ca_Project. Tese PhD - MediBrain

Transcrição

Gisela Maria Henrique Maia
Papel das Vias Serotoninérgicas Ascendentes na
Epileptogénese e nas Patologias Associadas à
Epilepsia
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Instituto de Anatomia J. A. Pires de Lima
Centro de Morfologia Experimental
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Papel das Vias Serotoninérgicas Ascendentes na
Epileptogénese e nas Patologias Associadas à Epilepsia
Plano de Tese de Doutoramento
Sob a Orientação de:
Professor Doutor Nikolay Lukoyanov
e Co-Orientação de:
Professor Doutor José Paulo Andrade
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Índice
Lista de Abreviaturas…………………………………………………………………….6
ESTADO DA ARTE
Introdução……………………………………………………….………………….……8
Capítulo 1. Epilepsia do Lobo Temporal…………………………………………...…10
1.1.
Alterações morfológicas da ELT………………………………..…..….11
1.2.
Défices emocionais e cognitivos associados à ELT……………...…….13
Capítulo 2. Modelos Experimentais de Epilepsia do Lobo Temporal……………...….16
2.1. Modelos Agudos de ELT…………………………………………………..16
2.2. Modelos Crónicos de ELT……………………………………………...….17
2.2.1. Modelos Baseados no Status Epilepticus………………….……..17
2.2.1.1 SE induzido por Ácido Caínico……………………...…17
2.2.1.2 SE induzido por Pilocarpina………………………….....19
2.2.2. Modelos de Kindling……………………………………………..20
2.2.2.1. Kindling Rápido………………………………….…….21
2.2.2.2. Kindling Rápido da Amígdala……………………….…22
2.2.2.3. Kindling Químico………………………………………23
Capítulo 3. Envolvimento da Serotonina na Génese da Actividade Convulsiva….......24
3.1. Receptores 5-HT1………………………………………………………….25
3.2. Receptores 5-HT2………………………………………………………….27
3.3. Receptores 5-HT3………………………….………………………………27
3.4. Receptores 5-HT4……………………………………………...…………..28
3.5. Receptores 5-HT7………………………………...………..………………28
3.6. Antidepressivos como agentes proconvulsivantes…….……………..……31
3.7. Antidepressivos como agentes anticonvulsivantes……………………….31
Capítulo 4. Envolvimento da Serotonina nas Alterações Comportamentais e
Neuroanatómicas Associados à Actividade Convulsiva………………………………34
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Capítulo 5. Alterações Serotoninérgicas Periféricas Associadas à Epilepsia…..……..36
5.1. Alterações serotoninérgicas nas plaquetas de pacientes com epilepsia…....36
5.2. Alterações serotoninérgicas n as plaquetas de pacientes com alterações
emocionais…………………………………………………………………...…37
CONTRIBUIÇÃO PESSOAL
Objectivos gerais…………………………………………………......…………..…….40
Planeamento das tarefas…………………………….…………………………………..42
Tarefa 1. Efeito das crises convulsivas sobre neurónios serotoninérgicos no
núcleo dorsal do rafe, na formação do hipocampo, no córtex entorrinal e na
amígdala…………………………………………………………………………...…....43
Tarefa 2. Alterações comportamentais e morfológicas resultantes das crises
convulsivas após inibição da síntese de serotonina no núcleo dorsal do
rafe………………………………………………………………….……………....…..45
Tarefa 3. Efeitos antiepilépticos e neuroprotectores da fluoxetina e da
eslicarbazepina: estudos comportamentais e morfológicos no modelo de ácido
caínico……………………………………………………………..……………..…….47
Tarefa 4. Efeitos antiepilépticos e comportamentais resultantes da estimulação
do nervo vago na epilepsia refractária: alterações morfológicas em modelos de ácido
caínico………………………………………………………………………………….49
Cronograma de Actividades………..……………………………...….……………..51
Referências Bibliográficas……………………………………….…………...………52
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Lista de Abreviaturas
5-HT – Serotonina
Ach - Acetilcolina
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DR – Núcleo dorsal do rafe
ECS – Electrochoques
ERC – Córtex entorrinal
EEG – Electroencefalograma
ELC - Eslicarbazepina
ELT – Epilepsia do lobo temporal
ELTm – Epilepsia do lobo temporal mesial
FLX - Fluoxetina
GABA – Ácido gama-aminobutírico
GERP – Genetically epilepsy prone rats
HS – Esclerose Hipocampal
I.p. - Intraperitoneal
KA – Ácido Caínico
MAO – Monoamina oxidase
MES – Maximal Electroshocks
MPPF – 4-18-fluoro-N-2-(1-2-methoxiphenil)-1-piperazinil)ethil-N-2-piridinilbenzamida
RMN – Ressonância magnética nuclear
PCA – para-cloranfetamina
PET – Tomografia por emissão de positrões
REAK – Rapid electrical amigdala kindling
SE – Status epilepticus
SERT – Transportador da Serotonina
SNC – Sistema nervoso central
SNP – Sistema nervoso periférico
SPECT – Tomografia por emissão monofotónica
SSRI – Inibidor selectivo da recaptação de serotonina
TAC – Tomografia axial computorizada
Trp - Triptofano
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Estado da Arte
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INTRODUÇÃO
O projecto aqui apresentado, intitulado “Papel das Vias Serotoninérgicas
Ascendentes na Epileptogénese e nas Patologias Associadas à Epilepsia” foi realizado
no âmbito do projecto de doutoramento do Programa Doutoral em Neurociências da
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, a ser desenvolvido no Instituto de
Anatomia J. A. Pires de Lima desta Instituição.
Os primeiros relatos do síndrome que é hoje conhecido como epilepsia datam de
há 3000 anos A.C. Nos primordiais tempos de Platão, a doença era associada a factores
divinos. Face à falta de conhecimento da época, a manifestação física da crise epiléptica
era explicada com base em conceitos pagãos. O conceito de epilepsia adaptou-se ao
longo dos tempos, sendo o séc. XIX o ponto de viragem no conhecimento e na aceitação
de que a epilepsia é uma patologia com origem no sistema nervoso central, tendo os
trabalhos de Georget, Charcot, Babinski, Gowers e Lennox contribuído para este facto.
Desde essa altura os fenómenos sobrenaturais, os ovários e as crises de histeria perdem
vigor; actualmente a epilepsia é uma das patologias mais estudadas no campo das
neurociências.
Hoje em dia sabemos que as crises convulsivas resultam de uma alteração da
actividade bioeléctrica cerebral, temporária e reversível, que induz manifestações
motoras, sensitivas, sensoriais, psíquicas e neurodegenerativas. Apesar da ciência já
muito ter contribuído para o conhecimento nesta área, acredita-se que ainda estamos
longe de saber detalhadamente os fenómenos inerentes aos processos de epileptogénese.
A complexidade é tal, que alguns tipos de epilepsia respondem favoravelmente à
terapêutica medicamentosa, enquanto outros tipos adquirem gradualmente resistência à
intervenção farmacológica. Um dos exemplos é a epilepsia do lobo temporal associada a
esclerose mesial hipocampal, cuja patofisiologia lhe confere refractabilidade
medicamentosa. Assim, este projecto de doutoramento foi desenvolvido com o intuito
de dar continuidade à investigação da epileptogénese, estabelecendo o paralelismo entre
as alterações morfológicas do sistema nervoso central e a função dos diversos receptores
de serotonina no controlo das crises.
Este trabalho divide-se em duas grandes partes. A primeira debruça-se sobre o
Estado da Arte e os seus 4 capítulos sintetizam os estudos feitos até à data no âmbito da
epilepsia do lobo temporal, abordando não apenas a experimentação animal, mas
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também a humana; são abordados os modelos animais utilizados neste tipo de epilepsia,
bem como o envolvimento da serotonina na génese da actividade convulsiva, nas
alterações comportamentais e neuroanatómicas associadas à epilepsia. Na segunda
parte, Contribuição Pessoal, é feito o planeamento das tarefas a serem desenvolvidas ao
longo do tempo.
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Capítulo 1.
Epilepsia do Lobo Temporal
A epilepsia representa o segundo grupo de doenças neurológicas mais comum,
caracterizado por crises convulsivas recorrentes. Afecta cerca de 2% da população
mundial e estima-se que mais de um terço dos pacientes epilépticos desenvolvam um
quadro de resistência farmacológica. Destes, metade possui epilepsia do lobo temporal
(ELT), o tipo de epilepsia sintomática mais comum, associada a alterações do complexo
amigdalóide, formação do hipocampo e córtices entorrinal e perirrinal (Squire e ZolaMorgan, 1991). A alteração da estabilidade das membranas neuronais destas regiões
induz crises parciais simples ou parciais complexas, cuja semiologia é caracterizada por
sensações epigástricas ascendentes, alterações emocionais, alucinações auditivas ou
gustativas e perda de consciência (Engel, 1996). Uma característica frequente da ELT é
a alteração dos estados de memória (Helmstaedter, 2002), devido ao envolvimento
frequente da formação do hipocampo.
Dado o elevado número de pacientes que desenvolvem resistência farmacológica,
torna-se essencial elucidar os mecanismos de epileptogénese, de forma a identificar
estratégias de tratamento para prevenir o desenvolvimento das crises. A crise é o ponto
comum a todas as epilepsias. Por sua vez, a característica comum a todos os tipos de crise é
a alteração transitória do comportamento, induzida pelo firing alterado, síncrono e rítmico
de uma população de neurónios, cujas descargas se propagam para regiões com conexões ao
foco principal.
Os estudos clínicos indicam que cerca de 70 a 80% dos doentes com epilepsia
podem ser tratados com sucesso, chegando mesmo a abandonar a terapêutica
farmacológica com um baixo risco de recidivas. Apesar disso, um número significativo
desenvolve resistência farmacológica. Nestes pacientes verifica-se um fracasso no
controlo das crises após dois ou mais esquemas de fármacos antiepilépticos. Perante
este quadro, a decisão de quando efectuar cirurgia nestes doentes com epilepsia
refractária é uma questão bastante relevante. É necessário um estudo multidisciplinar
minucioso, implicando a compilação de informações com origem clínica, sinal
biológico (EEG), imagem morfológica (TAC, RMN) ou imagem funcional (PET,
SPECT), permitindo a classificação das crises e a selecção de pacientes para
determinada estratégia cirúrgica. Alguns dos síndromes epilépticos que poderão
apresentar resolução cirúrgica incluem a ELT (com comprometimento do complexo
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amígdalo-hipocampal), as epilepsias neocorticais (epilepsias frontais e também
occipitais) e epilepsias relacionadas com tumores ou malformações vasculares
(Kilpatrick et al., 2003). Os tipos de crises tratáveis com a cirurgia são as crises parciais
simples, as crises parciais complexas e alguns tipos de crises generalizadas. A cirurgia
mais comum e com maior sucesso utilizada na ELT é a cirurgia de ressecção do córtex
temporal anterior com amigdalohipocampectomia.
1.1.
