universidade de franca programa de pós

Transcrição

UNIVERSIDADE DE FRANCA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM CIÊNCIAS
“Obtenção de derivados semissintéticos de
diterpenos, avaliação de suas atividades
biológicas e estudos detalhados de alguns
destes derivados por RMN”
Aline Nazaré Silva
Franca
2012
Aline Nazaré Silva
“Obtenção de derivados semissintéticos de
diterpenos, avaliação de suas atividades biológicas e
estudos detalhados de alguns destes derivados por
RMN”
Dissertação de Mestrado apresentada à
Universidade de Franca como exigência
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Ciências. Área de concentração:
Química.
Orientador: Prof. Dr. Vladimir Constantino
Gomes Heleno
Franca
2012
Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca
S578o
Silva, Aline Nazaré
Obtenção de derivados semissintéticos de diterpenos, avaliação de
suas atividades biológicas e estudos detalhados de alguns destes
derivados por RMN / Aline Nazaré Silva; orientador: Vladimir
Constantino Gomes Heleno. – 2012
88 f. : 30 cm.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca
Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Ciências
1. Diterpenos.
2. Atividade antimicrobiana.
3. Atividade
antiespasmódica. 4. Ressonância magnética nuclear. I. Universidade de
Franca. II. Título.
CDU – 547.913.6
Dedico este trabalho ao meu pai Carlos,
minha mãe Neura e ao meu marido Fabricio
por todo apoio, dedicação, paciência e
principalmente por tanto amor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço acima de tudo a Deus, porque sei que sem Ele, eu não teria
percorrido nem a metade do caminho.
A todos os meus familiares, que sempre me apoiaram nas decisões da minha
vida.
A todos os meus amigos de trabalho, que foram de importância ímpar, para o
meu crescimento e desenvolvimento deste trabalho. A nossa amizade foi fundamental
nesta minha jornada.
Ao meu orientador Prof. Dr. Vladimir C. G. Heleno, por toda paciência, por toda
dedicação, por todo apoio, incentivo, confiança, credibilidade, enfim, devo todo esse
trabalho a você que nunca desistiu de me orientar.
Ao Prof. Dr. Sérgio Ricardo Ambrósio, que fez com que os meus dias no
laboratório fossem muito mais alegres, obrigado por fazer do nosso ambiente de
trabalho uma alegria, que está em si instalada. E eu não posso me esquecer da sua
serenidade, de seu caráter, companheirismo, dedicação e do amor com que você
realiza as coisas.
Aos meus avós João e Amélia, Claudionor ( in memoriam) e Altivina (in
memoriam), por fazerem parte da minha vida. Porque toda sabedoria e garra de vocês
me fizeram uma pessoa melhor.
Aos meus amigos Marcela, Marilia, João Henrique, Ana Carolina, Marcela
Bragatto, Felipe e Éder, por me suportarem no meu stress, na minha falta de paciência
e na minha arrogância. Vocês sempre estiveram ao meu lado quando eu precisava, ou
para me fazer sorrir ou para me mostrar que eu estava errada. Vou levar por toda
minha existência, a lembrança da carinha de cada um de vocês.
À minha sogra Maria Helena e ao meu sogro Miguel, pela ajuda prestada nos
momentos em que precisei.
Ao meu marido Fabricio por todo apoio, amor, compreensão e dedicação
oferecidos na reta final do meu trabalho. Sei que muitas vezes deixei meu stress
prevalecer, mas seu amor foi grande o suficiente para compreender e apoiar.
Aos meus afilhados, que com a inocência de criança, fizeram com que meus
dias fossem mais doces.
Ao meu irmão Danilo, a minha cunhada Beatris e ao meu sobrinho-afilhado
Gabriel, que me deram toda força e apoio necessário para seguir caminhando, quando
muitas vezes eu pensava em desistir.
Aos meus pais Carlos e Neura, que me deram mais essa oportunidade. Não
tenho aqui palavras para descrever minha gratidão. Vocês fizeram o possível e o
impossível, somente para ver em meu rosto um sorriso e prova de amor maior, não há.
Vocês se anularam para que eu e o meu irmão pudéssemos brilhar. Toda a vida de
vocês foi dedicada a nós e nada que eu fizer ou disser vai retribuir o que vocês fizeram
por mim.
À todos que fazem parte da minha vida, que me acompanharam, me deram
força e contribuíram de alguma forma nesta etapa da minha vida. Muito obrigada a
todos.
Ao Prof. Dr. Antônio Gilberto Ferreira da Universidade de São Carlos (UFSCar),
por colocar seu equipamento de Ressonância Magnética Nuclear a nossa disposição.
À Daiane Sass da Universidade de São Paulo (USP-RP) por me ajudar na
realização das reações de hidrogenação e a universidade por ceder o equipamento.
Ao Prof. Dr. Antônio Eduardo Miller Crotti e Prof. Dr. Sergio Ricardo Ambrósio,
que fizeram parte da banca de qualificação, obrigado pelo aceite ao convite e pelas
dicas que foram valiosas para a conclusão deste trabalho.
À minha prima-irmã Patrícia Nazaré Miranda, simplesmente pelo que tu és. O
seu jeito de ser e sua presença na minha vida são o suficiente para que minha
felicidade esteja completa. Obrigada por me apoiar tanto e por escutar várias vezes as
minhas apresentações. Seu otimismo e admiração me deixaram confiante.
Aos meus padrinhos Ana Claudia, Claudinei (in memoriam), Daniela e
Claudinei pelo companheirismo e por acreditarem que eu era capaz.
À todos os professores do programa de pós graduação da Universidade de
Franca (UNIFRAN).
E por fim agradeço a FAPESP pelo apoio financeiro, que foi imprescindível
para a minha formação e conclusão deste trabalho.
SUMÁRIO_____________________________________________________________________i
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas
ii
Resumo
iii
Abstract
iv
1. Introdução
1
1.1. Produtos Naturais: Biodiversidade e Descoberta de Substâncias
1
1.2. Diterpenos
3
1.3. Modificação Estrutural
7
1.4. Ressonância Magnética Nuclear
9
2. Objetivos
11
3. Materiais e Métodos
12
3.1. Procedimento Experimental
12
3.1.1. Equipamentos e Materiais
12
3.1.2. Isolamento dos Materias de Partida
13
3.1.3. Modificações Estruturais
19
3.1.4. Atividade Biológica
24
4. Resultados e Discussões
28
4.1. Identificação das substâncias obtidas por re-isolamento
28
4.2. Identificação das substâncias obtidas por semi-síntese
37
4.2.1. Derivados do Ácido Caurenóico
37
4.2.2. Derivados do Óleo da Copaiba
44
4.2.3. Estudos detalhados de diterpenos por RMN
59
4.2.4. Atividade biológica dos derivados obtidos
77
5. Conclusões
83
6. Referências Bibliográficas
84
LISTA DE ABREVIATURAS________________________________________________________ii
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura
Significado
AcOEt
Acetato de etila
ATCC
American Type Culture Collection
CCC
Cromatografia em Coluna Clássica
CCDC
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CH2N2
Diazometano
CIM
Concentração Inibitória Mínima
CLAE
Cromatografia líquida de alta eficiência
CLV
Cromatografia Líquida à Vácuo
COSY
Correlated Spectroscopy
d
Dubleto
dd
Duplo dubleto
dddd
Duplo duplo duplo dupleto
ddt
Duplo duplo tripleto
dddt
Duplo duplo duplo tripleto
dq
Duplo quadrupleto
dt
Duplo tripleto
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC
Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence
Hex
Hexano
I.C.
Isolado Clínico
J
Constante de acoplamento
m
Multipleto
MeOH
metanol
NCI
National Cancer Institute, USA
NCTC
National Collection of Type Cultures
LISTA DE ABREVIATURAS________________________________________________________ii
NOE
Nuclear Overhauser Effect
RMN
Ressonância Magnética Nuclear
PN
Produtos Naturais
qd
Quarteto de dupletos
s
simpleto
Van.
Vancomicina
RESUMO____________________________________________________________________iii
RESUMO
Silva, A. N. Obtenção de derivados semissintéticos de diterpenos, avaliação de suas
atividades biológicas e estudos detalhados de alguns destes derivados por RMN.
2012. 88 p. Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca, Franca – SP.
Neste trabalho, cinco diterpenos foram reisolados, sendo quatro deles da
classe dos labdanos: ácido copálico (7), acetato do ácido copálico (8), ácido copálico
hidroxilado (9) e ácido ent-agático (10) e um da classe dos cauranos: ácido caurenóico
(4). Os labdanos foram isolados do óleo da copaíba de Copaifera langsdorffi e o ácido
caurenóico foi extraído de Mikania glomerata.
COOH
COOH
AcO
H
COOH
COOH
COOH
HO
COOH
4
7
8
9
10
Os diterpenos acima, obtidos em quantidade, foram posteriormente submetidos
a uma série de reações químicas, visando sua modificação estrutural. Com isso foram
obtidos vários derivados semissintéticos: 16 labdanos (21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36) e 6 cauranos (12, 13, 16, 18, 19, 20).
COOH
R2
COOMe
R2
R1
21. R1=CH3; R2=H
22. R1=CH3; R2=OAc
23. R1=CH3; R2=OH
24. R1=COOH; R2=H
COOMe
R2
R1
25. R1=CH3; R2=H
26. R1=CH3; R2=OAc
27. R1=CH3; R2=OH
28. R1=COOMe; R2=H
COOMe
R2
R1
29. R1=CH3; R2=H
30. R1=CH3; R2=OAc
31. R1=CH3; R2=OH
32. R1=COOMe; R2=H
R1
33. R1=CH3; R2=H
34. R1=CH3; R2=OAc
35. R1=CH3; R2=OH
36. R1=COOH; R2=H
RESUMO____________________________________________________________________iii
H
COO-Na+
H
COOMe
12
13
H
CH2OH
H
R
18. R=COOH
19. R=COONa
20. R=COOMe
16
Todos estes novos derivados foram submetidos à atividade antimicrobiana frente
a um conjunto de 13 micro-organismos (Staphylococcus haemolyticus (29970 ATC),
Enterococcus
faecium
(NCTC
717),
Enterococcus
faecalis
(NCTC
775),
Staphylococcus capitis (27840 ATCC), Staphylococcus aureus (I.C.153), Enterococcus
faecalis (I.C.179), Staphylococcus haemolyticus (I.C.213), Staphylococcus aureus
(I.C.180),
Staphylococcus
Staphylococcus
capitis
aureus
(I.C.207),
(I.C.222), Staphylococcus
Staphylococcus
aureus (I.C.223),
epidermidis
(I.C.
177),
Staphylococcus epidermidis (I.C. 254)), sendo que um derivado re-isolado (7) e um
derivado modificado (21) apresentaram resultado interessante frente a estes microorganismos e um conjunto deles foi testado quanto à atividade antiespasmódica por
nossos colaboradores.
Este trabalho também inclui um estudo detalhado por Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) de duas substâncias: um derivado, éster metílico do ácido caurenóico
(13) e outro isolado de Copaifera langsdorffi, acetato do ácido copálico (8). Este parte
do trabalho incluiu a realização de experimentos de RMN de 1H, RMN de
13
C {1H},
COSY, HSQC e HMBC, o que levou a uma atribuição completa dos dados de RMN de
1
H e de
13
C de ambas as substâncias, havendo também a confirmação total da
atribuição pelos resultados de RMN de 2D.
Palavras-chave: diterpenos, atividade antimicrobiana, atividade antiespasmódica,
Ressonância Magnética Nuclear.
ABSTRACT___________________________________________________________________iv
ABSTRACT
Silva, A. N. Semi-synthetic diterpenes obtention, the evaluation of their biological
activities and the detailed NMR studies for some of those derivatives. 2012. 88 p.
Master Dissertation – Universidade de Franca, Franca – SP.
In this work, five Diterpenes were re-isolated. Four of them are labdanes
isolated from Copaifera langsdorffi oilresin: copalic acid (7), copalic acid acetate (8), 3hydroxy-copalic acid (9), ent-agatic acid (10) and one is a kaurane, isolated from
Mikania glomerata: kaurenoic acid (4).
COOH
COOH
AcO
H
COOH
COOH
COOH
HO
COOH
4
7
8
9
10
The isolated diterpenes, showed on the figure above, were obtained in sufficient
amounts to be submitted to several transformations. This structural modification work
yielded 16 labdane derivatives (19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 31, 32, 33, 34, 35,
36, 37) and 6 kauranes derivatives (10, 12, 14, 27, 28, 29).
COOH
R2
COOMe
R2
R1
R2
R1
21. R1=CH3; R2=H
22. R1=CH3; R2=OAc
23. R1=CH3; R2=OH
24. R1=COOH; R2=H
COOMe
COOMe
R2
R1
25. R1=CH3; R2=H
26. R1=CH3; R2=OAc
27. R1=CH3; R2=OH
28. R1=COOMe; R2=H
H
COO-Na+
H
COOMe
10
12
R1
29. R1=CH3; R2=H
30. R1=CH3; R2=OAc
31. R1=CH3; R2=OH
32. R1=COOMe; R2=H
H
CH2OH
14
33. R1=CH3; R2=H
34. R1=CH3; R2=OAc
35. R1=CH3; R2=OH
36. R1=COOH; R2=H
H
R
27 : R=COOH
28 : R=COONa
29 : R=COOMe
ABSTRACT___________________________________________________________________iv
All derivatives were conducted into anti-microbial assays agaist a group of 13
microorganisms: Staphylococcus haemolyticus (29970 ATC), Enterococcus faecium
(NCTC 717), Enterococcus faecalis (NCTC 775), Staphylococcus capitis (27840
ATCC),
Staphylococcus
Staphylococcus
aureus
haemolyticus
(I.C.153),
(I.C.213),
Enterococcus
faecalis
(I.C.179),
Staphylococcus
aureus
(I.C.180),
Staphylococcus aureus (I.C.222), Staphylococcus aureus (I.C.223), Staphylococcus
capitis (I.C.207), Staphylococcus epidermidis (I.C. 177), Staphylococcus epidermidis
(I.C. 254). A considerable number of these derivatives were also evaluated for their
anti-spasmodic activity. Structure-activity relationship works can be carried out with
these results.
This work also includes a detailed Nuclear Magnetic Ressonance (NMR) study
of two derivatives: a semi synthetic one (12) and an isolated one (8). Experimets such
as 1H, NMR of
13
C {1H}, COSY, HSQC and HMBC were performed which allowed a
complete and unequivocal assigments of all 1H and 13C NMR data.
Keywords: diterpenes, antimicrobial activity, anti-spasmodic activity, Nuclear Magnetic
Resonance.
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
1. INTRODUÇÃO
1.1. Produtos Naturais, Biodiversidade e Descoberta de Substâncias Bioativas
O Dictionary of Natural Products descreve dados químicos, estruturais e
bibliográficos para 100.000 produtos naturais (PN) e substâncias relacionadas (Morais
et al., 2007), o que proporciona compreensão sobre a importância desta fonte de
substâncias. Estas substâncias, classificadas como PN, são de inúmeras classes
diferentes e apresentam variadas atividades biológicas e terapêuticas de importância
elevada para a humanidade (Braz-Filho, 1994; Pinto et al., 2002; Simões et al., 2003).
Dentre os reinos da natureza, os vegetais têm contribuído de forma bastante
significativa, fornecendo substâncias aplicáveis na profilaxia e tratamento de doenças
que acometem os seres humanos (Montanari&Bolzani, 2001; Newman et al., 2003). A
variedade e complexidade dos metabólitos secundários biossintetizados por plantas
têm atraído grandes investimentos em pesquisas de bioprospecção, com o objetivo de
obter novas entidades químicas farmacologicamente ativas (Montanari&Bolzani, 2001;
Rates, 2001).
Apesar das plantas serem uma fonte importante de novos compostos ativos,
somente uma pequena porcentagem delas tem sido fitoquimicamente investigada
(Soejarto, 1996; Fabricantand Farnsworth, 2001) e avaliada com relação ao seu
potencial farmacológico (Ambrosio et al., 2006; Tirapelli et al., 2008). Se
considerarmos que só no Brasil, maior biodiversidade genética vegetal do mundo,
existem mais de 55.000 espécies catalogadas (Dias, 1996), de um total estimado entre
350.000 a 550.000 (Simões et al., 2003), podemos ter uma noção da variedade de
substâncias que ainda podem ser obtidas de fontes naturais. Devemos considerar
também que, além de plantas, organismos marinhos (Hay&Fenical, 1997; Michl, 1993)
e micro-organismos (Pinto et al., 2002) contribuem consideravelmente para obtenção
de produtos naturais. Com isto pode-se estimar o potencial da variedade estrutural de
1
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
substâncias a serem identificadas e, consequentemente, a variedade de atividades
que se espera.
