na sala 1.
O pessoal envolvido deve utilizar um jaleco de laboratório limpo, que não deve ser utilizado
fora desta sala.
Utilize luvas descartáveis quando manusear reagentes.
Sala 2 - preparo de amostras
Tanto a sala como o equipamento da sala deve permanecer livre de produtos
produtos de
amplificação. O pessoal envolvido deve utilizar um jaleco de laboratório limpo, que não deve
amplificação
ser utilizada fora desta sala. Durante o preparo das amostras, deve utilizar e mudar
frequentemente de luvas descartáveis. Destape com muito cuidado os frascos com amostras
(processadas). Evite abrir, ao mesmo tempo, mais do que um frasco de reação com amostra.
Para evitar a contaminação ou limpar superfícies contaminadas, recomendamos a utilização
de DNAZap™ (Ambion) para as pipetas e as superfícies de trabalho. Note que a utilização de
DNAZap™ é apenas uma medida de precaução adicional e portanto deve respeitar o melhor
possível todas as recomendações feitas sobre a concepção e procedimentos do laboratório.
13
Rev. 01 – Jul/2013
Sala 3 - amplificação e detecção de amplímeros
amplímeros
O pessoal envolvido na amplificação e na detecção de produtos de amplificação deve usar
um jaleco de laboratório limpo, que não deve ser usado fora desta sala e deve ser mudado
diariamente. Utilize luvas descartáveis quando trabalhar com produtos de amplificação.
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
INNOGENETICS N.V.
Technologiepark 6
9052 Gent - Belgium
Tel.: +32-9 329 13 29
REGISTRO ANVISA
80433150014
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
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Diagrama de interpretação
HPV genotypes
6
Probe # LR
X
1
2
3
4
11
LR
16
HR
18 18 26*
HR HR pHR
31
HR
33 35
HR HR
39
HR
40
LR
43
LR
44
LR
45
HR
45
HR
51
HR
52 53* 53*
HR pHR pHR
54 56
LR HR
58 58 58
HR HR HR
58
HR
59 66* 68
HR pHR HR
X
X
X
X
7
X
X
(X)***
8
9
10
X
X
X
X
X
X
X
11
X
X
X
X
X
X
13
X
14
X
15
X
16
X
X
17
X
X
X
X
X
19
X
X
X
X
X
X
X
X
X
20
21
22
X
X
X
X
X
X
X
23
X
24
25
73 74** 82
HR
HR
X
6
18
70
LR
X
5
12
69/71** 70
LR
X
26
27
28
* : 26, 53 and 66 are considered probable high-risk (pHR) genotypes according to Munoz et al. N Engl J Med 2003;348:518-27.
** : 69, 71 and 74 are not classified as high-risk, probable high-risk or low risk genotypes according to Munoz et al. N Engl J Med 2003;348:518-27.
*** : probeline 10 may show weak reactivity when probelines 8 and 9 are positive; in this case the sample should be interpreted as genotype 31.
X
X
X
X
X
X
X

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