Alterações morfológicas da ELT
A HS (esclerose hipocampal) é a patologia mais frequente nos doentes com ELT
e a sua identificação, quando presente na RMN, dá um suporte imagiológico ao
diagnóstico clínico e electroencefalográfico. As amostras cirúrgicas obtidas em casos de
displasia cortical focal e displasia parahipocampal em que há evidência imagiológica de
alterações de sinal na substância branca parahipocampal, correspondentes a gliose
reactiva e células hipertróficas (Pillay et al., 2009) vêm dar um apoio morfológico aos
registos electrofisiológicos, nos quais se identifica uma diferença de padrão de
propagação das crises parahipocampais e hipocampais. Todavia, parece não existir
dúvidas de que a atrofia do córtex entorrinal, presente em 63% dos pacientes com ELT e
HS, poderá estar na génese da epilepsia (Pillay, 2009).
Durante a epileptogénese desencadeiam-se na formação do hipocampo inúmeras
alterações neurobiológicas, consideradas potenciais alvos para a intervenção terapêutica.
Essas alterações incluem a perda neuronal nas regiões CA1 e CA3 (Blumcke et al.,
2002; Wieser et al., 2005), mas tipicamente mais marcada em CA1 (Carne et al., 2004),
verificando-se também uma perda neuronal no hilo da circunvolução denteada e
também em regiões extrahipocampais, nomeadamente na amígdala e córtex entorrinal
(Blumcke et al., 2002; Wieser et al., 2005, Cardoso et al., 2008a). Outras alterações
descritas incluem gliose, fenómenos de plasticidade neuronal e dendrítica. (Jutila et al.,
2002). Acredita-se que a epileptogénese pode ser provocada por perda neuronal e que,
por sua vez, uma variedade de insultos que incluem status epilepticus (SE) (Gorter et
al., 2003), isquemia (Sadowski et al., 1999) e acidose (Ding et al, 2000) induzem a
morte dos neurónios da formação do hipocampo. Todavia, as alterações estruturais e
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funcionais não têm obrigatoriamente que ser acompanhadas de morte neuronal, embora
esta morte seja evidente em grande parte dos casos.
Apesar da morte neuronal ser um fenómeno bem caracterizado na ELT, é ainda
controverso se esta mesma perda neuronal é causa ou consequência das crises. Alguns
estudos indicam que o SE induz morte neuronal aguda no Homem (Pitkanen e Sutula,
2002), sendo esta evidência apoiada por estudos experimentais em diversos modelos
animais, nos quais as crises prolongadas induzidas por ácido caínico (KA), pilocarpina e
kindling, produzem um padrão de neurodegenerescência hipocampal semelhante ao
padrão encontrado no Homem (Nissinen, 2006). Tendo em conta que a epilepsia se
caracteriza pela repetição de crises convulsivas, também a administração repetida de
electrochoques (ECS) causa lesões cerebrais, sendo o córtex entorrinal e o hilo da fáscia
denteada, estruturas particularmente vulneráveis (Sloviter et al., 1996; McNamara,
1999; Salmenpera et al., 2000). Do ponto de vista morfológico, observa-se uma perda
aproximada de 17% de neurónios no hilo da circunvolução denteada (Lukoyanov et al.,
2004), bem como uma diminuição do número de sinapses entre a camada II do córtex
entorrinal e as células granulares da fáscia denteada, com redução do volume das
camadas II, III, V-VI do córtex entorrinal (Cardoso et al., 2008). Também o córtex
retrosplénico b (Rgb) está envolvido na actividade convulsiva, verificando-se perda
significativa de neurónios nas camadas IV e V do Rgb, acompanhadas de redução do
volume nas camadas I, IV, V e VI (Cardoso et al b., 2008). Esta perda neuronal e
volumétrica é acompanhada de ligeiro aumento da neurogénese na circunvolução
denteada (Scott et al., 2000) e do sprouting das fibras musgosas na camada molecular
(Gombos et al., 1999; Vaidya et al., 1999) em modelos de administração repetitiva de
ECS. Estes estudos mostram existir um envolvimento do córtex entorrinal nas crises
epilépticas, embora pareça contribuir menos para as crises quando comparado com a
formação do hipocampo (Heinemann et al., 1993).
Na formação do hipocampo as células granulares e as células do hilo da
circunvolução denteada actuam como filtro para a dispersão dos estímulos excitatórios
do córtex entorrinal; quando há lesão da circunvolução denteada estes mecanismos
falham, o que contribui para a génese das crises no circuito córtex entorrino-hipocampal
(Pillay et al., 2009). Porém, para que este processo se verifique, torna-se necessária a
repetição das crises, e os modelos de ECS oferecem-nos essa clara evidência, com perda
neuronal no hilo da circunvolução denteada, mas não no hipocampo próprio, visto que a
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exposição aos ECS é breve (Gombos et al., 1999; Vaidya et al., 1999). No entanto,
quando se induzem descargas prolongadas das células granulares na circunvolução
denteada através da estimulação da via perfurante em ratos, verifica-se perda
significativa de neurónios piramidais nas camadas CA3 e CA1 do hipocampo próprio,
bem como alterações nas conexões sinápticas dos neurónios nas restantes regiões da
formação do hipocampo. (Sloviter e Damiano, 1981; McIntyre et al., 1982; Sloviter et
al., 1983).
1.2. Défices Emocionais e Cognitivos Associados à ELT
A relação entre epilepsia e alterações cognitivas tem vindo a ser cada vez mais
descrita (Kondziella et al., 2007), dado que a epilepsia refractária tem numerosos
impactos na vida social, psicossocial e diária dos pacientes. A frequência das crises, os
sintomas depressivos e uma precária qualidade de vida dos pacientes com este tipo de
patologia parecem ser as razões que levam ao suicídio, tornando-se este a principal
causa de morte (Gilliam et al., 2004). Parece haver uma relação entre epilepsia,
comportamentos suicidas e depressão, partilhando estas patologias alguns mecanismos
comuns, nomeadamente a disfunção serotoninérgica no sistema límbico (Oquendo et
al., 2003).
A amígdala é uma das estruturas-chave do sistema límbico com papéis muito
bem definidos tanto a nível emocional como na epilepsia. Estudos com PET e SPECT
nos pacientes com ELT (Theodore, 2006; Didelot et al.; 2008; Ito et al.; 2007) e em
ratos epilépticos (Keele et al., 2005) mostram alterações nos receptores 5-HT na
amígdala, formação do hipocampo e noutras áreas do sistema límbico (Kim et al., 2007;
Smolders et al., 2008). A diminuição crónica dos níveis serotoninérgicos nos indivíduos
com ELT conduz a uma hiperexcitabilidade da amígdala basolateral (Rainnie et al.;
1992), resultando na incapacidade de inibir os comportamentos emotivos e controlar os
impulsos associados a desordens afectivas que incluem o medo, a ansiedade, a insónia,
a agressão, a dificuldade de aprendizagem e o défice no reconhecimento (de faces, por
exemplo). Desenvolve-se assim uma combinação de causa-efeito entre crise convulsiva
devido a alterações químicas e estruturais no sistema límbico e alterações psiquiátricas.
Consultando o Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, podemos
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verificar a existência de uma relação bidireccional entre doenças psiquiátricas e
epilepsia; os doentes com epilepsia, incluindo crianças, mostram taxas elevadas de
doenças depressivas (22,6%), ansiedade (35,8%) e défices de atenção e hiperactividade
(ADHD, 26,4%).
A prevalência da depressão situa-se entre os 20 a 55% em pacientes com um
pobre controlo das crises (Gillian et al., 2004; Pellock et al., 2004), em comparação
com a população geral, cujos casos rondam os 13 a 21% (Blazer et al., 1994). A
combinação sintomatológica de depressão, anergia, irritabilidade e euforia, a dor atípica,
a insónia, o medo e a ansiedade é conhecida como desordem disfórica interictal e
coexiste frequentemente com um quadro de excessiva actividade neuronal paroxística
nos doentes com epilepsia. Além disso, verifica-se também uma relação entre as taxas
de suicídio em casos de epilepsia, dado que a depressão ocorre numa grande
percentagem de pacientes epilépticos que se suicidam (Salzberg e Vajda, 2001). Uma
hipofunção serotoninérgica parece constituir o maior mecanismo patogénico que está na
base do desenvolvimento da depressão (Hasler et al., 2004). Os pacientes com
depressão evidenciaram resposta atenuada aos agonistas dos 5-HT1A in vivo e
diminuição da ligação dos receptores 5-HT1A post mortem (Lesch et al., 1990).
Verifica-se uma correlação significativa entre sintomas depressivos em doentes com
ELT e diminuição das ligações dos receptores 5-HT1A (Hasler et al., 2007) nas regiões
límbicas incluindo a formação do hipocampo ipsilateral (Giovacchini et al., 2005) e o
córtex do cíngulo anterior (Savic et al., 2004).
Os pacientes com ELT apresentam frequentemente défices na memória espacial
e outras formas de memória declarativa. Em comparação com indivíduos controlos, os
casos de ELT evidenciam uma performance cognitiva baixa em várias tarefas,
nomeadamente na memória, no discurso e na resolução de problemas diários (Silva et
al., 2007). Esta relação não está totalmente esclarecida, pelo que se tornam necessários
mais estudos comportamentais e de memória em modelos animais de ELT.
Os modelos animais de epilepsia refractária (induzida por pilocarpina e que
desenvolvem SE com posteriores crises espontâneas) exibem aumento significativo da
ansiedade em testes comportamentais e em testes de memória como o open field, o
elevated plus maze, o hole board e o teste de exploração de novos objectos;
simultaneamente, desenvolvem também diminuição da imobilidade no forced swim and
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tail suspension test, enquanto que o Morris water maze indica uma severa deficiência da
aprendizagem e da memória (Müller et al., 2009). Todavia, nos modelos que utilizam
ácido caínico, após injecção intrahipocampal deste composto, os animais exibem apenas
pequenas alterações nos testes comportamentais utilizados para avaliar a actividade e a
função motora, os comportamentos depressivos, a aprendizagem e a memória (Gröticke
et al.; 2009).
Estudos realizados com o precursor da serotonina, o triptofano, e com os subreceptores desta amina, evidenciam o seu papel na modulação das funções cognitivas
em modelos animais de ELT. A modulação da memória é da dependência dos
receptores 5-HT4, que também regulam a síntese de vários neurotransmissores a nível
pré- e pós-sináptico (Lucas, 2009). Pelo contrário, os antagonistas dos receptores 5-HT6
promovem o processo de memória e revertem a amnésia; o SB-39985 e as drogas
amnésicas como o dizocilpina e a escopolamina, modulam a expressão do RNAm do
receptor 5-HT6 no córtex pré-frontal, na formação do hipocampo e no corpo estriado,
em animais submetidos ao Pavlovian/mental autoshaping task (Huerta-Rivas et al.,
2009).
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Capítulo 2.