O estudo para a descoberta de produtos naturais bioativos é importante não
apenas pela necessidade de caracterização das propriedades farmacológicas das
moléculas em questão, mas também pelo conhecimento de novas substâncias que
possam servir de modelos (protótipos) para originar análogos estruturais com
propriedades farmacológicas mais promissoras (Montanari&Bolzani, 2001; Barreiro,
2002, Vuorela et al., 2004). Atualmente, uma tendência multidisciplinar para o
desenvolvimento de novas drogas inicia-se pelo conhecimento de substâncias naturais
bioativas, associado com a obtenção de análogos estruturais por metodologias
sintéticas, biotecnológicas ou isolamento de novas fontes naturais. A avaliação de
suas atividades farmacológicas tem demonstrado grandes perspectivas na descoberta
de moléculas de grande interesse terapêutico (Barreiro, 2002; Vuorela et al., 2004).
O desenvolvimento de novos fármacos de origem natural envolve um longo,
caro e multidisciplinar processo (Rates, 2001), sendo necessários altos investimentos,
medidos aos milhões de dólares, e um mínimo de 10 anos de trabalho
(Montanari&Bolzani, 2001; Tirapelli et al., 2008). Apesar de todas as dificuldades, os
produtos naturais ainda desempenham papel fundamental para o fornecimento de
substâncias aplicáveis no tratamento de doenças que acometem os seres humanos
(Vuorela et al., 2004). Como exemplo, podemos citar o NCI (National Cancer Institute,
USA) que avaliou mais de 50.000 extratos de plantas para a atividade anti-HIV e mais
de 33.000 para a atividade anti-tumoral (Rates, 2001), além de diversos
quimioterápicos eficazes como vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) e taxol
(paclitaxel; Taxol®) que tiveram suas origem a partir do metabolismo secundário
vegetal (Tirapelli et al., 2008). Fundamentada nestes exemplos de sucesso, a indústria
farmacêutica vem realizando grandes investimentos em pesquisas de bioprospecção,
2
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
mesmo tendo em conta que a pesquisa de novos fármacos é um mercado de alto risco
(Montanari&Bolzani, 2001; Barreiro, 2002).
Com isso, é importante ressaltar que o acesso a novas substâncias com novos
potenciais biológicos pode se dar de duas maneiras distintas: Uma delas seria a partir
do estudo de novas espécies, contando com o fato de isolar novas substâncias e com
o fato delas serem ativas. Vários grupos nacionais estão envolvidos com a busca de
princípios bioativos de plantas (Montanari&Bolzani, 2001). Outro caminho seria o de
re-isolar substâncias já conhecidas, de fontes botânicas também já estudadas e que
podem ser transformadas quimicamente em novas estruturas. Ambas as formas
possibilitam obter novas substâncias que podem apresentar novas atividades, ou
mesmo maior potencial em uma dada atividade. Vale ressaltar que o estudo de novas
espécies forneceria um número bem mais limitado de novas estruturas para serem
testadas.
1.2. Diterpenos
Os diterpenóides possuem uma vasta gama de atividades biológicas e
ecológicas. Atividades biológicas como antimicrobiana, antiparasitária (Trypanosoma
cruzi), citotoxidade com relativa seletividade para células cancerígenas, atividade antiHIV, hipotensora, antiinflamatória, entre outras (Ghisalberti, 1997). Atividades
ecológicas como redução de larvas de insetos herbívoros(De Carvalho et al., 1997), e
atividade inseticida, foram demonstradas por alguns diterpenos do tipo clerodano em
Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata), uma peste que desenvolveu
resistência a um grande número de inseticidas sintéticos (Lopes-Olguín et al., 1998).
Um exemplo de diterpenóide utilizado como fármaco anti-cancerígena é o paclitaxel,
extraído de Taxus brevifolia Nutt.
3
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
A utilização de plantas que contêm esta classe de compostos na medicina
popular mexicana como agentes contraceptivos, estimulantes da menstruação e
abortivo (Gallegos, 1983), somada à utilização de diterpenóides como marcadores
quimiotaxonômicos (Figueiredo et al., 1995) reiteram a importância dos diterpenos.
1.2.1. Potencial Antiespasmódico dos diterpenos
Trabalhos recentes têm apresentado novos testes com resultados promissores
para substâncias desta classe de Produtos Naturais, como significante atividade
antiespasmódica e relaxante da musculatura lisa (Ribeiro et al., 2007). Em outro
trabalho, Ambrosio e seus colaboradores evidenciaram que o ácido pimaradienóico
(ácido ent-pimara-8(14)-dien-19-óico) (1) (figura 1) inibe a contração de artéria carótida
de rato induzida por fenilefrina e KCl (Ambrosio et al., 2002), enquanto que Tirapelli e
seus colaboradores (Tirapelli et al., 2002) demonstraram o efeito inibitório desse
metabólito em aorta de rato. Estudos recentes mostraram que o mecanismo de ação
desta inibição é devido ao bloqueio do influxo de Ca2+ extracelular (Ambrosio et al.,
2006; Tirapelli et al., 2008). De forma geral, os antagonistas do cálcio causam uma
dilatação arteriolar generalizada, o que resulta em queda da pressão arterial (Rang et
al., 1997). Devido a isto, foi formulada uma hipótese de que este metabólito poderia
apresentar atividade anti-hipertensiva in vivo (Ambrosio et al., 2006), o que foi
confirmado por Tirapelli e seus colaboradores. Isso coloca os diterpenos como uma
nova promessa para o tratamento de doenças cardiovasculares (Tirapelli et al., 2008).
H
COOH
(1)
HO
H
(2)
HO
H
CH2OH
(3)
Figura 1: Exemplos de diterpenos pimaranos.
4
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
Além de observar que os diterpenos apresentam significativo potencial
antiespasmódico (Ambrosio et al., 2006), estudos comparativos entre metabólitos de
estruturas análogas, demonstraram que pequenas alterações estruturais são capazes
de influenciar significativamente esta atividade (Ambrosio et al., 2004; Tirapelli et al.,
2005).
A partir destes dados, pode-se concluir que a obtenção de vários diterpenos
com diferenças estruturais pode proporcionar um consistente estudo de atividade
biológica, podendo resultar em uma descoberta de compostos bem mais ativos. Além
disso, um estudo de várias estruturas análogas certamente proporciona resultados
para futuras investigações sobre a relação estrutura-atividade, mostrando eventuais
grupos farmacofóricos e abrindo um novo caminho para a obtenção de um potencial
fármaco, através de síntese ou semi-síntese.
1.2.2. Potencial Antimicrobiano dos Diterpenos
Outros resultados bastante interessantes e recentes dos diterpenos estão
relacionados à atividade antimicrobiana significativa destes metabólitos. Trabalho
recente realizado em nosso grupo de pesquisa (Ambrosio et al., 2008), mostrou um
potencial antimicrobiano bastante promissor para o ácido caurenóico (ácido ent-caur16-en-19-óico) (4) (figura 2), um diterpeno da classe dos cauranos.
OH
H
COOH
(4)
H
COOH
H
COOH
(5)
OH
(6)
Figura 2: Exemplos de diterpenos cauranos.
5
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
Testes antimicrobianos foram realizados frente a patógenos da cavidade bucal
e estes resultados, em conjunto com outros testes realizados com outras estruturas de
diterpenos, foram importantes para a elaboração de uma patente recentemente
depositada (Vinholis et al., 2008).
Nestes casos, assim como na atividade antiespasmódica, percebem-se
diferenças no potencial antimicrobiano de compostos de diferentes estruturas. Isto
deixa claro que a obtenção e avaliação de estruturas análogas também abre a
possibilidade de alcançar substâncias com potencial promissor.
Copaifera é um gênero arbóreo pertencente à família Leguminoseae, a qual
abrange mais de 30 espécies nativas da América Latina, distribuídas entre Honduras e
o sul do Brasil (Tappin et al., 2004). Os trabalhos realizados com esse gênero estão
em sua maioria relacionados com óleo extraído do tronco dessas árvores, o qual
demonstra uma grande variedade de propriedades farmacológicas, podendo-se
destacar o seu significante potencial antiinflamatório, analgésico e antimicrobiano
(Veiga Jr. & Pinto, 2002; Tappin et al., 2004; Veiga Jr. et al., 2007; Lima Neto et al.,
2008). Dos Santos e colaboradores (Dos Santos et al., 2008), avaliando a atividade
antimicrobiana de óleos de diferentes espécies de Copaifera do Brasil sugerem que
esses bálsamos sejam uma promissora fonte para a descoberta de novos e seletivos
agentes para o tratamento de importantes doenças infecciosas. Apesar da publicação
de diversos artigos científicos demonstrando o potencial farmacológico do óleo-resina
de copaíba, ainda pouco se conhece as principais substâncias responsáveis por tais
atividades (Veiga Jr. & Pinto, 2002; Tappin et al., 2004; Veiga Jr. et al., 2007; Lima
Neto et al., 2008).
Uma revisão do metabolismo secundário presente nas espécies de Copaifera
demonstra que os sesquiterpenos e os diterpenos da classe dos labdanos e
clerodanos são os constituintes majoritários do óleo-resina dessas árvores (Veiga Jr. &
6
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
Pinto, 2002; Tappin et al., 2004; Veiga Jr. et al., 2007; Lima Neto et al., 2008), já tendo
sido caracterizados aproximadamente 30 diferentes estruturas químicas de diterpenos.
De todos os diterpenóides isolados e identificados, o ácido ent-8(17)-13E-labdadieno15-óico (ácido copálico (7); Figura 3) foi o único metabólito encontrado em todos os
óleos analisados (Veiga Jr. & Pinto, 2002), o que o torna o principal marcador químico
dos exsudatos das espécies de Copaifera.
Em trabalho recente de nosso grupo de pesquisas (Souza et al., 2009), foram
isolados como componentes majoritários de Copaífera langsdorffii Desf., o ácido
copálico (7), dois derivados funcionalizados na posição 3, sendo um o grupo acetato
(8) e o outro uma hidroxila (9) e um outro com uma função carboxila na posição 19
(10) . No mesmo trabalho foi constatada interessante atividade antimicrobiana de
diterpenos deste esqueleto contra patógenos bucais. Estes resultados, juntamente
com o que foi exposto sobre atividades dos óleos extraídos de espécies de Copaifera,
evidenciam o considerável potencial desta outra classe de diterpenos.
COOH
H
COOH
AcO
(7)
H
HO
(8)
COOH
COOH
H
COOH
H
(9)
(10)
Figura 3: Estrutura química dos Labdanos constituintes do óleo de copaiba.
1.3. Modificação Estrutural
Uma quantidade expressiva de derivados de cauranos já foram quimicamente
obtidos por transformação de diterpenos obtidos de fontes naturais, como mostram os
resultados da literatura (Boeck et al., 2005; Batista et al., 2007).
A realização de modificações deste tipo (como os exemplos da figura 4) em
diterpenos naturais, isolados em quantidades expressivas, é uma das formas mais
7
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
eficientes de se obter derivados, também em quantidade, para realização de ensaios
biológicos. É interessante destacar que a combinação de várias modificações pode
resultar em interessante variabilidade estrutural.
OMe
H
COOH
H
COO-Na+
18
H
COO-Na+
12
15
H2
NaOH
NaOH
Pd/C
H2SO4
OMe
H
CH2OH
H
COOH
17
MeOH
4
OMe
H
COOH
11
CH2N2
H2SO4
MeOH
H2SO4
LiAlH4
H
CH2OH
16
H
COOMe
13
MeOH
OMe
H
COOMe
14
Figura 4: Exemplos de reações com ácido caurenóico (4).
Pode ser observado em estudos de atividade biológica que a atividade varia
consideravelmente conforme as diferenças estruturais. Esta informação é marcante a
ponto de estruturas muito semelhantes apresentarem atividades muito diferentes, ou
mesmo dois compostos com estruturas similares fornecerem resultados como: um
ativo e um inativo. Isto é uma boa justificativa para promover tais mudanças
estruturais.
Além disso, o resultado da realização de testes de atividade biológica com um
conjunto significativo de substâncias análogas é certamente um subsídio importante
para estudos de relação estrutura-atividade.
8
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
1.4. Ressonância Magnética Nuclear
A Ressonância Magnética Nuclear é hoje, sem dúvida, imprescindível na
elucidação estrutural de produtos naturais (PN) e de substâncias orgânicas sintéticas.
A evolução contínua dos equipamentos de RMN e o desenvolvimento de novas
técnicas (Claridge, 2009), têm possibilitado análises muito mais detalhadas de
substâncias de estruturas complexas. Valores de deslocamentos químicos e de
constantes de acoplamento podem ser medidos, atualmente, com exatidão muito
maior e, além disso, um conjunto cada vez maior de informações pode ser obtido por
análises de RMN. Devido a isto, é crescente a possibilidade de elucidação estrutural
completa e inequívoca de substâncias, com esta ferramenta.
É grande o número de compostos de classes variadas que apresentam
problemas de esclarecimento total de estrutura, bem como escassez de dados
confiáveis na literatura. Pode-se constatar tal informação, observando as várias
publicações recentes com revisão de estruturas químicas (Velandia et al., 1998; Costa
et al., 2000; Delfourne et al., 2000; Heleno et al., 2004; Heleno et al. 2008), o que
deixa claro que há muito a ser feito na área. O fato de um grande número de produtos
naturais terem sido isolados e caracterizados antes do desenvolvimento de várias
técnicas de RMN hoje disponíveis faz com que seja comum encontrar dados
incompletos, inexatos ou, em alguns casos, até errados.
Os diterpenos constituem uma classe de compostos que merece atenção no
que diz respeito ao estudo por RMN. Os dados de RMN encontrados na literatura para
esta classe de substâncias, apresentam uma série de sinais de hidrogênio não
atribuídos e vários deles sem esclarecimento de multiplicidade devido à grande
superposição de sinais entre 0,5 e 2,5 ppm e à grande complexidade dos
acoplamentos destes sinais que são relativos aos vários grupos CH2. Como a
atribuição de todos os sinais destes grupos e o esclarecimento de suas multiplicidades
9
INTRODUÇÃO__________________________________________________________________
não são normalmente utilizados para a determinação estrutural, feita por comparação
com dados da literatura, é comum encontrar o re-isolamento destas substâncias, mas
sem este esclarecimento. Portanto, o entendimento de toda esta complexidade para
este grupo de substâncias é um importante alvo para estudos de RMN. Além disso,
estudos em andamento para determinação da Estereoquímica utilizando técnicas de
RMN, certamente necessitarão destes dados mais detalhados.
Valores de constantes de acoplamento (J) são de extrema importância para
estudos de estereoquímica e conformação de moléculas orgânicas, fornecendo
informações relevantes sobre a geometria molecular. Com isso, é clara a importância
da medida de constantes de acoplamento homonuclear de hidrogênio.
10
OBJETIVOS____________________________________________________________________
2. OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram:
 Re-isolar os constituintes de duas fontes botânicas diferentes: o óleo da
copaíba (Copaifera langsdorffi), contendo quatro constituintes majoritários
(ácido copálico (7), acetato do ácido copálico (8), ácido copálico hidroxilado (9)
e ácido ent-agático (10)) e o guaco (Mikania glomerata), contendo uma
substância majoritária (ácido caurenóico (4)).
COOH
AcO
H
COOH
4
COOH
COOH
COOH
HO
COOH
7
8
9
10
 Realizar modificações estruturais a partir dos diterpenos isolados, a fim de
obter uma quantidade considerável de derivados semi-sintéticos.
 Realizar a avaliação destes derivados frente às atividades biológicas:
antimicrobiana e antiespasmódica.
 Realizar de estudos detalhados de RMN com alguns derivados, visando o
esclarecimento total dos dados de RMN de 1H e de 13C.