Modelos Experimentais de ELT
As limitações éticas e experimentais dos estudos em humanos fazem com que os
estudos em animais se tornem imprescindíveis. Dada a necessidade de melhorar a
compreensão dos mecanismos envolvidos no início ictal, na epileptogénese e nas crises
espontâneas recorrentes, bem como o estudo de novas estratégias terapêuticas, conduz
ao gradual desenvolvimento de modelos animais que mimetizam os diferentes tipos de
epilepsia/crises do Homem. Estes modelos dividem-se em dois grandes grupos,
nomeadamente agudos ou crónicos, consoante as capacidades de indução de
convulsões/epilepsia.
No que diz respeito à ELT, os diversos modelos experimentais dão-nos a
oportunidade de (1) estudar diferentes factores (trauma, contusão) que podem
influenciar o subsequente desenvolvimento de epilepsia; (2) observar diferentes eventos
que podem contribuir para o processo de doença (durante a epileptogénese)
subsequentes a esses factores mas antecedente ao início e ao desenvolvimento de crises
espontâneas; e (3) estudar o SNC (sistema nervoso central) na epilepsia crónica em
detalhe, utilizando técnicas fisiológicas, farmacológicas, moleculares e anatómicas
(Nissinen, 2006)
2.1. Modelos Agudos de ELT
Os modelos agudos permitem essencialmente estudar as alterações promovidas
pelas crises convulsivas e, no que diz respeito à ELT, o modelo de MES (maximal
electroshocks) é um dos modelos eléctricos não invasivos mais usados, a par do modelo
químico de pentilenotetrazol (PTZ)
No modelo de MES usa-se um estímulo eléctrico intenso e de curta duração para
induzir uma crise tónico-clónica generalizada. Esta crise acontece imediatamente após a
estimulação induzida, mediante eléctrodos estimuladores bipolares implantados na
córnea, ou um eléctrodo monopolar em cada lobo da orelha.
O PTZ, cujo mecanismo de acção é conferido pela inibição dos canais de cloro
associados a receptores do GABA, implica a injecção de uma dose relativamente
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elevada (geralmente 70 mg/Kg) subcutaneamente, o que resulta em convulsões tónicoclónicas recorrentes de curta duração.
2.2. Modelos Crónicos de ELT
2.2.1 Modelos Baseados no Status Epilepticus
Contrastando com o modelo de kindling, o SE é mais fácil de produzir, embora
as sequelas induzidas sejam mais variáveis. O SE é frequentemente produzido pela
administração sistémica (subcutânea ou intraperitoneal) de ácido caínico ou pilocarpina.
Estes agentes convulsivos podem também ser aplicados em locais específicos como a
amígdala e a formação do hipocampo. Após a indução do SE, as crises espontâneas
ocorrem num período de 1 mês e as alterações morfológicas que ocorrem no hipocampo
após o SE induzido tanto por substâncias químicas, como por estimulação eléctrica, são
frequentemente semelhantes às alterações encontradas na ELT humana. A desvantagem
do SE reside na dificuldade do seu controlo, bem como o substancial número de animais
que morrem durante a fase de SE.
2.2.1.1. Status Epilepticus induzido por Ácido Caínico
O KA é um análogo estrutural do glutamato, com propriedades excitotóxicas
(Coyle, 1983) que induz um comportamento epileptiforme em ratos após administração
intraventricular, e crises convulsivas após administração sistémica (Tanaka et al., 1992).
O seu mecanismo de acção desenvolve-se pela sua interacção com o receptor
glutamatérgico (sub-tipo KA), onde promove despolarização de todos os neurónios que
expressam este receptor, por um longo período de tempo. O stratum lucidum de CA3 e
as camadas piramidais de CA1 e CA3 da formação do hipocampo expressam grande
afinidade para as ligações do KA, sendo as áreas mais sensíveis para a acção deste
ácido. (Sperk, 1994).
São várias as formas de administração do KA, desde a administração
intraperitoneal, endovenosa, subcutânea, até à administração via cirurgia estereotáxica
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nos ventrículos cerebrais, na formação do hipocampo e na amígdala. O fármaco pode
ser administrado numa única dose eleveda (8 a 15 mg/Kg), em várias pequenas doses
(2,5 a 5,0 mg/Kg) (Hellier et al., 1998), ou localmente em doses de 0,1 a 0,3 µg por
hemisfério (Leite et al., 2002)
Após a administração sistémica de KA, as crises límbicas que se originam na
formação do hipocampo, rapidamente se propagam para o septo lateral, complexo
amigdalóide, complexo subicular, córtex entorrinal e várias regiões extralímbicas (BenAri et al., 1981). Cinco minutos após administração sistémica de KA os ratos adaptam
uma postura catatónica, e 9 minutos após a administração são registadas os primeiros
grafoelementos de actividade paroxística no EEG, caracterizados por pontas ou surtos
de pontas (Tuunanen et al., 1999). Aproximadamente 1 hora após a administração de
KA o EEG regista pontas contínuas, o que é considerado o início do SE. As primeiras
crises espontâneas motoras (Tanaka et al., 1992; Hellier et al., 1998) ocorrem entre 4 a
7 dias após a injecção de KA e a frequência das crises é bastante variável de animal para
animal, indo desde um pequeno número de crises, até crises diárias (Hellier et al.,
1998), sendo na maioria do casos, crises generalizadas no estádio 3 a 5, de acordo com a
escala de Racine (1972).
O modelo de KA mostra muitas alterações neuropatológicas semelhantes às
encontradas na ELT em humanos. Em ambos os casos as lesões neuronais confinam-se
à formação do hipocampo, região parahipocampal, complexo amigdalóide e córtex
piriforme (Schwob et al., 1980; Ben-Ari et al., 1985; Hudson et al., 1993; Pitkänen et
al., 1998; Tuunanen et al., 1999). O hilo da circunvolução denteada, as regiões CA1 e
CA3 (Schowb et al., 1980; Groticke et al., 2008) do hipocampo, a camada III do córtex
entorrinal (Du et al., 1993, 1995) e especialmente o núcleo basal da amígdala
(Tuunanen et al., 1999; Yilmazes-Hanke et al., 2000) encontram-se alterados de uma
forma semelhante à que é encontrada no Homem. No que diz respeito à circunvolução
denteada, as lesões são caracterizadas por uma desorganização estrutural na camada das
células granulares, provavelmente devido às alterações da migração neuronal (Engel,
1996, 2001). Porém, tanto no modelo animal com KA como na ELT, a camada granular
parece ser bastante resistente às crises epilépticas, sendo a perda neuronal nesta região
menos evidente (Houser, 1992).
18
2.2.1.2. Status Epilepticus Induzido por Pilocarpina
A pilocarpina é um agonista dos receptores muscarínicos da acetilcolina (Ach),
que induz crises epilépticas em roedores após ser administrada sistémica ou
intracerebralmente (aplicação focal ou intraventricular) (Turski et al., 1989). Pode ser
administrada numa única dose elevada (320-400 mg/kg) ou combinada com lítio (3
mEq/Kg, correspondentes a 127 mg/Kg) (Tariq et al., 2008). O tratamento prévio com
lítio, seguido de várias doses de pilocarpina, produz um SE eficiente, com a vantagem
de se registar uma menor mortalidade, comparado com doses mais elevadas (Glien et
al., 2001). A par da pilocarpina procede-se à administração subcutânea de
metilescopolamina (1mg/Kg) de forma a reduzir os efeitos periféricos associados à
activação do sistema nervoso autónomo provocada pela pilocapina (Cavaleiro et al.,
2006). Esta substância produz várias alterações comportamentais, a seguir às quais se
desencadeiam crises límbicas motoras cerca de 30 minutos após a injecção do fármaco;
o estado 4 ou 5 desenvolve-se passados 10 minutos e a actividade crítica progride para
crises epilépticas límbico, que dura várias horas; todavia, o SE é mantido por cerca de
90 minutos, após os quais é feita administração de diazepam para parar a crise e
diminuir a taxa de mortalidade (Cavalheiro et al., 2006).
A primeira crise epiléptica espontânea ocorre após 2 a 75 dias após injecção de
pilocarpina e a frequência, no período crónico, varia consideravelmente entre os animais
(Cavalheiro et al., 2006), sendo que estes podem experimentar desde apenas poucas
crises até ao desenvolvimento de crises diárias. A maioria das crises no modelo de
pilocarpina preenchem os critérios dos estádios 3 a 5 da escala de Racine (crises
generalizadas).
A amígdala, o tálamo, o córtex olfactivo, a formação do hipocampo, o neocórtex
e a substância negra são as regiões mais sensíveis às lesões provocadas pela pilocarpina
(Turski et al., 1989; Fujikawa, 1996). O SE induzido provoca alteração nas funções
cognitivas, como está comprovado utilizando o Morris water-maze (Hort et al., 1999;
Grotick et al., 2008).
19
2.2.2 Modelo de Kindling
Denomina-se kindling o fenómeno pelo qual a aplicação repetitiva de um
estímulo eléctrico com limiar inicialmente subconvulsivo (via implantação crónica de
eléctrodos), produz alterações progressivas nas respostas diárias à estimulação (Goddard
et al., 1969). A sua grande vantagem reside na facilidade de indução das crises.
O modelo de kindling eléctrico aproxima-se mais às condições humanas de TLE,
em comparação com os modelos de crises induzidas quimicamente. Os primeiros
estádios do kindling representam um modelo de crises parciais; todavia, com a repetição
diária, observam-se crises parciais complexas secundariamente generalizadas. As áreas
cerebrais mais sensíveis ao kindling afectam toda a região límbica, bem como algumas
áreas prosencefálicas; o efeito mais dramático encontra-se após estimulação de
estruturas do lobo temporal como a amígdala e região cortical adjacente, incluindo os
córtex piriforme, perirrinal, insular e entorrinal (Mohapel et al., 1996).
Uma vez produzido, o estado kindled persiste indefinidamente, sendo induzido
através da estimulação diária, durante várias semanas a meses. Estima-se que um padrão
de 90 a 100 crises sejam necessárias para que o animal desenvolva um estádio de crises
espontâneas (Sutula e Ockuly, 2006). Aproximadamente 20 a 25% das aplicações de
kindling na via perfurante irão desencadear crises convulsivas de índice 4 ou mais
(Racine, 1972; Michalaskis et al., 1998). Tal é confirmado pelo estudo
electrofisiológico após estimulação bilateral desta via, em que se registaram descargas
das células granulares por um período de 4 horas, resultando em morte das células
musgosas do hilo, e que expressam a sub-unidade 2 do receptor de glutamato (GluR2),
em ratos geneticamente modificados para resistência ao KA. Estimulações mais
prolongadas da via perfurante, por um período de 24 horas, promovem uma perda
neuronal extensa na formação do hipocampo, no septo e no córtex entorrinal (Kienzler
et al., 2009).
20
2.2.2.1. Kindling Rápido
O kindling rápido é um método pelo qual se observam fenómenos de
epileptogénese que conduzem a uma hiperexcitabilidade límbica, assim como à
progressão de alterações cognitivas e resposta às drogas anti-epilepticas (Schmutz et al.,
1988; Loscher, 2002; Pitkanen e Sutula, 2002). Mazarati et al. (2007) demonstraram o
valor do kindling rápido no estudo das modificações da doença em termos de atraso do
desenvolvimento das crises motoras em resposta a estímulos repetitivos. Todavia, a
utilidade do kindling rápido como modelo de supressão da epileptogénese necessita de
uma validação mais completa.