11
MATERIAIS E MÉTODOS__________________________________________________________
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Procedimento Experimental
3.1.1. Equipamentos e Materiais
As análises por CLAE foram realizadas em cromatógrafo CBM-20A Shimadzu
modelo Prominence-LC-6AD, equipado com injetor manual, degasser DGU-20A5
acoplado a detector UV-Vis (modelo SPD-20A) operando em =210 e 254 nm, e a
microcomputador com software LCSolution para processamento dos dados. Nas
análises por CLAE foi utilizada coluna de fase reversa (C18) Shimadzu (4,6 mm x 250
mm, 5 μm) e loop de 20 μL. A fase móvel utilizada foi acetonitrila/H2O (9:1) com 0,1%
de ácido fosfórico e fluxo de 1mL/min.
Os espectros de RMN foram registrados em espectrômetro Brucker modelo
AVANCE DRX400, operando a 400 MHz para 1H e a 100 MHz para
13
C. Os
experimentos foram realizados no laboratório de RMN da UFSCar (Departamento de
Química) do Prof. Dr. Antônio Gilberto Ferreira, que colocou seu equipamento à
disposição e estes foram estudados detalhadamente em nosso laboratório. As
amostras foram, preparadas em clorofórmio deuterado (Aldrich) e metanol deuterado
(Aldrich), para o sal, a uma concentração de 20-25 mg/mL.
As análises por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
foram realizadas em placas de alumínio Merck (art 107730), recobertas com uma
camada de sílica gel 60 GF254 de espessura 0,25 mm.
As separações por cromatografia em coluna clássica (CCC) foram realizadas
em colunas de vidro de tamanhos selecionados conforme a quantidade de amostra,
equipados com torneira de silicone na parte inferior e contendo sílica gel 60, 70-230
mesh (0,063-0,200 mm) Merck como fase estacionária, na proporção de 160 g/g de
amostra. As amostras foram aplicadas ao topo da coluna incorporadas à sílica.
12
As separações por cromatografia líquida a vácuo (CLV) foram realizadas em
colunas de vidro de tamanhos selecionados conforme a quantidade de amostra.
Contendo sílica gel 60, 70-230 mesh (0,063-0,200 mm) e sílica gel 60H, 70-230 mesh
(0,040-0,063 mm) Merck como fase estacionária, na proporção de 200 g/g de amostra.
As amostras foram aplicadas ao topo da coluna incorporadas à sílica.
Os solventes utilizados como meio reacional e como fases móveis nas
análises por CCDC e CCC foram de grau P.A. (marca Synth). Os solventes
empregados
como
meio
reacional
foram
previamente
tratados
conforme
recomendações da literatura (Perry, J. A, 2009).
Na revelação de placas cromatográficas foram utilizados irradiação com luz
ultravioleta, revelação com cristais de iodo resublimado em sistema fechado e vanilina
sulfúrica, preparada conforme descrito a seguir. Em um frasco de vidro de 1 L foram
adicionados 450 mL de água destilada em 100 mL de H2SO4 e, posteriormente, 450
mL de MeOH. Após agitação, 30 mL desta solução foram utilizados para a
solubilização de 0,3 g de vanilina. Este sistema foi agitado vigorosamente até
completa solubilização dos cristais de vanilina.
Para secagem dos produtos obtidos foram utilizados Mg 2SO4 (sulfato de
magnésio), da marca Merck;
Para as análises por CLAE foram utilizados reagentes ultrafiltrados da marca
J. T. Backer e água ultrapura (milliQ®).
3.1.2. Isolamento dos Materiais de Partida
Para o isolamento dos materiais de partida, foram utilizados métodos
cromatográficos comuns, tais como cromatografia líquida a vácuo e cromatografia em
coluna clássica. Neste caso, como se trata de um re-isolamento direcionado à
substância majoritária de interesse, não há interesse de análise detalhada de todas as
frações, apenas aquelas nas quais foi detectada a presença de ácido caurenóico (4),
13
ácido copálico (7), ácido copálico acetilado (8), ácido copálico hidroxilado (9) e ácido
ent-agático (10). Tal detecção foi realizada por comparação com padrão da substância
desejada, o qual já havia sido isolado e mantido como padrão pelo nosso grupo.
COOH
AcO
H
COOH
4
COOH
COOH
COOH
HO
COOH
7
8
9
10
Figura 5: Caurano e Labdanos a serem isolados.
3.1.2.1. Isolamento e Purificação do Ácido Caurenóico
As partes aéreas de Mikania glomerata foram adquiridas da empresa Nutri
Ervas, localizada em São Paulo. Lote GUA0310FS.
Porções das partes aéreas de Mikania glomerata (guaco) foram colocadas no
ultrassom com diclorometano por 15 minutos. Em seguida, uma filtração foi realizada e
o solvente foi removido utilizando evaporador rotativo sob pressão reduzida. Foram
obtidos de 1kg de planta, 42 g de extrato bruto. O extrato foi suspenso em 300 mL de
uma mistura de MeOH/H2O 9:1 (v/v) e filtrada em papel de filtro. A parte solúvel foi
particionada com n-hexano (4 x 300 mL) e diclorometano (2 x 300 mL).
Após análise por CCDC das frações obtidas com padrão de ácido caurenóico
deixou claro que a fase hexânica da partição continha grande quantidade desta
substância. Com isso, esta fração foi submetida a uma cromatografia liquida a vácuo
(CLV) com gradiente crescente de polaridade, obtendo-se assim 12 frações, que estão
descritas na tabela 1. Essas frações foram analisadas por CCDC utilizando como fase
móvel (Hex/AcOEt 9:1). KA.2, KA.3
e KA.4 mostraram a presença de ácido
14
caurenóico sendo então purificadas por CCC (Hex/AcOEt 9:1), resultando em 900 mg
de ácido caurenóico.
Tabela 1: Esquema de eluição utilizado no fracionamento do guaco
Fase Móvel Utilizada
Volume (mL)
Fração
Hex
400
KA.1
Hex/AcOEt 9:1
400
KA.2
Hex/AcOEt 8:2
400
KA.3
Hex/AcOEt 7:3
250
KA.4
Hex/AcOEt 6:4
250
KA.5
Hex/AcOEt 1:1
250
KA.6
Hex/AcOEt 4:6
250
KA.7
Hex/AcOEt 3:7
250
KA.8
Hex/AcOEt 2:8
250
KA.9
Hex/AcOEt 1:9
250
KA.10
AcOEt
250
KA.11
MeOH
250
KA.12
Hex: n-hexano; AcOEt: acetato de etila; MeOH: metanol
3.1.2.2. Isolamento e Purificação dos Diterpenos Labdanos.
O óleo-resina de Copaifera langsdorffii Desf. (codificado como O.C) foi
adquirido da empresa de fitotérapicos Apis Flora, localizada na cidade de Ribeirão
Preto. (Lote 0790310 Fabricação 09/2010)
O isolamento dos constituintes químicos de C. langsdorffii iniciou-se realizando
uma cromatografia líquida à vácuo (CLV) de acordo com adaptações da metodologia
15
(Pelletier et al., 1986). 30 gramas do material vegetal foram incorporados em 32
gramas de sílica gel 60. O material foi fracionado utilizando-se uma coluna de vidro e
380g de sílica gel (½ 60 e ½ 60H). O empacotamento dessa coluna foi realizado com
auxílio de vácuo e n-hexano. (Pelletier et al., 1986). Durante o processo, foram
coletadas 7 frações, sendo empregado como fase móvel um esquema de eluição com
gradiente crescente de polaridade, como pode ser observado na tabela 2.
Tabela 2: Esquema de eluição utilizado no fracionamento do O.C.
Volume coletado (L)
Fração
Massa obtida (g)
Hex
1
O.C1
17,46
Hex/AcOEt 9:1
1
O.C2
6,19
Hex/AcOEt 8:2
1
O.C3
3,46
Hex/AcOEt 7:3
1
O.C4
1,73
Hex/AcOEt 1:1
1
O.C5
1,58
AcOEt
1
O.C6
0,66
MeOH
1
O.C7
0,27
As análises foram feitas por CCDC e as frações que apresentaram manchas
majoritárias de interesse foram O.C3, O.C5 e O.C6. Estas então foram escolhidas para
dar continuidade ao isolamento.
3.1.2.2.1. Fração O.C3
Com essa fração (3,46g) foi feito novamente uma CLV utilizando-se 130 g de
sílica gel 60 (½ 60 e ½ 60H). O empacotamento da coluna foi realizado sob vácuo,
16
utilizando-se como solvente o n-hexano, sendo a amostra incorporada em sílica gel
60. Foram coletadas 8 frações e o esquema de eluição em gradiente crescente de
polaridade de acordo com a tabela 3.
Tabela 3. Esquema de eluição utilizado no fracionamento da fração O.C3.
Volume Utilizado
(mL)
Fração
Massa obtida (g)
Hex
250
O.C3.1
0,09
Hex/AcOEt 24:1
250
O.C3.2
0,12
Hex/AcOEt 23:2
250
O.C3.3
1,3
Hex/AcOEt 22:3
250
O.C3.4
1,2
Hex/AcOEt 21:4
250
O.C3.5
0,4
Hex/AcOEt 4:1
250
O.C3.6
0,2
AcOEt
250
O.C3.7
0,1
MeOH
250
O.C3.8
0,03
Todas as frações foram analisadas primeiramente por CCDC, utilizando como
faze móvel (Hex/AcOEt 8:2). As frações O.C3.4 e O.C3.5 foram analisadas
posteriormente por CLAE, utilizando fase móvel acetonitrila/H2O (9:1) com 0,1% de
ácido fosfórico. Estas frações foram analisadas por CLAE fazendo comparação com
um padrão, porque eram as frações que evidenciavam a presença do ácido copálico.
3.1.2.2.2. Fração O.C5
Com essa fração (1,58g) foi feito novamente uma CLV utilizando-se 130 g de
sílica gel 60 (½ 60 e ½ 60H). O empacotamento da coluna foi realizado sob vácuo,
17
utilizando-se como solvente o n-hexano, sendo a amostra incorporada em 18g de
sílica gel 60. Foram coletadas 8 frações e o esquema de eluição em gradiente
crescente de polaridade de acordo com a tabela 4.
Tabela 4. Esquema de eluição utilizado no fracionamento da fração O.C5.
Volume Utilizado
(mL)
Fração
Massa obtida (g)
Hex/AcOEt 3:1
250
O.C5.1
0,11
Hex/AcOEt 7:3
250
O.C5.2
0,77
Hex/AcOEt 13:7
250
O.C5.3
0,49
Hex/AcOEt 3:2
250
O.C5.4
0,01
Hex/AcOEt 11:9
250
O.C5.5
0,04
Hex/AcOEt 1:1
250
O.C5.6
0,03
AcOEt
250
O.C5.7
0,04
MeOH
250
O.C5.8
0,16
Hex: hexano; AcOEt: acetato de etila; MeOH: metanol
Todas essas frações foram analisadas através de CCDC utilizando-se como
fase móvel uma mistura de (Hex/AcOEt 7:3). A análise desse procedimento
demonstrou que a fração O.C5.2 e O.C5.3 eram constituídas por uma mancha
principal.
3.1.2.2.3. Fração O.C6
Esta fração foi analisada por CCDC utilizando fase móvel (Hex/AcOEt 6:4) e
mostrou que esta era constituída por uma mancha majoritária. Esta fração foi
18
analisada por CLAE utilizando fase móvel acetonitrila/H2O (9:1) com 0,1% de ácido
fosfórico e confirmou-se que a substância principal já estava isolada.
3.1.3. Modificações Estruturais
3.1.3.1. Reações com Ácido Caurenóico
3.1.3.1.1. Reação com Diazometano – reação 1.
Diazometano
Temp. Ambiente
H
COOH
(4)
H
COOMe
(13)
Esquema 1: Reação de ácido caurenóico com diazometano.
Em um erlenmeyer de 100 mL foi preparada uma solução de 50 mg de
substrato em 5 mL de éter etílico e a ela foi adicionada, aos poucos, uma solução
etérea de CH2N2 (diazometano) recém-preparada. Após cada adição, a mistura foi
agitada por alguns segundos até cessar a liberação de gás (N2). O processo foi
repetido até que não houvesse mais liberação de gás com nova adição de
diazometano. Ao final, retirou-se o solvente, por evaporação rotativa, obtendo o éster
metílico do substrato com rendimento de 92%.

Preparação diazometano
Em um balão de fundo redondo de 125 mL dissolveu-se 2,416 g de N-metil -Nnitroso-p-toluenesulfonamide (Diazogen) em 30mL de éter etílico anidro.
A solução de Diazometano foi colocada em um balão de fundo redondo de 125
mL, sob banho de gelo, e verteu-se através de gotejamento a solução de hidróxido de
potássio. Posteriormente, o balão fechado foi transferido para um banho de óleo de
19
silicone para aquecimento e acoplado a um condensador reto contendo na saída um
erlenmayer com 10 mL de éter etílico anidro em banho de gelo (figura 01). O sistema
foi aquecido até 100°C e o diazometano produzido foi recolhido.
3.1.3.1.2. Redução com LiAlH4 – reação 2.
LiAlH4
THF, 100°C
H
H
COOMe
(13)
CH2OH
(16)
Esquema 2: Reação do éster do ácido caurenóico com LiAlH4.
Em um balão de 3 bocas de 25 mL contendo 7,5 mg de LiAlH4 foram
adicionados 5 mL de THF anidro, a mistura foi colocada em banho de gelo e
adicionadas à ela, gota à gota, uma combinação de 30 mg ácido caurenóico em 2,5
mL de THF anidro, retirou-se então do banho. A mistura foi colocada em refluxo por 8
horas. Após cessada a reação, esta foi adicionada à 20 mL de água e foi acidificada
com H2SO4. Esta fase aquosa foi extraída com 3 porções de 20 mL de acetato de etila.
A fase orgânica foi seca com MgSO4 e o solvente foi retirado por evaporação rotativa,
obtendo-se um rendimento de 76%.
3.1.3.1.3. Formação do sal de sódio – reação 3.
20
NaOH
H
H
COO-Na+
COOH
(4)
(12)
Esquema 3: Reação da formação de sal de sódio de ácido caurenóico.
Em um erlenmeyer de 50 mL, foi preparada uma solução de 100 mg do
substrato em 5 mL de hexano, à esta foram adicionados 5 mL de uma solução aquosa
de NaOH 0,5 M. A mistura foi agitada vigorosamente por 3 minutos e filtrada à vácuo
em funil de Büchner. O sólido retido no papel de filtro foi lavado com água gelada e
seco em estufa à 50ºC, obtendo um rendimento de 80%.
3.1.3.1.4. Reação de Hidrogenação – reação 4.
H2
Pd/C
H
R
4 : R=COOH
12 : R=COONa
13 : R=COOMe
2 atm
H
R
18 : R=COOH
19 : R=COONa
20 : R=COOMe
Esquema 4: Hidrogenação de ácido caurenóico e seus derivados
Em um frasco especial (tubo de vidro), foram colocados 70mg da substância a
ser hidrogenada, 20 mL de etanol absoluto e uma quantidade catalítica de paládio
sobre carbono ativado. O tubo foi fechado em uma autoclave para hidrogenação à alta
pressão. Através dos controles de entrada e saída de gases, foi passado hidrogênio
no sistema para eliminação de ar. A pressão de hidrogênio foi regulada em 2 atm e a
mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Ao final deste
tempo, a mistura reacional foi filtrada em Celite® e o solvente foi eliminado por
21
evaporação rotativa, obtendo-se um rendimento de 95% a 98% para todas as
substâncias hidrogenadas.
3.1.3.2. Reações com os derivados de Copaifera langsdorffi
3.1.3.2.1. Reação de Hidrogenação – reação 5.
COOH
H2
Pd/C
R2
COOH
R2
2 atm
R1
7. R1=CH3; R2=H
8. R1=CH3; R2=OAc
9. R1=CH3; R2=OH
10. R1=COOH; R2=H
R1
21. R1=CH3; R2=H
22. R1=CH3; R2=OAc
23. R1=CH3; R2=OH
24. R1=COOH; R2=H
Esquema 5: Hidrogenação dos labdanos.
Para as reações de hidrogenação dos labdanos, foi adotada a mesma
metodologia utilizada na reação com o ácido caurenóico (item 3.1.3.1.4, página 21).