A vantagem do kindling rápido reside na possibilidade de estudar as alterações
precoces ao rearranjo de redes neuronais identificadas nos casos crónicos de ELT,
podendo-se identificar formas de minimizar as consequências a longo prazo, pelo que as
epilepsias pediátricas poderão vir a beneficiar bastante deste tipo de estudos (Mazarati
et al., 2007). De acordo com Michalakis et al. (1998), as crises espontâneas não
provocam lesões nos tecidos, não se verificando diferenças histológicas entre crises
espontâneas e crises não espontâneas no hilo da cincunvolução denteada. Todavia, uma
única crise com duração pós-descarga de 82 segundos pode induzir fragmentação de
DNA das células granulares da fáscia denteada, bilateralmente (Bengzon et al., 1997).
Estes dados são confirmados com estudos de diferenciação de kindling rápido e lento,
com concomitante análise dos níveis de neurotransmissores e monoaminas. A
estimulação em massa (a cada 6 segundos, durante 40 estímulos) em ratos
geneticamente sensíveis ao kindling da amígdala, provocou crises cada vez mais
intensas associadas a um aumento progressivo do glutamato extracelular e diminuição
do GABA, promovendo também um aumento dos níveis de noradrenalina e dopamina,
mas não de serotonina. Estes resultados estão em linha com resultados prévios,
permitindo aferir que o sistema serotoninérgico desempenha um papel menos relevante
do que o noradrenérgico no kindling (Araki et al., 1983; During et al., 1992; e Shin et
al., 2004). Mais ainda, a estimulação repetitiva massiva da amígdala pode
diferencialmente afectar e/ou inibir os níveis de neurotransmissores nas crises, sendo a
sensibilidade a esta manipulação, geneticamente determinada (Shin et al., 2004).
Outra vantagem acrescida do kindling rápido é o estudo de drogas antiepilépticas e a grande diferença está na frequência diária dos estímulos. Os protocolos
21
de kindling tradicional implicam uma ou duas estimulações diárias, podendo levar
semanas a realizar-se, desenvolvendo-se o kindling da amígdala mais rapidamente que o
kindling da formação do hipocampo (McIntyre et al., 2002). Porém, os protocolos de
kindling rápido têm em conta a aplicação de vários estímulos por dia, permitindo que os
animais atinjam um estado de pleno kindling mais rapidamente, em comparação com o
kindling tradicional. A diferença é bastante significativa, já que os estudos de kindling
tradicional indicam que após 150 crises do estado 5 observa-se progressiva redução de
neurónios nas regiões CA1 e CA3 da formação do hipocampo, da circunvolução
denteada e do córtex entorrinal (Cavazos et al., 1991). Já no kindling rápido que induz
crises hipocampais recorrentes (Lothman e Williamson, 1993, 1994), os animais
atingem um estado de kindling total em 3 dias, obtendo-se uma resposta positiva do
levtiracetam ao quarto dia (Smedt et al., 2005). O kindling rápido da formação do
hipocampo promove morte neuronal generalizada nos ratos (Bengzon et al., 2007),
induzindo um aumento da apoptose nas células granulares da circunvolução denteada
após estimulação da via perfurante (Sloviter et al., 1996).
2.2.2.2. Kindling Rápido da Amígdala
As crises produzidas pelo kindling rápido da amígdala (REAK) estimulam a
neurogénese na circunvolução denteada, sem aparente morte neuronal. O modelo REAK
em ratinho promove uma oportunidade para testar, de uma forma bastante controlada, o
efeito das crises numa grande variedade de condições experimentais.
Em contraste com os modelos de SE em que se verifica extensiva morte
neuronal na formação do hipocampo (Borges et al., 2003; Smith et al., 2005), o REAK
provoca um aumento mitótico na região subgranular da circunvolução denteada, sem
que se verifique aumento da morte neuronal nesta região (Smith et al., 2005). Trata-se
de um modelo rápido de indução de crises focais fenotipicamente semelhantes às que
ocorrem na ELTm em humanos, e que regula a neurogénese em resposta às crises, não
somente devido à brevidade dos insultos, mas também à ausência de morte neuronal
(Smith et al., 2005).
22
2.2.2.3 Kindling Químico
O kindling químico é uma forma rápida de indução de crises generalizadas, de
índole mais grave e prolongada (Cavalheiro et al., 1991), estando associado a alterações
metabólicas incluindo hipóxia e hipertermia, e a lesão dos neurónios da formação do
hipocampo e alterações na neurogénese (Smith et al., 2005). Estes modelos baseiam-se
na administração repetitiva de substâncias químicas, e o PTZ parece ser bastante
relevante, dado o seu papel antagonista do sistema GABAérgico.
23
Capítulo 3.
Envolvimento da Serotonina na Génese da Actividade Convulsiva
A serotonina é um importante neurotransmissor encontrado nos SNC e sistema
nervoso periférico (SNP) dos mamíferos e o estudo do seu envolvimento na epilepsia é
necessário para a resolução do problema da resistência farmacológica (Loscher e
Leppik, 2002). Associada a fenómenos de regulação das crises (Bagdy et al., 2007),
participa em mecanismos inibitórios e excitatórios, consoante os neurotransmissores
activados, nomeadamente o GABA e o glutamato. Na verdade, altas concentrações
extracelulares de serotonina promovem um efeito protector e anticonvulsivante,
enquanto as reduzidas concentrações extracelulares agravam as crises (Clinckers et al.,
2004). No SNC, o principal centro de síntese e regulação de serotonina são os núcleos
do rafe, principalmente o núcleo dorsal do rafe (DR) (Moore e Halaris, 1975; Azmitia e
Segal, 1978) que projecta para várias estruturas do sistema límbico, especialmente a
formação do hipocampo e a amígdala.
Não é apenas a redução de serotonina mas também do seu precursor, o triptofano
(Trp), que estão envolvidos nos fenómenos de epileptogénese. Estudos realizados em
pacientes com epilepsia indicam diminuição dos níveis de Trp no plasma e no líquido
cefalorraquidiano (Ko et al., 1993; Marion et al., 1985), verificando-se uma redução de
cerca de 30% na taxa de captação cerebral de Trp nestes pacientes, quando comparados
com os controlos (Mainardi et al., 2008). Baixas concentrações de Trp na dieta durante
o desenvolvimento produz diminuição da taxa de síntese de 5-HT, afectando o
desenvolvimento e maturação dos interneurónios corticais GABAérgicos (OrozcoSuárez, 1997, Thompson, 1998), e serotoninérgicos (Orozco-Suarez et al., 2003) no
córtex cerebral e nos núcleos do rafe, respectivamente. Estes factos promovem
alterações da excitabilidade cortical, contribuindo, em parte, para o aumento da
actividade convulsiva (Feria Velasco et al., 2008). Vários estudos revelam que a 5-HT é
essencial para a activação dos neurónios GABAérgicos e, desta forma, inibir a
actividade epileptiforme.
Nos últimos anos os estudos das vias serotoninérgicas têm vindo a reforçar o
papel desta monoamina na modulação da excitabilidade neuronal em várias áreas
cerebrais, via activação dos cerca de 14 receptores descritos, cuja distinção tem por base
as diferentes características estruturais, funcionais e farmacológicas (Brandley et al.,
24
1986; Hoyer et al., 1994). Existem diferentes tipos de neurónios que expressam
receptores serotoninérgicos no SNC e, pelo menos, os 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2C e 5-HT7
(Hoyer et al., 1994; Barnes e Sharp, 1999) e 5-HT4 (Tokarski et al., 2002) estão
presentes nos neurónios GABAérgicos e glutamatérgicos da formação do hipocampo
e/ou córtex cerebral. Os receptores serotoninérgicos acoplados à proteína G e o receptor
5-HT3 ligado a canais iónicos podem directa ou indirectamente modificar a condutância
iónica das membranas celulares, resultando em despolarização ou hiperpolarização
neuronal (Barnes e Sharp, 1999).
O córtex entorrinal (ERC), que recebe fortes projecções 5-HT do núcleo do rafe
e as envia para a formação do hipocampo e outras regiões corticais, expressa grandes
quantidades de receptores 5-HT1, 5-HT2 e 5-HT3, parecendo ser o local de modulação
da actividade bioeléctrica. A aplicação de serotonina no ERC inibe a transmissão
excitatória (Schmitz et al., 1995) e reduz a excitabilidade neuronal via activação dos
canais de K+ (Grunschlag et al., 1997; Ma et al., 2007). Mais recentemente estes dados
foram apoiados pelos trabalhos de Deng e Lei (2007), que demonstraram pela primeira
vez que a 5-HT aumenta a síntese do GABA, por facilitação do TASK-3 – um tipo de
canal K2p, e inibe a actividade paroxística em modelos animais com concentrações
reduzidas de Mg2+, na camada III do ERC, via activação dos receptores 5-TH2A. Outros
autores referem que a 5-HT excita as células piramidais de CA1 (Schmitz et al., 1995) e
as células granulares da circunvolução denteada (Levkovitz e Segal, 1997) via inibição
dos interneurónios GABAérgicos.
3.1. Receptores 5-HT1
Os receptores 5-HT1A estão localizados tanto a nível pós-sináptico nos neurónios
do sistema límbico, como a nível dos dendritos e do soma dos neurónios dos núcleos do
rafe do mesencéfalo e protuberância. No prosencéfalo, estes receptores estão presentes
nos neurónios piramidais do neocórtex, bem como nas células granulares e piramidais
da formação do hipocampo (Francis et al., 1992). Em ratos tratados com KA, verifica-se
uma correlação significativa entre a perda dos receptores 5-HT1A e a perda neuronal na
região CA1 durante a fase crónica após injecção de KA (Van Bogaert et al., 2001).
25
Os receptores 5-HT1A expressam-se em neurónios serotoninérgicos do núcleo do
rafe, em neurónios colinérgicos no septo e, provavelmente, em neurónios
glutamatérgicos do córtex e formação do hipocampo (Francis et al., 1992).
Alguns investigadores referiram que a serotonina inibe a actividade
epileptiforme por activar o receptor 5-HT1A (Salgado-Commissariat e Alkadhi, 1997) e
hiperpolarizar directamente as células piramidais no córtex cerebral (Colino e Halliwell,
1987). Estes receptores estão predominantemente localizados em regiões límbicas e os
estudos em animais sugerem que a 5-HT, por via destes receptores, medeia um efeito
anti-epiléptico e anticonvulsivo.