3.1.3.2.2. Reação com Diazometano – reação 6.
COOH
Diazometano
Temp. Ambiente
R2
R1
COOMe
R2
R1
7. R1=CH3; R2=H
8. R1=CH3; R2=OAc
9. R1=CH3; R2=OH
10. R1=COOH; R2=H
25. R1=CH3; R2=H
26. R1=CH3; R2=OAc
27. R1=CH3; R2=OH
28. R1=COOMe; R2=H
Esquema 6: Reação dos labdanos com diazometano.
22
COOH
R2
COOMe
Diazometano
Temp. Ambiente
R2
R1
R1
21. R1=CH3; R2=H
22. R1=CH3; R2=OAc
23. R1=CH3; R2=OH
24. R1=COOH; R2=H
29. R1=CH3; R2=H
30. R1=CH3; R2=OAc
31. R1=CH3; R2=OH
32. R1=COOMe; R2=H
Esquema 7: Reação dos labdanos hidrogenados com diazometano.
Para a formação do éster metílico dos labdanos novamente foi utilizado os
mesmos procedimentos realizados com ácido caurenóico (item 3.1.3.1.1, página 19).
3.1.3.2.3. Reação de metoxilação – reação 7.
OMe
COOH
MeOH
H2SO4
R2
R1
COOH
R2
R1
7. R1=CH3; R2=H
8. R1=CH3; R2=OAc
9. R1=CH3; R2=OH
10. R1=COOH; R2=H
33. R1=CH3; R2=H
34. R1=CH3; R2=OAc
35. R1=CH3; R2=OH
36. R1=COOMe; R2=H
Esquema 8: Obtenção dos labdanos metoxilados.
Em um balão de 25 mL, foi preparada uma solução 100 mg da substância a ser
metoxilada em 4 mL de metanol. Em seguida, 4 gotas de ácido sulfúrico foram
adicionadas lentamente, à esta solução sob agitação, permanecendo assim em
temperatura ambiente por 18 horas. A mistura reacional foi, então, colocada em um
funil de separação contendo 40 mL de água destilada e esta foi extraída utilizando-se
23
de 3 porções de 20 mL de acetato de etila. A fase orgânica foi seca com MgSO 4 e o
solvente foi retirado por evaporação rotativa, obtendo um rendimento de 89%.
3.1.4. Atividade Biológica
3.1.4.1. Atividade antimicrobiana
O estudo da atividade antimicrobiana dos derivados obtidos foram realizados
no LAPEMA - UNIFRAN, sob responsabilidade do Prof. Dr. Carlos Henrique Gomes
Martins, colaborador para realização dos ensaios.
A atividade foi determinada pela concentração inibitória mínima (CIM). A CIM é
definida como a menor concentração do agente antimicrobiano capaz de inibir
completamente o crescimento bacteriano. O procedimento utilizado para determinação
da CIM foi baseado na metodologia preconizada pelo Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing; Nineteenth Informational Supplement (M100-S19). Clinical and Laboratory
Standards Institute,2009).
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para cada
microrganismo foi realizada em triplicata utilizando-se o método de microdiluição em
microplacas. Um miligrama de cada diterpeno foi dissolvido em 125 μL de
dimetilsulfóxido (DMSO) e 1875 μL de caldo Mueller Hinton será adicionado. A
concentração final de DMSO não foi superior a 5% e a solução nesta porcentagem foi
utilizada como controle negativo.
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, culturas de 24 horas dos
microrganismos foram transferidas para tubos contendo 10 mL de solução salina
esterilizada. A suspensão será padronizada comparando-a com o tubo 0,5 da escala
de McFarland (0,1 mL de uma solução 1% de BaCl2 em 9,9 mL de uma solução 1% de
24
H2SO4). Em seguida, foram realizadas diluições sucessivas em solução salina e por
fim no meio Mueller Hinton, de modo a fornecer um inóculo de 5 x 105 UFC/mL
(Unidade Formadora de Colônia/mL).
Em microplacas esterilizadas de 96 orifícios, foi adicionado um total de 100 μL
contendo meio Mueller Hinton, as suspensões dos microrganismos e as soluções dos
metabólitos a serem avaliados. Os diterpenos foram avaliados em diferentes
concentrações permitindo determinar a concentração necessária para inibir o
crescimento dos microrganismos a serem avaliados.
Em um dos orifícios de cada placa foi feito o controle da cultura, a qual deve
apresentar crescimento bacteriano devido à ausência de agentes antimicrobianos. Em
outro orifício foi feito o controle de esterilidade do meio Mueller Hinton e em outro o
controle do solvente (DMSO) utilizado para a solubilização dos diterpenos. Como
controle positivo, foi utilizado a vancomicina.
As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Posteriormente, foram
adicionados em cada orifício 30 μL de uma solução aquosa 0,02% de resazurina,
sendo as placas reincubadas por 3 horas. A presença da coloração azul (coloração da
solução de resazurina) será interpretada como ausência de crescimento bacteriano.
Para a determinação da atividade antimicrobiana das substâncias isoladas,
foram utilizadas as cepas padrão e os isolados clínicos: Staphylococcus haemolyticus
(29970 ATC), Enterococcus faecium (NCTC 717), Enterococcus faecalis (NCTC 775),
Staphylococcus capitis (27840 ATCC), Staphylococcus aureus (I.C.153), Enterococcus
faecalis (I.C.179), Staphylococcus haemolyticus (I.C.213), Staphylococcus aureus
(I.C.180),
Staphylococcus
Staphylococcus
capitis
aureus
(I.C.207),
(I.C.222), Staphylococcus
Staphylococcus
aureus (I.C.223),
epidermidis
(I.C.
177),
Staphylococcus epidermidis (I.C. 254).
25
3.1.4.2. Atividade antiespasmódica
O estudo da atividade antiespasmódica dos derivados obtidos foram realizados
sob responsabilidade do Prof. Dr. Sergio Ricardo Ambrósio, colaborador para
realização dos ensaios desta atividade.
Ratos da linhagem Wistars, com idade média entre 50-75 dias, pesando entre
200- 250g, foram anestesiados e eutanasiados, de acordo com o Comitê Ético Animal
da Universidade de Franca - UNIFRAN. Para o estudo da reatividade vascular, os
segmentos da artéria aorta foram expostos e removidos, e separados em anéis com
(4mm) de aorta, sendo que após a retirada e o isolamento da artéria, dois ganchos de
metal foram inseridos no lúmem da mesma para produzir tensão.
Os anéis foram inseridos em uma cuba de órgão isolado (10,0 mL) contendo
solução de Kreb’s cuja composição é (mM): NaCl :118,00; KCl : 4,7; KH2PO4 : 1,2;
MgSO4 : 1,2; NaHCO3 : 15,00; C6H12O6 : 5,5; CaCl 2 : 2,5; pH = 7,4, sendo mantidos à
uma temperatura constante de 37ºC e gaseificados com mistura carbogênica (95% O2
e 5% CO2).
Um dos ganchos foi conectado a um suporte fixo ajustável e o outro a um
transdutor isométrico de força visando detectar modificações do tônus muscular. Os
registros foram realizados através de sistema de aquisição de sinais (Insight® EFE
321A) e processado pelo programa Windaq32 (DATAQ® INSTRUMENTS).
Antes do início dos protocolos experimentais, as preparações permaneceram
em repouso sob tensão de 0,75g durante 60 minutos para estabilização. A viabilidade
do endotélio vascular foi verificada, sendo utilizadas apenas as artérias com endotélio
vascular íntegro. Para tanto, as preparações isoladas foram pré-contraidas com
fenilefrina (Phe, 10-8 M) e posteriormente submetidas à ação da acetilcolina (Ach, 10-8
M). A ausência de relaxamento induzida pela Ach foi considerada indicativo de
ausência de endotélio vascular íntegro.
26
Posteriormente ao desenvolvimento das etapas descritas, realizou-se uma
curva de contração destas artérias utilizando-se concentrações de Phe que variaram
de 10-11 a 10-5 M, que serviram de controle para os experimentos. Após a realização
desta curva, as preparações foram lavadas exaustivamente até retornarem ao seu
tônus inicial, sendo então incubadas com os diterpenos na concentração de 100 μM
por período de tempo de 60 minutos como previamente descrito na literatura
(Ambrosio et al. 2002). Após esse período de tempo foi construído novamente uma
curva de contração com estas artérias utilizando-se Phe (10-11 a 10-5 M), o que
permitiu avaliar o potencial de inibição dos metabólitos avaliados. Para cada diterpeno
testado foram realizadas 8 experimentos independentes (n = 8).
Os resultados foram analisados utilizando o programa graph pad prisma®
versão 5.01 Graph Pad software Inc. (San Diego, CA, USA), onde foram expressos
como a média ± o e.p.m. e analisados estatisticamente utilizando-se o teste “one-way”
e “two-way” seguido do teste de Bonferroni, onde valores p < 0,05 foram considerados
significantes. Como parâmetro farmacológico foi utilizado o efeito máximo de inibição
produzido pelo diterpeno (Emax).
27
RESULTADOS E DISCUSSÕES______________________________________________________
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Identificação das Substâncias isoladas.
Nos casos aqui descritos, a identificação se deu por comparação com dados de
espectroscopia previamente publicados na literatura. Como se trata de re-isolamentos,
todas as substâncias já são produtos naturais conhecidos e previamente identificados.
4.1.1. Ácido caurenóico (4) de Mikania glomerata.
A identificação de ácido caurenóico (4) também se deu por comparação de
dados de RMN obtidos para a substância isolada com os dados de RMN da literatura
(Nascimento & Oliveira, 2001). Os espectros de RMN, tanto de RMN de 1H quanto de
RMN de
13
C {1H}, feitos a partir da amostra de ácido caurenóico (4) obtida neste
procedimento, estão nas figuras 6, 7 e 8 respectivamente, nas páginas 28 e 29. Desta
forma foi identificada a amostra de ácido caurenóico (4) obtida de Mikania glomerata.
Ác.Caurenóico_1.001.esp
1.0
0.9
20
2
3
0.8
11
1
10
4
5
9
6
12
8
13
16
14
TMS
17
15
18
7
COOH
19
1.24
18
0.6
20
0.95
0.5
0.4
17a 17b
13
0.3
0.2
0.1
2.64
4.80
4.74
Normalized Intensity
0.7
0
1.00 1.03
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
1.02
4.0
3.5
3.0
Chemical Shift (ppm)
2.5
3.06 2.94
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Figura 6: Espectro de RMN de 1H de ácido caurenóico (4).
28
16
19
19
0.80
43.82
155.88
0.85
184.62
17
0.75
21.80
19.06
18.41
15.56
COOH
18
15
7
33.08
28.94
0.90
6
8
39.65
4
5
44.21
3
9
41.25 43.73
37.76
10
17
13
16
14
48.93
1
2
12
57.04
55.09
0.95
11
102.98
20
1.00
77.30
76.68
Ác.Caurenóico_1.002.esp
0.70
0.65
0.60
0.55
180
160
140
120
100
80
60
40
20
Figura 7: Espectro de RMN de 13C de ácido caurenóico (4).
1.00 Ác.Caurenóico_1.002.esp
20
11
13
14 e 10
10
4
5
9
6
8
18
15
7
19
0.75
11
2
20
15.56
21.80
18
28.94
33.08
3
19.06
18.41
6
12
37.76
41.25
40.67
7
1
17
COOH
39.65
44.21
3
1
13
16
14
4
43.73
15
48.93
0.80
9
55.09
0.85
2
8
5
57.04
0.90
43.82
0.95
12
0.70
0.65
0.60
0.55
55
50
45
40
35
30
25
20
15
Figura 8: Espectro de RMN de 13C de ácido caurenóico (4) expansão 1.
29
Tabela 5: Dados de RMN 1H da substância 4.
H
Da Costa et al., 1996
13
2,62 s(l)
17b
4,73 s
17a
4,78 s
18
1,25 s
20
0,96 s
Tabela 6: Dados de RMN 13C da substância 4.
C
Da Costa et al., 1996
1
40,7
2
19,0
3
37,7
4
43,8
5
57,0
6
21,8
7
41,3
8
44,2
9
55,0
10
39,7
11
18,4
12
33,0
13
43,9
14
39,7
15
48,9
16
155,8
17
103,0
18
29,0
19
185,0
20
15,5
Substância 4
2,64 s(l)
4,74 s
4,80 s
1,24 s
0,95 s
Substância 4
40,7
19,1
37,8
43,7
57,0
21,8
41,3
44,2
55,1
39,6
18,4
33,1
43,8
39,6
49,0
156,0
103,0
28,9
184,6
15,6
4.1.2. Constituintes de Copaifera langsdorffii
Todo o trabalho de re-isolamento dos constituintes C. langsdorffii foi realizado
seguindo um roteiro da literatura (Souza et al., 2010). Durante este trabalho, nossa
amostra de óleo mostrou-se mais rica em derivados que outras. Desta forma, seria
possível isolar quatro constituintes majoritários, ao invés de dois, planejados
inicialmente. Isso possibilitou, no decorrer do trabalho, aumentar o número de
derivados obtidos.
30
Durante este processo, as amostras foram analisadas por CLAE, utilizando-se
o padrão das substâncias. O conjunto dos cromatogramas obtidos por CLAE estão
apresentados a seguir (figuras 9 a 16) e mostram a comparação de cada padrão com
uma fração obtida composta por ele, evidenciando a presença dos quatro
componentes no óleo.
14.043
mV(x1,000)
SPD-20A Ch1:210nm
1.00
0.00
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
28.891
17.123
16.000
12.679
6.975
6.121
0.25
4.583
3.548
0.50
8.058
0.75
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0 min
Figura 9: Padrão do ácido copálico (7).
14.044
mV(x1,000)
SPD-20A Ch1:210nm
2.5
2.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
32.480
22.114
17.225
0.0
15.167
0.5
12.629
13.184
6.241
7.020
1.0
8.206
1.5
25.0
30.0
35.0
min
Figura 10: Fração O.C3.4
6.777
mAU
3500 Extract-190nm,4nm (1.00)
3000
2500
2000
-500
0.0
2.5
5.0
9.892
5.493
4.893
4.225
0
3.199
500
2.240
1000
6.189
1500
7.5
10.0
12.5
15.0
min
Figura 11: Padrão do acetato do ácido copálico (8).
31
6.923
mAU
Extract-190nm,4nm (1.00)
400
300
0
0.0
2.5
5.0
6.421
5.077
100
5.675
3.849
200
7.5
10.0
12.5
15.0
min
5.186
mAU
3500 Extract-190nm,4nm (1.00)
3000
2500
2000
1500
-500
0.0
2.5
5.0
10.675
8.833
0
7.211
500
5.945
3.598
4.186
1000
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5 min
Figura 13: Padrão do ácido copálico hidroxilado (9).
5.077
mAU
750
500
0.0
2.5
5.0
6.906
7.5
18.115
0
5.711
3.584
4.128
250
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0 min
Figura 14: O.C6
32
mAU
3500 Extract-190nm,4nm (1.00)
3000
4.217
2500
2000
10.919
1500
-500
0.0
2.5
5.0
9.184
7.522
7.5
10.205
0
6.245
6.795
500
5.249
3.101
1000
10.0
12.5
15.0
min
Figura 15: Padrão do ent-agático (10).
4.218
mAU
2500
2000
1500
0.0
2.5
5.0
7.5
9.895
0
8.712
500
6.973
5.170
5.824
1000
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
min
Assim o trabalho de isolamento forneceu quatro diterpenos da classe dos
labdanos que, para confirmação de suas estruturas, foram submetidos a análises por
RMN. Os dados de RMN obtidos para cada substância isolada foram comparados com
os dados de RMN da literatura (Souza et al., 2010). Os espectros de RMN estão nas
figuras de 17 a 20. Desta forma foram confirmadas as identificações dos quatro
constituintes majoritários do óleo de copaíba utilizado.
33
1.0 SRA_OC38.001.esp
16
20
0.9
12
11
13
14
1
0.8
10
2
3
5
4
9
6
17
8
COOH
15
7
0.7
0.6
0.87
0.80
0.68
16
0.5
2.16
18 19 20
19
18
0.4
17a
14
0.3
17b
0.1
4.49
4.84
5.67
0.2
0
1.00 0.25
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
1.00 1.01
5.0
4.5
3.51
4.0
3.5
3.0
2.5
4.50 3.87 3.45
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Figura 17: Espectro de RMN de 1H do ácido copálico (7).
2.05
acetato do ácido copálico.001.esp
1.0
16
11
13
0.9
14
3
21
O
0.7
8
5
7
6
17
COOH
18 20
16
15
19
2.16
18
4
9
0.87
0.8
22
10
2
0.85
1
O
0.6
0.4
14
17a
4.88
4.88
0.5
5.67
17b e 3
0.3
0.2
4.52
19
22
12
0.72
20
0.1
0
1.01
7.0
6.5
6.0
5.5
1.01 2.18
5.0
4.5
3.40 3.20
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
3.55 3.50 3.24
1.5
1.0
0.5
0
Figura 18: Espectro de RMN de 1H do acetato do ácido copálico (8).
34
19
18 20
13
14
1
3
HO
0.7
9
10
2
5
4
COOH
17
8
15
7
6
2.16
0.9
16
12
11
1.00
20
0.69
16
1.0
0.8
0.77
ácido copálico hidroxilado.001.esp
19
18
0.6
0.5
14
17a
0.4
17b
3
3.26
3.25
4.51
0.2
4.87
5.67
0.3
0.1
0
1.01
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
1.00 1.37
5.0
4.5
1.18
4.0
3.5
3.0
3.20
2.5
4.23 3.79 3.85
2.0
1.5
1.0
0.5
0
16
1.0
20
1
10
2
12
3
4
5
9
6
18
13
16
8
17
COOH
20
15
7
COOH
18
19
0.6
0.5
14
17a 17b
4.51
0.3
4.88
0.4
5.67
0.7
11
14
0.9
0.8
2.16
vlad_ans1_12o.001.esp
0.62
1.25
Figura 19: Espectro de RMN de 1H do ácido copálico hidroxilado (9).
1.00
1.00
1.29
0.2
0.1
0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
0.36
4.0
3.5
3.0
3.02 1.21
2.5
2.0
4.17
1.5
3.11
1.0
0.5
0
Figura 20: Espectro de RMN de 1H do ácido ent-agático (10).
35
As estruturas dos componentes do óleo isolados estão agrupadas na figura 21.
COOH
COOH
AcO
COOH
COOH
HO
COOH
7
8
9
10
Figura 21: Estruturas dos labdanos isolados.
As quantidades destes diterpenos obtidas foram: 900 mg de ácido copálico (7),
770 mg do acetato do ácido copálico (8), 660 mg de ácido copálico hidroxilado (9) e
490 mg de ácido ent-agático (10). Isso a partir de 30mL (praticamente 30g) do óleo.
Tabela 7: Dados de RMN 1H da substância 7
H
Ohsaki et al., 1994
14
5,67 s
16
2,17 s
17b
4,49 s(l)
17a
4,85 s(l)
18
0,87 s
19
0,80 s
20
0,68 s
Substância 7
5,67 s(l)
2,16 s
4,49 s(l)
4,84 s(l)
0,87 s
0,80 s
0,68 s
Tabela 8: Dados de RMN 1H da substância 8
H
Ohsaki et al., 1994
3
-------------------------------------14
5,67 s
16
2,17 s
17b
4,49 s(l)
17a
4,85 s(l)
18
0,87 s
19
0,80 s
20
0,68 s
22
--------------------------------------
Substância 8
4,51 dd
5,66 tq
2,16 s
4,52 d
4,87 ddt
0,87 s
0,84 s
0,71 s
2,05 s
36
H
Justicia et al., 2005
3
3,22 dd (J2a-3 = 4,2 e J2b-3 = 11,5)
14
5,62 s
16
2,13 s
17b
4,49 s(l)
17a
4,84 s(l)
18
0,97 s
19
0,75 s
20
0,66 s
H
Zdero et al., 1991
14
5,65 s
16
2,15 s
17b
4,50 s(l)
17a
4,86 s(l)
18
1,22 s
20
0,59 s
Substância 9
3,26 dd (J2a-3 = 4,7 e J2b-3 = 11,2)
5,87 s(l)
2,16 s
4,51 s(l)
4,87 s(l)
1,00 s
0,77 s
0,69 s
Substância 10
5,67 s(l)
2,16 s
4,51 s(l)
4,88 s(l)
1,26 s
0,62 s
4.2. Identificação das substâncias obtidas por semi-síntese
4.2.1. Derivados de ácido caurenóico (4).
Com as reações descritas no item 3.1.3. (página 19) foram obtidos,
inicialmente, três derivados do ácido caurenóico (figura 22). Todos foram identificados
por comparação dos dados de RMN de 1H com nossos dados obtidos anteriormente
para estes mesmos derivados obtidos.
H
COOMe
13
H
CH2OH
16
H
COO-Na+
12
Figura 22: Derivados obtidos de ácido caurenóico (4).
37
4.2.1.1. Produto da reação com diazometano .
Neste caso, temos a transformação de um ácido carboxílico em éster metílico.
20
11
12
0.8
2
10
5
4
6
8
21
15
7
18
COOMe
18
19
21
0.5
20
0.83
0.6
3
9
17
1.17
0.7
1
13
16
14
3.64
Ác.Cau.Metoxilado_2.001.esp
0.4
0.3
17a 17b
13
0.1
2.63
4.79
4.73
0.2
0
1.00 1.02
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
2.84
4.0
3.5
3.0
0.99
2.5
2.96
2.0
1.5
3.22
1.0
0.5
0
Figura 23: Espectro de RMN de 1H da substância 13.
Foi feita uma comparação dos espectros de RMN de 1H do material de partida
(4) e do produto (13). Nota-se que a diferença visual entre os espectros da substância
4 figuras 6 (página 28) e da substância 13 (figura 23, acima): é o sinal em 3,64 ppm
que aparece apenas no espectro da figura 23 e não no da figura 6 (substância 4). Isto
é prova suficiente de que ocorreu a transformação desejada, conforme o esquema 1
(página 19).
38
4.2.1.2. Produto da redução com LiAlH4 .
Neste caso, temos uma análise interessante, baseada nos resultados de RMN.
Inicialmente, nota-se que se trata de uma mistura de isômeros.
1.0 Vlad_KARed.001.esp
0.7
3
18
1
10
4
5
9
6
12
16
13
14
8
7
20
17
+
2
3
15
CH2OH
18
19
1
10
4
5
9
6
12
8
17
13
16
14
15
7
CH2OH
19
16a
16b
0.6
0.4
1.04
0.5
1.69
11
0.94
2
0.8
11
2.04
20
0.9
0.3
2.30
2.64
0.1
3.88
5.05
4.79
4.73
4.20
0.2
0
1.01 0.40 0.37 1.68 1.63
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
0.37 1.08 4.89 3.56
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
4.70 6.75
1.0
0.5
0
Figura 24: Espectro de RMN de 1H do produto da reação 2.
Com isso, analisando o espectro e, baseado nos sinais encontrados principalmente nos sinais de hidrogênios ligados a carbono sp2 - foram propostos dois
isômeros obtidos, mostrados na figura 25.
H
CH2OH
16a
H
CH2OH
16b
Figura 25: Isômeros 16a e 16b obtidos na reação 2.
39
A análise da expansão dos sinais de hidrogênios ligados a carbono com dupla
ligação possibilitou inclusive a determinação da proporção de isômeros obtida.
Vlad_KARed.001.esp
20
0.30
2
3
1
10
5
4
11
9
6
12
13
14
16
8
7
20
17
+
CH2OH
0.25
18
18
19
16a
10
4
5
9
6
12
8
13
16
14
17
15
7
CH2OH
19
16b
0.20
2.30
2.64
4.79
4.73
0.05
3.88
0.10
4.20
0.15
5.05
2
3
15
1
11
0
1.01
5.0
0.40 0.37
1.68
4.5
1.63
4.0
3.5
0.37
3.0
1.08
2.5
Figura 26: Espectro de RMN de 1H do produto da reação 2 (expansão 1).
Nota-se, neste espectro, o sinal de um hidrogênio ligado à dupla ligação para o
composto 16a (5,05 ppm) e de dois sinais relativos a dois hidrogênios ligados à dupla
ligação do composto 16b (entre 4,73 e 4,79 ppm). Os sinais entre 3,88 e 4,20 ppm são
relativos aos grupos –CH2–OH dos dois isômeros, mas que foram facilmente
diferenciados pelas suas integrais. Com esta análise se confirma as estruturas
apresentadas na figura 25 como sendo as estruturas dos dois isômeros obtidos por
esta reação de redução de ácido caurenóico com LiAlH4. As integrais dos sinais entre
2,2 e 5,2 ppm, mostrados na figura 26 (acima), possibilitaram a determinação da
proporção dos isômeros obtidos (75% de 16a para 25% de 16b).
Verifica-se ainda, no espectro, a existência de cinco sinais de metilas no
espectro (três relativos ao composto 16a e dois relativos ao composto 16b), o que está
40
de acordo com a proposta, inclusive com as integrais dos mesmos coincidindo com a
quantidade relativa dos dois isômeros.
4.2.1.3. Formação do sal de sódio .
Para este caso, temos inicialmente que considerar que outro solvente, mais
polar, foi necessário para a dissolução da amostra e subseqüente realização do
experimento de RMN. O solvente utilizado aqui é metanol deuterado, enquanto que o
do espectro do material de partida é clorofórmio deuterado.
Sal Ác.Caurenóico_3.001.esp
0.45
0.40
2
4
10
5
6
8
17
13
16
14
18
15
7
COO-Na+
18
19
1.04
0.30
3
9
12
1.89
0.35
1
11
1.10
20
0.25
20
0.20
0.15
17a 17b
13
2.58
0.05
4.76
4.76
4.70
0.10
0
15.33 1.00 0.88
4.5
1.76
4.0
3.5
0.80
3.0
1.55
2.5
2.0
3.01 3.60
1.5
1.0
0.5
0
Figura 27: Espectro de RMN de 1H do sal de sódio do ácido caurenóico (12).
Com isso, devemos ignorar os sinais em 3,31 e 4,87 ppm que são relativos ao
solvente. A integração do sinal em 1,89 ppm, outra diferença visual, mostra que não se
trata de sinal da amostra.
Desta forma, a comparação dos espectros da substância 12 (figura 27) e da
substância 4 (figura 6, página 28), considerando as pequenas diferenças relativas à
mudança de solvente, mostra que os dois espectros são praticamente idênticos, o que
41
era de se esperar, uma vez que o sinal do grupo –OH do ácido não foi observado para
a substância 4. A análise do espectro de RMN, aliada ao teste de solubilidade provam
a estrutura proposta para 12.
Os derivados obtidos nesta fase inicial foram fornecidos para estudos de
atividade antimicrobiana por nossos colaboradores, junto com outras substâncias de
outras pesquisas (Andrade et al., 2011).
4.2.1.4. Produtos obtidos da hidrogenação.
4.2.1.4.1. Hidrogenação do ácido caurenóico.
Todos derivados do ácido caurenóico foram, em seguida, submetidos à
hidrogenação com Pd/C, para fornecer outro conjunto de derivados, cujas obtenções
foram descritas no item 3.1.3.1.4 (página 21, esquema 4).
1.23
18
ANS_KAH.001.esp
20
0.9
1
2
0.7
4
18
5
9
6
12
8
13
16
14
17
15
20
7
COOH
19
17
1.01
0.8
10
3
11
0.94
1.0
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
1.00
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
2.79 3.21 3.09
1.5
1.0
0.5
0
Figura 28: Espectro de RMN de 1H do ácido caurenóico hidrogenado (18).
42
Uma comparação entre o espectro de RMN de 1H do substrato (figura 6, página
28 e do produto (figura 28, acima) foi realizada. A partir desta comparação verifica-se
que na verdade temos ausência de sinal na região entre 4,7 e 4,8 ppm referentes aos
hidrogênios da dupla ligação, o que confirma a formação do produto desejado.
4.2.1.4.2. Hidrogenação do éster metílico do ácido caurenóico.
11
12
1
2
0.7
4
18
5
6
8
17
21
15
7
18
COOMe
21
19
0.5
0.4
20
0.82
1.57
0.6
10
3
9
13
16
14
1.16
20
0.8
3.64
éster metilico do KA hidrogenado(b) ok.001.esp
17
0.3
0.2
0.1
0
3.00
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.80 3.89 2.50 2.60 4.39
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Figura 29: Espectro de RMN de 1H da substância (20) reação 4, esquema 4.
Uma comparação entre o espectro de RMN de 1H do substrato (figura 23,
página 38 e do produto (figura 29, acima) foi realizada. A partir desta comparação
verifica-se que na verdade temos ausência de sinal na região entre 4,7 e 4,8 ppm
referentes aos hidrogênios da dupla ligação, o que confirma a formação do produto
desejado.
43
4.2.1.4.3. Hidrogenação do álcool obtido na reação com LiAlH4.
No caso com este substrato, a hidrogenação não ocorreu. A intenção era
hidrogenar ambos os isômeros (figura 25, página 39), de forma que se obtivesse um
único produto, eliminando a dificuldade de separação dos mesmos. Como estes
isômeros apresentaram sempre praticamente o mesmo RF em cromatografia em
camada delgada para algumas misturas de solventes testadas, a separação de ambos
parece bastante improvável. Para os ensaios biológicos não nos interessam misturas,
portanto a hidrogenação, levando ambos isômeros ao mesmo produto, resolveria o
problema. No entanto, a reação não ocorreu nas condições testadas e este estudo foi
preterido, priorizando-se a obtenção de mais derivados a partir dos labdanos.
4.2.1.4.4. Hidrogenação do sal de sódio do ácido caurenóico.
0.9
20
2
3
0.8
10
4
5
9
6
12
8
13
16
14
17
18
7
17
COO-Na+
18
20
15
19
1.01
0.7
1
11
0.94
1.0
1.23
sal do ácido caurenóico hidrogenado ok.001.esp
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
3.00 3.58 4.68
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Novamente realizou-se uma comparação com o espectro de RMN de 1H do
substrato figura 27 (página 41) e do produto figura 30 (acima). A partir desta
44
comparação verifica-se que, na verdade, temos ausência de sinal na região entre 4,7 e
4,8 ppm referentes aos hidrogênios da dupla ligação, o que confirma a formação do
produto desejado.
4.2.2. Derivados do óleo da copaíba
As quatro substâncias isoladas do óleo de copaíba (Copaífera langsdorffi)
foram todas submetidas a quatro tipos de reações: hidrogenação, formação do éster
metílico a partir dos Labdanos e dos Labdanos hidrogenados e a reação de adição de
metoxila.
4.2.2.1. Produtos da reação de hidrogenação.
As quatro substâncias derivadas do óleo de copaíba foram submetidas à
reação de hidrogenação, conforme procedimento descrito no item 3.1.3.2.1, página 22.
1.0 ácido copálico hidrogenado.001.esp
16
0.9
20
12
11
13
14
1
0.8
10
2
3
4
5
9
6
8
17
COOH
15
7
0.7
18
19
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
45
Podemos fazer uma comparação com o espectro de RMN de 1H do ácido
copálico (figura 17, página 34) e do produto (figura 31, acima). A partir desta
comparação verifica-se a ausência de sinais na região entre 4,7 e 4,8 ppm referentes
aos hidrogênios da ligação dupla, o que confirma a hidrogenação completa do
substrato.
2.05
16
1.0
20
11
12
13
14
0.9
1
10
2
0.8
17, 18, 19 e 20
0.85
21
acetato do ácido copálico hidrogenado.001.esp
3
4
AcO
5
9
6
8
COOH
17
15
7
21
19
18
16
0.6
0.5
0.98
0.7
0.4
3
0.3
4.46
0.2
0.1
0
0.09
7.0
6.5
6.0
5.5
1.00
5.0
4.5
3.07
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
4.60 11.39
1.5
1.0
0.5
0
Podemos fazer uma comparação com o espectro de RMN de 1H do acetato do
ácido copálico (figura 18, página 34) e do produto (figura 32, acima). A partir desta
comparação verifica-se a ausência de sinais na região entre 4,7 e 4,8 ppm, referentes
aos hidrogênios da ligação dupla, o que confirma a hidrogenação completa do material
de partida. O sinal em 4,47 ppm que aparece no espectro acima (figura 32) é relativo
ao H-3, que é o hidrogênio ligado ao carbono que está diretamente ligado ao grupo
acetato. O sinal em 5,3 ppm não faz parte da amostra, conforme verificado por sua
integral relativa.