Apesar de se reconhecerem vários tipos de receptores, os 5-HT1A são a classe
mais envolvida na epileptogénese e vários estudos apontam para a importância da sua
redução em casos de epilepsia temporal. Os estudos no Homem utilizando o PET
indicam que os receptores serotoninérgicos 5-HT1A pós-sinápticos estão em défice na
formação do hipocampo ipsilateral ao foco epiléptico em pacientes com (Ito et al.,
2007) e sem atrofia hipocampal na RMN (Theodore, 2004; Toczek et al., 2003). Outros
estudos evidenciam um défice de 5-HT1A na amígdala, no córtex do cíngulo anterior,
córtex temporal lateral, na formação do hipocampo contralateral e nos núcleos do rafe
(Savic et al., 2004), estando de acordo com as evidências em animais, demonstrando o
papel da amígdala e da formação do hipocampo (Andrade et al., 1986 e Colino et al.,
1987) no controle da hiperexcitabilidade neuronal. Além disso, o neocórtex que envolve
o foco epiléptico de pacientes com ELTm apresenta défice de ligações de 5-HTT em
todas as camadas corticais, especialmente nas camadas I e II, enquanto as camadas V e
VI apresentam aumento nas ligações dos receptores 5-HT4 (Rocha et al., 2007).
Fica a dúvida se esse défice é causa ou consequência das crises. Note-se que a
perda selectiva de receptores 5-HT1A nos interneurónios da região CA1 de musaranhos
adultos sensíveis às crises pode ser uma modificação compensatória adquirida, induzida
pela repetição de crises (Kim et al., 2007).
A activação dos receptores 5-HT1A pré-sinápticos e pós-sinápticos têm efeitos
opostos: a activação dos 5-HT1A pré-sinápticos nos neurónios glutamatérgicos pode
induzir convulsões por aumento da síntese de glutamato, enquanto a activação dos 5HT1A pós-sinápticos nos mesmos neurónios glutamatérgicos tem um efeito
anticonvulsivo (Kim et al., 2007)
26
Os receptores mais estudados e com maior impacto na epilepsia são os 5-HT2C,
apresentando-se em elevada concentração no plexo coroideu, apesar dos locais de
ligação destes receptores estarem difusamente distribuídos e presentes em áreas do
córtex cerebral (piriforme, cíngulo e retrosplénico), sistema límbico (nucleus
accumbens, formação do hipocampo e amígdala) e no núcleo caudado e substância
negra. A sua função ainda não está claramente definida, dividindo-se os vários estudos
pelas acções proconvulsivantes, como anticonvulsivantes.
A activação dos receptores 5-HT2 na formação do hipocampo e no corpo
estriado pode facilitar as crises induzidas pela estimulação muscarínica de várias áreas
do sistema límbico (Freitas et al., 2004) em modelos de SE induzido por pilocarpina.
Neste mesmo modelo de pilocarpina, o SE induzido não é capaz de alterar a densidade
dos receptores 5-HT2C na formação do hipocampo, mas pode levar a uma diminuição da
afinidade dos 5-HT2C para a 5-HT (Freitas et al., 2005)
A presença dos 5-TH2C no córtex piriforme e substância negra foi demonstrada
pela resposta electrofisiológica mediada (Sheldon e Aghajanian, 1991) e, quando
activados, verifica-se aumento da actividade da fosfolípase C no plexo coroideu,
iniciando-se uma excitação neuronal em várias regiões cerebrais (Sheldon e Aghajanian,
1991). Todavia, esta ideia não é apoiada por outros estudos, nos quais se verificou um
efeito anti-convulsivante mediante a supressão da hiperexcitabilidade neuronal
(Applegate e Tecott, 1998); além disso ratinhos geneticamente modificados com
bloqueio dos receptores 5-HT2C são muito mais susceptíveis a crises audiogénicas
(Tecott et al., 1995; Brennan et al., 1997; Applegate et al., 1998).
Os receptores 5-HT3 encontram-se no SNC e SNP, sendo os núcleos do tronco
cerebral (núcleo dorsal do vago e núcleos do nervo trigémeo), a área postrema e o
núcleo solitário, e a substância gelatinosa em todos os níveis da medula espinal, as
regiões que apresentam maior densidade destes receptores (Hoyer et al., 1994). Embora
em menor densidade, estes receptores também se encontram no córtex cerebral e em
27
regiões límbicas como a formação do hipocampo, a amígdala e núcleo medial da
habénula. O seu envolvimento na epilepsia é pouco claro e os estudos com estes
receptores são escassos, mas parece que a sua activação desencadeia uma rápida
despolarização por abertura de canais selectivos de catiões (Peters et al., 1992).
Os receptores 5-HT4 expressam-se em estruturas límbicas (hipotálamo, nucleus
accumbens e amígdala), nos tubérculos olfactivos, no hipocampo, nos núcleos da base e
na substância negra, estando bem documentado o seu envolvimento nos processos de
aprendizagem e memória (Engel et al., 1996; Bockaert et al., 1998), assim como no
aumento da susceptibilidade para as crises (Compan et al., 2004). A activação dos 5HT4 aumenta a actividade epileptiforme na formação do hipocampo de ratos (Tokarsky
et al., 2002), diminuindo ao mesmo tempo a síntese de GABA e aumentando a síntese
de serotonina (Bockaert et al., 1998).
A concentração de receptores 5-HT7 é relativamente elevada no tálamo,
hipotálamo e formação do hipocampo, apresentando-se em menor concentração no
córtex cerebral e na amígdala (Stowe e Barnes, 1998). A actividade biológica dos
ligandos sugere que os 5-HT7 podem estar envolvidos na dor, enxaqueca, epilepsia,
depressão, ansiedade, memória e regulação dos ciclos circadianos (Lovenberg et al.,
1993; Thomas et al., 2003). Os primeiros estudos destes receptores são a favor de um
efeito proconvulsivante; todavia, estudos mais recentes apontam estes receptores como
anticonvulsantes.
Assim, a aplicação de SB 269970, um antagonista dos receptores 5-HT7, mostra
actividade antidepressiva (Wesolowska et al., 2006) e aumenta a acção das drogas
antidepressivas (Wesolowska et al., 2007), como imipramina (um antidepressivo
tricíclico) ou de citalopram (um bloqueador selectivo da recaptação de 5-HT). Estes
diminuem a resposta da região CA3 do hipocampo à activação dos receptores 5-HT7
28
(Tokarski et al., 2005) e parecem actuar no núcleo supra-quiasmático, onde sub-regulam
os 5-HT7, após tratamento crónico (Mullins et al., 1999). Estes resultados vão ao
encontro dos resultados obtidos por Pericic (2007), onde se demonstra que o 5-CT (um
potente agonista dos 5-HT7) exerce acções anticonvulsivantes em ratos submetidos ao
stress; este efeito anticonvulsivo foi abolido pelo SB 269970 (Peričić e Strac, 2007).
Nem todas as classes de antidepressivos estão estudadas e alguns revelam mesmo não
possuir qualquer efeito. É o caso da tiapentina, um antidepressivo atípico facilitador da
recaptação da serotonina, e do hidroaspartato de lítio, cujo uso não resulta na
modificação da resposta hipocampal à activação dos receptores 5-HT7 (Pitra et al.,
2007).
Por outro lado, vários autores apoiam a hipótese de que o aumento da
excitabilidade neuronal está associada ao aumento da soma de potenciais de acção póssinápticos excitatórios e inibitórios, contribuindo para a formação da actividade
bioeléctrica do cérebro, apoiando o efeito pro-convulsivo destes receptores. Estudos
electrofisiológicos têm mostrado que a activação dos receptores 5-HT7 aumenta a
excitabilidade da membrana neuronal nos gânglios dorsais espinhais (Cardenas et al.,
1999), na formação do hipocampo (Bacon e Beck, 2000; Gill et al.; 2002; Tokarski et
al., 2003), especialmente na região CA3 (Stowe e Barnes, 1999; Gill et al., 2002), no
tálamo (Chapin e Andrade, 2001a,b) e no córtex pré-frontal (Beique et al., 2004),
resultando em surtos intermitentes de actividade paroxística (Chapin e Andrade,
2001a,b, Gill et al., 2002; Tokarski et al., 2003). Assim a depleção do receptor 5-HT7
diminui a susceptibilidade para a actividade paroxística e para o fenótipo resistente às
crises, parecendo existir uma modificação adaptativa ao longo do desenvolvimento.
Neste âmbito, Beique et al., (2004) concluem que no córtex pré-frontal se verifica uma
regulação de receptores de 5-HT que controlam a excitabilidade de neurónios
piramidais. A serotonina promove uma despolarização na camada V durante os 6 a 12
dias do período pós-natal, surgindo gradualmente uma hiperpolarização durante a
terceira semana pós-natal. Estas ou outras modificações que ocorrem em áreas do
cérebro mais directamente relacionadas com a epilepsia, como a formação do
hipocampo, apesar de serem ainda pouco conhecidas, sugerem que as modificações
adaptativas à perda da despolarização induzida pelos 5-HT7 pode ter contribuído para o
actual fenótipo observado na predisposição para as crises (Witkin et al., 2007). Outros
29
estudos são necessários para determinar o mecanismo exacto do efeito proconvulsivante
da depleção de receptores 5-HT7.
A depressão é um ponto comum aos animais pós-SE, embora coexista com várias
alterações comportamentais e bioquímicas congruentes com um estado depressivo,
levando a um desenvolvimento sintomatológico de anedonia (a perda da capacidade de
sentir prazer, Mazarati et al., 2008), um dos sintomas-chave em indivíduos deprimidos,
(Overstreet et al., 2005), a par das alterações da memória, das funções locomotoras e
emocionais (Groticke et al., 2008) que acompanham os casos de ELTm. Estudos
realizados em animais geneticamente modificados demonstram défices de aprendizagem
dependentes das alterações da formação do hipocampo e aumento dos níveis de
ansiedade (Sarnyai et al., 2000).
Apesar de já nas décadas de 70 e 80 do século passado a investigação básica
demonstrar que as concentrações reduzidas de 5-HT estavam intimamente relacionadas
com a susceptibilidade das crises em modelos animais (Lazarova et al., 1983) e no
homem a ideia de que os antidepressivos podem ser utilizados no tratamento da
epilepsia é recente. Somente após a década de 90 foi estabelecido o papel da serotonina
na patogénese da epilepsia; antes desta data, os inibidores selectivos da recaptação de
serotonina (SSRIs), utilizados até então apenas como agentes antidepressivos, não
existindo indicação para tratamento de depressão em pacientes com epilepsia, apesar
das já existentes evidências contrárias: Boggan e Seiden em 1973 mostraram que o 5hidroxitriptofano, um precursor da serotonina, tinha efeito antiepiléptico. Também
Truscott (1975) descrevera o efeito da fenilalanina e do 5-hidroxitriptofano nas crises de
ratinhos
É certo que a administração repetida de antidepressivos exerce uma influência
pronunciada nos sistemas serotoninérgicos cerebrais. Todavia, estes sistemas não estão
totalmente compreendidos e apenas recentemente se chegou a um consenso sobre o uso
de antidepressivos na epilepsia. Como é evidente, o efeito antidepressivo é útil porque
os pacientes com epilepsia refractária apresentam fortes sinais e sintomas de depressão.
Por outro lado parecem aumentar a latência das crises epilépticas, diminuindo a sua
intensidade e duração. No entanto nem todos os antidepressivos podem ser usados,
existindo alguns que estão mesmo contra-indicados.