46
0.97
ácido copálico hidroxilado hidrogenado.001.esp
16
1.0
20
11
12
13
0.9
3
0.8
10
2
HO
18
4
9
5
6
8
17
0.77
14
1
COOH
15
7
19
0.7
0.6
0.5
0.4
3
0.3
3.19
0.2
0.1
0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Realizou-se novamente uma comparação com o espectro de RMN de 1H do
ácido copálico hidroxilado (figura 19, página 35) e do produto (figura 33, acima). A
partir desta comparação verifica-se a ausência de sinais na região entre 4,7 e 4,8 ppm
referentes aos hidrogênios olefínicos, o que confirma a hidrogenação do substrato. O
sinal em 3,2 ppm é o sinal referente ao H-3, que está diretamente ligado ao carbono
do grupo OH.
47
7.27
ans_agath1.001.esp
1.0
16
20
11
12
13
0.9
14
1
10
0.8
3
0.7
18
4
9
5
6
8
7
17
COOH
15
COOH
19
0.6
0.5
1.23
2
0.4
0.3
0.2
0.1
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Novamente uma comparação com o espectro de RMN de 1H do ácido entagático (figura 20, página 35) e do produto (figura 34, acima) foi realizada. A partir
desta comparação verifica-se a ausência de sinais na região entre 4,7 e 4,8 ppm
referentes aos hidrogênios da ligação dupla, confirmando a hidrogenação. Os produtos
obtidos a partir da hidrogenação geram uma sobreposição de sinais na região de 0,5 e
2,5 ppm mais complexa que a original. Essa sobreposição dificulta as análises nos
espectros, mas a ausência dos sinas na região dos hidrogênios olefínicos comprovam
que a reação realmente aconteceu conforme o esperado.
4.2.2.2. Produtos da reação com diazometano
Para esta reação temos a transformação do ácido carboxílico em éster metílico.
Os produtos das reações com diazometano foram identificados por RMN de 1H por
comparação com os espectros do material de partida.
48
16
20
1
10
2
3
0.8
12
13
5
6
8
17
15
COOMe
15
7
18
19 20
19
0.80
0.68
0.87
18
4
9
16
0.6
2.16
11
14
0.9
0.7
3.69
éster metilico do ácido copálico.001.esp
1.0
0.5
0.4
14
17a 17b
4.84
5.65
0.2
4.49
0.3
0.1
0
1.00
7.0
6.5
6.0
5.5
1.09 1.06
5.0
4.5
3.05
4.0
3.5
3.0
2.95
2.5
2.0
3.24 3.26 3.15
1.5
1.0
0.5
0
Figura 35: Espectro de RMN de 1H da substância (25) da reação 6, esquema 6.
A diferença notável entre os espectros de RMN de 1H do ácido copálico (figura
17, página 34) e 35 (acima): é o sinal em 3,69 ppm que aparece apenas no espectro
da substância 25 (figura 35). Isto é prova suficiente de que ocorreu a transformação
desejada, conforme o esquema 6 (página 22).
49
16
1.0
12
0.9
21
15
13
0.8
3
AcO
4
5
9
6
8
17
COOMe
19
18
20
15
7
21
0.7
18
0.87
0.85
10
2.15
1
2
19
16
14
0.71
11
1.74
20
3.69
éster metilico do acetato do ácido copálico.001.esp
2.05
0.6
0.5
14
0.4
17a 17b e 3
4.52
0.2
4.87
5.64
0.3
0.1
0
1.00
7.0
6.5
6.0
5.5
1.02 2.19
5.0
4.5
2.84
4.0
3.5
3.0
3.12 2.17 3.67
2.5
2.0
2.99 2.69 2.54
1.5
1.0
0.5
0
Neste caso também fizemos a comparação dos espectros de RMN de 1H do
acetato do ácido copálico com o espectro do produto obtido. Nota-se que a diferença
entre os espectros das figuras 18 (página 34) e 36 (acima): é novamente o sinal em
3,69 ppm que aparece neste espectro. Com isso comprova-se que ocorreu a
transformação desejada.
.
50
3.69
3.62
1.26
18
éster metilico do ácido copálico hidroxilado.001.esp
16
20
1
10
2
0.055
3
H3CO
18
13
15 21
5
6
17
8
7
COOMe
15
16
20
19
0.040
0.51
2.15
0.035
0.030
0.025
14
1.73
0.045
4
9
19
12
14
0.060
0.050
11
1.18
0.065
17a 17b
0.020
4.87
4.50
0.010
5.64
0.015
1.00
1.07
1.14
0.005
0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
3.04 1.41 3.30
4.0
3.5
3.0
3.09
2.5
2.0
3.20 3.38
1.5
1.0
2.96
0.5
0
Figura 37: Espectro de RMN de 1H substância (27) reação do esquema 6 (página 22).
Novamente foi realizada uma comparação de dados com de RMN de 1H da
figura 37 (acima) com o espectro do ácido copálico hidroxilado (figura 19, página 35).
A comparação leva a conclusão que a diferença entre os espectros é o sinal em 3,68 e
3,61 ppm, que pode ser verificado no espectro acima, figura 37 e que estão ausentes
na figura 19 (página 35). De acordo com espectro temos duas metilas de éster, que
para este caso era esperado apenas uma. Com isso pode-se concluir que a reação
aconteceu em dois pontos reativos da molécula, no ácido e no álcool.
51
3.62
1.0 éster metilico do ácido ent-agático.001.esp
16
12
11
13
14
1
10
2
3
4
0.7
6
8
7
17
COOMe
18
19
15
15
COOMe
18
16
19
20
0.51
0.6
2.15
5
9
1.18
0.8
1.67
20
3.69
0.9
0.5
0.4
14
17a 17b
0.3
5.64
4.87
4.50
0.2
0.99
0.98
1.00
0.1
0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
3.32 0.47 3.30
4.0
3.5
3.0
3.42
2.5
2.0
9.86
1.5
3.55
1.0
3.33
0.5
0
Neste caso também realizamos a comparação com o espectro de RMN de 1H
do produto obtido (figura 38) com o espectro da figura 20 (página 35). Para este caso
nota-se a presença de duas metoxilas uma em 3,62 e outra em 3,69, o que já era
esperado porque a substância possui duas funções ácidas na sua estrutura. Isto
comprova que a reação ocorreu como o esperado.
4.2.2.3. Éster metílico dos produtos hidrogenados.
Os derivados do óleo de Copaífera langsdorffi sofreram uma modificação
estrutural, onde as ligações duplas foram hidrogenadas, obtendo assim 4 novos
produtos. Estes produtos foram, então, submetidos a uma nova modificação estrutural,
pela reação com diazometano, objetivando-se a obtenção de éster metílico a partir dos
labdanos hidrogenados.
52
1.0 éster metílico ácido copálico hidrogenado.001.esp
16
0.9
20
11
12
13
14
1
0.8
10
2
3
4
9
5
6
8
17
COOMe
15
7
0.7
19
0.6
15
0.5
3.66
18
0.4
0.3
0.2
0.1
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Verifica-se neste caso quando comparado com o espectro de RMN de 1H da
figura 31 (página 45) com o espectro da figura 39 (acima) o surgimento de um sinal em
3,66 ppm. Este sinal refere-se à metila do éster, o que indica que a reação realmente
aconteceu.
53
1.0 éster metílico ácido copálico acetilado hidrogenado.001.esp
16
20
11
21
12
13
2.04
0.9
14
0.8
1
10
2
3
0.7
AcO
4
5
9
6
8
17
COOMe
15
7
15
19
18
3.66
21
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
4.46
3
0.1
0
1.00
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
3.59
4.0
3.5
3.0
3.06
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Verifica-se neste espectro acima que, quando comparado com o espectro de
RMN de 1H da figura 32 (página 46), nota-se o surgimento de um sinal em 3,66 ppm.
Este sinal refere-se à metila do éster, o que indica que a reação realmente aconteceu.
No caso abaixo, verifica-se novamente comparando o espectro de RMN de 1H
da figura 33 (página 47) com o espectro da figura 41 (abaixo) o surgimento de um sinal
em 3,65 ppm. Este sinal refere-se à metila do éster, o que indica que a reação
realmente aconteceu.
54
éster metílico ácido copálico hidroxilado hidrogenado.001.esp
16
1.0
20
11
12
13
15
14
0.9
1
3
HO
9
10
2
0.8
3.66
4
5
6
17
8
COOMe
15
7
19
18
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
16
1.0
12
20
1
10
2
3
0.8
18
11
13
15
14
0.9
0.7
3.66
3.63
éster metílico ácido ent-agático hidrogenado.001.esp
4
5
9
6
8
7
17
COOMe
18
15
COOMe
19
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
55
No caso da substância 32, também realizamos a comparação com o espectro
de RMN de 1H da figura 42 com o espectro da figura 34 (página 48). Para este caso
nota-se a presença de duas metoxilas: uma em 3,63 e outra em 3,66. Isto comprova
que a reação ocorreu como o esperado.
4.2.2.4. Adição de metoxila nos diterpenos isolados do óleo.
Com esta reação esperava-se obter um éter pela adição do grupo metoxila
(-OCH3) do metanol no carbono da ligação dupla, catalisada por ácido, conforme já
havia sido realizado para o ácido caurenóico. Com a análise dos espectros concluiu-se
que na verdade não foi isso que ocorreu, a conclusão obtida é que os produtos
formados são os ésteres metílicos (resultantes da esterificação dos grupos ácidos) e
não os éteres.
Nestes casos também realizamos a comparação com os espectros de RMN de
1
H das quatro substâncias isoladas, que são os espectros das figuras 17,18, 19 e 20
(páginas 34 e 35) com os quatro espectros das figuras 43, 44, 45 e 46 (a partir da
próxima página). Para estes casos nota-se exatamente a mesma coisa que para os
ésteres metílicos: a presença das metilas entre 3,6 e 3,7 ppm. Esses espectros
comprovam a nossa suspeita, visto que todos os sinais das duplas ligações aparecem
no espectro. A comparação destes espectros com os espectros dos ésteres metílicos
obtidos anteriormente (figuras 35 a 38, páginas 49 a 52), deixa claro que são as
mesmas substâncias, exceto para os casos das substâncias (9) e (10), que neste caso
apresentam apenas uma metila de éster.
56
1.0
16
20
0.9
11
12
13
14
10
0.8
3
0.7
18
4
9
5
6
COOMe
17
8
18
15
15
7
19
20
16
19
0.87
0.80
0.68
1
2
0.6
2.16
3.69
ácido copálico metilado.001.esp
0.5
0.4
17a 17b
14
4.84
5.65
0.2
4.49
0.3
0.1
0
1.01
7.5
7.0
6.5
6.0
1.25 1.22
5.5
5.0
4.5
2.97
3.06
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
3.38 3.30 3.26
1.5
1.0
0.5
0
3.68
15
16
20
0.9
11
19
18
16
12
13
14
0.8
3
AcO
6
COOMe
15
7
20
19
0.68
18
5
17
8
0.6
0.5
14
0.4
17a
17b
3
3.24
4.86
0.2
4.50
0.3
5.63
0.7
4
9
0.98
10
2.15
1
2
0.76
ans_acetm2.001.esp
1.0
0.1
0
1.03 0.15
7.0
6.5
6.0
5.5
1.05 1.05
5.0
4.5
3.27
1.18
4.0
3.5
3.0
3.03
2.5
2.0
3.01 2.96 2.86
1.5
1.0
0.5
0
57
1.0 ácido copálico hidroxilado metilado.001.esp
16
11
12
13
10
0.8
3
15
7
6
15
19
18
19
18
0.6
20
0.77
16
0.68
0.99
0.5
2.15
0.7
COOMe
17
8
5
4
HO
9
3.69
14
1
2
1.25
20
0.9
0.4
14
0.3
17a 17b
0.1
4.51
4.86
5.64
0.2
0
1.04
7.5
7.0
6.5
6.0
0.99 1.02
5.5
5.0
4.5
3.16
4.0
3.5
3.0
3.56
2.5
2.0
13.04 3.46 3.51 3.07
1.5
1.0
0.5
0
-0.5
16
20
12
13
15
14
0.9
1
10
2
3
0.8
18
4
5
9
6
8
COOMe
17
15
7
18
COOH
16
19
20
0.4
14
0.68
0.5
1.25
2.15
0.99
0.6
17a 17b
0.2
4.86
0.1
4.51
0.3
5.64
11
0.77
1.0
0.7
3.68
ácido ent-agático metilado.001.esp
0
1.00
7.0
6.5
6.0
5.5
0.97 0.99
5.0
4.5
3.11
4.0
3.5
3.0
3.17
2.5
2.0
7.81 3.40 3.06 3.04
1.5
1.0
0.5
0
Figura 46: Espectro de RMN de 1H da substância (36) reação 7, esquema 8
58
A reação não ocorreu conforme o esperado, mas produziu um resultado
consideravelmente interessante, uma vez que a reação com diazometano é mais
perigosa e complicada que esta com metanol e ácido sulfúrico. Desta forma, este
último procedimento passa a ser uma alternativa mais fácil, mais barata e mais segura
de se obter os ésteres. Além disso, é comum hoje em dia ter certa dificuldade em
comprar o diazogen (reagente para gerar diazometano). Por problemas de segurança,
várias empresas não entregam mais o produto. Desta forma, além de apenas uma
alternativa, esta passa a ser uma nova opção para possibilitar a reação em questão
Outros fatores que merecem ser comentados são a seletividade da
esterificação nos casos das substâncias 9 e 10, gerando respectivamente 35 e 36. No
caso da substância 10, com duas funções ácido, apenas uma foi esterificada. Já na
substância 9, a esterificação ocorreu normalmente, o que parece não ter ocorrido com
ela no caso de diazomentano. Desta forma, podemos ver esta reação (com ácido
sulfúrico e metanol) não só como alternativa, mas como forma de obter diferentes
ésteres.
4.2.3. Estudo detalhado de diterpenos por RMN.
4.2.3.1. Estudo da substância 12.
Para o início dos estudos de RMN de diterpenos, devido à grande
complexidade encontrada nestes espectros de 1H causada pela sobreposição de
sinais, foram iniciados os estudos com o éster metílico do ácido caurenóico (12). Este
trabalho foi realizado em colaboração com outro estudante – Eder Henrique da Silva –
de nosso grupo de pesquisas.
O estudo proposto de elucidação estrutural completa por RMN dos diterpenos
tem uma motivação um tanto diferente daquelas envolvidas em algumas outras
59
propostas. Para algumas substâncias que apresentam sinais bem separados no
espectro de RMN de 1H, as medidas de constantes de acoplamento e a verificação
das multiplicidades são facilitadas pela pouca sobreposição dos sinais. No caso dos
diterpenos acontece ao contrário: o excesso de sobreposição dos sinais dificulta o
estudo detalhado dos mesmos. É por isso que é muito comum serem analisados
apenas os sinais de hidrogênios olefínicos, carbinólicos e de metilas. Nossa dedicação
foi em elucidar um pouco mais que estes sinais, em busca de um método que possa
chegar à elucidação completa.
Inicialmente, ao se observar o espectro de RMN de 1H da substância em
questão, pode-se perceber a grande sobreposição de sinais na região entre 0,5 e 2,0
ppm.
1.0
20
0.9
2
0.8
1
10
4
5
9
6
12
21
17
13
16
14
15
8
7
18
COOMe
18
19
21
0.6
1.17
20
0.5
0.83
0.7
3
11
3.64
0.4
0.3
15a, 15b
17a 17b
13
2.04
0.1
2.63
4.79
4.73
0.2
0
1.01 1.03
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
2.94
4.0
3.5
3.0
0.99
2.5
1.97
2.0
3.03 3.14
1.5
1.0
0.5
0
Nota-se, inicialmente, os sinais já citados como facilmente identificáveis e que
já são devidamente atribuídos na literatura, como os sinais das metilas H-18 e H-20.
Além disso, o sinal em 3,64 ppm também pode ser facilmente atribuído à metoxila da
60
posição 21. Os demais sinais, em comparação com dados da literatura para o ácido
caurenóico (Da Costa et al., 1996), que tem a estrutura muito semelhante, estão com
deslocamentos químicos muito próximos da literatura, mas aqui apresentam maior
detalhamento em suas definições.
Este é o caso, por exemplo, do sinal de H-13, um hidrogênio de CH da cabeça
de ponte e perto da ligação dupla.
0.045
HH13
13
20
0.040
2
3
0.035
1
10
4
5
11
9
6
12
13
16
14
8
17
J 13, 14b
15
7
J 13, 12b
COOMe
18
19
J 13, 14a
21
J 13, 17a
0.030
J 13, 17b
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
2.67
2.66
2.65
2.64
2.63
2.62
2.61
2.60
2.59
Figura 48: Espectro de RMN de 1H da substância 12 – expansão 1.
Diferentemente do apresentado na literatura (ver tabela 11, página 67), este
sinal não é um singleto, e apresenta características de ter acoplamentos ainda mais
complexos do que somente um tripleto. Ao verificar os experimentos 2D, percebe-se
que este sinal apresenta correlação H-H (COSY) com outros quatro sinais: dois deles
são com os sinais H-17a, H-17b, H-14a, H-14b e H-12b. Desta forma, sua
multiplicidade na tabela aparece como ”multipleto”, mas deve ser resultados de uma
61
combinação de valores de constantes de acoplamento, como num duplo, duplo, duplo,
tripleto (dddt), que foi confirmada pelo espectro simulado no programa SimEsp_NMR.
X(H)=
Freqüênc ia: 400 MHz Largura a meia altura: 2,5 H z
Intensidade mínima: 0,01
2
3
4
5
6
+4,40
+1,90
+0,90
+0,90
J(2,X)= +1,70 +11,40
+4,00
+2,00
J(3,X)= +4,00
+2,00
0,00
J(4,X)=
0,00
-2,00
J(1,X)= +5,00
1402,7
Tí tulo: D efault
(H1) = 1402,68
(H2) = 602,68
(H3) = 800
(H4) = 1045,32
(H5) = 2554,68
(H6) = 2522,68
-4,00
1398,8
J(5,X)=
H1
Espectro Simulado
Curv a Combinada: 50% Lorentziana + 50% GaussianaS imEsp_NMR (LS O
- FFCLRP - USP)
Figura 49: Sinal de RMN de 1H simulado para H-13, da substância 12.
Sinais mais complexos, como o caso dos sinais dos hidrogênios da posição 17,
também foram detalhadamente estudados, conforme mostram as figuras 50 e 51 a
seguir.
0.11 Ác.Cau.Metoxilado_2.001.esp
H 17a
0.10
20
11
12
0.09
0.08
2
3
1
10
4
5
9
6
13
16
14
8
17
J 17a, 15b
15
7
J 17a, 15a
0.07
0.06
COOMe
18
19
J 17a, 17b
21
0.05
J 17a, 13
0.04
0.03
0.02
0.01
0
-0.01
-0.02
4.825
4.820
4.815
4.810
4.805
4.800
4.795
62
H 17b
0.11
20
0.10
0.09
0.08
2
3
1
10
4
5
11
9
6
12
13
16
14
8
17
J 17b, 15b
15
J 17b, 15a
7
COOMe
0.07
18
19
J 17b, 17a
21
0.06
0.05
J 17b, 13
0.04
0.03
0.02
0.01
0
4.765
4.760
4.755
4.750
4.745
4.740
Uma análise inicial leva a conclusão de que os sinais devem ser resultado de
uma combinação complexa de acoplamentos, no entanto se percebe facilmente que
não se trata de singletos, como na multiplicidade da literatura (tabela 11).
Ambos os sinais foram detalhadamente estudados, com uma série de medidas
visando encontrar cada uma das constantes de acoplamento. Medidas realizadas nos
demais sinais de hidrogênios acoplados com estes foram de grande utilidade,
confirmando alguns valores de J.
Simulações
de
sinais
realizadas
com
o
programa
SimEsp_NMR
(SimEsp_NMR, 2011) foram indispensáveis para o total esclarecimento. Os resultados
destas simulações estão nas figuras 52 e 53. A semelhança de cada sinal simulado
com o experimental, incluindo aparência e o deslocamento químico de cada pico
individualmente é que atestam a veracidade das medidas efetuadas.
63
X(H)=
Intensidade mí nima: 0,11
12
Tí tulo: D efault
20
17
11 13
(H1) = 1916
16
14
(H2) = 1892
1
9
8 15
2
10
(H3) = 834
5
7
3
(H4) = 820
6
4
2
3
4
5
+2,20
+2,60
+0,90
J(2,X)= +2,20
+2,60
+1,50
J(3,X)=
0,00
0,00
J(1,X)= +1,50
0,00
J(4,X)=
1912,5
1913,9
1918,1
1916
1917,2
21
1919,6
19
1913,4
COOMe
18
1914,9
(H5) = 1052
H1
Espe ctr o Sim ula do
- FFCLRP - USP)
Figura 52: Sinal de RMN de 1H simulado para H-17a, da substância 12.
X(H)=
12
Tí tulo: D efault
20
17
11 13
(H1) = 1895
16
14
(H2) = 1918
1
9
8 15
2
10
(H3) = 834
5
7
3
(H4) = 820
6
4
2
3
4
5
+2,20
+2,60
+0,90
J(2,X)= +2,20
+2,60
+1,50
J(3,X)=
0,00
0,00
J(1,X)= +1,50
J(4,X)=
0,00
21
1893,9
19
1896
COOMe
18
1895,1
(H5) = 1052
H1
- FFCLRP - USP)
Figura 53: Sinal de RMN de 1H simulado para H-17b, da substância 12.
O programa simulador (SimEsp_NMR, 2011) é utilizado da seguinte forma:
Uma vez de posse das constantes de acoplamento e dos deslocamentos químicos dos
sinais, estes dados são inseridos e o programa calcula o espectro. O importante é que
ele leva em consideração todas as interações que levam às distorções do espectro
chamado de segunda ordem. Isto é exatamente o problema dos diterpenos: não só os
sinais estão sobrepostos, como eles são de hidrogênios que acoplam entre si, o que
causa mais distorções e torna a interpretação dos sinais e as medidas de constantes
64
de acoplamento extremamente difíceis. Por isso é que são poucos os dados na
literatura.
Após este detalhado estudo com os sinais dos hidrogênios da posição 17,
pôde-se concluir que se tratava de sinais com quatro constantes de acoplamento
diferentes, ou seja, de duplos duplo duplo dubletos (dddd), como mostrado na tabela
11.
Outros sinais que demandaram considerável trabalho para elucidação foram os
sinais de H-15a e H-15b.
0.12
0.11
20
H 15a
H 15b
11
12
0.10
2
0.09
3
1
10
4
5
9
6
13
H 16
8
7
15
H
0.08
COOMe
0.07
18
J 15a, 15b
19
21
0.06
J 15b, 15a
0.05
0.04
J 15a, 17a
J 15b, 17a
0.03
J 15a, 17b
0.02
J 15b, 17b
J 15a, 14(?)
0.01
0
2.13
2.12
2.11
2.10
2.09
2.08
2.07
2.06
2.05
2.04
2.03
2.02
2.01
Inicialmente, parecia que era um único sinal e estava aproximadamente em
2,05 ppm. As medidas de integral relativa foram feitas, em sua maioria entre 2,09 e
2,04 ppm. A não coincidência dos valores de integral com o que deveria ser esperado
para esta primeira proposta, deixou claro que se tratava de algo diferente. Análises
mais detalhadas levaram a percepção de que os sinais em 2,11 e 2,02 ppm não eram
simples impurezas, mas sim parte dos sinais de H-15a e H-15b que, por sua
proximidade de deslocamento químico e acoplamento entre si, geraram grande
65
17
distorção. Desta forma, outras medidas mais detalhadas foram realizadas e os dados
alcançados foram utilizados no simulador SimEsp-NMR, resultando no sinal da figura
55.
X(H)=
20
2
3
1
10
4
5
11
9
6
12
+2,60
+2,60
0,00
0,00
J(4,X)=
15
8
0,00
7
21
H1
805,3
807,7
810,2
845,3
843,3
847,3
849,4
832,7
821,9
830,6
19
0,00
J(3,X)=
COOMe
18
5
+2,20
J(2,X)=
17
13
16
14
4
+2,20
824,4
= 834
= 820
= 792
= 1920
= 2080
828,5
(H1)
(H2)
(H3)
(H4)
(H5)
3
+2,20
826,8
Tí tulo: D efault
2
J(1,X)= +16,80
H2
H3
- FFCLRP - USP)
Figura 55: Sinais de RMN de 1H simulados para H-15 (a e b), da substância 12.
O resultado obtido foi muito bom, levando ao esclarecimento da multiplicidade
dos sinais e proporcionando a medida das constantes de acoplamento.
O ponto mais intrigante desta proposta é o fato de um dos hidrogênios
apresentar 3 valores de constantes de acoplamento e o outro apresentar 4 valores.
Apesar de serem hidrogênios de CH2 diferentes (acoplam entre si), não é muito
comum apenas um deles ter um acoplamento a mais.
Um estudo detalhado do modelo tridimensional da molécula nos levou a
encontrar um acoplamento em W. O hidrogênio 15a, acopla com o hidrogênio da
posição 14 pelo fato das ligações entre eles estarem no plano, formando um W
(mostrado na figura 54). Isto não ocorre para o hidrogênio H-15b, o que explica esta
diferença.
66
Os dados de RMN obtidos neste estudo para a substância 12, juntamente com
os dados da literatura foram reunidos na tabela 11.
Tabela 11: Dados de RMN de 1H da substância 12.
C
 CLIT.
C
H
 HLIT.
(ppm)
H
Constantes de acoplamento (Hz)
(ppm)
Mult.
Mult.
Lit.
Exp.
(ppm)
(ppm)
1
40,7
41,0
2
19,0
19,4
3
37,7
38,3
4
43,8
5
57,0
57,3
5
1,03 (1H)
m
6
21,8
22,1
6a
1,82 (1H)
m
6b
1,76 (1H)
m
1a
1,87 (1H)
m
1b
0,78 (1H)
m
2a
1,85 (1H)
m
2b
1,42 (1H)
m
3a
2,17 (1H)
m
3b
q
7
41,3
41,5
7
8
44,2
44,4
q
0,98 (1H)
---
m
---
---
---
1,52 (2H)
---
m
---
---
---
---
---
9
55,0
55,3
9
10
39,7
39,9
q
11
18,4
18,6
11
1,58 (2H)
m
12
33,0
33,3
12a
1,63 (1H)
m
12b
1,50 (1H)
m
13
43,9
44,0
13
1,06 (1H)
---
2,62
m
---
2,63 (1H)
J(13,12b)=4,4;J(13,14a)=1,9;J(13,14b)=5,0;J(13,17a)=0,9;
s(l)
dddt
J(13,17b)=0,9
14
15
39,7
48,9
39,6
49,2
14a
1,96 (1H)
J(14a,13)=1,9;J(14a,14b)=11,4
dd
14b
1,13 (1H)
J(14b,14a)=11,4;J(14b,13)=5,0
ddt
15a
2,08 (1H)
J(15a,14b)=1,7;J(15a,15b)=16,8;J(15a,17a)=2,2;
15b
2,05 (1H)
---
dq
---
dt
J(15a,17b)=2,2
J(15b,15a)=16,8;J(15b,17a)=2,6;J(15b,17b)=2,6
16
155,8
156,1
q
---
---
---
---
17
103,0
103,2
17a
4,79
4,79 (1H)
J(17a,13)=0,9;J(17a,15a)=2,2;J(17a,15b)=2,6;J(17a,17b)=1,5
---
s(l)
dddd
17b
4,79
4,73 (1H)
J(17b,13)=0,9;J(17b,15a)=2,2;J(17b,15b)=2,6;J(17b,17a)=1,5
s(l)
dddd
18
29,0
29,0
18
1,24
1,16 (3H)
---
s
s
19
185,0
178,3
q
---
---
---
---
---
20
15,5
15,6
20
0,95
0,82 (3H)
---
s
s
21
---
51,3
21
---
3,64 (3H)
--20
2
3
1
10
4
5
11
9
6
12
13
16
14
8
s
17
15
7
COOMe
18
19
21
67
4.2.3.2. Estudo da substância 8.
2.05
22
1.0
19
16
20
11
12
13
3
22
21
O
5
4
6
17
8
COOH
16
15
7
19
18
0.6
9
0.87
0.7
10
2
0.85
O
2.16
0.8
20
18
14
1
0.72
0.9
0.5
0.4
17a 17b e 3
14
4.52
0.2
4.88
4.88
5.67
0.3
0.1
0
1.01
7.0
6.5
6.0
5.5
1.01 2.18
5.0
4.5
3.40 3.20
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
3.55 3.50 3.24
1.5
1.0
0.5
0
Os sinais já citados como facilmente identificáveis e que já são devidamente
atribuídos na literatura, como os sinais das metilas H-16, H-18, H-19 e H-20, foram
atribuídos em primeiro lugar. Da mesma forma, o sinal em 2,05 ppm também pode ser
facilmente atribuído à metoxila da posição 22. Os sinais de H-3, H-14, H-17a e H-17b
estão descritos na literatura (Ohashi et al., 1994), o que facilitou a atribuição. No
entanto, apresentamos aqui alguns detalhamentos não ressaltados naquela
publicação, como multiplicidade e valores de constantes de acoplamento.
Este é o caso, por exemplo, do sinal de H-14, o hidrogênio de uma das
ligações duplas.
68
16
20
11
13
0.20
22
21
10
2
3
J 14, 12a
14
1
O
0.15
14
12
O
4
18
9
5
6
8
7
17
COOH
15
J 14, 12b
J 14, 15
19
0.10
0.05
0
5.675
5.670
5.665
5.660
5.655
5.650
Diferentemente do apresentado na literatura (ver tabela 12, página 76), este
sinal não é um singleto, e apresenta características de ter acoplamentos ainda mais
complexos do que somente um tripleto ou quadrupleto. Ao verificar os experimentos
2D, percebe-se que este sinal apresenta correlação H-H (COSY) com outros três
sinais: dois deles são com os sinais H-12a e H-12b;e o outro com H-16. Desta forma,
sua multiplicidade na tabela aparece como ”multipleto”, mas deve ser resultados de
uma combinação de valores de constantes de acoplamento, como sendo um tripleto
de quadrupletos. O sinal foi simulado com o programa SimEsp_NMR, resultando no
espectro calculado da figura 58, página seguinte. Para os cálculos, foram inseridos no
programa o valor do deslocamento químico e os valores das constantes de
acoplamento homonucleares de hidrogênio (J). Observando-se que a aparência do
sinal calculado é muito semelhante ao sinal experimental, pode-se concluir que os
valores obtidos para as constantes de acoplamento estão corretos.
69
X(H)=
Tí tulo: H 14
20
J(2,X)=
12
11
13
3
4
5
6
+1,30
+1,20
+1,20
+1,20
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
-2,00
J(3,X)=
14
1
O
3
O
21
22
10
2
9
8
5
4
17
7
6
COOH
15
J(4,X)=
2263,4
= 2264
= 924
= 792
= 864
= 864
= 864
2264,6
(H1)
(H2)
(H3)
(H4)
(H5)
(H6)
2
J(1,X)= +1,30
16
J(5,X)=
-4,00
19
18
H1
- FFCLRP - USP)
Figura 58: Sinal de RMN de 1H simulado para H-14 da substância 8.
Sinais mais complexos, como o caso dos sinais dos hidrogênios da posição
17a, também foram detalhadamente estudados, conforme mostram as figuras 59 e 60
a seguir.
17a
16
20
0.25
O
22
13
14
1
21
10
2
3
0.20
J 17a, 17b
12
11
O
18
4
5
9
6
8
7
17
COOH
J 17a, 9
15
J 17a, 7b
J 17a, 7a
19
0.15
0.10
0.05
4.890
4.885
4.880
4.875
4.870
4.865
4.860
70
X(H)=
20
Tí tulo: H 17a
11
J(2,X)=
13
O
3
22
21
10
2
O
18
4
5
9
6
8
17
7
COOH
15
3
4
5
+3,80
+2,40
+2,40
0,00
0,00
+4,00
0,00
+2,00
J(3,X)=
14
1
1947
= 1948
= 1808
= 612
= 792
= 964
2
J(1,X)= +1,20
1949,1
(H1)
(H2)
(H3)
(H4)
(H5)
16
12
J(4,X)=
0,00
19
H1
- FFCLRP - USP)
Figura 60: Sinal de RMN de 1H simulado para H-17a da substância 8.