30
3.6. Antidepressivos como agentes proconvulsivantes
Como referido, os antidepressivos estavam contra-indicados em indivíduos
epilépticos, dado ocorrerem crises em pacientes com história intencional ou acidental de
overdose de antidepressivos tricíclicos (Liper, 1994; Baselt, 2000). Além disso os
tratamentos da depressão ou outras doenças psiquiátricas com antidepressivos tricíclicos
registam alguns casos de crises convulsivas (Rosenstein et al., 1993). O uso de doses
terapêuticas e overdose de SSRIs e inibidores da MAO conduziram a observações
similares (Marangel et al., 1999; Barry et al., 2001). A apoiar a ideia proconvulsiva dos
antidepressivos surgem os estudos epidemiológicos, que mostram que os indivíduos que
tomam antidepressivos têm um maior risco de convulsões, quando comparados com a
população geral (Hauser, 1997).
3.7. Antidepressivos como agentes anticonvulsivantes
Nos últimos anos a teoria anticonvulsivante tem vindo a ganhar espaço e vários
são os estudos que a apoiam, contornando as evidências prévias de aumento das crises
em indivíduos sujeitos a terapêutica antidepressiva. Os estudos animais indicam que a
depleção de serotonina no SNC não altera a acção anticonvulsivante da fluoxetina
(FLX), deixando as camadas profundas do colículo superior como o local de acção
anticonvulsivante da FLX na atenuação de crises tónico-clónicas generalizadas em
GERPs (geneticaly epilepsy-prone rat). Se o local de acção parece ser o colículo
superior, o mecanismo poderá estar relacionado com a sub-regulação dos receptores de
galanina tipo 2 (GalR2). Na verdade, a administração crónica de fluoxetina sub-regula
os GalR2, mas não os GalR1 no DR (Lu et al., 2005). Dado que os GalR2 promovem a
transmissão serotoninérgica, esta acção da fluoxetina pode ser um dos mecanismos do
efeito antidepressivo. Alguns autores defendem que o aumento da transmissão
serotoninérgica pode reduzir selectivamente a sensibilidade dos circuitos cerebrais para
a iniciação das crises. Este fenómeno pode explicar, pelo menos parcialmente, a
actividade anticonvulsiva da FLX. Ainda assim, existem vários estudos clínicos que
apoiam esta acção, visto que a FLX aumenta o efeito anticonvulsivante de várias drogas
antiepilépticas como a fenitoína e a carbamazepina (Mamiya et al., 2001). Em pacientes
31
com ELT mesial a administração de FLX reduz a frequência das crises parciais
complexas (Albano et al., 2006); já nos animais submetidos a FLX verifica-se no
estádio pós-SE a inibição de crises espontâneas recorrentes após a administração deste
fármaco (Hernandez et al., 2002). O efeito antiepiléptico nas crises induzidas por
estimulação hipocampal apenas se observa após tratamento crónico e persiste por uma
semana após o fim do tratamento com FLX (Wada et al., 1995, Mazarati et al., 2008). É
de notar que o tratamento crónico com fluoxetina exibiu alguns efeitos favoráveis nas
propriedades anticonvulsivantes de antiepilepticos (como a carbamazepina, fenitoína e o
valproato de sódio), resultando, contudo, de interacções farmacocinéticas (Borowicz,
2007).
O efeito antidepressivo induzido pelos fármacos aumenta a actividade
serotoninérgica, facto que resulta numa acção anticonvulsivante (Jobe e Brawning,
2005). Esta ideia é apoiada pelos estudos realizados em GERPs, que apontam uma
diminuição de noradrenalina e serotonina no encéfalo, neste modelo de epilepsia (Jobe
et al., 1995; Jobe, 2004). Os GERPs são um bom modelo para a avaliação
anticonvulsivante da fluoxetina, dado que a predisposição destes animais para as crises
é parcialmente dependente dos défices serotoninérgicos no cérebro (Dailey et al., 1992)
Estes défices ocorrem tanto a nível pré-sináptico como pós-sináptico e tanto os GERP3
(animais com 3 tipos de crises) como os GERP9 (animais com 9 tipos de crises)
apresentam uma magnitude semelhante de défices de serotonina. As alterações présinápticas surgem, pelo menos parcialmente, devido a uma perda de terminais
serotoninérgicos e noradrenérgicos, enquanto os défices pós-sinápticos surgem da falha
de regulação de receptores para compensar quantitativamente as reduções nas
concentrações (Nicoletti et al., 1986). Estes ensaios foram todos realizados com doses
terapêuticas. Os estudos animais indicam que elevadas doses podem activar outros
processos biológicos podem aumentar a susceptibilidade para convulsões (Jobe e
Browning, 2005).
Apesar da FLX inibir o metabolismo da 5-HT e interromper o SE induzido pela
excitabilidade cerebral em ratos pós-SE, falha na melhoria dos comportamentos
associados ao SE. Ainda assim, estão associados efeitos anticonvulsivantes da FLX em
modelos de electrochoques (Borowicz et al., 2007), verificando-se um aumento no
limiar da crise, bem como uma potenciação da actividade anti-electrochoque da
carbamazepina, difenilhidantoina e fenobarbital (Borowick et al., 2006).
32
A imipramina e o citalopram (antidepressivo tricíclico e inibidor selectivo da
recaptação de serotonina, respectivamente) exibem efeitos antidepressivos, a par das
suas propriedades anticonvulsivantes nos modelos animais de pilocarpina, facilitando
directamente a síntese de serotonina (Albano et al., 2006; Smolders et al., 2008). Este
efeito anticonvulsivo que os antidepressivos exibem e a simultânea facilitação
serotoninérgica (e também dopaminérgica) da formação do hipocampo leva a colocar a
hipótese de esta estrutura é um importante local de acção anticonvulsiva-antidepressiva
combinada, e que a ausência desta acção está associada ao bloqueio directo do aumento
destas monoaminas nesta região.
Os estudos mais recentes vêm confirmar que o sistema serotoninérgico não
contribui para as propriedades proconvulsivantes dos antidepressivos mas que, mesmo
assim, é preferível o uso de SSRIs em detrimento dos tricíclicos (cuja sobredosagem
causa convulsões) e dos inibidores da MAO (Jobe e Browning, 2005). Assim se reforça
a ideia de que o uso de antidepressivos em doses terapêuticas promove aumento da
transmissão
noradrenérgica
e
serotoninérgica,
actuando
como
agentes
anticonvulsivantes, enquanto overdoses de antidepressivos activam outros processos
biológicos que podem ser proconvulsivantes. Talvez a resposta positiva dos SSRI esteja
na sua capacidade de prevenir a atrofia do hipocampo por estimulação da neurogénese
das células (McEwen et al., 2005) e por mecanismos de neuroprotecção. Cada vez se
verifica um maior incentivo clínico para o uso de SSRIs, dado que estes têm um efeito
positivo do âmbito de quadros clínicos depressivos e de epilepsia. Assim, são seguros
quando administrados com precaução em doentes com epilepsia e depressão e a sua
utilização não deve ser menosprezada (Kondziella et al., 2009).
33
Capítulo 4.
Envolvimento da Serotonina nos Défices Comportamentais e nas Alterações
Morfológicas Associadas à Epilepsia
O principal desafio em qualquer estudo experimental na área da epilepsia é
determinação se as modificações estruturais e/ou funcionais que ocorrem como resposta
a lesões cerebrais são causa ou consequência do desenvolvimento da epilepsia. No que
diz respeito ao envolvimento da serotonina nestes processos, os estudos são ainda muito
escassos, sendo necessário avaliar todo o eixo serotoninérgico, desde o núcleo dorsal do
rafe até ao córtex cerebral. De facto, já existem alguns dados a nível dos locais de
síntese da 5-HT, que relacionam este sistema serotoninérgico com a epileptogénese. Por
exemplo, o neuropéptideo galanina modula as crises límbicas dado que interage com a
produção de serotonina nas populações neuronais que projectam para a formação do
hipocampo e ERC. O núcleo dorsal do rafe apresenta dois tipos de receptores de
galanina, GalR1 e GalR2, que desempenham efeitos opostos no que concerne á
epileptogénese: a activação dos GalR1 reduz a síntese de seronotina no núcleo dorsal da
rafe e, consequentemente, na formação do hipocampo (efeito pró-convulsivante),
enquanto que a activação dos galR2 aumenta a síntese de 5-HT nestas mesmas regiões,
tendo, por conseguinte, um efeito anti-convulsivante (Mazaratti et al., 2005).
A estimulação da via perfurante promove descargas prolongadas das células
granulares, o que causa extensas alterações na formação do hipocampo, acompanhada
de lesões extrahipocampais restritas ao septo e ERC, sprouting das fibras musgosas e
crises convulsivas (Kienzler et al., 2009). A estimulação prolongada da via perfurante
produz esclerose hipocampal, reorganização sináptica e um SE permanente. A injecção
intra-hipocampal de KA produz hipertrofia maciça da camada granular (Suzuki et al.,
1995; Bouilleret et al., 1999; Riban et al., 2002), que aparentemente resulta da perda de
expressão de reelina que normalmente mantém a estrutura laminar da camada granular
(Heinrich et al., 2006). Seria de total interesse o estudo das alterações serotoninérgicas
decorrentes da estimulação desta via, dado que os dados anatomo-funcionais são
escassos e pouco claros, no que diz respeito ao envolvimento da serotonina nas crises
epilépticas.
Das diversas classes de receptores 5-HT estudados, os 5-HT1A são talvez os mais
investigados e os estudos indicam degenerescência destes receptores nos processos de
34
epilepsia. Será a degenerescência destes receptores um dos fenómenos responsáveis
pela epileptogénese, ou este achado é consequência das crises? Kim e colaboradores,
utilizando ratos geneticamente modificados, estudaram musaranhos resistentes e
musaranhos sensíveis á epilepsia, verificando que a sub-regulação dos receptores póssinápticos 5-HT1A nos neurónios GABAérgicos da formação do hipocampo de
musaranhos sensíveis pode ser uma resposta compensatória para aumentar a inibição
GABAérgica, regulando assim as crises; verificaram também uma redução selectiva dos
5-HT1A nos interneurónios da região CA1 em musaranhos sensíveis adultos, o que
reflecte uma modificação compensatória, induzida pelas crises repetidas (Kim et al.,
2007).
Mais recentemente, estudos em ratos geneticamente modificados, em que se
verifica um grande aumento de fibras serotoninérgicas, revelam que esta lhes confere
resistência às crises generalizadas induzidas por KA; por outro lado, o tratamento
prolongado com para-cloranfetamina (PCA), um dos inibidores da síntese de serotonina
restabeleceu a susceptibilidade às crises, confirmando que os défices de serotonina estão
envolvidos nos processos degenerativos e na propagação da actividade convulsiva.
35
Capítulo 5.