Este sinal também era apresentado na literatura (ver tabela 12, página 76),
como sendo um singleto, mas este apresenta características de ter acoplamentos
ainda mais complexos. Ao verificar os experimentos 2D, percebe-se que este sinal
apresenta correlação H-H (COSY) com outros quatro sinais: sendo eles H-17b, H-9, H7a e H-7b. Fazendo a simulação do sinal no SimEsp_NMR utilizando as constantes de
acoplamento que estão na tabela 12 para este hidrogênio, obtém-se um sinal simulado
(figura 60) extremamente semelhante ao sinal experimental. Desta forma, conclui-se
que as constantes de acoplamento utilizadas na simulação estão corretas e que a
multiplicidade do sinal pode mesmo ser denominada como um duplo duplo tripleto
(ddt).
71
16
12a
20
0.09
11
12
13
14
J 12a, 12b
0.08
J 12a, 11a
22
21
O
4
18
J 12a, 11b
9
10
2
3
0.07
5
17
8
6
COOH
15
7
19
J 12a, 14
0.06
1
O
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
2.36
2.35
2.34
2.33
2.32
2.31
2.30
2.29
2.28
2.27
2.26
2.25
X(H)=
Freqüênc ia: 400 MHz Largura a meia altura: 2 H z
Tí tulo: H 12a
20
11
16
2
3
5
+4,20
+1,30
0,00
0,00
+4,00
0,00
+2,00
J(2,X)=
12
13
J(3,X)=
J(4,X)=
14
O
938,7
18
4
5
6
7
17
0,00
COOH
15
19
910,3
21
8
914,3
3
22
10
2
920,9
O
9
924,5
1
928
= 924
= 792
= 648
= 664
= 2264
934,7
(H1)
(H2)
(H3)
(H4)
(H5)
4
J(1,X)= +14,00 +10,50
H1
- FFCLRP - USP)
Figura 62: Sinal de RMN de 1H simulado para H-12a da substância 8.
O sinal do H-12a também teve sua multiplicidade esclarecida e confirmada
através do simulador de espectros. Com os valores de constantes de acoplamento, o
sinal foi simulado e a grande semelhança deste sinal com o experimental novamente
72
atestam a veracidade dos valores. A multiplicidade deste sinal foi determinada como
sendo duplo duplo duplo dupleto.
H3
16
20
11
12
13
14
0.20
1
O
3
22
21
10
2
O
4
5
9
6
8
17
COOH
J 3, 2a
15
7
J 3, 2b
18
19
H 17b
4.52
0.15
0.10
J 17b, 17a
0.05
0
2.16
4.57
4.56
4.55
4.54
4.53
4.52
4.51
4.50
4.49
4.48
4.47
4.46
4.45
Figura 63: Sinal de RMN de 1H da substância 8 – expansão 1
No espectro acima (figura 63) mostra o sinal de H 17b e H 3 que estão com o mesmo
deslocamento. A multiplicidade de H 3 fica claramente definida como sendo um duplo
dupleto e H 17b como um dupleto.
73
0.065
0.060
H 7a
0.055
0.050
J 7a, 7b
0.045
J 7a, 17a
0.040
J 7a, 6
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0
1.13
2.445
2.440
2.435
2.430
2.425
2.420
2.415
2.410
2.405
2.400
2.395
2.390
2.385
Figura 64: Sinal de RMN de 1H da substância 8 – expansão 2.
A figura 64 (acima), trata-se do H-7a, o qual também foi possível esclarecer a
sua multiplicidade facilmente como sendo um duplo duplo dupleto.
0.15
H 1a
H9
0.10
H 2b
H 2a + H 6a
H 11a + H 11b
0.05
0
1.20
1.80
2.22
1.75
2.37
1.70
1.65
2.91
1.60
1.55
1.50
74
A figura 65 (página anterior), mostra uma expansão de 1,50 a 1,80 ppm.
Na figura temos vários sinais de hidrogênio, não com multiplicidades esclarecidas,
mas todos os deslocamentos químicos esclarecidos. Temos também o sinal do H 1a
como sendo um duplo tripleto e H 9 como sendo também um duplo tripleto.
0.15
H5
H 6b
0.10
J 6b, 7a
H 1b
J 6b, 5
0.05
0
1.47
1.45
1.40
2.42
1.35
1.30
1.25
1.25
1.20
1.15
A figura 66 (acima), também mostra uma expansão de vários hidrogênios na
região de 1,15 a 1,45 ppm, com a multiplicidade do H- 6b, sendo ele um quarteto de
dupletos e também a multiplicidade do H- 5, como sendo um duplo dupleto.
Todos os dados obtidos de forma mais detalhada para esta substância foram
organizados na tabela 12, abaixo.
75
Tabela 12: Dados de RMN de 1H da substância 8.
C
1
2
C
(ppm)
37,9
24,3
H
(ppm)
1,78 (1H)
Constantes de acoplamento (Hz)
1a
 HLIT.
(ppm)
---
1b
---
1,24 (1H)
2a
---
2b
---
H
J(1a, 1b)=13
Mult.
Lit.
---
Mult.
Exp.
dt
J(1b, 1a)=13
---
m
1,74 (1H)
---
---
m
1,56 (1H)
---
---
m
4,52 (1H)
---
J(3, 2a)=4,5; J(3,2b)=11,8
---
-----
dd
--dd
3
80,6
3
4
36,7
---
-----
5
54,6
5
---
1,17 (1H)
---
---
6
23,8
6a
---
1,72 (1H)
J(6a, 6b)=4,2
---
m
6b
---
1,39 (1H)
J(6b, 6a)=4,2; J(6b, 7a)=12,9
---
qd
7a
---
2,41 (1H)
J(7a, 7b)=4,2; J(7a, 6b)=12,9; J(7a, 17a)=2,4
---
ddd
7b
-----
1,96 (1H)
---
J(7b, 7a)=4,2
---
---
m
---
7
38,0
8
147,4
---
9
55,7
9
39,2
---
-----
1,54 (1H)
---
J(9, 17a)=3,8
10
---
-----
ddd
---
11
21,6
11a
---
1,66
---
---
m
11b
---
1,61
---
---
m
12a
---
2,31 (1H)
J(12a,12b)=14;J(12a,11a)=10,5;J(12a,11b)=4,2;J(12a,14)=1,3
---
dddd
12b
m
---
12
39,9
163,6
---
-----
2,01 (1H)
---
J(12b,12a)=14
13
---
---
14
115,0
14a
5,67
5,66 (1H)
J(14,15)=1,2;J(14,12a)=1,3;J(14,12b)=1,3
s(l)
tq
15
171,9
---
16
19,2
2,17
---
2,16 (3H)
---
J(15,14)=1,2
---
S
---
d
---
17
107,0
17a
4,49
4,87 (1H)
J(17a,17b)=1,2;J(17a,9)=3,8;J(17a,7a)=2,4;J(17a,7b)=2,4
s(l)
ddt
17b
4,85
4,52 (1H)
J(17b,17a)=1,2
S
d
18
0,87
0,87 (3H)
---
S
s
0,80
0,84 (3H)
---
S
s
18
28,2
19
16,5
20
14,5
20
21
171,0
21
0,68
---
0,71 (3H)
---
-----
S
---
s
---
22
21,3
22
---
2,05
---
---
s
16
20
11
12
13
14
1
O
3
22
21
10
2
O
18
4
5
9
6
8
7
17
COOH
15
19
Foi alcançada para esta molécula uma atribuição muito mais completa e
detalhada dos sinais de RMN de 1H e de 13C.
76
4.2.4. Atividade biológica dos derivados obtidos
4.2.4.1. Atividade Antimicrobiana
Os derivados obtidos foram enviados para a avaliação de seu potencial
biológico antimicrobiano frente a alguns micro-organismos resistentes e algumas
cepas padrão. O conjunto de micro-organismos utilizados inclui: Staphylococcus
aureus wb81 (M1); Staphylococcus aureus ic180 (M2); Staphylococcus aureus w7749
(M3); Staphylococcus capitis ic207 (M4); Staphylococcus epidermidis ic177 (M5);
Staphylococcus haemolyticus ic213 (M6); Enterococcus faecalis ic179 (M7);
Staphylococcus aureus ATCC 29213 (M8); Staphylococcus capitis ATCC 27840 (M9);
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 (M10); Staphylococcus haemolyticus ATCC
29970 (M11); Enterococcus faecalis NCTC 775 (M12) e Enterococcus faecium NCTC
717 (M13). De M1 a M7 são isolados clínicos multirresistentes. As estruturas das
substâncias testadas estão na figura 67 (abaixo) e os resultados obtidos para as
substâncias estão na tabela 13 e 14 (próxima página).
COOH
COOH
AcO
H
COOH
COOH
COOH
HO
COOH
7
4
8
H
COO-Na+
H
COOMe
12
13
COOH
R2
21. R1=CH3; R2=H
22. R1=CH3; R2=OAc
23. R1=CH3; R2=OH
24. R1=COOH; R2=H
10
H
CH2OH
H
R
18. R=COOH
19. R=COONa
20. R=COOMe
16
COOMe
R2
R1
9
COOMe
R2
R1
25. R1=CH3; R2=H
26. R1=CH3; R2=OAc
27. R1=CH3; R2=OH
28. R1=COOMe; R2=H
COOMe
R2
R1
29. R1=CH3; R2=H
30. R1=CH3; R2=OAc
31. R1=CH3; R2=OH
32. R1=COOMe; R2=H
R1
33. R1=CH3; R2=H
34. R1=CH3; R2=OAc
35. R1=CH3; R2=OH
36. R1=COOH; R2=H
Figura 67: Substâncias testadas para atividade antimicrobiana.
77
Tabela 13: Resultados de atividade antimicrobiana (CIM) – Parte 1.
Microrg
Substâncias - Resultados µg/mL
7
8
9
10
16
18
19
20
21
22
23
24
Van.
M1
100
400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
1,47
M2
50
400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
1,475
M3
50
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
1,475
M4
50
400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
*
>400
>400
>400
0,737
M5
50
>400
400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
1,475
M6
50
400
>400
>400
>400
50
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
1,475
M7
50
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
>5,9
M8
50
400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
0,737
M9
200
400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
25
>400
>400
>400
0,737
M10
6,25
>400
>400
>400
>400
>400
400
>400
6,25
400
>400
>400
0,737
M11
25
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>12,5
>400
>400
>400
1,475
M12
50
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
0,737
M13
50
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
12,5
>400
>400
>400
>5,9
Concentrações das substâncias testadas = 400 µg/mL a 0,195 µg/mL; Concentrações do controle positivo testado (Vancomicina) =
5,9µg/mL a 0,0115µg/mL.
*Não cresceu
Tabela 14: Resultados de atividade antimicrobiana (CIM) – Parte 2.
Microrg
Substâncias - Resultados µg/mL
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Van.
M1
>400
>400
>400
>400
> 400
>400
>400
400
>400
>400
>400
400
1,47
M2
>400
>400
>400
>400
> 400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
400
1,475
M3
>400
>400
>400
>400
> 400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
1,475
M4
>400
>400
>400
>400
> 400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
0,737
M5
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
1,475
M6
>400
400
>400
>400
> 400
>400
>400
>400
>400
200
50
200
1,475
M7
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>5,9
M8
>400
>400
>400
>400
> 400
>400
>400
100
>400
>400
>400
>400
0,737
M9
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
*
>400
>400
>400
>400
0,737
M10
100
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
200
200
200
0,737
M11
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
1,475
M12
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
0,737
M13
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
>400
400
>400
400
>5,9
Concentrações das substâncias testadas = 400 µg/mL a 0,195 µg/mL; Concentrações do controle positivo testado (Vancomicina) =
5,9µg/mL a 0,0115µg/mL.
*Não cresceu
78
Nota-se nos resultados que, de uma maneira geral, as substâncias em sua
esmagadora maioria apresentaram uma concentração inibitória mínima de 400 ou
>400 para todos os micro-organismos. As únicas substâncias que foram diferentes
disso foram as substâncias 7 e 21 (figura abaixo).
COOH
7
COOH
21
Figura 68: Labdanos que mostraram atividade contra os micro-organismos
Segundo Rios e Récio (Rios, J.L.; Recio, M.C. J., 2005) uma substância pode
ter seu potencial antimicrobiano considerado como promissor, para valores de
CIM≤10g/mL. Para um extrato ou fração, são considerados promissores valores de
CIM≤100g/mL. No entanto, dependendo da importância e resistência do microorganismo, comparadas com a eficiência do agente antimicrobiano disponível no
mercado, alguns valores maiores de CIM podem ser considerados interessantes. À luz
dessa observação, podemos considerar bons os resultados obtidos para a substância
7 para a maioria dos micro-organismos, com CIM=50g/mL para nove casos e
CIM=25g/mL para um. Além disso, pode-se considerar promissor o resultado da
substância 7 contra S. epidermidis - ATCC 14990, com CIM=6,25g/mL. A substância
21 também apresentou resultados muito bons, com CIM=12,5g/mL para oito casos e
CIM=6,25 g/mL para S. epidermidis ATCC 14990.
79
4.2.4.2. Atividade Atiespasmódica
Objetivando estudar a relação entre a estrutura química de diterpenos e o potencial
antiespasmódico (Ambrósio et al., 2006) demonstrado por esta classe de produtos naturais
na artéria aorta de ratos, foi investigado 4 diterpenos do tipo labdano e um diterpeno do tipo
caurano. Nas Figuras 66 a 71 estão apresentados as substâncias testadas e os resultados
obtidos com os diterpenos investigados.
COOH
COOH
COOH
HO
COOH
7
9
10
COOMe
H
COO-Na+
12
25
Figura 69: Estrutura das substâncias testadas.
Figura 70: Gráfico do resultado para substância 7.
80
81
Por meio da análise de dados da literatura científica (Ambrósio et al., 2006) é
possível verificar que diversos diterpenos da classe dos pimaranos e cauranos são capazes
de inibir a contração da artéria aorta de ratos quando induzida por fenilefrina (Phe), o que
demonstra o potencial antiespasmódico desta classe de produtos naturais. Pelos resultados
obtidos com estes estudos, nota-se claramente que nenhum dos diterpenos do tipo labdano
avaliados foi capaz de inibir a resposta contráctil da artéria isolada quando estimulada com
Phe. É interessante observar que, apesar das estruturas do tipo labdano testadas até o
momento não apresentarem potencial antiespasmódico significante, estes resultados
permitirão uma comparação entre os esqueletos químicos dos diterpenos, o que certamente
será fundamental para uma análise futura da relação entre a estrutura química desta classe
de metabólitos e seu potencial em inibir a contração da artéria aorta de ratos.
Por outro lado, o sal sódico do ácido caurenóico na concentração de 100 µM inibiu a
contração da artéria em aproximadamente 39%, apresentando diferença estatisticamente
significativa em relação ao controle (P<0,05). Comparando-se com a literatura para o ácido
caurenóico (Tirapelli et al., 2005), que apresentou na mesma concentração uma inibição de
aproximadamente 56%, é possível concluir que a modificação do grupamento ácido pelo seu
respectivo sal sódico, reduz o efeito inibitório anteriormente apresentado por este diterpeno
(Tirapelli et al., 2005). Futuramente, novos diterpenóides serão investigados e uma
correlação mais abrangente a respeito da relação entre a estrutura química desta classe de
metabólitos e a atividade antiespasmódica na artéria aorta será obtida.
82
CONCLUSÃO___________________________________________________________________
5. CONCLUSÃO
A preparação de todos os materiais de partida foi realizada com sucesso
através do isolamento dos diterpenos caurano e labdanos. As modificações estruturais
em ácido caurenóico foram realizadas e resultaram nos derivados esperados, com
exceção de um dos derivados. Por outro lado, a obtenção de derivados de labdanos
foi expressivamente maior do que o planejado inicialmente pela inclusão de mais duas
estruturas como materiais de partida nas transformações. Com isso, foi obtido com
sucesso um variado grupo de estruturas de diterpenos, todos com estruturas
identificadas.
As
avaliações
de
atividades
biológicas
mostraram
resultados
consideravelmente interessantes. Visto que a modificação estrutural pode potencializar
a atividade de uma substância.
Quanto aos estudos de Ressonância Magnética Nuclear, pode-se verificar
neste trabalho que uma quantidade considerável de atribuições de dados para os
diterpenos foram atingidas. O esclarecimento dos sinais do éster metílico do ácido
caurenóico e do acetato do ácido copálico rendeu um conjunto de dados ainda não
existentes na literatura.
83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS____________________________________________________
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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