Alterações Serotoninérgicas Periféricas Associadas à Epilepsia
Quando o tema Epilepsia é abordado, o conceito imediato que nos surge limita
esta doença à ideia geral de que a epilepsia resulta de uma hiperexcitabilidade cerebral
que induz alterações cerebrais, menosprezando-se os estudos periféricos. Este erro
frequente traduz a escassez de estudos a nível sanguíneo, quando, de facto, parece haver
uma forte correlação entre as alterações serotoninérgicas centrais e as alterações no
transportador da serotonina (SERT) acoplado à membrana das plaquetas sanguíneas;
assume-se que este transportador reflecte, embora através de mecanismos ainda
desconhecidos, a correlação funcional entre as plaquetas humanas e o SERT cerebral
(Rausch et al., 2005; Uebelhack et al., 2006).
Importa referir que a 5-HT presente nas plaquetas sanguíneas deriva da 5-HT
sintetizada pelas células enterocromafina do gut, a principal fonte de serotonina
periférica (Gershon, 2004) e funciona como neurotransmissor no sistema nervoso
entérico (Gershon, 2003). Parte desta 5-HT entra na circulação sanguínea, e apesar da
maior parte ser eliminada pelo fígado, pulmões e outros órgãos (Anderson et al., 1987),
parte dela é captada pelas plaquetas através da acção do SERT. Comparada com a 5-HT
das plaquetas, a concentração de 5-HT livre no sangue humano é negligível (Anderson
et al., 1987; Beck et al., 1993). Assim, a 5-HT plasmática deriva principalmente das
plaquetas, que há já alguns anos têm sido consideradas como um modelo periférico de
neurónios serotoninérgicos pré-sinápticos. (Pletscher et al., 1980)
5.1. Alterações serotoninérgicas nas plaquetas de pacientes com epilepsia
Os estudos que estabelecem uma relação entre o SERT plaquetário e a
ocorrência de crises convulsivas em pacientes com epilepsia são escassos e englobam
apenas os casos nos quais se verifica um controlo farmacológico das crises. Neste
contexto, as convulsões são escassas, ocorrendo em intervalos de vários dias a meses.
Nas amostras sanguíneas destes doentes, após tratamento com paroxetina, verifica-se
uma diminuição da densidade dos SERT nas plaquetas sanguíneas, após episódios
recentes (há menos de 4 dias) de crises convulsivas, revertendo-se este efeito alguns
36
dias depois (Cupello et al., 2005). Assumindo que estes resultados representam eventos
bioquímicos que têm lugar no tecido cerebral, os dados sugerem que este fenómeno
representa parte de uma reacção homeostática do cérebro, em resposta à
hiperexcitabilidade (Albano et al., 2006). Todavia, estes achados não se verificam nos
pacientes com crises psicogénicas pseudocrises (Cuppelo et al., 2008), pelo que a
determinação da densidade dos SERT nas plaquetas poderá ser um método viável para o
diagnóstico diferencial entre as verdadeiras crises convulsivas e as pseudocrises.
O estudo dos SERT plaquetários extende-se aos estudos farmacológicos. O
topiramato, um antiepilépticoi de elevado espectro de acção utilizado tanto em crianças
como em adultos, pode mesmo influenciar o metabolismo da 5-HT em crianças
afectadas pela epilepsia; são contudo necessários mais estudos para estabelecer até que
ponto estas modificações plasmáticas indicam efeitos directos do topiramato no sistema
serotoninérgico (Grosso et al., 2008).
Nenhum dos estudos encontrados na literatura contempla casos de epilepsia do
lobo temporal associada a esclerose hipocampal, que confira um carácter de
refractabilidade farmacológica. Neste âmbito, são ainda desconhecidas as alterações nos
SERT plaquetários em pacientes que experimentam convulsões frequentes, cuja
periodicidade de ocorrência das crises não permite, supostamente, a reversão dos efeitos
nos SERT, descritos por Cupello, em 2005.
5.2. Alterações serotoninérgicas nas plaquetas de pacientes com alterações
emocionais
A epilepsia está associada a diversas patologias do foro psiquiátrico, como
previamente descrito. A patofisiologia de várias destas doenças, como as desordens de
humor, estão associadas a alterações nos receptores serotoninérgicos e no SERT das
plaquetas (Alda e Hrdina, 2000; Mendelson, 2000). Além disso, o efeito terapêutico dos
SSRI associados a modificações adaptativas que afectam a via fosforilativa intracelular.
Também nos pacientes com desordens de pânico e ansiedade estão descritas alterações
serotoninérgicas associadas às plaquetas, nomeadamente modificações nos níveis de
SERT, assim como alterações nos receptores 5-HT1A (Lesch et al., 1992).
37
Em doentes deprimidos verificam-se alterações específicas da densidade dos
SERT das plaquetas (Paul et al., 1981; Langer et al., 1982; Langer etal., 1987; Mellerup
et al., 1993; Uebelhack et al., 2006). Estes estudos periféricos, quando analizados em
paralelo com os estudos do sistema nervoso central, reforçam a ideia geral de que a
depressão e a epilepsia partilham de uma reacção comum aos sistema serotoninérgico
cerebral, sendo a alteração da densidade dos SERT uma dessas reacções, e que esta se
traduz a nível cerebral e a nível sanguíneo.
38
Contribuição Pessoal
39
Objectivos Gerais
Embora existam claras evidências de que a serotonina participa activamente na
regulação das crises convulsivas associadas à ELT por esclerose mesial hipocampal,
existe ainda um número significativo de questões que necessitam de resposta. Em
particular, permanece pouco claro como este neuromediador está envolvido no processo
de epileptogénese, assim como no desenvolvimento de alterações cerebrais estruturais e
funcionais, associados com doenças neurológicas. Neste âmbito, as principais técnicas
utilizadas para o estudo do papel das vias serotoninérgicas ascendentes na ELT
fundamentam-se apenas nas análises electrofisiológica e bioquímica, em diversos
modelos animais. Embora exista um consenso em relação ao papel pró ou
anticonvulsivante de alguns sub-tipos de receptores serotoninérgicos, há ainda classes
destes receptores cuja acção é ainda desconhecida ou ambígua. Por outro lado,
praticamente não existem estudos sobre as alterações nas vias serotoninérgicas
ascendentes associadas com os diversos tipos de crises epilépticas. O estudo de
interacções de serotonina e mecanismos de plasticidade associados à epileptogénese é
bastante recente e ainda limitado à investigação farmacológica.
Realizada a revisão bibliográfica sobre o papel da 5-HT na ELT, deparamo-nos
com escassez de estudos comportamentais e morfológicos que incluam esta amina, pelo
que ainda estão por estudar vários aspectos relacionados com os seguintes pontos:
1. Paralelismo entre crises convulsivas e a integridade funcional e estrutural do
sistema serotoninérgico do SNC;
2. Papel da serotonina na epileptogénese e no desenvolvimento das alterações
comportamentais e morfológicas, resultantes da actividade convulsiva;
3. Potencial antiepiléptico e neuroprotector dos agonistas da serotonina;
4. Relação entre a estimulação do nervo vago e a actividade do sistema
serotoninérgico
no
cérebro,
e
desenvolvimento
das
alterações
comportamentais e estruturais associadas com a actividade convulsiva.
40
A epilepsia provoca lesão neuronal, ou a lesão neuronal provoca epilepsia? Esta
é uma das questões que todos os epileptologistas gostariam de ver definitivamente
resolvida; todavia, os estudos continuam a revelar resultados díspares e a extrapolação
dos ensaios em modelos animais para a realidade humana revela-se difícil e controversa.
Acredita-se que o estudo morfo-funcional a ser desenvolvido com os recursos existentes
no Centro de Morfologia Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade do
Porto pode vir a contribuir, na qualidade de principal objectivo deste projecto, para a
resolução dos paradigmas acima mencionados. Pode ser um passo para melhorar o
controlo das crises epilépticas, combater a refractabilidade farmacológica e diminuir o
número de casos cirúrgicos. Os objectivos específicos de cada uma das tarefas acima
referidas são desenvolvidos de seguida.
41
Planeamento das Tarefas
42
Tarefa 1.
Efeito das crises convulsivas sobre a via serotoninérgica ascendente
O objectivo principal deste trabalho é definir o tipo de alterações morfológicas e
funcionais na via serotoninérgica ascendente, consequentes a crises convulsivas, em
modelos animais de ELT. Para tal, pretende-se fazer um estudo do núcleo dorsal do
rafe, cujos neurónios sintetizam a serotonina, bem como de estruturas ricas em
receptores de 5-HT, como é o caso da formação do hipocampo e do córtex entorrinal.
Proceder-se-à à estimativa do número total de neurónios destas regiões encefálicas
expressam receptores de 5-HT, bem como à densidade das fibras serotoninérgicas,
usando para o efeito, métodos estereológicos unbiased. O passo seguinte versa a análise
destes mesmos parâmetros, mas em animais submetidos a status epilepticus (SE)
prolongado induzido químicamente pelo KA.
Para este estudo serão usados 18 ratos machos adultos, da estirpe Wistar, com 10
semanas de idade, distribuídos por 2 grupos (9 animais por grupo). O primeiro grupo
sera compost por ratos que serão submetidos a SE previamente induzido por KA,
enquanto os ratos do segundo grupo (não tratados) serão utilizados como controlos.
Os cérebros dos animais serão seccionados com o vibratome e tratados
imunohistoquimicamente com anticorpos policlonais (Chemicon International). Em
cada grupo (KA e controlo), serão usados cortes seriados para cada anticorpo, a saber:
anticorpos para 5-HT, 5-HTT, receptores 5-HT1A e 5-HT4.
Será efectuada análise morfométrica (número de célulasusando métodos
estereológicos unbiased. A densidade das fibras serotoninérgicas sera estimada usando
sistemas de grelhas apropriados, como previamente descrito.
Com este trabalho pretende-se fazer um estudo morfológico de várias regiões
responsáveis pelo papel pró- ou anti-convulsivo da serotonina, abordando para tal os
seguintes parâmetros:
43
(1) Número total de neurónios e volume neuronal que sintetizam serotonina no
núcleo dorsal do rafe, em condições normais (controlo) e após indução de SE por AC;
(2) Número total de neurónios que expressam receptores de 5-HT1A na formação
do hipocampo e no córtex entorrinal em condições normais (controlo) e após indução de
SE por AC;
(3) Número total de neurónios que expressam receptores de 5-HT4 na formação
do hipocampo e no córtex entorrinal em condições normais (controlo) e após indução de
SE por AC;
(4) Densidade das fibras serotoninérgicas na formação do hipocampo e no córtex
entorrinal em condições normais (controlo) e após indução de SE por AC.
44
Tarefa 2.
Alterações
comportamentais
e
morfológicas
resultantes
das
crises
convulsivas após inibição da síntese de serotonina no núcleo dorsal do rafe
Os avanços na compreensão da transmissão serotoninérgica cerebral têm vindo a
evidenciar o papel regulador desta amina no início e propagação da actividade
epiléptica. Dado que os estudos morfológicos envolvendo a serotonina são escassos,
este trabalho tem como principal objectivo definir o tipo de alterações estruturais em
consequência das crises, após inibição da síntese de 5-HT no núcleo dorsal do rafe. Para
este efeito, pretende-se correlacionar os volumes e os números totais de neurónios na
formação do hipocampo e no córtex entorrinal. Simultaneamente, pretende-se
determinar o número de neurónios produtores do neuropeptídeo Y (NPY) na formação
do hipocampo, após inibição da síntese de serotonina, usando-se para este efeito,
métodos estereológicos unbiased.
Neste estudo serão usados 18 ratos machos adultos, da estirpe Wistar, com 10
semanas de idade, distribuídos por 3 grupos (grupo controlo com n=9 e grupo
experimental de ácido caínico com n=9). Todos os animais utilizados nesta tarefa foram
previamente tratados intraperitonealmente com uma neurotoxina selectiva da 5-HT, a
paracloranfetamina (PCA) numa dose de 20 mg/Kg.
Serão realizados testes comportamentais em todos os animais, aplicando o
Morris Water Maze para avaliar a memória espacial e a memória de trabalho, o
Elevated Plus Maze para estudar a ansiedade, o Forced Swim Test para avaliar a
depressão e o Open Field para avaliar a resposta emocional dos animais.
Os cérebros dos animais serão utilizados para os estudos histológicos. Alguns
deles serão mantidos em glicolmetacrilato, obtendo-se então séries de cortes de cada
animal, para tratamento com método de Giemsa, a fim de avaliar as estruturas acima
descritas. Será obtida ainda uma série adicional para tratamento com anticorpo de
coelho anti-NPY (Chemicon International) e outra para tratamento com anticorpo antitransportador de 5-HT (Chemicon International).
45
Com este trabalho pretende-se estudar, em termos comportamentais e
morfológicos, as alterações cognitivas, emotivas e neuroanatómicas induzidas pelas
crises convulsivas, após a depleção de serotonina no cérebro. Estes objectivos serão
conseguidos através da avaliação dos seguintes parâmetros:
(1) Estudo das funções cognitivas (aprendizagem e memória espacial, memória
de trabalho, passive e active avoidance) em animais epilépticos, com e sem lesões das
vias serotoninérgicas;
(2) Estudo das funções emotivas (ansiedade, reactividade a novas situações e
condicionamento de medo) em animais epilépticos, com e sem lesões das vias
serotoninérgicas;
(3) Determinação do número total de neurónios na formação do hipocampo e
córtex entorrinal após a inibição da síntese de 5-HT, em animais controlo e em animais
submetidos a SE;
(4) Determinação do número total de neurónios produtores de NPY na formação
do hipocampo, após a inibição da síntese de 5-HT, em animais controlo e em animais
submetidos a SE;
(5) Quantificação da densidade das fibras serotoninérgicas da formação do
hipocampo e do córtex entorrinal, após a inibição da síntese de 5-HT, em
animais controlo e em animais submetidos a SE.
46
Tarefa 3.
Efeitos
antiepilépticos
e
neuroprotectores
da
fluoxetina
e
da
eslicarbazepina: estudos comportamentais e morfológicos no modelo de
ácido caínico
A relação entre epilepsia, depressão e ansiedade são actualmente alvo de um
forte interesse clínico e experimental, tendo sido estabelecido o papel relevante da 5-HT
nestas patologias. Elevadas concentrações extracelulares desta amina no sistema límbico
estão associadas a efeitos antidepressivos existindo um aumento da plasticidade
neuronal. Os mecanismos de acção de alguns dos fármacos inibidores da recaptação da
serotonina (SSRIs) parecem ser dependentes dessa plasticidade. O uso da fluoxetina na
epilepsia tem sido crescente, sendo evidentes os benefícios da conjugação deste fármaco
com os antiepilépticos, no sentido de diminuir as doses terapêuticas e minimizar a
intensidade das crises.
O progresso científico na compreensão dos processos patofisiológicos
associados à iniciação, amplificação e propagação da actividade paroxística no cérebro
tem permitido o desenvolvimento de novas linhas de anti-epilépticos, muitos dos quais
quimicamente semelhantes aos fármacos já utilizados clinicamente. O acetato de
eslicarbazepina (ELS) é um dos anti-epilépticos de terceira geração cuja eficácia no
controlo das crises e a redução dos efeitos colaterais comparativamente aos
antiepilépticos clássicos têm acrescidas vantagens nas crises associadas à ELT, pelo que
se supõe a existência de um maior efeito neuroprotector em relação aos fármacos
convencionais. A ELS possui uma potência anticonvulsivante semelhante à
carbamazepina e partilha com esta e com a oxcarbazepina a capacidade de inibir os
canais de sódio dependentes da voltagem; é ainda eficaz contra crises induzidas por
electrochoques e previne o desenvolvimento de kindling em ratos.
Com este trabalho pretende-se definir o potencial antiepileptogénico e
neuroprotector da fluoxetina e da ELS após a indução de crises pelo KA. Para o efeito
estabeler-se-à a relação entre crises convulsivas, défices comportamentais e alteração no
número de neurónios mais vulneráveis a estas crises e o efeito neuroprotector dos
antiepiléptico e do antidepressivo.
47
Para este estudo serão usados ratos machos adultos, da estirpe Wistar, com 10
semanas de idade, previamente tratados KA. Alguns dos animais serão submetidos a um
tratamento adicional com FLX ou ELS. Todos os dados serão comparados com os
dados do grupo controlo (ratos não tratados).
A actividade crítica será avaliada comportamentalmente de acordo com a escala
de Racine (classificação I-V) (Racine, 1972) durante um período de 2 meses após a
indução do SE e durante o período dos estudos comportamentais. Todos os animais
serão submetidos a estudos comportamentais, procedendo-se para o efeito à aplicação
do Morris Water Maze para estudar as funções cognitivas, do Elevated Plus Maze para
estudar a ansiedade, do Forced Swim Test para avaliar a depressão e o Open Field para
avaliar a resposta emocional dos animais.
descritas. Os restantes cerebros serão utilizados para procedimentos imunocitoquímicos
de forma a obter amostras marcadas para o 5-HTT.
Com este trabalho pretende-se fazer um estudo comportamental e morfológico,
resultante da acção antiepiléptica e neuroprotectora da fluoxetina e da eslicarbazepina,
após a indução de SE com KA, abordando para o efeito os seguintes parâmetros:
(1) Alterações comportamentais e avaliação das crises em animais sujeitos a SE
e em animais tratados com fluoxetina e eslicarbazepina após o SE;
(2) Número total de neurónios na formação do hipocampo e córtex entorrinal em
animais controlo, em animais sujeitos a SE por KA e em animais posteriormente
tratados com fluoxetina e eliscarbazepina;
(3) Densidade das fibras serotoninérgicas na formação do hipocampo e córtex
entorrinal em animais controlo, em animais sujeitos a SE por KA e em animais
posteriormente tratados com fluoxetina e eliscarbazepina.
48
Tarefa 4.
Efeitos antiepilépticos e comportamentais resultantes da estimulação do
nervo vago no modelo de ácido caínico
A estimulação do nervo vago (VNS) é um método terapêutico aprovado pela
FDA (Food and Drug Administration) e pela EMEA (Agência Europeia do
Medicamento) e já foi utilizado em mais de 10000 pacientes com epilepsia refractária à
medicação e que não têm indicação cirúrgica. A sua aplicação clínica estende-se a
várias alterações do foro neurológico e psiquiátrico, pelo que também foi recentemente
aprovado como tratamento co-adjuvante na depressão farmaco-resistente.
Os estudos electrofisiológicos em ratos evidenciaram um aumento da taxa de
disparo dos neurónios serotoninérgicos nos núcleos dorsais e medial do rafe, 14 dias
após a estimulação do nervo vago. Por outro lado, a estimulação repetitiva do nervo
vago parece contribui para os processos de LTP (long-term potentiation), activando
desta forma sinapses serotoninérgicas latentes, especialmente na formação do
hipocampo. Nesta estrutura, os receptores 5-HT1A parecem contribuir para a acção
antidepressiva e antiepileptogénea, através da regulação da taxa de disparo dos
neurónios (Manta et al., 2009). Esta tarefa tem como objectivo principal estudar o efeito
da estimulação do nervo vago nas alterações comportamentais e morfológicas em
animais epilépticos, após a indução de SE pelo KA.
Parte deste trabalho, nomeadamente no que diz respeito á estimulação do nervo
vago, será realizado em colaboração com o Institute of Mental Health Research,
Ottawa, Canada. Sumariamente, nos animais do grupo 1 será implementado
cirurgicamente um dispositivo estimulador do nervo vago; este grupo receberá também
tratamento com KA, 5 dias depois da colocação do estimulador. No grupo 2 será
implementado um dispositivo semelhante em tamanho e forma ao estimulador do nervo
vago, mas que não emitirá nenhum pulso eléctrico; à semelhança do grupo 1, os animais
do grupo 2 serão submetidos a tratamento com KA. No grupo 3 será implementado um
verdadeiro neuroestimulador do vago, sendo que após este procedimento os animais
receberão uma solução i.p. de soro fisiológico. O grupo 4 será formado pelos animais
que receberão um dispositivo semelhante ao neuroestimulador, mas que não emite
49
impulsos eléctricos, recebendo posteriormente um tratamento com solução de soro
fisiológico intraperitonealmente. O estimulador será colocado subcutaneamente e os
eléctrodos serão ligados ao nervo vago esquerdo. Doze horas após a indução do SE, o
estimulador vagal será accionado, e os animais dos grupos experimentais receberão
neuroestimulação do nervo (30 segundos de estimulação, 5 minutos off de ondas
contínuas com uma frequências de 20 Hz e pulso de 500 µs e intensidade de 0,25 mA).
A actividade crítica será avaliada comportamentalmente de acordo com a escala
de Racine (classificação I-V) (Racine, 1972) durante um período de 2 meses. Após este
período os animais serão submetidos a estudos comportamentais (Morris Water-Maze
para avaliação da memória espacial, do Elevated Plus Maze para estudar a ansiedade e o
Open Field para avaliar a reactividade emocional dos animais).
descritas. Os restantes cerebros serão utilizados para procedimentos imunocitoquímicos
de forma a obter amostras marcadas para o 5-HTT.
Com este trabalho pretende-se fazer um estudo comportamental e morfológico,
resultante da acção antiepiléptica promovida pela estimulação do nervo vago, após a
indução de SE com KA, abordando para o efeito os seguintes parâmetros:
(1) Alterações comportamentais e avaliação das crises em animais submetidos a
estimulação do nervo vago, após tratamento com KA;
(2) Número total de neurónios na formação do hipocampo e córtex entorrinal em
animais controlo e em animais submetidos a estimulação do nervo vago, após
tratamento com KA;
(3) Densidade das fibras serotoninérgicas na formação do hipocampo e no córtex
entorrinal em animais submetidos a estimulação do nervo vago, após tratamento com
KA.
50
Cronograma de Actividades
Preve-se a realização das 4 tarefas num período de aproximadamente 4 anos,
conforme esquematizado no seguinte cronograma:
51
Referências Bibliográficas
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